Professional Documents
Culture Documents
QT MN -HI xét nghiệm kháng thể cúm
QT MN -HI xét nghiệm kháng thể cúm
1. NGUYÊN TẮC
Protein hemagglutinin (HA) gây ngưng kết hồng cầu nhờ sự gắn kết của HA với các
thụ thể trên bề mặt hồng cầu. Khi có sự gắn kết đặc hiệu của kháng thể vào vị trí quyết
định kháng nguyên trên HA, phân tử này sẽ bị khóa lại và không thể gắn kết hồng cầu
được nữa gây nên hiện tượng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI). Đây là cơ sở để phát
triển phương pháp HI, được sử dụng rộng rãi trong việc đánh giá đáp ứng miễn dịch
với vaccine cúm.
Phản ứng HI được thực hiện trên các plate 96 giếng. một lượng kháng nguyên HA nhất
định được trộn với một loạt các độ pha loãng huyết thanh, hồng cầu sau đó được thêm
vào để đánh giá độ gắn kết của kháng thể với phân tử HA qua hiệu quả ngưng kết với
hồng cầu.
4. NGUYÊN TẮC
Phương pháp vi trung hòa (MNA) là phương pháp huyết thanh học dựa vào phản ứng
trung hòa virus kết hợp ELISA trong đó virus được trung hòa bởi kháng thể trong huyết
thanh, rồi đem cấy vào tế bào thích hợp. Mức độ hiện diện của virus sẽ được đánh giá
bằng việc gắn kết với một kháng thể đặc hiệu và phát hiện bằng phản ứng ELISA.
Ngoài việc được sử dụng trong chẩn đoán, MNA được sử dụng rộng rãi trong các
nghiên cứu dịch tễ và miễn dịch cũng như đánh giá đáp ứng miễn dịch của vaccine.
6.1. Xác định hiệu giá virus TCID50 cho thử nghiệm
Dịch virút được pha loãng bậc 10 trong môi trường duy trì MM (DMEM chứa 0.2%
BSA và trypsin TPCK 2µg/ml) (từ 10-1 đến 10-10).
Chuyển 100µl mỗi độ pha loãng của virus vào 4 giếng của plate ELISA lần lượt cho
đến khi hết các độ pha loãng, cột 12 của plate chỉ chứa MM và là chứng tế bào (CC)
Đặt plate virus pha loãng vào ủ trong tủ 37oC, 5% CO2 trong 1 giờ. Bước này thực
hiện để đồng bộ với điều kiện của phản ứng trung hòa.
Chuẩn bị dịch tế bào MDCK nồng độ 1.5x105 tb/ml trong MM, chuyển vào mỗi
giếng 100µl dịch tế bào và đem ủ ở điều kiện tủ 37oC, 5% CO2 từ 18 – 20 giờ.
Thực hiện phản ứng ELISA
Sau thời gian ủ, loại bỏ hết môi trường trong plate
Rửa mỗi giếng bằng 200µl PBS
Loại bỏ PBS trong plate, bổ sung vào mỗi giếng 100µl dung dịch cố định lạnh
Đặy kín plate và ủ ở nhiệt độ phòng 10 – 12 phút
Loại bỏ dung dịch cố định và để plate khô tự nhiên
Sau khi plate được cố định, rửa 3 lần với dung dịch rửa (300µl/giếng)
Pha loãng kháng thể sơ cấp tỷ lệ 1:1000 trong dung dịch pha loãng kháng thể
và chuyển vào mỗi giếng 100µl
Đặy nắp và ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
Rửa plate 3 lần với dung dịch rửa
Pha loãng kháng thể thứ cấp tỷ lệ 1:2000 trong dung dịch pha loãng kháng thể
và chuyển vào mỗi giếng 100µl.
Đặy nắp và ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
Rửa plate 5 lần với dung dịch rửa.
Pha cơ chất và chuyển vào mỗi giếng 100µl
Ủ ở nhiệt độ phòng 5 – 10 phút. Thời gian ủ có thể khác nhau giữa các loại
virus
Thêm vào mỗi giếng 100µl dung dịch dừng phản ứng
Đo tín hiệu màu của các giếng ở bước sóng 490nm (OD490).
Đọc kết quả
Tính giá trị OD490 trung bình của các giếng CC
So sánh giá trị OD490 của các giếng với OD490 của CC, giếng nào có OD490
cao gấp 2 lần so với OD490 của CC thì được ghi nhận là dương tính với virus.
Kết quả TCID50 được tính bằng phương pháp Reed-Muench.
Kiểm tra lại hiệu giá virus (BT) (thực hiện 1 lần trong mỗi đợt thí nghiệm)
Cho 50µl MM vào các giếng cột 11 (A11 – H11)
Cho 50µl WV vào giếng A11, pha loãng ½ dọc xuống giếng H11, bỏ 50µl sau
cùng ở giếng H11.
Thêm vào 50µl MM vào các giếng A11 – H11
Sau thời gian ủ, tiến hành thực hiện phản ứng ELISA như đã mô tả trong phần xác
định hiệu giá virus TCID50.
(OD trung bình của VC) – (OD trung bình của CC)
X= + (OD trung bình của CC)
2
Trong đó X là giá trị OD tại đó 50% số tế bào MDCK được gây nhiễm. Các giá trị
thấp hơn hoặc bằng X được ghi nhận là dương tính với hoạt tính trung hòa. Nghịch
đảo độ pha loãng huyết thanh tương ứng với giếng đó sẽ là hiệu giá kháng thể trung
hòa 50% cho mẫu huyết thanh đó. Tương ứng với cách thực hiện trên, độ pha loãng
các huyết thanh sẽ như sau: giếng A 1:10, giếng B 1:20, giếng C 1:40, giếng D 1:80,
giếng E 1:160, giếng F 1:320, giếng G 1:640, giếng H 1:1280.
Các giếng CC nên có OD490<0.2 và VC có OD490>0.8
Đối với việc khẳng định lại hiệu giá virus thì trong đa số các trường hợp, phản ứng
được chấp nhận khi BT có 5 – 7 giếng dương tính với virus.