173 MOLEKULARNI MARKERI Da bi se prevazisle pomenute nepogodnosti primene proteinskih markera, razvojem tehnolepije omoguéeno je da se varijabilnost odreduje dizekino na nivoa DNK. Danaénje metode koje se rutinski primenjuju su vezultat dugogodinjeg isteivanja strakture i fmkelje DNK i RINK, metoda Kloniranja, izolacije i karakterizacije gena, U tekstu ée biti prikazani osnovni principi dve DNK tehnologije: polimorfnost dudine restrikeionih fiagmenata { Janéana teakeija polimeraze, kao j osnovne. napomene vezane za tehnike sckvencioniranja, Potimorfnost dutine-restrikcionih fragmenata - - Restriction Eragment Lenght Polymorphism (RFLP) ‘Zasniva se na pojavi da odredeni baktcrijski enzimi imiaju sposobnost da prepoznaje specifigne sckvence na DNK i da na tim mestima katalizuju hidrolize fosfodiestarskih veza odn.“seku” molekul DNK. Ta specifiéna mesta na DNK molekulu zovu se restrikeiona mesta, enzimi se zovu restrikeioni enzimi (endonuldeaze), a dobifeni fragment DNK su restrikcioni fragmenti (Teb, 114, $1. 11.11). Do danas je iz raznih sojeva bakterija Roloveno preko 100 razlititih endomukleaza i svaka od njih aosi naziv Koji potige od skraéenog naziva bakterije iz Koje je izolovana. Svaki enzim ima svoju specificnost - restrikciono mesto (koje moze biti komponovano od 4-8 baznih parova (bp)), specifigan natin seéenja Clepljivi” ili “tavni® krajevi) i specifiéne zahteve sredine (pH, T, itd) u kojima optimalno deluju, Tabela L1.4. Restrikcione endonukleaze enzim _[sckv.restrikmesta | tip setenja | seky. krajeva Abul S-AGCT3" ravni krajevi_ | 5-AG CT" TCGA-5* 3-TC GAS" ‘SauSAT_| 5-GATC3" teplivilkajevi 15° GATC-3° 3-CTAG-5* 3:CTAG -5' Hint 13-GANTC- lepliivi Krajevs 3CTNAG-5! 3-CINA G-5! Bam | 5-GGATCC3" lephhivi krajewi'| S“G GATCC- 3CCTAGG-5 3-CCTAG G.5' BsrBL [S-CCGCTC-3" vavni laajevi_ | 5© NNNCCGCTC-3" 3-GGCGAG-5' 3'_NNNGGCGAG-5' EooRT |) S-GAATTC-3" lepljivi krajevi [5"G AATIC-3 3-CTTAAG-5* 3-CTTAA 6-5! Pel SCTGCAG-S epliivi krajevi | SCTGCA G3" S.GACGTC'S! 3:G ACGTC'S' sre eee, — Slike 11.11 Princip deistea restriteionog enzima LeuRth174 Iz svega navedenog moze se zakljutiti da ako se jedan segment DNK seée razlicitim restriktazamaa - produkt ée biti restrikcioni fragmenti razlidite duzine (SI. 11.12). Slika 11.12. Restrikeijom istog regiona DNK enzisni EcoRi I Hindlll dafu produkte razligite duzine a Sa droge strane, sr2 same RFLP metode 2a odredivanje varijabilnosti genoma je u tome da ako se istim enzimom see DNK dye individue, za koje se smatra da imaju ‘ajednitko poreklo, mogu se dobiti restrikcioni, Gegmenti razligite duzine (SI. 11.13), Uzok Sxeinu tome su promene & genomu (latkaste, hromozomske ili mutacije Kariotipa), koje su astale iokom odvojenog evolutivnog razvoja i koje su uslovile izmenu poricije restrikcionih mesta primenjenc endonukleaze. Glika 11.13. Polimorfaost duzine restrikeionih fragmenata 5 jedinki migeva Kao matrica za se¢enje moze posluziti kako nukleama tako i vannukiearna ONK prisutna U eitohondsiiama (mtDINK) i plestidima {epDNK). Praktigno, 2a odredivanje polimorfhasti DNK postoje dva osnovna pristupa: A) Ukoliko je bjekat mifNK iti epDNK obidno je dovaljno samo izolovati ONK. isedi je eindomikleazon, Feugioente jada mi webs 5 pasmatrati RELP profile, Poredenjso polimortnost fragmenata dve popubieie, ele je DINK. seen wli eneimom moze se deck do7 a ee oo 175 odgovora o broju_supstituciia baza po _pukleotidu u sekvenci (p), ako se zna broj istih fragmenata (F), broj baza restrikcionog mesta upotrebljenog enzima (n) i vkupan broj baza u restrikcionim mestima celog RFLP profila (N). Kada se ovakav pristup primeni na vile populecija i kada se sumizaju podaci iz viSe razligitth restrikcionih reakeija - obradom podataka o broju supstitucija mode se do¢i do dendrograma koji ée prikazivati nivo srodnosti. pel GFP SFY 72)" uz standardnu devijaciju —o= (p(1-pyvny!” B).Ukoliko je objekat nuklearna DNK. . - njena veliGina “onemoguéava —direktio odredivanje = RFLP na. asnovu coum one elextroforegrama. Posto je u pitanju veliki oe broj restrikcionih fragmenata, moguée je da i. se desi da neki od njih, mada imaju razligitu cnet neon mame sekvencu, mogu biti iste dudine, te ée se na aw gelu preklapati, Zato je neophodno izvrsiti Cremeans NN selekciju, odn. proveriti nivo polimorfnosti SS ee So. Wo samo na odredenom delu genoma. U ove Sone ~~ svthe koristi se metod ~ DNK-DNK rawmsect |g hibcidizacije, gde se ispitivans i restriktazama obradena DNK hibridizuje sa DNK “probama” (poznatim segmentima DNK koji su u predhodnim proufavanjima izolovani iz istog ili srodnog organiza). Sam proces je kompleksan (SI. 11.14} i ‘sastoji se iz nekeliko faza: 0 Toner ww Weghr Bee omen faza 1: izolovanje DNK See OE, faza 2: restrikeija. : . wt faza 3: rezdvajanje fragmenata srepemoting na agerozriom gelu faza 4: Southern blotting, 48 haar anos podiaza: hibridizacija la agers Ves je napomenuto da je agaroze a U veoma nepogodaa za manipulaciju | zbor toga je za oaredni deo procesa neophodio preneti DNK fragmenie sa gela na neki nossé pogodniji za meanipulisanje, U te Prentic mth ibe re svthe Koriste se membrane (celulozne it _ najlon), & sam proces prensa i bibridizacije O vrmiagreeis urwteneran! DNK-DNK naziva se Southem blowing ‘SarTacrnsagegnyon _ (Southern E.M, - autor metode, biotting ~ upijanje). Pod dejstvom kapitamih sila DNK iz gela ¢e biti prenegena na nitroceluloznu membrana Slika 11.14, Southern blowing procedues