Diagnosa Leptospira dengan Polymerase Chain Reaction

Pengantar
Leptospirosis adalah salah satu zoonosis paling luas di dunia 1.
Leptospira adalah bakteri yang sangat invasif, mampu menginfeksi luas berbagai
host mamalia. Penularan terjadi baik melalui kontak langsung dengan hewan yang
terinfeksi atau melalui kontak tidak langsung dengan tanah atau air yang
terkontaminasi dengan air kencing dari inang dengan infeksi ginjal kronis. Gejala
dan keparahan leptospirosis sangat bervariasi dari yang ringan, penyakit seperti
flu hingga bentuk hemoragik yang fatal dengan keterlibatan organ vital yang berat
seperti hati, paru-paru dan ginjal yang secara konvensional disebut 'penyakit
Weil'.2 Jadi, istilah' penipu ulung 'telah diterapkan pada infeksi spirochetal ini.
Diagnosis klinis tidak akurat, terutama di daerah tropis di mana penyakit demam
akut serupa lainnya adalah umum. Leptospirosis mungkin bingung dengan
malaria, hepatitis virus, influenza, demam berdarah, infeksi rickettsial, demam
tifoid, melioidosis dan lain-lain. Oleh karena itu diagnosis dini dan akurat dari
leptospirosis penting untuk perawatan yang tepat dan cepat, yang menyelamatkan
jiwa untuk pasien dengan penyakit berat. Demonstrasi langsung Leptospira dalam
persiapan dari spesimen dengan mikroskopi medan gelap telah terhambat karena
kurangnya spesifisitas.4 Isolasi patogen adalah padat karya dan memakan waktu.
Leptospira membutuhkan media kultur yang kompleks dan mereka memiliki
waktu generasi yang panjang. Oleh karena itu, budaya bukanlah metode awal.
Metode diagnostik saat ini untuk leptospirosis biasanya tergantung pada
demonstrasi antibodi serum 5. Tes serologis yang paling umum adalah tes
aglutinasi mikroskopik (MAT), tetapi memakan waktu dan tidak memiliki
kepekaan 6. Beberapa penelitian menemukan bahwa polymerase chain reaction
(PCR) telah semakin digunakan untuk mendiagnosis penyakit menular yang
disebabkan oleh mikroorganisme yang tumbuh dengan lambat atau lambat7.
Banyak teknik berbasis PCR seperti DNA polimorfik acak, PCR diikuti dengan
analisis restriksi atau hibridisasi telah dikembangkan dan dievaluasi berdasarkan
pengetikan strain referensi leptospiral. PCR dapat berguna juga untuk diagnosis
cepat leptospirosis terutama dalam kasus fase akut penyakit di mana teknik
diagnostik lainnya dapat memberikan hasil negatif atau waktu mengkonsumsi.
Konsensus umum adalah bahwa amplifikasi PCR gen 16SrRNA dapat berfungsi
sebagai alternatif untuk metode serologis yang digunakan saat ini untuk
mengidentifikasi bakteri patogen. Penelitian ini dirancang dengan tujuan untuk
mendeteksi DNA leptospiral dengan amplifikasi PCR Pomona (strain Pomona)
Pyrogenes (strain Salinem), 16SrRNA dalam serum pasien dengan klinis
diagnosis leptospirosis dan membandingkan hasil dengan uji aglutinasi
mikroskopis (MAT) dan IgM ELISA.

Bahan dan Metode:

Sampel darah dikirim ke Mikrobiologi Departemen dari 100 pasien
dengan klinis kecurigaan leptospirosis menghadiri rumah sakit kami selama
Januari 2007 hingga Februari 2008. Faine's kriteria digunakan untuk mencurigai
leptospirosis dimana, pasien dengan demam, sakit kepala, sakit kuning, batuk dan
sesak napas, subconjunctival suffusion, tanda-tanda iritasi dan kejang meningeal
dilibatkan. Pada 100 pasien ini, penyebab lain demam berkepanjangan
dikesampingkan dengan melakukan tes seperti tes Widal untuk tifoid, uji
aglutinasi tabung standar untuk brucellosis dan skrining HBsAg untuk hepatitis B.
Sera adalah dipisahkan dari semua sampel ini dan diuji oleh IgM ELISA, MAT
dan PCR.

IgM Elisa: Itu dilakukan menggunakan IVD LEPTOSPIRA IgM Microwell

ELISA Test (IVD Research Inc, Carlsbad, CA92010 USA, sesuai dengan
instruksi pabrikan. Absorbansi
serum kontrol positif dan negatif yang disediakan dalam kit digunakan untuk
perhitungan. Hasil negatif didefinisikan sebagai absorbansi 0,0-0,3 unit densitas
optik (OD), hasil samar-samar sebagai 0,5 untuk ≤1 unit OD dan hasil positif
sebagai> 1,0 unit OD.
MAT: Ini dilakukan sesuai standar sesuai dengan Cole dkk. 12. Strain Leptospiral
digunakan: Serovar leptospiral yang digunakan termasuk mengikuti serovar dalam
spesies
1. interrogans Leptospira –
Australis (strain Ballico),
Autumnalis (strain Bankinang)
Bataviae (strain Swart)
Canicola (regangan Hond Utrecht IV),
Hebdomadis (strain Hebdomadis)
Icterohemorrhagiae (strain RGA)
2. Leptospira kirschneri –
Grippotyphosa (strain Moskva V)
3. Leptospira borgpetersenii - Javanica (strain Poi), Tarassovi (strain
Tarassovi) Semaranga (Patoc I) digunakan.
Semua strain diperoleh dari National Leptospirosis Reference Center,
Regional Medical Research Centre (pusat kerjasama WHO untuk diagnosis di
leptospirosis, ICMR) di Port Blair, Andaman dan Nicobar islands.
Serovar ini dipelihara dengan semisolid 0,1% EMJH agar dengan
menggunakan medium Leptospira dasar (Hi-Media) ditambah dengan 10%
pengayaan (Tween 80 dan Bovine serum albumin) di 28-300C di sekrup
tertutup tabung reaksi. Serum hyperimmune dibangkitkan terhadap masing-
masing dari 12 serovar di duplikat kelinci sehat 13. Ini digunakan sebagai
kontrol positif saat melakukan MAT.
Persiapan antigen: 0,5 ml masing-masing regangan perwakilan dari
panel 12 serovar diinokulasi ke dalam 10 ml cairan EMJH sedang. Sebuah
loopful budaya diperiksa di bawah mikroskop lapangan gelap untuk
mengkonfirmasi tidak adanya kontaminasi dan rumpun dan kehadiran
leptospira yang layak. Inkubasi dilakukan pada 300C selama 5-7 hari. Itu
diencerkan ke MacFarlands 1 untuk digunakan sebagai antigen, (sekitar 2-3x
108 leptospira / ml).
 Prosedur: Menggandakan pengenceran dari 1 dalam 50 menjadi 1
dalam 3200 disiapkan. Dua puluh lima mikroliter dari serovar spesifik
ditambahkan ke semua sumur. Salah satu sumur hanya memasukkan antigen
tanpa penambahan antibodi dan berfungsi sebagai kontrol antigen.
Pengenceran akhir setelah menambahkan antigen adalah dari 1 dalam 100
hingga 1 pada 6400. Pengenceran serum tertinggi menunjukkan sekitar 50%
leptospira teraglutinasi atau pengurangan jumlah sel leptospiral dibandingkan
dengan kontrol antigen diambil sebagai titer titik akhir. Titer 1 dari 100 atau
lebih dianggap signifikan 14. Pasien yang sera positif oleh IgM ELISA dan
memiliki titer MAT dari 1≥ 100 atau MAT saja dengan titer 1 ≥100 dianggap
sebagai kasus leptospirosis yang dikonfirmasi.
Polymerase Chain Reaction (PCR): Referensi strain diuji dengan
metode PCR: Semua serovar yang digunakan untuk MAT dalam penelitian ini
diuji oleh PCR. Isolasi DNA: DNA diekstraksi dari sampel serum
menggunakan metode guanidine isothiocynate seperti yang dilaporkan oleh
Boom et al. 15. PCR: Untuk PCR, primer spesifik patogen serovar dari gen
16S rRNA digunakan, sesuai Hookey dkk 16. 5
'CTCTGGCGGGCGCGTCTTAAA 3' 5 'TTCACCGCTACACCTGGAA 3'
Amplifikasi DNA dilakukan dalam volume total 25μl. Setiap 25μl reaksi PCR
mengandung 2,5 mM MgCl2, 200 μM dNTPs, 50 mM KCl, 10 mM tris HCl,
1% Triton X-100, 1 unit Taq DNA polymerase (Genei), 5 pmoles primer, dan
30 ng DNA genomik. Tabung kontrol kosong yang tidak mengandung DNA
tambahan dijalankan dengan setiap rangkaian campuran reaksi untuk
berfungsi sebagai kontrol negatif. DNA diekstraksi dari sampel serum
artifisial dibubuhi dengan Leptospira interrogans serovar Icterohaemmoragiae
berfungsi sebagai kontrol positif untuk tes PCR.
Profil PCR adalah sebagai berikut: Denaturasi DNA pada 94ºC
selama 1 menit, annealing pada 55ºC selama 1-2 menit dan ekstensi untuk 2
menit. Ekstensi akhir dari produk yang diamplifikasi berada di 72ºC bentuk
10mins. Sebanyak 35 siklus dilakukan. Setelah siklus selesai, perpanjangan
akhir dari produk diperkuat dilakukan pada 72ºC selama 10 menit. Produk
dianalisis pada gel agarose 1% yang mengandung etidium bromida dan dilihat
di bawah Iluminasi UV dan didokumentasikan.

Hasil :
Kekhususan PCR: Untuk menentukan spesifisitas uji PCR, kemampuan
pasangan spesifik untuk memperkuat DNA dari semua strain referensi diuji.
DNA diekstraksi dari yang lain bakteri seperti Staphylococcus aureus,
Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi,
Salmonella paratyphi A, dan Escherichia coli juga diuji dengan PCR. HASIL:
spesifisitas PCR: Semua leptospira diamplifikasi produk 16SrRNA. Tidak ada
produk amplifikasi bakteri lain yang terdeteksi menggunakan 16SrRNA
primer. Dari 100 sampel serum yang diuji, 18 (18%) ditemukan positif oleh
PCR yaitu mereka mengamplifikasi fragmen 631 bp dari gen 16SrRNA. PCR
saja positif dalam empat kasus, sementara pada tiga kasus PCR positif
bersama dengan MAT dan IgM ELISA. Sebagian besar pasien adalah laki-laki
dewasa dan gejala klinis terutama diamati di antara pasien demam (98%),
sakit kuning dan sakit kepala (78%), mialgia (77%). Di antara 33 kasus
leptospirosis yang didiagnosis oleh MAT, 29 (87,9%) sampel serum positif
oleh IgM ELISA (Tabel 1) dan 4 (13%) adalah PCR positif (Tabel 2). Di
antara 43 kasus positif dengan ELISA saja, 14 (34,14%) sampel menunjukkan
amplifikasi positif oleh PCR. Sensitivitas dan spesifisitas PCR bila
dibandingkan dengan MAT adalah 11% dan 95% masing-masing. Alasan
untuk sensitivitas yang lebih rendah bisa jadi karena fase penyakit di mana
sampel pasien dikirim. Sebagai dibandingkan dengan MAT, ELISA
menunjukkan sensitivitas 43% dan spesifisitas 76%. Perbandingan hasil dari
tiga tes mengungkapkan bahwa kombinasi MAT dan ELISA memiliki
sensitivitas tertinggi yang mengkonfirmasi infeksi pada sebanyak 61 pasien.
Namun kami memiliki 4 serum dari pasien dengan kecurigaan klinis
leptospirosis negatif oleh MAT dan ELISA tetapi dijemput oleh PCR.