NMR structural determination of unique invertebrate

glycosaminoglycans endowed with medical properties

Los glicosaminoglicanos (GAG) son polisacáridos sulfatados de estructura
compleja dotados de numerosas funciones biomédicas. Aunque se
distribuyen de manera ubicua en vertebrados, los GAG también pueden
ocurrir en ciertos invertebrados terrestres o marinos. La espectroscopia de
resonancia magnética nuclear (RMN) ha sido la técnica analítica empleada
principalmente en la caracterización estructural de GAG de cualquier fuente.
El objetivo de esta revisión es ilustrar la aplicación de la RMN en la
determinación estructural de algunos ejemplos representativos de GAG de
invertebrados de estructuras únicas y dotados de acciones terapéuticas. Se
trata del sulfato de condroitina fucosilado holotúrico, el sulfato de acharan
aislado del caracol Achatina fulica, los sulfatos de dermatan con distintos
patrones de sulfatación extraídos de las especies ascidianas, el sulfato de
heparan sulfurónico sulfatado aislado del gastrópodo Nodipecten nodosum y
la heparina hibrida Molécula de heparán sulfato obtenida del camarón
Litopenaeus vannamei. Estos GAG de invertebrados exhiben estructuras
distintas en comparación con los extraídos de GAG de mamíferos. Las
distintas estructuras de los GAG de invertebrados conducen también a
diferentes mecanismos de acción en comparación con los estándares GAG de
mamíferos. Los GAG de invertebrados comprenden candidatos terapéuticos
prometedores en la lucha contra las enfermedades. La solución NMR ha
desempeñado un papel fundamental en esta investigación, descubrimiento y
desarrollo de fármacos basados en carbohidratos.
Al igual que en los análisis estructurales de GAG de mamíferos, la solución
por espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) sola o combinada
con otras técnicas ha sido el método preferido utilizado para caracterizar las
moléculas de invertebrados.
Aquí, se analiza este análisis basado en RMN de GAG de estructuras únicas
encontradas exclusivamente en animales invertebrados con el fin de ofrecer
una guía técnica directa a futuras investigaciones en el área. También se
proporciona una discusión sobre las implicaciones medicinales de estas
distintas estructuras de GAG de invertebrados para resaltar sus beneficios
potenciales en tratamientos futuros y la profilaxis de ciertas enfermedades.
Holothurian FucCS
La primera evidencia que describe la existencia de que los pepinos de mar
(Echinodermata, Holothuroidea) podrían sintetizar un GAG diferente en su
pared corporal parece provenir de la referencia 24. A través de los análisis de
composición de monosacáridos, se informó que se compuso el nuevo GAG
extraído de la especie holotúrica Ludwigothurea grisea de cantidades
equimolares de unidades de aL-fucopiranosa (Fucp), bD-GlcA y bD-GalNAc. En
un trabajo adicional del mismo grupo, los investigadores ampliaron la
caracterización estructural de este GAG holotúrico mediante el uso de
espectroscopía de RMN combinada con análisis de metilación. En este
trabajo, los autores han confirmado inequívocamente que este nuevo GAG de
L. grisea está compuesto por unidades Fucp con ramificación 3 ramificadas a
las unidades GlcA, que junto con las unidades GalNAc forman un esqueleto
similar a CS como se ve comúnmente en CSs de mamíferos ( Figura 1). Este
nuevo GAG holoturiano se denominó entonces sulfato de condroitina
fucosilado (FucCS).
La evidencia que respalda la aparición fisiológica de FucCS vinculada a un
núcleo proteico como se ve en los proteoglicanos compuestos por GAG se
incrementó de manera inclusiva. Se observó que la estructura de FucCS de L.
grisea era muy heterogénea, y la propuesta definitiva para su estructura se
alcanzó solo en dos trabajos adicionales del mismo grupo. Una revisión
exhaustiva sobre los antecedentes y la historia de este GAG de pepino de mar
se ha publicado recientemente. La composición y las cantidades de unidades
actualmente aceptadas para FucCS de L. grisea así como para FucCS
obtenidos de otras especies de pepino de mar estudiadas hasta ahora se
muestran en la Tabla 1. Estas estructuras de FucCS se determinaron
principalmente mediante espectroscopia de RMN en estado líquido. A
continuación, ilustro la caracterización estructural basada en RMN de FucCS
de tres de estas especies holoturias, en base a la referencia pendiente 15. Se
presenta una breve discusión sobre las actividades médicas y los requisitos
estructurales de FucCS en algunas de estas actividades después del análisis
de RMN.
La Fig. 1 muestra los espectros de RMN unidimensionales (1D) 1H (paneles
AeC) y 13C (paneles DeF) asignados parcialmente de FucCSs aislados de tres
especies de pepinos de mar: Isostichopus badionotus, Stichopus tremulus y
Holothuria vagabunda. Las señales a 1.21 y 1.89 ppm se derivan
respectivamente de los protones de metilo de Fucp (CH3) y grupos acetilo de
GalNAc (COCH3). Las señales entre 5.1 y 5.6 ppm pertenecen a los átomos
anoméricos de las unidades de Fucp con diversos sulfatos.
El espectro de RMN 1H de FucCS de I. badionotus muestra señales
anoméricas a 5.23 y 5.56 ppm (Fig. 2A). Esto indica la presencia de unidades
Fucp 4-mono-sulfatadas (Fuc4S) y 2,4-di-sulfatadas (Fuc2,4S) (Tabla 2). Los
valores integrales de estos picos muestran que el contenido de sulfatación es
de 4.1% y 95.9% para unidades mono y disulfatadas, respectivamente (Tabla
1). El espectro 1H de FucCS de S. tremulus muestra tres señales claras en la
región anomérica (Fig. 2B). Los picos de 5.23 y 5.56 ppm pertenecen a las
unidades Fuc4S y Fuc2,4S, respectivamente (Tabla 2). La señal a 5,33 ppm se
asignó al Fucp 3,4-disulfatado (Fuc3,4S) en base a los estudios de FucCS
obtenidos de Stichopus japonicus y L. grisea.
FucCS fromS. el trémulo se compone de 24.8%, 22.4% y 52.8% de Fuc4S,
Fuc2,4S y Fuc3,4S, respectivamente (Tabla 1). En la región 1H anomérica de
FucCS de H. vagabunda (Fig. 2C), los picos a 5.17 y 5.23 ppm pertenecen a la
unidad Fuc4S, mientras que los de 5.33 y 5.56 ppm pertenecen a las unidades
Fuc3,4S y Fuc2,4S, respectivamente. La señal a 5.09 ppm se asigna a una
unidad de fucosa no sulfatada (Fuc0S). En base a los valores integrales de
estos picos, el patrón de sulfatación de las unidades de Fucp de cadena lateral
en FucCS de H. vagabunda es 25.6%, 50.2%, 15.8% y 8.4% para Fuc0S, Fuc4S,
Fuc2,4S y Fuc3,4S ( Tabla 1).
Los diferentes patrones de sulfatación de las ramas de Fucp pueden afectar
los desplazamientos químicos de los protones de metilo en esta unidad
propia, pero también en unidades GalNAc adyacentes (paneles de inserto
superiores de la Fig. 2). Por ejemplo, I. badionotus FucCS tiene una señal
principal de protones de metilo a 1.19 ppm (Fig. 2A), que puede asignarse
fácilmente a un Fuc2,4S. Los FucCS de S. tremulus y H. vagabunda presentan
un perfil de señal de metilo de Fucp complicado (Fig. 2B y C) similar a sus
señales de protones anoméricos, lo que indica patrones de sulfatación
complejos de sus unidades de Fucp. Las señales de protones de metilo de los
acetilos de GalNAc (1.8e2.0 ppm) también son diferentes entre los tres FucCS.
Se encontró un pico importante en 1.89e1.93 ppm en los espectros de FucCSs
de S. tremulus y I. badionotus, lo que indica que comparten un patrón de
sulfatación similar en las unidades GalNAc dentro de sus esqueletos de
columna vertebral. Sin embargo, H. vagabunda FucCS proporciona señales de
metilo de GalNAc más complejas debido al complejo patrón de sulfatación de
sus unidades de GalNAc de composición, como se explica a continuación. Los
espectros 1D 13C RMN de FucCSs (Fig. 2DeF) no muestran ninguna diferencia
aparente en los patrones de sulfatación de las ramas de Fucp. Sin embargo,
las señales principales fueron útiles para asignar la secuencia del esqueleto
CS ya que estas señales de carbono son muy similares a las presentes en el
espectro de un condroitín sulfato E estándar (CS-E), 33 y en el FucCS de S.
japonicus37, que contiene el CS-E como su columna vertebral (Tabla 1). En CS
E, el GalNAc está sulfatado en 4 y 6 Oposiciones. Una señal a 67.5 ppm,
presente en los tres espectros, proviene de la 6-sulfatación en GalNAc.
La señal relacionada con la 4-sulfatación es difícil de asignar ya que se
encuentra en la región de superposición de 70e80 ppm. H. vagabunda FucCS
da un espectro complejo (Fig. 2F) y la señal adicional a 62.5 ppm se indica de
un C6 no sulfatado en las unidades GalNAc de composición. En la región de
señal 13C anomérica, I. badionotus FucCS (Fig. 2D) muestra tres señales
claras con dC a 97.6, 99.8 y 104.1 ppm, derivadas de los tres tipos de
monosacáridos constituyentes, Fucp, GalNAc y GlcA, respectivamente. Esto es
consistente con el informe anterior.14 Sin embargo, aunque las señales de
GalNAc y GlcA también fueron claramente reconocibles en los espectros de
los otros dos FucCS (Fig. 2E, F), sus señales anoméricas de Fucp fueron
bastante complicadas ya que los patrones de sulfatación son más Ncomplex
en estos FucCSs que en I. badionotus FucCS.
FucCS de los pepinos de mar puede exhibir efectos beneficiosos en varios
sistemas biomédicos como la coagulación, 14,15,27,38,39 trombosis,
hemodiálisis 39e44, 45 aterosclerosis, 46,47 crecimiento celular, 48
angiogénesis, 49 fibrosis, 50 tumores e inflamación. , 51 infecciones virales,
52,53 hiperglucemia, 54 enfermedades infecciosas (malaria), 55 y nefropatía
diabética.56 En la mayoría de estos sistemas, las unidades Fucp sulfatadas
desempeñan un papel esencial. La defucosilación puede abrogar muchas de
estas funciones. Además de la presencia de Fucp, sus patrones de sulfatación
también parecen contribuir a la función. Sin embargo, la anticoagulación y la
antitrombosis son las únicas actividades de FucCS en las que se han
identificado los patrones de sulfatación de las unidades de composición de
Fucp para la mejor respuesta.
El esclarecimiento de este requisito estructural solo en las actividades
relacionadas con el sistema cardiovascular parece ser una consecuencia
natural de la gran cantidad de trabajo relacionado con los efectos de FucCS
en este sistema. La gran demanda de nuevos anticoagulantes y
antitrombóticos es proporcional al número de muertes y los pacientes
reportados con complicaciones relacionadas con el sistema de corazón y
sangre. teniendo el patrón de 2,4-di-sulfatación.
La Tabla 1 muestra el potencial anticoagulante de las FucCS estudiadas hasta
ahora. Las mediciones se realizaron a través del método del tiempo de
tromboplastina parcial activada (aPTT). Los tiempos más largos logrados a
través de este experimento in vitro representan los mejores potenciales
anticoagulantes. Es evidente que las FucCS de la especie I. badionotus,
Thelenata ananas y Apostichopus japonicus tienen las mejores respuestas.
Los niveles de unidades de Fuc2,4S en estos tres FucCS son altos cuando se
comparan con los FucCS de las otras especies holoturias.
Fig. 1. Representación estructural de
los FucCS holoturios (monosacáridos
negros y rojos) y los CS regulares
(monosacáridos negros) como se ve en
los mamíferos. Son a-L-fucopiranosa
(L-Fucp) en rojo, ácido b-D glucurónico
(D-GlcA) y N-acetil-b-Dgalactosamina
(D-GalNAc). Tenga en cuenta que la
GAG holoturiana se diferencia de la
contraparte de los mamíferos solo por
la adición de la unidad de fucosilo
sulfatado resaltada en rojo (para la
interpretación de las referencias al
color en la leyenda de esta figura, el lector hace referencia a la versión web de este
artículo).
Fig. 2. Espectros de RMN de 1D 1H (AeC) y 13C (DeF) de FucCS de tres especies de pepinos
de mar: Isostichopus badionotus (A y D), Stichopus tremulus (B y E) y Holothuria
vagabunda (C y F). Modificado con permiso del trabajo.
Tabla 1. Desplazamientos químicos de RMN 1H de los residuos de fucosa en FucCSs.