Usp 38 Pruebas Microbiologicas / (51) Pruebas de Eficacia Antimicrobiana 109 Pruebas Microbiolégicas (51) PRUEBAS DE EFICACIA ANTIMICROBIANA Cambio en ta redaccién: INTRODUCCION Los conservantes antimicrobianos son sustancias agregadas a productos farmacéuticos acuoses, Las formas fatmacéuticas no estérles pueden tener conservantes agregados para protegerlas del desarrollo de microorganismos introducidos inadvertida mente durante 0 después del proceso de fabricacién. En el caso de articulos estériles envasacos en envases multidosis, los con- servantes antimicrobianos se agregan para inhibir el desarrollo de microorganismos que puedan introducirse por la extraccién reiterada de dosisindividuales. En todas las unidades multidosis estériles se espera encontrar uno © més conservantes antimi- crobianos, Los conservantes antimicrobianos no deben emplearse en lugar de las buenas précticas de fabricaci6n, solamente para redu- Cir la poblacién microbiana viable de un producto no estérl, 0 para controlar la biocarga antes de la esterilizacién de formula Ciones multidosis durante la fabricacién. Los conservantes antimicrobianos de las formas farmacéuticas farmacopeicas cumplen Con los requisitos en 5.20 Sustancias Agragadas de las Advertencias y Requistos Generales TTodos los agentes antimicrabianos titles son sustancias toxicas. Para la maxima proteccién de los pacientes, la concentra: ci6n del conservante que se indique como eficaz en el producto envasado final debe ser inferior al nivel que pueda resultar téxico para los seres humanos, baséndose en la dosis recomendada del producto medicinal La concentracién de un conservante antimicrobiano agregado puede mantenerse al rinimo silos ingredientes activos de la formulacién poseen actividad antimicrobiana intrinseca. La eficacia antimicrobiana, ya sea inherente al producto 0 producida por la adicién de un conservante antimicrobiano, debe ser demostrada para todas las inyecciones envasadas en envases multi dsis © para otros productos que contengan conservantes antimicrobianos. La eficacia antimicrobiana debe ser demostrada paara formas farmacéuticas de base acuosa, multidos's tpicas y arales, y para otras formas farmacéuticas, como por ejemplo ‘oftalmicas, éticas, nasales, de irigacién y liquids de dials (ver Formas Farmacéuticas (1151). Para los propésitos de la prue- baa, “acuoso” se define como una actividad de agua de més de 0,6 (ver Determinacién de Actividad de Agua en Productos Farma- cbuticos No Esténles (1112), Los organismos de desafio se hasan generalmente en los posibles contaminantes del producto farmacéutica, teniendo en ‘cuenta fos atributos fisicos, la formulacion y el uso prevsto del mismo. La serie de organismos de desaffo estindar descrita en esta prueba no necesita prevenir la inclusidn de otras especies, si se considera itil para medi la actividad biologica de los con. servantes de un producto especifico. Estos organismos de desafio suplementarios no se discuten en este capitulo, pero se pue- den afadir a los organismos de prueba descritos. PTs) PROCEDIMIENTOS GENERALES jtulo proporciona procedimientos para demostrar la eficacia de conservantes antimicrobianos agregadas. Fstos conser- vantes antimicrobianos deben estar declarados en la etiqueta. Los procedimientos y los criterios de aceptacion para la eficacia se aplican a un producto en el envase original sellado en el que fue distribuido por el fabricante (ver la Tabla T para categorias de productos). Esta prueba no tiene que realzarse en estos envases, pero se debe evitar el uso de materiales que puedan inte. raccionar con el conservante en los envases que se usan para la prueba de eficacia microbiana, Procedimiento de Promocién del Crecimiento y Aptitud del Método de Recuperacion CCONSIDERACIONES GENERALES Debe establecerse la capacidad del procedimiento para detectar microorganismos de desafio en presencia de un producto a examinar adecuadamente neutralizado. La aptitud del procedimiento debe volver a contirmarse si se produce algun cambio en los materiales 0 métodos, el producto o los materiales que estan en contacto directo can el producto y que pueda alterar los resultados de la prueba Debe establecerse la capacidad promotora del crecimiento de los medios usados en este procedimiento,Capitulos 110 (51) Pruebas de Eficacia Antimicrobiana / Pruebas Microbiologicas usp 38 PREPARACION DE CEPAS DE PRUEBA sar suspensiones estandarizadas de cepas de prueba o preparar segtin se indica a continuacién, Las técnicas de manteni- Imiento de cultivos de lote de siembra (sistemas de lote de siembra) se san para que los microorganismos viables empleados paara inoculacién correspondan a no mas de cinco pasajes desde el lote de siembra maestro original. Cultivar por separado ‘cada cepa bacteriana y fungica de prueba (ver la Tabla 2) sat los cultivos de fos siguientes microorganismos:' Candida albicans (ATCC N° 10231), Aspergillus brasiliensis (ATCC N° 116404), Escherichia coli (ATCC N° 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC N® 9027) y Staphylococcus aureus (ATCC N° 6538) Los microorganismos viables empleados en el procedimiento deben formar parte de un cultivo de crecimiento reciente (p.¢}, «en fase logaritmica de crecimiento) a excepcidn de las esporas A. brasiliensis. Se describen las condiciones de cultivo para el indculo (ver la Tabla 2) donde los medios adecuados son el Agar Digerido de Caseina y Soja © Medio de Agar Sabouraud Dex- trosa. Para cosechar los cultivas bacterianos y de C. albicans, emplear solucién salina SR esti, lavar la superficie de crecimiento y recagerlo en un recipiente adecuado. Para cosechar las esporas de A. broslenss, usar solucion salina SR estéril que contenga 10,05% de polisorbato 80. La suspension de esporas debe tratarse asépticamente (pz, fitracién a través de lana de vidrio esté- rl) para elimiinarhifas. Todas las suspensiones microbianas deben prepararse para garantizar que no se produce un traslado de ‘medio de crecimiento residual del inéculo (p.e., centrfugacién seguida de resuspension en un liquido de suspensién estéril apropiado). ‘Como alternativa, los organismos del cultivo madre pueden crecer en un medio liquid adecuado (es decir, Caldo Digerido de Caseina y Soja 0 Caldo Sabouraud Dextrosa) y las células se pueden cosechar mediante centrifugacién, luego lavar y resus- ender en liquido de suspensién estérl apropiado. Las suspensiones microbianas que se usan para inoculaciones deben ajustar- se para obtener un recuento microbiano de aproximadamente 1 x 108 ufc/mL. Usar las suspensiones bacterianas y de levaduras dentro de las 2 horas 0 dentro de las 24 horas, sise almacenan entre 2" y 8°. Se puede preparar una suspensién de esporas stable y mantenerla a 2°-8° hasta 7 dias. [NoTE—Elcélculo estimado de la concentracién del inéculo se puede obtener me- diante procedimientos turbidimétricos para los microorganismos de desafio y luego confirmarse mediante un recuento en pla- al PROMOCION DEL CRECIMIENTO DE LOS MEDIOS Los medios usados en este procedimiento deben ser capaces de permitir el crecimiento microbiano. Analizar cada partida de medio listo para usar y cada partida de medio preparado a partir de medio deshidratado o de los ingredientes descritos Para medios s6lidos, los recuentos obtenidos deben ser al menos 50% del valor calculado para un inéculo estandarizado. Para un indculo recientemente preparado, se produce un crecimiento de microorganismos comparable al obtenido anterior- mente con una partida de medio analizada y aprobada previamente. Aptitud del Método de Recuento en Presencia del Producto Preparar una dilucién 10-! (en volumen) agregando 1 mL del producto a 9 mL de solucién salina u otro diluyente neutrali- zante, Continuar este patron de dilucién hasta niveles de dilucién 10-? y 10-, Agregar un ntimero apropiado de organismos de desafio a cada tubo de producto diluido, mezclar y sembrar en placa un volumen adecuado de cada dilucién para obtener menos de 250 ufe/placa para bacteria y levaduras (idealmente entre 25 y 250 ufc) menos de 80 ufe/placa para A. brasiliensis (dealmente entre 8 y 80 ufc). Esta siembra en placa debe realzarse como minimo por duplicado (aunque un ntimero mayor de repeticiones puede ser til para minimizar la variabilidad en la estimacién del recuento en placa). Se realiza un contol posi- tivo de este procedimiento al introducir los mismos inéculos en solucién salina y transferie vokimenes similares de soluci6n s na a placas de agar. Un patron de recuperacién adecuado es aquel que proporciona al menos 50% del recuento de esta solu- cién salina de control (promediado). Si el producto diluido presenta propiedades antimicrobianas, quizas deban incorporarse neutralizadores espectficos alos di- luyentes o a los medios de recuperacin. Para més informacién, ver Validacién de Recuperacién Microbiana en Articulos Farmaco peicos (1227). La eapacidad del procedimiento para medir la eficacia de los conservantes puede verse comprometida sila aptitud del méto- do requiere una dilucién significativa (10 6 10°), ya que esto afectara la recuperacién medida (p.¢j., puede ser dificil medir una reduccién logaritmica de 3 unidades para un inéculo de 10-10). Sino se encuentra un agente neutralizador 0 método. adecuado y la aptitud del método requiere una ailucin signiticativa, se puede usar un nivel mas alto de indculo (p.¢)., 107- 10) de manera que se pueda medir una reduccin logaritmica de 3 unidades, El promedio de la recuperacion informada no puede ser menos de 1 ufc/placa (0 100 ufc/mL si se realiza el recuento en placa de 1 mL por duplicado a una dilucién de 10". La fitracién por membrana se puede usar para fillrar volimenes mas grandes de diluciones para contrarrestar esta dificultad © para asistr en la neutralizaci6n de las propiedades antimicrobianas "Disponible en American Type Culture Colection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2208 (hitps/wwwatce or)Usp 38 Pruebas Microbiologicas | (51) Pruebas de Eficacia Antimicrobiana 111 Anilisis del Producto ‘CATEGORIAS DE PRODUCTOS Para los fines de analisis, los articulos farmacopeicos se dividen en cuatro categorias (ver la Tabla 1). Los criterios de eficacia antimicrobiana para estos productos se establecen en funcin dela ruta de administracion. Es de esperar que las formulaciones que contienen conservantes cumplan con los estndares minimos de eficacia, si estin envasados en envases multidosis 0 en. envases unitarios ‘Tabla 1. Categorias de Productos Farmacopeleos _ Categoria = Descripelén del Producto - Inyecables, otros parenteralesincluyendo emubiones, productos cos, productos nsaes estes y productos _ 1 ‘tlbnices preparados con baes 0 vehicuos 200s —" ‘Productos empleads de manera tpica preparados con bases o vehiculosacuosos, productos natal no esr _2___| Tes yemulsionesincluyendo aquélos que se aptican a membrana mucosas — 3 Productos orale a excepcién de anticids, preparados con bases 0 vehicules 3cuos0s 4 Anticids preparados con una base acuosa PROCEDIMIENTO El procedimiento puede realizarse ya sea en cinco envases originales, si hay suficiente volumen de producto disponible en cada envase y si el envase del producto puede ser penetrado asépticamente (es decir, agua y jeringa a través de un tapon de .goma elastomérico), 0 en cinco recipientes bacteriologicos estériles con tapa [inerte con respecto a los agentes antimicrobia- nos] de tamafio adecuado a los que se ha transferido un volumen suficiente de producto. inocular cada envase o recipiente, segiin corresponda, con uno de los inéculos preparados y normalizados, y mezclar. El volumen de suspension del inéculo em- pleado esté entre 0,59 y 1,0% del volumen de! producto para minimizar los efectos potenciales en el producto. La concentra- cién de microorganismos de prueba agregados al producto (Categoria 1; 2.6 3) es tal que la concentracién final de la prepara- cién de prueba después de la inoculacién esta comprendida entre 1 x 10% y 1 x 10¢ ufe/ml del producto. En los productos de la Categoria 4 (anticidos), la concentracién final de la preparacién de prueba después de la inoculaci6n esté comprendida en- tte 1 x 10°y 1 x 10* ufc/mt det producto. La concentraci6n inicial de microorganismos viables en cada preparacién de prueba se calcula a partir de la concentracion dde micraorganismos en cada inéculo normalizado determinada mediante el método de recuento en placa. Incubar los envases fo recipientes inoculados a 22,5 + 2,5°. Tomar muestras de cada uno de ellos en los intervalos apropiados (especificados en la Tabla 3). Registrar todos los cambios de apariencia observados en estos intervalos. Determinar mediante el procedimiento de recuento en placa el numero de ufc presentes en cada preparacin de prueba en los intervals correspondientes (ver Procedi- ‘mientos Generales en Pruebas de Recuento Micrabiano (61). El recuento en placa se realizaré usando un minimo de placas por duplicade, con el niimero de ufc promediado antes de la determinacién de ufc/ml. deducido. Si se usa fitracién por membra- ra, usar fitras de membrana por duplicado para cada estimacién. Usando las concentraciones calculadas de ufc/mL presentes al inicio de la prueba, calcular el cambio en valores log,, de la concentraci6n de ufc/mL para cada microorganismo en los in- tervalos de prueba aplicables, y expresar los cambios en la concentracién en términos de reducciones logaritmicas. La reduc- cién logaritmica se define como la diferencia entre el valor de la concentacién inicial de ufc/mL en la suspensién, en unidades |og,»,y el valor de ufc/mL, en unidades log, de los sobrevivientes al tiempo correspondiente. ‘Tabla 2. Condiciones de Cultivo para la Preparacién de Indeulos - Tiempo de Tempo teeton de Yemperaturs de neuen Treoperactoe ___organtmo Medio Apropiads dsiocubacn ‘tinsel mcrobiana Gd Died de Casa ‘oie fst co os Die de Cay | ance 8739 se - Penner x30 Calde Bigs de Casa so | Piemonascenmore | eat Digeio de Ctenny| | | ite 9027) sa mesecy, apseas ie2tnoms | asin aldo Digerido de Caseina y) | sons | | | Stepmcocasouren | Agr Digeo de Caseinay | cen 38) PA | aaseas __twrinoas | sin Wedio de ar abouraod | 1 Candas Denve | | [arcenr 10231) | Caldo Sabouraud Dexvosa| 22.5 + 2.5 | 44.52 horas ey