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Resumen.
Existen formas de realizar estudios cuantitativos de las colonias bacterianas de forma indirecta y
directa. En el presente documento se exponen los resultados de la cuantificación de
microorganismos de una colonia de E. coli por turbidimetría y por recuento directo. Partiendo de
una hora inicial, se midió la absorbancia en el espectrofotómetro de la muestra y se realizó el
conteo en la cámara de Neubauer (tomando 10 cuadros) comenzando 2,75 horas después, y
repitiendo cada media hora. Debido a que se empezó a hacer la cuantificación tarde, no se pudo
certificar fase de latencia, ni la duración de la fase exponencial. No obstante, se determinó por
ambos que la colonia se encontraba en la fase estacionaria. Las discrepancias entre resultados
correspondieron a errores de observación, principalmente la dificultad de diferenciar células vivas
y muertas por el método de recuento directo.
Palabras clave: E. coli, recuento directo, tubidimetría, fase estacionaria, cámara de Neubauer.
Abstract.
There are several ways to make cuantitative studies of bacteria colonias by indirect and direct
methods. In this paper the results of a cuantitative study of the microorganisms in an E. coli
colony by turbidimetry and direct counting will be exposed. Taking an inicial time, the absorbance
was measured in the spectrophotomer and a the number of cells was determined by counting in a
Neubauer chamber (taking 10 squares) starting 2,75 hours after, and repeating each 30 minutes.
Due the counting was started late, it could not certifiacte the lag phase and the exponencial phase
duration neither. However, is was determined by both methods the colony was in stationary
phase. The discrepancies between the results correspond to observation mistakes, mainly the
difficulty for differentiate between living cells and dead cells by direct counting.
Los resultados de los métodos descritos varían de acuerdo a la fase de crecimiento en la que se
encuentra la colonia. Dichas fases son: la fase de latencia, en donde la bacteria es inoculada en un
nuevo medio y el crecimiento no comienza inmediatamente, se necesita que los microorganismos
produzcan las enzimas necesarias para crecer en el nuevo medio; la fase exponencial, donde se
registra el mayor crecimiento bacteriano, pero se ve afectada por condiciones del medio; la fase
estacionaria, donde el crecimiento de la colonia llega a su límite ya sea porque un nutriente
esencial para las bacterias se agota, se acumulan sustancias tóxicas en el medio, no queda; y la
fase de muerte, donde la población bacteriana empieza a reducirse. (Universidad de Caracas).
Metodología.
Materiales:
-Gotero Pasteur.
-Tubos de ensayo.
-Cámara de Neubauer.
Equipos:
-Espectrofotómetro.
-Microscopio óptico.
Métodos:
-Se tomaron diferentes muestras de una muestra original de cultivo de E. coli en 5 diferentes
tubos de ensayo a distintos tiempos.
-Se procedió a realizar el conteo de las bacterias usando para ello la cámara de Neubauer y el
microscopio óptico. Se realizó el conteo en 10 cuadros por cada muestra tomada para calcular la
cantidad de microorganismos por mL.
Discusión.
𝑀𝑖𝑐𝑟𝑜𝑜𝑟𝑔𝑎𝑛𝑖𝑠𝑚𝑜𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑚𝐿
1
= ( ) 𝑥𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑎𝑠 𝑥 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑜
Donde las dimensiones del cuadro fueron todas de 0,1 cm, por lo que el volumen es de 0,0001 mL
y se tomó una disolución no diluida, siendo este factor 100.
Las gráficas 1 y 2 muestran el modo en el que variaron las dos magnitudes medidas con el pasar
del tiempo:
Gráfica 1. Variación del número de células de E. coli por mililitro en el tiempo.
250000
200000
Número de
150000 microorganismos por
mililitro o gramo de
100000
muestra original
50000
0
0 1 2 3 4 5
Absorbancia
0.2
0.18
0.16
0.14
0.12
0.1
Absorbancia
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0 1 2 3 4 5
En lo que respecta al número máximo número de células, es de esperarse que pueda estimarse en
la fase estacionaria dado que el crecimiento tiende a detenerse bien sea por el agotamiento de un
nutriente esencial y/o el aumento de material de desecho en el cultivo. Sabiendo que el cultivo
inicial se realizó partiendo de una colonia cuya absorbancia es de 0,256, en condiciones propicias
la colonia debería llegar a dicho valor. Pero, la máxima absorbancia reportada fue de 0,172, por lo
que el número de células por mL no alcanzó su tope. Posiblemente surgió un cambio de
condiciones al inocularlo al nuevo medio, bien sea por una variación en la composición química de
este (nutrientes, pH), o por cambios de temperatura.
Con respecto a las otras fases, en “La fase estacionaria en E. Coli” se establece una fase de latencia
que dura aproximadamente una hora, y una exponencial de dos hojas. En este estudio no se pudo
determinar la presencia y duración de la fase de latencia, ni la duración de la fase exponencial. Así
mismo, como esta última no se pudo registrar, el cálculo de la tasa específica de crecimiento y del
tiempo de duplicación no se efectuó ya que se hacen con base a una gráfica a escala
semilogarítmica de la fase exponencial.
Cuestionario.
DIRECTOS
- Las técnicas de recuento microscópico de células sin fijar usando microscopía de contraste de
fase. Para ello se cuenta el número de partículas en un volumen determinado usando una célula
de Petroff-Hauser o de Neubauer (portaobjetos modificado en el que una rejilla nos permite
conocer el volumen que estamos observando). El procedimiento es rápido y sencillo; pero no
permite distinguir células vivas inmóviles de células muertas. (Tortora et al., 2007).
- Contaje de partículas utilizando sistemas automáticos del tipo Coulter Counter. La operación de
estos sistemas es sencilla y permite rápidamente determinar el número de partículas presentes
en una suspensión y la distribución de sus tamaños. El problema es que no distingue entre células
vivas y muertas ni entre células y agregados de material insoluble presente en la suspensión del
cultivo. (Tortora et al., 2007).
- Medida de peso seco. El sistema consiste en la filtración del cultivo a través de una membrana
que retenga las células y su posterior desecación hasta peso constante. El sistema, obviamente, no
diferencia células vivas de muertas y su sensibilidad es limitada. (Tortora et al., 2007).
INDIRECTOS
- Técnicas turbidométricas basadas en la medida de la turbidez de los medios de cultivo en los que
crecen microorganismos unicelulares. La turbidez es proporcional a la masa de las partículas en
suspensión (células) y su medida nos permite estimarla. Para ello se utiliza un equipo similar al que
se emplea en la medida de la absorbancia de luz por disoluciones coloreadas (colorímetro, por
ejemplo). Las medidas se hacen a una longitud de onda adecuada (normalmente en el entorno de
550 nm) y los valores se suelen denominar valores de densidad óptica. La limitación de este
sistema, por otra parte muy sencillo, es que no distingue células vivas de muerta y que
normalmente no es capaz de detectar densidades celulares menores a 10.000 células por mililitro.
(Universidad de Granada, 2007).
- Medida del ATP. Es una medida relativamente sencilla basada en la emisión de luz por la
luciferasa de luciérnaga (Photimus pyralis) en presencia de O2 y de ATP. De esta forma se puede
medir la concentración de ATP en un volumen dado de cultivo. Esta medida es interesante porque
la concentración de ATP decae rápidamente en las células muertas, de forma que esa medida
indirecta detecta únicamente a las células vivas. (Universidad de Granada, 2007).
Ventajas.
La turbidimetría tiene una gran variedad de aplicaciones y permite trabajar con muestras
gaseosas, liquidas e incluso con sólidos transparentes. La formación de precipitados difíciles de
filtrar, como por ejemplo los gelatinosos o los de tamaño de partícula muy pequeño, suelen
proporcionar suspensiones ideales para la aplicación de técnicas basadas en la dispersión de la luz
que sustituye a las técnicas gravimétricas. (Hernández et al., 2002)
Desventajas.
En la Fase exponencial, cada célula del medio de cultivo se divide en dos células hijas y estas en
otras dos, lo que hace que el crecimiento sea una función exponencial. En esta fase, influye la
presencia de condiciones como lo son la temperatura, presencia de aminoácidos y otros
nutrientes en el medio, que pueden aumentar o disminuir la reproducción celular. (Madigan et al,
2003).
Fase estacionaria, en esta podemos hablar de un constante número de células, dada debido a un
componente límite esencial para la reproducción, o por la acumulación de materiales de desecho
de la población, que es un factor importante junto con la falta de nutrientes y condiciones
ambientales diferentes, para que se dé la fase de muerte, en donde la población empieza a
decaer. Gráficamente, esta fase es exponencial, pero no se comporta como la fase exponencial,
por que varía el tiempo de muerte de las células. (Madigan et al, 2003).
Bibliografía.
MADIGAN, Michael T et al. Brock, biología de los microorganismos. Décima edición. Editorial
Pearson. 2003.
RAMÍREZ SANTOS, Jesús et al. La fase estacionaria en la bacteria Escherichia Coli. Revista
latinoamericana de Microbiología. 2005. Disponible en:
http://www.medigraphic.com/pdfs/lamicro/mi-2005/mi05-3_4f.pdf