PNT ANÀLISI

MICROBIOLÒGIC D'ORINA
Autors/es:
Los corrosivos
Paula Boqué, Jordi Diéguez, Sandra Martín, Paula Monzón

Revisors/es:
Mentors/es

Data:
06/05/2019
Índex

Fase Pre-Analítica
 Recollida d’orina………………………………………………………………...................2
Fase Analítica
 Tira reactiva……………………………………………………………………...…………..…..4
 Tinció de Gram.……………………………………………………………….....……….….…5
 Observació microscòpica del sediment d’una mostra d’orina……….…….7
 Cultiu……………………………………………………………………………....……………......8
 Sembra…………………………………………………………………………....………….…....10
 Antibiograma……………………………………………………………………...……….…….11
 Oxidasa…………………………………………………………………………….………….…....14
 Catalasa…………………………………………………………………………...…………….....15
 API……………………………………………………………………………........…………….....16
 Control de canvis……………………………………………………………………………....18
 Referènciesdocumentals…………………………………………........……..………....18

1
 PNT Anàlisi Codi PNT: 405379
microbiològic d'orina Pàgina 2 de 18
Versió 1
Data: 06/05/2019

PRE-ANALÍTICA

Recollida d’orina
- Objectiu: Obtenir una mostra d’orina d’una alta qualitat per ser posteriorment
analitzada.
- Responsabilitat i abast: La recollida de mostra és realitzada pel pacient. En el cas del
transport i conservació de la mostra és el personal facultatiu del laboratori qui duu a
terme aquesta tasca. Finalment, la mostra és acceptada o rebutjada pels tècnics de
laboratori.
- Definicions:
Micció: Procés d’orinar des de la bufeta fins a la seva expulsió a l’exterior.
- Materials:
 Recipient Anaclin per recollida d’orina
 Sabó
 Tovallola neta
- Descripció del procediment:
 Netejar-se les mans i els genitals amb aigua i sabó.
 Assecar amb una tovallola neta.
 Obrir el recipient i mantenir-lo obert sense tocar l’interior o les bores.
 Rebutjar la primera part de la micció.
 Tancar el recipient hermèticament.
- Etiquetatge de la mostra:
 Retolar l’etiqueta amb:
 Data de recollida
 Número de la mostra
 Zona de recollida
 Tractament de la mostra
 Nom de la persona que ha extret la mostra
 Omplir la fitxa d’extracció amb:
 Data de recollida
 Número de la mostra
 Zona de recollida
 Tractament de la mostra
 Profunditat de l’extracció
 Volum de la mostra recollida
- Transport i conservació d’orina:
 La mostra ha de ser transportada al laboratori en un període de temps màxim
d’una hora a temperatura ambient.
 Registrar l’arribada de la mostra i es conserva a una nevera de 2-8ºC en un
marge màxim de 24 hores.
- Acceptació i rebuig de mostres d’orina:

2
 El tècnic de laboratori dicta si una mostra és acceptada o rebutjada segons els
següents criteris.
 Acceptació
 L’etiqueta de la mostra conté la informació del pacient, el número de
registre i la data d’extracció.
 A la sol·licitud s’especifica el tipus de mostra que és.
 L’obtenció de l’orina s’ha realitzat abans de l’administració
d’antibiòtics.
 S’ha efectuat un transport i una conservació correcta de la mostra.
 Rebuig
 Orina contaminada amb altres substàncies.
 No s’ha seguit el protocol de recollida d’orina correctament.
 La pacient té la menstruació.
 El recipient ha estat contaminat incomplint les instruccions del
protocol.
 No es compleixen els criteris d’acceptació.
- Registres:
Mostra Data Tipus Transport Conservació Rebuig/
Acceptació
221559 10/02/2019 Micció Immediat 2-8ºC Acceptada
aïllada
22160 10/02/2019 Micció 15 minuts 15ºC Rebutjada
aïllada

- Annexes:

3
 PNT Anàlisi Codi PNT: 405379
microbiològic d'orina Pàgina 4 de 18
Versió 1
Data: 06/05/2019
ANALÍTICA

Tira reactiva
- Objectiu: Determinar substàncies que hi ha en la mostra d’orina d’un pacient.
- Responsabilitat i abast: Aquesta tècnica la poden realitzar tècnics de laboratori o
infermeres.
- Definicions:
EPIS: Equip de protecció individual, per exemple, bata, guants, etc.
Patrons de referència: són els paràmetres de referència on compares els resultats de la
teva tira reactiva, amb el patrons que depenen el color et mostren el resultats de la
teva pràctica.
- Materials:
 Mostra d’orina en recipient adequat
 EPIS
 Tira reactiva
 Patrons de referència
 Timer
- Descripció del procediment:
 Netejar-se les mans i la zona de treball.
 Preparar el material necessari.
 Obrir el recipient de la mostra sense tocar les vores o l’interior del recipient.
 Introduir la tira reactiva en la mostra d’orina, assegurar-se que la mostra està
completament mullada.
 Esperar 1 o 2 minuts.
 Extreure la tira de la mostra d’orina i espera 1 o 2 minuts.
 Comparar els resultats amb el patró de referència, aquest anotar-los a la
llibreta de laboratori.
 Tirar la mostra al wc i el recipient a les escombraries.
 Recollir i netejar el material i la zona de treball.

- Registres:
Temps espera 1-2 minuts

- Annexes:

4
 PNT Anàlisi Codi PNT: 405379
microbiològic d'orina Pàgina 5 de 18
Versió 1
Data: 06/05/2019

Tinció de gram
- Objectiu: Identificar el tipus de paret cel·lular que té el bacteri per a la seva
identificació.
- Responsabilitat i abast: Tècnics de laboratori.
- Definicions:
EPIS: Equip de protecció individual, per exemple, bata, guants, etc.
- Materials:
 Portaobjectes
 EPIS
 Aigua destil·lada
 Mostra de bacteri
 Micropipeta.
 Puntes estèrils de micropipeta
 Pont de tincions
 Cubeta
 Cristall violeta
 Lugol
 Timer
 Bec-bunsen
 Pinça de fusta
 Safranina
 Barreja alcohol/acetona
 Microscopi òptic
- Descripció del procediment:
 Netejar-se les mans i la zona de treball.
 Preparar el material necessari.
 Pipetejar 40 microlites de la mostra de bacteri i es posen al portaobjectes.
 Pipetejar 60 microlites d’aigua destil·lada i es posen en el portaobjectes
juntament amb els bacteris.
 Escalfar el portaobjectes a sobre del Bec-bunsen, progressivament fins que la
gota d’aigua destil·lada i bacteri s’evapora i queda fixada en el portaobjectes.
 Cobrir el portaobjectes amb solució cristall violeta i deixar actuar 1 minut.
 Rentar amb aigua destil·lada breument l’excés de colorant i escorre el
portaobjectes.
 Cobrir el portaobjectes amb lugol i deixar actuar 1 minut-
 Rentar amb aigua destil·lada l’excés de colorant i escorre el portaobjectes.
 Cobrir el portaobjectes amb una barreja d’alcohol/acetona en proporció 1:1
durant 30 segons.
 Rentar amb aigua destil·lada l’excés de colorant i escorre el portaobjectes.
 Cobrir el portaobjectes amb solució de safranina durant 2 minuts.

5
  Rentar amb abundant aigua destil·lada l’excés de colorant i deixar assecar el
portaobjectes.
 Visualitzar al microscopi òptic, els bacteris gram + es veuen de color blau/lila i
els bacteris gram - es veuen de color rosa/vermell.
 Recollir i netejar el material i la zona de treball.

- Registres:
Colorant Temps espera
Cristall violeta 1 minut
Lugol 1 minut
Alcohol-acetona 30 segons
Safranina 2 minuts

- Annexes:

6
 PNT Anàlisi Codi PNT: 405379
microbiològic d'orina Pàgina 7 de 18
Versió 1
Data: 06/05/2019

Observació microscòpica del sediment d’una

mostra d’orina
- Objectiu: Detectar la presència d’estructures cristal·lines i formes amorfes.
- Responsabilitat i abast: Tècnics de laboratori.
- Definicions:
EPIS: Equip de protecció individual, per exemple, bata, guants, etc.
Sobrenedant: Part superior clara després de la centrifugació
- Materials:
 Microscopi òptic
 Centrifuga
 Pipeta Pasteur
 Portaobjectes
 Cobreobjectes
 Mostra d’orina
 Tubs de centrífuga de plàstic amb tap
 ESPIS
- Descripció del procediment:
 Netejar-se les mans i la zona de treball.
 Preparar el material necessari.
 Pipetejar 10 ml de mostra d’orina en tubs d’assaig amb tapa per la centrífuga
amb ajuda de la micropipeta.
 Centrífugar la mostra durant 15 minuts a 1500rpm
 Descartar el sobrenedant
 Resuspender el sediment utilitzant una pipeta pasteur.
 Tirar una gota petita de sediment en el portaobjectes
 Posar un cobreobjectes damunt de la mostra del portaobjectes. Per a això
col·locarem el cobre en un angle de 30°
 Observar amb els objectius secs
 Netejar i rebutjar correctament el material.
- Registres:
Temps centrífuga 15 minuts
Revolucions centrífuga 1500rpm

- Annexes:

7
 PNT Anàlisi Codi PNT: 405379
microbiològic d'orina Pàgina 8 de 18
Versió 1
Data: 06/05/2019

Cultiu
- Objectiu: Serveix com a recurs alimentari controlat per al creixement i de bacteris en
específic.
- Responsabilitat i abast: Tècnics de laboratori.
- Definicions: No aplica.
- Materials:
 Guants
 Paper de filtre
 Peptona: 4g/l
 Extracte de carn bovina: 3g/l
 Triptona: 4g/l
 Lactosa: 10g/l
 L-Cistina:128 mg/l
 Blau de bromotimol: 20 mg/l
 Agar: 15g/l
 Aigua destil·lada: 1L
 Autoclau
 Erlenmeyer
 Bascula analítica
 Vidre de rellotge
 Espàtula
 Agitador magnètic
 mosca magnètica
 Paper d’alumini
 Plaques de petri estèrils
 Matràs aforat a 250 ml
 Embut
 Guant ignífug
 Nevera
- Descripció del procediment:
 Per aconseguir 250ml del medi de cultiu de CLED precisem dels següents
reactius.
 Peptona: 1 g
 Extracte de carn bovina: 0,75 g
 Triptona: 1 g
 Lactosa: 2,5 g
 L-Cistina: 32 mg
 Blau de bromotimol: 5mg
 Agar: 3.75 g

8
  Un cop tenim els reactius agafem el vidre de rellotge i espàtula i els pesem
amb la bàscula analítica amb les quantitats anteriors.
 Agafem un matràs aforat a 250 ml i afegim aigua destil·lada fins als 250ml.
 A continuació amb un embut afegirem els reactius dins el matràs i
homogeneïtzem.
 Aboquem el contingut del matràs a un erlenmeyer el qual dipositem en un
agitador magnètic per acabar de homogeneïtzar i fer-lo bullir.
 Un cop bullit el retirem amb un guant ignífug i aboquem una quantitat que
cobreixi tota la superfície de la placa de petri.
 A continuació es col·locaran les plaques al interior de la nevera perquè es
solidifiquin.
- Registres:
Temperatura refrigeració 2-8ºC

- Annexes: No aplica.

9
 PNT Anàlisi Codi PNT: 405379
microbiològic d'orina Pàgina 10 de 18
Versió 1
Data: 06/05/2019

Sembra
- Objectiu: Serveix per al diagnòstic d’una infecció urinària i detectar quina es el bacteri
involucrat i el numero de colònies existents a partir del recompte de les UFC en el
propi medi.
- Responsabilitat i abast: Tècnics de laboratori.
- Definicions:
UFC: Unitats Formatives de Colònies.
CLED: Agar Cistina-Lactosa Deficient en electròlits (medi de cultiu).
- Materials:
 Guants
 Plaques de petri amb CLED
 Paper de filtre
 Nansa de sembra
 Estufa de cultiu
 Mostra d’orina
 Bec Bunsen
 Cinta adhesiva
- Descripció del procediment:
 Amb el medi de cultiu ja solidificat continuarem amb el procés de sembra per
esgotament (zig-zag).
 Encendrem el bec Bunsen i procedirem a esterilitzar la nansa de sembra fins
que quedi vermella incandescent, esperarem uns segons que es refredi.
 Amb els medi de cultiu, la mostra i la nansa a un radi no inferior a 15 cm del
bec bunsen (conservació de l’esterilitat) procedirem amb la nansa a recollir
una mostra de l’orina i aplicar el mètode de zig zag sobre el medi de CLED.
 Un cop sembrats els bacteris s’etiqueta a la part inferior a les bores de la placa
amb el nom del bacteri, la data que s’ha realitzar i qui a efectuat el urocultiu es
depositaran a l’estufa a 37ºC durant 24h-48h i observarem i farem el recompte
de les colònies formades (UFC).
- Registres:
Data 11/02/2019
Temperatura estufa 37ºC
Temps estufa 24h-48h

- Annexes:

10
 PNT Anàlisi Codi PNT: 405379
microbiològic d'orina Pàgina 11 de 18
Versió 1
Data: 06/05/2019

Antibiograma
- Objectiu: Determinar la sensibilitat bacteriana a diferents antibiòtics.
- Responsabilitat i abast: Tècnics de laboratori.
- Definicions:
Tripticasa soia: és un mitjà de creixement d'ús general preparat amb o sense sang o
enriquiments. S'utilitza per a l'aïllament de diferents ceps de microorganismes.
Estàndards de terbolesa de McFarland: escala utilitzada en microbiologia com a
referència en suspensions bacteriològiques per a saber que el nombre de bacteris per
mil·lilitre, o més aviat en UFC segons una escala que va de 0.5 a 10.
- Materials:
 Mostra bacteriana
 Tripticasa soia
 Tubs amb sérum fisiològic (0,85 g de NaCl en 100 ml de agua destil·lada
estèril)
 Nansa de sembra.
 Pinces i isòtops estèrils
 Plaques d’agar Müeller-Hinton
 Discos comercials d’antibiòtic
 Regla
- Descripció del procediment:
 Preparació de l’inòcul
 Mètode del mitjà de cultiu líquid:
 Agafar de 3 a 5 colònies iguals de la placa de cultiu de 18 a 24 hores.
 Sembrar les colònies en 5 ml d'un mitjà líquid (Tripticasa soia).
 Incubar en l'estufa a 35 °C durant 2 a 6 hores fins aconseguir o
superar una terbolesa del 0.5 de l'escala de MacFarland.
 Ajustar la terbolesa amb sèrum fisiològic estèril si aquesta és
superior.
 Mètode de suspensió directa de colònies:
 A partir d'una placa de cultiu de 18 a 24 hores agafar diverses
colònies amb una nansa.
 Ajustar l'inòcul a una terbolesa equivalent al 0.5 de l'escala
de MacFarland amb sèrum fisiològic.
 Agitar en un agitador "vortex" durant 15-20 segons.

Es recomana utilitzar el primer mètode si el cultiu té més de 24 hores

d'incubació. El segon mètode és el més adequat per a microorganismes de
creixement difícil en mitjans líquids i per a estafilococos en els quals es
vulgui detectar la resistència a oxacilina.

11
  Inoculació de les plaques.
 Abans que transcorrin 15 minuts d'haver ajustat l'inòcul,
introduir un isòtop estèril dins de la suspensió.
 Retirar l’isòtop de la suspensió i girar-lo diverses vegades contra la paret
del tub per sobre del nivell del líquid amb la finalitat d'eliminar l'excés
d'inòcul.
 Inocular les plaques d’agar completament, sense deixar cap zona lliure.
 Lliscant l'isòtop per la superfície del agar tres vegades, girant la placa uns
60 graus cada vegada i passant-la finalment per la perifèria del agar per a
aconseguir una sembra uniforme.
 Deixar assecar de 3 a 5 minuts abans de dipositar els discos.

 Dispensació dels discos.

 Col·locar els discos amb pinces estèrils.
 Pressionar els discos lleugerament sobre la superfície del agar.
 Assegurar-se que els discos contacten perfectament amb la superfície del
agar.
 No situar els discos a menys de 15 mm de la vora de la placa.
 Distribuir de manera que no es produeixi superposició dels halos
d'inhibició.
 Per a plaques de 150 mm no s'empraran més de 12 discos i per a les
de 100 mm no més de 6.
 Incubar les plaques invertides (agar en la part superior), en grups no
superiors a 5 plaques, a 35 °C en atmosfera aeròbica abans que
transcorrin 15 minuts.
 Les plaques s'incubaran 16-18 hores (amb estafilococos sensibles
a meticilina ha de prolongar-se la incubació fins a 24 hores per a
confirmar l'absència de resistència a la meticilina).

 Lectura dels resultats.

 Després de 18 hores d'incubació llegir el diàmetre de les zones de
completa inhibició amb un regla.
 Si el microorganisme és un estafilococo o un enterococo, esperar 24
hores per a assegurar la sensibilitat a la oxacilina i vancomicina.
 Mesurar zones dels mitjans transparents sobre el revers de la placa.
 Observar utilitzant llum transmesa en proves de sensibilitat
a meticilina en estafilococos l'halo al voltant de la oxacilina per visualitzar
les colònies diminutes.
 Quan apareixen colònies dins de l'halo d'inhibició, pot tractar-se de
mutants resistents, contaminacions, poblacions heterogènies o cultius
mixtos i convé tornar a identificar-les i realitzar una altra vegada l'assaig
de sensibilitat antimicrobiana.
 No tenir en compte les colònies diminutes que apareixen en l'halo
d'inhibició (per norma general).

- Registres:
Bacteri Resistència antibiòtica Sensibilitat antibiòtica
E. coli

12
- Annexes:

13
 PNT Anàlisi Codi PNT: 405379
microbiològic d'orina Pàgina 14 de 18
Versió 1
Data: 06/05/2019

Oxidasa
- Objectiu: Determinar si un microorganisme produeix l’enzim citocromo-oxidasa.
- Responsabilitat i abast: Tècnics de laboratori.
- Definicions: No aplica.
- Materials:
 Colònies bacterianes crescudes en medi de cultiu sòlid
 Tires de paper absorbent amb una zona reactiva que conté diclorur de N, N-
dimetil-1,4- fenilendiamoni 0,1µmol;1-naftol 1,0 µmol
 Nansa de plàstic d’un sol ús
- Descripció del procediment:
 Dipositar colònia en la zona reactiva de la tira.
 Fregar amb la nansa en la zona reactiva de la tira.
 Esperar entre 10 i 30 minuts.
 Interpretar resultats.

- Registres: Tira Resultat

Tira 4 Oxidasa positiva
Temps 10-30
Tira 20 Oxidasa negativa
espera minuts
Tira 11 Oxidasa negativa
- Annexes:

14
 PNT Anàlisi Codi PNT: 405379
microbiològic d'orina Pàgina 15 de 18
Versió 1
Data: 06/05/2019

Catalasa
- Objectiu: Detectar la presència de l’enzim catalasa als organismes a partir de la reacció
del microorganisme amb el peròxid d’hidrogen.
- Responsabilitat i abast: La prova és realitzada per qualsevol personal facultatiu del
laboratori i per tècnics de laboratori.
- Definicions: No aplica.
- Materials:
 Suspensió bacteriana
 Bec-Bunsen
 Portaobjectes
 Micropipeta
 Puntes de micropipeta estèrils
 Nansa de sembra
 Peròxid d’hidrogen
- Descripció del procediment:
- Afegir una gota de peròxid d’hidrogen amb la micropipeta sobre el portaobjectes.
- Esterilitzar la nansa de sembra al Bec-Bunsen.
- Esperar uns segons a que la nansa es refredi sense apartar-la del camp estèril.
- Introduir la nansa de sembra a la suspensió microbiana.
- Fregar la gota amb la nansa que conté bacteris.
- Detectar la presència de bombolles.
- Anotar i registrar els resultats.
- Registres:
Mostra Resultat
A Catalasa negativa
B Catalasa positiva

- Annexes:

15
 PNT Anàlisi Codi PNT: 405379
microbiològic d'orina Pàgina 16 de 18
Versió 1
Data: 06/05/2019

API
- Objectiu: A través de la determinació de l’activitat metabòlica amb les proves
bioquímiques s’obté la informació necessària per la identificació de bacteris.
- Responsabilitat i abast: Aquest procediment és realitzat per tècnics de laboratori o
personal especialitzat en bioquímica.
- Definicions:
Galeria API 20E: Taula separada per tubs per estudiar diferents paràmetres
Inocular: Introduir la suspensió microbiana en cada un dels tubs.
Taula de referència: Taula on apareixen diferents resultats per contrastar amb els
resultats obtinguts a fi d’identificar les propietats dels microorganismes.

- Materials:
 Galeria API 20E
 Nansa de sembra
 Bec-Bunsen
 Aigua destil·lada
 Cultiu microbiològic
 Solució salina
 Micropipeta
 Puntes de micropipeta
- Descripció del procediment:
 Preparació de la galeria:
 Afegir aigua destil·lada a la base de la galeria.
 Retirar l’excés d’aigua.
 Proves API:
 Esterilitzar la nansa de sembra al Bec-Bunsen fins que es trobi
incandescent.
 Deixar refredar per evitar cremar els microorganismes.
 Recollir una mostra del cultiu ja sembrat amb la nansa.
 Introduir la mostra en un tub amb solució salina.
 Inocular cada tub.
 Pipetejar la suspensió a cada tub sense arribar a la cúpula amb l’ajuda
de la micropipeta.
 Excepcions:
 Les proves anomenades VP, GEL i CIT s’omplen de suspensió
completament, fins a omplir la cúpula completament.
 Els tubs que contenen ADH, LDC, ODC, H2S i URE s’omplen fins al tub
amb suspensió microbiana però se’ls hi afegeix a la cúpula parafina
líquida.
 Incubació i lectura de resultats:

16
  Tapar la galeria per evitar l’evaporació.
 Introduir-la en l’estufa d’incubació a 37ºC durant 24h.
 Passades les 24h retirar la galeria de l’estufa i fer la lectura de resultats.
 Contrastar els canvis en cada medi amb la taula de referència.
 Anotar els resultats i registrar-los.

- Registres:

Mostra Data API Temps Temperatura

22159 12/02/2019 API 20E 24h 37ºC

22161 12/02/2019 API 20E 24h 37ºC

- Annexes:

Proves API

Lectura de resultats

17
Control de canvis
Versió numero Canvis realitzats Data
0 Afegir més imatges 02/05/2019
1 Realitzar referències 05/05/2019
documentals
1 Afegir registres 05/05/2019
1 Modificar índex 05/05/2019
1 Reorganitzar estructura 05/05/2019

Referències documentals
https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seim
c-procedimientomicrobiologia37.pdf (SEIMC: Ana Fernández Olmos Celia García de la Fuente
Juan Antonio Saéz Nieto Sylvia Valdezate Ramos )Data de consulta: 29/04/2019

https://es.wikipedia.org/wiki/Tira_reactiva_de_orina Data de consulta: 29/04/2019

https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seim
c-procedimientomicrobiologia11.pdf (SEIMC: José A. García Rodríguez Rafael Cantón J. Elías
García Sánchez Mª Luisa Gómez-Lus Luis Martínez Martínez Carmen Rodríguez-Avial Jordi Vila)
Data de consulta: 29/04/2019

https://www.docsity.com/es/pnt-antibiograma/590394/?auth_done#Data de consulta:
29/04/2019

18