Coloración

Hematoxilina-
Eosina
INTEGRANTES
CORONADO CUSI STEFANIA
FABIAN AMBROSIO YELSIN
DAVILA DAVILA JORDAN
EVANGELISTA REQUEJO CLAUDIA
FRANCIA REYES YOLANDA
GONZALES BARRON ROCIO
MATERIALES
 LAMINA HISTOLOGICA EN BLANCO
 BATERIA DE COLORACION H-E
 BALSAMO DE CANADA
 LAMINILLA CUBREOBJETOS
 CAJA PORTALAMINA
 LAPIZ CON BORRADOR
 GUANTES QUIRURJICOS
 PAPEL HIGIENICO
 CRONOMETRO
 CAMPO DE TRABAJO
 En la batería de coloración H-E se pudo
observar :
• Se puede observar tres baterías la primera la
cual estaba conformada por
LA SEGUNDA BATERIA ESTA CONFORMADA
POR:

HEMATOXILINA

A. CARBONATADA
 EOSINA E

A. ACIDO A
La tercera batería esta conformada
por:

ALCOHOL 96 %

A. ABSOLUTO 2
A. ABSOLUTO 3

XILOL 1
Introducir las láminas portaobjetos en el xilol 1 durante 10 minutos
Introducir las láminas portaobjetos en el xilol 2 durante 10 minutos
Realizar 10 inmersiones en alcohol absoluto 1
Realizar 10 inmersiones en alcohol absoluto 2
Realizar 10 inmersiones en alcohol absoluto 3
 AGUA DE CAÑO

Lavar con agua corriente ( de caño)

 COLORACIÓN

Procedimiento en práctica
En este primer paso, procedemos a colorear como
hematoxilina de Harris durante un tiempo de 15
minutos. Esta coloración va actuar a nivel nuclear.
 Procedemos al lavado en agua
corriente.

En la imagen observamos como

se torna de un color entre
morado y rosado aunque aún no
muy notorio.
Como se visualiza en la imagen
procedemos a introducir las muestras en
agua carbonatada, nos aseguramos de
que estén totalmente sumergidas, luego
tomamos un tiempo de 3 minutos. Esta
tiene la propiedad de intensificar el color
( auxocroma).
Procedemos a lavar una sola vez, a
diferencia de la anterior ( 3 veces) , notamos
que la coloración es más notoria, gracias a la
propiedad ya mencionada.
Por último procedemos a sumergirlo
completamente en eosina durante un tiempo de 3
minutos, la cual actúa como colorante
citoplasmático de contraste o de fondo.
 Finalizando lavamos en agua
corriente tres veces hasta lograr
quitar el colorante sobrante.

Podemos observar ya
la muestra un poco
más notoria, luego de
ser introducida en las
tres sustancias ya
mencionadas.
 DESHIDRATACIÓN
Hacer 10 inmersiones con las laminas de porta objetos en el
alcohol al 96%
 DESHIDRATACIÓN
Observamos que el colorante le falta intensificar la coloración y exceso
 DIAFANIZACIÓN
Introducir las laminas porta objeto en el XIOL 1 durante 5 minutos
 DIAFANIZACIÓN
Observamos que las estructuras están definidas y coloreas , el
exceso del colorante esta desaparecido.
 DIAFANIZACIÓN
 Dejar secar para eliminar el exceso de xilol
 Montaje:
• Montar con bálsamo de Canadá:
• Luego con un lápiz que tenga borrador,
presionamos sobre el cubreobjetos de
adentro hacia afuera .
 Secar:
• Dejar la lámina histológica por 24 horas
La tinción hematoxilina y eosina es el método mas popular de
tinción utilizado en histología y medicina diagnostica.

El método supone la aplicación de la tinción de hematoxilina,

que por ser catiónica o básica, tiñe estructuras ácidas (basófilas)
en tonos azul y púrpura,como por ejemplo los núcleos
celulares; y el uso de eosina que tiñe componentes básicos
(acidófilos) en tonos de color rosa, gracias a su naturaleza
aniónica o ácida, como el citoplasma.
La Eosina es un colorante ácido (predomina densidad de carga negativa), por lo cual
se asocia y colorea a estructuras catiónicas del citoplasma y matriz extracelular, tales
como: filamentos citoplasmáticos (como los de células musculares); membranas
intracelulares; y fibras extracelulares (por sus aminoácidos básicos ionizados).

La Hematoxilina se asocia con mordientes para actuar como un colorante básico, por
lo cual se asocia y colorea estructuras aniónicas (que posean fosfatos, sulfatos y/o
carboxilos ionizados):
•Heterocromatina y nucléolos
•RNA ribosomal
•Matriz extracelular (por los sulfato de los GAG)
RESULTADOS
Núcleo celular: Azul
Citoplasma: Rosa
Musculatura: Rojo , rosa o fucsia
Glóbulos rojos: Rojo, anaranjado
Fibrina: Rosa

Sangre: células sanguíneas

Especie: humano (Homo sapiens; mamíferos)
Técnica: Hematoxilina-eosina en frotis sanguíneo.
La Hematoxilina, es un compuesto que se obtiene de la planta leguminosa
Haematoxylum campechianum L., conocida también con el nombre de
palo de Campeche. Es un producto natural que al ser oxidado constituye
una substancia de color morado oscuro denominada hemateína.
Tal como se obtiene de la planta e incluso luego de sufrir el proceso de
oxidación, su capacidad de tinción es muy limitada. Por lo tanto, debe
combinarse con iones metálicos, especialmente las sales de hierro (III) o
aluminio (II), que actúan como mordientes.
Si bien la hematoxilina es una sal neutra, suele ser denominada como un
colorante básico, ya que el componente cromógeno reside en el complejo
catiónico (básico) de la misma. Es de notar que la tinción histológica por
hematoxilina no indica tanto la constitución química de los componentes
celulares, sino la densidad de cargas eléctricas negativas de los mismos.
La eosina Y (C20H8Br4O5, tetrabromofluoresceína, CI 45380, CI 45386),
comúnmente conocida como eosina amarilla.

La eosina B (C20H8Br2N2O9, dibromodinitrofluoresceína, CI 45400),

también conocida como eritrosina B azulada.
Estructura molecular del xilol
 CARACTERÍSTICAS DE LA HEMATOXILINA
De acuerdo al procedimiento de tinción puede ser progresiva (intensifica la coloración) y regresiva (eliminación del exceso)

 Se obtiene de forma natural (plantas)

 Para ser un colorante maduro pasa por un proceso de oxidación

 Utilización para coloración de muestras

 Utilización para la industria textil

 Presenta propiedades semejantes a las anilinas básicas

 Es un colorante directo

 Los agentes oxidantes naturales: el aire (varios meses de exposición)

 Los agentes artificiales puede ser: oxido de mercurio, permanganato de potasio, bicromato de potasio, etc.

 En las tinciones histológicas tiñe los componentes ácidos dando un color violeta
 CARACTERISTICAS DE LA EOSINA
El nombre “Eosina” proviene de aurora (naranja).
Presenta auto fluorescencia espontánea
Se la emplea tanto en soluciones acuosas como alcohólicas.
Las eosinas son xantenos ácidos ó colorantes de ftaleína.
Las más comunes son:
 Eosina amarilla, es la más usada.
 Eosina B (azul).
 Floxina.
 Eritrocina (está halogenada con iodo en lugar de bromo).
 Zafranina.
 Rosa de Bengala.

Es un colorante artificial (se trata de derivados hidroxixanténicos

halogenados con tres grupos arilo).
 CARACTERISTICAS DE LA EOSINA
 Su punto de solubilidad es del 44 % en agua y del 7 % en alcohol.
Se puede usar un acentuador del color (por ejem. ácido acético al
0.2 % ó ácido tánico).
Da una buena coloración citoplasmática ó de fondo.

Para colorear se emplea generalmente una batería de coloración.

 CARACTERISTICAS DEL XILOL o XILENO
Químicamente denominado dimetilbenceno, es un
anillo de benceno con dos grupos metilo unidos a él,
presentando tres isoformas, en las que la posición de los
dos grupos metilo varia en el anillo de benceno.
El Xilol solo es soluble en alcohol al 100%

Se utiliza también como solvente y diluyente.

El alcohol y el xileno disuelven los lípidos de la célula y

por lo cual al extraerse también se extraen las grasas y
los lípidos de la célula.

El líquido diafanizador de uso más frecuente es el xilol

 CARACTERISTICAS DEL XILOL o XILENO
La diafanización de los tejidos deshidratados se debe a que
estas sustancias poseen un alto índice de refracción y al
interactuar con los tejidos los vuelven transparentes.
Es un excelente agente aclarante pero tiende a hacer que los
tejidos sean excesivamente duros y quebradizos y esto nunca
deben dejarse en este líquido más de 3 horas.
Se llama aclaración, ya que el tejido se torna transparente o
claro en el xileno, esto se debe a que cambia su índice de
refracción.
El xileno es inadecuado para el encéfalo y los ganglios
linfáticos, pues los hace demasiado quebradizos, para estos
órganos es mejor utilizar cloroformo.
Para el procesamiento de muestras, se sumergieron los tejidos
en soluciones de xilol I y II durante 15 minutos cada una.
 CARACTERISTICAS DEL METANOL

El metanol (estructura química CH3OH), es un líquido incoloro,

volátil, inflamable, con olor leve a alcohol en estado puro.
Se le emplea con frecuencia para fijar frotis desecados:

SANGRE.
MEDULA OSEA.
GANGLIO.
BAZO.
LIQUIDOS DE PUNCION.

Altera morfológicamente a los lípidos.

Como fijador de emergencia vale, pero tiene grandes
inconvenientes: no fija la cromatina, produce retracción, no tiene
efecto mordiente y produce fenómenos de desplazamientos.
(sustitución de hidratos de carbono).
 CARACTERISTICA DE ETANOL
Líquido claro, transparente o incoloro, volátil, inflamable y de olor
agradable.
Como fijador único utilizaremos alcohol a unas concentraciones
entre el 70 y 90% y se obtiene cogiendo de 70−90 ml de alcohol puro
y se lleva hasta 100 con agua destilada.

La fijación mas potente va a corresponder a las soluciones más

concentradas pero a altas concentraciones la capa externa del tejido
se endurece en exceso, lo que impide la penetración del fijador a la
parte interna de la pieza.
El tiempo de fijación correspondiente a una pieza de 5mm de
espesor es dos a cuatro horas renovando unas 3 veces el líquido.
Es un fijador que preserva el glucógeno y la actividad de ciertas
enzimas titulares, fija los pigmentos y se emplea en las extensiones
citológicas
 CARACTERISTICAS DEL ETANOL
Como altera escasamente la estructura antigénica de los tejidos es un
buen agente fijador para inmunohistoquímica. Entre las ventajas del
alcohol están:
 Fijan y deshidratan al mismo tiempo
Posee una gran velocidad de penetración
Precipita muy rápidamente las proteínas y el glucógeno lo que unido a
la anterior propiedad aporta extraordinariamente el tiempo de fijación
es un notable agente bactericida y por tanto un buen conservante
No fija adecuadamente la cromatina porque disuelve los ácidos
nucleícos y además disuelve parcialmente los lípidos.
Endurece y contrae excesivamente los tejidos.
Prepara mas la tinción porque carece de efecto mordiente
A medida que realiza la fijación se va diluyendo al incorporar el agua
que extrae de los tejidos por lo cual pierde actividad progresivamente