QUI TRÌNH THỰC HIỆN PHẢN ỨNG NGĂN NGƯNG KẾT HỒNG CẦU (HI)

1. NGUYÊN TẮC
Protein hemagglutinin (HA) gây ngưng kết hồng cầu nhờ sự gắn kết của HA với các
thụ thể trên bề mặt hồng cầu. Khi có sự gắn kết đặc hiệu của kháng thể vào vị trí quyết
định kháng nguyên trên HA, phân tử này sẽ bị khóa lại và không thể gắn kết hồng cầu
được nữa gây nên hiện tượng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI). Đây là cơ sở để phát
triển phương pháp HI, được sử dụng rộng rãi trong việc đánh giá đáp ứng miễn dịch
với vaccine cúm.
Phản ứng HI được thực hiện trên các plate 96 giếng. một lượng kháng nguyên HA nhất
định được trộn với một loạt các độ pha loãng huyết thanh, hồng cầu sau đó được thêm
vào để đánh giá độ gắn kết của kháng thể với phân tử HA qua hiệu quả ngưng kết với
hồng cầu.

2. DỤNG CỤ - HÓA CHẤT - SINH PHẨM

2.1. Dụng cụ, trang thiết bị
- Micro-pipette đơn kênh (200µl), đa kênh (200µl) (Eppendorf)
- Đầu côn (200µl) (Corning)
- Tube 1.5ml (Eppendorf)
- Tube li tâm 15ml (Corning)
- Pipette nhựa 5ml, 10ml (Corning)
- Pipettte aid (Eppendorf)
- Máng nhựa (Greiner)
- Plate chữ V 96 giếng (Nunc)
- Tủ cấy vô trùng class 3
- Bể ổn nhiệt
- Máy li tâm
2.2. Hóa chất, sinh phẩm
- Kháng nguyên HA (NIBSC)
- Kháng huyết thanh chuẩn (NIBSC)
- RDE (Denka Seiken)
- Dung dịch đệm PBS (0.01M) pH 7.2 (Sigma)
- Hồng cầu gà 0.5% trong dung dịch PBS
3. KỸ THUẬT TIẾN HÀNH
3.1. Xử lý huyết thanh
Trong huyết thanh có chứa một số thành phần gây ức chế ngưng kết hồng không đặc hiệu
cho kháng thể kháng virus cúm, do đó để tránh trường hợp dương tính giả, huyết thanh cần
được xử lý với enzym (RDE) để loại bỏ các yếu tố ức chế ngưng kết không đặc hiệu này.
- RDE được pha loãng theo hướng dẫn của nhà sản xuất, chia nhỏ và được bảo quản ở
điều kiện -70oC cho đến khi sử dụng
- Quá trình xử lý được tiến hành như sau: cho 3 thể tích RDE vào 1 thể tích huyết thanh,
ủ qua đêm trong tủ 37oC, sau đó bất hoạt RDE ở 56oC trong 30 phút, để huyết thanh
trở lại nhiệt độ phòng, bổ sung vào 6 thể tích nước muối sinh lý NaCl 0.85% được
huyết thanh có nồng độ pha loãng cuối cùng 1:10.
3.2. Chuẩn bị kháng nguyên HA cho phản ứng HAI và chuẩn độ ngược
- Độ pha loãng cao nhất của virus tạo ra ngưng kết hoàn toàn được xem là điểm chót
nồng độ HA. Hiệu giá HA là nghịch đảo độ pha loãng virus cao nhất gây ra ngưng kết
hoàn toàn và được ký hiệu là đơn vị HA (HAU)/thể tích virus.
- Hiệu giá tiêu chuẩn cho phản ứng HAI là 4 HAU/25µl hay 8 HAU/50µl, tiến hành pha
loãng dịch virus đến hiệu giá tiêu chuẩn và chuẩn độ ngược bằng phản ứng HA để kiểm
tra lại hiệu giá của dung dịch virus đã chuẩn bị.

3.3. Phản ứng HAI

- Cho 25µl PBS (pH 7.2) vào tất cả các giếng từ hàng B đến hàng H
- Cho 50µl mỗi huyết thanh đã được xử lý vào các giếng ở hàng A (trừ giếng A7)
- Pha loãng ½ bằng chuyển 25µl từ hàng A lần lượt cho đến hàng H, bỏ 25µl cuối cùng
ở hàng H.
- Bổ sung 25µl dịch virus chuẩn vào tất cả các giếng, riêng các giếng ở cột 7 thì bổ sung
25µl PBS.
- Đặy kín plate và ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút.
- Bổ sung 50l hồng cầu gà 0,5% vào tất cả các giếng, ủ ở nhiệt độ phòng từ 30 – 60
phút.

3.4. Đọc và biện luận kết quả

Nếu có sự phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể, sự ngưng kết hồng cầu sẽ bị ức chế,
hồng cầu lắng xuống đáy giếng tạo thành một chấm tròn. Nồng độ pha loãng cao nhất gây
ra ức chế ngưng kết sẽ được ghi nhận hiệu giá của kháng thể.

3.5. Điều kiện để kết quả phản ứng HI có giá trị

- Chuẩn độ ngược phải cho kết quả 8HAU/50µl
- Chứng huyết thanh không gây ngưng kết hồng cầu
- Chứng âm không gây ngưng kết hồng cầu
- Huyết thanh chuẩn gây ngưng kết tại nồng độ biết trước
 QUI TRÌNH THỰC HIỆN PHẢN ỨNG VI TRUNG HÒA (MNA)

4. NGUYÊN TẮC
Phương pháp vi trung hòa (MNA) là phương pháp huyết thanh học dựa vào phản ứng
trung hòa virus kết hợp ELISA trong đó virus được trung hòa bởi kháng thể trong huyết
thanh, rồi đem cấy vào tế bào thích hợp. Mức độ hiện diện của virus sẽ được đánh giá
bằng việc gắn kết với một kháng thể đặc hiệu và phát hiện bằng phản ứng ELISA.
Ngoài việc được sử dụng trong chẩn đoán, MNA được sử dụng rộng rãi trong các
nghiên cứu dịch tễ và miễn dịch cũng như đánh giá đáp ứng miễn dịch của vaccine.

5. DỤNG CỤ - HÓA CHẤT - SINH PHẨM

5.1. Dụng cụ, trang thiết bị
- Micro-pipette đơn kênh (200µl), đa kênh (200µl) (Eppendorf)
- Đầu côn (200µl) (Corning)
- Tube 1.5ml (Eppendorf)
- Tube li tâm 15ml (Corning)
- Pipette nhựa 5ml, 10ml (Corning)
- Pipettte aid (Eppendorf)
- Máng nhựa (Greiner)
- Plate ELISA 96 giếng (Nunc)
- Tủ an toàn sinh học cấp 2
- Tủ ấm CO2, 37oC
- Bể ổn nhiệt 37oC, 56oC
- Máy li tâm
- Kính hiển vi soi ngược
- Tủ đông sâu -70oC
- Máy đọc ELISA bước sóng 490nm
- Máy rửa plate tự động
- Máy li tâm lạnh
- Bình nitơ lỏng
5.2. Hóa chất, sinh phẩm
- Tế bào MDCK (CCL-34)
- Chủng virus A/H1N (NIBSC)
- Huyết thanh chuẩn (NIBSC)
- Môi trường DMEM (Gibco 11960)
- Huyết thanh bào thai bê FBS (Gibco)
- Trypsin EDTA (Gibco)
- L-Glutamin, Trypsin TPCK, đệm PBS, kháng sinh penicillin-streptomycin 100X
(Sigma)
- Dung dịch Acetone 80% trong PBS
- Wash buffer: PBS, Tween-20 0.05%
- Blocking buffer: PBS, 1% BSA, 0.1% Tween-20
- Kháng thể sơ cấp Anti-NP mouse monoclonal antibody, CDC 90-0026
- Kháng thể thứ cấp IgG cộng hợp HRP, Kirkegaard and Perry 474-1802
- Cơ chất HRP (Sigma)
- Dung dịch ngừng phản ứng: Acid Sulfuric 1N

6. KỸ THUẬT TIẾN HÀNH

6.1. Xác định hiệu giá virus TCID50 cho thử nghiệm
 Dịch virút được pha loãng bậc 10 trong môi trường duy trì MM (DMEM chứa 0.2%
BSA và trypsin TPCK 2µg/ml) (từ 10-1 đến 10-10).
 Chuyển 100µl mỗi độ pha loãng của virus vào 4 giếng của plate ELISA lần lượt cho
đến khi hết các độ pha loãng, cột 12 của plate chỉ chứa MM và là chứng tế bào (CC)
 Đặt plate virus pha loãng vào ủ trong tủ 37oC, 5% CO2 trong 1 giờ. Bước này thực
hiện để đồng bộ với điều kiện của phản ứng trung hòa.
 Chuẩn bị dịch tế bào MDCK nồng độ 1.5x105 tb/ml trong MM, chuyển vào mỗi
giếng 100µl dịch tế bào và đem ủ ở điều kiện tủ 37oC, 5% CO2 từ 18 – 20 giờ.
 Thực hiện phản ứng ELISA
 Sau thời gian ủ, loại bỏ hết môi trường trong plate
  Rửa mỗi giếng bằng 200µl PBS
 Loại bỏ PBS trong plate, bổ sung vào mỗi giếng 100µl dung dịch cố định lạnh
 Đặy kín plate và ủ ở nhiệt độ phòng 10 – 12 phút
 Loại bỏ dung dịch cố định và để plate khô tự nhiên
 Sau khi plate được cố định, rửa 3 lần với dung dịch rửa (300µl/giếng)
 Pha loãng kháng thể sơ cấp tỷ lệ 1:1000 trong dung dịch pha loãng kháng thể
và chuyển vào mỗi giếng 100µl
 Đặy nắp và ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
 Rửa plate 3 lần với dung dịch rửa
 Pha loãng kháng thể thứ cấp tỷ lệ 1:2000 trong dung dịch pha loãng kháng thể
và chuyển vào mỗi giếng 100µl.
 Đặy nắp và ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
 Rửa plate 5 lần với dung dịch rửa.
 Pha cơ chất và chuyển vào mỗi giếng 100µl
 Ủ ở nhiệt độ phòng 5 – 10 phút. Thời gian ủ có thể khác nhau giữa các loại
virus
 Thêm vào mỗi giếng 100µl dung dịch dừng phản ứng
 Đo tín hiệu màu của các giếng ở bước sóng 490nm (OD490).
 Đọc kết quả
 Tính giá trị OD490 trung bình của các giếng CC
 So sánh giá trị OD490 của các giếng với OD490 của CC, giếng nào có OD490
cao gấp 2 lần so với OD490 của CC thì được ghi nhận là dương tính với virus.
Kết quả TCID50 được tính bằng phương pháp Reed-Muench.

6.2. Phản ứng trung hòa virus

 Xử lý bất hoạt huyết thanh ở 56oC trong 30 phút.
 Cho 50µl MM vào các giếng cột 1 – 10 của plate, bổ sung thêm 40µl vào các giếng
hàng A (A1 - A10)
 Cho 10µl mỗi huyết thanh đã bất hoạt vào mỗi giếng của hàng A (huyết thanh 1 vào
A1, huyết thanh 2 vào A2, …)
 Thực hiện pha loãng ½ bằng cách chuyển lần lượt 50µl từ hàng này sang hàng kia
(A1 sang B1, B1 sang C1 … H1; A2 sang B2, B2 sang C2, … H2; …)
 Bỏ đi 50µl cuối cùng ở hàng H
 Pha loãng virus trong MM sao cho 50µl chứa 100TCID (WV), cho 50µl dịch này
vào tất cả các giếng (trừ các giếng ở cột 11 và 12)

Kiểm tra lại hiệu giá virus (BT) (thực hiện 1 lần trong mỗi đợt thí nghiệm)
 Cho 50µl MM vào các giếng cột 11 (A11 – H11)
 Cho 50µl WV vào giếng A11, pha loãng ½ dọc xuống giếng H11, bỏ 50µl sau
cùng ở giếng H11.
 Thêm vào 50µl MM vào các giếng A11 – H11

Chứng tế bào (CC) và chứng virus (VC)

 Thiết lập 4 giếng CC và 4 giếng VC ở cột 12. CC và VC phải được thực hiện trên
mỗi plate
  Cho 100µl MM vào mỗi giếng CC và 50µl MM + 50µl WV vào mỗi giếng WV
 Ủ plate trong tủ 37oC, 5% CO2 trong 1 giờ.

Chuẩn bị tế bào MDCK

 Pha loãng thành dịch chứa 1.5 x 105 tb/ml. Cho 100µl dịch tế bào này vào tất cả
các giếng của plate sau khi ủ.

 Ủ plate trong tủ 37oC, 5% CO2 từ 18 – 20 giờ.

 Sau thời gian ủ, tiến hành thực hiện phản ứng ELISA như đã mô tả trong phần xác
định hiệu giá virus TCID50.

6.3. Phân tích kết quả

 Kết quả được tính cho từng plate riêng
 Hiệu giá 50% kháng thể trung hòa virus của mỗi huyết thanh được tính theo công
thức sau:

(OD trung bình của VC) – (OD trung bình của CC)
X= + (OD trung bình của CC)
2

 Trong đó X là giá trị OD tại đó 50% số tế bào MDCK được gây nhiễm. Các giá trị
thấp hơn hoặc bằng X được ghi nhận là dương tính với hoạt tính trung hòa. Nghịch
đảo độ pha loãng huyết thanh tương ứng với giếng đó sẽ là hiệu giá kháng thể trung
hòa 50% cho mẫu huyết thanh đó. Tương ứng với cách thực hiện trên, độ pha loãng
các huyết thanh sẽ như sau: giếng A 1:10, giếng B 1:20, giếng C 1:40, giếng D 1:80,
giếng E 1:160, giếng F 1:320, giếng G 1:640, giếng H 1:1280.
 Các giếng CC nên có OD490<0.2 và VC có OD490>0.8
 Đối với việc khẳng định lại hiệu giá virus thì trong đa số các trường hợp, phản ứng
được chấp nhận khi BT có 5 – 7 giếng dương tính với virus.