Penuntun Praktikum Bioteknologi Kelautan

Prodi Bioteknologi
Genap 2017
Lab 1. Penyaringan Air Laut
Alat :
1. Vacuum Pump
2. Membrane filter 0.2 µm
3. Filter Kit
4. Water Container 10 L
Bahan :
1. Air Laut salinitas 25-30 psu
Prosedur :
1. Pastikan vacuum pump tersambung ke filter kit
2. Masukkan membrane filter ke dalam filter kit
3. Nyalakan pompa vacuum
4. Masukkan air laut ke dalam filter kit
5. Adjust pompa vacuum bila perlu untuk memperlancar aliran air
6. Masukkan air laut hasil saringan ke dalam water container dan beri label
7. Gantilah filter membrane bila kotor dan aliran air tidak lancar
Lab 2. Pembuatan Media f/2 untuk kultur mikroalga
Alat :
1. Micro pipet 10-100 µL
2. Erlenmeyer flask 1000 mL 7 buah
3. Autoclave
4. Aluminium Foil
5. Autoclave tape
6. Erlenmeyer flasks 100-250 mL + Gelas ukur 50 mL-100 mL 10 buah
7. Timbangan analitik
8. Spatula
Bahan :
1. F/2 media concentrate A dan B
2. Sodium metasilicate
3. Air laut yang telah di filter

1
 Prosedur :
1. Masukkan 750 mL air laut yang telah di filter ke dalam Erlenmeyer flasks dan beri
autoclave tape pada setiap flask
2. Autoclave Erlenmeyer yang berisi air laut pada suhu 121°C.
3. Autoclave Erlenmeyer 100-250 mL yang telah diberi tape pada suhu 121°C
4. Bila proses autoclave telah selesai, keluarkan flasks dengan hati-hati. Gunakan
sarung tangan bila perlu untuk menghindari tangan anda terpapar panas
5. Sambil menunggu air laut dalam flask dingin, timbanglah 0.0132 g Sodium
Metasilicate menggunakan timbangan analitik
6. Masukkan masing-masing 132 µL f/2 concentrate A dan B ke dalam Erlenmeyer
flasks. Tambahkan Sodium Metasilcate. Aduk atau goyangkan flasks dengan hati-
hati hingga silicate larut
7. Tambahkan air laut steril dan telah diautocalve kedalam masing-masing flask
sehingga volume dalam tiap flask mencapai 1000 mL
8. Bila media f/2 telah siap, masukkan 50-100 mL kedalam Erlenmeyer flasks 100-250
mL
9. Simpan semua media dalam refrigerator sampai praktikum selanjutnya
Lab 3. Kultur Mikroalga
Alat :
1. Hand held Fluorometer
2. Haemocytometer
3. Light Microscope
4. Micropipet 0-20 µL
5. Pasteur Pipet
Bahan
1. Microalgae culture stock
2. Culture media
3. 90% (v/v) acetone containing a little MgCO3
Prosedur
1. Keluarkan flasks yang berisi media kultur dari refrigerator
2. Masukkan 10 mL culture stock ke dalam masing-masing flask dan aduk dengan cara
digoyangkan
3. Beri label flask dengan nama kelompok, species mikroalga dan tanggal kultur
4. Ambil sampel mikroalga dari flask ± 20 µL dan masukkan dalam haemocytometer
5. Hitung jumlah sel mikroalga dibawah mikroskop dan catat pada lab notebook anda
6. Ukur pula kepadatan sel menggunakan hand held fluorometer
7. Catat data fluorescence disamping data haemocytometer agar dibandingkan pada saat
perhitungan pertumbuhan
8. Letakkan flask kultur pada lab bench yang terkena cahaya matahari langsung

2
 9. Amati pertumbuhan dengan menggunakan haemocytometer dan hand held
fluorometer setiap 2 hari sekali selama 2 minggu. Bila pertumbuhan belum mencapai
stationary phase lanjutkan pengamatan sampai 3 minggu
10. Catat data pertumbuhan hasil pengamatan dalam lab notebook anda
11. Bila pertumbuhan telah mencapai stationary phase, saring 15-20 mL sampel
mikroalga menggunakan filter fiber GF/F. Catat volume sampel yang anda saring
12. Simpan filter di dalam gelap pada suhu-20°C untuk mencegah kerusakan pigmen
sampai praktikum selanjutnya untuk perhitungan kandungan carotenoid
Field : Sampling Mikroalga dari Teluk Kendari
Alat:
1. Plankton net 10-25µm mesh size
2. Botol Samples
3. Ember volume 10 L 4 buah
4. Styrofoam
5. Erlenmeyer Flask 500 mL yang telah disterilisasi 10 buah
6. Hand refractometer
7. Termometer
Bahan
1. F/2 Culture Media
Prosedur
1. Pengambilan sampel akan dilakukan antara jam 10-12 Siang
2. Semua peserta mata kuliah Bioteknologi Kelautan harus mengikuti proses pengambilan
sampel mikroalga.
3. Transportasi menggunakan angkot
4. Sesampainya di perairan Teluk Kendari, saringlah air laut sebanyak 50 L menggunakan
ember ke dalam Plankton Net
5. Masukkan sampel hasil penyaringan ke dalam botol sampel dan beri label lokasi
pengambilan sampel, tanggal dan nama kelompok
6. Catat pula kedalaman, salinitas dan suhu air laut di lokasi pengambilan sampel
7. Tiap kelompok bertanggung jawab terhadap sampel masing-masing
8. Sesampai di Lab, masukkan sampel dalam Erlenmeyer flask 500 mL
9. Tambahkan 100 mL f/2 media
10. Letakkan Erlenmeyer yang berisi sampel di atas laboratorium bench yang terpapar sinar
matahari
Lab 4. Isolasi Mikroalga Menggunakan Agar
Alat:
1. Cawan Petri + tutup
2. Spatula
3. Lampu Bunsen

3
 4. Inoculating loop
5. Parafilm
6. Flask 1000 mL 2 buah
7. Flask 2 L
8. 1 ml or 0.1 ml pipette box
9. Bunsen burner
10. Timbangan analitik
11. Test tube steril 10 mL 20 buah + Rak
Bahan:
1. F/2 Culture media
2. Agar
3. Acetone analytical grade
4. Sampel mikroalga
5. Air laut steril
Prosedur
1. Timbang 15 g agarose dan masukkan dalam 2 l conical flask yang telah diisi 500 mL
air distilasi
2. Panaskan 500 mL air laut steril sampai salinitasnya mencapai 50-70 psu
3. Panaskan agar dalam microwave sampai agar mencair.
4. Campurkan agar yang masih panas dengan air laut dalam flask yang baru
5. Aduk dan tutup flask
6. Autoclave flask pada suhu 125 °C for 30 minutes at 1 atm dan dinginkan
7. Jika telah dingin, tambahkan 500 mL F/2 medium dan aduk dengan cara memutar
flask sehingga nutrient tercampur
8. Tuang medium agar yang masih hangat ke dalam cawan petri steril, tutup dan
dinginkan sampai agar mengeras
9. Jika belum digunakan, simpan dalam kantong plastic di dalam refrigerator (kulkas)
10. Ambil 0.1 mL sampel mikroalga dan letakkan dalam agar plate
11. Sterilkan inoculation platinum loop dengan cara panaskan pada lampu Bunsen sampai
berwarna merah
12. Dinginkan loop dan spread the algal sample by streaking onto the agar
13. Tutup kembali agar plate dan gunakan parafilm untuk menutup sisi luar plate
sehingga agar tidak mongering
14. Letakkan cawan petri yang telah berisi koloni alga di lab bench yang terpapar
matahari
15. Jangan lupa memberi label pada setiap cawan petri dengan tanggal isolasi, sumber
sampel dan nama kelompok
16. Cek cawan petri setiap minggu
17. Jika koloni telah tumbuh, ambil sampel mikroalga menggunakan sterile platinum
hook and check dibawah microscope
18. Since different colonies on this first streak plate often tend to grow together, it is
difficult to pick off colonies with only one species. You may have to scrape some

4
 colonies off the first plate and re-streak them on a second plate in order to get good
separation.
19. Select and transfer a small portion of the monospecific pure colony together with
some agar using a sterile platinum loop into a test tube filled with 5-10 ml of f/2
culture medium and shake it regularly during incubation on an illuminated glass rack.
20. When a colour change is observed in the tube, check under the microscope the
isolated algal strain
21. Subculture these cells about once a week in order to keep them healthy.

Lab 5. Total Carotenoid Assay

Alat :
1. Spectrophotometer
2. Centrifuge
3. Mortar and Pestle
4. Small test tube 5 mL

Bahan:
1. Sampel mikroalga yang telah disaring
2. Liquid Nitrogen
3. Ethanol:Water (3/1 v/v) solvent

Prosedur:

1. Tumbuk filter dengan cara menuangkan 1 mL liquid nitrogen sampai extract

microalgae keluar
2. Tambahkan 2 mL ethanol/water (3/1 v/v) mixture dan diamkan selama 30 minutes.
3. Centrifugasi hasil extraksi pada kecepatan 4500 × g selama 10 min
4. Tuang extract pada test tube steril
5. Pellet hasil centrifugasi ditambahkan kembali 2 mL of the ethanol/water mixture and
extracted for a second time selama 30 menit
6. Tuangkan hasil extract dalam test tube
7. Dilute hasil extract dengan menambahkan 50 mL 90 % (v/v) methanol in water. Jika
masih terlalu pekat tambahkan lagi 50 mL solvent
8. Baca absorbances menggunakan spectrophotometer pada 470, 652 and 665 nm
9. Hitung total carotenoid content menggunakan persamaan Lichtenthaler sebagai
berikut:

Cα (µg/mL) = 13.36 A665 – 5.19 A652

Cb (µg/mL) = 27.43 A652 – 8.12 A665
C(x+c) (µg/mL) = (1000 A470 – 2.13 Cα – 97.64 Cb) / 209