La investigación encontró que la iniciación abortiva, donde la ARN polimerasa sintetiza transcripciones cortas de 2-15 nucleótidos antes de iniciar la transcripción completa, ocurre in vivo en Escherichia coli. Se detectaron transcripciones abortivas de 11-15 nucleótidos generadas in vivo utilizando hibridación con sondas de ácido nucleico. Estas transcripciones abortivas exhibieron características como ser afectadas por la interacción entre la ARN polimerasa y el ADN del promotor o los factores de transcripción, lo que
La investigación encontró que la iniciación abortiva, donde la ARN polimerasa sintetiza transcripciones cortas de 2-15 nucleótidos antes de iniciar la transcripción completa, ocurre in vivo en Escherichia coli. Se detectaron transcripciones abortivas de 11-15 nucleótidos generadas in vivo utilizando hibridación con sondas de ácido nucleico. Estas transcripciones abortivas exhibieron características como ser afectadas por la interacción entre la ARN polimerasa y el ADN del promotor o los factores de transcripción, lo que
La investigación encontró que la iniciación abortiva, donde la ARN polimerasa sintetiza transcripciones cortas de 2-15 nucleótidos antes de iniciar la transcripción completa, ocurre in vivo en Escherichia coli. Se detectaron transcripciones abortivas de 11-15 nucleótidos generadas in vivo utilizando hibridación con sondas de ácido nucleico. Estas transcripciones abortivas exhibieron características como ser afectadas por la interacción entre la ARN polimerasa y el ADN del promotor o los factores de transcripción, lo que
Durante la iniciación de la transcripción in vitro, la ARN polimerasa puede
participar en la iniciación abortiva: la síntesis y liberación de transcritos de ARN
cortos, de 2 a 15 nucleótidos, antes del inicio productivo. Eso no se sabe si la iniciación abortiva ocurre in vivo. Usando hibridación con bloqueado sondas de ácido nucleico, detectamos directamente transcripciones abortivas in vivo y, por lo tanto, muestran que abortivo la iniciación ocurre in vivo. Además demostramos que la iniciación abortiva in vivo es un determinante del promotor fuerza, un determinante de la función de la ARN polimerasa, y un objetivo de regulación por factor de transcripción GreA. Las transcripciones abortivas pueden tener funciones funcionales, fisiológicamente importantes en la regulación de genes expresión in vivo.
Durante la transcripción, la ARN polimerasa (RNAP) sintetiza los primeros ~ 8-15
nucleótidos (nt) de ARN como un complejo de transcripción inicial del promotor de RNAP (1-3) [utilizando un "crujido" mecanismo (4)]. Tras la síntesis de una transcripción de ARN de una longitud umbral de ~ 8-15 nt, RNAP rompe sus interacciones con el ADN del promotor, escapa del promotor y entra en el proceso síntesis de ARN como un complejo de elongación de transcripción RNAP-ADN (1- 3) [utilizando un Mecanismo de "escalonamiento" (5)]. En reacciones de transcripción in vitro, el iniciador RNAP inicial complejo de transcripción puede participar en decenas a cientos de ciclos de síntesis y liberación de corto Transcripciones de ARN ("iniciación abortiva") (1-3,6-8). La iniciación abortiva compite con iniciación productiva in vitro y, como tal, es un determinante crítico de la fuerza del promotor y una objetivo de la regulación de la transcripción in vitro (1- 3,7-13). Se ha propuesto que abortivo la iniciación también ocurre in vivo (6,8). En apoyo de esta propuesta, los factores que afectan los rendimientos de Las transcripciones completas in vitro a través de los efectos sobre la iniciación abortiva también afectan los rendimientos de transcripciones completas en vivo (9- 14). Sin embargo, no hay evidencia directa de que la iniciación abortiva ocurre in vivo ha sido presentado. El promotor del bacteriófago T5 N25 y su derivado N25anti son sistemas modelo clásicos para el estudio de la iniciación abortiva y el escape del promotor (9,11-14). N25 y N25anti difieren solo en sus secuencias transcritas iniciales (posiciones +3 a +20) pero exhiben radicalmente diferente características in vitro con respecto al abortivo: relación productiva (APR; 40 para N25; ~300 para N25anti), el tamaño máximo de las transcripciones abortivas (10 nt para N25, 15 nt para N25anti) y la cinética del escape del promotor (kclear ~1.7 por minuto para N25; ~0.06 por minuto para N25anti). Para determinar si la iniciación abortiva ocurre in vivo, buscamos detectar transcripciones abortivas generado durante la transcripción de una copia plasmida de N25anti en Escherichia coli, usando sondas de ácido nucleico bloqueadas desarrolladas para la detección de microARN basada en la hibridación (15, dieciséis). Pensamos que la APR relativamente alta de N25anti facilitaría la acumulación de cantidades detectables de transcripciones abortivas y que el tamaño máximo relativamente alto de las transcripciones abortivas de N25anti facilitarían la hibridación eficiente del núcleo bloqueado sondas ácidas. Para validar el método, realizamos reacciones de transcripción in vitro usando E. coli RNAP y una plantilla de ADN que lleva el promotor N25anti, una unidad de transcripción de 100 nt, y el terminador tR2 (N25anti-100-tR2). Realizamos reacciones paralelas usando radiactivo NTP con análisis por autorradiografía (Fig. 1A, izquierda) y uso de NTP no radiactivos con análisis por hibridación (Fig. 1A, derecha). La hibridación fue capaz de detectar transcripciones abortivas teniendo longitudes de 11-15 nt.
Para detectar transcripciones abortivas in vivo, presentamos un plásmido que lleva
N25anti-100-tR2 en células, ARN aislado, ARN electroformado en geles de urea- poliacrilamida, y visualizados transcripciones por hibridación (Fig. 1B). Muestras de ARN de las células con el plásmido que lleva N25anti-100-tR2 (pero no de células con un plásmido de control que carece de N25anti-100-tR2) exhibido transcripciones correspondientes a la movilidad a los 11-15 nt transcripciones abortivas observadas in vitro (Fig. 1B). Los transcritos de 11-15 nt generados in vivo se observaron con ambos N25anti-100-tR2 llevado en un plásmido de múltiples copias (Fig. 1B) y N25anti-100-tR2 llevado en una sola copia, derivado de Fplasmid, plásmido (Fig. S1).
Para demostrar que las transcripciones de 11 a 15 nt detectadas in vivo son
transcripciones abortivas, demostramos que exhiben tres características distintivas de transcripciones abortivas como se define in vitro: (1) alterar las interacciones entre RNAP y el ADN del promotor alteran los rendimientos de los transcritos de 11-15 nt (Figs. S2, S3) (ver 1, 3, 10, 13, 17), (2) alterar las interacciones entre RNAP y la iniciación de la transcripción el factor σ altera los rendimientos de las transcripciones de 11-15 nt (Figuras S4, S5) (véase 18, 19), y (3) transcripción factor de elongación GreA altera los rendimientos de los transcritos 11-15 nt (Fig. S6) (ver 1, 3, 9). Concluimos que la iniciación abortiva ocurre in vivo (Figuras 1, S1-S7). Concluimos que la iniciación abortiva es un factor determinante de la potencia del promotor (Figuras S2, S3), un determinante de RNAP función (figuras S4, S5) y un objetivo de regulación de la transcripción in vivo (figura S6). Los resultados se obtuvieron con RNAP bacteriana. Sin embargo, debido a que la iniciación abortiva ocurre in vitro con todos los RNAP caracterizados (bacterianos, de arqueas, eucariotas y bacteriófagos) lo consideramos es probable que la iniciación abortiva ocurra in vivo con todos los RNAP. Análisis de la región transcrita inicial secuencias de promotores de E. coli definidos experimentalmente indican que hasta ~ 4000 diferentes tránscritos abortivos 2-10 nt pueden generarse in vivo (Tabla S1). El descubrimiento de que las transcripciones abortivas se generan in vivo y se acumulan a niveles detectables in vivo, plantea la posibilidad de que las transcripciones abortivas puedan desempeñar funciones funcionales. Por ejemplo, una transcripción abortiva producida a partir de un primer promotor podría funcionar como una secuencia específica cebador para la iniciación de la transcripción en un segundo promotor o podría funcionar como un efector antisentido contra un ARN específico. Las prioridades clave serán definir el conjunto completo de transcripciones abortivas producido in vivo (el "aborto"), y para definir roles funcionales de transcripciones abortivas en vivo. GENÉTICA: BEADLE Y TA TUM A este respecto, se debe tener en cuenta que el factor de presión de selección probablemente también varíe donde surja tal aislamiento, así como el de la población tamaño, para las poblaciones se llevará a cabo en entornos algo diferentes. Se puede notar al cerrar que aquí hay un factor fisiológico que actúa sobre Mecánica de la población que no depende del cambio genético para cambios en su especificidad de acción; a este respecto, es similar al recorrido reacción en salmón4 y aves, "a las preferencias de apareamiento condicionado de pájaros6 y a las reacciones de las hormigas hacia los compañeros de colonia.7
Desde el punto de vista de la genética fisiológica, el desarrollo y
funcionamiento de un organismo consiste esencialmente en un sistema integrado de reacciones químicas controladas de alguna manera por los genes. Es enteramente se puede suponer que estos genes, que a su vez son parte de la sistema, controlar o regular reacciones específicas en el sistema ya sea por actuando directamente como enzimas o determinando las especificidades de las enzimas ". Dado que es probable que los componentes de dicho sistema estén interrelacionados en formas complejas, y dado que la síntesis de las partes de los genes individuales son presumiblemente dependiente del funcionamiento de otros genes, parecería que debe haber órdenes de control directo del gen que van desde relaciones simples de uno a uno con relaciones de gran complejidad. En la investigación las reglas de los genes, el genetista fisiológico usualmente intenta determinar las bases fisiológicas y bioquímicas de las ya conocidas rasgos hereditarios Este enfoque, como se hizo en el estudio de la antocianina pigmentos en plantas, 2 la fermentación de azúcares por levaduras3 y un número de otras instancias, 4 ha establecido que muchas reacciones bioquímicas son de hecho, controlado de maneras específicas por genes específicos. Además, las investigaciones de este tipo tienden a apoyar la suposición de que el gen y la enzima las especificidades son del mismo orden.5 Sin embargo, hay una serie de limitaciones inherentes a este enfoque. Quizás el más serio de estos es que el investigador debe, en general, limitarse a un estudio de no letal personajes hereditarios. Tales personajes probablemente involucren más o menos llamadas reacciones "terminales" no esenciales.5 La selección de estos para el estudio genético fue quizás responsable de la ahora desapareciendo rápidamente creencia de que los genes solo se preocupan por el control de lo "superficial" caracteres. Una segunda dificultad, no sin relación con la primera, es que el enfoque estándar para el problema implica el uso de personajes con manifestaciones visibles. Muchos de estos personajes implican morfología variaciones, y es probable que se basen en sistemas de bioquímica reacciones tan complejas que hacen que el análisis sea extremadamente difícil. Consideraciones como las que acabamos de delinear nos han llevado a investigar el problema general del control genético de desarrollo y metabólico reacciones al revertir el procedimiento ordinario y, en lugar de intentar para calcular las bases químicas de los caracteres genéticos conocidos, para establecer determinar si y cómo los genes controlan las reacciones bioquímicas conocidas. los ascomycete Neurospora ofrece muchas ventajas para tal enfoque y es adecuado para estudios genéticos.6 En consecuencia, nuestro programa ha sido construido alrededor de este organismo. El procedimiento se basa en la suposición que el tratamiento con rayos X inducirá mutaciones en los genes relacionados con el control de reacciones químicas específicas conocidas. Si el organismo debe ser capaz de llevar a cabo una cierta reacción química para sobrevivir en un medio dado, un mutante incapaz de hacer esto obviamente será letal en este medio. Tal un mutante puede mantenerse y estudiarse, sin embargo, si crecerá en un medio al cual se ha agregado el producto esencial de la genética reacción bloqueada. El procedimiento experimental basado en este razonamiento
puede ilustrarse mejor si se considera un ejemplo hipotético.
Normal las cepas de Neurospora crassa pueden usar sacarosa como fuente de carbono, y Por lo tanto, son capaces de llevar a cabo el control específico y enzimáticamente controlado reacción implicada en la hidrólisis de este azúcar. Asumiendo esta reacción para ser controlado genéticamente, debería ser posible inducir un gen para mutar a una condición tal que el organismo ya no podría llevar a cabo la sacarosa hidrólisis. Una cepa que lleve este mutante no podrá crecer en un medio que contenga sacarosa como única fuente de carbono, pero debería poder crecer en un medio que contenga algún otro carbono normalmente utilizable fuente. En otras palabras, debería ser posible establecer y mantener tal cepa mutante en un medio que contiene glucosa y detectar su incapacidad de utilizar sacarosa transfiriéndola a un medio de sacarosa. Se pueden desarrollar procedimientos esencialmente similares para una gran cantidad de metabolismo procesos. Por ejemplo, la capacidad de sintetizar factores de crecimiento (vitaminas), aminoácidos y otras sustancias esenciales se deben perder a través de mutación genética si nuestras suposiciones son correctas. Teóricamente, cualquiera de tales la deficiencia metabólica puede ser "pasada por alto" si la sustancia que falta puede ser suministrado en el medio y puede pasar las paredes celulares y las membranas protoplásmicas.
En términos de práctica experimental específica, hemos ideado un procedimiento
en el que se establecen cultivos de esporas únicas con rayos X en un llamado "completo" medio, es decir, uno que contiene tantos de los normalmente sintetizados constituyentes del organismo como sea posible. Posteriormente estos son probado transfiriéndolos a un medio "mínimo", es decir, uno que requiere organismo para llevar a cabo todas las síntesis esenciales de las cuales es capaz. En la práctica, el medio completo está hecho de agar, sales inorgánicas, malta extracto, extracto de levadura y glucosa. El medio mínimo contiene agar (opcional), sales inorgánicas y biotina, y un disacárido, grasa o más fuente de carbono compleja. Biotina, el único factor de crecimiento de tipo salvaje Las cepas de Neurospora no pueden sintetizarse, 7 se suministra en forma de un comercial concentrado que contiene 100 microgramos de biotina por cc.8 Cualquiera pérdida de la capacidad de sintetizar una sustancia esencial presente en el medio y ausente en el medio mínimo está indicado por una cepa que crece en el primero y no crece en el segundo medio. Tales tensiones son luego probado de manera sistemática para determinar qué sustancia o sustancias no pueden sintetizar Estas pruebas subsiguientes incluyen intenta cultivar cepas mutantes en el medio mínimo con (1) conocido vitaminas añadidas, (2) aminoácidos agregados o (3) glucosa sustituida para el fuente de carbono más compleja del medio mínimo. Las cepas de ascosporas individuales se derivan individualmente de la peritecia de N. crassa y N. sitophila radiografiadas antes de la meiosis. Entre aproximadamente 2000 de tales cepas, se encontraron tres mutantes que crecen esencialmente normalmente en el medio completo y escasamente en el mínimo medio con sacarosa como fuente de carbono. Una de estas cepas (N. sitophila) demostró ser incapaz de sintetizar la vitamina Be (piridoxina). UN segunda cepa (N. sitophila) resultó ser incapaz de sintetizar vitamina B1 (tiamina). Pruebas adicionales muestran que esta cepa es capaz de sintetizar la mitad pirimidina de la molécula B1 pero no la mitad tiazol. Si tiazol solo se agrega al medio mínimo, la cepa crece esencialmente normalmente. Se ha encontrado que una tercera cepa (N. crassa) no puede para sintetizar ácido para-aminobenzoico. Esta cepa mutante parece ser completamente normal cuando se cultiva en el medio mínimo al que p- aminobenzoico ácido ha sido agregado. Solo en el caso del "pyridoxinless" cepa tiene un análisis de la herencia del defecto metabólico inducido sido investigado Por esta razón cuentas detalladas de la tiamina deficiente y las cepas deficientes en ácido p-aminobenzoico serán diferidas. Los estudios cualitativos indican claramente que el mutante piridoxidable, cultivado en un medio que contiene un microgramo o más de vitamina sintéticaClorhidrato de BB por 25 cc. del medio, se aproxima mucho en velocidad y Característica de las cepas normales de crecimiento cultivadas en un medio similar con no B6. Las concentraciones más bajas de B6 dan tasas de crecimiento intermedias. UN investigación preliminar de la dependencia cuantitativa del crecimiento de el mutante en vitamina B6 en el medio dio los resultados resumidos en Tabla 1. Experimentos adicionales han dado resultados esencialmente similares pero en un acuerdo cuantitativo aproximado con los del cuadro 1. Está claro que el estudio adicional de los detalles de las condiciones de cultivo es necesario antes de que la tasa de aumento de peso de este mutante se pueda usar como ensayo preciso de vitamina B6. Se ha encontrado que la progresión de la frontera de micelios de Neurospora a lo largo de un tubo de cultivo de vidrio horizontal medio lleno con un agar medio proporciona un método conveniente de investigar lo cuantitativo efectos de los factores de crecimiento. Tubos de aproximadamente 13 mm. diámetro interior y unos 40 cm. de longitud se utilizan. Segmentos de unos 5 cm. en los dos extremos se giran hacia arriba en un ángulo de aproximadamente 45 °. El medio Agar se vierte para para llenar el tubo aproximadamente a la mitad y se le permite establecer con el segmento principal del tubo en una posición horizontal. Los extremos girados del tubo son taponado con tapones de algodón. Las inoculaciones se realizan en un extremo del agar superficie y la posición del frente de avance grabado en conveniente intervalos. La frontera formada por el avance de los micelios es notable bien definido, y no hay dificultad para determinar su posición dentro de un milímetro o menos. La progresión a lo largo de tales tubos es estrictamente lineal con el tiempo y la velocidad es independiente de la longitud del tubo (hasta 1,5 metros). los la velocidad no cambia al reducir el diámetro del tubo interior a 9 mm., o sellando uno o ambos extremos. Por lo tanto, parece que la difusión de gas está en no hay forma de limitar en tales tubos. Los resultados del crecimiento de la cepa piridoxinless en tubos horizontales en que el medio de agar contenía cantidades variables de B6 se muestran gráficamente en las figuras 1 y 2. La tasa de progresión es claramente una función de concentración de vitamina B6 en el medio.10 También es evidente que no hay una diferencia significativa en la tasa entre el mutante suministrado con B6 y la cepa normal crece en un medio sin esta vitamina. Estos resultados son consistentes con la suposición de que el fisiológico primario diferencia entre las cepas piridoxinless y normal es la incapacidad del primero para llevar a cabo la síntesis de vitamina B6. Ciertamente más de un paso en esta síntesis y, en consecuencia, el diferencial genético involucrado está supuestamente preocupado con solo un paso específico en la biosíntesis de vitamina Bo.
Con el fin de determinar la herencia del personaje piridoxinless, cruces entre
cepas normales y mutantes se hicieron. Las técnicas para la hibridación y el aislamiento de ascosporas se han elaborado y descrito por Dodge, y por Lindegren.6 Las ascosporas de 24 ascos de la cruz fue aislada y sus posiciones en las asci registradas. Para algunos razón desconocida, la mayoría de estos no pudieron germinar. De siete asci, sin embargo, una o más esporas germinaron. Estos se cultivaron en un medio conteniendo glucosa, extracto de malta y extracto de levadura, y en esto todos creció normalmente Las culturas normales y mutantes fueron diferenciadas por cultivándolos en un medio deficiente B6. En este medio, el mutante las culturas crecieron muy poco, mientras que las no mutantes crecieron normalmente. los los resultados se resumen en la tabla 2. Está claro de estos bastante limitados datos de que esta incapacidad para sintetizar vitaminas B6 se transmite como debería ser si fue diferenciado de lo normal por un solo gen. Los resultados preliminares resumidos anteriormente nos parecen indicar que el enfoque esbozado puede ofrecer una promesa considerable como método de aprender más sobre cómo los genes regulan el desarrollo y la función. por ejemplo, debería ser posible, encontrando una cantidad de mutantes incapaces de llevar a cabo un paso particular en una síntesis dada, para determinar si solo un gen generalmente se ocupa de la regulación inmediata de un determinado reacción química específica. Es evidente, desde el punto de vista de la bioquímica y la fisiología, que el método esbozado es de valor como una técnica para descubrir sustancias de importancia fisiológica. Desde el medio completo utilizado se puede preparar con extracto de levadura o con un extracto de extracto Neurospora, es evidente que si, a través de la mutación, se pierde la capacidad para sintetizar una sustancia esencial, se pone a disposición una cepa de prueba para usar al aislar la sustancia. Puede, por supuesto, ser una sustancia no previamente se sabía que era esencial para el crecimiento de cualquier organismo. Así podemos esperar descubrir nuevas vitaminas, y de la misma manera, debería ser posible descubrir aminoácidos esenciales adicionales, si es que existen. Nosotros de hecho, han encontrado una cepa mutante que puede crecer en un medio contiene extracto de levadura Difco pero no puede crecer en ninguno de los medios que hemos probado hasta ahora. Evidentemente algún factor de crecimiento presente en La levadura y hasta ahora desconocida para nosotros es esencial para Neurospora.
Resumen. Se describe un procedimiento mediante el cual, usando Neurospora,
uno puede descubrir y mantener cepas mutantes inducidas por rayos X que se caracterizan por su incapacidad para llevar a cabo procesos bioquímicos específicos. Siguiendo este método, se han establecido tres cepas mutantes. En uno de estos la capacidad de sintetizar vitamina B6 ha sido total o perdió. En un segundo la capacidad de sintetizar la mitad de tiazol de la vitamina La molécula B1 está ausente, y en el tercer ácido para-aminobenzoico no está sintetizado Por lo tanto, está claro que todas estas sustancias son esenciales factores de crecimiento para Neurospora-11 Crecimiento del mutante sin piridoxina (un mutante incapaz de sintetizar vitamina B6) es una función del contenido de B6 del medio en el que se encuentra crecido. Se describe un método para medir el crecimiento siguiendo progresión lineal de los micelios a lo largo de un tubo horizontal medio lleno con un medio de agar. La incapacidad de sintetizar la vitamina B6 aparentemente se diferencia por un solo gen de la capacidad del organismo para elaborar este crecimiento esencial sustancia.
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