14. Pruebos bioquimicas para Ia identificacién de bacterias
La propiedad termorresistente es la base para
la diferenciacion de algunas especies del
género Pseudomonas.
A)
B)
c)
IV. REACTIVOS EMPLEADOS
pnitrofenil fostato.?
Preparar en concentracion del 0,1. %
en agua destiladautilizando. un
frasco volumé
ico.
2. Guardar en un frasco de vidrio
color caramelo. Evitar la exposicién
ala luz
3. Rotular correctamente.
Buffer Tris, 0,02 M, pH:8
1, Disolver 3.02 g (0,025 moles, peso
mol, 121) detrissdlido (hidroximetil)
aminometano (0 2-amino-2-hidro-
ximetil-1.3-propandiol) en 100 ml
aproximadamente de agua destila-
da en un frasco volumétrico de un
litvo. Hervir el agua destilada para
que se desprenda el CO."
2. Agregar 25 ml de CH LN (0,025
moles de CIH) y cs.p. 1.000 ml
con agua destilada hervida.
3. Controlar el pH; a 37° C debe ser 8.
4. Rotular correctamente.
Método de utilizacién (de ambos reac-
tivos).”
1. Con una torunda estévil retirar las
células que se desarrollan en un
medio de agar adecuado y preparar
una suspension celular del organis-
mo bajo sospecha, en buffer T
(pH:8) con una densidad igual al
N°3 del nefeloémetro de MeFar
land.
a) Estandarizar las densidades de
células por ml
b) Preparar diez tubos patron nu-
merados desde el 1 hasta el 10.
1. Cada tubo contiene un multi-
plo de 300.000.000 de orga-
hismos por ml
Numero del tubo patron por
300,000,000 es igual al mti-
mero de organismos por ml
(Tubo 3 = 9 x 10* cél/mb),
oH
Fosfatasa
b—on
OH
paitrofenil fostato,
Gncoloro)
Colocar 0,5 ml de la suspensién
de microorganismo en buffer en
dos tubos, y rotularlos tubos 1 y 2.
Colocar el Tubo 1 en un baito de
agua a 70°C durante 20° min
EI Tubo 2 es el control no calentado.
Despueés de la incubacién del Tubo
1, agregar 0,5 ml de una solucién
de-prnitrofenil fosfato al 01% (in-
colora) a ambos tubos.
Segunda incubacién, ambos _tubos,
nun bafo de agua MG,
b) Desde 1h hasta el dia siguiente.
es negativa (no aparece color
amarillo en ninguno de los tu-
bos), incubar 24 h.
7. Registrar las reacciones de color
D) Control de calidad. Antes de adoptarlos
para su empleo general, deben contro-
Larse los reactivos con cultivos positives
y negativos conocidos. El Staphylococcus
epidermidis y ka P. aeruginosa constituyen
Duenos controles porque se obtiencn
hacilmente y no crean problemas cuan-
do se los conserva como cultivos madre,
epidermidis: prueba de la fostatasa
negativa, no se produce fosfatasa® P.
aeruginosa: prucba de la fostatasa positi-
va, resistente al calor.
BE) Conservacion: Guardar ambos reacti-
vos en un reftigerador (a 4° C) cuando
no se los emplea. Su estabilidad es
variable: por lo tanto, periddicamente
habra que hacer un control de calidad.
desechandolos si muestran una reac-
cion negativa o débil con un organismo
positive conocido.
F) Quimica de la accion del reactivo: El
Prnitrofenil fosfato es un reactivo ineo-
loro que se desclobla para dar p-nitrofe-
nol (un compuesto de color amarillo) y
fosfato inorginico cuando sobre él
acttia ‘la enzima fosfatasa.’ Las sales
coloreadas de los p-nitrofenoles se for-
man con bases (buffer Tris); probable-
mente son sales de una estructura
quinoide.”
as sales de nitrofenol son de color
amarillo intenso.”
Fosfato
inorginico
pritvoenot
i (amarillo)