〇

A
(12) 特 許 協 力 条 約 に 基 づ い て 公 開 され た 国 際 出 願
(19) 世界 知 的所有権機 関
国際事 務 局
(43) 国 際 公 開 曰
2012 年 3 月 2 日 （ 29.03.2012)

(51) 国際特 許分 類 ： (74) 代 理 人 ：田 中 光 雄 ， 外 （ TANAKA, Mitsuo et al.);

C12P 17/12 (2006.01) C12N 15/09 (2006.01) 〒 5400001 大 阪 府 大 阪 市 中 央 区 城 見 1 丁 目 3 番
C12N 1/21 (2006.01) 7 号 I M P ビル 青 山特 許 事 務 所 Osaka (JP).

(21) 国際 出願 番 号 ： PCT/JP20 1 1/071520 (81) 指定国 （ 表 示 の な い 限 り、 全 て の 種 類 の 国 内 保

護 が 可 肯 ) : AE, AG, AL, AM, AO, AT, AU, AZ, BA,
(22) 国 際 出 願 日： 201 1 年 9 月 21 日（21 .09.201 1)
BB, BG, BH, BR, BW, BY, BZ, CA, CH, CL, CN, CO,
(25) 国際 出願 の 言 語 ： 日本 語 CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DO, DZ, EC, EE, EG, ES, FI,
GB, GD, GE, GH, GM, GT, HN, HR, HU, ID, IL, IN, IS,
(26) 国際 公 開の 言語 ： 日本 語 JP, KE, KG, KM, KN, KP, KR, KZ, LA, LC, LK, LR,
優 先権 丁 一 タ： LS, LT, LU, LY, MA, MD, ME, MG, MK, MN, MW,
(30)
特 願 2010-212261 年 月 曰（22.09.2010) MX, MY, ML, NA, NG, NI, NO, NZ, OM, PE, PG, PH,
2010 9 22 JP
PL, PT, QA, RO, RS, RU, RW, SC, SD, SE, SG, SK, SL,
(71) 出願 人 （ 米 国 を 除 く全 て の 指 定 国 に つ い て ） ：石 SM, ST, SV, SY, TH, TJ, TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG,
川 県 公 立 大 学 沄 人 (ISHIKAWA PREFECTURAL US, UZ, VC, VN, ZA, ZM, ZW.
PUBLIC UNIVERSITY CORPORATION) [JP/JP]; 〒
(84) 指定国 （ 表 示 の な い 限 り、 全 て の 種 類 の 広 域 保
9218836 石 川 県野 々巿 巿 末 松 一 丁 目 3 0 8 番 地
護 が 可 肯^: ARIPO (BW, GH, GM, KE, LR, LS, MW,
Ishikawa (JP1
MZ, NA, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZM, ZW), ユ ー ラ シ ア
(72) 発 明 者 ；お よ び (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), ョ一 ロ ッパ
(75) 発 明 者 /出 願 人 （ 米 国 に つ い て の み )：中 川 明 (AL, AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR,
fNAKAGAWA, Akira) [JP/JP]; 〒 9218836 石川 県 GB, GR, HR, HU, IE, IS, IT, LT, LU, LV, MC, MK, MT,
野 々巿 巿 末松 一 丁 目 3 0 8 番 地 石川県立大 NL, NO, PL, PT, RO, RS, SE, SI, SK, SM, TR), OAPI
学 内 Ishikawa 南 博 道 (MINAMI, Hiromichi) (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GQ, GW, ML, MR,
[JP/JP]; T 2 18836 石 川 県 野 々 巿 巿 末 松 一 丁 目 3 NE, SN, TD, TG).
0 8 番地 石 川 県 立 大 学 内 Ishikawa (JP). 片 山
添付 公 開書 類 ：
咼嶺 （ KATAYAMA, Takane) [JP/JP]; 〒 9218836 石
川 県野 々巿 巿 末 松 一 丁 目 3 0 8 番 地 石川県 一 国際調 査報 告 （
条約第 21 条 (3))
立 大 学 内 Ishikawa (JP). 熊 谷 英彦（ KUMAGAI,
一 明 細 書 の 別 個 の 部 分 と して 表 した 配 列 リス ト
Hidehiko) [JP/JP]; 〒 921 8836 石 川 県 野 々 巿 巿 末 松 (規 則 5.2(a))
—丁 目 3 0 8 番地 石 川 県 立 大 学 内 Ishikawa
(JP).

(54) Title: METHOD FOR PRODUCING PLANT BENZYLISOQUINOLINE ALKALOID

(54) 発 明 の 名 称 ：植 物 べ ン ジ ル イ ソキ ノ リ ン ア ル 力 ロイ ドの 生 産 方 法

(57) Abstract: A method ior synthesizing (s)-reticulin being important as a juncnon intermediate in biosvnthetic pathwav 0 1 ben-
zylisoquinoline alkaloid b y culturing the transgenic microbes expressing the enzyme necessary for the biosynthesis.

要 約 ：ベ ン ジ ル イ ソキ ノ リ ン ア ル 力 ロ イ ドの 生 合 成 経 路 に お け る分 岐 点 中 間 体 と して 重 要 な （S ) -
(57)
レチ ク リ ン を 、 そ の 生 合 成 に必 要 な 酵 素 を 発 現 す る形 質 転 換 微 生 物 の 培 養 に よ っ て 合 成 す る 方 法 。
 明 細 書

発 明 の 名 称 ：植 物 べ ン ジ ル イ ソ キ ノ リン アル 力 ロイ ドの 生 産 方 法

技術分野

[0001 ] 本 発 明 は、 植 物 べ ン ジ ル イ ソ キ ノ リン アル カ ロ イ ドの 生 産 方 法 に 関 す る。

背景技術
[0002] イ ソ キ ノ リン ァル カ ロ イ ドは 6 0 0 0 種 に も 及 ぶ 多 様 な 化 合 物 群 で あ り、

モ ル ヒネ や ベ ル ベ リン等 有 用 医 薬 品 を 多 く含 ん で お り、 植 物 の 生 産 す る重 要

な 有 用 二 次 代 謝 産 物 で あ る。 これ ま で 、 そ の 生 産 の ほ とん ど は 天 然 物 か らの

抽 出 に依 存 して い た 。 しか し、 植 物 細 胞 に お け る 二 次 代 謝 産 物 の 蓄 積 レベ ル

が 低 い た め 、 抽 出 に よ って 高 い収 量 を得 る こ と は 困 難 で あ る。

[0003] ベ ン ジ ル イ ソ キ ノ リン アル カ ロ イ ド、 例 え ば、 鎮 痛 化 合 物 で あ る モ ル ヒネ

お よ び コデ ィ ン、 お よ び 抗 菌 剤 で あ るベ ル べ リン お よ び パ ル マ チ ン は、 モ ク

レ ン科 、 キ ンポ ゥ ゲ 科 、 メ ギ 科 、 ケ シ 科 、 お よ び そ の 他 の 多 くの 植 物 種 に お

い て 、 チ ロ シ ンか ら （S)- レチ ク リン を介 して 合 成 さ れ る。 （S)- レチ ク リン は

、 多 くの タ イ プ の ベ ン ジ ル イ ソ キ ノ リン アル 力 ロ イ ドの 生 合 成 経 路 に お け る

分 岐 点 中 間 体 で あ る。 即 ち 、 （S)- レチ ク リン は 抗 マ ラ リァ薬 お よ び 抗 癌 薬 の

開 発 に有 用 な 医 薬 上 重 要 な 非 麻 薬 性 アル カ ロ イ ドで あ る。

[0004] 最 近 の 研 究 に よ り、 これ らの アル カ ロ イ ドは新 規 な 医 薬 と して 有 用 で あ る

可 能 性 が あ る こ と も示 唆 さ れ て い る。 例 え ば、 ァ ポ ル フ ィ ン 型 アル カ ロ イ ド

で あ る マ グ ノ フ ロ リン は、 動 脈 硬 化 性 疾 患 の 発 症 を 防 ぐた め に酸 化 ス トレス

の 際 に 高 密 度 リポ タ ンパ ク質 を保 護 す る こ と、 お よ び HIV-1 に よ る ヒ 卜リンパ

芽 球 様 細 胞 殺 傷 を 阻 害 す る こ とが 報 告 さ れ て い る （
非 特 許 文献 1 ~ 3 ) 。 最 近

の 報 告 に よ る と抗 菌 剤 で あ るベ ル ベ リンが コ レス テ ロー ル 低 下 活 性 を有 す る

こ と も示 さ れ て い る （
非 特 許 文献 4 ) 。

[0005] 医 薬 と して の 使 用 可 能 性 に お い て 非 常 に 注 目 さ れ て い る た め に、 い くつ か

の べ ン ジ ル イ ソ キ ノ リン ァル カ ロ イ ドは 全 合 成 に よ って 化 学 合 成 さ れ て きた

。 例 え ば、 麻 薬 性 鎮 痛 薬 で あ る モ ル ヒ ネ の 全 合 成 が 報 告 さ れ て い る （
非特許文
 献 5 ) 。 しか しな が ら、 ア ル カ ロ イ ドが 有 す る 複 雑 な 構 造 や キ ラ リテ ィ 一 の た

め 、 費 用 効 率 の 高 い 生 産 方 法 を 開 発 す る こ と は 困 難 で あ る 。 した が っ て 、 酵

素 に よ る 合 成 が 、 環 境 に 優 し く効 率 の よ い ア ル 力 ロ イ ド生 産 の た め に 望 ま し

い。

[0006] 植 物 代 謝 工 学 で は ア ル 力 ロ イ ド経 路 の 最 終 生 成 物 の 量 を 増 加 さ せ る 試 み が

しば しば な さ れ て き て お り、 選 抜 さ れ た 植 物 細 胞 で は 、 工 業 的 利 用 に 十 分 な

量 の 二 次 代 謝 産 物 を生産 す る こ とが で きる （
非 特 許 文 献 6 ) 。 しか しな が ら、

植 物 に お け る 二 次 代 謝 の フ ロー は複 雑 か つ 厳 密 に制 御 さ れ て い る た め 、 所 望

の 産 物 を 得 る こ と は 非 常 に 難 し く、 植 物 代 謝 工 学 の 成 功 例 は わ ず か しか 報 告

され て い な い。

[0007] こ れ ま で 、 コ デ ィ ノ ン レ ダ ク タ 一 ゼ に RNAi を 施 した 形 質 転 換 ケ シ （op i u m p o

ppy) 植 物 お よ び ベ ル べ リ ン 架 橋 酵 素 （BBE) に RNAi を 施 した 形 質 転 換 ハ ナ ビ シ ソ

ゥ （Ca forn i a poppy) 細 胞 が レ チ ク リ ン を 生 産 す る も の と して 報 告 さ れ て い

る（
非 特 許 文 献 7 お よ び 8 ) 。 形 質 転 換 ケ シ は レチ ク リ ン の 生 産 に 好 適 で あ る

が 、 植 物 お よ び 培 養 細 胞 に よ っ て 生 成 物 の 量 が 非 常 に 変 動 しや す く、 か つ 、

植 物 お よび 培 養 細 胞 は成 育 に長 い時 間 が か か る （
非 特 許 文 献 9 ) 。 さ らに、 こ

れ ら形 質 転 換 ケ シ は レ チ ク リ ン の メ チ ル 化 誘 導 体 を い く ら か 蓄 積 した 。 形 質

転 換 ア プ ロ ー チ は 代 謝 工 学 に 非 常 に 強 力 な ッ 一 ル で あ り得 る が 、 RNA i を 含 む

こ の 技 術 に は 、 所 望 の 代 謝 産 物 生 産 に 利 用 す る に は い ま だ さ らな る 改 善 の 余

地 が あ る。

[0008] 最 近 、 植 物 全 生 合 成 工 程 を 再 構 成 す る 試 み が 微 生 物 系 に お い て 調 べ られ る

よ うにな った （
非 特 許 文献 1 0 お よび 1 1 )。 微 生物 系 は その他 の植 物 代 謝 産

物 を 含 ま な い た め 、 二 次 代 謝 産 物 の 量 を増 加 さ せ る の み な らず 、 そ の 質 も 改

善 さ せ る こ と が 出 来 る 。 微 生 物 系 に は 化 学 物 質 の 生 体 内 変 換 に つ い て い くつ

か の 有 利 な 点 が あ る が 、 特 に植 物 代 謝 産 物 に つ い て は、 例 え ば、 基 質 入 手 可

能 性 が 制 限 さ れ て い る こ と と い った 不 利 な 点 も有 す る。 微 生 物 お よ び 植 物 由

来 遺 伝 子 の 組 合 せ は、 様 々 な 化 合 物 の 生 産 の た め の 効 率 的 な 系 の 確 立 に有 用

で あ る。
[0009] ベ ン ジ ル イ ソ キ ノ リ ン ア ル カ ロ イ ド経 路 に お い て は 、 ノ ル コ ク ラ ウ リ ン か

らベ ル ベ リ ン ま で の ほ ぼ す ベ て の 生 合 成 遺 伝 子 が 単 離 さ れ て お り、 そ れ ら の

活 性 は微 生物 シ ステ ム に お い て示 され て い る （
非 特 許 文献 1 2 お よび 1 3 )。

ベ ン ジ ル イ ソ キ ノ リ ン ァ ル カ ロ イ ド経 路 に お い て 、 ノ ル コ ク ラ ウ リ ン シ ン タ

— ゼ （以 下 、 NCS と も 称 す る ）に よ っ て ド一 パ ミ ン と 4 - ヒ ドロ キ シ フ エ 二 ル ァ セ

卜ア ル デ ヒ ド（以 下 、 4-HPAA と も 称 す る ）と を カ ッ プ リ ン グ す る こ と か ら、 （S)

- ノ ル コ ク ラ ウ リ ン を 介 して （S) - レチ ク リ ン が 産 生 さ れ る こ と が 明 らか と な つ

て い る。 （S) - ノ ル コ ク ラ ウ リ ン は 次 い で ノ ル コ ク ラ ウ リ ン 6-0- メ チ ル 卜ラ ン

ス フ エ ラ 一 ゼ （以 下 、 60MT と も 称 す る ）に よ っ て コ ク ラ ウ リ ン に 変 換 さ れ 、 コ

ク ラ ウ リ ン は 、 コ ク ラ ウ リ ン - N- メ チ ル トラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ （以 下 、 CNMT と も

称 す る ）に よ っ て N- メ チ ル コ ク ラ ウ リ ン に 変 換 さ れ 、 N- メ チ ル コ ク ラ ウ リ ン は

、 P450 ヒ ドロ キ シ ラ 一 ゼ （CYP80B) に よ っ て 3 ' - ヒ ドロ キ シ -N- メ チ ル コ ク ラ

ゥ リ ン （以 下 、 6-0- メ チ ル ラ ウ ダ ノ ソ リ ン と も 称 す る ） に 変 換 さ れ 、 そ して 3

' - ヒ ドロ キ シ -N- メ チ ル コ ク ラ ウ リ ン は 、 3 ' - ヒ ドロ キ シ -N- メ チ ル コ ク ラ ウ リ

ン -4' -0- メ チ ル トラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ （以 下 、 4 ' 0MT と も 称 す る ）に よ っ て 、 （S) -

レ チ ク リ ン に 変 換 さ れ る （図 4 ) 。

[00 1 0 ] 本 発 明 者 らは これ ま で に、 微 生 物 に お い て 、 植 物 お よ び 微 生 物 の 酵 素 を組

み 合 わ せ て イ ソ キ ノ リ ン ァ ル カ ロ イ ド生 合 成 経 路 を 再 構 築 し、 イ ン ビ トロ ま

た は イ ン ビ ボ で 、 ド一 パ ミ ン を 出 発 物 質 と して レ チ ク リ ン を 生 産 す る 方 法 を

開 発 して き た （
特 許 文 献 1 ) 。 か か る方 法 は、 微 生 物 由 来 の モ ノ ア ミ ン才 キ

シ ダ 一 ゼ （以 下 、 MA0 と も 称 す る ）を 用 い る こ と に よ っ て ド一 パ ミ ン か ら 3 , 4 -

ジ ヒ ドロ キ シ フ エ 二 ル ァ セ 卜ア ル デ ヒ ド （以 下 、 3 , 4-DHPAA と も称 す る ） を合

成 し、 該 3 , 4 - ジ ヒ ドロ キ シ フ エ 二 ル ァ セ 卜ア ル デ ヒ ドと ド一 パ ミ ン を カ ッ プ

リ ン グ さ せ る こ と を 一 つ の 特 徴 と して お り、 レ チ ク リ ン 生 合 成 経 路 に お け る

ヒ ドロ キ シ ル 化 の ス テ ッ プ を 省 略 しつ つ 、 ド一 パ ミ ン の み か ら効 率 的 に レ チ

ク リン を合 成 す る こ と を可 能 に す る も の で あ る。

[00 1 1 ] しか しな が ら、 か か る 方 法 に お い て は 、 出 発 物 質 と して ド一 パ ミ ン を 添 加

す る こ と が 必 須 で あ る。 ま た 、 イ ン ビボ で 反 応 を 行 う場 合 に は 、 （R, S ) - ラセ
 ミ混 合 物 と して レチ ク リ ン が 得 られ る た め 、 多 くの ベ ン ジ ル イ ソ キ ノ リ ン ァ

ル カ ロ イ ドの 生 合 成 経 路 に お け る 分 岐 点 中 間 体 で あ る （S)- レチ ク リ ン の み を

得 る た め に は 、 キ ラ ル カ ラ ム に よ る 光 学 分 割 等 を 行 う必 要 が あ る。

[001 2 ] ま た 、 上 記 特 許 文 献 1 の 方 法 と 同 様 に、 イ ソ キ ノ リ ン ア ル カ ロ イ ド生 合 成

経 路 を微 生 物 に お い て 再 構 築 し、 ド一 パ ミ ン と他 の ア ミ ン を 基 質 と して 共 存

さ せ て 反 応 を 行 う こ と に よ り、 レチ ク リ ン に 加 え て 様 々 な ア ル 力 ロ イ ドを 生

産 す る方 法 も 開 発 され て い る （
特 許 文 献 2 ) 。 しか しな が ら、 当 該 方 法 に お

い て も、 出 発 物 質 と して ド一 パ ミ ン を 用 い る こ と が 必 須 で あ り、 イ ン ビボ で

反 応 を 行 う場 合 に は （R, S)- ラ セ ミ混 合 物 と して レチ ク リ ン が 得 られ る。

[001 3 ] — 方 、 Hawk i ns お よ び Smo Lke は 、 ノル ラ ウ ダ ノ ソ リ ン の ラ セ ミ混 合 物 を

出 発 物 質 と して 用 い 、 組 換 え 酵 母 細 胞 に よ っ て （R, S)- レチ ク リ ン お よ び そ の

誘 導 体 を 生 産 す る こ と に成 功 して い る （
非 特 許 文献 1 4 ) 。

[0014] しか しな が ら、 上 記 特 許 文 献 1 お よ び 2 な らび に非 特 許 文 献 1 4 に 記 載 さ

れ る 方 法 に お い て 出 発 物 質 と して 用 い られ る ド一 パ ミ ン な らび に ノル ラ ウ ダ

ノ ソ リ ン は 比 較 的 高 価 で あ り、 培 養 の 間 に 容 易 に酸 化 さ れ て 褐 色 の 不 溶 性 ポ

リマ 一 を形 成 す る性 質 を有 す る。 そ の た め 、 か か る 化 合 物 を 出 発 物 質 と して

用 い る 上 記 の ア ル カ ロ イ ド生 産 方 法 を 経 済 的 な シ ス テ ム と す る こ と は 困 難 で

あ る。

[001 5 ] こ の よ う な 背 景 か ら、 上 記 ド一 パ ミ ン お よ び ノル ラ ウ ダ ノ ソ リ ン の よ う な

出 発 物 質 を 用 い ず 、 安 価 で 入 手 しや す い 基 質 か らベ ン ジ ル イ ソ キ ノ リ ン ア ル

カ ロ イ ドを効 率 的 に 生 産 す る こ と が 可 能 な シ ス テ ム を確 立 す る こ と が 望 ま れ

て い た。

先行 技術 文献

特 許 文献

[001 6] 特 許 文 献 1 ：特 開 2 0 0 9 _ 2 2 5 6 6 9 号 公 報

特 許 文献 2 : 国際 公 開W 0 2 0 0 8 / 1 5 3 0 9 4 号 パ ンフ レツ 卜

非特 許 文献

[001 7 ] 非 特 許 文 献 1 ：Hung TM, e t a し (2007) Magnof Lor i ne from Copt i d i s r h i zom

a protects h i g h dens i t y l poprote i n dur i ng ox i dant s t ress. B i o L Pharm

Bu LL 3 0 : 1157-1 160

非 特 許 文 南犬2 : Hung TM, e t a し (2007) Protect i v e effect o f magnof Lor i ne

i s o Lated from Copt i d i s r h i zoma o n Cu2+ - i nduced ox i dat i o n o f human Lo

w dens i t y Li poprote i n. P Lanta Med 73: 1281 - 1284

非 特 許 文 献 3 ：Rash i d MA, e t a し ( 1 995) Ant i -HIV a Lka Lo i d s from Todda Li

a as i a t i ca. Nat Prod Res 6 : 153-1 56

非 特 許 文 献 4 : Kong W, e t a L. (2004) Berber i ne i s a nove l cho Lestero L- L

ower i ng drug work i ng through a un i ue mechan i s m d i s t i nct from stat i ns

. Nature Med 10 : 1344-1 351

非 特 許 文 献 5 : Gates M, Tschud i G ( 1 952) The synthes i s o f morph i ne. J A

Chem Soc 74: 1109-1 110

非 特 許 文 南犬6 : Sato F, Inu i T, Takemura T (2007) Metabo Li c eng i neer i ng

i n i soqu i no Li ne a Lka Lo i d b i osynthes i s . Cur r Pharm B i otech 8 : 2 1 1-21 8

非 特 許 文 献 7 : A L Len RS, e t a し (2004) RNAi -med i ated rep Lacement o f mor

ph i ne i t h the nonnarcot i c a Lka Lo i d ret i c u Li ne i n o p i u m poppy. Nat Bi

otechno L 22: 1559-1 566

非 特 許 文 献 8 : Fuj i i N, Inu i T, Iwasa K, Mor i s h i g e T, Sato F (2007) Kno

ckdown of berber i ne b r i dge enzyme by RNAi accumu lates (S)-ret i c u Li ne

and act i vates a s i Lent pathway i n c u Ltured Ca Li forn i a poppy c e LLs. Tr

ansgen i c Res 16 : 363-375

非 特 許 文 南犬9 ：Sato F, Yamada Y (2008) i n B i oeng i nee r i ng and Mo Lecu Lar

B i o Logy o f P Lant Pathways, Vo lume 1, eds Bohnert HJ, Nguyen HT, Le i s

N, ( E Lsev i er, Amsterdam), pp 3 1 1-346.

非 特 許 文 献 10 ：Rathbone DA, Bruce NC (2002) Mi crob i a l t ransformat i on o

f a Lka Lo i ds. Cur r Op i n Mi crob i o L 5 : 274-281

非 特 許 文 献 11 ： o DK, e t a し (2006) Product i on of the ant i ma Lar i a L dru

g precursor artem i s i n i c ac i d i n eng i neered yeast. Nature 440 : 940-943

 非 特 許 文 南犬12 : Mi nam i , H. , Dubouzet, E. , Iwasa, Κ. , & Sato, F. Funct i o

na L ana lys i s o f norcoc Laur i ne synthase i n Copt i s j apon i ca. J. Bi o し C

hem. 282, 6274-6282 (2007)

非 特 許 文 南犬13 : Mor i s h i ge, T. , Tsuj i ta, T. , Yamada, Υ. , & Sato, F. Mo Le

c u Lar character i zat i o n o f the S-adenosy L-L-meth i o n i ne ：3 ' -hydroxy-N-me

thy Lcoc Laur i ne 4 ' -0-methy [ t ransferase i nvo lved i n i soqu i no Li ne a Lka Lo

i d b i osynthes i s i n Copt i s j apon i ca. J. B i o し Chem. 275, 23398-23405 (

2000)

非 特 許 文 献 14 : Hawk i ns, K. M. & Smo Lke, D. (2008) Product i on of benzy

Li soqu i no Li ne a Lka Lo i d s i n Saccharomyces cerev i s i ae. Nat. Chem. Bi o し

4, 564-573

発 明 の概 要

発 明 が解 決 しょ う とす る課題
[001 8 ] 本 発 明 の 目的 は、 ドー パ ミ ン等 の 比 較 的 高 価 な 出 発 物 質 を 用 い ず 、 安 価 で

入 手 しや す い 基 質 か らベ ン ジ ル イ ソ キ ノ リン ァル カ ロ イ ドを 生 産 す る シ ス テ

厶 を確 立 す る こ と に あ る。

課題 を解 決 す るため の手 段
[001 9 ] この た び 、 本 発 明 者 は、 植 物 お よ び 微 生 物 の 代 謝 に 関 わ る遺 伝 子 を組 み 合

わ せ て 、 ベ ン ジ ル イ ソ キ ノ リン アル 力 ロ イ ドの 生 合 成 経 路 を微 生 物 に お い て

再 構 築 す る こ と に よ り、 所 望 の ベ ン ジ ル イ ソ キ ノ リン アル 力 ロ イ ドを 生 産 す

る こ とが 可 能 な 微 生 物 系 を確 立 した 。

[0020] 具 体 的 に は、 本 発 明 者 は、 ベ ン ジ ル イ ソ キ ノ リン アル カ ロ イ ドの 生 合 成 経

路 に お け る分 岐 点 中 間 体 と して 重 要 な （S)- レチ ク リン を、 そ の 生 合 成 に必 要

な 酵 素 を発 現 す る形 質 転 換 微 生 物 の 培 養 に よ って 合 成 す る こ と に成 功 した 。

[0021 ] す な わ ち 、 本 発 明 は、 L- チ ロ シ ン を 生 産 す る代 謝 経 路 を有 す る イ ソ キ ノ リ

ン ァル カ ロ イ ド非 生 産 性 細 胞 に、 チ ロ シ ナ 一 ゼ お よ び そ の ア ダ プ タ 一 タ ンパ

ク質 、 L-D0PA 特 異 的 デ カル ボ キ シ ラ 一 ゼ 、 モ ノ ア ミ ン才 キ シ ダ 一 ゼ 、 ノル コ

ク ラ ウ リン シ ン タ 一 ゼ 、 ノル コ ク ラ ウ リン 6-0- メ チ ル トラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ 、
コクラ ウ リン-N- メチル トラ ンス フェラ一ゼな らび に3 ' - ヒ ドロキシ-N- メチル

コクラ ウ リン-4' -0- メチル トラ ンス フェラ一ゼか らな る群 よ り選択 され る少

な くとも 1 つの タ ンパ ク質 を コ一 ドす る少な くとも 1 つの遺伝 子 が導 入 され

てな る、 チ ロシナ一ゼ お よび その アダ プタ一 タ ンパ ク質、 L-D0PA 特異 的デ カ

ル ポ キシ ラ一ゼ、 モ ノア ミン才 キシ ダ一ゼ、 ノル コクラ ウ リンシ ンタ一ゼ、

ノル コクラ ウ リン 6-0- メチル トラ ンス フェラ一ゼ、 コクラ ウ リン- N- メチル

トラ ンス フェラ一ゼな らび に3 ' - ヒ ドロキシ-N- メチル コクラ ウ リン-4' -0- メ

チル トラ ンス フェラ一ゼ を発現 す る組換 え宿 主細胞 を提供 す る工程、 お よび

該組換 え宿 主細胞 を、炭 素源 と して グル コー ス、 フル ク 卜一 ス、 ガラ ク 卜一

ス、 ス ク ロー ス、 ラ ク 卜一 スお よび マル ト一 スか らな る群 よ り選択 され る 1

種 以上 の糖 お よび/ また は グ リセ 口一ル を含 む培地 において培養 す る工程 を

含 む、 （S) - レチ ク リンを生産 す る方法 を提供 す る。

また、 本発 明 は、 L- チ ロシ ンを生産 す る代謝 経路 を有 す るイ ソキ ノ リンァ

ル カ 口ィ ド非 生産性 細胞 に、 フ ィ一 ドバ ック阻害耐性 の3 - デ才 キシ-D- ァラ ビ

ノ- へ プッ 口ソ ン酸 -7- リン酸 シ ンタ一ゼ、 フ ィー ドバ ック阻害耐性 の コ リス

ミ酸 厶 タ一ゼ/ プ レフエナ一 卜デ ヒ ドロゲナ一ゼ、 トラ ンスケ トラ一ゼ、 ホ ス

ホエ ノ一ル ビル ビン酸 シ ンテ タ一ゼ、 チ ロシナ一ゼ お よび その ァダ プタ 一 タ

ンパ ク質、 L-D0PA 特異 的デ カル ボ キシ ラ一ゼ、 モ ノア ミン才 キシ ダ一ゼ、 ノ

ル コクラ ウ リンシ ンタ一ゼ、 ノル コクラ ウ リン 6-0- メチル トラ ンス フェラ一

ゼ、 コクラ ウ リン-N- メチル トラ ンス フェラ一ゼな らび に3 ' - ヒ ドロキシ-N- メ

チル コクラ ウ リン-4' -0- メチル トラ ンス フェラ一ゼか らな る群 よ り選択 され

る少な くとも 1 つの タ ンパ ク質 を コ一 ドす る少な くとも 1 つの遺伝 子 が導 入

され てな る組換 え宿 主細胞 であ って、 フ ィー ドバ ック阻害耐性 の3 - デ才 キシ-

D- ァラ ピノ- ヘ プッ ロソ ン酸- 7 - リン酸 シ ンタ一ゼ、 フ ィ一 ドバ ック阻害耐性

の コ リス ミ酸 厶 タ一ゼ/ プ レフエナ一 卜デ ヒ ドロゲナ一ゼ、 トラ ンスケ トラ一

ゼ、 ホ スホエ ノ一ル ビル ビン酸 シ ンテ タ一ゼ、 チ ロシナ一ゼ お よび その ァダ

プタ一 タ ンパ ク質、 L-D0PA 特異 的デ カル ボ キシ ラ一ゼ、 モ ノア ミン才 キシ ダ

—ゼ、 ノル コクラ ウ リンシ ンタ一ゼ、 ノル コクラ ウ リン 6-0- メチル トラ ンス

 フ ェラ一 ゼ、 コ クラ ウ リン-N- メチル トラ ンス フ ェラ一 ゼ な らび に3' - ヒ ドロ

キ シ-N- メチル コ クラ ウ リン-4' -0- メチル トラ ンス フ ェラ一 ゼ を発現 し、 か つ

、 tyrR 遺伝 子 を有 しな いか また は その機 能 が欠損 して い る組換 え宿 主細胞 を

提 供 す る工程 、 お よび該 組換 え宿 主細胞 を、 炭 素源 と して グル コー ス、 フル

ク 卜一 ス、 ガ ラ ク 卜一 ス、 ス ク ロー ス、 ラ ク 卜一 ス お よび マル ト一 スか らな

る群 よ り選 択 され る 1 種 以 上 の糖 お よび/ また は グ リセ 口 一 ル を含 む培 地 に

お いて培養 す る工程 を含 む、 （S)- レチ ク リンを生産 す る方 法 を提 供 す る。

[0023] さ らに、 本 発 明 は、 L- チ ロ シ ン を生産 す る代 謝 経路 を有 す るイ ソキ ノ リン

アル 力 ロイ ド非 生産 性 細胞 に、 チ ロシナ 一 ゼ お よび その ア ダ プタ一 タ ンパ ク

質、 L-D0PA 特 異 的デ カル ボ キ シ ラ一 ゼ、 モ ノ ア ミ ン才 キ シ ダ一 ゼ、 ノル コ ク

ラ ウ リンシ ンタ一 ゼ、 ノル コ クラ ウ リン 6-0- メチル トラ ンス フ ェラ一 ゼ、 コ

クラ ウ リン-N- メチル トラ ンス フ ェラ一 ゼ な らび に3' - ヒ ドロキ シ-N- メチル コ

クラ ウ リン-4' -0- メチル トラ ンス フ ェラ一 ゼ か らな る群 よ り選 択 され る少 な

くとも 1 つ の タ ンパ ク質 を コ一 ドす る少 な くとも 1 つ の遺伝 子 が導 入 され て

な る、 チ ロシナ 一 ゼ お よび その ア ダ プタ一 タ ンパ ク質、 L-D0PA 特 異 的デ カル

ボ キ シ ラー ゼ、 モ ノア ミ ン才 キ シ ダ一 ゼ、 ノル コ クラ ウ リンシ ンタ一 ゼ、 ノ

ル コ クラ ウ リン 6-0- メチル トラ ンス フ ェラ一 ゼ、 コ クラ ウ リン- N- メチル 卜

ラ ンス フ ェラ一 ゼ な らび に3' - ヒ ドロキ シ-N- メチル コ クラ ウ リン-4' -0- メチ

ル トラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ を発現 す る組換 え宿 主細胞 を提 供 す る。

発 明 の効 果
[0024] 本 発 明 に よ る と、 ベ ンジル イ ソキ ノ リンアル カ ロイ ドの生合成 に必 要 な遺

伝 子 を発現 させ た組換 え宿 主細胞 を、 微 生物 の培養 に通 常 用 い られ る培 地 中

で培養 す る こ とに よ り、 目的 のベ ンジル イ ソキ ノ リンアル カ ロイ ド、 特 に （S)

- レチ ク リンを高効 率 で生産 す る こ とが で きる。 す なわ ち、 本 発 明 に よれ ば、

微 生物 用 の培 地 を構 成 す る安価 か つ容 易 に入手 可 能 な基 質 か らベ ンジル イ ソ

キ ノ リンアル 力 ロイ ドを生産 す る こ とが で き、 出発物 質 と して追 加 の基 質 を

用 い る必 要 が な い。 した が って、 本 発 明 の微 生物 系 は、 希 少 なベ ンジル イ ソ

キ ノ リンァル カ ロイ ドを生産 す る コス 卜を劇 的 に減 少 させ る こ とが可 能 な、

 簡 便 か つ 費 用 効 率 の 高 い シ ス テ ム で あ る。

[0025] 本 発 明 に よ り、 多 様 な 有 用 化 合 物 生 産 の た め の 素 材 で あ る べ ン ジ ル イ ソ キ

ノ リ ン ァ ル カ ロ イ ドが 大 量 に 生 産 で き る 基 盤 が 構 築 さ れ る と と も に、 さ らな

る代 謝 変 換 に よ り、 新 た な る創 薬 資 源 の 開 発 が 可 能 と な る。 さ ら に、 本 発 明

の 微 生 物 系 は 、 新 規 な イ ソ キ ノ リ ン ァ ル カ ロ イ ドの 生 産 の た め の 新 規 経 路 を

開 発 す る た め に も有 用 で あ る。

[0026] また、 本 発 明 の微 生 物 系 に お い て再 構 築 され るベ ンジル イ ソ キ ノ リン アル

力 ロ イ ド生 合 成 経 路 の 個 々 の ス テ ッ プ は 、 い ず れ も既 知 か つ 制 御 可 能 な も の

で あ る。 した が っ て 、 個 々 の 生 合 成 遺 伝 子 の 発 現 レベ ル を 最 適 化 す る こ と お

よ び 経 路 の 流 れ を 改 良 す る こ と に よ っ て 、 さ ら に効 率 的 な 生 産 を 達 成 す る こ

と が 可 能 と な り う る。

図面 の簡 単 な説 明

[0027] [ 図 1] 本 発 明 に お い て 宿 主 細 胞 中 に再 構 築 さ れ る （
S)- レチ ク リ ン の 生 合 成 経 路

を 示 す 。 本 発 明 に よ っ て 構 築 さ れ る テ イ ラ ー メ イ ドの 生 合 成 経 路 は 、 TYR 、 DO

DC お よび MAO か らな る。 NCS 以 降 の 植 物 の 生 合 成 経 路 は 、 CYP80B の 反 応 を 回

避 す る よ う改 変 さ れ て い る。 略 語 は 以 下 の 通 りで あ る ： E4P 、 エ リ 卜ロ ー ス

-4- リ ン酸 ； PEP 、 ホ ス ホ エ ノ 一 ル ビル ビ ン酸 ； DAHP 、 3- デ 才 キ シ -D- ァ ラ

ビ ノ- へ プ ッ 口 ソ ン酸 -7- リ ン酸 ； HPP 、 4- ヒ ドロ キ シ フ エ ニ ル ピル ビ ン酸

； 3, 4-DHPAA, 3, 4- ジ ヒ ドロ キ シ フ エ 二 ル ァ セ 卜ア ル デ ヒ ド ； fbr-DAHP

S、 フ ィ一 ドバ ッ ク 阻 害 耐 性 の 3- デ 才 キ シ -D- ァ ラ ピ ノ- ヘ プ ッ 口 ソ ン酸 - 7- リ

ン酸 シ ン タ 一 ゼ ； fbr-CM/PDH 、 フ ィ一 ドバ ッ ク 阻 害 耐 性 の コ リス ミ酸 厶 タ

— ゼ / プ レ フ エ ナ 一 卜デ ヒ ドロ ゲ ナ 一 ゼ ； PEPS 、 ホ ス ホ エ ノ 一 ル ビル ビ ン

酸 シ ンテ タ 一 ゼ ； TKT 、 トラ ン ス ケ トラ 一 ゼ ； TYR 、 チ ロ シ ナ 一 ゼ ；

D0DC 、 L-D0PA特 異 的 デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ ； MA0 、 モ ノ ア ミ ン才 キ シ ダ 一 ゼ

； NCS 、 ノル コ ク ラ ウ リ ン シ ン タ 一 ゼ ； 60MT 、 ノル コ ク ラ ウ リ ン 6-0-

メ チ ル トラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ ； CNMT 、 コ ク ラ ウ リ ン- N- メ チ ル トラ ン ス フ エ

ラ一ゼ ； 4' 0 ΜΤ 、 3' - ヒ ドロ キ シ -N- メ チ ル コ ク ラ ウ リ ン- 4' -0- メ チ ル トラ

ン ス フ ェ ラ 一 ゼ。
[ 図 2] 組 換 え 宿 主 細 胞 を 用 い た （
S)- レチ ク リ ン の 生 産 。 （
a) 大 腸 菌 細 胞 に お

ける（
S)- レチ ク リ ン生 産 の 経 時 変 化 （
左 軸 、 実 線 ） 。 NCS-0RF378-TYR-D0DC - O

ptMA0/pET-21 d お よ び 60MT-4' 0MT-CNMT/pACYC1 84 を有 し、 L- チ ロ シ ン を 過

剰 生 産 す る 大 腸 菌 株 （丸 印 、 " 組 換 え 生 産 株 A " ) ま た は NCS-0RF378-TYR-D

0DC-optMA0/pET-21 d お よ び 60MT-4' 0MT-CNMT/pACYC1 84 を有 す る が 、 L- チ ロ

シ ン の 生 産 に 関 わ る代 謝 経 路 が 改 変 さ れ て い な い 大 腸 菌 株 （四 角 印 、 " 組 換

え 生 産 株 B " ) を、 炭 素 源 と して グル コ ー ス を 含 む 培 地 を 用 い て ジ ャ ー フ ァ

— メ ン タ 一 中 に お い て 培 養 した 。 組 換 え 生 産 株 A に つ い て は 、 グル コ ー ス を

含 ま な い 培 地 に お い て も 培 養 を 行 っ た （三 角 印 ） 。 各 々 の 株 の 細 胞 増 殖 （
右

軸、破線、記号 は（
S)- レチ ク リ ン生 産 と 同 じ対 応 関 係 ） を 600nm に お け る 吸

光 度 と して 示 す 。 矢 印 は 、 そ れ が 指 し示 す 時 点 に お け る I PTG (50 M) の 添 加

を 示 す 。 実 験 を 3 回 繰 り返 し、 本 質 的 に 同 じ結 果 を得 た 。 代 表 的 な 1 つ の 実

験 か らの デ ー タ を 図 に 示 す 。 （
b) 本 発 明 の 組 換 え 宿 主 細 胞 の 培 養 に よ っ て

得 られ た 反 応 生 成 物 の LC-MS/MS 解 析 。 選 択 イ オ ン モ ニ タ リ ン グ （
SIM) の パ

ラ メ 一 タ 一 ： m/z = 330 ( レチ ク リ ン ） 。

[ 図 3] 炭 素 源 と して グル コ ー ス を 含 む 培 地 に お け る （
S)- レチ ク リ ン の 生 産 に 対

す る IPTG 濃 度 の 影 響 。 L- チ ロ シ ン を 過 剰 生 産 し、 レチ ク リ ン生 合 成 遺 伝 子

を 発 現 す る 大 腸 菌 株 （ " 組 換 え 生 産 株 A " ) を、 IPTG の 添 加 （矢 印 ） の 前 に

0D が 10 に な る ま で 増 殖 さ せ た ； IPTG 誘 導 な し （丸 ） 、 50 M IPTG (

四 角 ） 、 15 0 M I PTG ( 三 角 ） 、 500 I PTG ( X 印 ） 。 実 験 を 3 回 繰 り返 し

、 本 質 的 に 同 じ結 果 を得 た 。 1 つ の 代 表 的 な 実 験 か らの デ ー タ を 図 に 示 す 。

[ 図 4 ] 提 唱 さ れ て い る植 物 の ベ ン ジ ル イ ソ キ ノ リ ン ァ ル カ ロ イ ド生 合 成 経 路 、

お よ び L- チ ロ シ ン か ら （
S)- レチ ク リ ン ま で の ベ ン ジ ル イ ソ キ ノ リ ン ア ル 力

ロ イ ド生 合 成 に 関 与 す る 遺 伝 子 。 略 語 は 以 下 の 通 りで あ る ： 4-HPAA 4- ヒ

ドロ キ シ フ エ 二 ル ァ セ 卜ア ル デ ヒ ド ； T H、 チ ロ シ ン ヒ ドロ キ シ ラ 一 ゼ ；

TYDC 、 チ ロ シ ン/ D0PA デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ ； NCS 、 ノル コ ク ラ ウ リ ン シ ン

タ一ゼ ； 60MT 、 ノル コ ク ラ ウ リ ン 6-0- メ チ ル トラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ ； CN

MT 、 コ ク ラ ウ リ ン- N- メ チ ル トラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ ； CYP80B N- メ チ ル コ ク
ラ ウ リ ン 3 ' - ヒ ドロ キ シ ラ 一 ゼ ； 4 ' 0 ΜΤ 、 3 ' - ヒ ドロ キ シ -N- メ チ ル コ ク ラ

ゥ リ ン -4' -0- メ チ ル トラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ 。

[ 図 5 ] レチ ク リ ン か らマ グ ノ フ ロ リ ン ま た は ス コ ウ レ リ ン に 至 る イ ソ キ ノ リ ン

ア ル カ ロ イ ドの 生 合 成 経 路 を 示 す 。 略 語 は 以 下 の 通 り ： CNMT 、 コクラウ リ

ン -N- メ チ ル トラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ ； CYP80G2 、 コ リツ べ リ ン シ ン タ 一 ゼ ； B

BE 、 ベ ル べ リ ン 架 橋 酵素。

[ 図 6 ] (R, S ) - レチ ク リ ン に 関 す る 反 応 生 成 物 の 立 体 選 択 性 の 解 析 。 標 準 (R, S

) - レチ ク リ ン （a) お よ び 本 発 明 の 組 換 え 宿 主 細 胞 （ " 組 換 え 生 産 株 A " ) の 培

養 に よ っ て 得 られ た 反 応 生 成 物 （b) を、 キ ラ ル カ ラ ム を備 え る A g は e n t HPLC

sys t e 上 で 分 離 した 後 、 LC-MS を 用 い て モ ニ タ 一 した 。 選 択 イ オ ン モ ニ タ リ

ング （S IM) パ ラ メ ー タ 一 ： m/z = 330 ( レチ ク リ ン）

[ 図 7 ] 培 地 中 に存 在 す る 中 間 産 物 の 量 お よ び 増 殖 中 に お け る グ リセ 口 一 ル 消 費

。 図 2 、 3 お よ び 9 と対 応 す る様 々 な 時 点 に お い て 培 地 を 回 収 し、 L - チ ロ シ

ン （丸 印 ） 、 L-D0PA ( 四 角 印 ） お よ び ド一 パ ミ ン （三 角 印 ） の 濃 度 を 決 定 し

た 。 グ リセ ロ ー ル 消 費 （X 印 ） を、 各 時 点 に お け る 培 地 中 の 濃 度 お よ び 添 加

した グ リセ ロ ー ル の 量 か ら算 出 した 。 実 験 を 3 回 繰 り返 し、 本 質 的 に 同 じ結

果 を得 た 。 1 つ の 代 表 的 な 実 験 か らの デ ー タ を 図 に 示 す 。

[ 図 8 ] (S) - レチ ク リ ン生 産 の た め に 用 い た プ ラ ス ミ ドの 模 式 図 。 pCOLADue t -

1 は 、 t y r A き、 a r o G b t ktA お よび psA 遺 伝 子 を 含 む 。 ET - 2 1d は 、 NCS 、

0RF378 、 TYR 、 DODC お よ び optMAO 遺 伝 子 を 含 む 。 pACYC 18 4 は 、 60MT 、 4 ' OM

T お よ び CNMT 遺 伝 子 を 含 む 。 い ず れ の 遺 伝 子 も、 T 7 プ ロ モ ー タ 一 に よ っ て

制 御 さ れ て い る。 t y r A き- a r o Gき- t ktA-ppsA/pC0LADue t- 1 お よ び 60MT-4' 0MT-

CNMT/pACYC 18 4 は 、 各 々 が 、 そ れ ぞ れ ppsA お よ び CNMT 遺 伝 子 の 下 流 に位

置 す る T 7 タ 一 ミ ネ 一 タ 一 配 列 を有 す る。 NCS-0RF378-TYR-D0DC-optMA0/pET-2

1d は 2 つ の T 7 タ ー ミ ネ ー タ 一 配 列 を有 して お り、 1 つ は NCS の 下 流 に位 置

し、 も う 1 つ は optMAO の 下 流 に位 置 して い る。 略 号 ：T7p 、 Τ 7 プ ロ モ ー タ

- ； T 7 t 、 T 7 タ ー ミ ネ ー タ 一 ； Ka n カ ナ マ イ シ ン耐 性 遺 伝 子 ； A mp アン

ピシ リ ン耐 性 遺 伝 子 ； C m「
、 ク ロラム フ ヱニ コ一ル 耐 性 遺 伝 子。
[ 図 9 ] 炭 素 源 と して グ リセ ロ ー ル を 含 む 培 地 に お け る （S)- レ チ ク リ ン 生 産 の 経

時変化 （左 軸 、 実 線 ） 。 L- チ ロ シ ン を 過 剰 生 産 し、 レ チ ク リ ン 生 合 成 遺 伝 子

を発 現 す る大腸 菌 株 （"組換 え生産 株 A " ) を、 50 M IPTG を用 いて （丸 ）

ま た は IPTG を 用 い ず に （四 角 ） 培 養 した 。 各 々 の 場 合 の 細 胞 増 殖 （右 軸 、

破 線 、 記 号 は （S)- レ チ ク リ ン 生 産 と 同 じ対 応 関 係 ） を 600nm にお ける吸光度

と して 示 す 。 実 験 を 3 回 繰 り返 し、 本 質 的 に 同 じ結 果 を 得 た 。 1 つ の 代 表 的

な 実 験 か らの デ ー タ を 図 に 示 す 。

[ 図 10 ] 本 発 明 の 組 換 え 大 腸 菌 株 を 培 養 した 培 地 か ら の （S)- レ チ ク リ ン の 迅 速

な 精 製 。 精 製 前 （a) お よ び 精 製 後 （b) の 培 地 を 、 MS に よ っ て イ オ ン ス キ ャ ン モ

— ド （m/z = 130-530) で 解 析 した 。 m/z = 330 は 、 （S)- レ チ ク リ ン の ピ 一

ク を示 す。

[ 図 1 1] (S)- レ チ ク リ ン 生 産 の た め に 用 い た プ ラ ス ミ ドの 模 式 図 。 pET-21 d は

、 NCS 、 RsTYR 、 DODC お よ び optMAO 遺 伝 子 を 含 む 。 い ず れ の 遺 伝 子 も 、 T7 プ

口 モ 一 タ 一 に よ っ て 制 御 さ れ て い る 。 NCS-RsTYR-D0DC-optMA0/pET-21 d は 2

つ の T 7 タ ー ミ ネ ー タ 一 配 列 を 有 して お り、 1 つ は NCS の 下 流 に 位 置 し、 も

う 1 つ は optMAO の 下 流 に 位 置 して い る 。 略 号 ： RsTYR 、 Ra Lston i a s o Lan

acearum 由 来 の TYR ； T7p 、 Τ7 プ ロ モ ー タ 一 ； T7t 、 T 7 タ 一 ミ ネ 一 タ 一 ； Amp r

、 ア ン ピシ リン耐性 遺伝 子。

[ 図 12 ] 炭 素 源 と して グ リセ ロ ー ル を 含 む 培 地 に お け る （S)- レ チ ク リ ン 生 産 の

経時変化 （左 車由、 実 線 ） o S t reptomyces castaneog Lob i sporus 由 来 の TYR お よ

び ア ダ プ タ 一 タ ン パ ク 質 0RF378 を 用 い た レ チ ク リ ン 生 産 株 （"組換 え生産 株

A " ) ( 四 角 ） 、 お よ び Ra Lston i a s o Lanacearum 由 来 の TYR を 用 い た レ チ ク リ

ン生産株 （"組換 え生産 株 C " ) ( 丸 印 ） を 培 養 した 。 矢 印 は 、 そ の 時 点 で I

PTG (50 M) を 添 加 した こ と を 示 す 。 細 胞 増 殖 （右 軸 、 破 線 、 記 号 は （S) - レ

チ ク リ ン 生 産 と 同 じ対 応 関 係 ） を 600nm に お け る 吸 光 度 と して 示 す 。 エ ラ 一

バ 一 は 、 3 つ の 独 立 した 実 験 の 標 準 偏 差 を 示 す 。

発 明 を実 施 す る た め の 形 態

本 発 明 は 、 L- チ ロ シ ン を 生 産 す る 代 謝 経 路 を 有 す る イ ソ キ ノ リ ン ア ル カ ロ
 ィ ド非 生 産 性 細 胞 に 、 チ ロ シ ナ 一 ゼ （以 下 、 TYR と も 称 す る ）お よ び そ の ァ ダ

プ タ 一 タ ン パ ク 質 、 L-D0PA 特 異 的 デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ （以 下 、 D0DC と も称 す

る ）、 モ ノ ア ミ ン 才 キ シ ダ 一 ゼ （MA0) 、 ノ ル コ ク ラ ウ リ ン シ ン タ 一 ゼ （NCS) 、 ノ

ル コ ク ラ ウ リン 6-0- メ チ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ （60MT) 、 コ ク ラ ウ リ ン - N - メ

チ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ （CNMT) な ら び に 3' - ヒ ド ロ キ シ -N- メ チ ル コ ク ラ ウ リ

ン -4' -0- メ チ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ (4' 0MT) か らな る 群 よ り選 択 さ れ る 少 な く

と も 1 つ の タ ン パ ク 質 を コ 一 ドす る 少 な く と も 1 つ の 遺 伝 子 が 導 入 さ れ て な

る 、 チ ロ シ ナ 一 ゼ （TYR) お よ び そ の ア ダ プ タ 一 タ ン パ ク 質 、 L-D0PA 特 異 的 デ カ

ル ポ キ シ ラ 一 ゼ （D0DC) 、 モ ノ ア ミ ン 才 キ シ ダ 一 ゼ （MA0) 、 ノ ル コ ク ラ ウ リ ン シ

ン タ 一 ゼ （NCS) 、 ノ ル コ ク ラ ウ リ ン 6-0- メ チ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ （60MT) 、

コ ク ラ ウ リ ン -N- メ チ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ （CNMT) な ら び に 3' - ヒ ドロ キ シ - N

- メ チ ル コ ク ラ ウ リ ン -4' -0- メ チ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ （4' 0MT) を発 現 す る組

換 え宿 主 細 胞 を提 供 す る工 程 、 お よび

該 組 換 え 宿 主 細 胞 を 、 炭 素 源 と し て グ ル コ ー ス 、 フ ル ク 卜一 ス 、 ガ ラ ク 卜

— ス 、 ス ク ロ ー ス 、 ラ ク 卜一 ス お よ び マ ル ト一 ス か ら な る 群 よ り 選 択 さ れ る

種 以 上 の糖 お よび / ま た は グ リセ 口 一 ル を 含 む 培 地 に お い て 培 養 す る 工 程

を 含 む 、 （S) - レ チ ク リ ン を 生 産 す る 方 法 を 提 供 す る 。

[0029] か か る方 法 に よれ ば、 特 定 の 酵 素 を発 現 す る組 換 え宿 主 細 胞 を、 微 生 物 の

培 養 に 通 常 用 い られ る 培 地 に お い て 培 養 す る こ と に よ り、 ダ ル コ ー ス お よ び

グ リ セ ロ ー ル 等 の 安 価 で 入 手 容 易 な 基 質 か ら 、 イ ン ビ ボ に お い て （S) - レ チ ク

リン を効 率 的 に生 産 す る こ とが 可 能 とな る。 好 ま し くは、 本 発 明 の 方 法 に よ

つ て 得 ら れ る レ チ ク リ ン は 、 実 質 的 に （R) - レ チ ク リ ン を 含 ま な い も の で あ る

[0030] 本 発 明 の 方 法 に お い て 用 い る 組 換 え 宿 主 細 胞 は 、 t y r R遺 伝 子 を 有 し な い か

ま た は そ の 機 能 が 欠 損 し て い る も の で あ る こ と が 好 ま し い 。 t y r R遺 伝 子 の 産

物 は 芳 香 族 ア ミ ノ酸 の 生 合 成 に 関 与 す る 遺 伝 子 の 発 現 を抑 制 す る機 能 を有 し

て い る た め 、 例 え ば t y r R遺 伝 子 を 有 し な い 宿 主 細 胞 を 用 い る こ と や t y r R遺 伝
 子 の 機 能 を 喪 失 さ せ る こ と に よ り、 本 発 明 の 方 法 に お い て 再 構 築 さ れ る 生 合

成 経 路 に お い て 重 要 な L- チ ロシ ンの 生 合 成 に対 す る抑 制 を解 除 す る こ とが で

き る。

[003 1] 本 発 明 の 方 法 に お い て 用 い る 組 換 え 宿 主 細 胞 は 、 フ ィ ー ドバ ッ ク 阻 害 耐 性

の 3- デ 才 キ シ -D- ァ ラ ピ ノ - ヘ プ ッ ロ ソ ン 酸 - 7 - リ ン 酸 シ ン タ 一 ゼ （以 下 、 f b r -

DAHPS と も 称 す る ）お よ び / ま た は フ ィ 一 ドバ ッ ク 阻 害 耐 性 の コ リ ス ミ 酸 厶 タ

— ゼ / プ レ フ エ ナ 一 卜デ ヒ ド ロ ゲ ナ 一 ゼ （以 下 、 f b r-CM/PDH と も 称 す る ）を 発

現 す る も の で あ る こ と が 好 ま しい 。 か か る 酵 素 の 発 現 に よ り、 該 組 換 え 宿 主

細 胞 に お い て L- チ ロ シ ン の 生 産 効 率 が 向 上 し 、 （S) - レ チ ク リ ン の 収 量 を 増 大

させ る こ とが で き る。

[0032] 本 発 明 の 方 法 に お い て 用 い る 組 換 え 宿 主 細 胞 は 、 ト ラ ン ス ケ ト ラ 一 ゼ （以 下

、 TKT と も 称 す る ）お よ び / ま た は ホ ス ホ エ ノ 一 ル ビル ビ ン酸 シ ン テ タ 一 ゼ （

以 下 、 PEPS と も 称 す る ）を 過 剰 発 現 す る も の で あ る こ と が 好 ま し い 。 か か る

酵 素 の 過 剰 発 現 に よ り、 該 組 換 え 宿 主 細 胞 に お い て シ キ ミ酸 経 路 の 出 発 物 質

で あ る エ リ 卜 ロ ー ス - 4 - リ ン 酸 （E4P) お よ び / ま た は ホ ス ホ エ ノ 一 ル ビル ビ ン

酸 （PEP) の 量 が 増 加 し 、 L - チ ロ シ ン 生 産 量 の 増 大 を 経 て 、 （S) - レ チ ク リ ン の 収

量 を増 大 させ る こ とが で き る。

[0033] した が っ て 本 発 明 は 、 L- チ ロ シ ン を 生 産 す る 代 謝 経 路 を 有 す る イ ソ キ ノ リ

ン ァ ル カ ロ イ ド非 生 産 性 細 胞 に 、 フ ィ 一 ドバ ッ ク 阻 害 耐 性 の 3- デ 才 キ シ -D-

ァ ラ ピ ノ - ヘ プ ッ ロ ソ ン 酸 - 7 - リ ン 酸 シ ン タ 一 ゼ （fb r-DAHPS ) 、 フ ィ 一 ドバ ッ ク

阻 害 耐 性 の コ リ ス ミ 酸 厶 タ 一 ゼ / プ レ フ エ ナ 一 卜デ ヒ ド ロ ゲ ナ 一 ゼ （fb r-CM/PD

H) 、 ト ラ ン ス ケ ト ラ 一 ゼ （TKT) 、 ホ ス ホ エ ノ 一 ル ビ ル ビ ン 酸 シ ン テ タ 一 ゼ （PEP

S ) 、 チ ロ シ ナ 一 ゼ （TYR) お よ び そ の ア ダ プ タ 一 タ ン パ ク 質 、 L-D0PA 特 異 的 デ カ

ル ポ キ シ ラ 一 ゼ （D0DC) 、 モ ノ ア ミ ン 才 キ シ ダ 一 ゼ （MA0) 、 ノ ル コ ク ラ ウ リ ン シ

ン タ 一 ゼ （NCS) 、 ノ ル コ ク ラ ウ リ ン 6-0- メ チ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ （60MT) 、

コ ク ラ ウ リ ン -N- メ チ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ （CNMT) な ら び に 3' - ヒ ドロ キ シ - N

- メ チ ル コ ク ラ ウ リ ン -4' -0- メ チ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ （4' 0MT) か らな る群 よ

り 選 択 さ れ る 少 な く と も 1 つ の タ ン パ ク 質 を コ 一 ドす る 少 な く と も 1 つ の 遺
伝 子 が 導 入 さ れ て な る 組 換 え 宿 主 細 胞 で あ っ て 、 フ ィ一 ドバ ッ ク 阻 害 耐 性 の

3- デ 才 キ シ -D- ァ ラ ピ ノ- ヘ プ ッ 口 ソ ン酸 -7- リ ン酸 シ ン タ 一 ゼ （fbr-DAHPS ) 、

フ ィ一 ドバ ッ ク 阻 害 耐 性 の コ リス ミ酸 厶 タ 一 ゼ / プ レ フ エ ナ 一 卜デ ヒ ドロ ゲ ナ

— ゼ （fbr-CM/PDH ) 、 トラ ン ス ケ トラ 一 ゼ （
TKT ) 、 ホ ス ホ エ ノ 一 ル ビル ビ ン酸 シ

ンテ タ 一 ゼ （
PEPS ) 、 チ ロ シ ナ 一 ゼ （
TYR) お よ び そ の ア ダ プ タ 一 タ ンパ ク 質 、 L-

D0PA 特 異 的 デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ （
D0DC ) 、 モ ノ ア ミ ン才 キ シ ダ 一 ゼ （
MA0 ) 、 ノル

コ ク ラ ウ リンシ ン タ 一 ゼ （
NCS ) 、 ノル コ ク ラ ウ リ ン 6-0- メ チ ル トラ ン ス フ エ

ラ一ゼ （
60MT ) 、 コ ク ラ ウ リ ン- N- メ チ ル トラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ （
CNMT) な らび に 3

' - ヒ ドロ キ シ -N- メ チ ル コ ク ラ ウ リ ン-4' -0- メ チ ル トラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ （

4' 0MT

) を 発 現 し、 か つ 、 tyrR 遺 伝 子 を有 しな い か ま た は そ の 機 能 が 欠 損 して い る 組

換 え 宿 主 細 胞 を提 供 す る 工 程 、 お よ び

該 組 換 え 宿 主 細 胞 を、 炭 素 源 と して グル コ ー ス 、 フル ク 卜一 ス 、 ガ ラ ク 卜

— ス 、 ス ク ロ ー ス 、 ラ ク 卜一 ス お よ び マ ル ト一 ス か らな る群 よ り選 択 さ れ る

種 以 上 の糖 お よび / ま た は グ リセ 口 一 ル を 含 む 培 地 に お い て 培 養 す る 工 程

を含 む、 （
S)- レチ ク リ ン を 生 産 す る 方 法 を さ ら に提 供 す る。

ま た 、 本 発 明 は 、 L- チ ロ シ ン を 生 産 す る代 謝 経 路 を有 す る イ ソ キ ノ リ ン ァ

ル カ ロ イ ド非 生 産 性 細 胞 に、 fbr-DAHPS 、 fbr-CM/PDH 、 TYR お よ び そ の ァ ダ プ

タ 一 タ ンパ ク 質 、 D0DC 、 MAO, NCS 、 60MT 、 CNMT な らび に 4' OMT か らな る群

よ り選 択 さ れ る 少 な く と も 1 つ の タ ンパ ク 質 を コ 一 ドす る 少 な く と も 1 つ の

遺 伝 子 が 導 入 さ れ 、 か つ 、 TKT お よ び PEPS を コ ー ドす る 遺 伝 子 が 導 入 さ れ て

な る 組 換 え 宿 主 細 胞 で あ っ て 、 fbr-DAHPS 、 fbr-CM/PDH 、 TYR お よ び そ の ァ ダ

プ タ 一 タ ンパ ク 質 、 D0DC 、 MAO, NCS 、 60MT 、 CNMT な らび に 4' OMT を発 現 し

、 TKT お よ び PEPS を 過 剰 発 現 し、 か つ 、 tyrR 遺 伝 子 を有 しな い か ま た は そ の

機 能 が 欠 損 して い る 組 換 え 宿 主 細 胞 を提 供 す る 工 程 、 お よ び

該 組 換 え 宿 主 細 胞 を、 炭 素 源 と して グル コ ー ス 、 フル ク 卜一 ス 、 ガ ラ ク 卜

— ス 、 ス ク ロ ー ス 、 ラ ク 卜一 ス お よ び マ ル ト一 ス か らな る群 よ り選 択 さ れ る

種 以 上 の糖 お よび / ま た は グ リセ 口 一 ル を 含 む 培 地 に お い て 培 養 す る 工 程
 を含 む、 （
S)- レチ ク リ ン を 生 産 す る 方 法 を提 供 す る。

[0035] ま た 、 本 発 明 に よ れ ば 、 レチ ク リ ン を 出 発 物 質 と して 作 用 す る イ ソ キ ノ リ

ン ァ ル カ ロ イ ド生 合 成 酵 素 を コ 一 ドす る 遺 伝 子 を 組 換 え 宿 主 細 胞 に さ ら に導

入 す る こ と に よ っ て 、 安 価 で 入 手 容 易 な 基 質 か ら、 イ ン ビボ に お い て イ ソ キ

ノ リ ン ァ ル カ ロ イ ドを 生 産 す る こ と も 可 能 で あ る。

[0036] す な わ ち 、 本 発 明 は 、 L- チ ロ シ ン を 生 産 す る代 謝 経 路 を有 す る イ ソ キ ノ リ

ン ア ル カ ロ イ ド非 生 産 性 細 胞 に、 TYR お よ び そ の ア ダ プ タ 一 タ ンパ ク 質 、 D0DC

、 MA0 、 NCS 、 60MT 、 CNMT 、 4' OMT な らび に レチ ク リ ン を 出 発 物 質 と して 作 用

す る イ ソ キ ノ リ ン ァ ル カ ロ イ ド生 合 成 酵 素 か らな る群 よ り選 択 さ れ る 少 な く

と も 1 つ の タ ンパ ク 質 を コ 一 ドす る 少 な く と も 1 つ の 遺 伝 子 が 導 入 さ れ て な

る、 TYR お よ び そ の ア ダ プ タ 一 タ ンパ ク 質 、 D0DC 、 MAO, NCS 、 60MT 、 CNMT 、 4'

OMT な らび に レチ ク リ ン を 出 発 物 質 と して 作 用 す る イ ソ キ ノ リ ン ァ ル カ ロ イ

ド生 合 成 酵 素 を 発 現 す る 組 換 え 宿 主 細 胞 を提 供 す る 工 程 、 お よ び

該 組 換 え 宿 主 細 胞 を、 炭 素 源 と して グル コ ー ス 、 フル ク 卜一 ス 、 ガ ラ ク 卜

— ス 、 ス ク ロ ー ス 、 ラ ク 卜一 ス お よ び マ ル ト一 ス か らな る群 よ り選 択 さ れ る

種 以 上 の糖 お よび / ま た は グ リセ 口 一 ル を 含 む 培 地 に お い て 培 養 す る 工 程

を 含 む 、 イ ソ キ ノ リ ン ア ル 力 ロ イ ドを 生 産 す る 方 法 を提 供 す る。

[0037] レチ ク リ ン を 出 発 物 質 と して 作 用 す る イ ソ キ ノ リ ン ァ ル カ ロ イ ド生 合 成 酵

素 の 例 と して は コ リツ べ リ ン シ ン タ 一 ゼ （
以 下 、 CYP80G2 と も称 す る ） お よ

び ベ ル べ リ ン架 橋 酵 素 （
以 下 、 BBE と も称 す る ） が 挙 げ られ 、 CYP80G2 を 発

現 さ せ る こ と に よ り コ リッ ベ リ ン を介 して マ グ ノ フ ロ リ ン を 合 成 す る こ と が

で き、 BBE を 発 現 さ せ る こ と に よ り プ ロ 卜ベ ル べ リ ン ア ル カ ロ イ ドで あ る ス

コ ウ レ リ ン を 合 成 す る こ と が で き る （図 5 ) 。 ま た 、 CYP80G2 を 発 現 さ せ る

場 合 に は 、 NADPH- シ 卜ク ロ 一 厶 P450 レダ ク タ 一 ゼ を 共 に 発 現 さ せ る の が 好 ま

しい 。

[0038] ま た 、 本 発 明 は 、 L- チ ロ シ ン を 生 産 す る代 謝 経 路 を有 す る イ ソ キ ノ リ ン ァ
 ル カ ロ イ ド非 生 産 性 細 胞 に、 TYR お よ び そ の ア ダ プ タ 一 タ ンパ ク 質 、 D0DC 、 MA

0 、 NCS 、 60MT 、 CNMT な らび に 4' OMT か らな る群 よ り選 択 さ れ る 少 な く と も

1 つ の タ ンパ ク 質 を コ 一 ドす る 少 な く と も 1 つ の 遺 伝 子 が 導 入 さ れ て な る、 T

YRお よ び そ の ア ダ プ タ 一 タ ンパ ク 質 、 D0DC 、 MAO, NCS 、 60MT 、 CNMT な らび に

4' OMT を 発 現 す る 組 換 え 宿 主 細 胞 を提 供 す る。

[0039] 本 発 明 の 組 換 え 宿 主 細 胞 は 、 以 下 の （i ) か ら （i i i ) の う ち 1 以 上 の 性 質 を有

して い る こ と が 好 ま しい ：

( i ) t y R遺 伝 子 を有 しな い か ま た は そ の 機 能 が 欠 損 して い る も の で あ る こ

と、

( i i ) fbr-DAHPS お よび / ま た は fbr-CM/PDH を 発 現 す る も の で あ る こ と、

( i i i ) TKT お よ び / ま た は PEPS を 過 剰 発 現 す る も の で あ る こ と。

これ らの 性 質 を有 す る こ と に よ り、 該 組 換 え 宿 主 細 胞 に お け る L- チ ロ シ ン

の 生 産 性 が 向 上 し、 （
S)- レチ ク リ ン な い し他 の イ ソ キ ノ リ ン ア ル 力 ロ イ ドの

収 量 を増 大 さ せ る こ と が で き る。

[0040] した が っ て 本 発 明 は 、 L- チ ロ シ ン を 生 産 す る代 謝 経 路 を有 す る イ ソ キ ノ リ

ン ア ル カ ロ イ ド非 生 産 性 細 胞 に、 fbr-DAHPS 、 fbr-CM/PDH 、 TKT 、 PEPS, TYR お

よ び そ の ア ダ プ タ 一 タ ンパ ク 質 、 D0DC 、 MAO, NCS 、 60MT 、 CNMT な らび に 4' 0

MT か らな る群 よ り選 択 さ れ る 少 な く と も 1 つ の タ ンパ ク 質 を コ 一 ドす る 少 な

く と も 1 つ の 遺 伝 子 が 導 入 さ れ て な る 組 換 え 宿 主 細 胞 で あ っ て 、 fbr-DAHPS 、

fbr-CM/PDH 、 TKT 、 PEPS, TYR お よ び そ の ア ダ プ タ 一 タ ンパ ク 質 、 D0DC 、 MA0 、

NCS 、 60MT 、 CNMT な らび に 4' OMT を 発 現 し、 か つ 、 tyrR 遺 伝 子 を有 しな い か

ま た は そ の 機 能 が 欠 損 して い る 組 換 え 宿 主 細 胞 を さ ら に提 供 す る。

[0041 ] ま た 、 本 発 明 は 、 L- チ ロ シ ン を 生 産 す る代 謝 経 路 を有 す る イ ソ キ ノ リ ン ァ

ル カ ロ イ ド非 生 産 性 細 胞 に、 fbr-DAHPS 、 fbr-CM/PDH 、 TYR お よ び そ の ァ ダ プ

タ 一 タ ンパ ク 質 、 D0DC 、 MAO, NCS 、 60MT 、 CNMT な らび に 4' OMT か らな る群

よ り選 択 さ れ る 少 な く と も 1 つ の タ ンパ ク 質 を コ 一 ドす る 少 な く と も 1 つ の

遺 伝 子 が 導 入 さ れ 、 か つ 、 TKT お よ び PEPS を コ ー ドす る 遺 伝 子 が 導 入 さ れ て

な る 組 換 え 宿 主 細 胞 で あ っ て 、 fbr-DAHPS 、 fbr-CM/PDH 、 TYR お よ び そ の ァ ダ

 プ タ 一 タ ン パ ク 質 、 D0DC 、 MAO, NCS 、 60MT 、 CNMT な ら び に 4 ' OMT を発 現 し

、 TKT お よ び PEPS を 過 剰 発 現 し、 か つ 、 t y r R 遺 伝 子 を 有 し な い か ま た は そ の

機 能 が 欠 損 して い る 組 換 え 宿 主 細 胞 を 提 供 す る 。

[0042] また、 本 発 明 に お い て は、 上 記 の 「TYR お よ び そ の ア ダ プ タ 一 タ ンパ ク質 」

に 代 え て 、 そ の 活 性 を 示 す た め に ア ダ プ タ 一 タ ン パ ク 質 を 必 要 と し な い TYR 、

例 え ば R a Ls t o n i a s o Lanacea r u m由 来 の TYR を 用 い る こ と も で き る 。 し た が っ て

、 本 発 明 は 、 L- チ ロ シ ン を 生 産 す る 代 謝 経 路 を 有 す る イ ソ キ ノ リ ン ア ル カ ロ

ィ ド非 生 産 性 細 胞 に 、 R a Ls t o n i a s o Lanacea r u m由 来 のチ ロシナ一ゼ （以 下 、 R

s TY と も 称 す る ） 、 D0DC 、 MAO, NCS 、 60MT 、 CNMT な ら び に 4 ' OMT か ら な る 群

よ り 選 択 さ れ る 少 な く と も 1 つ の タ ン パ ク 質 を コ 一 ドす る 少 な く と も 1 つ の

遺 伝 子 が 導 入 さ れ て な る 、 RsTYR 、 D0DC 、 MAO, NCS 、 60MT 、 CNMT な らび に4 ' OM

T を発 現 す る組 換 え宿 主 細 胞 を提 供 す る工 程 、 お よび

該 組 換 え 宿 主 細 胞 を 、 炭 素 源 と し て グ ル コ ー ス 、 フ ル ク 卜一 ス 、 ガ ラ ク 卜

— ス 、 ス ク ロ ー ス 、 ラ ク 卜一 ス お よ び マ ル ト一 ス か ら な る 群 よ り 選 択 さ れ る

種 以上 の糖 お よび/ ま た は グ リセ 口 一 ル を 含 む 培 地 に お い て 培 養 す る 工 程

を 含 む 、 （S) - レ チ ク リ ン を 生 産 す る 方 法 を さ ら に 提 供 す る 。

[0043] 同 様 に 、 本 明 細 書 に 記 載 さ れ る 様 々 な 本 発 明 の （S) - レ チ ク リ ン を 生 産 す る

方法 お よび組換 え宿 主細胞 において 「TYR お よ び そ の ア ダ プ タ 一 タ ンパ ク質 」

に 代 え て R a Ls t o n i a s o Lanacea r u m由 来 の TYR (RsTYR) を用 い る態 様 も、 本 発

明 の 好 ま しい 態 様 と して 提 供 さ れ る 。

[0044] な お 、 本 明 細 書 に お い て 、 RsTYR と の 用 語 は R a Ls t o n i a s o Lanacea r u m由 来 の

TYR を意 味 す るが、 単 にチ ロシ ナ 一 ゼ （TYR) と 表 記 した 場 合 に は 、 そ の 由 来

に 関 わ ら ず あ ら ゆ る TYR が 該 用 語 に 包 含 さ れ る も の と す る 。

[0045] こ こ で 、 ベ ン ジ ル イ ソ キ ノ リ ン ア ル カ ロ イ ドを 生 産 す る 植 物 に お け る 、 L -

チ ロ シ ン か ら （S) - レ チ ク リ ン に 至 る 生 合 成 経 路 を 図 4 に 示 す 。

[0046] — 方 、 本 発 明 の 方 法 に お い て 再 構 築 さ れ る 生 合 成 経 路 は 、 MA0 を用 い る こ

と に よ っ て ド一 パ ミ ン か ら 3 , 4-DHPAA を 合 成 し、 該 3 , 4-DHPAA と ド一 パ ミ
 ン を NCS の 作 用 を 介 し て カ ッ プ リ ン グ さ せ る こ と に よ り （S) - ノ ル ラ ウ ダ ノ

ソ リンを生成 させ る もの で あ る （図 1 ) 。 こ れ に よ り、 植 物 の 生 合 成 経 路 に

お け る N- メ チ ル コ ク ラ ウ リ ン 3 ' - ヒ ド ロ キ シ ラ 一 ゼ （以 下 、 CYP80B と も称

す る） に よ る水 酸 化 の工 程 （図 4 参 照 ） を 省 略 す る こ と が で き る 。

[0047] し か し、 芳 香 族 L - ア ミ ノ 酸 デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ が 本 発 明 の 方 法 に お い て 再

構 築 さ れ る 生 合 成 経 路 中 に 存 在 す る と、 該 芳 香 族 L- ア ミ ノ酸 デ カ ル ボ キ シ ラ

— ゼ の 作 用 に よ っ て 芳 香 族 L- ア ミ ノ酸 が 脱 炭 酸 さ れ て 芳 香 族 ァ ミ ン が 生 成 し

、 こ れ が MA0 と 反 応 して し ま う た め 好 ま し く な い 。 特 に 、 L - チ ロ シ ン が 脱 炭

酸 さ れ る と チ ラ ミ ン が 生 成 し、 MA0 は ド一 パ ミ ン よ り も チ ラ ミ ン に 対 し高 い

選 択 性 を示 す （す な わ ち チ ラ ミ ン と 優 先 的 に 反 応 す る ） た め 、 本 発 明 の 方 法

が 意 図 し な い 4-HPAA が 生 成 さ れ て し ま う 。 該 4-HPAA は NCS の作用 によ り

ド一 パ ミ ン と カ ッ プ リ ン グ し、 （S) - ノ ル コ ク ラ ウ リ ン が 生 成 さ れ る 。 こ の 場

合 、 該 （S) - ノ ル コ ク ラ ウ リ ン か ら （S) - レ チ ク リ ン を 得 る た め に は 、 60MT 、 CNM

丁、 4 ' 0MT に 加 え て CYP80B を用 い る必 要 が あ るが （図 4 ) 、 該 CYP80B はチ

卜ク ロ 一 厶 P450 酵 素 で あ る た め 、 微 生 物 内 で は う ま く機 能 し な い こ と が 多 い

[0048] そ こ で 、 本 発 明 の 方 法 に お い て は 、 L-D0PA 特 異 的 デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ （D0DC

) を 宿 主 細 胞 に 導 入 し て 発 現 さ せ る 。 具 体 的 に は 、 本 発 明 の 方 法 は 、 （i ) ベ ン

ジ ル イ ソ キ ノ リ ン ア ル 力 ロ イ ド生 合 成 経 路 の 再 構 築 に お い て 、 L - チ ロ シ ン を

脱 炭 酸 す る 芳 香 族 L- ア ミ ノ酸 デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ を 用 い る こ と を 避 け 、 そ の

代 わ りに （i i ) チ ロ シ ナ 一 ゼ （TYR) ま た は チ ロ シ ナ 一 ゼ （TYR) お よ び そ の ァ ダ

プ タ 一 タ ン パ ク 質 を 発 現 さ せ て L - チ ロ シ ン か ら L-D0PA へ の変 換 経 路 を作 り

、 さ らに （ι ι ι ) L-D0PA 特 異 的 デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ （D0DC) を 発 現 さ せ て L-D0P

A か ら ド一 パ ミ ン へ の 変 換 経 路 を 作 る こ と を 特 徴 と す る 。

[0049] した が っ て 、 本 発 明 の 組 換 え 宿 主 細 胞 お よ び 本 発 明 の 方 法 に お い て 用 い る

組 換 え 宿 主 細 胞 は 、 L-D0PA 特 異 的 デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ 以 外 の 芳 香 族 L- ァ ミ ノ

酸 デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ を コ ー ドす る 遺 伝 子 が 導 入 さ れ て い な い も の で あ る こ

と が 好 ま しい 。
[0050] これ に よ り、 宿 主 細 胞 へ 導 入 す る 遺 伝 子 に コ ー ドさ れ る 酵 素 に よ っ て L- チ

口 シ ン か らチ ラ ミ ン が 生 成 さ れ る こ と は 無 く、 そ の 一 方 で TYR ま た は TYR お

よ び そ の ア ダ プ タ 一 タ ンパ ク 質 な らび に D0DC の 発 現 に よ っ て ド一 パ ミ ン が

高 い 効 率 で 生 産 さ れ る。 そ の 結 果 、 ド一 パ ミ ン と 3, 4-DHPAA と の カ ッ プ リ ン

グによる（
S)- ノル ラ ウ ダ ノ ソ リ ン の 生 成 を 経 て （
S)- レチ ク リ ン に 至 る 経 路 へ

と代 謝 フ ロ ー を効 率 的 に 流 す こ と が 可 能 と な る （図 1 ) 。

[0051 ] な お 、 植 物 お よ び 動 物 に お い て は 、 L-D0PA は 主 に チ ロ シ ン ヒ ドロ キ シ ラ ー

ゼ （
T H、 EC 1. 14. 16. 2) に よ っ て L- チ ロ シ ン か ら合 成 さ れ 、 か か る 反 応 に は

補 因 子 と して テ トラ ヒ ドロ ビ才 プ テ リ ン （
BH4) が 必 要 で あ る。 しか し、 本 発 明

の 方 法 に お い て 好 適 に 用 い られ る 大 腸 菌 細 胞 は 、 該 テ トラ ヒ ドロ ビ才 プ テ リ

ン を 合 成 す る こ と が で き な い 。 そ こ で 、 本 発 明 の 方 法 に お い て は 、 L- チ ロ シ

ン か ら L-D0PA へ の 変 換 の た め に、 銅 お よ び ア ダ プ タ 一 タ ンパ ク 質 （
例 え ば OR

F378) 以 外 の 補 因 子 を 必 要 と しな い 、 細 菌 の チ ロ シ ナ 一 ゼ （
TYR 、 EC 1. 14. 18. 1

) を 用 い る こ と が 好 ま しい 。 ま た 、 ア ダ プ タ 一 タ ンパ ク 質 を 必 要 と しな い Ra Ls

ton i a s o Lanacearum 由 来 の TYR も 好 適 に 用 い る こ と が で き る。

[0052] 本 発 明 に係 る 組 換 え 宿 主 細 胞 は 、 通 常 、 L- チ ロ シ ン を 生 産 す る代 謝 経 路 を

有 す る イ ソ キ ノ リ ン ァ ル カ ロ イ ド非 生 産 性 細 胞 に、 TYR ま た は TYR お よ び そ の

ア ダ プ タ 一 タ ンパ ク 質 、 D0DC 、 MA0 、 NCS 、 60MT 、 CNMT な らび に 4' OMT から

な る群 よ り選 択 さ れ る 少 な く と も 1 つ の タ ンパ ク 質 を コ 一 ドす る 少 な く と も

1 つ の 遺 伝 子 を導 入 す る こ と に よ っ て 得 る こ と が で き る。

[0053] 例 え ば 、 L- チ ロ シ ン を 生 産 す る代 謝 経 路 を有 す る イ ソ キ ノ リ ン ア ル 力 ロ イ

ド非 生 産 性 細 胞 が 、 「
TYR ま た は TYR お よ び そ の ア ダ プ タ 一 タ ンパ ク 質 、 D0DC

、 MA0 、 NCS 、 60MT 、 CNMT な らび に 4' 0MT 」 か らな る群 よ り選 択 さ れ る タ ンパ

ク 質 を コ 一 ドす る 1 つ 以 上 の 遺 伝 子 を既 に有 して い る 場 合 に は 、 当 該 群 に 含

ま れ る他 の 全 て の 遺 伝 子 を 該 細 胞 に導 入 す る こ と に よ り、 「
TYR ま た は TYR お

よ び そ の ア ダ プ タ 一 タ ンパ ク 質 、 D0DC 、 MAO, NCS 、 60MT 、 CNMT な らび に 4' 0

MT の 全 て を 発 現 す る 本 発 明 の 組 換 え 宿 主 細 胞 を得 る こ と が で き る。 ま た 、 L

- チ ロ シ ン を 生 産 す る代 謝 経 路 を有 す る イ ソ キ ノ リ ン ア ル 力 ロ イ ド非 生 産 性 細
 胞 が 「TYR ま た は TYR お よ び そ の ア ダ プ タ 一 タ ン パ ク 質 、 D0DC 、 MAO, NCS 、 60M

丁、 CNMT な ら び に 4 ' 0MT 」 を コ ー ドす る 遺 伝 子 の い ず れ も 有 し て い な い 場 合

には、 「TYR ま た は TYR お よ び そ の ア ダ プ タ 一 タ ン パ ク 質 、 D0DC 、 MAO, NCS 、 6

0MT 、 CNMT な ら び に 4 ' 0MT 」 を コ ー ドす る 遺 伝 子 の 全 て を 該 細 胞 に 導 入 す る

こ と に よ り、 本 発 明 の 組 換 え 宿 主 細 胞 を 得 る こ と が で き る 。

[0054] 本 発 明 に係 る組 換 え宿 主 細 胞 を得 る た め に遺 伝 子 を導 入 す る宿 主 細 胞 は、 L

- チ ロ シ ン を 生 産 す る 代 謝 経 路 を 有 す る イ ソ キ ノ リ ン ア ル 力 ロ イ ド非 生 産 性 細

胞 で あ れ ば 特 に 限 定 さ れ な い が 、 よ り 効 率 的 な （S) - レ チ ク リ ン 生 産 の た め に

は 、 L- チ ロ シ ン を 大 量 に 生 産 す る 能 力 を 有 す る 宿 主 細 胞 で あ る こ と が 好 ま し

い。

[0055] L- チ ロシ ン を大量 に生産 す る能 力 は、 典 型 的 には、 以 下 の （1 ) ~ (3) か ら選

択 され る 1 以 上 の方 法 に よ って宿 主細胞 に付 与 す る こ とが で きる ：

( 1) 宿 主細胞 が有 す る t y r R遺 伝 子 の 機 能 喪 失 （Loss of f unc t i on) また は t

y r R遺 伝 子 の発現抑制 （こ こ に い う 機 能 喪 失 に は 、 完 全 な 機 能 喪 失 と 部 分 的 な

機 能喪 失 が含 まれ る） ；

(2) f b r-DAHPS お よび/ また は f b r-CM/PDH を コ 一 ドす る 1 以 上 の 遺 伝 子

の宿 主細胞 へ の導 入 お よび宿 主細胞 にお け る発現 ；

(3) TKT お よび/ また は PEPS を コ 一 ドす る 1 以 上 の 遺 伝 子 の 宿 主 細 胞 へ

の導 入 お よび宿 主細胞 にお け る過剰 発現 。

こ こ で 、 t y r R遺 伝 子 の 機 能 は 、 当 該 技 術 分 野 に お け る 公 知 の 手 段 、 例 え ば

相 同 組 換 え を 利 用 した ノ ッ ク イ ン / ノ ッ ク ァ ゥ 卜、 トラ ン ス ポ ゾ ン 等 の 転 移

因 子 の 転 移 を 利 用 した 遺 伝 子 破 壊 等 に よ っ て 喪 失 さ せ る こ と が で き る 。 ま た

、 t y r R遺 伝 子 の 発 現 は 、 当 該 技 術 分 野 に お け る 公 知 の 手 段 、 例 え ば コ サ ブ レ

ッ シ ヨ ン 、 ア ン チ セ ン ス 法 、 RNA i な ど に よ っ て 抑 制 す る こ と が で き る 。

[0056] t y r R遺 伝 子 を 有 しな い か ま た は そ の 機 能 が 欠 損 して い る 本 発 明 の 組 換 え 宿

主細胞 は、 例 え ば以 下 の方 法 に よ って得 る こ とが可 能 で あ る ：

( 1) t y r R遺 伝 子 を 有 しな い か ま た は そ の 機 能 が 欠 損 して い る 宿 主 細 胞 に 、 T

Y R等 の 必 要 な 遺 伝 子 を導 入 す る こ と、
 (2) 宿 主 細 胞 が 有 す る tyrR 遺 伝 子 の 機 能 を喪 失 さ せ た 後 、 該 宿 主 細 胞 に TYR

等 の 必 要 な 遺 伝 子 を導 入 す る こ と、 ま た は

(3) 宿 主 細 胞 に TYR 等 の 必 要 な 遺 伝 子 を導 入 した 後 、 該 宿 主 細 胞 が 有 す る t y

r R遺 伝 子 の 機 能 を喪 失 さ せ る こ と。

[0057] fbr-DAHPS お よび / ま た は fbr-CM/PDH を 発 現 して い る 細 胞 や 、 TKT お よ び

/ ま た は PEPS を 高 レベ ル で 発 現 して い る 細 胞 等 を、 本 発 明 に係 る 組 換 え 宿 主

細 胞 を得 る た め に 遺 伝 子 を導 入 す る 宿 主 細 胞 と して 用 い て も よ い 。

[0058] 「fbr-DAHPS 、 fbr-CM/PDH 、 TKT 、 PEPS, TYR ま た は TYR お よ び そ の ア ダ プ タ

— タ ンパ ク 質 、 D0DC 、 MAO, NCS 、 60MT 、 CNMT な らび に 4' 0MT 」 を 発 現 す る 本

発 明 の 組 換 え宿 主 細 胞 は、 例 え ば以 下 の 方 法 に よ って得 る こ とが 可 能 で あ る

( 1) これ ら全 て の 遺 伝 子 を 宿 主 細 胞 に導 入 す る こ と、 ま た は

(2) 「fbr-DAHPS 、 fbr-CM/PDH 、 TKT 、 PEPS, TYR ま た は TYR お よ び そ の ァ ダ

プ タ 一 タ ンパ ク 質 、 D0DC 、 MAO, NCS 、 60MT 、 CNMT な らび に 4' 0MT 」 か らな る

群 よ り選 択 さ れ る タ ンパ ク 質 を コ 一 ドす る 1 つ 以 上 の 遺 伝 子 を有 して い る 宿

主 細 胞 に、 当 該 群 に 含 ま れ る他 の 全 て の 遺 伝 子 を導 入 す る こ と。

[0059] 好 ま しい 態 様 に お い て 、 本 発 明 の 組 換 え 宿 主 細 胞 は 、 例 え ば 、 tyrR 遺 伝 子

の 機 能 を喪 失 さ せ た 宿 主 細 胞 に、 「fbr-DAHPS 、 fbr-CM/PDH 、 TKT 、 PEPS, TYR

ま た は TYR お よ び そ の ア ダ プ タ 一 タ ンパ ク 質 、 D0DC 、 MAO, NCS 、 60MT 、 CNMT

な らび に 4' 0MT 」 を コ ー ドす る 遺 伝 子 の 全 て を導 入 す る こ と に よ っ て 得 る こ

と が で き る。

[0060] ま た 、 上 記 の 方 法 に 限 らず 、 自然 に 生 じる 突 然 変 異 ま た は 公 知 の 突 然 変 異

誘 発 法 な ど に よ っ て L- チ ロ シ ン を 大 量 に 生 産 す る 能 力 を 獲 得 した 突 然 変 異 株

を、 本 発 明 に係 る 組 換 え 宿 主 細 胞 を得 る た め に 遺 伝 子 を導 入 す る 宿 主 細 胞 と

して 用 い て も よ い 。

[0061 ] 本 発 明 の 方 法 に お い て 遺 伝 子 を導 入 す る 宿 主 細 胞 と して は 、 ィ ソ キ ノ リ ン

ア ル カ ロ イ ド非 生 産 性 細 胞 で あ れ ば 特 に 限 定 さ れ な い が 、 例 え ば 大 腸 菌 、 酵

母 、 枯 草 菌 お よ び 糸 状 菌 な ど が 挙 げ られ 、 中 で も 大 腸 菌 が 特 に 好 ま しい 。
[0062] 宿主細胞 に遺伝子 を導入する場合、遺伝子 を直接導入 してもよいが、遺伝

子が組み込 まれたベ クタ一を宿主 に導入するのが好 ま しい。導入遺伝子はす

ベて同一のべ クタ一に組み込んでもよい し、 2 以上の別 々のべ クタ一に分 け

て組み込んでもよい。

[0063] 導入遺伝子 を組み込むベ クタ一 と しては、宿主細胞 内で 自律 的に複製 しう

るプラス ミ ドまたはファージか ら遺伝子組換 え用 と して構築 されたものが適

している。ベ クタ一は、導入 され る宿主細胞 に適合 した複製 開始起点、選択

可能なマ一力一、 プロモータ一等の発現制御配列、 および ター ミネータ一配

列 を含むものが好 ま しい。 プラス ミ ドベ クタ一 と しては、例 えば大腸菌 で発

現 させ る場合 は、 pET ベ クタ一系、 pQE ベ クタ一系、 pCo Ld ベ クタ一系な どが挙

げ られ、酵母 で発現 させ る場合 は、 pYES2 ベ クタ一系、 pYEX ベ クタ一系な どが

挙 げ られ る。

[0064] 選択可能なマ一力一 と しては、 アンピシ リン耐性遺伝子、 カナマイシ ン耐

性遺伝子、 ス トレブ トマイシ ン耐性遺伝子な どの抗生物質耐性遺伝子が挙 げ

られ る。

[0065] その内部 に組み込 まれた導入遺伝子 を発現 させ るベ クタ一 （

以下 において

、発現ベ クター と称 する）は、発現制御配列 を含むものが好 ま しい。発現制

御配列 とは、DNA 配列 に適切 に連結 した場合、宿主細胞 において、 そのDNA 配

列か らなる遺伝子の発現 を制御 すること、 すなわち、該DNA 配列のRNA への転

写 を誘導 および/ または促進すること、 あるいは抑制 することがで きる配列

を意味する。発現制御配列 には少な くともプロモーターが含 まれ る。 プロモ

—タ一は構成 的 プロモータ一であ っても誘導可能な プロモータ一であ っても

よい。 さ らに該発現べ クタ一には転写終結 シグナル、即 ちター ミネータ一配

列が含 まれ ることが好 ま しい。

[0066] 本発明に用いる発現べ クタ一は、上記遺伝子の末端 に、常法 によ り適 当な

制 限酵素認識部位 を付加することによ り作成 することが出来 る。

[0067] 発現ベ クターの宿主細胞への形質転換方法 と しては、従来公知の方法 を用

いることが出来、例 えば、塩化 カル シウム法、 エ レク トロボ レ一シ ヨン法、

 ヒ一 卜シ ョ ッ ク法 な ど が 挙 げ られ る。

[0068] 組 換 え 宿 主 細 胞 の 培 養 条 件 は 、 該 組 換 え 宿 主 細 胞 が 良 好 に 生 育 し、 か つ 、

目 的 と す る 一 群 の タ ンパ ク 質 、 例 え ば 「
TYR ま た は TYR お よ び そ の ア ダ プ タ 一

タ ンパ ク 質 、 D0DC 、 MA0 、 NCS 、 60MT 、 CNMT な らび に 4' 0MT 」 や 「fbr-DAHPS

、 fbr-CM/PDH 、 TKT 、 PEPS, TYR ま た は TYR お よ び そ の ア ダ プ タ 一 タ ンパ ク 質 、

D0DC 、 MAO, NCS 、 60MT 、 CNMT な らび に 4' 0MT 」 が 全 て 発 現 し、 そ れ ぞ れ の 機

能 また は酵 素 活 性 が 発 揮 され る条 件 で あ れ ば特 に 限 定 され な い。 具 体 的 に は

、 培 養 条 件 は 、 宿 主 の 栄 養 生 理 学 的 性 質 を考 慮 して 適 宜 選 択 す れ ば よ く、 通

常 、 液 体 培 養 で 行 わ れ る。

[0069] 組 換 え 宿 主 細 胞 の 培 養 に 用 い る 培 地 の 炭 素 源 と して は 、 宿 主 細 胞 が 利 用 で

き る物 質 で あ れ ば 特 に 限 定 さ れ な い が 、 糖 お よ び グ リセ ロ ー ル が 挙 げ られ 、

特 に 好 ま し くは グ リセ ロ ー ル で あ る。 糖 の 例 と して は 、 単 糖 、 例 え ば ダル コ

— ス 、 フル ク 卜一 ス 、 ガ ラ ク 卜一 ス 等 、 お よ び 二 糖 、 例 え ば ス ク ロ ー ス 、 ラ

ク 卜一 ス 、 マ ル ト一 ス 等 が 挙 げ られ 、 そ の 中 で も グル コ ー ス が 好 ま しい 。 ま

た 、 グ リセ ロ ー ル を炭 素 源 と して 用 い て 培 養 す る と、 グル コ ー ス を 用 い る 場

合 よ りも （
S)- レチ ク リ ン の 生 産 効 率 が 高 くな る。 ま た 、 窒 素 源 と して は 硫 酸

ア ン モ ニ ゥ 厶 、 カ ザ ミ ノ酸 な ど が 挙 げ られ る。 そ の 他 、 塩 類 、 特 定 の ァ ミ ノ

酸 、 特 定 の ビ タ ミ ン な ど を 所 望 に よ り使 用 で き る。

[0070] 例 え ば 、 大 腸 菌 を 培 養 す る 培 地 と して は 、 LB培 地 、 2 X YT 培 地 、 M9 最 少 培 地

が 挙 げ られ 、 酵 母 を 培 養 す る 培 地 と して は 、 SC 培 地 、 SD 培 地 、 YPD 培 地 が 挙 げ

られ る。

[0071 ] 培 養 温 度 は 、 宿 主 細 胞 が 成 育 し、 目 的 の 酵 素 を 発 現 し、 そ の 活 性 が 発 揮 さ

れ る範 囲 で 適 宜 変 更 で き る が 、 例 え ば 、 大 腸 菌 の 場 合 、 温 度 25 °C 、 80時 間 、

H 7. 0 の 培 養 条 件 を 用 い る こ と が で き る。 酵 母 の 場 合 、 例 え ば 、 温 度 30 °C

、 60 時 間 、 p H 5. 8 の 培 養 条 件 を 用 い る こ と が で き る。

[0072] (S)- レチ ク リ ン を 含 む 目 的 の イ ソ キ ノ リ ン ア ル カ ロ イ ドの 生 産 は 、 当 業 者

に 周 知 の あ らゆ る手 段 に よ っ て 確 認 す る こ と が 出 来 る。 具 体 的 に は 、 反 応 生

成 物 と 目 的 の イ ソ キ ノ リ ン ア ル カ ロ イ ド標 品 と を、 LC-MS に供 し、 得 られ る
 ス ペ ク トル を 比 較 す る こ と に よ っ て 同 定 す る こ と が 出 来 る。 ま た 、 反 応 生 成

物 と 目 的 の イ ソ キ ノ リ ン ア ル 力 ロ イ ド標 品 と の NMR 分 析 に よ る比 較 に よ って

も確 認 す る こ と が 出 来 る。

[0073] 本 明細 書 に お い て、 特 定 の遺 伝 子 を 「
発 現 」 す る と は 、 該 遺 伝 子 を構 成 す

る核 酸 分 子 が 少 な く と も RNA 分 子 へ 転 写 さ れ る こ と を い い 、 ポ リペ プ チ ドを

コ ー ドす る 遺 伝 子 の 場 合 に は 、 該 遺 伝 子 を構 成 す る核 酸 分 子 が RNA 分 子 へ 転

写 さ れ 、 該 RNA 分 子 が ポ リぺ プ チ ドに翻 訳 さ れ る こ と を い う。

[0074] 遺 伝 子 の 発 現 レベ ル は 、 当 該 技 術 分 野 に お け る 公 知 の 方 法 、 例 え ば ノ ー ザ

ン プ ロ ッ 卜、 定 量 的 PCR な ど に よ っ て 確 認 す る こ と が で き る。

[0075] 本 明細 書 に お い て、 特 定 の酵 素 を 「
発 現 」 す る と は 、 該 酵 素 の ポ リべ プ チ

ドを コ ー ドす る核 酸 分 子 か ら RNA 分 子 へ の 転 写 お よ び 該 RNA 分 子 か らポ リぺ

プ チ ドへ の 翻 訳 が 正 常 に 行 わ れ 、 活 性 を有 す る 酵 素 タ ンパ ク 質 が 生 み 出 さ れ

て 細 胞 内 ま た は 細 胞 外 に存 在 す る状 態 と な る こ と を い う。

[0076] 酵 素 の 発 現 レベ ル は 、 そ の 酵 素 活 性 の ア ツセ ィ に よ り確 認 で き る。 即 ち 、

目 的 酵 素 の 基 質 か ら生 成 物 へ の 変 換 を ァ ッセ ィ す る こ と に よ り確 認 す る こ と

が 出 来 る。 ま た 、 ウ ェ ス タ ン プ ロ ッ ト、 ELISA な ど公 知 の 手 法 を 用 い て 酵 素

タ ンパ ク 質 を検 出 お よ び 定 量 す る こ と に よ つ て も確 認 す る こ と が で き る。

[0077] 本 明細 書 に お い て、 特 定 の遺 伝 子 また は酵 素 を 「
過 剰 発 現 」 す る とは、 該

特 定 の 遺 伝 子 ま た は 酵 素 に相 当 す る 内 在 性 の 遺 伝 子 ま た は 酵 素 を 宿 主 細 胞 が

有 して い る 場 合 に は 、 該 内 在 性 遺 伝 子 ま た は 酵 素 の 発 現 レベ ル と、 導 入 さ れ

た 該 特 定 の 遺 伝 子 ま た は そ れ に コ ー ドさ れ る 酵 素 の 発 現 レベ ル と を 合 わ せ て

、 該 宿 主 細 胞 の 通 常 の 状 態 に お け る 該 内 在 性 遺 伝 子 ま た は 酵 素 の 発 現 レベ ル

を超 え る 遺 伝 子 ま た は 酵 素 の 発 現 レベ ル を 該 宿 主 細 胞 内 に お い て 達 成 す る こ

と を い う。 ま た 、 特 定 の 遺 伝 子 ま た は 酵 素 に相 当 す る 内 在 性 遺 伝 子 ま た は 酵

素 を 宿 主 細 胞 が 有 して い な い 場 合 に は 、 該 特 定 の 遺 伝 子 ま た は 酵 素 を 「
過剰

発 現 」 す る と は 、 導 入 さ れ た 該 特 定 の 遺 伝 子 ま た は そ れ に コ ー ドさ れ る 酵 素

に つ い て 、 常 套 の 検 出 方 法 に よ っ て 検 出 で き る レベ ル の 発 現 を 該 宿 主 細 胞 内

に お い て 達 成 す る こ と を い う。
[0078] 本 明細書 にお いて、 生合成 経路 を 「
再 構 築 」 す る とは、 所 望 の 化 合 物 を天

然 に は 生 産 しな い 宿 主 細 胞 中 に お い て 、 該 所 望 の 化 合 物 が 得 られ る よ う、 該

化 合 物 を 生 合 成 す る た め に必 要 な 1 ま た は複 数 の 反 応 を触 媒 す る 1 ま た は複

数 の 酵 素 を 発 現 さ せ て 、 該 化 合 物 へ と繋 が る 代 謝 経 路 を 作 り 出 す こ と を い う

。 か く して 宿 主 細 胞 内 に 「
再 構 築 」 され る生 合 成 経 路 は、 該 細 胞 が 天 然 に は

有 して い な い も の で あ る 。 本 発 明 の 方 法 に お い て 、 典 型 的 に は 、 所 望 の 化 合

物 は イ ソ キ ノ リ ン ア ル カ ロ イ ド、 特 に （S) - レチ ク リ ン で あ り、 必 要 な 酵 素 の

発 現 は 、 該 酵 素 を コ 一 ドす る 遺 伝 子 を 宿 主 細 胞 に 導 入 す る こ と に よ っ て 達 成

す る こ とが で き る。

[0079] 本 明 細 書 に お い て 、 本 発 明 の 方 法 に よ っ て 得 られ る レチ ク リ ン が 「実 質 的

に （R) - レチ ク リ ン を 含 ま な い 」 と は 、 （R) - レチ ク リ ン に 対 す る （S) - レチ ク リ

ン の ェ ナ ン チ 才 マ 一 過 剰 率 が 少 な く と も 8 0 % 以 上 、 好 ま し くは 9 0 % 以 上

、 最 も 好 ま し く は 1 0 0 % で あ る こ と を い う。

[0080] 本 発 明 に お い て 用 い られ る チ ロ シ ナ 一 ゼ （TYR) は 、 L - チ ロ シ ン の ベ ン ゼ ン環

の 3 位 を 水 酸 化 して L-DOPA に変 換 す る反 応 を触 媒 す る酵 素 活 性 を有 す る も

の で あ れ ば 特 に 限 定 さ れ な い 。 ま た 、 TYR の 由 来 は 特 に 限 定 さ れ な い が 、 微

生 物 由 来 の も の で あ る こ と が 好 ま し く、 例 え ば S t r ept omyces cas t aneog Lo b i

spo r u s 由 来 の も の が 挙 げ られ る 。 本 発 明 の 方 法 に お い て は 、 例 え ば 、 配 列 番

号 6 に 示 す ヌ ク レオ チ ド配 列 に コ ー ドさ れ る S . cas t aneog Lo b i spo r u s 由来

の TYR を 好 適 に 用 い る こ と が で き る 。

[008 1] ま た 、 TYR と して Ra Ls t o n i a s o Lanacea r u m由 来 の TYR (RsTYR) を用 い る こ と

も で き、 本 発 明 に お い て は 、 例 え ば 配 列 番 号 3 6 ま た は 3 7 に 示 す ヌ ク レオ

チ ド配 列 に コ ー ドさ れ る RsTYR を 好 適 に 用 い る こ と が で き る 。 RsTYR は 、 そ の

酵 素 活 性 を 示 す の に ア ダ プ タ 一 タ ン パ ク 質 を 必 要 と しな い 。 した が っ て 、 TYR

と して RsTYR を 用 い る 場 合 に は 、 後 述 の ア ダ プ タ 一 タ ンパ ク 質 を 発 現 さ せ る

必 要 は な い 。 ま た 、 TYR は 通 常 、 L-D0PA ま た は ド一 パ ミ ン を そ の キ ノ ン 誘 導 体

に 変 換 す る 能 力 （0 - ジ フ エ ノ ラ 一 ゼ 活 性 ） を 有 す る が 、 配 列 番 号 3 6 ま た は

3 7 に 示 す ヌ ク レオ チ ド配 列 に コ ー ドさ れ る RsTYR は、 か か る 0- ジフエノ
 ラ一 ゼ活性 が低 い (Hernandez-Romero, D. et a L, FEBS Journa l 273 (2006)

, 257-270) 。 した が っ て 、 配 列 番 号 3 6 ま た は 3 7 に 示 す ヌ ク レ オ チ ド配 列

に コ 一 ドさ れ る RsTYR を 用 い る こ と に よ り、 ド一 パ ミ ン の 生 産 量 を 増 大 さ せ 、

(S)- レチ ク リ ン の 生 産 効 率 を 向 上 さ せ る こ と が で き る 。

[0082] 本 発 明 に お い て 用 い ら れ る チ ロ シ ナ 一 ゼ （TYR) の ア ダ プ タ 一 タ ン パ ク 質 、 例

え ば 0RF378 タ ン パ ク 質 は 、 TYR の 触 媒 中 心 へ の 2 価 の 銅 イ オ ン （Cu(II) ) の

輸 送 を 補 助 す る タ ン パ ク 質 で あ る 。 少 な く と も 、 S t reptomyces 属 の細菌 に由

来 す る TYR に つ い て は 、 該 TYR が 完 全 な 触 媒 活 性 を 示 す た め に ア ダ プ タ 一 タ ン

パ ク 質 が 必 要 と さ れ る 。 例 え ば 、 S. castaneog Lob i sporus の染色体上 におい

て は 、 TYR 遺 伝 子 と 0RF378 が 直 列 に 並 ん で メ ラ ニ ン合 成 酵 素 遺 伝 子 オ ペ ロ ン

を 構 成 して お り、 TYR お よ び 0RF378 タ ン パ ク 質 の 両 方 が 発 現 す る こ と に よ つ

て TYR が 活 性 を 示 す （K. Ikeda et a L. , App L. M i crob iol. B i otechno L. 45

, 80-85 ( 1996) ; Y. Matoba et a し, . B i o し Chem. Vo L. 281 , No. 13 , pp. 8

981 -8990 (2006) ) 。 TYR の ア ダ プ タ 一 タ ン パ ク 質 の 例 と して は 、 S . castaneo

g Lob i sporus 由 来 の 0RF378 タ ン ノ《ク 質 や S t reptomyces ant i b i o t i cus 由来 の

0RF438 タ ン パ ク 質 が 挙 げ ら れ 、 本 発 明 に お い て は 、 例 え ば 、 配 列 番 号 7 に 示

す ヌ ク レ オ チ ド配 列 に コ ー ドさ れ る S . castaneog Lob i sporus 由 来 の 0RF378

タ ンパ ク 質 を 好 適 に 用 い る こ と が で き る。

[0083] 本 明 細 書 中 で TYR の ア ダ プ タ 一 タ ン パ ク 質 に つ い て 用 い る 用 語 に 関 し、 0RF3

78 を 例 に と る と、 「0RF378 」 と の 用 語 は 、 TYR の ア ダ プ タ 一 タ ン パ ク 質 で あ る

0RF378 タ ン パ ク 質 を コ 一 ドす る 遺 伝 子 ま た は オ ー プ ン リ 一 デ ィ ン グ フ レ ー ム

を 意 味 し、 「ア ダ プ タ 一 タ ン パ ク 質 0RF378 」 ま た は 「0RF378 タ ン パ ク 質 」 と

の 用 語 は 、 0RF378 に よ り コ 一 ドさ れ る タ ン パ ク 質 を 意 味 す る も の と す る 。

[0084] 本 発 明 に お い て 用 い ら れ る L-D0PA 特 異 的 デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ （D0DC) は 、 L -

D0PA か ら カ ル ボ キ シ ル 基 を 脱 離 さ せ て ド一 パ ミ ン に 変 換 す る 反 応 を 触 媒 す る

酵 素 活 性 を 有 し、 L-D0PA 以 外 の 他 の 芳 香 族 L - ア ミ ノ 酸 に 比 して 少 な く と も 1

0 倍 、 好 ま し くは 1 0 0 倍 、 よ り好 ま し くは 1 0 0 0 倍 以 上 の L-D0PA 選 択 性

を 示 す 、 芳 香 族 L - ア ミ ノ 酸 脱 炭 酸 酵 素 を い う 。 D0DC の 由 来 は 特 に 限 定 さ れ な
 い が 、 例 え ば 微 生 物 、 例 え ば Pseudomonas put ida 由 来 の も の が 挙 げ られ る

。 本 発 明 の 方 法 に お い て は 、 例 え ば 、 配 列 番 号 8 に 示 す ヌ ク レ オ チ ド配 列 に

コ ー ドさ れ る P . put ida 由 来 の D0DC を好 適 に用 い る こ とが で き る。

[0085] 本 発 明 に お い て 用 い ら れ る モ ノ ア ミ ン 才 キ シ ダ 一 ゼ （MA0) は 、 ド一 パ ミ ン を

3 , 4-DHPAA に変 換 す る反 応 を触 媒 す る酵 素 活 性 を有 す る も の で あ れ ば特 に 限

定 さ れ な い 。 MA0 の 由 来 と して は 、 例 え ば 微 生 物 、 例 え ば M i c r ococcus Lu t e

u s 、 Esche r ich ia co Li A r t h r obac t er a u r escens 、 K Lebs i e L La a e r ogenes が

挙 げ ら れ る が 、 M i c r ococcus Lu t eus 由 来 の も の を 用 い る の が 好 ま しい 。 本 発

明 の 方 法 に お い て は 、 例 え ば 、 配 列 番 号 9 に 示 す ヌ ク レ オ チ ド配 列 に コ ー ド

さ れ る M. Lu t eus 由 来 の MA0 を好 適 に用 い る こ とが で き る。

[0086] 本 発 明 に お い て 用 い ら れ る 、 ノ ル コ ク ラ ウ リ ン シ ン タ 一 ゼ （NCS) は ド一 パ ミ

ン と 3 , 4-DHPAA か ら 3 ' - ヒ ドロ キ シ ノ ル コ ク ラ ウ リ ン （以 下 、 ノ ル ラ ウ ダ ノ

ソ リ ン と も 称 す る ） を 得 る 反 応 、 ノ ル コ ク ラ ウ リ ン 6-0- メ チ ル トラ ン ス フ エ

ラ 一 ゼ （60MT) は 3 ' - ヒ ドロ キ シ ノ ル コ ク ラ ウ リ ン か ら 3 ' - ヒ ドロ キ シ コ ク ラ

ゥ リ ン を 得 る 反 応 、 コ ク ラ ウ リ ン - N- メ チ ル トラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ （CNMT) は 3 ' -

ヒ ドロ キ シ コ ク ラ ウ リ ン か ら 3 ' - ヒ ドロ キ シ -N- メ チ ル コ ク ラ ウ リ ン を 得 る 反

応 、 3 ' - ヒ ドロ キ シ -N- メ チ ル コ ク ラ ウ リ ン -4' -0- メ チ ル トラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ （

4 ' 0MT) は 3 ' - ヒ ドロ キ シ -N- メ チ ル コ ク ラ ウ リ ン か ら レ チ ク リ ン を 得 る 反 応 を

そ れ ぞ れ 触 媒 す る酵 素 活 性 を有 す る も の で あ れ ば特 に 限 定 され な い。

[0087] ま た 、 NCS 、 60MT 、 CNMT お よ び 4 ' 0MT は、 特 に限 定 され な い が、 イ ソキ ノ

リ ン ア ル 力 ロ イ ド生 産 性 植 物 由 来 の も の が 好 ま し い 。 イ ソ キ ノ リ ン ア ル カ ロ

イ ド生 産 性 植 物 と して は 、 ハ ナ ビ シ ソ ゥ 、 ケ シ 、 ェ ン ゴ サ ク 等 の ケ シ 科 植 物

、 メ ギ 等 の メ ギ 科 植 物 、 キ ハ ダ 等 の ミ カ ン科 植 物 、 コ プ シ 等 の モ ク レ ン科 植

物 、 才 才 ッ ヅ ラ フ ジ な ど の ッ ヅ ラ フ ジ 科 植 物 、 な ら び に 才 ゥ レ ン （Copt i s j a p

o n i ca) 等 の キ ン ポ ゥ ゲ 科 植 物 な ど の イ ソ キ ノ リ ン ァ ル カ ロ イ ド産 生 植 物 な ど

が 挙 げ られ 、 好 ま し くは 才 ゥ レ ン で あ る 。 本 発 明 の 方 法 に お い て は 、 例 え ば

、 配 列 番 号 1 1 、 1 2 、 1 3 お よ び 1 4 に 示 す ヌ ク レ オ チ ド配 列 に コ ー ドさ

れ る 、 い ず れ も 才 ゥ レ ン 由 来 の NCS 、 60MT 、 CNMT お よ び 4 ' 0MT を好適 に用

 い る こ と が 出 来 る。

[0088] 本 発 明 に お い て 用 い られ る レチ ク リ ン を 出 発 物 質 と して 作 用 す る イ ソ キ ノ

リ ン ァ ル カ ロ イ ド生 合 成 酵 素 は 、 レチ ク リ ン を 出 発 物 質 と して 目 的 の イ ソ キ

ノ リ ン ァ ル カ ロ イ ドを得 る 経 路 を構 成 す る 1 ま た は 複 数 の 酵 素 で あ り、 そ れ

ぞ れ の 経 路 の 反 応 を触 媒 す る 酵 素 活 性 を有 す る も の で あ れ ば 特 に 限 定 さ れ な

し、。 ま た 、 レチ ク リ ン を 出 発 物 質 と して 作 用 す る イ ソ キ ノ リ ン ア ル カ ロ イ ド

生 合 成 酵 素 は 、 特 に 限 定 さ れ な い が 、 イ ソ キ ノ リ ン ア ル カ ロ イ ド生 産 性 植 物

由 来 の も の で あ る の が 好 ま しい 。

[0089] — 方 、 イ ソ キ ノ リ ン ア ル カ ロ イ ド生 合 成 酵 素 と して シ 卜ク ロ 一 厶 P450 の 1

種 で あ る CYP80G2( コ リツ べ リ ン シ ン タ 一 ゼ ）を 用 い る 場 合 に、 共 に 用 い る の

が 好 ま しい 、 NADPH- シ 卜ク ロ 一 厶 P450 レダ ク タ 一 ゼ の 由 来 は 、 特 に 限 定 さ れ

な い が 、 酵 母 、 植 物 、 哺 乳 類 が 挙 げ られ る。

[0090] 本 発 明 の 方 法 に お い て マ グ ノ フ ロ リ ン を 生 産 す る 場 合 、 レチ ク リ ン か ら コ

リッ ベ リ ンへ の 反 応 を触 媒 す る 酵 素 、 お よ び コ リッ ベ リ ン か らマ グ ノ フ ロ リ

ンへ の 反 応 を触 媒 す る 酵 素 を 用 い れ ば よ く、 か か る 反 応 を触 媒 す る 酵 素 活 性

を有 す る も の で あ れ ば 特 に 限 定 さ れ な い 。 例 え ば 、 レチ ク リ ン か ら コ リツ べ

リ ンへ の 反 応 を触 媒 す る 酵 素 と して 、 配 列 番 号 1 5 に 示 す ヌ ク レオ チ ド配 列

に コ ー ドさ れ る CYP80G2 を 好 適 に 用 い る こ と が で き、 これ と共 に 配 列 番 号 1

6 に 示 す ヌ ク レオ チ ド配 列 に コ 一 ドさ れ る P450 レダ ク タ 一 ゼ を 用 い る こ と が

で き る。 ま た 、 コ リツ べ リ ン か らマ グ ノ フ ロ リ ンへ の 反 応 を触 媒 す る 酵 素 と

して 、 例 え ば 、 配 列 番 号 1 3 に 示 す ヌ ク レオ チ ド配 列 に コ ー ドさ れ る CNMT

を 好 適 に 用 い る こ と が で き る。

[0091 ] 本 発 明 の 方 法 に お い て ス コ ウ レ リ ン を 生 産 す る 場 合 、 レチ ク リ ン か らス コ

ゥ レ リ ンへ の 反 応 を触 媒 す る 酵 素 を 用 い れ ば よ く、 か か る 反 応 を触 媒 す る 酵

素 活 性 を有 す る も の で あ れ ば 特 に 限 定 さ れ な い 。 具 体 例 と して 、 配 列 番 号 1

7 に 示 す ヌ ク レオ チ ド配 列 に コ ー ドさ れ る BBE を 好 適 に 用 い る こ と が 出 来 る

[0092] さ ら に、 ベ ル べ リ ン を 生 産 す る 場 合 、 レチ ク リ ン か らス コ ウ レ リ ン を介 し
 て ベ ル ベ リ ン に 至 る 経 路 を 構 成 す る 酵 素 を 用 い れ ば よ く、 各 段 階 の 反 応 を 触

媒 す る 酵 素 活 性 を 有 す る も の で あ れ ば 特 に 限 定 さ れ な い 。 例 え ば 、 BBE 、 SMT(

ス コ ウ レ リ ン - 9-0- メ チ ル トラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ ） 、 CYP71 9A1 (カナ ジ ンシ ンタ

— ゼ ） お よ び THB0 ( テ トラ ヒ ドロベ ル べ リ ン 才 キ シ ダ 一 ゼ ）を 用 い る と よ い

。 BBE と して は 、 配 列 番 号 1 7 に 示 す ヌ ク レオ チ ド配 列 に コ ー ドさ れ る も の

が 好 適 に 用 い られ る 。 SMT 、 CYP71 9A THB0 の 配 列 情 報 に つ い て は 、 NCBI : Na

t i ona L Center for B i otechno logy Informat i o n の 提 供 す る GenBank (http:

//www. ncb i . n Lm. n i h . gov/) か ら 寻る こ と が 出 fe る 。

[0093] 本 発 明 に お い て 宿 主 細 胞 を 改 変 す る た め に 用 い る こ と が で き る tyrR 遺 伝 子

は 、 芳 香 族 ア ミ ノ酸 の 生 合 成 や 輸 送 に 関 わ る 複 数 の 遺 伝 子 の 発 現 を 調 節 す る

機 能 を 有 す る DNA 結 合 性 転 写 調 節 因 子 を コ ー ド して お り、 該 tyrR 遺 伝 子 に コ

- ドさ れ る 転 写 調 節 因 子 は 、 L- チ ロ シ ン を 生 合 成 す る い わ ゆ る シ キ ミ酸 経 路

に お い て 機 能 す る 、 3 - デ 才 キ シ -D- ァ ラ ピ ノ- ヘ プ ッ ロ ソ ン酸 - 7 - リ ン酸 シ ン タ

— ゼ (DAHPS) を コ 一 ドす る aroG 遺 伝 子 お よ び コ リス ミ酸 厶 タ 一 ゼ / プ レ フ エ ナ

— 卜デ ヒ ドロ ゲ ナ 一 ゼ （CM/PDH) を コ ー ドす る tyrA 遺 伝 子 の 発 現 を 抑 制 す る （

A. J . P i ttard et a し, Mo し Mi crob i o l . 5(7), 1585-1 592 ( 1991 ) ) 。 した が

つ て 、 本 発 明 に お い て 宿 主 細 胞 を 改 変 す る た め に 利 用 す る こ と が で き る tyrR

遺 伝 子 は 、 少 な く と も aroG 遺 伝 子 お よ び / ま た は tyrA 遺 伝 子 の 発 現 を 抑 制

す る機 能 を 有 す る も の で あ れ ば 特 に 限 定 さ れ な い 。

[0094] 本 発 明 に お い て 用 い る 宿 主 細 胞 が tyrR 遺 伝 子 を 有 す る か 否 か は 、 既 知 の t

yrR 遺 伝 子 の 配 列 情 報 、 例 え ば 大 腸 菌 K-1 2 DH1 0 B株 の tyrR 遺 伝 子 の 配 列 情 報

( 配 列 番 号 1 、 EMBL 受 入 番 号 ACB02543 、 KEGG 登 録 番 号 ECDH1 0BJ442) をも

と に 、 該 宿 主 細 胞 の ゲ ノ ム 配 列 等 に 対 して 配 列 相 同 性 検 索 を 行 う こ と に よ つ

て 推 定 で き る 。 相 同 な 遺 伝 子 （い わ ゆ る ホ モ ロ グ ） の 存 在 が 推 定 さ れ る 場 合

、 当 該 相 同 な 遺 伝 子 の 配 列 情 報 を も と に 行 う PCR 増 幅 お よ び 配 列 決 定 等 の 手

法 に よ っ て そ の 存 在 を 確 認 で き る 。 あ る い は 、 既 知 配 列 か らな る tyrR 遺 伝 子

の 核 酸 分 子 と の ハ イ プ リダ イ ゼ 一 シ ヨ ン に よ っ て 、 直 接 的 に tyrR 遺 伝 子 の 核

酸 分 子 を取 得 す る こ と も可 能 で あ る。
[0095] 宿 主 細 胞 に tyrR 遺 伝 子 が 存 在 す る 場 合 、 取 得 した tyrR 遺 伝 子 の 配 列 情 報

あ る い は 核 酸 分 子 を も と に、 人 工 的 核 酸 合 成 あ る い は ク ロ 一 ニ ン グ後 の 突 然

変 異 導 入 な どの手 法 に よ って、 遺 伝 子 破 壊 また は発 現 抑 制 用 の核 酸 を取 得 す

る こ と が で き、 該 核 酸 を 用 い て 、 相 同 組 換 え や RNAi な ど公 知 の 手 段 に よ っ て

宿 主 細 胞 が 有 す る tyrR 遺 伝 子 の 機 能 を喪 失 さ せ る か ま た は tyrR 遺 伝 子 の 発

現 を抑 制 す る こ と が 可 能 で あ る。

[0096] 相 同 性 検 索 は 、 公 知 の 手 段 、 例 え ば BLAST ア ル ゴ リズ ム 、 FASTA ァ ル ゴ リズ

厶 な ど を 利 用 して 行 う こ と が で き る。

[0097] 本 発 明 に お い て 、 宿 主 細 胞 を 改 変 す る た め に 用 い る こ と が で き る fbr-DAHP

S は 、 エ リ 卜ロ ー ス - 4- リ ン酸 （
E4P) と ホ ス ホ エ ノ 一 ル ビル ビ ン酸 （
PEP) か ら、

3- デ 才 キ シ -D- ァ ラ ピ ノ- ヘ プ ッ 口 ソ ン酸 -7- リ ン酸 (DAHP) を 生 成 す る 反 応 を触

媒 す る 酵 素 活 性 を有 し、 フ エ 二 ル ァ ラ ニ ン に よ る フ ィー ドバ ッ ク 阻 害 を 受 け

な い も の で あ れ ば 特 に 限 定 さ れ な い 。 こ こ で 、 「フ エ 二 ル ァ ラ ニ ン に よ る フ

イー ドバ ッ ク 阻 害 を 受 け な い （フ ィー ドバ ッ ク 阻 害 耐 性 で あ る ） 」 と は 、 フ

ェ ニ ル ァ ラ ニ ン に よ っ て DAHPS の 酵 素 活 性 が 全 く阻 害 さ れ な い か 、 ま た は フ

ェ ニ ル ァ ラ ニ ン に よ る 酵 素 活 性 の 阻 害 の 程 度 が 野 生 型 の DAHPS と比 較 して 有

意 に 小 さ い こ と を い う。 fbr-DAHPS は 、 フ エ 二 ル ァ ラ ニ ン存 在 下 で の 酵 素 活

性 が 同 非 存 在 下 で の 酵 素 活 性 と 同 等 ま た は そ れ 以 上 で あ る こ と が 好 ま しい 。

ま た 、 fbr-DAHPS は、 特 に 限 定 され な い が、 微 生 物 由来 の も の で あ る の が 好

ま し く、 大 腸 菌 由 来 の も の で あ る の が よ り好 ま しい 。 本 発 明 に お い て 、 例 え

ば 、 配 列 番 号 2 に 示 す ヌ ク レオ チ ド配 列 に コ ー ドさ れ る、 大 腸 菌 由 来 の fbr-

DAHPS を 好 適 に 用 い る こ と が 出 来 る。

[0098] 本 発 明 に お い て 、 宿 主 細 胞 を 改 変 す る た め に 用 い る こ と が で き る fbr-CM/P

DH は 、 コ リス ミ酸 か ら プ レ フ ェ ン 酸 を 生 成 す る 反 応 お よ び プ レ フ ェ ン 酸 か ら

4- ヒ ドロ キ シ フ エ ニ ル ピル ビ ン酸 （
HPP) を 生 成 す る 反 応 を触 媒 す る 酵 素 活 性

を有 し、 チ ロ シ ン に よ る フ ィー ドバ ッ ク 阻 害 を 受 け な い も の で あ れ ば 特 に 限

定 さ れ な い 。 こ こ で 、 「チ ロ シ ン に よ る フ ィー ドバ ッ ク 阻 害 を 受 け な い （フ

イー ドバ ッ ク 阻 害 耐 性 で あ る ） 」 と は 、 チ ロ シ ン に よ っ て CM お よび/ また は
 PDH の 酵 素 活 性 が 全 く 阻 害 さ れ な い か 、 ま た は チ 口 シ ン に よ る 酵 素 活 性 の 阻

害 の 程 度 が 野 生 型 の CM/PDH と 比 較 し て 有 意 に 小 さ い こ と を い う 。 fbr-CM/PD

Hは 、 チ ロ シ ン 存 在 下 で の 酵 素 活 性 が 同 非 存 在 下 で の 酵 素 活 性 と 同 等 ま た は そ

れ 以 上 で あ る こ と が 好 ま し い 。 ま た 、 fbr-CM/PDH は、 特 に限 定 され な い が、

微 生 物 由 来 の も の で あ る の が 好 ま し く、 大 腸 菌 由 来 の も の で あ る の が よ り 好

ま し い 。 本 発 明 に お い て 、 例 え ば 、 配 列 番 号 3 に 示 す ヌ ク レ オ チ ド配 列 に コ

— ドさ れ る 、 大 腸 菌 由 来 の fbr-CM/PDH を好 適 に用 い る こ とが 出来 る。

[0099] 本 発 明 に お い て 、 宿 主 細 胞 を 改 変 す る た め に 用 い る こ と が で き る TKT は、

カ ル ボ 二 ル 基 を 含 む 構 造 、 例 え ば -C(=0)CH 2
0H で 表 さ れ る構 造 を、 あ る糖 か

ら別 の 糖 へ 転 移 さ せ る 反 応 を 触 媒 す る 酵 素 活 性 を 有 す る も の で あ れ ば 特 に 限

定 さ れ な い 。 ま た 、 TKT は、 特 に限 定 され な い が、 微 生物 由来 の もの で あ る

の が 好 ま し く、 大 腸 菌 由 来 の も の で あ る の が よ り 好 ま し い 。 本 発 明 に お い て

、 例 え ば 、 配 列 番 号 4 に 示 す ヌ ク レ オ チ ド配 列 に コ ー ドさ れ る 、 大 腸 菌 由 来

の TKT を好 適 に用 い る こ とが 出来 る。

[01 00] 本 発 明 に お い て 、 宿 主 細 胞 を 改 変 す る た め に 用 い る こ と が で き る PEPS は

、 ピ ル ビ ン 酸 か ら ホ ス ホ エ ノ 一 ル ピ ル ビ ン 酸 （PEP) を 生 成 す る 反 応 を 触 媒 す る

酵 素 活 性 を 有 す る も の で あ れ ば 特 に 限 定 さ れ な い 。 ま た 、 PEPS は、 特 に限 定

さ れ な い が 、 微 生 物 由 来 の も の で あ る の が 好 ま し く、 大 腸 菌 由 来 の も の で あ

る の が よ り好 ま しい 。 本 発 明 に お い て 、 例 え ば 、 配 列 番 号 5 に 示 す ヌ ク レオ

チ ド配 列 に コ ー ドさ れ る 、 大 腸 菌 由 来 の PEPS を好 適 に用 い る こ とが 出来 る

[01 0 1 ] 即 ち 、 本 発 明 に 使 用 さ れ る 酵 素 と して は 、 こ れ ら に 限 定 さ れ な い が 、 以 下

の （a) ま た は （b) の タ ン パ ク 質 が 挙 げ ら れ る ：

(a) 配 列 番 号 2 、 3 、 4 、 5 、 6 も し くは 3 6 も し くは 3 7 、 7 、 8 、 9 も

し く は 1 0 、 1 1 、 1 2 、 1 3 、 1 4 、 1 5 、 1 6 ま た は 1 7 の ヌ ク レオ チ

ド配 列 に コ 一 ドさ れ る ア ミ ノ 酸 配 列 か ら な る タ ン パ ク 質 ；

(b) 配 列 番 号 2 、 3 、 4 、 5 、 6 も し くは 3 6 も し くは 3 7 、 7 、 8 、 9 も

し く は 1 0 、 1 1 、 1 2 、 1 3 、 1 4 、 1 5 、 1 6 ま た は 1 7 の ヌ ク レオ チ
 ド配 列 に コ 一 ドさ れ る ア ミ ノ酸 配 列 に お い て 、 1 若 し くは 数 個 の ア ミ ノ酸 が

欠 失 、 置 換 若 し くは 付 加 さ れ た ア ミ ノ酸 配 列 か らな り、 か つ 、 f b r-DAHPS 、 f b

r-CM/PDH 、 TKT 、 PEPS, TYR 、 0RF378 、 D0DC 、 MA0 、 NCS 、 60MT 、 CNMT 、 4 ' 0MT 、

CYP80G2 、 P450 レダ ク タ 一 ゼ ま た は BBE の 酵 素 活 性 を有 す る タ ンパ ク 質 。

[ 0 1 02] 本 発 明 に使 用 さ れ る タ ンパ ク 質 と して は 、 以 下 の （
ビ ）の タ ンパ ク 質 も 挙 げ

られ る。

( ビ ） 配 列 番 号 2 、 3 、 4 、 5 、 6 も し くは 3 6 も し くは 3 7 、 7 、 8 、 9 も

し くは 1 0 、 1 1 、 1 2 、 1 3 、 1 4 、 1 5 、 1 6 ま た は 1 7 の ヌ ク レオ チ

ド配 列 に コ ー ドさ れ る ァ ミ ノ酸 配 列 に 対 して 、 70% 以 上 、 好 ま し くは 80% 以

上 、 よ り好 ま し くは 90% 以 上 、 さ ら に 好 ま し くは 95% 以 上 の 相 同 性 を有 す る

ア ミ ノ酸 配 列 か らな り、 か つ 、 f b r-DAHPS 、 f b r-CM/PDH 、 TKT 、 PEPS, TYR 、 OR

F378 、 D0DC 、 MA0 、 NCS 、 60MT 、 CNMT 、 4 ' 0MT 、 CYP80G2 、 P450 レダ ク タ 一 ゼ ま

た は BBE の 酵 素 活 性 を有 す る タ ンパ ク 質 。

[ 0 1 03] 上 記 の、 （b) の タ ンパ ク 質 は 、 「fb r-DAHPS 、 f b r-CM/PDH 、 TKT 、 PEPS, TYR

、 0RF378 、 D0DC 、 MA0 、 NCS 、 60MT 、 CNMT 、 4 ' 0MT 、 CYP80G2 、 P450 レダ ク タ 一

ゼ ま た は BBE の 酵 素 活 性 を有 す る 」 と い う （a) の タ ンパ ク 質 の 機 能 が 失 わ れ

な い 程 度 に ア ミ ノ酸 変 異 （欠 失 、 置 換 、 付 加 ） が 起 こ っ て い る タ ンパ ク 質 で

あ る。 こ の よ う な 変 異 に は 、 自然 界 に お い て 生 じる 変 異 の 他 に、 人 為 的 な 変

異 も 含 ま れ る。 人 為 的 な 変 異 を 生 じさ せ る手 段 と して は 、 部 位 特 異 的 突 然 変

異 誘 発 法 (Nuc l e i c A c i d s Res. 10 , 6487-6500, 1 982) が 挙 げ られ る が これ に

限 定 さ れ る わ け で は な い 。 変 異 （欠 失 、 置 換 、 付 加 ） した ア ミ ノ酸 の 数 は 、

上記 （a) の タ ンパ ク 質 の 酵 素 活 性 が 失 わ れ な い 限 りそ の 個 数 は 制 限 さ れ な い が

、 好 ま し くは 5 0 ア ミ ノ酸 以 内 で あ り、 さ ら に 好 ま し くは 3 0 ア ミ ノ酸 以 内 で あ

る。

[ 0 1 04] ( b ，）の タ ンパ ク 質 も、 「fb r-DAHPS 、 f b r-CM/PDH 、 TKT 、 PEPS, TYR 、 0RF378

、 D0DC 、 MA0 、 NCS 、 60MT 、 CNMT 、 4 ' 0MT 、 CYP80G2 、 P450 レダ ク タ 一 ゼ ま た は

BBE の 酵 素 活 性 を有 す る 」 と い う （a) の タ ンパ ク 質 の 機 能 が 失 わ れ な い 程 度 の

(a) の タ ンパ ク 質 に 対 す る相 同 性 を有 す る タ ンパ ク 質 で あ る。 相 同 性 は 、 70%
 以 上 が 好 ま し く、 90% 以 上 が 特 に 好 ま しい 。

[01 05] 本発 明 において 「

相 同 性 」 と は 、 2 つ の ポ リペ プ チ ドあ る い は ポ リ ヌ ク レ

才 チ ド間 の 配 列 の 類 似 の 程 度 を 意 味 し、 比 較 対 象 の ア ミ ノ酸 配 列 ま た は 塩 基

配 列 の領 域 にわ た って 最 適 な状 態 （
配 列 の 一 致 が 最 大 と な る状 態 ） に ァ ラ イ

ン メ ン 卜さ れ た 2 つ の 配 列 を 比 較 す る こ と に よ り決 定 さ れ る。 相 同 性 の 数 値

(%) は 、 ア ラ イ ン メ ン トさ れ た 両 方 の （ア ミ ノ酸 ま た は 塩 基 ） 配 列 に お い

て 同 一 の ア ミ ノ酸 ま た は 塩 基 が 存 在 す る部 位 の 数 を 決 定 し、 次 い で 当 該 部 位

の 数 を 比 較 対 象 の 配 列 領 域 内 の ア ミ ノ酸 ま た は 塩 基 の 総 数 で 割 り、 得 られ た

数 値 に 100 を か け る こ と に よ り算 出 さ れ る。 最 適 な ァ ラ イ ン メ ン 卜お よ び 相 同

性 を得 る た め の ア ル ゴ リズ 厶 と して は 当 業 者 が 通 常 利 用 可 能 な 種 々 の ァ ル ゴ

リズ ム （
例 え ば 、 BLAST ア ル ゴ リズ ム 、 FASTA ア ル ゴ リズ ム な ど） が 挙 げ られ

る。 ア ミ ノ酸 配 列 の 相 同 性 は 、 例 え ば BLASTP 、 FASTA な ど の 配 列 解 析 ソ フ トゥ

エ ア を 用 い て 決 定 さ れ る。 塩 基 配 列 の 相 同 性 は 、 BLASTN 、 FASTA な ど の ソ フ ト

ウ ェ ア を 用 い て 決 定 さ れ る。

[01 06] タ ンパ ク 質 が fbr-DAHPS 、 fbr-CM/PDH 、 TKT 、 PEPS, TYR 、 0RF378 、 D0DC 、 M

A0 、 NCS 、 60MT 、 CNMT 、 4' 0MT 、 CYP80G2 、 P450 レダ ク タ 一 ゼ ま た は BBE の 酵

素 活 性 を有 す る か 否 か は 、 該 タ ンパ ク 質 調 製 物 に そ れ ぞ れ の 反 応 基 質 を 添 加

し、 そ れ ぞ れ の 酵 素 の 反 応 生 成 物 が 生 成 した か 否 か を調 べ る こ と に よ り判 定

す る こ と が 出 来 る。 fbr-DAHPS に つ い て は エ リ 卜ロ ー ス - 4- リ ン酸 （
E4P) お よ

び ホ ス ホ エ ノ 一 ル ピル ビ ン酸 （
PEP) を 添 加 し、 3- デ 才 キ シ -D- ァ ラ ビ ノ- へ プ ッ

口 ソ ン酸 - 7- リ ン酸 (DAHP) が 生 成 した か 、 fbr-CM/PDH に つ い て は コ リス ミ酸

を 添 加 し、 4- ヒ ドロ キ シ フ エ 二 ル ビル ビ ン酸 （
HPP) が 生 成 した か 、 TKT に つ い

て は 例 え ば リボ ー ス - 5- リ ン酸 （
R5P) お よ び キ シ ル ロ ー ス - 5- リ ン酸 （
Xu5P) を 添

加 し、 ダ リセ ル ア ル デ ヒ ド-3- リ ン酸 （
GAP) お よ び セ ドヘ プ ッ ロ ー ス - 7- リ ン酸

(S7P) が 生 成 した か 、 PEPS に つ い て は ピル ビ ン酸 を 添 加 し、 ホ ス ホ エ ノ 一 ル

ピル ビ ン酸 （
PEP) が 生 成 した か 、 TYR ( ま た は TYR お よ び 0RF378) につ いて は

L- チ ロ シ ン を 添 加 し、 L-D0PA が 生 成 した か 、 D0DC に つ い て は L-D0PA を 添 加

し、 ド一 パ ミ ン が 生 成 した か 、 MA0 に つ い て は ド一 パ ミ ン を 添 加 し、 3, 4-DHP
 AA が 生 成 し た か 、 NCS に つ い て は ド一 パ ミ ン と 3 , 4-DHPAA を 添 加 し、 3 ' - ヒ

ド ロ キ シ ノ ル コ ク ラ ウ リ ン が 生 成 し た か 、 60MT に つ い て は 3 ' - ヒ ドロ キ シ ノ

ル コ ク ラ ウ リ ン を 添 加 し、 3 ' - ヒ ド ロ キ シ コ ク ラ ウ リ ン が 生 成 し た か 、 CNMT

に つ い て は 3 ' - ヒ ド ロ キ シ コ ク ラ ウ リ ン を 添 加 し、 3 ' - ヒ ド ロ キ シ -N- メチル

コ ク ラ ウ リ ン が 生 成 し た か 、 4 ' 0MT に つ い て は 3 ' - ヒ ド ロ キ シ -N- メチル コク

ラ ウ リ ン を 添 加 し、 レ チ ク リ ン が 生 成 し た か を 調 べ る こ と に よ り 、 そ の 活 性

の 有 無 を 判 定 す る こ と が 出 来 る 。 ま た 、 CYP80G2 お よ び P450 レダ ク タ 一 ゼ に

つ い て は 、 そ れ ら の 共 存 下 で レ チ ク リ ン を 添 加 し、 コ リ ツ べ リ ン が 生 成 し た

か 、 そ し て BBE に つ い て は 、 レ チ ク リ ン を 添 加 し、 ス コ ウ レ リ ン が 生 成 し た

か を調 べ る こ と に よ りそ の 活 性 の有 無 を判 定 す る こ とが 出来 る。 な お、 コ リ

ッ ベ リ ン か ら マ グ ノ フ ロ リ ン の 反 応 を 触 媒 す る CNMT は 、 3 ' - ヒ ドロ キ シ コ ク

ラ ウ リ ン か ら 3 ' - ヒ ド ロ キ シ -N- メ チ ル コ ク ラ ウ リ ン の 反 応 を 触 媒 す る CNMT

と 同 じも の を 用 い る こ と が 出 来 る が 、 コ リッ ベ リ ン か らマ グ ノ フ ロ リ ンへ の

反 応 を 触 媒 す る か 否 か を 、 コ リ ツ べ リ ン を 添 加 し、 マ グ ノ フ ロ リ ン が 生 成 し

た か を調 べ る こ と に よ りそ の 活 性 の有 無 を判 定 す る と よ い。

[ 0 1 07] f b r-DAHPS が フ ィ ー ドバ ッ ク 阻 害 耐 性 で あ る か 否 か は 、 フ エ 二 ル ァ ラ ニ ン

の 存 在 下 お よ び 非 存 在 下 そ れ ぞ れ に お い て 酵 素 活 性 を 測 定 し、 同 条 件 に お け

る 野 生 型 の DAHPS の 酵 素 活 性 と比 較 す る こ と に よ って 確 認 す る こ とが で き る

( 例 え ば 、 K i kuch i, Y. et a し ， App L. Env i on. Mi c r ob i o l . 63, 7 6 1 -762 (

1 997) 参 照 ） 。 同 様 に 、 f b r-CM/PDH が フ ィ ー ドバ ッ ク 阻 害 耐 性 で あ る か 否 か

は 、 チ ロ シ ン の 存 在 下 お よ び 非 存 在 下 そ れ ぞ れ に お い て 酵 素 活 性 を 測 定 し、

同 条 件 に お け る 野 生 型 の CM/PDH の 酵 素 活 性 と比 較 す る こ と に よ って 確 認 す

る こ とが で さる ( 例 え は 、 L u t ke-Eve r s Loh, T. and S t ephanopou Los, G. , Ap

p L. Env i on. Mi c r ob i o l . 7 1, 7224-7228 (2005) 参照）。

[ 0 1 08] 反 応 生 成 物 が 、 3 - デ 才 キ シ -D- ァ ラ ピ ノ - ヘ プ ッ ロ ソ ン 酸 - 7 - リ ン 酸 (DAHP ) 、

4- ヒ ド ロ キ シ フ エ 二 ル ビ ル ビ ン 酸 （HPP) 、 ダ リ セ ル ア ル デ ヒ ド-3- リ ン 酸 （GAP)

、 セ ドヘ プ ッ ロ ー ス - 7 - リ ン 酸 （S7P) 、 ホ ス ホ エ ノ 一 ル ビ ル ビ ン 酸 （PEP) 、 L-D0

PA 、 ド一 パ ミ ン 、 3 , 4-DHPAA 、 3 ' - ヒ ドロ キ シ ノ ル コ ク ラ ウ リ ン 、 3 ' - ヒ ドロ キ

 シ コ ク ラ ウ リ ン 、 3 ' - ヒ ド ロ キ シ -N- メ チ ル コ ク ラ ウ リ ン、 レチ ク リ ン あ る い

は 目 的 の イ ソ キ ノ リ ン ア ル カ ロ イ ド （例 え ば 、 マ グ ノ フ ロ リ ン 、 ス コ ゥ レ リ

ン、 ベ ル べ リ ン等 ） で あ る か 否 か は 、 当 業 者 に 周 知 の あ らゆ る手 段 に よ っ て

確 認 す る こ と が 出 来 る 。 具 体 的 に は 、 反 応 生 成 物 と 3 - デ 才 キ シ -D- ァ ラ ピ ノ-

へ プ ッ ロ ソ ン 酸 - 7 - リ ン 酸 （DAHP) 、 4 - ヒ ド ロ キ シ フ エ 二 ル ビ ル ビ ン 酸 （HPP) 、

ダ リ セ ル ア ル デ ヒ ド- 3 - リ ン 酸 （GAP) 、 セ ドヘ プ ッ ロ ー ス - 7 - リ ン 酸 （S7P) 、 ホ

ス ホ エ ノ 一 ル ビ ル ビ ン 酸 （PEP) 、 L-D0PA 、 ド一 パ ミ ン 、 3 , 4-DHPAA 、 3 ' - ヒ ドロ

キ シ ノ ル コ ク ラ ウ リ ン 、 3 ' - ヒ ド ロ キ シ コ ク ラ ウ リ ン 、 3 ' - ヒ ド ロ キ シ -N- メチ

ル コ ク ラ ウ リ ン 、 レ チ ク リ ン ま た は 目 的 の ィ ソ キ ノ リ ン ァ ル カ ロ イ ドの そ れ

ぞ れ の 標 品 と を 、 LC-MS に 供 し、 得 ら れ る ス ペ ク トル を 比 較 す る こ と に よ つ

て 同 定 す る こ とが 出 来 る。 ま た 、 生 成 物 と対 応 す る標 品 との NMR 分 析 に よ る

比 較 に よ って も確 認 す る こ とが 出来 る。

[ 0 1 09] 次 いで、 本 発 明 に利 用 で きる f b r-DAHPS 、 f b r-CM/PDH 、 TKT 、 PEPS, TYR 、 0

RF378 、 D0DC 、 MAO, NCS 、 60MT 、 CNMT 、 4 ' OMT ま た は レチ ク リ ン を 出 発 物 質 と

し て 作 用 す る イ ソ キ ノ リ ン ァ ル カ ロ イ ド生 合 成 酵 素 を コ 一 ドす る 遺 伝 子 に つ

い て 説 明 す る。

[ 0 1 10 ] 本 発 明 に お い て 好 適 に 使 用 さ れ る 、 f b r-DAHPS 、 f b r-CM/PDH 、 TKT 、 PEPS, T

Y R 、 0RF378 、 D0DC 、 MA0 、 NCS 、 60MT 、 CNMT 、 4 ' 0MT 、 ま た は イ ソ キ ノ リ ン ア ル

力 ロ イ ド生 合 成 酵 素 の 具 体 例 で あ る CYP80G2 、 P450 レダ ク タ 一 ゼ も し くは BB

E を コ ー ドす る 遺 伝 子 と し て は 、 例 え ば 、 そ れ ぞ れ 配 列 番 号 2 、 3 、 4 、 5

、 6 も し くは 3 6 も し くは 3 7 、 7 、 8 、 9 も し くは 1 0 、 1 1 、 1 2 、

3 、 1 4 、 1 5 、 6 ま た は 1 7 に 示 す ヌ ク レ オ チ ド配 列 か ら な る 遺 伝 子 が

挙 げ られ る。

[ 0 111] 即 ち、 本 発 明 に使 用 され る遺 伝 子 は、 これ らに 限 定 され な い が、 好 ま し く

は 、 以 下 の （a) ま た は （b) の DNA で あ る 遺 伝 子 で あ る ：

(a) 配 列 番 号 2 、 3 、 4 、 5 、 6 も し くは 3 6 も し くは 3 7 、 7 、 8 、 9 も

し く は 1 0 、 1 1 、 1 2 、 1 3 、 1 4 、 1 5 、 1 6 ま た は 1 7 の ヌ ク レオ チ

ド配 列 か ら な る DNA ；
 (b) (a) の ヌ ク レオ チ ド配 列 か らな る DNA と相 補 的 な ヌ ク レオ チ ド配 列 か らな る

DNA と ス ト リ ン ジ ェ ン 卜な 条 件 下 で ハ イ プ リダ イ ズ し、 か つ 、 f b r-DAHPS 、 f b r

-CM/PDH 、 TKT 、 PEPS, TYR 、 0RF378 、 D0DC 、 MA0 、 NCS 、 60MT 、 CNMT 、 4 ' 0MT 、 C

YP80G2 、 P450 レ ダ ク タ 一 ゼ ま た は BBE の 酵 素 活 性 を 有 す る タ ンパ ク 質 を コ 一

ドす る DNA 。

[ 0 1 12 ] さ ら に 、 本 発 明 に 使 用 さ れ る 遺 伝 子 と して は 、 以 下 の （c) の DNA で あ る 遺 伝

子 も 挙 げ られ る ：

(c) 配 列 番 号 2 、 3 、 4 、 5 、 6 も し くは 3 6 も し くは 3 7 、 7 、 8 、 9 も

し くは 1 0 、 1 1 、 1 2 、 1 3 、 1 4 、 1 5 、 1 6 ま た は 1 7 の ヌ ク レオ チ

ド配 列 に 対 して 、 70% 以 上 、 好 ま し くは 80% 以 上 、 よ り好 ま し くは 90% 以 上

、 さ ら に 好 ま し くは 95% 以 上 の 相 同 性 を 有 す る ヌ ク レオ チ ド配 列 か らな り、

か つ 、 f b r-DAHPS 、 f b r-CM/PDH 、 TKT 、 PEPS, TYR 、 0RF378 、 DODC 、 MAO 、 NCS 、

60MT 、 CNMT 、 4 ' 0MT 、 CYP80G2, P450 レ ダ ク タ 一 ゼ ま た は BBE の 酵 素 活 性 を 有

す る タ ンパ ク 質 を コ 一 ドす る DNA 。

[ 0 1 13 ] こ こ で 、 ス ト リ ン ジ ェ ン 卜な 条 件 と は 、 特 異 的 な ハ イ プ リダ イ ゼ 一 シ ヨ ン

の み が 起 こ り、 非 特 異 的 な ハ イ プ リダ イ ゼ 一 シ ョ ン が 起 き な い よ う な 条 件 を

い う。 こ の よ う な 条 件 は 、 通 常 、 6 M尿 素 、 0 . 4 % SDS 、 0 . 5xSSC 程 度 で あ る 。 ハ

ィ プ リダ イ ゼ 一 シ ョ ン に よ り得 られ る DNA は （a) の ヌ ク レオ チ ド配 列 か らな る D

NA と 70% 以 上 の 高 い 相 同 性 を 有 す る こ と が 望 ま し く、 さ ら に 80% 以 上 の 相 同 性

を 有 す る こ と が 好 ま しい 。 こ こ で 「
相 同 性 」 に つ い て は 上 記 した と お りで あ

る。

[ 0 1 14 ] 上 記 遺 伝 子 に よ っ て コ ー ドさ れ る タ ンパ ク 質 が 「fb r-DAHPS 、 f b r-CM/PDH 、

TKT 、 PEPS, TYR 、 0RF378 、 DODC 、 MAO 、 NCS 、 60MT 、 CNMT 、 4 ' OMT 、 CYP80G2 、 P

450 レ ダ ク タ 一 ゼ ま た は BBE の 酵 素 活 性 を 有 す る 」 か 否 か の 確 認 方 法 は 、 タ

ンパ ク 質 に つ い て 上 記 した と お りで あ る 。

[ 0 1 15 ] 上 記 遺 伝 子 は 、 当 業 者 に 周 知 の PCR ま た は ハ イ プ リダ イ ゼ 一 シ ヨ ン技 術 に

よ っ て 取 得 す る こ と が 可 能 で あ り、 あ る い は DNA 合 成 機 な ど を 用 い て 人 工 的

に 合 成 して も よ い 。 配 列 の 決 定 は 常 套 方 法 に よ り配 列 決 定 機 を 用 い て 行 う こ
 とが 出 来 る。

実施 例
[01 16 ] 材料

全 て の 合 成 遺 伝 子 は、 GenScr i p t Inc. か ら入 手 した 。 （
R, S)- ノル ラ ウ ダ ノ

ソ リン は、 Acros Organ i c s か ら購 入 した 。 L- チ ロ シ ン、 L-D0PA お よ び ド一 パ

ミ ン は、 S i gma-ALdr i c h か ら購 入 した 。 （
R, S)- レチ ク リン は、 三 井 化 学 株 式

会 社 か ら寄 贈 さ れ た も の を使 用 した 。

[01 17 ] 発 現 ベ ク ター の構 築

tyrA b -aroG b -tktA-ppsA/pC0LADuet-1 の構 築

L- チ ロ シ ン を過 剰 生 産 す る宿 主 細 胞 を作 出 す る た め に、 以 下 の 4 つ の 遺 伝

子 を含 む 発 現 べ ク タ 一 を構 築 した ：tyrA き (fbr-CM/PDH) 、 aroG き (fbr-DAHP

S) 、 tktA (TKT) お よ び ppsA (PEPS) 。

[01 18 ] ま ず 、 pUC57 に ク ロ一 ニ ン グ さ れ た t y rAfbr お よ び aroG き 遺 伝 子 を、 GenS

c i t Inc. か ら購 入 した 。 該 プ ラ ス ミ ドに お い て 、 tyrA き は Ncol お よび E

coRI 制 限 酵 素 の 認 識 サ イ 卜に 隣 接 して お り、 aroGfbr は、 T7 プ ロ モ ー タ 一 に連

結 して い た 。 ま た 、 EcoRI 部 位 が 該 T7 プ ロ モ ー タ 一 の 上 流 に位 置 して お り、 S

acl 部 位 が aroG き の 下 流 に位 置 して い た 。

tktA お よ び ppsA 遺 伝 子 を、 大 腸 菌 K-1 2 MG1 655 の ゲ ノム DNA か ら、 そ れ

ぞ れ Ndel-tktA-F ( 配 列 番 号 1 8 ) と tktA-XhoI-R (配 列番号 1 9 ) の プラ

イ マ 一 セ ッ 卜お よ び Ndel-ppsA-F ( 配 列 番 号 2 0 ) と ppsA-XhoI-R (配 列番

号 2 1 ) の プライマ一セ ッ 卜 （
表 1 ) を 用 い て 増 幅 した 。 Ndel-Xhol を用 い

た 制 限 酵 素 消 化 の 後 、 tktA お よ び ppsA 遺 伝 子 を個 別 に、 そ れ ぞ れ pET-41 a

(Novagen) お よ び pCOLADuet-1 (Merck) の Ndel-Xhol 部 位 へ ク ロ一 ニ ン グ

した 。

[01 19 ] 上 記 4 つ の 遺 伝 子 を含 む 発 現 プ ラ ス ミ ドを構 築 す る た め 、 t y rAfbr 遺 伝 子 を

含 む DNA 断 片 を Ncol お よ び EcoRI を 用 い て tyrA f bゾpUC57 か ら切 り出 し、

そ の 後 、 pCOLADuet-1 の NcoI-EcoRI 部 位 へ ク ロ一 ニ ン グ した 。 次 に、 aroG fbr

/pUC57 の EcoRI-SacI 断片 （
T7 プ ロ モ ー タ 一 に結 合 した aroG き 遺 伝 子 を含
 む ） を 、 tyrA f b ゾpCOLADuet-1 の EcoRI-SacI 部 位 へ ク ロ 一 ニ ン グ した 。 か く

して 、 tyrA き - aroG fbr の発現 べ クタ一 （tyrA き - aroG f b ゾpCOLADuet-1 ) を得 た

[01 20] 次 い で 、 T 7 プ ロ モ ー タ 一 の 制 御 下 に あ る tktA を 、 tktA/pET-41 a か ら、 プ

ラ イ マ 一 5Sac-T7 (配 列 番 号 2 2 ) お よ び 3NottktA (配 列 番 号 2 3 ) (表 1

) を 用 い て 増 幅 した 。 次 い で 、 該 tktA お よ び T 7 プ ロ モ ー タ 一 を 、 tyrAfbr-ar

o Gf b ゾpCOLADuet-1 の Sacl-Notl 部 位 へ ク ロ 一 ニ ン グ し、 tyrA b -aroG b -tktA

/pCOLADuet-1 を得 た 。

[01 2 1 ] 最 後 に 、 Notl お よ び Xhol を 用 い て ppsA/pCOLADuet-1 を 消 化 し、 ppsA

遺 伝 子 お よ び T 7 プ ロ モ ー タ 一 を 含 む 断 片 を 得 た 。 次 い で こ の 断 片 を tyrAfb 「
- a

roG b -tktA/pC0LADuet-1 の Notl-Xhol 部 位 へ ク ロ 一 ニ ン グ して tyrA b -aroG

b -tktA-ppsA/pC0LADuet-1 を得 （図 8 ) 、 そ の 配 列 を 確 認 した 。

[01 22] NCS-0RF378-TYR-D0DC-optMA0/pKK223-3 の構 築

ノル ラ ウ ダ ノ ソ リ ン の 合 成 経 路 を再 構 築 す る た め 、 以 下 の 4 つ の 酵 素 を コ

— ドす る 遺 伝 子 を 含 む 発 現 べ ク タ 一 を 構 架 した ： S t reptomyces castaneog Lo

b i sporus の チ ロ シ ナ 一 ゼ （TYR) (TYR の 完 全 な 活 性 の た め 、 TYR お よ び そ の ァ

ダ プ タ 一 タ ン パ ク 質 0RF378 を 共 発 現 さ せ る ） 、 Pseudomonas put i d a の L-DOP

A特 異 的 デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ （D0DC) 、 M i crococcus Luteus の モ ノ ア ミ ン才

キシ ダ一ゼ （MA0) お よ び 才 ゥ レ ン （Copt i s j apon i ca) の ノ ル コ ク ラ ウ リ ン シ

ンタ一ゼ （NCS) 。

[01 23] ま ず 、 特 開 2 0 0 9 _ 2 2 5 6 6 9 号 公 報 お よ び M i nam i , H. et a し Proc

. Nat し Acad. Sc i . USA 105, 7393-7398 (2008) に記 載 さ れ る方 法 に従 って

、 M i crococcus Luteus の MAO 遺 伝 子 （配 列 番 号 9 ) お よ び 才 ゥ レ ン （C. ap

o n i ca) の NCS 遺 伝 子 （配 列 番 号 1 1 ) を 含 む 発 現 べ ク タ 一 pKK223-3 (NCS-M

A0/pKK223-3) を 作 成 した 。

[01 24] こ こ で 、 天 然 の MA0 は 大 腸 菌 に お け る 発 現 レベ ル が 低 い た め 、 本 発 明 者 ら

は コ ドン を 最 適 化 した MA0 ( 配 列 番 号 1 0 、 以 下 、 optMAO と称 す る ） を 用 い

る こ と と した 。 具 体 的 に は 、 pGS-21 a プ ラ ス ミ ドに ク ロ ー ニ ン グ さ れ た optM
 A O 遺 伝 子 を GenScr i pt I n に か ら購 入 し、 上 記 NCS-MA0/pKK223-3 中 に含 ま

れ る MA0 遺 伝 子 を 、 T7 プ ロ モ ー タ 一 に 駆 動 さ れ る optMAO 遺 伝 子 に よ って 置

き換 え た 。 当 該 置 換 は 、 上 記 購 入 した optMAO 遺 伝 子 を 含 む pGS-21 a プ ラ ス

ミ ドか ら、 プ ラ イ マ 一 5Bam-T7 (配 列 番 号 2 4 ) お よ び 3oMA0 (配 列 番 号 2

5 ) (表 1 ) を 用 い る PCR に よ っ て optMAO 遺 伝 子 お よ び T7 プ ロ モ ー タ 一

を 含 む BamHI-H i ndlll 断 片 を 生 成 し、 該 断 片 を NCS-MA0/pKK223-3 の BamHI-

H i ndlll 部 位 へ 組 み 込 む こ と に よ っ て 達 成 さ れ 、 そ の 結 果 NCS-optMA0/pKK22

3-3 を得 た 。

[01 25] Pseud 画 nas put i d a KT2440 株 の L-DOPA 特 異 的 デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ (D0DC

； EC 4 . 1. 1. 2 8 に 属 す る 芳 香 族 L- ア ミ ノ酸 デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ ） の 遺 伝 子

(配 列 番 号 8 ) を 、 同 株 の ゲ ノ ム DNA か ら プ ラ イ マ 一 5NdeD0DC (配 列 番 号 2

6 ) お よ び 3BamD0DC ( 配 列 番 号 2 7 ) (表 1 ) を 用 い て PCR に よ り増 幅 した

。 当 該 PCR 産 物 を Ndel-BamHI で 消 化 した 後 、 pET-3a (Novagen) の Ndel-Ba

mHI 部 位 へ 連 結 す る こ と に よ り、 D0DC/pET-3a を 得 た 。 か か る D0DC は 、 他 の

芳 香 族 ア ミ ノ酸 に 比 して 1 0 3 倍 を 超 え る L-D0PA 選 択 性 を 示 す デ カ ル ボ キ シ

ラ 一 ゼ で あ る 。 次 い で 、 T7 プ ロ モ ー タ 一 を 伴 う D0DC 遺 伝 子 を 、 該 DODC/pET-

3a か らプ ラ イ マ 一 5BamSacRVT7 (配 列 番 号 2 8 ) お よ び 3BamD0DC ( 配 列 番

号 2 7 ) (表 1 ) を 用 い て 増 幅 し、 こ れ を NCS-optMA0/pKK223-3 の BamHI

部 位 へ ク ロ 一 ニ ン グ して NCS-D0DC-optMA0/pKK223-3 を得 た 。

[01 26] pGS-21 a 中 に 直 列 に ク ロ 一 ニ ン グ さ れ 、 各 々 が 独 立 して T7 プ ロ モ ー タ 一 に

馬区動 さ れ て し、る 、 S t reptomyces castaneog Lob i sporus の TYRil 伝 子 ( 酉己歹 番

号 6 ) お よ び 0RF378 (配 列 番 号 7 ) を 、 GenScr i p t I n に か ら購 入 した 。 こ の

コ ン ス トラ ク 卜に お い て は 、 両 遺 伝 子 の コ ドン使 用 頻 度 が 最 適 化 さ れ て い る

。 プ ラ イ マ 一 5Sac-T7 (配 列 番 号 2 2 ) お よ び 3pGSEcoRV (配 列 番 号 2 9 )

( 表 1 ) を 用 い て 増 幅 さ れ た 、 TYR 遺 伝 子 お よ び 0RF378 を 含 む PCR 産 物 （Sa

cI-EcoRV 断 片 ） を 、 NCS-D0DC-optMA0/pKK223-3 の NCS と D0DC の 間 に 位 置

す る SacI-EcoRV 部 位 に 連 結 し、 NCS-0RF378-TYR-D0DC-optMA0/pKK223-3 を得

た。
[01 27] NCS-0RF378-TYR-D0DC-optMA0/pET-21 d の構 築

骨 格 の 異 な る プ ラ ス ミ ドを 有 す る 宿 主 細 胞 の 間 で 生 産 を 比 較 す る た め に 、 p

ET-21 d (Novagen) プ ラ ス ミ ドに 基 づ くベ ク タ 一 を 作 成 した 。

[01 28] ま ず 、 NCS に 結 合 した T7 プ ロ モ ー タ 一 を 含 む 断 片 を 、 NCS-MA0/pKK223-3 か

ら、 プ ラ イ マ 一 5Bg LII-T7 ( 配 列 番 号 3 0 ) お よ び 3NCSBamSacRV (配 列番 号

3 1 ) ( 表 1 ) を 用 い て 増 幅 した 。 次 い で 、 該 断 片 を 、 pET-21 d の Bg LII-Ba

mHI 部 位 へ 連 結 した 。 D0DC お よ び optMAO 遺 伝 子 を 含 む 、 NCS-DODC-optMAO/p

KK223-3 の Sacl-H i ndlll 断 片 を 、 NCS/pET-21 d の Sacl-H i ndlll 部位へ連

結 して 、 NCS-D0DC-optMA0/pET-21 d を 得 た 。 最 後 に 、 TYR 遺 伝 子 お よ び 0RF378

を 含 む 上 記 の PCR 産 物 (SacI-EcoRV 断 片 ） を 、 NCS-D0DC-optMA0/pET-21 d の

SacI-EcoRV 部 位 に 連 結 して 、 NCS-0RF378-TYR-D0DC-optMA0/pET-21 d を得 た

(図 8 ) 。

[01 29] NCS-RsTYR-D0DC-optMA0/pKK223-3 お よ び NCS-RsTYR-D0DC-optMA0/pET-21 d

の構 築

pGS-21 a 中 に ク ロ 一 ニ ン グ さ れ た 、 Ra Lston i a s o Lanacearum の TYR (RsTYR

) 遺伝 子 （
配 列 番 号 3 7 ) を 、 GenScr i p t I n に か ら購 入 した 。 こ の コ ン ス ト

ラ ク 卜に お い て は 、 RsTYR 遺 伝 子 の コ ドン使 用 頻 度 が 最 適 化 さ れ て い る 。 上 記

の NCS-0RF378-TYR-D0DC-optMA0/pKK223-3 お よ び NCS-0RF378-TYR-D0DC-opt

MA0/pET-21 d の 構 築 と 同 じ手 順 に 従 い （プ ラ イ マ 一 も 同 一 の も の を 使 用 ） 、 S

t reptomyces castaneog Lob i sporus の TYR 遺 伝 子 お よ び 0RF378 の 代 わ り に 該 RsT

Y R遺 伝 子 （
配 列 番 号 3 7 ) の 配 列 を 用 い て 、 NCS-RsTYR-D0DC-optMA0/pKK223-

3 お よ び NCS-RsTYR-D0DC-optMA0/pET-21 d を 作 成 した （図 1 1 、 後 者 の コ ン

ス トラ ク 卜の み を 示 す ） 。

[01 30] 振 盪 フ ラ ス コ 培 養 を 用 い 、 pET-21 d お よ び PKK223-3 プ ラ ス ミ ドコ ン ス ト

ラ ク 卜を 有 す る 組 換 え 宿 主 細 胞 の 間 で 生 産 性 を 比 較 した と こ ろ、 PKK223-3 よ

り も pET-21 d に 基 づ く プ ラ ス ミ ドを 有 す る 組 換 え 宿 主 細 胞 の 方 が 、 わ ず か に

レチ ク リ ン の 生 産 レベ ル が 高 い と い う結 果 を 得 た （デ ー タ 示 さ ず ） 。 した が

つ て 、 本 発 明 者 ら は NCS-0RF378-TYR-D0DC-optMA0/pET-21 d お よ び NCS-RsTY
 R-D0DC-optMA0/pET-2 1d を、 ノ ル ラ ウ ダ ノ ソ リン合 成 経 路 の 酵 素 を発 現 さ せ

る た め の プ ラ ス ミ ドと して 選 択 した 。

[ 0 13 1 ] 60MT-4' 0MT-CNMT/pACYC 18 4 の構 築

ノル ラ ウ ダ ノ ソ リンか ら レチ ク リン を合 成 す る経 路 を再 構 築 す る た め 、 前

述 の 特 開 2 0 0 9 _ 2 2 5 6 6 9 号 公 報 お よ び M i nam i , H. e t a L. P r oc. Na

t L. Acad. Sc i . USA 105, 7393-7398 (2008) に記 載 さ れ る方 法 に従 って 、 才

ゥ レ ン （C. j apon i ca) の 6 0 ΜΤ 、 4 ' 0MT お よび CNMT 遺 伝 子 を含 む 発 現 べ ク タ

- ACYC 18 4 (60MT-4' 0MT-CNMT/pACYC 184) を構 築 した （図 8 ) 。

[ 0 132] 本 実 施 例 に お い て 用 い た代 表 的 な PCR 条 件 を以 下 に示 す ：最 初 の 変 性 工 程

、 9 4 °C 、 2 分 ； 9 4 °C 、 15 秒 の 変 性 、 5 0 °C 、 3 0 秒 の ア ニ ー リン グ お よ び 6 8

°C 、 9 0 秒 の DNA 伸 長 か らな る サ イ クル を 3 0 サ イ クル ； そ して 最 後 の 6 8

°C 、 5 分 の 伸 長 ； これ に は KOD-p Lu s DNA ポ リメ ラ 一 ゼ （
東 洋 紡 ） を用 い た

。 本 実 施 例 に お い て 、 PCR は、 錶 型 とす る DNA 配 列 お よ び プ ラ イ マ 一 の 長 さ

、 T m値 な ど に応 じて 適 宜 条 件 を変 更 して 行 った 。 PCR 条 件 を最 適 化 す る こ と

は、 当業 者 に周 知 の 手 法 で あ る。

[ 0 133] レチ ク リン生 産 株 の 作 出

ま ず 、 L - チ ロ シ ン を過 剰 生 産 す る宿 主 細 胞 を作 出 す る た め 、 L u t ke-Eve r s Lo

h, T. , and Gr ego r y S t ephanopou Los, G. , App L. Mi c r o b i o l . B i o t echno L. (

2007) 7 5 : 103- 1 10 に記 載 さ れ て い る L - チ ロ シ ン を過 剰 生 産 す る 大 腸 菌 株 の

遺 伝 的 構 成 を採 用 した 。 具 体 的 に は、 t y r R遺 伝 子 中 に ノ ッ ク ア ウ ト突 然 変 異

を有 し、 t y r A 、 a r oG b t ktA お よ び ppsA を発 現 す る プ ラ ス ミ ドを有 す る

大 腸 菌 株 を作 出 した 。

[ 0 134] t y r R遺 伝 子 の 欠 失 は、 Qu i c k & Easy E. c o L i Gene De l e t i o n K i t (Gene B i

dges) を 用 い て 、 PCR 産 物 との 組 換 え に よ って 達 成 した 。 具 体 的 に は、 該 キ ッ

卜に含 まれ る Ffrr-PGK - g b 2 - neo-Ffrr の 配 列 を有 す る プ ラ ス ミ ドを錶 型 と し、

t y r R遺 伝 子 と相 同 な 配 列 を 5 ' 末 端 に有 す る プ ラ イ マ 一 d-t y r R-Sm-F (配 列番

号 3 2 ) お よ び d-t y r R-Sm-R (配 列番号 3 3 ) (表 1 ) を用 い て F 配列を

有 す る カ ナ マ イ シ ン耐 性 遺 伝 子 カ セ ッ トを PCR 増 幅 す る こ と に よ り、 F 配列
 を有 す る カ ナ マ イ シ ン耐 性 遺 伝 子 カ セ ッ 卜の 両 端 に t y r R遺 伝 子 と相 同 な 配 列

を有 す る DNA 断 片 を得 た 。 次 い で 、 該 断 片 を 用 い て 大 腸 菌 BL2 1 (DE3) を形

質 転 換 し、 相 同 組 換 え に よ って FRT 配 列 を有 す る カ ナ マ イ シ ン耐 性 遺 伝 子 力

セ ッ トを t y r R遺 伝 子 内部 に導 入 した 。 そ の 後 、 F L P 発 現 べ ク タ 一 （708-F LPe ;

Gene B i dges) を 用 い て 該 大 腸 菌 BL2 1 (DE3) を形 質 転 換 し、 F L P リ コ ン ビ

ナ 一 ゼ の 作 用 に よ って カ ナ マ イ シ ン耐 性 遺 伝 子 カ セ ッ 卜を 除 去 した 。 最 後 に

、 t y r R : : n u L L 変 異 を、 プ ラ イ マ 一 5 t y r RK0check (配 列 番 号 3 4 ) お よび 3 t

y r RKOcheck (配 列番 号 3 5 ) ( 表 1 ) を 用 い て 、 PCR に よ って 確 認 した 。

[ 0 135] 上 記 t y r R : : n u L L 変 異 を有 す る 大 腸 菌 BL2 1 (DE3) を、 t y r A b - a r oG b - t ktA

-ppsA/pCOLADue t- 1 ( 図 8 ) を 用 い て 形 質 転 換 し、 L - チ ロ シ ン 過 剰 生 産 株 を得

た 。 次 い で 、 該 L - チ ロ シ ン過 剰 生 産 株 を、 NCS-0RF378-TYR-D0DC-optMA0/pET

- 2 1d お よ び 60MT-4' 0MT-CNMT/pACYC 18 4 ( 図 8 ) を 用 い て 形 質 転 換 して 、 レ

チ ク リン生 産 株 を得 た （
本 明 細 書 に お い て 、 か か る株 を 「
組換 え生産 株 A 」

と称 す る ） 。 ま た 、 L - チ ロ シ ンの 生 産 に 関 して 上 記 の 改 変 （t y r R : : n u L L 変異

お よび t y r A b - a r oG b - t ktA-ppsA/pC0LADue t- 1 の導 入 ） が な され て い な い大

腸 菌 BL2 1 (DE3) 株 を NCS-0RF378-TYR-D0DC-optMA0/pET-2 1d お よ び 60MT-4

OMT-CNMT/pACYC 18 4 を 用 い て 形 質 転 換 して 組 換 え 大 腸 菌 株 を得 た （
本 明細書

に お い て 、 か か る株 を 「
組 換 え 生 産 株 B 」 と称 す る ） 。 さ らに、 上 記 L - チ ロ

シ ン過 剰 生 産 株 ( t y r R : : n u は変 異 を有 し、 か つ 、 t y r A b - a r oG b - t ktA-ppsA/pC

OLADue t - 1 で 形 質 転 換 さ れ て い る 大 腸 菌 BL2 1 (DE3) ) を、 NCS-RsTYR-DODC-optM

A0/pET-2 1d ( 図 1 1 ) お よ び 60MT-4' 0MT-CNMT/pACYC 18 4 を用 い て形 質転 換

して 、 レチ ク リン生 産 株 を得 た （
本 明 細 書 に お い て 、 か か る株 を 「
組換 え生

産 株 C 」 と称 す る ） 。 これ ら組 換 え 生 産 株 A 、 B お よ び C を、 レチ ク リン生

産 の た め に使 用 した 。

[ 0 136] 本 実 施 例 に お い て 用 い た プ ラ イ マ 一 の 配 列 を、 以 下 に示 す 。
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效一ム も i

【 —ム に
[ 0 137] 培養条件

宿 主 細 胞 を 液 体 L B 培 地 中 に お い て 3 7 °C で 終 夜 培 養 し、 1 0 L の細胞 培養

物 を 、 1 L の 改 変 した 常 套 の 培 地 （3 Lの ジ ャ ー フ ア ー メ ン タ 一 （BMS-03PI 、 A

BLE) 中 に お い て 、 1 リ ッ トル あ た り以 下 を 含 む ： 47. 6 g の T u r b o B r o t h (商 標

) (At hena Enzyme Sys t em) 、 1 . 6 g の NH4 C し 2 . 4 9 mg の CuS0 4 - 5 H2 0 、 3 g

の グ ル コ ー ス ま た は 5 g の グ リセ ロ ー ル 、 5 0 mg の ア ン ピ シ リ ン、 2 5 mg の

カ ナ マ イ シ ン、 お よ び 5 0 mg の ク ロ ラ ム フ エ ニ コ 一 ル ） に 接 種 した 。

[ 0 138] 28 % の NH4 0 H お よ び 1M の HC L を 自 動 添 加 す る こ と に よ り、 p H を 7 . 1

に 維 持 した 。 接 種 時 に お け る 撹 拌 速 度 は 1 0 0 r . p . m. で あ り、 溶 存 酸 素 レベ ル

は、 1 V V- 1 - の 連 続 的 通 気 を 用 い て 、 酸 素 飽 和 度 10 % まで低 下 させ た

。 グ ル コ ー ス 濃 度 は 、 0 . 5 g/mL の グル コ ー ス溶 液 の 添 加 に よ って 、 0 . 1 か ら

7 g/L の 間 に 維 持 した 。 グ リセ ロ ー ル 濃 度 は 、 1 g/mL の グ リセ ロ ー ル 溶 液

の 添 加 に よ っ て 、 0 . 1 か ら 6 g/L の 間 に 維 持 した 。 必 要 に 応 じ、 OD 600 が 1 0

( 炭 素 源 と して グ ル コ ー ス を 用 い る 培 地 に お け る 培 養 の 場 合 ） ま た は 1 5 ( 炭

素 源 と して グ リセ ロ ー ル を 用 い る 培 地 に お け る 培 養 の 場 合 ） に 達 した 時 点 で

、 ベ ク タ一付 属 の説 明書 等 に お い て示 され た、 あ る い は指 定 され た濃 度 （
最

終 濃 度 ） の I PTG を 培 養 物 に 添 加 して 発 現 誘 導 を 行 っ た 。

[ 0 139] 化 合 物 の検 出 お よび 定 量

製 造 元 の 説 明 書 に 従 い 、 グ ル コ ー ス C I I — テ ス トヮ コ 一 （
和光純薬工業株

式 会 社 ） を 用 い て 厶 タ ロ タ 一 ゼ — グル コ ー ス 法 に よ って 培 地 中 の グル コ ー ス

を 解 析 した 。 製 造 元 の 説 明 書 に 従 い 、 G Lyce r o L Assay Kit (Cayman Chem i c a l

Co. ) を 用 い て 培 地 中 の グ リセ ロ ー ル を 解 析 した 。

[ 0 140] 培 地 中 に お け る レチ ク リ ン以 外 の 芳 香 族 化 合 物 は 、 D i scove r y HS F 5 カラム

(Supe Lco) を 備 え る HPLC に よ っ て 解 析 した 。 0 . 5 mL/ 分 の 流 速 で 、 1 0 M

の ギ酸 ア ンモ ニ ゥ厶 （pH 3. 0) 中 に お け る ァ セ トニ ト リル 濃 度 を 3 % か ら 2

0% ま で 増 大 さ せ る こ と に よ り、 化 合 物 を カ ラ ム 上 で 分 離 した 。 280 n mに お け

る 吸 光 度 を 測 定 す る こ と に よ り、 化 合 物 の 溶 出 を モ ニ タ 一 した 。

[ 0 14 1 ] 生 産 さ れ た レチ ク リ ン を 測 定 す る た め 、 様 々 な 時 点 で 培 養 上 清 を 回 収 し、 2
 % の ト リ ク ロ 口酢 酸 を 用 い て タ ンパ ク 質 を 沈 殿 さ せ た 。 上 清 を 、 Ag はe n t HP

L C sys t e 上 で 分 離 した 後 、 LC-MS (3200 Q TRAP, App U e d B i osys t ems J apa

n L td. ) に よ っ て 解 析 した 。 HPLC の 条 件 は 以 下 の 通 りで あ っ た ： カ ラ ム 、 T

SKge L ODS-80Ts (4. 6 x 250 mm ; 東 ソ 一 株 式 会 社 ） ； 溶 媒 系 、 A ：0 . 1 % 酢

酸 水 溶 液 、 B ：0 . 1 % の 酢 酸 を 含 有 す る ァ セ トニ ト リル 溶 液 ； グ ラ ジ ェ ン 卜

モ ー ド ： 9 0 % の A (0-5 分 ） 、 9 0 % か ら 6 0 % の A (5-20 分 ） 、 10 % の A

(20-30 分 ） ； 流 速 、 0 . 5 mL/ 分 、 温 度 ：4 0 °C 。 レ チ ク リ ン を 、 LC- タ ン デ ム M

S ( LC-MS/MS) に お け る 断 片 化 ス ペ ク トル に つ い て 標 準 レ チ ク リ ン （
研 究室 ス

トツ ク ） と 比 較 す る こ と に よ っ て 同 定 した 。 Ana Ly s t 1. 4 . 1 ソ フ トウ ェ ア を

用 いて、 検 量線 （ mo L対 ピ ー ク 面 積 ） か ら レ チ ク リ ン の 量 を 推 定 した 。

[ 0 142] 生 産 さ れ た レチ ク リ ン を 、 Ag はe n t HPLC sys t e 上 で 分 離 した 後 、 LC-MS

に 供 す る こ と に よ っ て 、 該 レ チ ク リ ン の 立 体 選 択 性 を 解 析 した 。 HPLC の条件

は 以 下 の 通 り で あ っ た ： カ ラ ム 、 C H I RALCEL 0D-H (4. 6 X 250 mm 、 ダイセル

化 学 工 業 株 式 会 社 ） ； 溶 媒 系 、 へ キ サ ン /2- プ ロパ ノ ー ル / ジ ェ チ ル ァ ミ ン （

72 ：2 8 ：0 . 1 ) ； 流 速 、 0 . 5 5 mL/ 分 、 温 度 ：4 0 °C 。

[ 0 143] (S) - レチ ク リ ン の 精 製

Oas i s HLB 固相 抽 出 力 一 卜リッジ （Wat e r s ) お よ び HPLC に よ り、 培 養 上

清 か ら （S) - レ チ ク リ ン を 精 製 した 。 培 養 上 清 を ロ ー ドす る 前 に 、 該 カ 一 ト リ

ッ ジ を 水 で 前 平 衡 化 した 。 力 一 卜 リ ツ ジ を 5 % の メ タ ノ 一 ル で 洗 浄 し、 そ の

後 1 00% の メ タ ノール を用 い て （S) - レ チ ク リ ン を 溶 出 した 。 溶 出 液 を 、 上 記

の 条 件 に お い て 、 TSKge L ODS-80Ts カ ラム を備 え る HPLC に 供 試 した 。 （S) -

レ チ ク リ ン に 相 当 す る ピ ー ク 画 分 を 回 収 し、 そ の 後 、 精 製 の 程 度 を MS 解 析

に よ っ て 確 認 した 。

[ 0 144] 結果

組換 え宿 主細胞 に よ る （S) - レチ ク リ ン の 生 産

上 記 の 通 り に 作 出 した 2 種 の 組 換 え 大 腸 菌 株 （t y r R : :
nu 変 異 を 有 し、 発

現 プ ラ ス ミ ド t y r A き - a r o Gき - t ktA-ppsA/pC0LADue t - 1 、 NCS-0RF378-TYR-D0DC-

optMA0/pET-2 1d お よ び 60MT-4' 0MT-CNMT/pACYC 18 4 を 有 す る 「組 換 え 生 産 株

 A 」 、 お よ び 、 L- チ ロ シ ン の 生 産 に 関 わ る 代 謝 経 路 が 改 変 さ れ て お ら ず 、 発

現 プ ラ ス ミ ド NCS-0RF378-TYR-D0DC-optMA0/pET-21 d お よび 60MT-4' 0MT-CNM

T/pACYC1 8 4 を 有 す る 「組 換 え 生 産 株 B 」 ） を 、 炭 素 源 と して グ ル コ ー ス を 含

む 培 地 を 用 い て ジ ャ ー フ ァ ー メ ン タ 一 中 に お い て 培 養 し、 レ チ ク リ ン の 生 産

を 測 定 す る た め に 培 地 を 様 々 な 時 点 に お い て 回 収 した 。

[0145] 液 体 ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー - 質 量 分 析 （LC-MS) の結 果 、 組 換 え 生 産 株 B は 80

時 間 の う ち に 培 地 中 の グ ル コ ー ス か ら （S)- レ チ ク リ ン を 培 地 1L あ た り 0 . 5 3

g の 収 量 で 生 産 し、 一 方 、 組 換 え 生 産 株 A は 、 8 0 時 間 の う ち に 培 地 中 の グ

ル コ ー ス か ら （S)- レ チ ク リ ン を 培 地 1L あ た り 2 . 2 mg の 収 量 で 生 産 した こ

とが示 され た （図 2 ) 。 ま た 、 グ ル コ ー ス を 含 ま な い 培 地 に お い て は 、 組 換

え 生 産 株 A に よ る （S)- レ チ ク リ ン の 収 量 は 8 0 g / L と極 め て 低 か っ た （図 2 )

。 こ れ ら の 結 果 は 、 単 純 な 炭 素 源 で あ る グ ル コ ー ス か ら （S)- レ チ ク リ ン が 得

られ た こ と を 示 す 。

[0146] ま た 、 上 記 組 換 え 生 産 株 A に お い て は 、 IPTG に よ る誘 導 が な く と も、 導 入

した 生 合 成 遺 伝 子 の リー ク 発 現 に よ っ て （S)- レ チ ク リ ン が 生 産 さ れ た （図 3

) 。 こ れ は 本 発 明 に よ る （S)- レ チ ク リ ン の 生 産 コ ス トを 実 質 的 に 減 少 さ せ る

こ と が 可 能 で あ る こ と を 意 味 す る 。 さ ら に 、 炭 素 源 と して グ リセ ロ ー ル を 含

む 培 地 を 用 い て 組 換 え 生 産 株 A を 培 養 した 場 合 に は 、 8 0 時 間 に お け る （S)- レ

チ ク リンの収 量 は培 地 1L あ た り 6 . 2mg に ま で 増 大 し （図 9 ) 、 こ れ は 炭 素

源 と して グ ル コ ー ス を 用 い た 培 地 に お け る 生 産 量 よ り も お よ そ 3 倍 高 い も の

で あ った。

[0147] 別 の 実 験 と して 、 上 記 組 換 え 生 産 株 A お よ び C を 、 炭 素 源 と して グ リセ 口

— ル を 含 む 培 地 に お い て 培 養 し、 レ チ ク リ ン 生 産 量 を 測 定 した 。 そ の 結 果 、

組 換 え生産 株 C に お い て は、 同条 件 に お い て組 換 え生産 株 A を用 い た場 合 の

収 量 の お よ そ 7 倍 に あ た る、 培 地 1L あ た り最 大 46mg ( 3 回 の 独 立 した 実 験

の 平 均 と して 40. 5±4. 8mg/ い の （S)- レ チ ク リ ン が 生 産 さ れ た （図 1 2 ) 。

か か る 結 果 は 、 RsTYR の 採 用 に よ っ て ア ダ プ タ 一 タ ン パ ク 質 を 用 い る こ と な く

レチ ク リ ン の 生 産 を 達 成 で き、 か つ 、 レチ ク リ ン 生 産 量 を 増 大 さ せ 得 る こ と
 を実 証 した も の と言 え る。

[ 0 148] RsTYR を 用 い た ド一 パ ミ ン 生 産 株 （
上 記 L - チ ロ シ ン 過 剰 生 産 株 に RsTYR お よ

び D0DC を導 入 した 株 ） が 、 S . cas t aneog Lo b i spo r u s の TYR を 用 い た ド一 パ ミ ン

生産 株 （
上 記 L - チ ロ シ ン過 剰 生 産 株 に S . cas t aneog Lo b i spo r u s の TYR お よ び DO

DC を導 入 した 株 ） の ほ ぼ 4 倍 の 収 量 に あ た る 1 . 0 5 ± 0 . 05g/L (6. 8 5 ± 0 . 30mM

) の ド一 パ ミ ン を 生 産 した こ とか ら （デ ー タ示 さ ず ） 、 ド一 パ ミ ンの 生 産 能

力 の 増 大 が 、 組 換 え 生 産 株 C に お け る レチ ク リン生 産 の 増 大 に寄 与 して い る

可 能 性 が考 え られ る。

[ 0 149] イ ン ビボ で レチ ク リン を 生 産 す る た め の 公 知 の 方 法 （
特 許 文献 1 お よび 2

、 非 特 許 文 献 1 4 ) に お い て は ラ セ ミ体 と して レチ ク リンが 生 産 さ れ る の に

対 し、 本 発 明 の 上 記 組 換 え 生 産 株 A を 用 い る方 法 に お い て は、 （S) - レチ ク リ

ンの み が 生 産 さ れ た （図 6 ) 。 ま た 、 該 組 換 え 生 産 株 A の 培 養 中、 静 止 期 に

お い て は 中 間 体 と して L - チ ロ シ ンが 蓄 積 した が 、 培 養 期 間 全 体 に お い て L-D

0PA お よ び ド一 パ ミ ンの 蓄 積 は観 察 さ れ な か った （図 7 ) 。 ド一 パ ミ ンが 全

く蓄 積 しな い こ と に よ り、 （S) - 体 特 異 的 に ノル ラ ウ ダ ノ ソ リン を 生 成 す る NC

S の 触 媒 作 用 に よ らな い で ド一 パ ミ ン と 3 , 4-DHPAA とが 自発 的 縮 合 反 応 を起

こす こ とが 妨 げ られ る。 そ の 結 果 、 （R, S) - ラ セ ミ混 合 物 と して ノル ラ ウ ダ ノ

ソ リンが 生 成 さ れ る こ と は な く、 （S) - レチ ク リンの み が 得 られ る も の と考 え

られ る。

産 業 上 の利 用可能 性

[ 0 150] 本 発 明 の 組 換 え 宿 主 細 胞 を 用 い る レチ ク リンの 生 産 方 法 は、 光 学 的 に活 性

な (S) - レチ ク リン を、 植 物 培 養 細 胞 の 培 養 ま た は 遺 伝 子 組 換 え植 物 に よ る 生

産 （
通 常 、 数 ケ 月 か ら 1 年 程 度 の 期 間 を要 す る ） よ りも ず つ と速 く、 例 え ば

2 ~ 3 曰で 生 産 す る こ と を可 能 に す る も の で あ る。

[ 0 15 1 ] ド一 パ ミ ンや ノル ラ ウ ダ ノ ソ リンな どの 出 発 物 質 と比 較 して 、 本 発 明 の 方

法 に お い て 炭 素 源 と して 用 い得 る ダル コ ー ス ゃ グ リセ 口一 ル 等 の 物 質 は 安 価

か つ 入 手 が 容 易 で あ る。 した が って 、 例 え ば特 許 文 献 1 お よ び 2 な らび に非

特 許 文 献 1 4 に 開 示 さ れ る、 従 来 の 微 生 物 に よ る 生 産 方 法 と比 較 して 、 本 発
明 の 方 法 に よ る （S)- レ チ ク リ ン の 生 産 コ ス 卜は 非 常 に 低 い も の と な る 。

本 発 明 の さ ら な る 利 点 は 、 単 純 か つ 効 率 的 な 精 製 操 作 に よ っ て 、 望 ま な い

代 謝 産 物 （目 的 と し な い イ ソ キ ノ リ ン ア ル カ ロ イ ドを 含 む ） の 混 入 が ほ と ん

ど 無 い （S)- レ チ ク リ ン を 得 る こ と が で き る 点 で あ る 。 例 え ば 、 固 相 抽 出 お よ

び 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （HPLC) を 用 い て 培 地 か ら （S)- レ チ ク リ ン を 精

製 し た 結 果 、 精 製 さ れ た （S) - レ チ ク リ ン を 90% よ り も 多 く 回 収 す る こ と が で

き た （図 1 0 ) 。 か か る 単 純 か つ 高 収 率 の 精 製 操 作 に よ り 、 本 発 明 の （S)- レ

チ ク リ ン 生 産 方 法 は 経 済 的 に 実 現 可 能 な も の と な る 。
 請求の範 囲
[ 請 求 項 1] L- チ ロシ ン を生 産 す る代 謝 経 路 を有 す る イ ソ キ ノ リン アル 力 ロイ ド

非 生 産 性 細 胞 に、 チ ロシ ナ 一 ゼ また は チ ロシ ナ 一 ゼ お よび そ の ァ ダ プ

タ 一 タ ンパ ク質 、 L-D0PA 特 異 的 デ カル ボ キ シ ラ 一 ゼ、 モ ノ ア ミ ン才 キ

シ ダ 一 ゼ、 ノル コ ク ラ ウ リンシ ン タ 一 ゼ、 ノル コ ク ラ ウ リン 6-0- メ

チ ル トラ ンス フ ェ ラ 一 ゼ、 コ ク ラ ウ リン-N- メ チ ル トラ ンス フ ェ ラ 一

ゼ な らび に 3 ' - ヒ ドロキ シ -N- メ チ ル コ ク ラ ウ リン-4' -0- メ チ ル 卜ラ ン

ス フ エ ラ 一 ゼ か らな る群 よ り選 択 され る 少 な くと も 1 つ の タ ンパ ク質

を コ一 ドす る 少 な くと も 1 つ の 遺 伝 子 が導 入 され て な る、 チ ロシ ナ 一

ゼ また は チ ロシ ナ 一 ゼ お よび そ の ア ダ プ タ 一 タ ンパ ク質 、 L-D0PA 特 異

的 デ カル ボ キ シ ラ 一 ゼ、 モ ノ ア ミ ン才 キ シ ダ 一 ゼ、 ノル コ ク ラ ウ リン

シ ン タ 一 ゼ、 ノル コ ク ラ ウ リン 6-0- メ チ ル トラ ンス フ ェ ラ 一 ゼ、 コ

ク ラ ウ リン-N- メ チ ル トラ ンス フ ェ ラ 一 ゼ な らび に 3 ' - ヒ ドロキ シ -N-

メ チ ル コ ク ラ ウ リン-4' -0- メ チ ル トラ ンス フ ェ ラ 一 ゼ を発 現 す る組 換

え宿 主 細 胞 を提 供 す る工 程 、 お よび

該 組 換 え宿 主 細 胞 を、 炭 素 源 と して グル コー ス、 フル ク 卜一 ス、 ガ

ラ ク 卜一 ス、 ス ク ロー ス、 ラ ク 卜一 ス お よび マ ル ト一 ス か らな る群 よ

り選 択 され る 1 種 以 上 の糖 お よび / また は グ リセ 口一 ル を含 む 培 地 に

お い て 培 養 す る工 程 、

を含 む、 （S)- レチ ク リン を生 産 す る方 法 。

[ 請 求項 2] 組 換 え宿 主 細 胞 が、 tyrR 遺 伝 子 を有 しな い か また は そ の機 能 が 欠 損

して い る も の で あ る、 請 求 項 1 に記 載 の 方 法 。

[ 請 求項 3] 組 換 え宿 主 細 胞 が、 さ らに フ ィ一 ドバ ッ ク阻 害 耐 性 の 3- デ 才 キ シ - D

- ァ ラ ピ ノ- へ プ ッ 口 ソ ン酸 -7- リン酸 シ ン タ 一 ゼ お よび / また は フ ィ

- ドバ ッ ク阻 害 耐 性 の コ リス ミ酸 厶 タ 一 ゼ/ プ レフ エナ 一 卜デ ヒ ドロ

ゲ ナ 一 ゼ を発 現 す る も の で あ る、 請 求 項 1 また は 2 に記 載 の 方 法 。

[ 請 求項4 ] 組 換 え宿 主 細 胞 が、 さ らに トラ ンス ケ トラ 一 ゼ ぉ よび / また は ホ ス

ホ エ ノ一 ル ピル ビ ン酸 シ ンテ タ 一 ゼ を過 剰 発 現 す る も の で あ る、 請 求
 項 1 ~ 3 の い ず れ か に記 載 の 方 法 。

[ 請 求項 5] L- チ ロシ ン を生 産 す る代 謝 経 路 を有 す る イ ソ キ ノ リン アル 力 ロイ ド

非 生 産 性 細 胞 に、 フ ィ一 ドバ ッ ク阻 害 耐 性 の 3- デ 才 キ シ -D- ァ ラ ピ ノ-

へ プ ッ 口 ソ ン酸 -7- リン酸 シ ン タ 一 ゼ、 フ ィー ドバ ッ ク阻 害 耐 性 の コ

リス ミ酸 厶 タ 一 ゼ/ プ レフ エナ 一 卜デ ヒ ドロゲ ナ 一 ゼ、 トラ ンス ケ 卜

ラ 一 ゼ、 ホ ス ホ エ ノ一 ル ビル ビ ン酸 シ ンテ タ 一 ゼ、 チ ロシ ナ 一 ゼ また

は チ ロシ ナ 一 ゼ お よび そ の ア ダ プ タ 一 タ ンパ ク質 、 L-D0PA 特 異 的 デ カ

ル ポ キ シ ラ 一 ゼ、 モ ノ ア ミ ン才 キ シ ダ 一 ゼ、 ノル コ ク ラ ウ リンシ ン タ

— ゼ、 ノル コ ク ラ ウ リン 6-0- メ チ ル トラ ンス フ ェ ラ 一 ゼ、 コ ク ラ ウ

リン-N- メ チ ル トラ ンス フ ェ ラ 一 ゼ な らび に 3 ' - ヒ ドロキ シ -N- メ チ ル

コ ク ラ ウ リン-4' -0- メ チ ル トラ ンス フ ェ ラ 一 ゼ か らな る群 よ り選 択 さ

れ る 少 な くと も 1 つ の タ ンパ ク質 を コ一 ドす る 少 な くと も 1 つ の 遺 伝

子 が導 入 され て な る組 換 え宿 主 細 胞 で あ って、 フ ィー ドバ ッ ク阻 害 耐

性 の 3- デ 才 キ シ -D- ァ ラ ビ ノ- へ プ ッ 口 ソ ン酸 -7- リン酸 シ ン タ 一 ゼ、

フ ィ一 ドバ ッ ク阻 害 耐 性 の コ リス ミ酸 厶 タ 一 ゼ/ プ レフ エナ 一 卜デ ヒ

ドロゲ ナ 一 ゼ、 トラ ンス ケ トラ 一 ゼ、 ホ ス ホ エ ノ一 ル ビル ビ ン酸 シ ン

テ タ 一 ゼ、 チ ロシ ナ 一 ゼ また は チ ロシ ナ 一 ゼ お よび そ の ア ダ プ タ 一 タ

ンパ ク質 、 L-D0PA 特 異 的 デ カル ボ キ シ ラ 一 ゼ、 モ ノ ア ミ ン才 キ シ ダ 一

ゼ、 ノル コ ク ラ ウ リンシ ン タ 一 ゼ、 ノル コ ク ラ ウ リン 6-0- メ チ ル 卜

ラ ンス フ ェ ラ 一 ゼ、 コ ク ラ ウ リン-N- メ チ ル トラ ンス フ ェ ラ 一 ゼ な ら

び に 3 ' - ヒ ドロキ シ -N- メ チ ル コ ク ラ ウ リン-4' -0- メ チ ル トラ ンス フ エ

ラ 一 ゼ を発 現 し、 か つ、 tyrR 遺 伝 子 を有 しな い か また は そ の機 能 が 欠

損 して い る組 換 え宿 主 細 胞 を提 供 す る工 程 、 お よび

該 組 換 え宿 主 細 胞 を、 炭 素 源 と して グル コー ス、 フル ク 卜一 ス、 ガ

ラ ク 卜一 ス、 ス ク ロー ス、 ラ ク 卜一 ス お よび マ ル ト一 ス か らな る群 よ

り選 択 され る 1 種 以 上 の糖 お よび / また は グ リセ 口一 ル を含 む 培 地 に

お い て 培 養 す る工 程 、

を含 む、 （S)- レチ ク リン を生 産 す る方 法 。
[ 請 求項 6] 得 られ る レチ ク リ ン が 、 実 質 的 に （R)- レチ ク リ ン を 含 ま な い も の で

あ る こ と を特 徴 と す る、 請 求 項 1 ~ 5 の い ず れ か に 記 載 の 方 法 。

[ 請 求項 7] イ ソ キ ノ リ ン ア ル カ ロ イ ド非 生 産 性 細 胞 が 、 大 腸 菌 、 酵 母 、 枯 草 菌

お よ び 糸 状 菌 か らな る群 よ り選 択 さ れ る、 請 求 項 1 ~ 6 の い ず れ か に

記載 の方 法。

[ 請 求項 8] 組 換 え 宿 主 細 胞 に、 L-D0PA 特 異 的 デ カ ル ボ キ シ ラ ー ゼ 以 外 の 芳 香 族

L- ア ミ ノ酸 デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ を コ 一 ドす る 遺 伝 子 が 導 入 さ れ て い な

い こ と を特 徴 と す る、 請 求 項 1 ~ 7 の い ず れ か に 記 載 の 方 法 。

[ 請 求項 9] L- チ ロ シ ン を 生 産 す る代 謝 経 路 を有 す る イ ソ キ ノ リ ン ア ル 力 ロ イ ド

非 生 産 性 細 胞 に、 チ ロ シ ナ 一 ゼ ま た は チ ロ シ ナ 一 ゼ お よ び そ の ァ ダ プ

タ 一 タ ンパ ク 質 、 L-D0PA 特 異 的 デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ 、 モ ノ ア ミ ン才 キ

シ ダ 一 ゼ 、 ノル コ ク ラ ウ リ ン シ ン タ 一 ゼ 、 ノル コ ク ラ ウ リ ン 6-0- メ

チ ル トラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ 、 コ ク ラ ウ リ ン -N- メ チ ル トラ ン ス フ ェ ラ 一

ゼ な らび に 3 ' - ヒ ドロ キ シ -N- メ チ ル コ ク ラ ウ リ ン -4' -0- メ チ ル 卜ラ ン

ス フ エ ラ 一 ゼ か らな る群 よ り選 択 さ れ る 少 な く と も 1 つ の タ ンパ ク 質

を コ 一 ドす る 少 な く と も 1 つ の 遺 伝 子 が 導 入 さ れ て な る、 チ ロ シ ナ 一

ゼ ま た は チ ロ シ ナ 一 ゼ お よ び そ の ア ダ プ タ 一 タ ンパ ク 質 、 L-D0PA 特 異

的 デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ 、 モ ノ ア ミ ン才 キ シ ダ 一 ゼ 、 ノル コ ク ラ ウ リ ン

シ ン タ 一 ゼ 、 ノル コ ク ラ ウ リ ン 6-0- メ チ ル トラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ 、 コ

ク ラ ウ リ ン -N- メ チ ル トラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ な らび に 3 ' - ヒ ドロ キ シ -N-

メ チ ル コ ク ラ ウ リ ン -4' -0- メ チ ル トラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ を 発 現 す る 組 換

え宿 主 細 胞 。

[ 請 求 項 10 ] t y r R遺 伝 子 を有 しな い か ま た は そ の 機 能 が 欠 損 して い る も の で あ る

、 請 求 項 9 に記 載 の 組 換 え宿 主 細 胞 。

[ 請 求 項 1 1] さ ら に フ ィー ドバ ッ ク 阻 害 耐 性 の 3 - デ 才 キ シ -D- ァ ラ ビ ノ- へ プ ッ 口

ソ ン酸 - 7 - リ ン酸 シ ン タ 一 ゼ お よ び / ま た は フ ィ 一 ドバ ッ ク 阻 害 耐 性

の コ リス ミ酸 厶 タ 一 ゼ / プ レ フ エ ナ 一 卜デ ヒ ドロ ゲ ナ 一 ゼ を 発 現 す る

も の で あ る、 請 求 項 9 ま た は 1 0 に 記 載 の 組 換 え 宿 主 細 胞 。
[ 請 求 項 12 ] さ らに トラ ンス ケ トラ 一 ゼ お よび / また は ホ ス ホ エ ノ一 ル ビル ビ ン

酸 シ ンテ タ 一 ゼ を過 剰 発 現 す る も の で あ る、 請 求 項 9 ~ 1 1 の い ず れ

か に記 載 の 組 換 え宿 主 細 胞 。

[ 請 求 項 13 ] L- チ ロシ ン を生 産 す る代 謝 経 路 を有 す る イ ソ キ ノ リン アル 力 ロイ ド

非 生 産 性 細 胞 に、 フ ィ一 ドバ ッ ク阻 害 耐 性 の 3- デ 才 キ シ -D- ァ ラ ピ ノ-

へ プ ッ 口 ソ ン酸 -7- リン酸 シ ン タ 一 ゼ、 フ ィー ドバ ッ ク阻 害 耐 性 の コ

リス ミ酸 厶 タ 一 ゼ/ プ レフ エナ 一 卜デ ヒ ドロゲ ナ 一 ゼ、 トラ ンス ケ 卜

ラ 一 ゼ、 ホ ス ホ エ ノ一 ル ビル ビ ン酸 シ ンテ タ 一 ゼ、 チ ロシ ナ 一 ゼ また

は チ ロシ ナ 一 ゼ お よび そ の ア ダ プ タ 一 タ ンパ ク質 、 L-D0PA 特 異 的 デ カ

ル ポ キ シ ラ 一 ゼ、 モ ノ ア ミ ン才 キ シ ダ 一 ゼ、 ノル コ ク ラ ウ リンシ ン タ

— ゼ、 ノル コ ク ラ ウ リン 6-0- メ チ ル トラ ンス フ ェ ラ 一 ゼ、 コ ク ラ ウ

リン-N- メ チ ル トラ ンス フ ェ ラ 一 ゼ な らび に 3 ' - ヒ ドロキ シ -N- メ チ ル

コ ク ラ ウ リン-4' -0- メ チ ル トラ ンス フ ェ ラ 一 ゼ か らな る群 よ り選 択 さ

れ る 少 な くと も 1 つ の タ ンパ ク質 を コ一 ドす る 少 な くと も 1 つ の 遺 伝

子 が導 入 され て な る組 換 え宿 主 細 胞 で あ って、 フ ィー ドバ ッ ク阻 害 耐

性 の 3- デ 才 キ シ -D- ァ ラ ビ ノ- へ プ ッ 口 ソ ン酸 -7- リン酸 シ ン タ 一 ゼ、

フ ィ一 ドバ ッ ク阻 害 耐 性 の コ リス ミ酸 厶 タ 一 ゼ/ プ レフ エナ 一 卜デ ヒ

ドロゲ ナ 一 ゼ、 トラ ンス ケ トラ 一 ゼ、 ホ ス ホ エ ノ一 ル ビル ビ ン酸 シ ン

テ タ 一 ゼ、 チ ロシ ナ 一 ゼ また は チ ロシ ナ 一 ゼ お よび そ の ア ダ プ タ 一 タ

ンパ ク質 、 L-D0PA 特 異 的 デ カル ボ キ シ ラ 一 ゼ、 モ ノ ア ミ ン才 キ シ ダ 一

ゼ、 ノル コ ク ラ ウ リンシ ン タ 一 ゼ、 ノル コ ク ラ ウ リン 6-0- メ チ ル 卜

ラ ンス フ ェ ラ 一 ゼ、 コ ク ラ ウ リン-N- メ チ ル トラ ンス フ ェ ラ 一 ゼ な ら

び に 3 ' - ヒ ドロキ シ -N- メ チ ル コ ク ラ ウ リン-4' -0- メ チ ル トラ ンス フ エ

ラ 一 ゼ を発 現 し、 か つ、 tyrR 遺 伝 子 を有 しな い か また は そ の機 能 が 欠

損 して い る、 組 換 え宿 主 細 胞 。

[ 請 求 項 14] 大 腸 菌 、 酵 母 、 枯 草 菌 お よび 糸 状 菌 か らな る群 よ り選 択 され る、 請

求 項 9 ~ 1 3 の い ず れ か に記 載 の 組 換 え宿 主 細 胞 。

[ 請 求 項 15 ] L-D0PA 特 異 的 デ カル ボ キ シ ラ 一 ゼ 以 外 の 芳 香 族 L- ア ミ ノ酸 デ カル ボ
キ シ ラ 一 ゼ を コ ー ドす る 遺 伝 子 が 導 入 さ れ て い な い こ と を特 徴 と す る

、 請 求 項 9 ~ 1 4 の い ず れ か に記 載 の 組 換 え宿 主 細 胞 。
 INTERNATIONAL SEARCH REPORT International application No.

I PCT / JP2 0 1 1 / 0 7 1 5 2 0
A . CLASSIFICATION O F SUBJECT MATTER
C I 2 P I 7/1 2 (2 0 0 6 . 0 1 ) , C 1 2N1 /21 (2 0 0 6 . 0 1 ) i , ：ュ ュ5 / お （2 0 0 6 . 0 1 ) n

According to

B. FIELDS SEARCHED
Minimum documentation searched (classification system followed b y classification symbols)
C12 P1 7 / 12 C 1 2N1 / 2 1 , C 1 2N1 5 / 0 9

Documentation searched other than minimum documentation t o the extent that such documents are included i n the fields searched
Jitsuyo Shinan Koho 1922-1 996 Jitsuyo Shinan Toroku Koho 1996-2011
Kokai Jitsuyo Shinan Koho 1971-2011 Toroku Jitsuyo Shinan Koho 1994 - 2011

Electronic data base consulted during the international search (name o f data base and, where practicable, search terms used)
CA/BI 〇S I S /MEDLINE /WPI DS ( S TN ) f
JST Plus / JMEDPlus / JST 7 5 8 0 ( JDream ェェ）

C. DOCUMENTS CONSIDERED T O B E RELEVANT

Category* Citation o f document, with indication, where appropriate, o f the relevant passages Relevant t o claim No.

X/ Y WO 2008/ 153 094 Al (Kyoto Unive rsi t y ) f

9 14, 15/
18 December 2008 (1 8 . 12 . 2 0 0 8 ) , 1. 15
& US 2010/ 0184166 Al & EP 21 69075 Al

X/ Y Hiromi chi MINAMI et al . , " B s e ibut su ni yoru 9, 14, 15/

Koto Shokubut s Alkaloi d no S e i san " , Kagaku t o 1- 15
S eibut su , 2009, vol . 47, page s 528 t o 530

LOE LER, S . et al . , The hydroxylati on step i n 1- 15

the bio syntheti c pathway l eadi ng from
norcocl aurine t o reti culine . Phytochemi stry
(1990 ) Vo l . 2 9 p . 3 49 9- 35 03

FACCHINI , P .J . et al . , D i ffe rential and t i s sue - 1- 15

spe ci f i c expre s si on of a gene fami l y for
tyro s ine/ dopa decarboxylas i n opium poppy .
J Biol Chem . (1 9 9 4 ) Vol .269 p . 2 6684- 26690

Further documents are listed i n the continuation o f Box C . [ ] See patent family annex.

Special categories o f cited documents: "T" later document published after the international filing date or priority
"A" document defining the general state o f the art which i s not considered date and not i n conflict with the application but cited t o understand
t o b e o f particular relevance the principle or theory underlying Hie invention

"E" earlier application or patent but published o n or after the international "X" document o f particular relevance; the claimed invention cannot b e
filing date considered novel o r cannot b e considered t o involve an inventive
"L" document which may throw doubts o n priority ciaim(s) o r which is step when the document i s taken alone
cited t o establish t e publication date o f another citation o r other "Y" document o f particular relevance; the claimed invention cannot b e
special reason (as specified) considered t o involve an inventive step when the document is
"O" document referring t o an oral disclosure, use, exhibition o r other means combined with one o r more other such documents, suet combination
"p' ， d
dooccuummeenntt p
puubblliisshlieedd prnioori t o the international filing date but later than
being obvious t o a person skilled i n the art
the priority date claimed document member o f the same patent family

Date o f the actual completion o f the international search Date o f mailing o f the international search report
20 December , 2011 (2 0 . 1 2 . 1 1 ) 27 De cember , 2011 (2 7 . 12 . 1 1 )

Name and mailing address o f the ISA/ Authorized officer

Japane se Patent Offi ce

Facsimile No. Telephone No.

Form PCT/ISA/210 (second sheet) (July 2009)
 INTERNATIONAL SEARCH REPORT International application No.

C (Continuation). DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT

Category* Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages Relevant to claim No.

Y LUTKE -EVERSLOH , . e t a l - f L —tyro s ine -1 5

product ion b y deregul ated s t rains of
E s che r i chia col i . Ap l Microbiol Biotechno l .
(2 007 ) Vo l . 5 p . 1 03- 1 10

X WO 2 0 0 / 0 91 7 A2 (CERES INC . ) , 1, 6, 8, , 15
3 1 Augu s t 2 0 0 6 ( 3 1 . 0 8 . 2 0 0 6 ) ,
& US 2 0 0 6 / 0 1 9 5 9 3 4 A l & EP 1 8 418 A2

A KEGG PATHWAY : y r o s ine metabo l i sm— E scheri chia 1- 15

col i K- 1 2 MGl 6 5 5 < t t p / / w . genome . j p / kegg 一
bin/ show pathway?orq _name=ec &mapn = 0 3 5 0 &
mapsale=l . 0 &s h d e s c r i t on=show> [ retrieved
on 2 0 11 . 12 . 15 ]

Form PCT/ISA/210 (continuation of second sheet) (July 2009)

 国 際調 査 報告 国 際 出願 番 号 ？ 丁ノ ? 2 0 1 1 / 0 7 1 5 2 0

発 明 の 属 す る分 野 の 分 類 （国 際 特 許 分 類 （I P C ) )

IntCl. C12P17/12 (2006. 01) i ， C12N1/21 (2006. 01) , C12N15/09 (2006. 01) n

B . 調 查 を行 った分 野
調 査 を行 っ た 最 小 限資 料 （国 際 特 許 分 類 （I P C ) )

IntCl. C12P17/12, C12N1/21, C12N15/09

最 小 限資 料 以 外 の 資 料 で調 査 を行 った分 野 に含 まれ る もの

ョ本 国 実 用 新 案 公 報 1 9 2 2 — 1 9 9 6 年
日本 国 公 開 実 用 新 案 公 報 1 9 7 1 — 2 0 1 1 年
日本 国 実 用 新 案 登 録 公 報 1 9 9 6 — 2 0 1 1 年
日本 国 登 録 実 用 新 案 公 報 1 9 9 4 2 0 1 1 年

国 際 調 査 で 使 用 した 電 子 デ ー タベ ー ス （デ ー タ ベ ー ス の 名 称 、 調 査 に 使 用 し た 用 語 )

CA/BIOSIS/MEDLINE/WPIDS (STN) ， JSTPlus/JMEDPlus/JST7580 (jDreamll)

C . 関 連 す る と認 め られ る 文 献
引用文 献 の 関連す る
カ テ ゴ リー * 引用 文 献名 及 び 一 部 の 箇 所 が 関 連 す る とき は 、 そ の 関 連 す る箇 所 の 表 示 請 求項 の番 号

W0 2008/153094 A (国 立 大 学 法 人 京 都 大 学 ) 2008. 12. 18, US 2010/0184166 A1 & 1, 6-9 ，14, 5 I

EP 2169075 A1 1-15

南 博道 他， 1, 6-9 ，14, 5 I
微 生 物 に よ る 高 等 植 物 ア ル 力 ロ イ ドの 生 産 1—15

化 学 と 生 物 ， 2009 ， Vol. 7, p . 528-530

. c 欄 の 続 き に も文 献 が 列 挙 され て い る。 パ テ ン トフ ァ ミ リ 二関 す る 別 紙 を 参 照 。

* 引用 文 献 の 日 の 後 に 公 表 され た 文 献
ΓΑ 」 特 に 関 連 の あ る 文 献 で は な く 、 一 般 的 技 術 水 準 を 示 す け 」 国 際 出 願 日 又 は 優 先 日後 に 公 表 さ れ た 文 献 で あ つ て
も の 出 願 と矛 盾 す る も の で は な く 、 発 明 の 原 理 又 は 理 論
ΓΕ 」 国 際 出 願 日 前 の 出 願 ま た は 特 許 で あ る が 、 国 際 出 願 日 の理解 のた め に引用す るもの

以 後 に 公 表 され た も の 「X 」 特 に 関 連 の あ る 文 献 で あ っ て 、 当 該 文 献 の み で 発 明
「L 」 優 先 権 主 張 に 疑 義 を 提 起 す る 文 献 又 は 他 の 文 献 の 発 行 の 新 規 性 又 は 進 歩 性 が な い と考 え られ る も の
若 し くは他 の特 別 な理 由 を確 立 す るた め に 引用 す 「Υ 」 特 に 関 連 の あ る 文 献 で あ っ て 、 当 該 文 献 と 他 の 1 以
る文 献 （
理 由を付す ） 上 の 文 献 との 、 当 業 者 に と っ て 自明 で あ る組 合 せ に
Γθ 」 口 頭 に よ る 開 示 、 使 用 、 展 示 等 に 言 及 す る 文 献 よ っ て 進 歩 性 が な い と考 え られ る も の
ΓΡ 」 国 際 出 願 日 前 で 、 か つ 優 先 権 の 主 張 の 基 礎 と な る 出 願 「& 」 同 一 パ テ ン ト フ ァ ミ リ ー 文 献

国 際調 査 を完 了 した 日 国際調 査 報告 の発 送 日
2 0 . 1 2 . 2 0 2 7 . 2 . 2 0 1 1

特許 庁審 査官 （
権 限 の あ る職 員 ） 4 B 3 8 4 5
国 際調 査機 関 の 名 称 及 び あ て先
日本 国 特 許 庁 （I S A / J Ρ)
小川 明 日香
郵便番 号 1 0 0 — 8 9 1 5
東 京 都 千 代 田 区 霞 が 関 三 丁 目4 番 3 号 電話番 号 0 3 — 3 5 8 1 — 1 1 0 内線 3 4 4 8

様 式 P C T / I S A 2 1 0 (第 2 ペ ー ジ ） （2 0 0 9 年 7 月 ）
 国際調査報告 国際出願番号 P C T / J P 2 0 1 1/ 0 7 1 5 2 0

C (続 き）. 関連す ると認 め られ る文献

引用文献の 関連す る
カテ ゴリー 引用文献名 及び一部の箇所が関連す るときは、その関連す る箇所の表示 請求項の番号

Υ LOEFFLER, S. et al. ， 1-15

The hyclroxyiation step i n the biosynthetic pathway leading r om norcoc 丄

aurine tc

reticul ine.

Phytochemistry (1990) Vol. 9 p . 3499-3503

FACCHINI, P. J . et al. ， 1-15

Differential and tissue-specific expression of a gene family for tyrosine/dopa

decarboxylase i n opium poppy.

J Biol Chem. (1994) Vol. 69 p . 26684- 26690

LUTKE-EVERSLOH, T . et al. ， 1-15

L tyrosine production b y deregulated strains of Escherichia coli.

Appl Microbiol Biotechnol. (2007) Vol. 5 p . 103- 110

WO 2006/091676 A2 (CERES INC. ) 2006. 08. 3 1， & US 2006/0195934 Al & EP 1866418 A2 1, 6 ，8，9, 5

KEGG PATHWAY : Tyrosine metabolism- Escherichia coli K-12 MG1655 1-15

く
http ：
//www. genome, jp/kegg- bin/ show—p a hway ?o r g—name=eco&mapno=00350&mapscale=l.

0&sh o _ e sc p on= sh o >

[retrieved on 2011. 12. 15]

様式 P C T / I SA/ 1 0 (第 2 ページの続 き） （2 0 0 9 年 7 月）