Isomangiferin, Suatu Penghambat Potensial Vascular Endothelial Growth Factor

Receptor 2 Kinase, Menekan Pertumbuhan Kanker Payudara. Metastasis, Dan

Angiogenesis.

PENGANTAR

Kanker payudara sejauh ini merupakan kanker paling sering di antara wanita dengan
perkiraan 1,38 juta kasus baru didiagnosis setiap tahun [1]. Mastektomi radikal dan
kemoterapi bermanfaat bagi sebagian besar pasien dengan kanker payudara lokal (sekitar
85% -90%), dengan kelangsungan hidup memanjang melampaui 5 tahun. Sayangnya, untuk
pasien dengan metastasis jauh, tingkat kelangsungan hidup hanya sekitar 10% hingga 18%
[2]. Obat dari kanker payudara stadium lanjut relatif jarang. Vascular endothelial growth
factor receptor 2 (VEGFR-2) adalah reseptor tirosin kinase membran-terikat sel yang ini
ditemukan di sel-sel endotel. VEGFR-2 memainkan peran kunci dalam pengembangan
angiogenesis tumor [3]. Meskipun VEGFR-2 awalnya digambarkan sebagai eks eksklusif
ditekan dalam sel-sel endotel, banyak penelitian telah menunjukkan itu juga dinyatakan
dalam sel tumor dari pasien dengan usus besar kanker [4], kanker pankreas [5], kanker paru
[6], iklan cervical karsinoma enosquamous [7], karsinoma tiroid meduler[8], glioma [9],
karsinoma sel skuamosa oral [10], dan payudara kanker [11]. Upregulation dari VEGFR-2
mRNA terdeteksi pada tahap awal dari payudara primer dan metastatik invasif kanker.
Korelasi yang kuat telah ditunjukkan antara ekspresi VEGFR-2 dan keluar klinikopatologi
datang pada kanker payudara. Ekspresi VEGFR-2 juga telah berkorelasi positif dengan
metastasis kelenjar getah bening di payudara kanker, dengan ekspresi VEGFR-2 yang tinggi
terkait dengan sig- hasil kelangsungan hidup yang jauh lebih buruk [12]. Selanjutnya, di
kanker payudara, ekspresi tran epitelial-mesenkimal penanda sition (EMT), termasuk Twist1
dan vimentin, adalah lebih tinggi pada tumor yang menampilkan ekspresi VEGFR-2 yang
lebih tinggi,sementara ekspresi E-cadherin lebih rendah pada tumor yang sama, memberi tahu
bahwa VEGFR-2 dapat berfungsi sebagai mediator potensial EMT pada kanker payudara
[13]. Karena itu, memblokir VEGFR-2 jalur pensinyalan cukup menjanjikan untuk terapi
kanker payudara. Isomangiferin adalah xanthone C-glukosida yang merupakan component
banyak tanaman di subfamili Cyclopia seperti Coffea Arabika dan Anemarrhenae
rhizoma [14]. Sedangkan isomangiferin memiliki aktivitas sitotoksik pada beberapa sel
kanker [15] pengaruhnya pada kanker payudara belum dieksplorasi secara memadai. Di sini,
kami memeriksa aktivitas anti-kanker potensial isomangiferin pada pertumbuhan tumor
payudara, metastasis, dan angiogenesis, dan mekanisme yang mendasari.
 METODE

Reagen dan antibodi

Isomangiferin dibeli dari Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai,
Cina). Kesuciannya adalah verified sebagai ≥ 98% dengan kromatografi cair kinerja tinggi.
Reagen yang digunakan untuk kultur sel seperti serum janin bovin (FBS)
dan tripsin, dan media pertumbuhan semuanya dibeli dari Gibco Life Technology (Carlsbad,
USA). Antibodi spesifik untuk aktin, VEGFR-2, terfosforilasi VEGFR-2 (p-VEGFR-2),
platelet adhesi sel-sel endotel molekul-1 (PECAM-1 /CD31), protein kinase B (PKB / AKT),
protein terfosforilasi kinase B (p-AKT), protein kinase teregulasi ekstraseluler (ERK), ERK
terfosforilasi (p-ERK), poli ADP-ribosa poli-merase (PARP), PARP terbelah, trans sinyal
terfosforilasi-ducer dan aktivator transkripsi 3 (p-STAT3), fokal adhesion kinase (FAK),
Caspase 3, dan β-aktin diperoleh dari Teknologi Sinyal Sel (Danvers, AS). Pro sel MTS
kit pengujian liferasi dibeli dari BD Biosciences (Franklin Danau, AS). VEGFR-2 jalur sinyal
pembuluh darah agonis faktor pertumbuhan endotel (VEGF) dan antagonis SU5408 adalah
dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, USA).

Budaya Sel
Garis sel karsinoma payudara manusia digunakan untuk in vitro pengalaman termasuk
MDA-MB-231, T47D, MCF7, dan SKBR3. Garis sel kanker payudara tikus triple-negatif
4T1 juga bekas. The MCF-10A mengabadikan mamalia manusia normal garis sel epitel
digunakan sebagai kontrol normal untuk menguji kaleng Sitotoksisitas sel sit dari
isomangiferin. Semua sel dibeli dari Koleksi Budaya Tipe Amerika (Manassas, AS) dan
dibudidayakan di saya Eagle's Dulbecco yang dimodifikasi tinggi itu media dium atau Ham
F12K (Kaighn) mengandung 10% FBS dalam suasana 5% CO pada 37 ° C. Umbili manusia
utama sel-sel endotel pembuluh darah (HUVECs; ScienCell Research Laboratories, San
Diego, USA) digunakan sebagai model untuk meniru proses angiogenesis. HUVEC
dibudidayakan di En Suplemen Sel Medium (Gibco Life Technology) dothelial ed dengan
5% FBS, 1% suplemen pertumbuhan sel endotel, dan 1% penisilin-streptomisin dalam
suasana 5% CO Itu media kultur disegarkan setiap 2 hingga 3 hari.

Model mouse xenograft kanker payudara manusia

MDA-MB-231 sel digunakan untuk kanker payudara tikus model xenograft mouse.
Laki-laki lima minggu BALB / c telanjang tikus dengan berat badan sekitar 25 g secara acak
dibagi menjadi dua kelompok. Sel MDA-MB-231 disuntikkan subkutan ke dalam setiap
mouse (2 × 106 sel per mouse). Ketika volume rata-rata setiap tumor adalah sekitar 100
mm3, tikus dibiarkan tidak diobati atau diobati dengan isomangiferin (10 mg / kg / hari)
setiap hari selama satu bulan secara intraperitoneal injeksi. Selama administrasi
isomangiferin, yang pertumbuhan tumor MDA-MB-231 xenografts dipantau setiap 6 hari.
Tiga puluh hari kemudian, semua tikus dikorbankan dan dibedah. Tumor-tumor subkutan
padat telah ditemukan pencitraan dan penimbangan fotografi.
Histologi dan imunohistokimia
Tumor yang dibedah juga digunakan untuk histologi dan imanalisis munohistokimia.
Tumor jaringan sudah diperbaiki 10% formaldehida selama 24 jam diikuti oleh de
konvensional hidrasi. Tumor yang ditanam parafin dengan hati-hati disebut dengan ketebalan
4 μm dan kemudian diwarnai dengan antibodi ke p-VEGFR-2 dan CD31. Sel-sel bernoda
dianalisis oleh Perangkat lunak Image-Pro Plus (Media Cybernetics Inc.,
Rockville,AMERIKA SERIKAT).

Uji MTS
Sel (5.000/biakan) ditempatkan dalam 96 tempat biakan selama 48 jam seperti yang
telah dijelaskan sebelumnya [16-18] dan diterapi dengan 1 μm isomangiferin. Kelangsungan
hidup sel dinilai menggunakan alat uji MTS (Promega, Madison, USA) seperti yang telah
dijelaskan oleh manufaktur. Nilai absorbsi dari kehidupan sel dalam biakan pada 96 tempat
biakan telah diukur setiap 515 nm menggunakan pembaca microplate (Thermo Fisher
Scientific, Waltham, USA). Untuk terapi SU5408, cell MDA-MB-231pertama kali diinkubasi
dengan 100 nM SU5408 dan kemudian diterapi dengan konsentrasi indikasi dari
isomangiferin.

Uji In Vitro dan Invasi

Untuk menentukan efek penghambat dari isomangiferin pada migrasi sel MDA-MB-
231, dilakukan uji ruang Boyden. Sel MDA-MB-231 (4x104/biakan) sebelumnya dilakukan
uji dalam 100 μL dari medium bebas FBS. Isomangiferin kemudian ditambahkan pada ruang
atas (8 μm; BD Biosciences) dengan konsentrasi yang berbeda bersama dengan 50 ng/mL
VEGF. Pada bagian bawah biakan diisi dengan 600 μL media yang berisi 0.5 % FBS. Setelah
sel diterapi selama 4 sampai 6 jam untuk memungkinkan migrasi sel dari ruang atas ke ruang
bawah. Sel telah diikat dengan paraformaldehyde 4% selama lebih dari 30 menit. Sel yang
tidak bermigrasi dan tetap berada di ruang atas biakan secara hati-hati dihilangkan
menggunakan cotton swab dan sel yang bermigrasi ke ruang bawah biakan diwarnai dengan
violet kristal 1%. Protokol untuk uji invasi sel hampir sama seperti uji migrasi, kecuali
membran pada ruang atas biakan dipenetrasi dengan gelatin 0.1 %. Gambar difoto
menggunakan mikroskop inverted (Olympus Life Science, Tokyo, Japan). Sel yang
bermigrasi ke bagian bawah ruang biakan dihitung dalam 5 sediaan yang dipilih secara acak.

Uji Ring Aortic Tikus

Aorta thoracis tikus dibedah dan dipotong menjadi bentuk cincin dengan diameter
sekitar 1-1.5 mm dan secara acak ditempatkan pada biakan berlapis Matrigel. Cincin yang
tipis ditutupi dengan 100 μL Matrigel lainnya dan dibiarkan mengeras selama 30 menit,
kemudian ditambahkan media segar tanpa serum. 24 jam kemudian, media diganti dengan
media segar yang mengandung 2.5 % FBS tanpa isomangiferin atau dengan konsentrasi yang
berbeda dari isomangiferin. Media diperbaharui setiap dua hari sekali. Setelah 5 hari,
microvessel yang tumbuh difoto menggunakan mikroskop inverted (Olympus Life Science).
Uji pembentukan tabung in vitro
50 microliters Matrigel (BD Biosciences) per biakan ditambahkan pada biakan dari 96
sediaan biakan yang didinginkan sebelumnya dan dipolimerasi pada suhu 37oC selama 30
menit. HUVECS (6.5 X 10 3/biakan) yang telah diberikan sediaan berlapis Matrigel dan
diterapi dengan konsentrasi bervariasi isomangiferin yang mengandung 50 ng/mL VEGF
setelah dibiarkan selama 6 jam. Media kultur tanpa VEGF digunakan sebagai kontrol negatif.
Setelah 10 jam, pembentukan tabung dicatat dengan foto dan struktur tabung dihitung secara
manual.

Uji Apoptosis
Alat deteksi apoptosis (BD Bioscience) digunakan untuk uji induksi apoptosis pada
sel kanker payudara oleh isomangiferin. Setelah diterapi dengan isomangiferin selama 36
jam, sel MDA-MB-231 dikumpulkan, dicuci, dan diwarnai dengan annexin V-fluorescein
isothiocyanate dan propidium iodide dan dianalisis dengan aliran cytometry menggunakan
apparatus EACSCalibur seperti yang dijelaskan di tempat lain.

Uji adhesi
Biakan dari 24 sediaan telah dilapisi 0.04 μg/ μL Matrigel dicampur dengan media
bebas FBS semalaman. Sel MDA-MB-231 (mendekati 106) ditambahkan pada setiap biakan
dan dibiarkan untuk mencapai 90% . Sebelum digunakan, sel dicuci untuk menghilangkan
serum. Untuk uji hambatan adhesi isomangiferin, sel MDA-MB-231 diinkubasi dengan
konsentrasi indikasi isomangiferin selama 1 jam. Bersamaan dengan inkubasi, sel menempel
di lapisan Matrigel pada biakan. Sel yang tidak melekat dihilangkan dengan cara dicuci 3 kali
dengan saline tahan phosphate. Setelah diikat dengan paraformaldehyde 4% dan diwarnai
dengan 1 % kristal violet, jumlah sel yang melekatdiukur menggunakan mikroskop inverted
yang telah disebutkan di atas.

Uji Vaskuler Endothelial Growth Factor receptor 2 Kinase

Aktifitas kinase VEGFR-2 (CST HTScan, Cat No. #7788) dilakukan menggunakan
alat uji kinase VEGFR-2 yang diperoleh dari Cell Signaling Technology. Secara singkat,
aktifitas kinase diukur dalam suatu uji radiometrik menggunakan komposisi: 4 mM 3-(N-
morpholino) asam propanesulfonic (pH 7.2), 2.5 mM β-glycerophosphate, 1 mM
ethyleneglycol-bis-(2-aminoethyl ether)-N,N’”-asam tetraacetic, 0.4 mM asam
ethylenediamine tetraacetic (EDTA), 4mM magnesium chloride hexahydrate, 0.05 mM
dithiothereitol, dan 50 µM adenosine triphosphate. Substrat rekombinan protein dasar myelin
manusia (200 ng/µL) dan dan variabel jumlah dari rekombinan VEGFR-2 manusia.
Penghambat SU5408 dan kinase VEGFR-2 I digunakan sebagai kontrol positif.
Analisis Western blot
Sel MDA-MB-231 dan HUVECs telah dipre-terapi dengan dan tanpa berbagai
konsentrasi isomangiferin selama 1 sampai 2 jam. Sel kemudian distimulasi dengan VEGF
(100ng/mL) selama 5 samapai 20 menit. Protein total yang diekstrasi menggunakan buffer
lysis RIPA (50 nM Tris-HCL, 150 mM Nacl, 5mM EDTA, 1 %Triton X-100, 1 % asam
sodium deoxycholic, 0.1 % sodium dodecyl sulfate (SDS), 2 mM phenyl methylsulfonyl
fluoride, 30 mM Na2HPO4, 50 mM NaF, dan 1 mM Na3VO4 selama 30 menit di es seperti
yang dijelaskan ditempat lain [20,21]. Setengah kuantitas protein dari masing-masing sampel
diberikan gel sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide elektrophoresis dan protein, ditransfer
ke filter membran nitrocellulose. Blots diinkubasi dengan antibodi spesifik kemudian
dibiarkan selama 1 jam pada temperatur ruang dengan 5% FBS, blots diperiksa dengan LI-
COR Infrared Imaged Odyssey (Gene Company Ltd, Hong Kong, China).

Analisa Statistik

semua hasil statistic dianalisa dengan menggunakan Student test, kecuali analisis
statistic untuk berat tumor yang menggunakan Two-way ANOVA dengan aplikasi Graphpad
Prisma 5. Setiap experiment diterbitkan secara terpisah dengan rangkap tiga. Hasil yang
menunjukkan p<0,05 menunjukkan hubungan yang spesifik.
 HASIL

Isomangiferin menghambat pertumbuhan kanker payudara dan menghalangi VEGFR-

2 pathway pada preparat xenograft
MDA-MB-231 xenograft breast tumor model digunakan untuk melihat efek dari
isomangiferin pada pertumbuhan tumor atau angiogenesis(Pertumbuhan pembuluh darah
baru) secara in vivo. Volume tumor dihitung selama proses perlakuan. Seperti yang terlihat
pada gambar 1A dan 1B, membandingkan antara control dan xenograft yang diberi perlakuan
isomangiferin, pertumbuhan tumor yang diberi perlakuan dengan isomangiferin menjadi lebih
lambat. Analisis statistic mengungkapkan terdapat perbedaan yang signifikan antara grup
control dan grup yang diperi perlakuan, yang mengindikasikan bahwa isomangiferin dapat
menekan tumor payudara secara in vivo. Terutama, tumor pada grup control mempunyai
pembuluh darah yang kecil dibandingkan dengan tumor yang diberi perlakuan (memberi
warna yang merah gelap seperti terlihat pada gambar 1A atas, vs penampakan pucat pada
gambar 1A bawah). Kami memperkirakan bahwa ada kemungkinan isomangiferin
menghambat pertumbuhan pembuluh darah (angiogenesis), yang benar-benar dapat
mempengaruhi pertumbuhan tumor. Antibody VEGVR-2 digunakan untuk memberi
pewarnaan tumor yang solid guna menilai pertumbuahan pembuluh darah (angiogenesis)
pada tumor. Seperti yang terlihat pada hasil imunohistokimia gambar 1D, intensitas dari
pewarnaan VEGR-2 pada kelompok perlakuan menunjukkan hasil yang nyata bahwa
kelompok perlakuan memiliki intensitas pewarnaan yang lebih rendah. Ekspresi dari CD31,
yang merupakan penanda dari permukaan pembuluh darah sel endotel, tampak berkurang
karena diberi perlakuan isomangiferin. Dari beberapa hasil diatas dapat disimpulkan bahwa
isomangiferin secara sebagian dapat meghambat pertumbuhan tumor akibat cara kerjanya
yang menghambat angiogenesis.

Isomangiferin menurunkan viabilitas sel

Pertama kami menguji efek dari 1µM isomangiferin pada sel kanker payudara MDA-
MB-231, T47D, MCF7, SKBR3, 4T1 dengan epitel payudara normal pada manusia
menggunakan alat MTS viability assay. Seperti terlihat pada gambar 2A, perlakuan tumor
payudara dengan isomangiferin secara jelas menghambat viabilitas sel dibanding control.
Separuh dari maksimal IC50 isomangiferin untuk sel tumor payudara mencapai hamper 1µM,
dimana IC50 untuk sel MCF-10A melewati 100µM, hal tersebut mengindikasikan bahwa
isomangiferin lebih toksik untuk sel kanker daripada sel yang normal. Hal ini menunjukkan
bahwa isomangiferin memiliki efek yang selektif terbatas pada sel kanker payudara saja.

Isomangiferin menghambat migrasi dan invasi dari sel MDA-MB-231

Pada kanker payudara, metastasi yang berhubungan dengan rekurensi masih menjadi
hal yang sering terjadi dan bertanggungjawab terhadap angka mortalitas. Untuk menentukan
efek efek isomangiferin pada metastasis kanker payudara, kami menunjukkan uji migrasi dan
invasi sel menggunakan sel MDA-MB-231. Sel tersebut memiliki mobilitas malignansi yang
tinggi. Hasil dari uji migrasi dan invasi menunjukkan bahwa bersamaan dengan
meningkatnya doseis isomangiferin, angka migrasi dan invasi menurun secara drastic. Hasil
tersebut mengindikasikan bahwa isomangiferin dapat menghambat kebiasaan migrasi dan
invasi dari sel MDA-MB-231.

Isomangiferin menghambat pertumbuhan pembuluh darah kecil dan tubulogenesis

vaskuler dari sel endotel
uji cincin cincin aorta tikus adalah uji klasik untuk mempelajari semua step pada
angiogenesis seperti aktivasi sel endotel, kemampuan pericyte, migrasi, dan perbaikan diri.
Uji cicin aorta diteliti untuk mengetahui efek anti angiogenik dari isomangiferin. Seperti yang
terlihat pada gambar #A, pada grup control, angka yang besar dari pertumbuhan pembuluh
darah dari cincin aorta pada hari ke5 hingga menempel pada Matrigel. Di sisi lain, secara
signifikan isomangiferin mengurangi pertumbuhan sel darah kecil. Formasi pembuluh darah
kecil (mikrovessel) secara tuntas diblok oleh 1µM isomangiferin. Sel endothelial secara
spontan terbentuk kapiler tiga dimensional yang tersingkap pada Matrigel. Karakteristik
tersebut seharusnya dapat diaplikasikan sebagai peniru angiogenesis pada manusia. Dengan
menggunakan uji formasi pipa tiga dimensi vaskuler, kami menguji efek isomangiferin pada
formasi miniature pipa dari sel endotel. HUVECs diberi perlakuan dengan perbedaan
konsentrasi dari isomangiferin yang ditambahkan ke permukaan Matrigel. pipa pipa
pembuluh darah secara komplit dihambat oleh isomangiferin pada konsentrasi 3µM (gambar
3C dan 3D). Diambi secara bersamaan, data tersebut menunjukkan bahwa isomangiferin
menurunkan proses pembentukan pembukuh darah(angiogenesis) dari sel endotel.

Isomangiferin menginduksi apoptosis sel tumor menghalangi perlekatan antar sel

Analisis flow cytometri digunakan pada sel MDA-MB-231 untuk melihat apakah
isomangiferin dapat menginduksi sel untyk apoptosis. Seperti terlihat pada gambar 3E,
isomangiferin mempengaruhi apoptosis sel MDA-MB-231 pada dosis yang telah ditentukan.
Terlebih saat konsentrasi isomangiferin meningkat dari 0 hingga 5µM, presentasi sel yang
apoptosis meningkat dari 7,15% sampai 13,06%. Kami menggunakan uji
adhesi(perlengketan) untuk menguji efek isomangiferin pada sel kanker payudara. Hasilnya
dapat dilihat pada gambar 3F yang menunjukkan bahwa isomangiferin menghalangi
penangkapan sel kanker yang hidup yang akan menuju ke Matrigel, dengan cara mengimitasi
proses perlengkatan dan penetrasi sel payudara dari lingkuan tumor yang kecil
(microenvironment). Dari proses berikut, didspatkan bahwa isomangiferin memiliki efek
menghambat pertumbuhan dan adesi (perlengketan) dari kanker payudara.
Gambar 3. Isomangiferin menghambat faktor pertumbuhan endotel vaskuler (VEGF) -
mengurangi pertumbuhan pembuluh darah kecil dan formasi tabung dari sel endotelial vena
umbilikal manusia (HUVECs) dan menginduksi sel-sel kanker payudara MDA-MB-231
untuk apoptosis dan adhesi. (A) Dari tikus Sprague-Dawley, bagian aorta diisolasi dan
kemudian ditempatkan di sumur-sumur yang dikuasai oleh faktor-faktor yang mengurangi
pertumbuhan Matrigel. Untuk merangsang angiogenesis, cincin pembuluh itu diobati dengan
50 mg / mL VEGF dengan ada atau tidaknya isomangiferin selama 5 hari. Foto-foto
perwakilan dari pembentukan sel-sel endotel sel percabangan tali dari pinggiran cincin aorta
di bawah perawatan 1 μM isomangiferin. (C) Isomangiferin menghambat pembentukan
tabung VEGF-induced dari tabung HUVEC. HUVECs ditempatkan di piring 96-well dilapisi
dengan Matrigel (6,5 × 103 per sumur). Setelah 10 jam, sel-sel diperbaiki, dan struktur
tubular difoto (pembesaran, x 100). (D) Hasil statistik Gambar 3C. Nilai-nilai ditampilkan
sebagai mean ± SEM dari tiga percobaan independen. (E) Setelah inkubasi dengan dosis
isomangiferin yang berbeda selama 36 jam, MDA-MB-231 sel dikumpulkan dan apoptosis
dinilai oleh annexin V-fluorescein isothiocyanate dan prodidium iodide (annexin V / PI)
pewarnaan dan aliran cytometry (n = 3). (F) MDA-MB-231 sel diinkubasi dengan dosis yang
diindikasikan dari isomangiferin selama 1 jam. Setelah inkubasi, sel-sel diekspos dan
dipatuhi Matrigel. Setelah 1% kristal ungu bernoda, jumlah dan fenotipe sel yang menempel
ditentukan oleh mikroskop (pembesaran, x 400). * P <0,05 vs kontrol; † p <0,01 vs. kontrol;
‡ p <0,001 vs. kontrol.

Gambar 4. Isomangiferin menekan kanker payudara melalui penghambatan jalur signaling 2

reseptor vaskular dari endotel vaskular (VEGFR-2). (SEBUAH) Isomangiferin menginduksi
apoptosis sel. Protein dari MDA-MB-231 sel yang diobati dengan konsentrasi isomangiferin
yang ditunjukkan selama 24 jam diajukan Western blot untuk immunoblotting dari caspase-3
dan polimer poli-polymerase (ADP-ribose polymerase) yang terbelah. (B) Isomangiferin
tentang ihibiton proliferasi sel kanker payudara tergantung pada aktivitas VEGFR-2. 100 nM
SU5408 digunakan atau tidak untuk memblokir aktivitas VEGFR-2 dan kemudian MDAMB-
231 sel diobati dengan isomangiferin. Proliferasi sel dinilai dengan tes MTS. Nilai
ditampilkan sebagai rata-rata ± standard error dari rata-rata dari tiga eksperimen independen.
(C) Isomangiferin menekan aktivasi VEGFR-2 pada sel-sel endotel vena umbilikalis manusia
(HUVECs). Aktivasi VEGFR-2 dianalisis dengan Western blot dan diperiksa dengan antibodi
yang ditunjukkan. Western blot dilakukan dengan cara yang dijelaskan dalam Metode dan
menggunakan antibodi spesifik yang sesuai. PARP = poli ADP-ribosa polimerase; NS = tidak
signifikan; p-AKT = protein terfosforilasi kinase B, p-PKB / p-AKT; AKT = protein kinase
B, PKB / AKT; p-ERK = protein kinase terekstraseluler terfosforilasi; ERK protein kinase
teregulasi ekstraseluler; p-STAT3 = transduser sinyal terfosforilasi dan penggerak transkripsi
3; FAK = kinase adhesi fokus. * P <0,05 vs kontrol; † p <0,01 vs. kontrol.
Isomangiferin Memicu Jalur Apoptosis Kaspase Dependen Dan Menghambat Jalur
Isyarat VEGFR-2-Mediated
Uji kinase VEGFR-2 dilakukan untuk menyelidiki apakah isomangiferin merupakan
inhibitor VEGFR-2 potensial untuk terapi kanker payudara. SU5408, penghambat sel-
permeabel klasik dari kinase VEGFR-2, memiliki IC50 72,42 nM, yang konsisten dengan
laporan sebelumnya [22]. Isomangiferin juga menghambat aktivitas kinase VEGFR-2 dengan
IC50 820,67 nM (Tambahan Tabel 1, tersedia online). Pemeriksaan western blot
mengungkapkan bahwa pengobatan isomangiferin mengarah ke aktivasi PARP dibelah dan
pengurangan caspase 3 di Sel MDA-MB-231 (Gambar 4A). Untuk mengkonfirmasi lebih
lanjut bahwa penekanan yang dimediasi isomangiferin dari sel-sel kanker payudara
tergantung pada sinyal VEGFR-2, sel-sel yang tidak diobati atau pra-perawatan dengan 100
nM SU5408 sebelum perawatan dengan berbeda konsentrasi isomangiferin. Seperti yang
ditunjukkan pada Gambar 4B, isomangiferin menghambat proliferasi sel MDA-MB-231
dengan cara yang tergantung dosis (kolom biru). Sebaliknya, proliferasi sel pra-perawatan
dengan SU5408 tidak terhambat oleh isomangiferin (kolom merah tua). Kunci dari
pemeriksaan isyarat molekul yang terlibat dalam isyarat VEGFR-2-mediated jalur
pengobatan isomangiferin mengungkapkan bahwa isomangiferin dengan kuat menghambat
fosforilasi VEGFR-2 yang diinduksi VEGF di situs Tyr1175 dengan cara yang bergantung
pada konsentrasi (Gambar 4C). Isomangiferin menekan ekspresi p-AKT, protein kinase
terkontrol ekstraseluler terfosforilasi (p-ERK), p-STAT3, dan FAK, sedangkan jumlah total
AKT atau protein kinase teregulasi ekstraseluler (ERK) tidak terpengaruh. Protein ini adalah
molekul hilir VEGFR-2 dan memainkan peran penting dalam proliferasi, migrasi, dan
diferensiasi sel-sel endotel, menunjukkan bahwa isomangiferin menghambat angiogenesis
melalui VEGFR-2-dimediasi jalan.

DISKUSI
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menguji potensi terapeutik VEGFR-2 untuk
kanker payudara. Temuan kami menunjukkan bahwa molekul alami isomangiferin mungkin
memiliki potensi untuk menekan pertumbuhan tumor payudara manusia, metastasis, dan
angiogenesis dengan menargetkan jalur pensinyalan VEGFR-2.
Sel-sel kanker mensekresikan VEGF untuk mengaktifkan jalur VEGFR-2, yang pada
gilirannya merangsang proliferasi terkait kanker, migrasi, invasi, dan angiogenesis.
Angiogenesis sangat penting untuk suplai darah dan nutrisi ketika tumor berkembang,
sehingga berperan penting dalam semua langkah tumorigenesis termasuk pertumbuhan
tumor, invasi, dan metastasis. Jalur pensinyalan VEGF dimulai ketika VEGF mengenali dan
berikatan dengan reseptornya, tyrosine kinase VEGFR. Pensinyalan terlibat dalam
angiogenesis terutama dimediasi oleh VEGFR-2. Secara khusus, aktivasi VEGFR-2
mengarah ke aktivasi lebih lanjut dari banyak molekul sinyal intraseluler yang berbeda,
seperti itu sebagai FAK, phosphoinositide 3-kinase / AKT kinase, mamalia target rapamycin
(mTOR) / ribosomal protein S6 kinase (P70S6K), protein kinase C / protein kinase D [23],
ERK [24].
Karena jalur sinyal VEGFR-2 adalah ciri dari kanker, Food and Drug Administration
Amerika Serikat baru-baru ini bevacizumab yang disetujui (dipasarkan sebagai Avastin®), a
antibodi monoklonal terhadap VEGF, untuk pengobatan kanker. Yang penting, obat ini dapat
bersifat kuratif dalam banyak jenis kanker [25]. Mencari yang lebih aman, terjangkau, dan
berkhasiat molekul kecil dengan aktivitas penghambatan terhadap VEGFR-2 jalur adalah area
panas dalam penelitian kanker.
Di sini, kami menunjukkan bahwa isomangiferin menghambat proliferasi dari beberapa
jalur sel kanker payudara secara in vitro, dan kemanjurannya terhadap kanker payudara
ditunjukkan secara in vivo juga. Selain itu, konsentrasi isomangiferin serendah 1 μM cukup
untuk merusak respon angiogenik yang diinduksi VEGF baik secara in vitro maupun in vivo.
Pada 3 μM, isomangiferin hampir seluruhnya memblokir pembentukan struktur kapiler dan
microvessel proses sprouting. Hasil kami menunjukkan bahwa isomangiferin memiliki
aktivitas anti-angiogenik yang mengarah ke penghambatan pertumbuhan tumor. Kami juga
menunjukkan isomangiferin itu pengobatan menginduksi apoptosis sel MDA-MB-231
melalui jalur tergantung caspase.
Isomangiferin menghambat kanker payudara terutama dengan memblokir VEGFR-2-
dimediasi jalur angiogenesis. Dalam penelitian ini kami tidak hanya memverifikasi bahwa
isomangiferin menghambat VEGFR-2 jalur, tetapi juga membuktikan bahwa isomangiferin
memiliki penghambatan langsung aktivitas untuk memblokir aktivitas in vitro VEGFR-2, jadi
mungkin berfungsi sebagai antagonis reseptor tirosin kinase. Dengan mempertimbangkan
bahwa VEGFR-2 adalah target terapi yang penting, isomangiferin mungkin memiliki potensi
besar untuk dikembangkan dengan cara yang sama seperti VEGFR-2 inhibitor kinase
molekul kecil. Namun, ada beberapa keterbatasan dalam penelitian kami. Kami tidak
mengesampingkan mekanisme molekuler lain yang juga bisa berkontribusi aktivitas anti
kanker isomangiferin. Misalnya, sedikit diketahui tentang aktivitas anti kanker isomangiferin
dibandingkan dengan bahwa analognya, mangiferin. Dengan demikian, dapat disimpulkan
bahwa isomangiferin dan mangiferin mungkin berbagi beberapa molekul mekanisme dan
tindakan farmakologis. Misalnya, mangiferin dapat mengurangi kadar glukosa darah dan
mengurangi sel metabolisme nutrisi [26]. Kita dapat secara logis berspekulasi tentang
isomangiferin itu mungkin memiliki beberapa fungsi analog untuk menurunkan keganasan
tumor melalui downregulation dari metabolisme glukosa sel dan asupan nutrisi. Selanjutnya,
di studi sebelumnya, mangiferin menyebabkan penangkapan siklus sel manusia sel HL20
promyelocytic leukemia dengan meningkatkan stabilitas protein Nrf2 melalui penghambatan
ubiquitination nya dan degradasi [27]. Studi lain melaporkan bahwa mangiferin menghambat
invasi LNCaP pada sel kanker prostat manusia menekan faktor-κB nuklir dan matriks
metalloproteinase-9 [28].
Mengenai aktivitas anti kanker isomangiferin, relatif pengalaman penelitian yang matang
dengan mangiferin menyediakan contoh yang baik dan arah yang menjanjikan. Dalam
penelitian ini, isomangiferin menghambat angiogenesis tumor dengan memblokir kinase
aktivitas VEGFR-2 serta sinyal hilirnya termasuk p-AKT, p-ERK, dan FAK. Menariknya,
tumor penghambat angiogenesis juga telah terungkap sebelumnya dalam potensinya peran
mangiferin dalam pengobatan kanker [29]. Hasil kami meningkatkan kesadaran akan
farmakologi isomangiferin mekanisme dan mengungkapkan mekanisme inovatif
isomangiferin properti anti-kanker.
Kesimpulannya, molekul isomangiferin kecil alami memiliki potensi untuk menghambat
pertumbuhan tumor payudara, metastasis, dan angiogenesis, dan bertindak dengan
menargetkan pensinyalan VEGFR-2 jalan. Studi kami memberikan bukti bahwa
isomangiferin memiliki nilai potensial dalam pengobatan kanker payudara.