‫الجلسة العملية الثالثة‬ ‫جامعة حلب‬

‫‪Aleppo university‬‬
‫‪Faculty of Science‬‬ ‫صبغ السياط‬ ‫كلية العلوم‬
‫‪Microbiological Lab‬‬ ‫‪Bacterial Flagella Staining‬‬ ‫مختبر بحوث الميكروبيولوجيا‬

‫إن دراسة الحركة الجرثومية في المخابر الطبية من حيث وجود ‪ presence‬السياط الجرثومية وعددها‬
‫وترتيبها هو ذو فائدة عظيمة لتحديد الهوية الجرثومية للجراثيم الممرضة التالية‪:‬‬
‫‪.A‬البورديتيال الشاهوقية ‪ Bordetella pertussis‬المتسببة بداء السعال الديكى ‪.whooping cough‬‬
‫‪ Listeria monocytogenes.B‬المسسببة إنتانات الدماغ والسحايا ‪meningoencephalitis‬‬
‫‪.C‬المتقلبة الشائعة ‪ Proteus vulgaris‬المتسببة بعدة أمراض كأخماج الجهاز البولي ‪urinary tract‬‬
‫‪ infections‬وتجرثم الدم ‪ bacteremia‬واإلنتان الرئوي ‪.pneumonia‬‬
‫‪.D‬الزائفة الزنجارية ‪ Pseudomonas aeruginosa‬المتسببة باألخماج الجلدية والجروح المتقيحة ‪skin‬‬
‫‪and wound infections‬‬
‫‪ .E‬السلمونلية التيفية ‪ Salmonella typhi‬المسبب األساسي للحمة التيفية‪typhoid fever‬‬
‫اآلسي ِويَّة ‪ Vibrio cholerae‬المسببة لداء الكولي ار ‪cholera‬‬
‫َ‬ ‫ض َّم ُة الكولي ار‬
‫‪َ .F‬‬
‫تقنية صبغ السياط الجرثومية ‪:Bacterial Flagella Stain Protocol‬‬
‫تتحرك العديد من الجراثيم بوساطة ملحقات دورانية ‪ rotary appendages‬تسمى بالسياط‬
‫‪ ،flagella‬التي يمكن أن يتجاوز طولها طول الخلية الجرثومية‪ ،‬إال أنها ضيقة ورفيعة جداً لدرجة عدم‬
‫قدرة ورؤيتها بالمجهر الضوئي ‪ light microscopy‬إذا لم تعامل بشكل جيد‪ ،‬ولكن يمكن زيادة قطر هذه‬
‫البنيات الدقيقة المسماة بالسياط إذا ما عوملت بالمواد المثبتة للصباغ ‪ mordants‬ومن ثم يمكن رؤيتها‬
‫بشكل واضح تحت المجهر الضوئي‪.‬‬
‫إن أول من قدم شرحاً عن صباغ السياط الباحث األلماني ‪ Robert Koch‬عام ‪ ،1877‬ومن ثم توالت‬
‫الدراسات الهادفة إلى تطوير هذه الصبغة ففي عام ‪ 1930‬نشر الباحث ‪ Leifson‬طريقة مبسطة عن‬
‫صباغ السياط ‪ simple flagella stain‬سميت باسم الباحث نفسه ‪ ،Leifson Staining‬كما الحظ‬
‫واستنتج الباحث أثناء قيامه بهذه الطريقة أنه قد تحدث لبعض الجراثيم المتحركة ذات السياط الكبيرة‪،‬‬
‫طفرة ‪ mutations‬معينة تؤدي إلى اختفاء تلك السياط وبالتالي عدم قدرة هذا الجرثوم على الحركة‪.‬‬
‫وفي عام ‪ 1958‬تم تطوير طريقة صباغ جديدة تسمى طريقة صباغ األطباق بالفضة ‪silver-plating‬‬
‫‪ stain‬إال أنها تعتبر من الطرق المعقدة في الصباغ وهذا ما يفسر محدودية انتشار هذه الطريقة طورت‬
‫هذه التقنية عام ‪ ،1977‬وحديثاً في عام ‪ 2000‬تم تقديم تقنية جديدة تعتمد على وسم البروتين السوطي‬
‫بمواد مفلورة تسمى ‪ NanoOrange‬دعيت هذه الطريقة باسم ‪ ،fluorescent protein stain‬وهكذا فقد‬
‫أقرت جميع المنظمات العلمية المتخصصة بعلم الجراثيم الطبية ألن تنفيذ أي تقنية من التقنيات المذكورة‬
‫في تلوين وصبغ السياط هو أمر صعباً نوعاً ما ‪.somewhat difficult‬‬

‫‪Produced By Dr. Zaher Samman Tahan‬‬ ‫‪1‬‬

‫‪Master Degree in Microbiology, Ph.D in Medical Bacteriology and Antibiotics.‬‬
 ‫الجلسة العملية الثالثة‬ ‫جامعة حلب‬
‫‪Aleppo university‬‬
‫‪Faculty of Science‬‬ ‫صبغ السياط‬ ‫كلية العلوم‬
‫‪Microbiological Lab‬‬ ‫‪Bacterial Flagella Staining‬‬ ‫مختبر بحوث الميكروبيولوجيا‬

‫الهدف ‪:PURPOSE‬‬
‫الهدف من القيام بهذه التقنية هو تلوين السياط الجرثومية وذلك بإيضاح وجودها أو عدم وجودها‬
‫وبطريقة توضعها على محيط الخلية الجرثومية‪ ،‬كما تفيد هذه التقنية في تصنيف بعد السالالت الجرثومية‬
‫من النمط الشكلي ‪ phenotypically‬على اعتبار أن ليس كل الجراثيم تحتوي على سياط‪ ،‬وحتى إذا‬
‫كانت من نمط الجراثيم ذات السياط فيتم التعرف على مكان توضع السياط إذ يمكن أن تحتوي بعض‬
‫السالالت الجرثومية على سوط قطبي وحيد ‪ polar flagellum‬فتسمى أحادية السوط القطبي‬
‫‪ ،monotrichous‬أما الجراثيم الحاوية على خصلة من السياط ‪tufts‬‬
‫السياط ‪ ،lophotrichous‬أما‬‫َّة ِ‬‫‪ of flagella‬فتسمى الجراثيم عْفري ِ‬
‫َُ‬
‫في حال وجود سوط أو أكثر على كال القطبين فتسمى بمتقابلة الساط‬
‫ياط ‪ ،amphitrichous‬وأخي اًر وجود سياط تحيط بكامل‬ ‫الس ِ‬
‫متَقاِبل ِ‬
‫ُ ُ‬
‫محيط الخلية الجرثومية تسمى بمحيطية السياط ‪peritrichous‬‬

‫البنية ‪:Structure‬‬
‫تتحرك السياط الجرثومية عبر قوة التحفيز البروتونية‬
‫‪ proton motive force‬أو من خالل تدرج تركيز‬
‫شوارد الصوديوم ‪ sodium gradient‬فقد بينت الدراسات‬
‫الحديثة أنه تصل سرعة حركة بعض السياط إلى سرعات‬
‫صاعقة ‪ astounding Speed‬تتجاوز ‪100,000 rpm‬‬
‫دورة في الدقيقة كما هو الحال عند أنواع جنس الضمات‬
‫‪Vibrio sp‬وهذا ما يسمح بحركة تقدر بـ ‪ 147 µm/sec‬كما هو الحال في النوع ‪.V. alginolyticus‬‬
‫‪Produced By Dr. Zaher Samman Tahan‬‬ ‫‪2‬‬
‫‪Master Degree in Microbiology, Ph.D in Medical Bacteriology and Antibiotics.‬‬
 ‫الجلسة العملية الثالثة‬ ‫جامعة حلب‬
‫‪Aleppo university‬‬
‫‪Faculty of Science‬‬ ‫صبغ السياط‬ ‫كلية العلوم‬
‫‪Microbiological Lab‬‬ ‫‪Bacterial Flagella Staining‬‬ ‫مختبر بحوث الميكروبيولوجيا‬

‫تتألف بنية السياط الجرثومية من تحت وحدات بروتينية‬

‫‪ protein subunits‬تدعى بالفالجيلين ‪flagellin‬‬
‫وهي مميزة جداً لجميع السياط الموجودة عند طالئعيات‬
‫النوى ‪ ،eukaryotic‬ترتكز السياط على الغشاء‬
‫السيتوبالسمي أو الجدار الخلوي الجرثومي بوساطة‬
‫أجسام قاعدية ‪ . basal bodies‬تأخذ السياط شكالً‬
‫حلزونياً ممي اًز يساعدها على الحركة االندفاعية‪.‬‬
‫السياط غالباً ما تكون طويلة يتجاوز طولها بعدة مرات‬
‫طول الخلية الجرثومية ذاتها‪ ،‬أما عرضها فيتراوح ما‬
‫بين ‪ 10-50 nm‬وهكذا فإن أفضل الطرق لمشاهدة السياط الجرثومية هي باستخدام المجهر اإللكتروني‪ ،‬إذ‬
‫أن أصغر بعد يمكن إيضاحه بالمجهر الضوئي هو ما يقارب ‪~200 nm‬‬
‫لذا تعتمد هذه الطريقة على زيادة قطر هذه السياط عبر استخدام مثبتات الصبغة كحمض التانيك ‪tannic‬‬
‫‪ acid‬وملونات تعمل على تشكيل راسب غروي ‪ colloidal precipitate‬الذي يمتص من قبل السياط‬
‫وعنها يعمل على زيادة قطرها وتلوينها إلى حد يمكن تميزه بالمجهر الضوئي‬
‫من خواص حمض التانيك أنه معقد سهل اإلنحالل بالكحول وعند انخفاض درجة الـ ‪. pH‬‬
‫مواد العمل ‪:MATERIALS‬‬
‫• شرائح زجاجية جديدة‪.‬‬
‫• كحول ايتلي ‪ 95%‬وماسحات قطنية لتنظيف الشرائح‪.‬‬
‫• لهب‪.‬‬
‫• ماصات دقيقة ‪.Micropipettors 5 to 200 ml‬‬
‫• روؤس ماصات دقيقة معقمة‪.‬‬
‫• ماء مقطر ‪.Distilled water‬‬
‫• ورق نشاف‪.‬‬
‫تحضير المحاليل ‪:Leifson flagella stain Solutions‬‬
‫‪Solution A:‬‬

‫‪Sodium chloride‬‬ ‫‪1.5 g‬‬

‫‪Distilled water‬‬ ‫‪100 ml‬‬

‫‪Produced By Dr. Zaher Samman Tahan‬‬ ‫‪3‬‬

‫‪Master Degree in Microbiology, Ph.D in Medical Bacteriology and Antibiotics.‬‬
 ‫الجلسة العملية الثالثة‬ ‫جامعة حلب‬
‫‪Aleppo university‬‬
‫‪Faculty of Science‬‬ ‫صبغ السياط‬ ‫كلية العلوم‬
‫‪Microbiological Lab‬‬ ‫‪Bacterial Flagella Staining‬‬ ‫مختبر بحوث الميكروبيولوجيا‬

‫‪Solution B:‬‬

‫‪Tannic acid‬‬ ‫‪3.0 g‬‬

‫‪Distilled water‬‬ ‫‪100 ml‬‬
‫‪Solution C:‬‬

‫‪Pararosaniline acetate‬‬ ‫‪0.9 g‬‬

‫‪Pararosaniline hydrochloride‬‬ ‫‪0.3 g‬‬
‫)‪Ethanol, 95% (vol/vol‬‬ ‫‪100 ml‬‬
‫نمزج حجم من المحلول ‪ A‬مع حجم مكافئ له من المحلول ‪ ،B‬ومن ثم نأخذ حجمين من المزيج الناتج‬
‫وتضاف إلى حجم من المحلول ‪C‬‬
‫طريقة العمل‪:‬‬
‫‪ .1‬اصنع معلقاً جرثومياً من مزرعة فتية من جراثيم حاوية على السياط وبواسطة الالقحة الجرثومية‬
‫ذات العقدة علق هذه الكمية الصغيرة من الجراثيم مع ‪ 100 ml‬من الماء المقطر‪.‬‬
‫‪ .2‬قم بهز المزيج الناتج بشكل لطيف حتى نحص على معلق ذو عكارة خفيفة‪ ،‬تجنب استعمال لقاح‬
‫جرثومي كثيف األمر الذي من شأنه أن ال يوضح السياط الجرثومية أثناء معاملتها‪.‬‬
‫‪ .3‬نظف شريحة زجاجية جديدة بالكحول ومن ثم عرضها على لهب خفيف‪.‬‬
‫‪ .4‬برد الشريحة ومن ثم أكتب على أحد طرفيها اسم الجرثوم المستخدم ‪.‬‬
‫‪ .5‬انشر بواسطة الماصة الدقيقة كمية من الجراثيم تكفي لتغطية الشريحة وبوضع الماصة الدقيقة‬
‫موازية للشريحة الزجاجية‪.‬‬
‫‪ .6‬جفف الشريحة على هواء المخبر وتجنب استخدام اللهب‪.‬‬
‫‪ .7‬ارسم باستخدام قلماً من الشمع مستطيل حول المحضر الجاف‪.‬‬
‫‪ .8‬صب محلول ‪ Leifson‬الجاهز في داخل المستطيل وعلى حدوده‪.‬‬
‫‪ .9‬حضن الشريحة في درجة ح اررة المخبر لمدة ‪. 15 minutes‬‬
‫‪ .10‬وبعد ظهور البريق الذهبي للشريحة والملون عليها أغسل الشريحة بشكل لطيف جداً بماء‬
‫الصنبور‬
‫‪ .11‬بعد التجفيف توضع قطرة من زيت األرز وتفحص على التكبير ‪.100‬‬

‫‪Produced By Dr. Zaher Samman Tahan‬‬ ‫‪4‬‬

‫‪Master Degree in Microbiology, Ph.D in Medical Bacteriology and Antibiotics.‬‬
 ‫الجلسة العملية الثالثة‬ ‫جامعة حلب‬
Aleppo university
Faculty of Science ‫صبغ السياط‬ ‫كلية العلوم‬
Microbiological Lab Bacterial Flagella Staining ‫مختبر بحوث الميكروبيولوجيا‬

: REFERENCES ‫المراجع المعتمدة‬

1. Cohen-Bazire, G., and J. London. 1967. Basal organelles of bacterial flagella. J. Bacteriol.
94:458–465.
2. Emerson, S. U., K. Tokuyasu, and M. I. Simon. 1970. Bacterial flagella: polarity of elongation.
Science 169:190–192.
3. Grossart, H. P., G. F. Steward, J. Martinez, and F. Azam. 2000. A simple, rapid method for
demonstrating bacterial flagella. Appl. Environ. Microbiol. 66:3632–3636.
4. Iino, T. 1969. Polarity of flagellar growth in Salmonella. J. Gen. Microbiol. 56:227–239.

Produced By Dr. Zaher Samman Tahan 5

Master Degree in Microbiology, Ph.D in Medical Bacteriology and Antibiotics.
 ‫الجلسة العملية الثالثة‬ ‫جامعة حلب‬
Aleppo university
Faculty of Science ‫صبغ السياط‬ ‫كلية العلوم‬
Microbiological Lab Bacterial Flagella Staining ‫مختبر بحوث الميكروبيولوجيا‬

5. Jarrell, K. F., and M. J. McBride. 2008. The surprisingly diverse ways that prokaryotes move.
Nature reviews. Microbiology 6:466–476.
6. Leifson, E. 1930. A method of staining bacterial flagella and capsules together with a study of the
origin of flagella. J. Bacteriol. 20:203–211.
7. Leifson, E. 1951. Staining, shape and arrangement of bacterial flagella. J. Bacteriol. 62:377–389.
8. Macnab, R. M. 1977. Bacterial flagella rotating in bundles: a study in helical geometry. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 74:221–225.
9. Macnab, R. M. 1999. The bacterial flagellum: reversible rotary propellor and type III export
apparatus. J. Bacteriol. 181:7149–7153.
10. Magariyama, Y., S. Sugiyama, K. Muramoto, I. Kawagishi, Y. Imae, and S. Kudo. 1995.
Simultaneous measurement of bacterial flagellar rotation rate and swimming speed. Biophys. J.
69:2154–2162.
11. Magariyama, Y., S. Sugiyama, K. Muramoto, Y. Maekawa, I. Kawagishi, Y. Imae, and S.
Kudo. 1994. Very fast flagellar rotation. Nature 371:752.
12. Manson, M. D., P. Tedesco, H. C. Berg, F. M. Harold, and C. Van der Drift. 1977. A
protonmotive force drives bacterial flagella. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:3060–3064.
13. Muramoto, K., I. Kawagishi, S. Kudo, Y. Magariyama, Y. Imae, and M. Homma. 1995.
High-speed rotation and speed stability of the sodium-driven flagellar motor in Vibrio
alginolyticus. J. Mol. Biol. 251:50–58.
14. Murray, R. G. E., R. N. Doetsch, and C. F. Robinow. 1994. Light microscopy. In P. Gephardt,
R. G. E. Murray, W. A.Wood, and N. R. Krieg (ed.), Methods for general molecular bacteriology.
American Society for Microbiology, Washington, DC.
15. Rhodes, M. E. 1958. The cytology of Pseudomonas spp. as revealed by a silver-plating staining
method. J. Gen. Microbiol. 18:639–648.
16. Shunk, I. V. 1920. A modification of Loeffler's flagella stain. J. Bacteriol. 5:181–187.
17. Silflow, C. D., and P. A. Lefebvre. 2001. Assembly and motility of eukaryotic cilia and flagella.
Lessons from Chlamydomonas reinhardtii. Plant Phys. 127:1500–1507.
18. West, M., N. M. Burdash, and F. Freimuth. 1977. Simplified silver-plating stain for flagella. J.
Clin. Microbiol. 6:414–419.

Produced By Dr. Zaher Samman Tahan 6

Master Degree in Microbiology, Ph.D in Medical Bacteriology and Antibiotics.