Trabajo Práctico: Respiración celular

Objetivos

Al finalizar este laboratorio el estudiante podrá:

1. Entender qué es la respiración celular, su importancia y los pasos principales de la
misma.
2. Medir la tasa de respiración aeróbica en levaduras.
3. Analizar el efecto de diferentes sustancias sobre la respiración.

Introducción
El funcionamiento normal de las células requiere de un aporte continuo de energía, tanto
para sus procesos metabólicos como para el mantenimiento de la estructura. La respiración
celular es el proceso por el cual las células, después de una serie de reacciones químicas,
degradan moléculas orgánicas y obtienen la energía necesaria para desarrollar todas sus
actividades. Durante la Respiración Celular se producen reacciones Redox, que involucran
transferencia de electrones desde los combustibles celulares (fuentes de carbono reducidas)
hacia las coenzimas NAD+ y FAD que son así reducidas respectivamente a NADH y
FADH2. A su vez, el NADH y FADH2 transfieren sus electrones a la cadena respiratoria.
En este último proceso, las coenzimas son nuevamente oxidadas y sus electrones son
aceptados finalmente por el O2.
En las células eucariotas el proceso de respiración celular se realiza en las mitocondrias,
mientras que en las células procariotas el proceso ocurre en la membrana celular (Figura
1). Antes de explicar las etapas de la respiración celular, vamos a repasar los conceptos de
ATP y mitocondria.

Figura 1: Esquema general de la cadena respiratoria proveniente de mitocondrias o bacterias.

Aunque son muy diversas las biomoléculas que contienen energía almacenada en sus
enlaces, es el ATP (adenosín trifosfato) la molécula que interviene en todas las
transacciones de energía que se llevan a cabo en las células; por ella se la califica como
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"moneda universal de energía". El ATP está formado por adenina, ribosa y tres grupos
fosfatos y contiene enlaces de alta energía entre los grupos fosfato que al romperse liberan
la energía almacenada. En la mayoría de las reacciones celulares el ATP se hidroliza a
ADP, rompiéndose un sólo enlace y quedando un grupo fosfato libre, que suele transferirse
a otra molécula en lo que se conoce como fosforilación. Sólo en algunos casos se rompen
los dos enlaces resultando AMP y 2 grupos fosfato. El sistema ATP <---> ADP es el
sistema universal de intercambio de energía en las células.

Las mitocondrias son los organelas celulares encargadas de suministrar la mayor parte de
la energía necesaria para la actividad celular, actúan por tanto, como centrales energéticas
de la célula y sintetizan ATP a expensas de los carburantes metabólicos (glucosa, ácidos
grasos y aminoácidos). Una característica de las mitocondrias es que se cree que eran,
antiguamente, bacterias aeróbicas que vivían en forma independiente ya que poseen
ribosomas y su propio ADN, lo que les brinda cierta autonomía, y que fueron ingeridas
("tragadas", pero NO digeridas) por células anaeróbicas ancestrales, produciéndose un
continuo mutualismo (simbiosis). Esta hipótesis fue planteada por L. Margulis y D. Sagan,
en la teoría endosimbiótica, que intenta explicar la aparición de las células eucariotas,
basándose en el hecho de que las mitocondrias tienen su propio ADN, al igual que los
cloroplastos, que pertenecen a las células vegetales, y realizan la fotosíntesis, que lograron
adaptarse y sobrevivir a los cambios. La ultraestructura mitocondrial está en relación con
las funciones que desempeña: en la matriz se localizan los enzimas responsables de la
oxidación de los ácidos grasos, los aminoácidos, el ácido pirúvico y el ciclo de Krebs. En la
membrana interna están los sistemas dedicados al transporte de los electrones que se
desprenden en las oxidaciones anteriores y un conjunto de proteínas encargadas de acoplar
la energía liberada del transporte electrónico con la síntesis de ATP, estas proteínas le dan
un aspecto granulado a la cara interna de la membrana mitocondrial (Figura 2). También se
encuentran dispersas por la matriz una molécula de ADN circular y unos pequeños
ribosomas implicados en la síntesis de un pequeño número de proteínas mitocondriales.

Figura 2: Esquema de una mitocondria. Se muestra las membranas internas y externas y la localización de
los complejos de membrana interna que participan en el transporte de electrones y los procesos que se llevan a
cabo en la matriz mitocondrial.

Etapas de la respiración celular

Podemos clasificar a la respiración celular, como proceso químico-biológico, en tres etapas:

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- la glucólisis o glicólisis
- el ciclo de Krebs
- transporte de electrones en la cadena respiratoria

La respiración celular sigue distintas rutas en presencia o ausencia de oxígeno. En presencia

de oxígeno sucede respiración aeróbica y en ausencia de oxígeno sucede respiración
anaeróbica. Ambos procesos comienzan con la glucólisis.

Glucólisis: es el primer paso de la respiración celular y consiste de una serie de reacciones

que ocurren en el citoplasma de la célula y por las cuales, a partir de una molécula de
glucosa, se producen dos moléculas de ácido pirúvico (piruvato). Todos los organismos
llevan a cabo la glucólisis. La glucólisis se divide en dos partes: en la primera la molécula
de glucosa se divide en dos moléculas de gliceraldehido- 3-fosfato y en la segunda estas
dos moléculas se convierten en dos moléculas de ácido pirúvico (piruvato). Durante la
glucólisis se producen dos moléculas de ATP y dos de NADH (Figura 3A).

Ciclo de Krebs: La respiración celular aeróbica es el conjunto de reacciones, de

oxidoreducción, en las cuales el ácido pirúvico producido por la glucólisis se transforma en
CO2 y H2O, y en el proceso, se producen 36 moléculas de ATP. En las células eucariotas
este proceso ocurre en las mitocondrias en dos etapas llamadas el Ciclo de Krebs (Figura
3B) (o ciclo de ácido cítrico) y la cadena de transporte de electrones.

A B

Figura 3: A: Esquema de la Glucólisis. Se muestran los pasos de consumo y producción de ATP y la obtención de
NADH. B: Esquema simple del Ciclo de Krebs. En el esquema se muestran los productos principales obtenidos.

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Cadena de transporte de electrones o cadena respiratoria: En la etapa final del proceso de
la respiración, los electrones "arrancados" de las moléculas que se respiran y que se
"almacenan" y transportan en el NADH Y FADH2, irán pasando por una serie de
transportadores, situados en las crestas mitocondriales formando tres grandes complejos
enzimáticos. La disposición de los componentes de la cadena de transporte permite que los
electrones "salten" de unos a otros, lo que genera una cierta cantidad de energía (llamada
fuerza protón-motriz). Tanto los electrones como los protones, que han sido impulsados a
lo largo de la cadena respiratoria, deben unirse a un aceptor final. En la respiración aeróbica
el aceptor último de electrones (y protones) es el O2, que al unirse al H2, forma H2O como
producto final.

Figura 4: Esquema de la Cadena transportadora de electrones. Las flechas de los complejos I, III y IV
indican el transporte de H+ de la matriz mitocondrial al espacio intermembrana.

Como vemos en el esquema la cadena respiratoria está constituida por cuatro complejos:
Complejo I: Las NADH deshidrogenasas: son flavoproteínas o metaloflavoproteínas que
poseen como grupo prostético la FMN y un centro Fe-S. Oxidan al NADH transfiriendo 2
electrones a las quinonas y 4 protones desde la matriz mitocondrial al espacio
intermembrana.
Complejo II: la Succinato deshidrogena, única enzima del ciclo de Krebs unida a la
membrana, transfiere los electrones a la ubiquinona sin bombeo de protones. La
ubiquinona/coenzima Q, liposoluble, transporta dos electrones y dos protones al complejo
III.
Complejo III: es la ubiquinona-citocromo C oxidoreductasa o citocromo bc, es el que
transporta los electrones desde la ubiquinona al citocromo c. El citocromo c, hidrosoluble
transporta los electrones de a uno hacia el complejo IV.
Complejo IV: es la citocromo oxidasa y es la que transporta los electrones hacia el oxígeno,
reduciéndolo y formando agua, y se bombean 4 protones al espacio intermembrana.

Síntesis de ATP
La síntesis de ATP se produce en la membrana interna de la mitocondria en un proceso
conocido como fosforilación oxidativa. Los protones que se acumularon en el espacio
intermembrana durante la oxidación de los sustratos reductores, NADH, FADH2 y
succinato generan un grandiente electroquímico que se asocia a una energía potencial
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(fuerza protón motriz). En el espacio intermembrana hay un exceso de cargas positivas y
mayor concentración de protones que en la matriz mitocondrial. Los protones son
transportados a favor de su gradiente mediante un complejo proteico llamado ATP sintasa
hacia la matriz mitocondrial y se aprovecha la energía del gradiente electroquímico para
fosforilar ADP. La ecuación que resume el proceso es la siguiente:

ADP + Pi + nHP+ ----- t ATP + H20 + nHN+

nHP+ son los protones del lado del espacio

intermembrana y nHN+ en la matriz.

Inhibidores y desacoplantes
Se han descrito sustancias inhibitorias y desacoplantes de la cadena respiratoria que tienen
sus blancos de acción a diferentes niveles (Figura 5).
Los inhibidores de la Cadena de Transporte de Electrones (CTE) son sustancias que se
enlazan a alguno de los componentes de la cadena de transporte de electrones bloqueando
su capacidad para cambiar de una forma reversible desde la forma oxidada a la forma
reducida y viceversa. Esta inhibición resulta en una acumulación de los componentes en sus
formas reducidas antes del punto de inhibición, y la presencia de las formas oxidadas de los
componentes de la CTE después del punto de inhibición.

Insecticida
Antibiotico
Barbitúrico

Figura 5: Esquema de la cadena respiratoria indicando el sitio de inhibición en el que actúa cada
sustancia.

Los agentes desacoplantes pueden desacoplar la oxidación de la fosforilación. Por ejemplo,

el 2,4 dinitrofenol (DNP) y el cianuro-p-trifluorometoxifenylhidrazona (FCCP). Son
moléculas hidrofóbicas que poseen la propiedad de ser ácidos débiles. Por ello pueden
protonarse en el espacio intermembrana y atravesar la membrana interna mitocondrial para
liberar el protón en la matriz. De esta manera rompen el gradiente de protones. La

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valinomicina, también es un agente desacoplante que transporta iones K+ a través de las
membranas biológicas y rompe el gradiente electroquímico.

Parte experimental:

Estudio de la actividad respiratoria del microorganismo eucariota

Saccharomyces cereviseae

Preparación de la suspensión de levaduras

A partir de un sobre de levadura comercial se preparara una suspensión de 1g en 10 ml en

agua destilada estéril a TA, se deja en reposo para activar la células durante 30 min.

Consumo de oxígeno

1. Se determinará el consumo de oxígeno de la suspensión de levaduras, utilizando un

Oxígrafo Gilson, el cual consta de un electrodo sensible a la concentración de oxígeno
disuelto en la suspensión. En la cámara del equipo colocamos 1,7 ml de agua destilada
y se agregaran 15 ul de la suspensión de levaduras y una solución de glucosa al 0.5%
final como fuente de carbono respirable. La medición se realiza a TA con agitación
constante.

2. Para observar el efecto del agregado de inhibidores de la cadena respiratoria, se

adicionará a la celda cianuro de potasio 3 mM y se registrara el cambio en el consumo
de oxígeno.

3. Para observa el efecto de los desacoplantes de la cadena respiratoria, se adicionará a la

celda 2,4 DNP y se registrará el cambio en el consumo de oxígeno.

4. Para observar el efecto de un aceptor externo de electrones (DPIP), que cambia su

color de acuerdo al estado de oxidación del mismo, en tubo de hemólisis se prepara una
mezcla conteniendo:
- tubo 1: buffer Fosfato de Potasio 50mM pH 7,5 y DPIP 0,0027%
- tubo 2: buffer Fosfato de Potasio 50mM pH 7,5, 5 ul de la suspensión de levaduras,
0.5% de glucosa y DPIP 0,0027%
- tubo 3: buffer Fosfato de Potasio 50mM pH 7,5, 5 ul de la suspensión de levaduras,
0.5% de glucosa, cianuro de potasio 3mM y DPIP 0,0027%

Observar la decoloración o no del reactivo y el efecto de la presencia o ausencia de un

inhibidor de la cadena de transporte en el tubo.

Fundamento de un electrodo polarográfico para determinar la concentración de O2.

En una solución, el O2 necesario para la respiración aeróbica de todas las formas de vida, se
encuentra disuelto en el medio acuoso. La concentración de O2 dependerá de su solubilidad,
de la presión parcial del gas en la atmósfera, de la temperatura y de otras sustancias
presentes en la solución. Para determinar la concentración de O2 vamos a usar un oxígrafo
que posee un electrodo polarográfico tipo Clark, sensible a la concentración de O2. Este
electrodo posee una membrana de material plástico (polietileno o fluorcarbono) permeable
al O2 que cubre el electrodo sensible al O2 e impermeable a los contaminantes y a los iones
de la muestra que se podrían reducir. La velocidad de difusión del O2 a través de la
membrana es directamente proporcional a la concentración de O2 disuelto en el medio en el
que se sumerge el electrodo. El electrodo propiamente dicho está formado por un ánodo y
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un cátodo metálicos. El cátodo está separado del ánodo por una envoltura de vidrio y se
encuentra en el centro. El ánodo (Ag/AgCl) está rodeando al cátodo y suministra los
electrones para la reacción (Figura 6). Los metales se encuentran separados del medio por
la membrana permeable al O2 y en contacto con una solución de un electrolito de soporte,
usualmente KCl 1 M. Es necesario aplicar un voltaje al electrodo indicador para polarizarlo
y de este hecho deriva su nombre.

Figura 6: Esquema de un electrodo polarográfico de

tipo Clark. La membrana semipermeable se encuentra
en el extremo inferior, pegada a la superficie plana del
electrodo.

La reacción que ocurre en el cátodo es una reducción del oxígeno disuelto en la superficie
del metal noble platino:

O2 + 2 H2O + 2e- H2O2 + 2 OH-

H2O2 + 2e- 2 OH-

En tanto el ánodo provee los electrones

Ag + Cl- AgCl + e-

La reacción total es entonces:

4 Ag + O2 + 2 H2O + 4 Cl- 4 AgCl + 4 OH-

Para obtener la concentración de O2 se debe calibrar a dos puntos. Un punto el el cual la

concentración de O2 es máxima, es decir la solución se encuentra saturada con el gas
disuelto y para ello debe agitarse mucho. El otro punto en el cual la concentración de O2 es
prácticamente cero. Para ello se consume todo el oxígeno agregando sulfito de sodio
Na2SO3 o bien un microorganismo que respire en la celda.

Bioseguridad

En el trabajo práctico se debe trabajar con guantes y delantal.

Es fundamental no comer ni beber nada ya que trabajaremos con sustancias tóxicas

Cianuro de potasio: Muy tóxico por inhalación, por ingestión y en contacto con la piel. En
contacto con ácidos libera gases muy tóxicos. Muy tóxico para los organismos acuáticos,
puede provocar a largo plazo efectos negativos en el medio ambiente acuático. Manténgase
el recipiente bien cerrado. En caso de contacto con la piel, lávese inmediata y
abundantemente con agua. No tirar los residuos por el desagüe. En caso de accidente o
malestar, acúdase inmediatamente al médico (si es posible, muéstresele la etiqueta).

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Elimínese el producto y su recipiente como residuos peligrosos. Evítese su liberación al
medio ambiente. Recábense instrucciones específicas de la ficha de datos de seguridad.
Es un polvo blanco con un ligero olor a ácido cianhídrico cuando está húmedo. En contacto
con la humedad ambiental se descompone con formación de ácido cianhídrico. Puede
reaccionar con dióxido de carbono disuelto en agua, liberando ácido cianhídrico. Materias a
evitar: Ácidos, nitratos, nitritos, fluoruro y cloratos. Oxidantes. Altamente tóxico, el KCN
tiene un olor como el de las almendras amargas, pero no todos pueden percibirlo porque la
capacidad para ello se debe a un rasgo genético. Es una de las pocas sustancias que forman
compuestos solubles con el oro, y por esto se usa en joyería para el dorado químico y para
dar brillo a este metal. Puede usarse en la minería de oro para extraer el metal de los
minerales, aunque más comúnmente se usa cianuro de sodio.
Protección respiratoria: Protección respiratoria con filtro antipolvo de cianuros
Protección de las manos: Guantes material plástico.
Protección de los ojos: Gafas de protección.
Protección cutánea: Utilizar ropa de trabajo adecuada que evite el contacto del producto.
La sustancia irrita fuertemente los ojos, la piel y el tracto respiratorio. La sustancia puede
causar efectos en respiración celular, dando lugar a convulsiones y pérdida del
conocimiento.
Inhalación: Trasladar a la víctima a un lugar ventilado. Mantener en reposo y abrigado.
Aplicar respiración artificial en caso de insuficiencia respiratoria. Solicitar asistencia
médica.
Contacto la piel: Quitar las ropas contaminadas. Lavar con agua abundante el área afectada.
Requerir asistencia médica en caso de irritación persistente.
Contacto con los ojos: Lavar con abundante agua durante 15 minutos, manteniendo los
párpados abiertos. Acudir al oftalmólogo en caso de irritación persistente
Medios de extinción adecuados: Polvo químico seco.
Medios de extinción que no deben utilizarse: Agua, espuma o dióxido de carbono.
Riesgos particulares derivados de la exposición a la sustancia o a sus productos
decombustión: Por descomposición térmica pueden generarse humos muy tóxicos de
cianuro de hidrógeno.
Manipulación: Evitar la formación de polvo. No fumar, comer o beber durante su
manipulación. Procurar higiene personal adecuada después de su manipulación. Trabajar
bajo vitrina extractora

2,4-DINITROFENOL:

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