COM DETECTAR LA SÍNDROME DE L’X FRÀGIL?

LA DETECTEM A DOS MEMBRE D’UNA FAMÍLIA VOLUNTÁRIA

Paula Boqué, Carlos Calvo, Jordi Diéguez, Sandra Martín i Paula Monzón.

Abstract: Després d’una exhaustiva investigació per a la demostració de l’existència d’una malaltia monogènica com
és el síndrome de l’X fràgil en una família de 5 membres, vàrem concloure a partir de diversos mètodes i tècniques de
laboratori des de l’extracció del ADN fins la demostració final de resultats on es van apreciar els membres de la
família que sí estaven afectats per la malaltia i descartar en els que no hi apareixia el gen FMR1 mutat.

Keywords: gen FRM1, síndrome X fràgil, repetició triplets CGG, ADN, malaltia monogènica

Introducció: La síndrome X fràgil és una malaltia monogènica també coneguda com a Síndrome de Martin-Bell, es
causada per una mutació al gen FMR-1 del cromosoma X concretament, al braç llarg del cromosoma.

Aquest gen es caracteritza per la repetició dels triplets CGG. En condicions normals, els triplets es repeteixen de 6 a
54 cops, mentre que en persones afectades es repeteixen més de 200 cops provocant així que el gen es desactiva i
no es produeixi la proteïna corresponent.

Els individus que presenten de 55 a 200 repeticions del segment CGG es diu que tenen una premutació del gen
FMR-1. Per tant, els individus premutats no expressen una mutació completa, és a dir, tenen un menor grau de
discapacitat mental i conseqüentment, expressen parcialment els seus símptomes.
D’altra banda els individus els quals superen les 200 repeticions del triplet CGG, expressen completament la mutació,
és a dir, tenen una completa discapacitat mental i en conseqüència manifesten absolutament els símptomes. (Monzó
C., et al 2017)

Principalment, és una patologia associada al cromosoma X que poden patir tant homes com dones; en el sexe
masculí si ha sigut transmès es veurà directament afectat, en canvi, en les dones al tenir dos cromosomes X
necessita que els seus dos progenitors en siguin portadors per poder-se veure afectada.

A continuació es veuran els diferents i complexos processos realitzats al llarg de la investigació per a la determinació
del síndrome X fràgil les mostres de sang de 5 membres d’una família voluntària la qual volia descobrir si en el seu
ADN podia existir aquesta malaltia monogènica. Així mateix, en cas de trobar una també ens hem enfocat en l’origen
patern de la malaltia, és a dir, si la malaltia era transmesa pel pare o per la mare.

L’estudi d’aquesta malaltia va fer possible optimitzar el temps i material a través del protocol que es va seguir. Fins i
tot, va proporcionar una obtenció d’ADN amb una qualitat elevada i absència de residus.

Mètodes:
Extracció:
Es van realitzar 5 extraccions de sang perifèrica de tota la família, les quals es van dipositar en un tub d’assaig i
posteriorment es va afegir la solució de lisi d’eritròcits per eliminar les plaquetes i el trencament de la membrana dels
hematies a la dissolució i la seva posterior alliberació de l’hemoglobina en el sobrenedant, la qual causa
interferències a les lectures. Darrerament es van afegir solucions de lisi cel·lular per al trencament de la membrana
dels leucòcits i la seva consegüent alliberació del ADN.
Ja obtingut el ADN en un tub d’assaig es tenia que assegurar de que es trobava sense impureses perquè es pogués
tractar de manera adequada i poder continuar amb el procés sense resultats erronis.

Purificació:
Una vegada els àcids nucleics es van extreure de les 5 mostres, es va passar a realitzar la purificació de l’ADN la
qual implica la separació de l’ADN de proteïnes i lípids mitjançant solvents orgànics i cicles de centrifugació.

En primer lloc, es va afegir la barreja de Fenol:cloroform:alcohol isoamílic (25:24:1) aconseguint dissoldre les
proteïnes i els lípids. Aquests van precipitar creant la fase orgànica i alliberant l’ADN a la fase aquosa gràcies a un
cicle de centrifuga.

En segon lloc, es va afegir el cloroform a la fase aquosa per tal de netejar l’ADN i es va tornar a centrifugar creant de
nou una fase orgànica i una fase aquosa.
A través de la fase aquosa es va determinar el volum de cada tub i es va afegir el doble del volum mesurat
d’isopropanol; de nou els tubs van ser centrifugats fent precipitar l’ADN en forma de medusa al pellet i sobrenedant
amb altres molècules.

Un cop es va extreure el sobrenedant va incorporar-se als tubs etanol analític i van ser centrifugats per tal de rentar
una altra vegada el pellet.
Finalment, l’ADN de cada tub va ser resuspès agregant aigua destil·lada estèril.

Tots els eppendorfs amb l’ADN mostraven un color clar sense restes d’hemoglobina i altres molècules i per tant, es
va poder continuar amb el protocol establert. No obstant, en cas d’haver trobat restes als eppendorfs s’hauria d’haver
tornat a realitzar la purificació per poder treballar amb resultats confiables

Espectrofotòmetre:
Després de tenir purificades les mostres del ADN es van determinar les seves concentracions en la solució i la puresa
real a partir de l’absorbància en diferents unitats d’ona de l’espectrofotòmetre (230 nm, 260 nm, 280 nm i 320 nm).

Amb les dades obtingudes es van restar les absorbàncies de 320 nm de les altres absorbàncies corresponents a
cada mostra per eliminar la terbolesa de la solució en la fórmula. Es van fer els quocients corresponents de cada
mostra (QUO:260/280) i (QUO:260/230) per a descartar qualsevols contaminació de carbohidrats, proteïnes, lípids,
etc. Per altre banda també es van determinar les seves quantitats de ADN en la solució donat que per cada unitat
d’absorbància en 260 nm equival a 50 ng/ul d’ADN.

Els resultats donats en la prova d’espectrofotometria donaven peu a seguir endavant en la prova de PCR ja que
aquests donaven tots un grau de puresa adequat i per tant eren perfectament idonis per seguir amb la següent prova
sense cap tipus d’error.

PCR:
A partir de la PCR es va amplificar el gen FMR1 i es va poder observar l’absència o presència del gen, per tant també
de la malaltia genètica.
Abans de realitzar la PCR es van dissenyar els primers per amplificar la seqüencia del gen FMR1 de totes les
mostres dels membres de la família. Al cercador PubMed seleccionarem l’opció “Gene” i introduirem FMR1,
seleccionarem el gen d’humà amb el codi de referència ID: 1756. A partir de la pàgina Ensembl es va observar en la
seqüència del gen dins del genoma humà. A continuació es va entrar a Primer3Plus i a partir de la seqüència que es
va obtenir i amb les regions flanquejants es va obtenir el primer.

Figura 1. Seqüenciació del gen FMR1 del Figura 2. Creació de primer. En blau tenim el primer
genoma humà. Forward. En groc tenim el primer Reverse.

A partir de la informació del primer es va enviar a l’empresa Invitrons per que els sintetitzessin i es van encarregar de
manera líquida.
Tenint ja els primers es va preparar la màster mix i es va introduir al termociclador per escalfar i refredar els tubs
controlant la temperatura. El termociclador es va configurar de la següent manera:
 A continuació es van extreure les mostres amplificades del termociclador.
Per verificar que la PCR es va realitzar correctament es va realitzar una electroforesi en gel, aquesta consisteix en
introduir les mostres d’ADN als pous en un extrem del gel i aplicar corrent elèctrica per fer que les mostes corrin a
través del gel segons la seva mida, fent així que els fragments d’ADN quedin separats. Quan el gel es tenyeix amb un
pigment que s’uneix a l’ADN, els fragments d’ADN poden veure’s com bandes, les quals representen fragments
d’ADN de la mateixa mida, indicant així les còpies del fragment FMR1. En un dels pous es va introduir un marcador
amb fragments d’ADN de longituds conegudes que va servir de referència per poder comparar amb l’ADN de la
família.

Seqüenciació:
A partir de la PCR es va realitzar una seqüenciació de l’ADN que va ajudar a trobar el gen alterat.
Quan es va aconseguir l’ADN dels 5 pacients es va introduir el fragment FMR1 de cada ADN a la seqüenciadora,
aquest procediment tracta de realitzar moltes còpies d’aquest fragment, posteriorment es va afegir àcids fluorescents
i va començar el primer cicle, es va incorporar la primera base fluorescent i es van realitzar moltes còpies de cada
grup. Quan es va observar a un punt fluorescent molt intens es va captar la imatge i es va procedir a l’extracció de la
fluorescència de la primera base. Es va repetir aquest cicle fins a llegir tot el fragment. Per últim des de l’ordinador es
van unir aquests fragments tal i com estava la informació original i es va traduir en text original.

Resultats: A l’hora de obtenir els resultats de les proves anteriorment esmentades es van comparar amb altres
articles (Saúl Lindo-Samanamud, et.al 2013) on a part de la informació dels procediments, es buscava una tècnica
d’amplificació de seqüència de les bases per PCR.

-Resultats obtinguts en el espectrofotòmetre:

PARE MARE FILLA 1 FILLA 2 FILL 3

230 nm 0,217 0,221 0,215 0,223 0,219

260 nm 0,420 0,416 0,423 0,418 0,414

280 nm 0,226 0,230 0,224 0,221 0,229

320 nm 0,016 0,02 0,022 0,024 0,026

-Resultats de la quantitat d’ADN segons les absorbàncies:

PARE MARE FILLA 1 FILLA 2 FILL 3

Quantitat 0,42*50 ng 0,416*50 ng 0,423*50 ng 0,418*50 ng 0,414*50 ng

PARE: 21 ng d’ADN
MARE: 20.8 ng d’ADN
FILLA 1: 21,15 ng d’ADN
FILLA 2: 20,9 ng d’ADN
FILLA 3: 20,7 ng d’ADN
-Resultats obtinguts en la PCR: Figura 3.
A l’esquerra es mostra la longitud dels fragments de les mostres.
Carril Marker indica els valors de referència amb els que
comparar les mostres estudiades
1. Mostra de dona sana (filla)
2. Mostra d’home sà (pare)
3. Mostra de dona portadora (mare)
4. Mostra d’home afectat (fill)
5. Mostra de dona sana (filla)
A la dreta indica les replicacions del triplet CGG. 50 replicacions
comporta a un individu sà, 50-199 indica un individu premutat i
>200 indica un individu afectat

-Resultats de la seqüenciació:

PARE MARE FILLA 1 FILLA 2 FILL 3

Nombre de triplets 24 257 36 43 274

base: repeticions repeticions repeticions repeticions repeticions

Quan hi ha un pare afectat i una mare no portadora la seva descendència és 50% filles portadores no afectades i 50
% fills no afectats.

D’altra banda quan el pare no és afectat i la mare portadora la seva descendència és 25% filles no portadores i 25 %
filles portadores. Els fills d’altra banda seran 25% no afectats i 25% afectats.

Per tant, les dones portadores tenen 50% de probabilitats de transmetre el gen afectat amb una descendència que
pot oscil·lar entre fills o filles sans, portadors o afectats. En el cas dels homes, hi ha un 100% de probabilitats de que
les filles siguin portadores ja que transmet el seu cromosoma X el qual està afectat. En el cas dels fills no es
transmetria el gen ja que es transmet el cromosoma Y el qual no està alterat.

Discussió:
L’objectiu de la realització d’aquestes proves era obtenir resultats per donar resposta a la pregunta de quins membres
de la família patien la malaltia de la síndrome de l’X fràgil.

A partir del espectrofotòmetre es van concloure que totes les mostres estaven en un estat adequat de purificació tant
de proteïnes, com lípids, sals, carbohidrats etc. Seguidament de descobrir la quantitat d’ADN en totes les mostres de
cada familiar.

A partir dels resultats que es van obtenir en l’electroforesi de la PCR observem que en el pare i les dues filles la
banda que determina la mutació i la premutació no es manifesta mentre que en la mare es manifesta en la
premutació i en el fill en la mutació complerta.

Als resultats de la seqüenciació vam observar que al pare i a les dos filles el nombre de repeticions dels triplets bases
es d’entre 6 i 54 cops, a diferència de la mare i el fill que superen les 200 repeticions.

Conclusió:
A partir de les proves realitzades vam observar que en la família hi havia un individu portador i un d’afectat.
L’individu portador era la mare, la qual contenia el gen en un dels seus cromosomes X, per tant al no tenir els dos
cromosomes afectats no podia observar-se cap afectació. L’individu afectat era el tercer fill, el qual amb el gen
transmès per part del cromosoma X de la mare havia adquirit el gen que provoca la malaltia i per tant sí presentava
una afectació.
D’altra banda, com el pare no contenia la mutació era sà, de mateixa manera que les seves dues filles.
Figura 4. Arbre genealògic de la família estudiada.
La primera generació està formada per l’individu 1 que simbolitza la mare i l’individu 2 és el pare. L’individu 1 de la
primera generació és el portador del gen, mentre que l’individu 2 de la primera generació és sà.
La segona generació està formada per l’individu 1 que és una filla, l’individu 2 és la seva germana i l’individu 3 és el
germà. Els individus 1 i 2 de la segona generació són sans, en canvi, l’individu 3 es troba afectat.

Bibliografia:
https://revistageneticamedica.com/wp-content/uploads/2017/05/GMG1-23-27-web.pdf (Raquel Rodríguez López,
Laboratorio de genética molecular, consulta:18/03/2019 )

https://www.cdc.gov/ncbddd/fxs/facts.html (Center for Disease Control and prevention, consulta:18/03/2019 )

https://www.imegen.es/informacion-al-paciente/informacion-genetica-enfermedades-hereditarias/enfermedades-
geneticas hereditarias/sindrome-x-fragil/ (Instituto de Medicina Genómica. S.L. consulta:18/03/2019)

http://147.96.70.122/Web/TFG/TFG/Memoria/LARA%20GARCIA%20LORENTE.pdf (Lara García Lorente, consulta:

18/03/2019)

Referencies:
http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1018-130X2013000400002 (Saúl Lindo-Samanamud,
Mario Cornejo-Olivas, Olimpio Ortega, Victoria Marca, Keren Espinoza-Huertas, Pilar Mazzetti, 19/09/2013)

https://revistageneticamedica.com/wp-content/uploads/2017/05/GMG1-23-27-web.pdf (Raquel Rodríguez López,

Laboratorio de genética molecular, 2017 )

Correspondència:
Institut Jesuïtes del Clot
Carrer de València 680
08027 Barcelona, (España)
Correu electrònic: loscorrosivos2018@gmail.com
Tel: 93 352 50 52