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Início: 03/08/2015
Fim: 08/12/2015
Dias e horário: sextas-feiras das 19hs às 22h40
Local: sala 04 B6 inferior
Professor: Roberto K. Salinas
Contato: roberto@iq.usp.br; sala 1001 do bloco 10 inferior
Mês DiaAssunto
Agosto 7 Hemoglobina e mioglobina, cooperatividade
14 Cinética enzimática, equação de Michaelis-Menten
21 Cinética enzimática
Mecanismos de catálise e tipos de inibição
28 Cinética
Membrana biológica
Compostos ricos em energia (ex. ATP, GTP)
Setembro 4 Transporte de membrana
Revisão de estruturas de carboidratos
Introdução ao metabolismo dos carboidratos
11 Semana da Pátria
18 Revisão para Prova 1
25 Semana da Química
Outubro 02 Prova 1
09 Via glicolítica
Ciclo de Krebs
16 Cadeia de transporte de elétrons e fosforilação oxidativa
23 Degradação e síntese de glicogênio
Neoglicogênese
Regulação, enzimas alostéricas
Integração do metabolismo de carboidratos, sinalização por
insulina e glucagon
30 Metabolismo de ácidos graxos
Fotossíntese
Novembro 06 Revisão
13 Prova 2 – não cai fotossíntese
20 Dia da consciência negra
27 Ação hormonal e integração metabólica/Biossíntese de
carboidratos em plantas e bactérias
Dezembro 04 Prova 3
Dezembro 11 Prova substitutiva (aberta)
Dezembro 15 Data máxima para cadastro de notas
Média Final = (P1 + P2 + P3)/3
Observação: 1) Os alunos que entregarem os exercícios obterão até 0.25 pontos na
média final caso necessitem.
1
2) A nota da prova substitutiva substitui a menor nota.
Introdução à Bioquímica
Roberto Salinas – roberto@iq.usp.br
Instituto de Química - USP
21 de outubro de 2015
1. Estrutura de proteínas
Figura 1: Reação de condensação entre Alanina e Serina formando um dipeptídeo Ala-Ser com
eliminação de uma molécula de H2O. As cargas líquidas do peptídeo e dos aminoácidos não estão
mostradas.
2
Figura 2. Diagrama de Ramachandran. As regiões delimitadas pelas linhas verdes
demarcam combinações permitidas de Ψ e Φ. Pontos fora das regiões delimitadas
pelas linhas verdes indicam um aminoácido com algum problema ou correspondem a
glicinas.
A relação evolutiva entre proteínas de diferentes organismos pode ser inferida a partir
de comparações entre sequências de aminoácidos. Famílias de proteínas que
compartilham a mesma estrutura e a mesma função podem ser facilmente
identificadas com base em similaridades entre sequências de aminoácidos. Membros
de uma mesma família são chamados de proteínas homólogas. A função de uma
3
proteína desconhecida pode eventualmente ser deduzida a partir da comparação de
sua sequência de aminoácidos com milhares de sequências de proteínas contidas nos
bancos de dados (por exemplo UNIPROT). Duas proteínas contendo ao menos 30%
de identidade de sequência geralmente compartilham a mesma estrutura e função.
Proteína A GVDEQRFRIEVIDDDVFEEDECFYIRLFN-------PSEGVK----------LAVPMIAT
Consenso G ++ R+ +IDDD+FEEDE F + L N EG+ L P AT
Proteína B GETQKEIRVGIIDDDIFEEDENFLVHLSNIRVSTEASDEGILEASRVSTLACLGSPSTAT
Proteínas assumem diversas funções, mas uma das funções mais comuns é a ligação
específica e reversível de outras moléculas. A molécula que se liga à proteína é
chamada de ligante. O ligante liga-se a um sítio de ligação, o qual deve ser
complementar em forma, tamanho, carga e hidrofilicidade ou hidrofobicidade ao
ligante (modelo chave-fechadura). A interação entre o ligante e a proteína é
específica, de forma que a proteína pode distinguir o ligante entre milhares de outras
moléculas parecidas. Exemplo: enzimas reconhecem especificamente o substrato.
No caso das enzimas, o sítio de ligação ao ligante é conhecido como sítio catalítico.
Enzimas frequentemente reconhecem um substrato de acordo com um modelo de
complementariedade espacial, chave-fechadura.
4
Fe2+ (Figura 4). O grupo Heme está ligado não covalentemente à proteína (veja PDB
1MBO).
Figura 4. Grupo Heme encontrado na mioglobina e na hemoglobina. O íon Fe2+ faz ligações de
coordenação com os quatro átomos de nitrogênio do anel. O Fe2+ ainda pode formar duas outras
ligações de coordenação que são formadas com as histidinas proximal e distal (veja PDB 1MBO).
[!"] !
𝐾𝑎 = ! [!]
= !! (1)
!
5
isoterma de ligacao
1
0.9
0.8
0.7
theta (% sitios ocupados
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 0.008 0.009 0.01
concentracao de ligante total (mol/l)
Em água, o grupo heme liga-se ao monóxido de carbono (CO) com 20 mil vezes
maior afinidade do que ao oxigênio. Por outro lado, quando o heme está ligado na
mioglobina a diferença de afinidade cai para 200 vezes. Detalhes estruturais, em
particular a interação com a histidina distal explicam porque a afinidade do grupo
heme pelo CO diminui.
1MBO:mioglobina DLKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRH
cadeia alfa QVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHCLLVTLAAHL
beta beta KVKAHGKKVLGAFSDGLAHLDNLKGTFATLSELHCDKLHVDPENFRLLGNVLVCVLAHHF
.:* ** .* *: : : . : *:: *. * :: :.::.. :: .* :
1MBO:mioglobina PGDFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKE
cadeia alfa PAEFTPAVHASLDKFLASVSTVLTSKYR-
beta beta GKEFTPPVQAAYQKVVAGVANALAHKYH-
:* .:.: :* : . . :: **:
Figura 6. Alinhamento de sequência da mioglobina (PDB 1MBO) com as cadeias
alfa e beta da hemoglobina (PDB 1HGA).
6
Apesar de diferenças na sequência de aminoácidos, as estruturas
tridimensionais da mioglobina (PDB 1MBO) e da hemoglobina (PDB 1HGA) são
muito parecidas. A hemoglobina possui quatro grupos heme, um em cada subunidade,
podendo transportar até 4 moléculas de O2.
A presença de quatro sítios de ligação e 4 subunidades afeta profundamente as
características da hemoglobina como molécula carreadora de oxigênio. A curva de
ligação do oxigênio na hemoglobina é sigmoide, indicando que oxigênio liga-se
cooperativamente à proteína (Figura 7). Em um processo cooperativo, a interação do
ligante com o primeiro sítio altera a afinidade do segundo sítio e assim por diante.
Como consequência da cooperatividade observada na curva de ligação a
oxigênio, a porcentagem de saturação da hemoglobina varia muito mais rapidamente
com a concentração de oxigênio do que no caso da mioglobina que não é cooperativa.
Por exemplo, no equilíbrio de ligação mostrado na Figura 7, nota-se que para ir de
20% a 80% de saturação seria necessário aumentar a concentração de ligante apenas
duas vezes, de 12.6 para 25.2 nM (Figura 7). Enquanto que no caso de um equilíbrio
não cooperativo como exemplificado na Figura 5, a concentração de ligante deveria
ser aumentada aproximadamente 10 vezes para aumentar a fração de sítios ocupados
de 20 a 80%. Portanto, uma proteína cooperativa é muito mais sensível a pequenas
alterações na concentração de ligante. Esta característica torna a hemoglobina capaz
de captar oxigênio nos pulmões, onde a pressão de O2 é maior, e liberar nos tecidos
onde a pressão de O2 é menor.
curva de Hill
4
3.5
3
v (numero de sitios ocupados
2.5
1.5
0.5
0
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04
concentracao de ligante (mol/l)
Figura 7. Curva de Hill para uma proteína com 4 sítios de ligação e Kd 0.1 µM. A
concentração total de proteína é 1 mM.
7
A ligação cooperativa de um ligante com oxigênio em uma consequência da
interação entre as subunidades. A estrutura quaternária da hemoglobina envolve um
grande número de interações fracas (eletrostática, ligação de hidrogênio e van der
Waals) entre as subunidades alfa e beta. Estas interações são cruciais para modular a
afinidade dos diferentes sítios de ligação pelo oxigênio. Como ?
Monod, Wyman e Changeaux propuseram um modelo para explicar a
cooperatividade da hemoglobina. Este modelo, chamado de “concerted model”,
propõe que a hemoglobina está em equilíbrio entre um estado tenso (“T”) e outro
relaxado (“R”):
8
between subunits.
6. Comparison of Fetal and Maternal Hemoglobins Studies of oxygen transport in pregnant mammals
show that the O2-saturation curves of fetal and maternal blood are markedly different when measured
under the same conditions. Fetal erythrocytes contain a structural variant of hemoglobin, HbF, consisting
of two a and two g subunits (a2g2), whereas maternal erythrocytes contain HbA (a2b2).
1.0
HbF
!BPG
v 0.5
HbA
!BPG
0
2 4 6 8 10
pO2 (kPa)
(a) Which hemoglobin has a higher affinity for oxygen under physiological conditions, HbA or HbF?
Explain.
5. Depois de passar alguns dias em altitudes muito elevadas,
(b) What is the physiological significance of the different a concentração de BPG
O2 affinities?
nos When
(c) eritrócitos
all theaumenta. Qual será
BPG is carefully o efeito
removed fromdo aumento
samples da and
of HbA concentração de BPGOna-saturation
HbF, the measured 2
curva de saturação da hemoglobina? Proponha uma explicação para porque
curves (and consequently the O2 affinities) are displaced to the left. However, HbA essanow has a
adaptação
greater seria benéfica
affinity para
for oxygen o funcionamento
than does HbF. When do BPGorganismo em altas
is reintroduced, the altitudes.
O2-saturation curves
Desenhe
returngráficos
to normal,para fundamentar
as shown a sua
in the graph. resposta.
What is the effect of BPG on the O2 affinity of hemoglobin?
How can the above information be used to explain the different O2 affinities of fetal and maternal
hemoglobin?
2. Cinética enzimática
9
formar uma nova dupla-fita de DNA. Ela é praticamente insensível a erros
incorporando menos de um nucleotídeo errado a cada mil. Dessa forma a DNA
polimerase é uma enzima altamente específica para a fita de DNA molde.
Equilíbrio
!"#$%&#'
∆𝐺 = ∆𝐺° + 𝑅𝑇𝑙𝑛 !"#$"%&"'
, (3)
sendo que
6. Reações químicas que não são espontâneas (∆G0 > 0) podem tornar-se espontâneas
ajustando-se as concentrações de reagentes e produtos. Este aspecto é determinante
em condições celulares. Por exemplo, considere a reação de isomerização de
dihidroxicetona-fosfato (DHAP) em gliceraldeido-3-fosfato (GAP) que ocorre durante
a via glicolítica. A razão entre as concentrações de DHAP e GAP no equilíbrio é
0.0475 a 298 K e pH 7 (R = 8315 JK-1mol-1). Pergunta-se:
10
i) A reação de isomerização de DHAP em GAP nas condições de equilíbrio é
espontânea?
ii) A reação será espontânea quando as concentrações de DHAP e GAP forem
200 µM e 3 µM, respectivamente?
Enzimas aceleram reações químicas mas não alteram o equilíbrio da reação, que
é dado apenas em função da diferença de energia livre entre produtos e
reagentes (Figura 8).
![!"#$]
𝑣= !"
= 𝑘[𝐷𝐻𝐴𝑃] (5)
onde a constante de velocidade “k” é expressa em s-1. Reações que são diretamente
proporcionais à concentração do reagente são chamadas de “reações de primeira
ordem”. Reações bimoleculares e cuja velocidade é proporcional à concentração de
dois reagentes são chamadas “reações de segunda ordem”, neste caso a constante
cinética é expressa em M-1s-1.
Catálise enzimática
11
G0 ET‡
Produtos
Reagentes
Coordenada de reação
Figura 8. Diagrama de energia livre em função da coordenada de reação para uma
reação na ausência (preto) e presença da enzima (vermelho). A enzima estabiliza a o
estado de transição, diminuindo a barreira de energia de ativação.
v = k[E]total . (6)
0.12
0.1
0.08
v0
0.06
controle
maior Vmax
0.04 menor KM
0.02
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
[Substrato] (M)
12
em condições de baixíssima concentração de enzima e um excesso de substrato.
Quando a enzima é misturada com um excesso de substrato, há um período inicial
durante o qual as concentrações de intermediários, de complexo enzima-substrato
(ES) aumentam até atingir valores estacionários. Uma vez que os intermediários
atingiram concentrações estacionarias, as velocidades de reação alteram-se muito
pouco com o tempo.
O complexo ES também pode ser formado a partir da reação reversa entre enzima e
produto. Mas como as medidas são realizadas nos instantes iniciais em que a
concentração de produto é muito pequena, a reação reversa pode ser ignorada. Esta
análise também assume que a decomposição de ES em enzima e produto livres é
rápida, e portanto pode ser ignorada. O esquema final é:
13
𝑉!"# = 𝑘! [𝐸]!"!#$ (8)
0.12
0.1
0.08
v0
0.06
controle
maior Vmax
0.04 menor KM
0.02
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
[Substrato] (M)
14
Em uma condição em que a concentração de substrato for muito menor do que o KM,
!!"#
𝑣! = !!
[𝐸]!"!#$ [𝑆]. (10)
É interessante imaginar o quão eficiente uma enzima pode ser. A resposta para essa
pergunta depende do limite da razão kcat/KM. Suponha que a decomposição do
complexo ES em enzima e produtos seja muito mais rápida do que a velocidade de
dissociação do complexo (k2 >> k-1), neste caso o limite é dado por k1, a constante de
velocidade de formação do complexo “ES”. O limite para k1 é a velocidade de difusão
das moléculas em solução, um número da ordem de 108 a 109 M-1s-1. Enzimas que
possuem valor kcat/KM nesta faixa são ditas “perfeitas”, pois atingiram a perfeição
catalítica (Tabela 6).
A análise dessa equação indica que o ponto em que o gráfico cruza o eixo das
ordenadas equivale a 1/Vmax e que o coeficiente angular é dado por KM/Vmax.
Inibição
Enzimas podem ser inativadas pelo aumento da temperatura, ou pela interação não
covalente com inibidores, pequenas moléculas que competem com o substrato pelo
sítio ativo. Estes inibidores são chamados de “competitivos”. No caso de um inibidor
competitivo, o mecanismo de Michaelis-Menten teria que ser alterado para:
15
E não é difícil derivar a equação de Michaelis-Menten levando em conta o equilíbrio
entre a enzima e o inibidor competitivo:
!!"# [!]
𝑣= !
. 12
!! !! ![!]
!!
Mecanismos
De onde vem o poder catalítico e a especificidade das enzimas? Nós já vimos que as
enzimas formam um complexo com o substrato através da formação de interações não
covalente, e que elas interagem melhor com o estado de transição. Como isto ocorre?
a)catálise covalente: em que o sítio ativo contem um núcleofilo poderoso que liga-se
covalentemente a parte do substrato durante a catálise
b)catálise ácido-base: uma molécula que não seja a água assume o papel de
doador/aceptor de prótons
c)catálise por aproximação: enzimas facilitam proximidade entre os substratos
trazendo-os para uma mesma superfície de interação
d)catálise por íon metálico: íons metálicos agem cataliticamente, por exemplo ao
facilitar a formação de nucleófilos.
Proteases
16
Embora esta reação seja termodinamicamente favorável, ela é extremamente lenta na
ausência de um catalisador. Para promover a clivagem da ligação peptídica a enzima
deve facilitar um ataque nucleofílico no grupo carbonila da ligação peptídica. A
quimotripsina emprega um nucleofico forte capaz de fazer este ataque nucleofilico.
Este nucleofilo é o grupo hidroxil da cadeia lateral de uma serina extraordinariamente
reativa. A reatividade extraordinária da Ser195 vem do fato de que o grupo OH da
cadeia lateral forma uma ligação de hidrogênio com a His57. O grupo NH da His57
forma, por sua vez, uma ligação de hidrogênio com a cadeia lateral do Asp102. Este
arranjo, conhecido como “tríade catalítica”, estabiliza uma carga negativa na cadeia
lateral da Ser195, que se torna extraordinariamente ácida (Figura 10).
Figura 10. Tríade catalítica da quimotripsina formada pela Ser195, His57 e Asp102. A
rede de ligações de hidrogênio torna o grupo OH da Ser195 extremamente reativo e
estabiliza um oxiânion.
17
intermediário covalente. Na próxima etapa uma molécula de água ocupa o lugar do
grupo amino do substrato. A His57 age como uma base e abstrai um próton da água,
enquanto o grupo hidroxila ataca a carbonila do intermediário que colapsa liberando a
segunda metade do peptídeo e regenerando a enzima.
Anidrase carbônica
As constantes k1 (pseudo-primeira ordem) e k-1 (primeira ordem) são 0.15 s-1 e 50 s-1,
respectivamente, na ausência de catalisador. Portanto o equilíbrio da reação é
deslocado no sentido da formação de CO2.
Anidrase carbônica acelera a reação de hidratação de CO2 para velocidades kcat = 106
s-1. A enzima possui um íon Zn2+ coordenado por três histidinas, o quarto ponto de
coordenação do Zn2+ é satisfeito por uma molécula de H2O.
18
grupo responsável por essa transição é uma molécula de água que está coordenada
pelo Zn2+. A interação com o Zn2+ faz com que o pKa da molécula de água diminuísse
de 15.7 para 7.0. Esta molécula de água é capaz de perder um próton facilmente
devido2/1/08
2608T_ch06sm_S63-S77 ao pKa1:11PM
mais baixo, formando
Page S-66 um radical hidroxila
ntt 102:WHQY028:Solutions que é capaz de realizar um
Manual:Ch-06:
ataque nucleofílico no CO2 gerando um íon bicarbonato.
Exercícios
S-66 1. Uma6
Chapter enzima
Enzymesque catalisa a reação de conversão entre duas moléculas “X” e “Y” é
isolada de duas espécies de bactérias. As enzimas possuem o mesmo Vmax, mas
possuem
(c) An enzyme valores
2608T_ch06sm_S63-S77 2/1/08 de
that KMPagediferentes.
catalyzes
7:34AM A enzima
the reaction Xy z Y isAManual:Ch-06:
S-75 ntt 102:WHQY028:Solutions possui from
isolated KM =two
2.0bacterial
µM, enquanto que enzymes
species. The a
enzima B possui
have the same VM K = 0.5 µM. A gráfico abaixo mostra a cinética de duas reações
max, but different Km values for the substrate X. Enzyme A has a Km of 2.0 !M,
efetuadas com aB mesma
while enzyme has a Km concentração
of 0.5 !M. The plot de below
enzima showse [X] = 1 µM.
the kinetics Qual carried
of reactions curva out
corresponde
with the asame
qualconcentration
enzima? of each enzyme and with [X] ! 1 !M. Which curve corresponds to
which enzyme? Chapter 6 Enzymes S-75
(b) Using the Living Graph for Equation 6–30 and the kinetic parameters in (a), create a plot in
which both a and a! are 1.0. Now observe how the plot changes when a " 2.0; when a! " 3.0;
and when a " 2.0 and a! " 3.0.
(c) Using the Living Graphs for Equation 6–30 and the Lineweaver-Burk equation in Box 6–1, create
Lineweaver-Burk (double-reciprocal) plots for all the cases in (a) and (b). When a " 2.0, does
the x intercept move to the right or to the left? If a " 2.0 and a! " 3.0, does the x intercept
move to the right or to the left?
Answer
[Y]
(a) When [S] increases from 0.2 to 0.4 mM, V0 increases by a factor of 1.96. When [S] " 10
mM, V0 " 50 mM s#1. When [S] increases from 100 to 200 mM, V0 increases by a factor of
1.048.
(b) When a " 2.0, the curve is shifted to the right as the Km is increased by a factor of 2.
When a! " 3.0, the asymptote of the curve (the Vmax) declines by a factor of 3. When
a " 2.0 and a! " 3.0, the curve briefly rises above the curve where both a and a! " 1.0,
due to a decline in Km. However, the asymptote is lower because Vmax declines by a
factor of 3.
(c) When a " 2.0, the x intercept moves
Timeto the right. When a " 2.0 and a! " 3.0, the x
intercept moves to the left.
Answer
2. O exame da we
Data Analysis
(a)23. Here
estrutura
Problem de uma enzima permite formular
want to find the value of [S] when V0 ! 0.25 V of an
hipóteses
. The
sobre a
Michaelis-Menten
the structuremax
contribuiçãoequation
de cada isaminoácidos para a estrutura e para a atividade da enzima. Uma
Exploring and Engineering Lactate Dehydrogenase Examining
sults in hypotheses
enzyme re-
about the relationship between different amino acids in the protein’s structure and
forma de testar essasfunction.
the protein’s hipóteses
One way toétestusar técnicasis todeuse DNA
these hypotheses recombinante
recombinant DNA technology to para gerar
max[S]/(K
generate mutant versions of the V enzyme Vand then examine" the[S])
structure and function of these altered
mutantes, e examinar os efeitos das 0 !mutações sobre
m a estrutura e atividade da enzima.
forms. The technology used to do this is described in Chapter 9.
A lactato desidrogenase
so One example
V0 ! Vmax
dehydrogenase,
of(LDH)
this kind
when [S]/(K é uma
of
m "enzima
analysis
published in 1989. Lactate
is the
[S]) work que or
of
! 0.25;Clarkecatalisa a redução
and colleagues on the enzyme delactate
dehydrogenase (LDH) catalyzes the reduction of pyruvate
piruvato com
NADH para with formar
NADH lactato.
to form lactateUm (seeesquema
Section 14.3). do sítio ativo
A schematic da enzima,
of the enzyme’s active site contendo
is shown below; piruvato
0.33Km ! 0.33(0.0050 M) ! 1.7 # 10$3 M
[S]the!center:
the pyruvate is in
e NADH ligados, está mostrado abaixo:
(b) The Michaelis-Menten equation can be rearranged to
Lactate dehydrogenase
102
V0/Vmax !Gln[S]/(Km " [S])
C
Substituting [S] ! %12% KmArg
109
into the
O equation
NH2 gives
Thr246
NH
H C C OH
V0 /Vmax
C ! 0.5 K /1.5K
+ m
3
m ! 0.33
HN NH H
CH 3
H H
Similarly, substituting [S] ! 2K gives OmC H
NH Pyruvate N (NADH)
His195 + C H
V0 /VHNmax ! O0.67
– O
H CH3
H H
And substituting [S]O!– O10Km gives
HN + NH H3C C CH2
C C Ile250
/V168
V0Asp max ! 0.91
NH
Arg171
(c) The upper curve corresponds to enzyme B ([X] is greater than the Km for this enzyme),
O mecanismo anddathereação é similar
lower curve ao mecanismo
corresponds to enzymedeA.outras
When thereduções por NADH.ofOsub-
initial concentration
strate isenvolve
estado de transição greater than Km, the
o grupo rate ofdo
carbonil thepiruvato
reaction fortemente
is less sensitive to the depletion of
polarizado:
substrate at early stages of the reaction and the rate remains approximately linear for a
longer time.
9. Applying the Michaelis-Menten Equation I A research group discovers a new version of happyase,
which they call happyase*, that catalyzes the chemical reaction 19
88z SAD
HAPPY y88
S-76 Chapter 6 Enzymes
The reaction mechanism is similar to many NADH reductions (Fig. 13–24); it is approximately the
reverse of steps 2 and 3 of Figure 14–7. The transition state involves a strongly polarized carbonyl
group of the pyruvate molecule as shown below:
CH3
A
!
OOC"
A
C
G G
O – O
Pergunta-se:
(a) A mutant form of LDH in which Arg109 is replaced with Gln shows only 5% of the pyruvate bind-
ing and 0.07% of the activity of wild-type enzyme. Provide a plausible explanation for the effects
i) Umofmutante da LDH no qual a Arg109 foi substituída por Gln mostra apenas 5 %
this mutation.
de
(b)ligação
A mutanta piruvato
form of LDH e 0.07 % da
in which atividade
Arg171 da with
is replaced enzima selvagem.
Lys shows Proponha
only 0.05% uma
of the wild-type
explicação
level ofpara os efeitos
substrate desta
binding. Why mutação
is this dramatic effect surprising?
171
ii)
(c)Você espera
In the questructure
crystal a substituição
of LDH, datheArg171 por uma
guanidinium grouplisina afete
of Arg a afinidade
and the carboxyl da group of pyru-
vate are aligned as shown
enzima pelo piruvato? Por quê? in a co-planar “forked” configuration. Based on this, provide a plausible
171
explanation for the dramatic effect of substituting Arg with Lys.
(d)
3. A mutant
Uma enzimaform of LDH
recém descoberta Ile250 is replaced
in whichcatalisa a reaçãowith Gln shows
descrita reduced binding of NADH. Pro-
abaixo.
vide a plausible explanation for this result.
Clarke and colleagues also set out to engineer a mutant version of LDH that would bind and re-
duce oxaloacetate rather than pyruvate. They made a single substitution, replacing Gln102 with Arg;
the resulting enzyme would reduce oxaloacetate to malate and would no longer reduce pyruvate to
Olactate.
valor They had therefore
do turnover converted
encontrado LDH
para to enzima
esta é 600 s-1. Quando [E]T = 20×10-9 M
malate dehydrogenase.
-1
e(e)
[T] Sketch
= 40 the
µM, a velocidade
active da reação
site of this mutant é voxaloacetate
LDH with 0 = 9.6 µMs . Calcule o KM para o
bound.
substrato.
(f) Provide a plausible explanation for why this mutant enzyme now “prefers” oxaloacetate instead
of pyruvate.
4.
(g)A The
hidrólise
authorsdewere
pirofosfato a ortofosfato
surprised that substitutingé auma
largerreação acoplada
amino acid importante
in the active para a
site allowed
deslocar o equilíbrio
larger substrate tode reações
bind. biossintéticas,
Provide por exemplo
a plausible explanation for thisa result.
síntese de DNA. Esta
reação de hidrólise é catalisada por uma pirofosfatase que possui massa de 120 kDa e
consisteAnswer
de seis subunidades idênticas. Para esta enzima, a unidade de atividade
(a)
enzimática éIndefinida
the wild-type
comoenzyme, the substrate
a quantidade is held innecessária
de enzima place by a hydrogen bond and an ion-
109 para hidrolisar 10
dipole interaction between the charged side chain of Arg and the polar carbonyl of
µmol de pirofosfato em 15 minutos a 37 0C. A enzima purificada possui Vmaxthe= polarized
pyruvate. During catalysis, the charged Arg109 side chain also stabilizes
2800
unidades por carbonyl
miligrama de enzima.
transition state. In the mutant, the binding is reduced to just a hydrogen bond,
substrate binding is weaker, and ionic stabilization of the transition state is lost, reducing
a) Quantos mols de substrato
catalytic activity. são hidrolisados por segundo por miligrama de enzima
quando a(b)
concentração
Because Lysdo andsubstrato for muito
Arg are roughly the maior do que
same size o Km?
and have a similar positive charge, they
probably have very similar properties. Furthermore, because pyruvate binds to Arg171 by
(presumably)
b) Quantos mols an ativos
de sítios ionic interaction,
existem em an Arg to Lys
1 mg demutation
enzima?would probably
Assuma quehave little
cada
effect on substrate binding.
subunidade possui um sítio ativo.
(c) The “forked” arrangement aligns two positively charged groups of Arg residues with the
negatively charged oxygens of pyruvate and facilitates two combined hydrogen-bond and
c) Qual é o turnover da enzima?
ion-dipole interactions. When Lys is present, only one such combined hydrogen-bond
and ion-dipole interaction is possible, thus reducing the strength of the interaction. The
5. Suponha que uma enzima
positioning mutanteis ligue-se
of the substrate com o substrato com uma afinidade
less precise.
100x maior
(d) Iledo que
250 a enzima
interacts selvagem.
hydrophobically Qual
with é oofefeito
the ring NADH.desta mutação
This type sobre iso not
of interaction
turnover (kcatpossible
) considerando-se que a side
with the hydrophilic interação
chain ofcom
Gln. o estado de transição não foi
afetada?
6. Para uma enzima que segue a equação de Michaelis-Menten, qual é o valor de Vmax
considerando-se que v0=1µM/min a 1/10 KM?
20
7. A penicilina é hidrolisada por uma enzima beta-lactamase que está presente em
algumas cepas de bactérias resistentes a antibióticos. A massa desta enzima é 29.6
kDa. A quantidade de enzima hidrolisada em 1 minuto em uma solução de 10 ml
contendo 10-9 gramas de beta-lactamase purificada foi medida em função da
concentração de penicilina (tabela abaixo). Assuma que a concentração de penicilina
não se altera apreciavelmente durante o ensaio.
5
0.01
4.5
4
v (nanomol/segundo)
0.008
3.5
1/v0 (s/mol)
3
0.006
2.5
0.004 2
0
1.5
0.002 1
0.5
0 0
−2 0 2 4 6 8 10
0 10 20 30 40 50
−1 5
[S]*1e6 (M) 1/[S] M x 10
21
Azul (sem inibidor): 𝑦 = 13𝑥 + 1.3×10!
Vermelho (com inibidor): 𝑦 = 40𝑥 + 1.3×10!
45
6
x 10
15
40
35
30
v (micromol/minuto)
10
1/v0 (s/mol)
25
20
0
15
5
10
0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 −2 −1.5 −1 −0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
[S]*1e6 (M) −1 5
1/[S] M x 10
3. Metabolismo
Fermentação alcoólica
22
∆𝐺° = −30.5 𝑘𝑗. 𝑚𝑜𝑙 !!
6
NH2
N C
C N Adenina
HC
C CH
N
N
O- O- O-
-O-P-O-P-O-P-O-CH
2 O
O O O
H H H
H Ribose
HO OH
AMP
ADP
ATP
Figura 11. Reação de hidrólise de ATP formando ADP e fosfato inorgânico (Pi). A
variação de energia livre nas condições padrão (ΔG0) está indicada. Esta reação possui
um ΔG ainda mais negativoTIPOS
ALGUNS nas condições celulares devido às concentrações fora do
DE ENZIMAS
equilíbrio de ADP e ATP (veja a equação 3, pág. 10)!! Estrutura dos compostos
fosforilados ATP, ADP e AMP.
Quinases: São enzimas que catalisam a transferência de um grupo fosfato de um
composto de alta energia (em geral do ATP) para um aceptor.
Isomerases: São enzimas que catalisam
O metabolismo celularreações
é voltadodepara
isomerização defundamentais:
dois aspectos função. i) produção
Mutases: São de ATP para fornecer
isomerases energia para
que catalisam os processos celulares
a transferência e ii) síntese
de grupos de de baixa
fosfatos
intermediários de biossíntese (ác. graxos,
energia de uma posição para a outra, dentro da mesma molécula.lipídeos, hormônios, aminoácidos,
nucleotídeos, etc). O metabolismo degradativo é chamado de catabolismo, enquanto
Desidrogenases: que oSão enzimas
metabolismo que catalisam
biosintético é conhecidoreações de óxido-redução,
como anabolismo. Organismos quepor
+
transferência deobtém energiado
hidrogênio livre a partir dapara
substrato luz do sol coenzima,
uma são chamados de fótotropicos,
geralmente NAD enquanto
ou FAD. que
Essas reações, na maioria dos casos são reversíveis.
Aldolases: São enzimas que cindem açúcares fosforilados, dando origem a
diidroxiacetona-fosfato e a outro açúcar, com 3 átomos de carbono a menos que o 23
substrato original.
Fosfatases: São enzimas que catalisam reações de hidrólise de ésteres de fosfato.
organismos que obtém energia livre através da oxidação de moléculas (exemplo
açúcares) são chamados de quimiotrópicos.
Células clivam e oxidam moléculas glicose para produzir energia na
forma de moléculas de ATP e intermediários para as reações de biossíntese. A
principal via para obtenção de ATP é o metabolismo de glicose que se inicia através
da quebra da glicose pela via glicolítica, na qual uma molécula de glicose é clivada
em duas moléculas de piruvato (ácido pirúvico) com a concomitante formação de
duas moléculas de ATP.
A descoberta da via glicolítica (ou glicólise) está intimamente relacionada ao
estudo da fermentação alcóolica promovida por leveduras. De fato, uma parte da
bioquímica tal qual conhecemos hoje originou-se a partir do estudo da fermentação
alcoólica durante o final do século XIX e a primeira metade do século XX. Nessa
época, sabia-se que leveduras eram capazes de fermentar açúcar para produzir etanol
(Figura 12), e percebeu-se que tanto o extrato de levedura como as células vivas
possuíam a mesma atividade. Uma fração do extrato de leveduras que era não
dializável e sensível à temperatura foi chamada de zymase, enquanto que outra fração
que era dializável e insensível à temperatura foi chamada de cozymase. Mais tarde
descobriu-se que zymase e cozymase eram, respectivamente, uma mistura de enzimas
e de co-fatores como NAD+, ATP, ADP e íons metálicos.
Pesquisas realizadas para compreender este fenômeno acabaram conduzindo à
descoberta da sequência de reações de envolvidas na quebra anaeróbica de glicose
(hexose; açúcar de 6 carbonos) em etanol e gás carbônico, e à identificação e
isolamento das enzimas que catalisam estas reações. Estes estudos, realizados
simultaneamente tanto em leveduras como em extratos de músculo, mostraram que a
glicólise é uma via comum a todos os organismos, de procariotos às nossas células
humanas.
A glicólise quebra duas moléculas de glicose (uma hexose) em duas moléculas
de piruvato (ácido pirúvico). O catabolismo anaeróbico do piruvato em células de
levedura leva à formação de etanol, enquanto que em células musculares leva à
formação de ácido lático (Figura 13). O ácido lático é formado no músculo quando a
quantidade de oxigênio disponível é insuficiente para promover o metabolismo
aeróbico (por exemplo, uma situação de exercício físico intenso). O ácido lático
formado no músculo pode ser convertido novamente em glicose nas células do fígado
pelo chamado “ciclo de Cori”.
A sequência de reações enzimáticas da via glicolítica tal como a conhecemos
hoje pode ser observada na Figura 14.
24
cally, yeasts convert it to ethanol; but muscles con-
vert it to lactate (Figure 3): ‘. . . a muscle resting in
nitrogen’, Meyerhof explains, ‘produces lactic acid
steadily; in oxygen no lactic acid accumulates’12
([157] p. 1415). Indeed, there have been many par-
allels and interconnexions in the research on the
hexose
two kinds of eukaryotic cell, those of yeasts and
those of muscles.13
C C C C C C
Notes on some of the most exceptional
investigators
C C C C C C
By 1940, the complete pathway of glycolysis
glucose to ethanol and carbon dioxide. triose triose
Figure 2. Path of carbon atoms in the conversion of
Each carbon atom had been elicited, largely by a few remarkable
of a glucose molecule is numbered to show its fate during biochemists, of whom five were of Jewish origin,
fermentation as was an astonishing number of other outstanding
[94,95,96,98], Dorothy Needham’s Machina Carnis [177], Fruton’s Proteins, Enzymes, Genes [80] and volume 31 of Comprehensive
Biochemistry by Florkin and Stotz [74].
25
8
HOCH2
O
HO
OH
OH
GLICÓLISE Glicose
OH
ATP ATP
ADP ADP
P -OCH2
O
OH Glicose 6-fosfato
HO OH
OH
P -O-CH2 O CH2OH
HO Frutose 6-fosfato
OH
HO
ATP
ATP
ADP
ADP
P -O-CH2 O CH2O- P
HO OH
Frutose 1,6 bisfosfato
HO
H2C-O- P HC=O
ADP ADP
ATP ATP
O=C-O-
HC-OH 3-Fosfoglicerato
H2C-O- P
COO-
HC-O- P
2-Fosfoglicerato
H2C-OH
H2O
COO-
C-O- P
Fosfoenolpiruvato
CH2
ADP
ADP
ATP
ATP
COO- COO-
HC-OH C=O
Lactato Piruvato
CH3 NAD+ NADH CH3
NAD+ NADH
26
Todas as reações ocorrem no citosol das células eucarióticas. A glicose não
atravessa a membrana celular, entra na célula com auxílio de uma proteína carreadora
específica. Imediatamente, é possível notar que: i) a glicólise envolve duas etapas de
fosforilação por ATP, formando ADP e fosfato inorgânico (Pi); ii) cada molécula de
glicose contendo 6 átomos de carbono é convertida em duas moléculas de ácido
pirúvico, mais oxidado; iii) o processo global envolve a formação de 4 moléculas de
ATP, ou seja, produção líquida de duas moléculas de ATP; iv) ocorre uma reação de
oxido-redução quando gliceraldeído-3-fosfato é convertido em 1,3-bifosfoglicerato,
os elétrons são transferidos para a coenzima NAD+ formando NADH.
Vamos analisar estas reações em mais detalhe.
27
quantidade de energia livre). A reação entre glicose e fosfato inorgânico (PO4-3)
formando glicose-6-fosfato consome uma grande quantidade de energia e não
ocorreria caso não fosse acoplada à reação de hidrólise de ATP:
28
Figura 17. Reação de fosforilação da frutose-6-fosfato catalisada pela enzima
fosfofrutoquinase 1 (PFK1) com o consumo de uma molécula de ATP. A variação de
energia livre envolvida é ΔG0 = -14.2 kJ.mol-1.
29
Figura 19. Reação de clivagem da frutose 1,6 bifosfato em dois compostos de 3
átomos de carbono, gliceraldeído 3-fosfato e dihidroxiacetona-fosfato. Essa reação é
catalisada pela enzima aldolase. A variação de energia livre envolvida é ΔG0 = +23.8
kJ.mol-1.
Apesar de que o ΔG0 da reação é positivo, nas condições celulares esta reação
também é praticamente reversível. Esta etapa conclui a conversão de uma molécula de
glicose em duas moléculas de gliceraldeído-3-fosfato, um composto de 3 átomos de
carbono e mais oxidado do que a glicose. Para tanto foi necessário a hidrólise de duas
moléculas de ATP formando ADP. As próximas etapas envolvem a oxidação de
gliceraldeído-3-fosfato em piruvato, um ácido carboxílico e portanto um composto
mais oxidado. A conversão de gliceraldeído-3-fosfato envolverá perda de elétrons
(oxidação) e a formação de duas moléculas de ATP (quatro moléculas no computo
geral).
30
chamado de co-fermento ou co-enzima. O papel do NAD como carreador de
hidrogênio foi sugerido em torno de 1920, mas a natureza química da coenzima
somente foi elucidada nos anos 30. NAD (Figura 21) é um dinucleotídeo de
nicotinamida e adenina. Ele funciona como um carreador de átomos de hidrogênio
em uma ampla série de reações de oxido-redução ao aceitar um íon hidreto (H-; um
próton e 2 elétrons). NAD e NADH são solúveis, e podem mover-se de uma enzima
para outra.
Reações de oxido-redução:
31
Figura 22. Reação de oxidação e adição de ortofosfato catalisada pela gliceraldeído-
3-fosfato desidrogenase.
Figura 23. Reação catalisada pela fosfoglicerato quinase. A variação de energia livre
dessa reação nas condições padrão é ΔG0 = -18.8 kcal.mol-1, no entanto nas condições
celulares a reação é reversível com ΔG = + 1.3 kcal.mol-1.
32
Figura 24. Reações de isomerização de 3-fosfoglicerato a 2-fosfoglicerato (ΔG0 =
+4.6 kJ.mol-1); de desidratação de 2-fosfoglicerato formando uma dupla ligação e o
composto fosfoenolpiruvato (ΔG0 = +1.7 kJ.mol-1); e de transferência de um grupo
fosforil do fosfoenolpiruvato ao ADP formando ATP e piruvato (ΔG0 = -31.4 kJ.mol-
1
).
Esta reação envolve uma variação de energia livre da ordem de ΔG0 = -73.1
-1
kJ.mol , e resulta na formação de duas moléculas de ATP e na redução de duas
moléculas de NAD+. Esse processo poderia seguir indefinidamente não fosse o fato de
que a disponibilidade de NAD+ na célula é finita. Conforme já discutido acima, em
condições anaeróbicas, o piruvato é reduzido a lactato (células musculares) ou a
etanol (levedura) regenerando NAD+. Esse processo é conhecido como fermentação
(Figura 25):
33
Figura 25. Reações enzimáticas que ocorrem nas células de levedura ou do músculo
durante a fermentação e levam à regeneração de NAD+.
34
Glicólise exercícios
35
Ciclo de Krebs
36
Figura 27. Reação de descarboxilação oxidativa de piruvato formando NADH e um
radical acetil ativado através da ligação com a Coenzima A (acima). Estrutura
molecular da Coenzima A (abaixo). Esta reação é irreversível como indica a
descarboxilação.
O complexo piruvato desidrogenase é formado por três enzimas que
promovem a descarboxilação e oxidação do piruvato formando um grupo acetil, e
promovem ainda a reação de condensação entre o grupo acetil e o grupo sulfidril da
Coenzima-A gerando, através de uma ligação tio-éster, Acetil-CoA (Figura 28). Uma
das co-enzimas importantes nesse processo chama-se FAD, um grupo prostético
associado fortemente a uma das enzimas do complexo piruvato desidrogenase e que
aceita um um par de elétrons (dois prótons e dois elétrons) assumindo a forma
reduzida, FADH2 (Figura 29). As enzimas associadas a um grupo FAD são chamada
de flavoproteínas. Ao contrário do NAD, o FAD associa-se fortemente à enzima e é
incapaz de difundir-se livremente em solução.
37
Figura 29. Estrutura do grupo prostético FAD na forma oxidada (esquerda) e na
forma reduzida, FADH2 (direita).
38
Figura 30. As três primeiras reações do ciclo de Krebs. A entrada de Acetil-CoA no
ciclo da-se pela condensação com oxaloacetato (um alfa-ceto ácido) formando citrato.
Em seguida o citrato sofre uma isomerização formando isocitrato, que é oxidado e
descarboxilado gerando alfa-cetoglutarato.
39
Succinato é um composto de 4 átomos de carbono que deve ser oxidado a
oxaloacetato. A forma para fazer isso é primeiro oxidar succinato a fumarato
gerando FADH2, seguido de uma reação de hidratação que forma malato, este por sua
vez pode ser oxidado a oxaloacetato completando o ciclo de Krebs e gerando a
terceira molécula de NADH (Figura 32).
A enzima succinato desidrogenase distingui-se das outras enzimas do ciclo de
Krebs pois utiliza FAD como grupo aceptor de elétrons, além disso ela esta embebida
na membrana mitocondrial interna onde ocorrem as reações da cadeia de transporte de
elétrons. Dessa forma, a succinato desidrogenase faz o link entre o ciclo de Krebs e a
fosforilação oxidativa responsável pela formação de ATP.
Figura 32. Motivo de três reações necessárias para oxidar succinato a oxaloacetato.
Este motivo consiste de uma reação de oxidação catalisada pela enzima succinato
desidrogenase, seguido de uma reação de hidratação catalisada pela enzima fumarase
e outra oxidação que finalmente converte malato em oxaloacetato. Duas coenzimas
reduzidas são produzidas neste processo, FADH2 e NADH.
Olhando estas reações de forma global, vemos que elas perfazem um ciclo em
que uma unidade de dois carbonos entra (Acetil-CoA) e sai completamente oxidada
na forma de duas moléculas de CO2. Note que os átomos de carbono da Acetil-CoA
somente irão sair na forma de CO2 após a quarta volta no ciclo. A cada volta, são
formadas coenzimas reduzidas NADH e FADH2 (Figura 33). Seguramente, o ciclo
pode ser alimentado por unidades de Acetil-CoA provenientes da quebra de glicose
pela via glicolítica, ou provenientes de outras vias metabólicas como a oxidação de
ácidos graxos e a degradação de certos aminoácidos. Subprodutos do metabolismo
também podem alimentar o ciclo de Krebs, como succinato ou oxaloacetato
provenientes do metabolismo de aminoácidos, assim como o ciclo de Krebs também
fornecerá esqueletos de carbono para outras reações biossintéticas.
40
C2
acetil-CoA
condensação
C4 C6
citrato isomerização
oxaloacetato
NADH
C6
oxidação isocitrato
descarboxilação CO2
C4 Ciclo de Krebs oxidativa
NADH
Malato
C5
α-cetoglutarato
hidratação
descarboxilação
oxidativa CO2
H 2O C4 NADH
C4
Fumarato oxidação hidrólise Succinil-CoA
C4
FADH2 Succinato
GTP
Figura 33. Visão global do ciclo de Krebs. O tipo de cada reação está indicado em
vermelho. Os compostos que depois serão úteis para a síntese de ATP estão indicados
em azul.
41
água. Um gradiente de prótons através da membrana interna da mitocôndria é gerado
à medida em que os elétrons são transportados pela cadeia de transporte de elétrons.
Esse gradiente será utilizado para promover a síntese de ATP.
42
Fosforilação oxidativa
espaço inter-membrana
H+ H+ H+ H+
I II e- III IV
FAD
NADH FADH2 O2 H 2O
NAD+ H+
matriz
ADP + Pi ATP
Figura 34. Elétrons provenientes das coenzimas reduzidas NADH e FADH2
(provenientes do ciclo de Krebs) são transferidos para as proteínas carreadoras da
cadeia de transporte de elétrons através de uma série de reações de oxido-redução.
Estes elétrons são utilizados para reduzir O2 formando H2O. O fluxo de elétrons
43
através dos carreadores é acoplado ao transporte de prótons através da membrana,
gerando uma força próton-motriz que é suficiente para promover a síntese de ATP
pela enzima ATP-sintase.
ΔG0 = -nFΔE0
Claramente, como o oxigênio possui maior potencial de redução ele irá oxidar o
NADH. Dessa forma, o NADH será doador e o O2 acceptor de elétrons e a reação
global deve ser escrita como:
44
interna da mitocôndria (Figura 34). A fim de calcular qual é a variação de energia
livre associada ao transporte de prótons para fora da matriz podemos fazer:
[!]!"#$
∆𝐺 = 𝑅𝑇𝑙𝑛 [!] + 𝑛𝐹∆𝐸 (4)
!"#$%&
F0
Axle
Stator
F1
doi:10.2210/rcsb_pdb/mom_2005_12
45
Exercícios sobre fosforilação oxidativa
a. Verificar se é possível:
a1. oxidação de NADH sem síntese de ATP.
a2. oxidação de NADH sem consumo de oxigênio.
a3. consumo de oxigênio sem síntese de ATP.
a4. consumo de oxigênio sem formação de gradiente de H+.
a5. consumo de oxigênio sem oxidação de NADH.
46