ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

NGÔ THỊ QUỲNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN

DƯỢC LIỆU VÀ CAO DƯỢC LIỆU
TỪ CÂY LÁ DIỄN

(Dicliptera chinensis (L.) Ness)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2017
 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

NGÔ THỊ QUỲNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN

DƯỢC LIỆU VÀ CAO DƯỢC LIỆU
TỪ CÂY LÁ DIỄN

(Dicliptera chinensis (L.) Ness)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

KHÓA I

Người hướng dẫn:

1. PGS.TS.TRẦN VIỆT HÙNG
2. ThS.NGUYỄN THÚC THU HƯƠNG

HÀ NỘI – 2017
 LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời
điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân
thành với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời
gian qua.
Trước hết, tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc
tới PGS.TS.Trần Việt Hùng – Viện Kiểm nghiệm thuốc TP.HCM, TS.Vũ Đức
Lợi - Giám đốc trung tâm khảo thí, Chủ nhiệm bộ môn Dược liệu và Dược
học cổ truyền Khoa Y Dược, ĐHQGHN, ThS.Nguyễn Thúc Thu Hương –
giảng viên bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền Khoa Y Dược,
ĐHQGHN,đã hướng dẫn tận tình, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình thực hiện khóa luận.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, các kỹ thuật viên bộ môn
Dược liệu và Dược học cổ truyền, Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc, Bào chế
và Công nghệ dược phẩm – Khoa Y Dược, ĐHQGHN đã giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình làm thực nghiệm tại trường.
Xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, các phòng ban đã tạo mọi
điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận. Cám ơn các thầy cô Khoa Y Dược,
ĐHQGHN đã quan tâm dìu dắt và truyền kiến thức cho tôi trong 5 năm học
vừa qua.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn ủng
hộ, động viên và khích lệ tôi trong quá trình học tập và làm khóa luận.

Hà Nội, tháng 6 năm 2017

Sinh viên
Ngô Thị Quỳnh
 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
CTCT Công thức cấu tạo
DCP Dicliptera chinensis polysaccharide
DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV
DMN Dimethylnitrosamine
EtOH Ethanol
HF Bệnh sơ gan
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
HPLC
Chromatography).
NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
MeOH Methanol
MS Phương pháp khối phổ
PL Phụ lục
PTN Phòng thí nghiệm
r Hệ số tương quan.
SKLM Sắc ký lớp mỏng
TT Thuốc thử
 DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên bảng Trang

Bảng 1.1: Công thức cấu tạo của các chất có trong cây Lá diễn 10

Bảng 2.1: Cách pha dãy chuẩn quercetin để đo quang 19

Bảng 3.1: Bảng kết quả định tính các chất có trong dược liệu từ cây
27
Lá diễn
 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Tên hình, đồ thị Trang
Hình 1.1: Bộ phận trên mặt đất của cây Lá diễn 8
Hình 3.1: Thân, lá, hoa cây Lá diễn 24
Hình 3.2: Hình ảnh vi phẫu thân cây Lá diễn 25

Hình 3.3: Hình ảnh vi phẫu lá cây Lá diễn 25

Hình 3.4: Đặc điểm vi phẫu bột dược liệu từ cây Lá diễn 26
Hình 35: Đường chuẩn sự phụ thuộc của độ hấp thụ A theo nồng
28
độ quercetin
 MỤC LỤC

MỞ ĐẦU……………………………………………………………………... 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN…………………………………………………. 3

1.1. TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN DƯỢC
LIỆU VÀ CAO DƯỢC LIỆU ........................................................................... 3
1.1.1. Cách thức xây dựng tiêu chuẩn ......................................................... 3
1.1.2. Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn cơ sở nói chung.......................... 3

1.2. TỔNG QUAN VỀ CAO DƯỢC LIỆU ................................................... 4

1.2.1. Định nghĩa ......................................................................................... 4
1.2.2. Phân loại ............................................................................................ 5

1.3. TỔNG QUAN VỀ TIÊU CHUẨN THUỐC NHỎ MẮT ....................... 5

1.3.1. Tính chất: Thể chất lỏng ................................................................... 5
1.3.2. Độ trong ............................................................................................. 5
1.3.3. Kích thước tiểu phân ......................................................................... 6
1.3.4. Giới hạn cho phép về thể tích ............................................................ 6
1.3.5. Định tính ............................................................................................ 6
1.3.6. Định lượng ......................................................................................... 6
1.3.7. Độ vô khuẩn ...................................................................................... 6
1.3.8. Độ pH ................................................................................................ 6
1.3.9. Các yêu cầu kỹ thuật khác ................................................................. 7

1.4. TỔNG QUAN VỀ CÂY LÁ DIỄN ......................................................... 7

1.4.1. Đặc điểm thực vật .................................................................................... 7

1.4.1.1. Vị trí phân loại chi Dicliptera ........................................................ 7
1.4.1.2. Đặc điểm thực vật chi Dicliptera ................................................... 8
1.4.1.3. Số lượng loài và sự phân bố các loài thuộc chi Dicliptera ............ 9
1.4.2. Thành phần hóa học .......................................................................... 9
1.4.3. Tác dụng sinh học............................................................................ 11
1.4.3.1. Công dụng, chỉ định và phối hợp trong dân gian ......................... 11
1.4.3.2. Tác dụng dược lý đã được nghiên cứu ......................................... 11
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……….. 13

2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ..................................................................... 13

2.1.1. Nguyên vật liệu................................................................................ 13
2.1.1.1. Dược liệu Lá diễn ......................................................................... 13
2.1.1.2. Chiết xuất và phân đoạn cao khô dược liệu Lá diễn .................... 13
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................... 13
2.1.3. Hóa chất ........................................................................................... 13
2.1.4. Trang thiết bị, dụng cụ .................................................................... 14

2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 14

2.2.1. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu từ cây Lá diễn ...................... 14
2.2.1.1. Mô tả............................................................................................. 14
2.2.1.2. Vi phẫu ......................................................................................... 15
2.2.1.3. Bột : Làm tiêu bản , soi bột dưới kính hiển vi. ............................ 15
2.2.1.4. Mất khối lượng do làm khô .......................................................... 15
2.2.1.5. Tro toàn phần ............................................................................... 15
2.2.1.6. Kim loại nặng ............................................................................... 15
2.2.1.7. Tỷ lệ vụn nát ................................................................................. 15
2.2.1.8. Định tính ....................................................................................... 16
2.2.1.9. Định lượng.................................................................................... 17
2.2.2. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao khô dược liệu từ cây Lá diễn ........ 17
2.2.2.1. Tính chất ....................................................................................... 17
2.2.2.2. Mất khối lượng do làm khô .......................................................... 17
2.2.2.3. Độ mịn .......................................................................................... 17
2.2.2.4. Độ PH ........................................................................................... 18
2.2.2.5. Định tính ....................................................................................... 18
2.2.2.6. Định lượng.................................................................................... 18
2.2.2.7. Tro toàn phần ............................................................................... 21
2.2.2.8. Kim loại nặng (Pb) ....................................................................... 21
2.2.2.9. Độ vô khuẩn. ................................................................................ 22

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ………………………………. 23

3.1. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu từ cây Lá diễn ............................ 23
 3.1.1. Mô tả............................................................................................. 23
3.1.2. Vi phẫu ......................................................................................... 23
3.1.3. Bột ................................................................................................ 25
3.1.4. Mất khối lượng do làm khô .......................................................... 26
3.1.5. Tro toàn phần ............................................................................... 26
3.1.6. Kim loại nặng: không quá 10ppm. ............................................... 26
3.1.7. Tỷ lệ vụn nát ................................................................................. 26
3.1.8. Định tính ....................................................................................... 27
3.1.9. Định lượng.................................................................................... 27

3.2. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao khô dược liệu từ cây Lá diễn .............. 27
3.2.1. Tính chất ....................................................................................... 27
3.2.2. Mất khối lượng do làm khô .......................................................... 27
3.2.3. Độ mịn .......................................................................................... 27
3.2.4. Độ PH ........................................................................................... 27
3.2.5. Định tính ....................................................................................... 27
3.2.6. Định lượng.................................................................................... 27
3.2.7. Tro toàn phần ............................................................................... 28
3.2.8. Kim loại nặng ............................................................................... 28
3.2.9. Độ vô khuẩn ................................................................................. 28

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………………. 29

Kết luận .................................................................................................. 29

Kiến nghị................................................................................................ 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………....31

 MỞ ĐẦU

Ngày nay trên thế giới, xu hướng tìm kiếm và sử dụng các sản phẩm
chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc tự nhiên ngày càng tăng. Con người có
khuynh hướng sử dụng nhiều thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên. Việt Nam
chúng ta cũng không nằm ngoài xu hướng đó. Điều kiện tự nhiên ưu đãi cho
đất nước ta có hệ sinh thái phong phú và đa dạng, có tiềm năng to lớn về tài
nguyên cây thuốc. Đất đai và khí hậu nhiệt đới gió mùa phù hợp với nhiều
loại cây trồng, trong đó có nhiều loài cây thuốc quý. Đây chính là tiền đề tốt
để ngành Dược phát triển thuốc từ Dược liệu [18].
Cây Lá diễn (Dicliptera chinensis (L.) Ness) là loài thực vật phổ biến ở
một số tỉnh ở Việt Nam. Lá diễn không chỉ dùng làm thực phẩm ăn hàng ngày
mà còn được sử dụng làm thuốc với nhiều công dụng như: chữa cảm mạo, sốt,
đau mắt đỏ, viêm họng sưng đau, làm mát gan… Tuy nhiên, cho tới nay
những nghiên cứu về thành phần hóa học, tác dụng dược lý của cây vẫn còn
hạn chế. Hầu như chưa có tiêu chuẩn đầy đủ nào để làm thước đo đánh giá
chất lượng của dược liệu này; xây dựng một tiêu chuẩn để định danh, chống
nhầm lẫn và xác định hàm lượng các thành phần có tác dụng dược lý trong
dược liệu là việc làm rất cần thiết, không những góp phần vào việc đầy lùi các
sai phạm trên, mà còn đảm bảo chất lượng nguồn nguyên liệu, chống sử dụng
nhầm lẫn dược liệu giả đang tràn lan trên thị trường đồng thời ứng dụng làm
thuốc hay sản xuất thuốc [19].
Ngày nay cùng với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật và
công nghệ, các dược liệu được tổng hợp được ứng dụng rộng rãi và sử dụng
ngày càng nhiều. Vì vậy, để phát huy tiềm năng của nguồn dược liệu đáp ứng
yêu cầu chăm sóc sức khỏe nhân dân chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu và
chiết xuất dược liệu Lá diễn thành dạng cao bột khô. Một trong số đó là vấn
đề xây dựng các tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu đồng thời xây dựng tiêu
chuẩn cơ sở cho cao dược liệu Lá diễn. Đây cũng là một yếu tố cấp bách đối
với các nhà nghiên cứu dược liệu. Để có thể sử dụng dược liệu làm nguyên
liệu làm thuốc thì đòi hỏi cần phải xây dựng các tiêu chuẩn chất lượng, đồng
thời xây dựng các phương pháp thử để đánh giá các tiêu chuẩn đó [20].

1
 Từ những lý do trên, chúng tôi nhận thấy Lá diễn là một loại dược-
thực phẩm quý cần được nghiên cứu và phát triển. Để có thể tận dụng được
nguồn dinh dưỡng cũng như các dược tính quý của cây Lá diễn, góp phần đa
dạng hóa các sản phẩm, nâng cao giá trị thương mại của cây Lá diễn. Vì vậy
chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“ Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn dược liệu và cao dược liệu từ
cây Lá diễn” với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở dược liệu từ cây Lá diễn
2. Xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở cao khô dược liệu từ cây Lá diễn
.

2
 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN
DƯỢC LIỆU VÀ CAO DƯỢC LIỆU
Hiện nay, các nghiên cứu về dược liệu đang được chú trọng và phát
triển. Tuy nhiên trong báo cáo, Cục Quản lý Y, Dược cổ truyền đã đưa ra
những con số báo động, hàng năm, ngành dược Việt Nam sử dụng khoảng
60.000 tấn dược liệu các loại, trong đó có khoảng 80-85% nhập khẩu (chủ yếu
nhập từ Trung Quốc). Như vậy, hiện nay mới chỉ có khoảng 1.400 tấn dược
liệu nhập khẩu có nguồn gốc rõ ràng là rất ít so với nhu cầu sử dụng dược liệu
hiện nay. Qua đây có thể thấy tình hình dược liệu vận chuyển lậu đang diễn
biến phức tạp. Ngoài số liệu dược liệu không rõ nguồn gốc thì hiện người tiêu
dùng cũng đang phải đối mặt với những nguy cơ sử dụng các loại dược liệu
kém chất lượng, giả. Việc thông quan dược liệu qua cửa khẩu còn rất nhiều
hạn chế. Tại các cửa khẩu, cán bộ hải quan chỉ kiểm tra được số lượng, trọng
lượng bao hàng, không kiểm tra được chất lượng các dược liệu do việc xây
dựng các tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu và các sản phẩm từ dược liệu còn
hạn chế và một số các loại dược liệu còn chưa có tiêu chuẩn nào cụ thể [5,6].
1.1.1. Cách thức xây dựng tiêu chuẩn
Tiêu chuẩn cơ sở được xây dựng dựa trên các kết quả nghên cứu khoa
học và công nghệ, tiến bộ kỹ thuật, kinh nghiệm, nhu cầu và khả năng thực
tiễn. Các tiêu chuẩn quốc gia tưng ứng được khuyến khích sử dụng để xây
dựng hoặc chấp nhận thành tiêu chuẩn cơ sở [6].
1.1.2. Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn cơ sở nói chung
❖ Tiêu chuẩn cơ sở có thể được xây dựng theo những phương thức cơ bản
sau:
Chấp nhận tiêu chuẩn quốc gia, tiêu chuẩn khu vực hoặc tiêu chuẩn
nước ngoài tương ứng thành tiêu chuẩn cơ sở. Ví dụ như đối với việc xây
dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu ta tham khảo Dược điển VN IV, Dược điển
nước ngoài như: Dược điển Anh, Mỹ, Trung Quốc làm tài liệu tham chiếu.
Sửa đổi, bổ sung tiêu chuẩn cơ sở hiện hành.

3
 Xây dựng mới tiêu chuẩn cơ sở trên cơ sở sử dụng các kết quả nghiên
cứu khoa học và công nghệ, các kết quả thử nghiệm, đánh giá, phân tích và
thực nghiệm. Đây chính là phương pháp mà bài báo cáo khóa luận này chúng
tôi muốn hướng tới để xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở dược liệu và tiêu
chuẩn cơ sở cao dược liệu từ cây Lá diễn. Đồng thời dựa trên cơ sở các quy
định tại Dược điển Việt Nam và các văn bản pháp luật liên quan [3, 4].
❖ Thông thường sẽ dựa vào các phương pháp sau để xây dựng tiêu chuẩn
cơ sở:
Phương pháp cảm quan: bằng sự quan sát về hình dạng, thể chất, mầu
sắc, mùi vị…chúng ta có thể nhận biết được từng vị dược liệu, cao dược liệu
hay các sản phẩm từ chúng. Phương pháp này chúng ta có thể xác định sơ bộ
được tên, bộ phận dùng, công dụng.
Phương pháp vi học: Bao gồm quan sát các đặc điểm vi học trên vi
phẫu và trên bột của dược liệu. Đối với vi phẫu ta cần phải cắt và nhuộm một
vi phẫu dược liệu, lên tiêu bản vi phẫu, lên tiêu bản bột, nhận biết và chỉ được
các đặc điểm vi phẫu, các đặc điểm cảu bột Dược liệu.
Phương pháp hóa học: bao gồm các phương pháp định tính, định lượng
qua các giai đoạn như chiết xuất, các phản ứng định tính hoặc định lượng, các
phản ứng hóa học trên vi phẫu hoặc trong các phản ứng vi thăng hoa.
Một số phương pháp khác như xác định độ ẩm, hàm lượng tro, tỷ lệ vụn
nát, tạp chất, độ nhiễm khuẩn…
1.2. TỔNG QUAN VỀ CAO DƯỢC LIỆU
1.2.1. Định nghĩa
Cao thuốc là chế phẩm được chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất
quy định các dịch chiết thu được từ dược liệu, thực vật hay động vật với các
dung môi thích hợp.
Các dược liệu trước khi chiết xuất được xử lý sơ bộ (sấy khô và chia
nhỏ đến kích thước thích hợp). Đối với một số dược liệu đặc biệt có chứa men
làm phân hủy hoạt chất cần phải diệt men trước khi đưa vào sử dụng bằng
cách dùng hơi cồn sôi, hơi nước sôi hoặc bằng phương pháp thích hợp khác.

4
1.2.2. Phân loại
Cao thuốc được chia làm 3 loại:
Cao lỏng: Là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử
dụng trong đó cồn và nước đóng vai trò dung môi chính (hay chất bảo quản
hay cả hai). Nếu không có chỉ dẫn khác, quy ước 1 ml cao lỏng tương ứng với
1 g dược liệu dùng để điều chế cao thuốc.
Cao đặc: Là khối đặc quánh. Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại
trong cao không quá 20%.
Cao khô: Là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm. Cao
khô không được có độ ẩm lớn hơn 5%. Dịch chiết được cô đặc đến khi độ ẩm
còn lại không quá 20% ta được cao đặc. Trong trường hượp điều chế cao khô,
tiếp tục sấy khô để độ ẩm còn lại không quá 5%. Để đạt đến thể chất quy
định, quá trình cô đặc và sấy khô dịch chiết thường được tiến hành trong các
thiết bị cô dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 60 oC. Nếu không có các
thiết bị cô đặc và sấy dưới áp suất giảm thì được phép cô cách thủy (không
được cô trực tiếp trên lửa) và sấy ở nhiệt độ không quá 80 oC [2, 4].
1.3. TỔNG QUAN VỀ TIÊU CHUẨN THUỐC NHỎ MẮT
Với định hướng nghiên cứu cao phân đoạn để làm nguyên liệu làm
thuốc nhỏ mắt nên trong khóa luận này tôi xin lấy tổng quan tiêu chuẩn thuốc
nhỏ mắt làm nền tảng để xây dựng tiêu chuẩn cao khô phân đoạn từ cây Lá
diễn.
Các chế phẩm thuốc nhỏ mắt phải đáp ứng các yêu cầu chất lượng
chung như sau [3, 4].
1.3.1. Tính chất: Thể chất lỏng ( linh động - nước; sánh - hỗn dịch ), màu
sắc.
1.3.2. Độ trong
Thuốc nhỏ mắt dung dịch phải đảm bảo về độ trong, không có các tiểu
phần quan sát được bằng mắt thường (thử theo PL 11.8 phần B).

5
1.3.3. Kích thước tiểu phân
Áp dụng cho thuốc nhỏ mắt dạng hỗn dịch, thử theo phụ lục 11.8 phần
A. Lấy một thể tích chế phẩm tương ứng với 10µg của pha rắn cho vào buồng
đém hoặc đưa lên lame và quan sát dưới kính hiểm vi có độ phóng đại thích
hợp.
Trong 1 mẫu đo:
Không được có quá 20 tiểu phân có kích thước lớn hơn 25 µm.
Không được có quá 2 tiểu phân có kích thước lớn hơn 50 µm.
Không có tiểu phân nào có kích thước lớn hơn 90 µm.
1.3.4. Giới hạn cho phép về thể tích
Giới hạn cho phép của mọi thể tích là +10% so với thể tích ghi trên
nhãn ( PL 11.1 DĐVN IV).
Thuốc rửa mắt nhiều liều phải đóng gói không quá 200 ml cho 1 đơn vị
đóng gói nhỏ nhất.
1.3.5. Định tính
Chế phẩm phải có các phản ứng hóa học đặc trưng của các thành phần
hoạt chất có trong chế phẩm.
1.3.6. Định lượng
Hàm lượng của các hoạt chất có trong chế phẩm phải nằm trong giới
hạn cho phép sau khi được thử bằng phương pháp thích hợp.
1.3.7. Độ vô khuẩn
Chế phẩm thuốc nhỏ mắt pải hoàn toàn vô khuẩn như quy định đối với
thuốc tiêm. ( PL 13.7 DĐVN IV).
1.3.8. Độ pH
pH của dung dịch đem thử phải nằm trong giới hạn quy định ( PL 6.2
DĐVN IV).
pH là đại lượng cho biết tính acid, tính kiềm của một dung dịch. Nước
mắt có độ pH trung tính, nghĩa là không có tính acid hay tính kiềm (pH của

6
nước mắt trong khoảng 7,4-7,6), do đó tốt nhất thuốc nhỏ mắt nên có độ pH
bằng với pH của nước mắt. Khi pha chế thuốc nhỏ mắt, nhà bào chế phải cân
nhắc, tính toán, lựa chọn độ pH sao cho vừa có tác dụng ổn định hoạt chất của
thuốc, vừa giúp mắt không bị kích ứng và đáp ứng tốt trong điều trị. rất mạnh
đối với mắt.
1.3.9. Các yêu cầu kỹ thuật khác
Thử theo quy định trong chuyên luận riêng.
Đối với dạng chế phẩm khô, dùng để pha thuốc nhỏ mắt trước khi
dùng, sau khi pha phải đáp ứng các yêu cầu chất lượng của thuốc nhỏ mắt.
Đối với chế phẩm đóng liều đơn phải đáp ứng các yêu cầu về phép thử độ
đồng đều hàm lượng hoặc độ đồng đều khối lượng (PL 11.2 hoặc 11.3 DĐVN
IV), trừ khi có chỉ dẫn khác.
1.4. TỔNG QUAN VỀ CÂY LÁ DIỄN
1.4.1. Đặc điểm thực vật

Lá diễn Dicliptera chinensis (L.) Ness, thuộc bộ Hoa Môi (Lamiales),

họ Ô rô – Acanthaceae, chi Dicliptera , loài Chinensis hay còn gọi là cây
gan heo [12,15].
1.4.1.1. Vị trí phân loại chi Dicliptera
Theo “Hệ thống phân loại về ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)” của tác
giả A. Takhtajan, chi Dicliptera có vị trí phân loại như sau [15]:
Giới Thực vật: Plantae
Ngành Ngọc lan: Magnolipphyta
Lớp Cỏ Tháp Bút: Equisetopsida C. Agardh
Phân lớp Mộc Lan: Magnoliidae Novák ex Takht
Bộ Bạc Hà: Lamiales
Họ Ô Rô: Acanthaceae
Chi: Dicliptera

7
 1.4.1.2. Đặc điểm thực vật chi Dicliptera
Chi Dicliptera Juss, họ Ô rô - Acanthaceae
Cây cỏ mọc tỏa ra. Lá mọc đối. Cụm hoa gồm nhiều đầu nhỏ có nhiều
hoa giữa hai lá bắc mọc đối, mỗi hoa có ở gốc hai lá bắc con; các đầu xếp
thành xim ở nách lá hay ở ngọn. Đài hoa gồm năm lá đài. Tràng 2 môi, với
ống gần hình, hơi loe ở đỉnh; môi trên 2 thùy hay nguyên, môi dưới 3 thùy.
Nhị 2, đính trên ống tràng, với 2 ô phấn, thường không đều, đĩa mật hình đấu.
Bầu chứa noãn trong mỗi ô. Qủa nang, với 4 giá noãn, tách ra khi chín; hạt
hình thấu kính [14,15].
D. chinensis (L.) Ness – Cây gan heo

Hình 1.1: Bộ phận trên mặt đất của cây Lá diễn

Mô tả: Cây thảo sống hằng năm hay vài ba năm, cao 30-80cm. Thân và
cành non có 4 cạnh, có lông tơ, các mấu phình to tựa như đầu gối. Lá mọc đối
màu xanh lục, phiến lá hình trứng thuôn, dài 2-7cm, rộng 2-4cm, đầu và gốc
đều nhọn. Quả nang ngắn có lông tơ ở phía đầu. Hạt dẹt. Ra hoa từ mùa đông
đến mùa hạ [14].
Bộ phận dùng: Toàn cây - Diclipterae Chinensis.
Nơi sống và thu hái: Cây của vùng lục địa Ðông Nam á châu, mọc
hoang ở chỗ ẩm ướt. Có thể thu hái toàn cây quanh năm, dùng tươi hay phơi
khô.
Tính vị, tác dụng: Lá diễn có vị khổ (đắng), tính hàn (lạnh), quy 2 kinh
Tâm, Can. Có tác dụng thanh nhiệt, mát gan, lương huyết gải độc, lợi liệu.
Dùng chữa cảm mạo phát sốt, ban đầu do nhiệt bệnh, đại tiện xuất huyết, tiểu

8
tiện xuất huyết, tiểu nhỏ giọt, phòng trị viêm não B, phong thấp viêm khớp.
Dùng ngoài giã nát đắp chữa mụn nhọt sưng đau [12, 14, 15].
1.4.1.3. Số lượng loài và sự phân bố các loài thuộc chi Dicliptera
Trên thế giới, chi Dicliptera (họ Acanthaceae) bao gồm hơn 150 loài
vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Chi này phân bố ở Châu Á: Trung Quốc, Lào,
Campuchia, Thái Lan, Indonesia, Malaysia, châu Phi, châu Úc và U.S.A.
Ở Việt Nam cây gan heo mọc hoang và được trồng ở nhiều địa phương
các tỉnh miền núi và trung du phía bắc như: Nam Định, Cao Bằng (Thạch
An), Lạng Sơn (Văn Quan), Bắc Kạn (chợ Đồn),Thái Nguyên, Tuyên Quang,
Quảng Ninh, Sơn La ...[8, 12].
1.4.2. Thành phần hóa học

Thành phần hóa học có vai trò quan trọng giúp làm sáng tỏ công dụng,
tác dụng dược lý, tác dụng sinh học…. của chi Dicliptera nói chung và cây Lá
diễn nói riêng [14,17, 22, 24].
Trong nghiên cứu của Gao YT, Yang XW và đồng nghiệp lại cho thấy
loài D. chinensis có chứa bảy hợp chất được phân lập từ dịch chiết ethyl
acetate. Các hợp chất được tách bằng sắc ký cột silica gel, sắc ký lớp mỏng
(SKLM) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), cấu trúc của chúng đã được
xác định bằng các phương pháp phổ UV, NMR và MS. Cấu trúc của chúng
được xác định là:
o Octasulphur
o Secoisolariciresinol dimethyl ether diacetate
o 5-methoxy-44'-di-O-methyl secoisolariciresinol
o Chinensis naphthol methyl ester
o Loliolide
o Beta -sitosterol 3-O-beta-D-glucopyranoside
o Stigmasterol 3-O-beta-D-glucopyranoside

9
Bảng 1.1. Công thức cấu tạo của các chất có trong cây Lá diễn.

STT Hoạt chất CTCT

1 Octasulphur

O
OH
OH
HO
secoisolariciresinol dimethyl
2
ethe diacetat
O
OH

H
O
OH
OH
O H

5-methoxy-4,4'-di-O-methyl
3
secoisolariciresinol H 3C
O
O CH 3

CH 3

H3C
O O

O
O
O

4 chinensis naphthol methyl este

O

O CH3
H3C

H3C
CH3

5 Loliolid O

HO O
CH3

10
 OH
HO OH

OH O O CH3
beta -sitosterol 3-O-beta-D- O O
6 O

glucopyranosid HO O

OH
OH

H3C
CH3
HO H CH3
Stigmasterol 3-O-beta-D- CH3 H
7 HO
O
glucopyranosid H H H
HO O
OH

1.4.3. Tác dụng sinh học

1.4.3.1. Công dụng, chỉ định và phối hợp trong dân gian
Toàn cây dùng để chữa cảm mạo, sốt cao, lên sởi, viêm phổi nhẹ, viêm
ruột thừa cấp, viêm gan cấp, viêm kết mạc, viêm ruột, kiết lỵ, viêm khớp,
giảm niệu, đái ra dưỡng chấp. Ngày dùng 30-60g dược liệu là toàn cây khô
hoặc dùng 60-120g cây tươi sắc lấy nước uống. Dùng ngoài trị ghẻ lở, rôm
sẩy, mụn nhọt, dùng lá tươi giã nát xoa lên hoặc đắp [4, 15, 21, 22].
1.4.3.2. Tác dụng dược lý đã được nghiên cứu
Tác dụng trên gan

Cây lá diễn có nhiều tác dụng dược lý khác nhau nhưng các nghiên cứu
chủ yếu tập trung vào tác dụng trên gan. Đã có nhiều nghiên cứu liên quan
đến tác dụng chữa bệnh xơ gan và đã có một số kết quả khả quan [25, 28,
30].

Tác dụng chống viêm

Dicliptera chinensis có hiệu quả đáng kể trong việc cải thiện xơ gan,
giảm viêm, hoại tử. Trong nghiên cứu này, các nhà nghiên cứu tiếp tục nghiên
DCP có tác dụng hoạt động đối kháng trên nhiễm độc gan ở chuột HF gây ra
bởi DMN, các cơ chế sinh học có liên quan đến điều tiết chức năng enzyme

11
huyết thanh, cải thiện chức năng trao đổi chất và ức chế phản ứng viêm trong
mô gan [27, 29, 30].

Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm

Năm 2013, Ahmad B và một nhà khoa học đã nghiên cứu hoạt động
kháng khuẩn, kháng nấm và diệt côn trùng của Dicliptera chinensis Hook.F.
Cho kết quả Dicliptera chinensis có tính kháng khuẩn và kháng nấm [21, 22,
23].

12
 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
2.1.1.1. Dược liệu Lá diễn
Dùng lá của cây Lá diễn thu hái tại TT.Cổ Lễ, huyện Trực Ninh, tỉnh
Nam Định. Mẫu tiêu bản đã được giám định tên khoa học tại Viện sinh thái và
tài nguyên sinh vật bao gồm cả cơ quan sinh dưỡng và cơ quan sinh sản.
Cắt nhỏ phơi hoặc sấy khô lá cây Lá diễn, đóng gói và bảo quản để
tiến hành làm thực nghiệm.

2.1.1.2. Chiết xuất và phân đoạn cao khô dược liệu Lá diễn
Mẫu lá cây lá diễn được phơi khô, nghiền thành bột (6,5 kg), sau đó
chiết trong methanol (3×8 lít) bằng thiết bị chiết siêu âm (50 0C, 3 h). Dịch
chiết được lọc qua giấy lọc, gộp dịch chiết lại và cất loại dung môi ở áp suất
giảm thu được 630,0 g cặn chiết methanol. Lấy 120 g cặn chiết này phân tán
vào 1,2 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố lần lượt với n-hexan và
ethylacetat (mỗi loại 3×1,5 lít). Các dịch chiết n- hexan, ethylacetat được cất
thu hồi dung môi thu được các cặn dịch tương ứng n- hexan (H, 31,0 g) và (E,
56,0 g) và lớp nước (N, 33,0 g). Dùng phân đoạn N để nghiên cứu xây dựng
tiêu chuẩn cao phân đoạn

2.1.2. Đối tượng nghiên cứu

Lá diễn phơi hoặc sấy khô được đóng gói bảo quản nơi khô ráo để làm
thực nghiệm.
Dùng phân đoạn N để nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cao phân đoạn.
2.1.3. Hóa chất
Các loại thuốc thử dùng trong định tính: TT Mayer, Dragendoft,
Buncharat, Balijet, Legal, Kelle-Killari, Felling, ninhydrin…..
Chất đối chiếu: Chất chuẩn PTN quercetin hàm lượng 99,0%.
Dung môi, hóa chất: EtOH 960, 900 , n-hexan, ethylacetate, Cloroform,
MeOH, AlCl3, NaOH, H2SO4 đặc, phenol, NaNO2, Nước cất 1 lần.

13
 Một số hóa chất khác dùng cho phản ứng: H2S04, Na2C03, Na0H 10%,
FeCl3 5%, NH3… và các hóa chất khác thuộc Khoa Y Dược Đại học Quốc
Gia Hà Nội [1],[ 3],[ 4].
2.1.4. Trang thiết bị, dụng cụ
• Máy quang phổ UV- VIS Cary 60.
• Máy siêu âm Utrasonic cleaner- MRC.
• Máy đo pH AL 20 pH- Aqualitic.
• Máy ly tâm HSCEN- 204- MRC.
• Máy lắc xoay điện Velp- Zx3.
• Cân phân tích AUW 220.
• Phễu lọc G3
• Nồi cách thủy
• Các dụng cụ thủy tinh khác: Bình định mức, pipet, cốc có mỏ,…
• Micropipet
• Các máy xay dược liệu, bếp điện, bếp đun cách thủy, kính hiển vi…
• Các dụng cụ thí nghiệm khác thuộc Khoa Y dược Đại học Quốc gia
Hà Nội [1].
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu từ cây Lá diễn
Dựa trên các tiêu chí trong Dược điển Việt Nam 4 về tiêu chuẩn
dược liệu:
• Mô tả
• Vi phẫu
• Soi bột
• Mất khối lượng do làm khô
• Tro toàn phần
• Tỷ lệ vụn nát
• Định tính
• Định lượng
• Kim loại nặng
2.2.1.1. Mô tả

14
 Dựa vào cảm quan. Kiểm tra hình thái, mầu sắc, mùi vị, kích thước
bằng cách đo trực tiếp. Mẫu dược liệu phải đạt tiêu chuẩn đã yêu cầu.
2.2.1.2. Vi phẫu
Cắt, tẩy, nhuộm và lên tiêu bản của lá và thân cây Lá diễn, tiến hành soi
trên kính hiển vi.
2.2.1.3. Bột : Làm tiêu bản , soi bột dưới kính hiển vi.
2.2.1.4. Mất khối lượng do làm khô
Dược liệu phải được làm thành mảnh nhỏ đường kính không quá 3 mm;
lượng đem thử từ 2 g đến 5 g; chiều dày lớp mẫu thử đem sấy là 5 mm và
không quá 10 mm đối với dược liệu có cấu tạo xốp. Nhiệt độ và thời gian sấy
theo yêu cầu của chuyên luận riêng (PL9.6 DĐVN IV).
2.2.1.5. Tro toàn phần
Cho 2 - 3 g bột đem thử vào một chén sứ hoặc chén platin đã nung và
cân bì. Nung ở nhiệt độ không quá 450 oC tới khi không còn carbon, làm
nguội rồi cân. Bằng cách này mà tro chưa loại được hết carbon thì dùng một ít
nước nóng cho vào khối chất đã than hoá, dùng đũa thuỷ tinh khuấy đều, lọc
qua giấy lọc không tro. Rửa đũa thuỷ tinh và giấy lọc, tập trung nước rửa vào
dịch lọc. Cho giấy lọc và cắn vào chén nung rồi nung đến khi thu được tro
màu trắng hoặc gần như trắng. Hợp dịch lọc vào cắn trong chén nung, đem
bốc hơi đến khô rồi nung ở nhiệt độ không quá 450 oC đến khi khối lượng
không đổi. Tính tỷ lệ phần trăm của tro toàn phần theo dược liệu đã làm khô
trong không khí (PL 9.8 DĐVN IV).
2.2.1.6. Kim loại nặng
Lấy 1,0 g chế phẩm, tiến hành theo phương pháp 3 (Phụ lục 9.4.8,
DĐVN IV).Dùng 1,0 ml dung dịch mẫu 10 ppm (TT) để chuẩn bị mẫu đối
chiếu.
2.2.1.7. Tỷ lệ vụn nát
Cân một lượng dược liệu nhất định (p gam) đã được loại tạp chất. Rây
qua rây có số quy định theo chuyên luận riêng. Cân toàn bộ phần đã lọt qua

15
rây (a gam). Tính tỷ lệ vụn nát (X%) (từ kết quả trung bình của ba lần thực
hiện) theo công thức:

a
X%   100
p

2.2.1.8. Định tính

Phản ứng hóa học đặc trưng
Chiết xuất: Các thành phần trong dược liệu (cành lá đã phơi sấy khô)
được tách ra từ các phân đoạn nhờ các dung môi có độ phân cực khác nhau
như ether, cồn, nước… để có được dịch chiết phù hượp cho từng phản ứng
hóa học đặc trưng trước khi tiến hành định tính.
Định tính Flavonoid:
Có nhiều phương pháp để phát hiện flavonoid chẳng hạn như:
a. Nhận biết bằng hơi amoniac:
Dịch chiết lá diễn chấm lên giấy lọc sau đó cho vào lọ bão hòa hơi
amoniac. Vết flavonoid thường cho màu vàng.
b. Tác dụng với H2SO4 đậm đặc:
Hòa tan hượp chất chứa flavonoid vào H2SO4 đậm đặc: flavon và
flavonol cho màu vàng đậm đến màu da cam và có phát huỳnh quang đặc biệt.
Chalcon, aurone cho màu đỏ hoặc xanh dương-đỏ. Flavanon cho màu từ cam
đến đỏ.
c. Tác dụng với dung dịch 1% NaOH/etanol:
Nhỏ dung dịch NaOH vào một dung dịch flavonoid hòa tan trong
etanol, sẽ có màu từ vàng đến cam đỏ.
d. Phản ứng Cyanidin của Wilstatter:
Phản ứng khử bằng bột Mg trong HCl/etanol.
Cho vào ống nghiệm khoảng 2 ml mẫu thử; thêm vào 1 ml ancol tert-
butyl hoặc ancol isoamyl; 0,5 ml HCl đậm đặc; 3-5 hạt Mg kim loại. Đun nhẹ

16
trong vài phút; lớp ancol ở trên sẽ xuất hiện màu. Nếu là Flavon; flavanon;
flavanonol; xanthone sẽ cho màu cam; đỏ; tím.
Nếu dùng bột kẽm thay thế bột Mg, thì chỉ có flavanonol cho màu hồng
nhạt hoặc không màu.
2.2.1.9. Định lượng
Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV- VIS) bằng
cách xây dựng đường chuẩn, sử dụng chất chuẩn là quercetin và máy quang
phổ UV-VIS Cary 60.
2.2.2. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao khô dược liệu từ cây Lá diễn
Dựa trên các tiêu chí tiêu chuẩn chung của cao khô dược liệu theo
Dược điển Việt Nam 4:
• Tính chất
• Mất khối lượng do làm khô
• Độ mịn
• Độ PH
• Định tính
• Định lượng
• Tro toàn phần
• Kim loại nặng
• Độ nhiễm khuẩn
2.2.2.1. Tính chất: Thử bằng cảm quan, chế phẩm phải đạt các yêu cầu đã
nêu.
2.2.2.2. Mất khối lượng do làm khô
Tiến hành theo phương pháp xác định mất khối lượng do làm khô ( Phụ
lục 9.6, DĐVN IV) như đối với dược liệu Lá diễn.
Cao khô phân đoạn phải được làm thành mảnh nhỏ đường kính không
quá 3 mm; lượng đem thử từ 2 g đến 5 g; chiều dày lớp mẫu thử đem sấy là 5
mm và không quá 10 mm nếu có cấu tạo xốp. Nhiệt độ và thời gian sấy theo
yêu cầu của chuyên luận riêng.
2.2.2.3. Độ mịn

17
 Tiến hành xác định độ mịn của bột theo phụ lục 3.5, DĐVN IV. Lấy
20g chế phẩm, không ít hơn 95% phần tử qua được rây số 355 và không quá
40% qua được rây số 180.
2.2.2.4. Độ PH: tiến hành đo độ PH bằng máy đo PH AL 20-Aqualitic.
2.2.2.5. Định tính: Đối với cao khô ta cần định tính Flavonoid là chất có
hoạt chất sinh học chính trong dược liệu Lá diễn.
Phản ứng hóa học
Lấy khoảng 2g bột dược liệu, thêm 10ml ethanol 90%. Đun sôi trong 3
phút, để nguội, lọc. Lấy 2ml dịch lọc, pha loãng với 10ml ethanol 90% rồi
chia vào 3 ồng nghiệm để làm các phản ứng sau:
Ống 1: Thêm 5 giọt acid hydrocloric đậm đặc (TT) và ít bột magnesi,
dung dịch chuyển dần từ màu vàng nhạt sang màu tím đỏ.
Ống 2: Thêm 2 giọt dung dịch natri hydroxyl 20% (TT), xuất hiện màu
vàng đậm.
Ống 3: Thêm 2 giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% (TT), dung dịch có
màu nâu tím.
2.2.2.6. Định lượng [4, 10, 17].
Flavonoid toàn phần trong Lá diễn có thể chiết xuất bằng dung môi
methanol hoặc ethanol [17, 26]. Để chiết flavonoid toàn phần từ dược liệu có
các phương pháp sau : phương pháp ngâm, phương pháp siêu âm, chiết
soxhlet… Trong đó phương pháp chiết bằng siêu âm chiết kiệt được flavonoid
toàn phần trong dược liệu, rút ngắn thời gian chiết, cách tiến hành đơn giản.
Qua tham khảo tài liệu và sau khi khảo sát sơ bộ chúng tôi lựa chọn chiết
flavonoid toàn phần trong Lá diễn bằng phương pháp siêu âm sử dụng dung
môi MeOH [24, 28].
Dung dịch thử gốc: Cân chính xác khoảng 0.4 g cao phân đoạn (dùng
phân đoạn N để nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn) vào cốc có mỏ, thêm 2.0 ml
MeOH, lắc cho tan cao rồi chuyển vào bình định mức 10.0 ml, lấy MeOH
tráng cốc 2 lần và thêm đến vạch được dung dịch thử gốc. Từ dung dịch trên

18
lấy chính xác 1ml cho vào bình định mức 50.0 ml và thêm đến vạch bằng
MeOH được dung dịch thử gốc có độ hấp thụ quang A ( 0.2-0.8 Abs).

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc

Dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác khoảng 10.0 mg quercetin cho
vào bình định mức dung tích 10.0 ml, hòa tan và thêm đến vạch bằng MeOH.
Thu được dung dịch quercetin chuẩn nồng độ 1mg/ml. Từ dung dịch này pha
loãng bằng MeOH thành dung dịch quercetin chuẩn gốc có nồng quercetin
100 µg/ml bằng cách lấy 10ml dung dịch chuẩn gốc trên cho vào bình định
mức 100.0 ml và thêm MeOH đến vạch.

Chuẩn bị dung dịch để đo quang

Chuẩn bị dung dịch thử: Lấy 1,0ml dung dịch thử gốc cho vào bình
định mức dung tích 10.0 ml. Thêm vào bình 4ml nước cất, 0.3ml NaNO2 5%;
0.5 ml dung dịch AlCl3/EtOH 5%; 2 ml NaOH 1M lắc đều. Sau khoảng 20
phút thêm nước cất vừa đủ 10ml lắc đều đem đi đo độ hấp thụ.
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: pha 1 dãy dung dịch chuẩn quercetin có
nồng độ biến thiên trong khoảng 5-50 µg/ml theo bảng 3.
Bảng 2.1: Cách pha dãy chuẩn quercetin để đo quang.

Dung dịch chuẩn 1 2 3 4 5 6

Nồng độ quercetin
5 10 20 30 40 50
(µg/ml)
Dung dịch gốc
quercetin 100µg/ml 1.25 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5
(ml)

NaNO2 5% (ml) 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75

AlCl3/EtOH 5% (ml) 1.25 1.25 1.25 1.25 1.25 1.25

NaOH 1M (ml) 5 5 5 5 5 5

19
 Lắc đều. Sau khoảng 20 phút thêm nước cất vừa đủ 25ml, lắc đều, đem
đi đo độ hấp thụ.
Chuẩn bị mẫu trắng: thay 1.0ml dung dịch thử bằng 1.0ml nước cất các
bước còn lại tiến hành tương tự.

Tiến hành đo quang

Quét phổ hấp thụ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn. Từ kết quả phổ
hấp thụ xác định bước sóng định lượng là bước sóng cực đại. Thực nghiệm
cho thấy cực đại ở bước sóng 425nm, lựa chọn bước sóng định lượng là
425nm.
Tiến hành đo độ hấp thụ của dãy chuẩn tại bước sóng 425nm xây dựng
đường chuẩn quercetin.
Tiến hành đo độ hấp thụ của dung dịch thử tại bước sóng 425nm, dựa
vào phương trình đường chuẩn tính ra nồng độ của flavonoid toàn phần có
trong mẫu tính theo quercetin.

Cách tính kết quả

Đo độ hấp thụ của dãy chuẩn từ đó xây dựng đường chuẩn quercetin. Do
độ hấp thụ của mẫu chuẩn. Xác định hàm lượng flavonoid toàn phần trong
mẫu dược liệu theo công thức sau:

Trong đó: F: là hàm lượng flavonoid toàn phần có trong dược liệu (%)
: là nồng độ flavonoid toàn phần trong dung dịch thử tính theo
quercetin (Giá trị này được phần mềm trong máy quang phổ UV-
VIS Cary 60 tính ra dựa vào đường chuẩn quercetin và độ hấp thụ
của mẫu thử ) (mg/ml)

h: là độ ẩm của dược liệu (Độ ẩm lá diễn xác định trên cân hàm
ẩm là: 8.3 (%)
m: là khối lượng mẫu ban đầu (g)
50×10: là độ pha loãng

20
2.2.2.7. Tro toàn phần
Cho 2 - 3 g bột đem thử vào một chén sứ hoặc chén platin đã nung và
cân bì. Nung ở nhiệt độ không quá 450 oC tới khi không còn carbon, làm
nguội rồi cân. Bằng cách này mà tro chưa loại được hết carbon thì dùng một ít
nước nóng cho vào khối chất đã than hoá, dùng đũa thuỷ tinh khuấy đều, lọc
qua giấy lọc không tro. Rửa đũa thuỷ tinh và giấy lọc, tập trung nước rửa vào
dịch lọc. Cho giấy lọc và cắn vào chén nung rồi nung đến khi thu được tro
màu trắng hoặc gần như trắng. Hợp dịch lọc vào cắn trong chén nung, đem
bốc hơi đến khô rồi nung ở nhiệt độ không quá 450 oC đến khi khối lượng
không đổi. Tính tỷ lệ phần trăm của tro toàn phần theo dược liệu đã làm khô
trong không khí.

2.2.2.8. Kim loại nặng (Pb)

Lấy 1.0 g chế phẩm, tiến hành theo phương pháp 3 (Phụ lục 9.4.8,
DĐVN IV). Dùng 1.0 ml dung dịch mẫu 10 phần triệu (TT) để chuẩn bị mẫu
đối chiếu.

Lấy một lượng chế phẩm thử như chỉ dẫn trong chuyên luận (không
nhiều hơn 2 g) cho vào một chén nung silica. Thêm 4 ml dung dịch magnesi
sulfat 25% trong acid sulfuric 1M (TT). Trộn đều bằng một đũa thuỷ tinh nhỏ
rồi đun nóng cẩn thận. Nếu hỗn hợp là một chất lỏng thì làm bay hơi từ từ
trên cách thuỷ đến khô. Đốt dần dần để than hoá, chú ý đốt ở nhiệt độ không
cao quá 800oC, tiếp tục đốt cho đến khi thu được cắn màu trắng hay xám nhạt.
Để nguội, làm ẩm cắn bằng khoảng 0.2 ml dung dịch acid sulfuric 1M (TT),
bốc hơi rồi đốt lại, sau đó để nguội. Toàn bộ thời gian đốt không nên quá 2
giờ. Hoà tan cắn, dùng 2 lượng, mỗi lượng 5 ml dung dịch acid hydrocloric
2M (TT). Thêm 0.1 ml dung dịch phenolphtalein (TT), rồi cho từng giọt dung
dịch amoniac đậm đặc (TT) đến khi có màu hồng. Để nguội, thêm acid acetic
băng (TT) đến khi mất màu dung dịch, rồi thêm 0.5 ml nữa. Lọc nếu cần, rồi
pha loãng dung dịch với nớc thành 20 ml.

Lấy 12 ml dung dịch thu được ở trên cho vào một ống nghiệm, thêm 2
ml dung dịch đệm acetat pH 3.5, lắc đều. Thêm 1.2 ml dung dịch
thioacetamid (TT), lắc đều rồi để yên 2 phút. So sánh màu của ống thử với

21
màu của ống mẫu được chuẩn bị đồng thời trong cùng điều kiện. Màu của ống
thử không được đậm hơn màu của ống mẫu.

Ống mẫu được chuẩn bị như sau: Lấy một thể tích dung dịch chì mẫu
10 phần triệu Pb như đã chỉ dẫn trong chuyên luận, cho vào chén nung silica,
thêm 4 ml dung dịch magnesi sulfat 25% trong acid sulfuric1M (TT), sau đó
tiếp tục xử lý nh cách xử lý mẫu ghi ở trên, bắt đầu từ câu: “Trộn đều bằng
một đũa thuỷ tinh nhỏ...” đến câu: “Lọc nếu cần, rồi pha loãng dung dịch với
nớc thành 20 ml”. Lấy 2 ml dung dịch thu được từ xử lý chế phẩm thử cho
vào một ống nghiệm, thêm 10 ml dung dịch thu được từ xử lý dung dịch chì
mẫu, 2 ml dung dịch đệm acetat pH 3.5. Lắc đều, thêm 1,2 ml dung dịch
thioacetamid (TT). L¾c ngay, rồi để yên 2 phút. Dung dịch ion chì mẫu có
mầu nâu sáng khi được so sánh với dung dịch được chuẩn bị trong cùng điều
kiện gồm 10 ml nớc và 2 ml dung dịch chế phẩm thử.

2.2.2.9. Độ vô khuẩn: thử theo DĐVN IV phụ lục 13.7.

Thí nghiệm đượcc tiến hành trong điều kiện vô khuẩn. Trong khi làm
thí nghiệm, chú ý không được lẫn chất khử khuẩn vào mẫu thử.

Đem chế phẩm sau khi đã được hoà loãng với dung môi thích hợp lọc
qua màng lọc, rồi cắt các màng lọc thành miếng nhỏ đem nhúng vào môi
trường, ủ môi trường đã cấy chế phẩm hoặc cấy màng lọc trong thời gian qui
định.

22
 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu từ cây Lá diễn
Từ các kết quả nghiên cứu, chúng tôi đề xuất tiêu chuẩn cơ sở dược liệu
Lá diễn (Dicliptera chinensis (L.) Ness) được trình bày như sau:
Bộ phận lá và thân tươi hay phơi khô, xay bột của cây Lá diễn
(Dicliptera chinensis (L.) Ness).
3.1.1. Mô tả

Hình 3.1: Thân, lá, hoa cây Lá diễn

Cây thảo sống hằng năm hay vài ba năm, cao 30-80cm. Thân và cành
non có 4 cạnh, có lông tơ, các mấu phình to tựa như đầu gối. Lá mọc đối. màu
xanh lục, phiến lá hình trứng thuôn, dài 2-7cm, rộng 2-4cm, đầu và gốc đều
nhọn, mặt dưới có lông. Cụm hoa nhỏ ở ngọn, bao xung quanh của cụm hoa
có lá bắc không đều. Đài 5, đều nhau, dính vào nhau đến ½. Tràng màu tím,
hồng hay trắng, ống hơi dài hơn môi, môi dưới hơi khía ba thùy nhị hai bao
phấn tù Quả nang ngắn có lông tơ ở phía đầu. Hạt dẹt, hình thấu kính.
3.1.2. Vi phẫu
Phần gân lá: gân phía trên và dưới đều lồi, gân dưới lồi nhiều hơn. Biểu
bì trên và dưới là một hàng tế bào, hình trứng nhỏ, xếp đều đặn liên tục, cả
biểu bì trên và dưới đều mang lông che chở đa bào cấu tạo bởi 3-4 tế bào, xếp
thẳng hàng có đầu lông nhọn, dài, ở phía gốc ngắn. Xếp sát biểu bì là mô dày,
thường có 2-3 hàng, là những tế bào hình tròn, kích thước không đều, có
thành dày phát triển nhiều ở góc. Mô mềm là những tế bào hình đa giác hay

23
hình tròn, thành mỏng có kích thước không đều. Gân chính có cung libe ôm
lấy cung gỗ.
Phần thân: hình tròn xẻ 4 thùy, biểu bì là một lớp tế bào hình chữ nhật,
bên ngoài phủ lớp cutin mỏng, có nhiều lông che chở.

8
9
7
6
5
4
3
2
1

Hình 3.2: Hình ảnh vi phẫu thân cây Lá diễn

Ghi chú:
1. biểu bì
2. Mô dày
3. Trụ bì hóa mô cứng
4. Mô mềm
5. Libe cấp một
6. Tầng sinh gỗ
7. Gỗ cấp II
8. Mô mềm ruột
9. Lông che chở

24
 Hình 3.3: Vi phẫu phần lá của cây Lá diễn
3.1.3. Bột
Bột (thân và lá) có màu xanh lục, có mùi thơm nhẹ của lá diễn, vị đắng.
Quan sát bằng kính hiển vi thấy các đặc điểm: Mảnh mô mềm mỏng, tế bào
hình đa giác, mảnh mang màu đỏ, rất nhiều tế bào mô cứng hình khối, vách
dày hóa gỗ nhiều, có tế bào đứng riêng lẻ và tụ tập thành đám, lông che chở
đa bào, mảnh mạch, mảnh biểu bì mang lông che chở, mảnh biểu bì mang lỗ
khí, lỗ khí, sượi đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng bó, thành dày, mảnh bần
có tế bào hình đa giác, màu nâu đen.

25
 Hình 3.4: Đặc điểm vi phẫu bột dược liệu từ cây Lá diễn
Ghi chú:
1. Mảng biểu bì mang lỗ khí
2. Lông che chở đa bào
3. Mảng mạch
4. Mảng mô mềm
5. Biểu bì
6 Tế bào mô cứng
7. Biểu bì chứa lông che chở đơn bào
8. Mảnh mạch xoắn
3.1.4. Mất khối lượng do làm khô: không quá 12%.
3.1.5. Tro toàn phần: không quá 10 % .
3.1.6. Kim loại nặng: không quá 10ppm.
3.1.7. Tỷ lệ vụn nát: không quá 2 %.

26
3.1.8. Định tính: Có các phản ứng đặc trưng của các chất trong dược liệu, đặc
biệt là làm phản ứng định tính Flavonoid.

Phản ứng định tính Kết quả sơ bộ

Nhóm chất
thuốc thử Kết quả Kết luận

Dung dịch NaOH 10% +

Hơi NH3 +

Dung dịch FeCl3 1% +

Flavonoid Có
Dung dịch +
Pb(CH3COO)2 +
Phản ứng cyanidin +
Bảng 3.1: Bảng kết quả định tính các chất có trong dược liệu từ cây Lá
dễn.
3.1.9. Định lượng: Hàm lượng Flavonoid không ít hơn 0.20 % tính theo dược
liệu khô kiệt.
3.2. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao khô dược liệu từ cây Lá diễn
Từ những nghiên cứu và dựa theo DĐVN IV chúng tôi đề xuất tiêu
chuẩn cơ sở cao khô phân đoạn dược liệu với định hướng làm nguyên liệu
thuốc nhỏ mắt từ cây Lá diễn như sau:
3.2.1. Tính chất: Khối bột khô tơi, đồng nhất, màu nâu đỏ, dễ hút ẩm. có mùi
thơm đặc trưng của dược liệu, không có mùi nấm mốc, vị đắng.
3.2.2. Mất khối lượng do làm khô: không quá 5 % .
3.2.3. Độ mịn: Lấy 20g chế phẩm, không ít hơn 95% phần tử qua được rây số
180 và không quá 40% qua được rây số 125.
3.2.4. Độ PH: do cao khô dược liệu được dùng làm nguyên liệu thuốc nhỏ
mắt nên sau khi pha xong thuốc nhỏ mắt phải đạt PH từ 7-7.6.
3.2.5. Định tính: Chế phẩm phải thể hiện phép thử định tính của Flavonoid từ
cây Lá diễn.
3.2.6. Định lượng
Mẫu thử A= 0.667 (Abs)

27
 Hình 3.5: Đường chuẩn sự phụ thuộc của độ hấp thụ A theo nồng độ
quercetin.
Từ phương trình đường chuẩn ta tính được Cx= 42.45 (µg/ml)
Hàm lượng Flavonoid toàn phần trong cao dược liệu là:
F(%)= 5.78 %
3.2.7. Tro toàn phần: không quá 5% .
3.2.8. Kim loại nặng: không quá 10 ppm.
3.2.9. Độ vô khuẩn: Tuyệt đối vô khuẩn như với thuốc tiêm.

28
 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
❖ Kết luận
- Đã xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở dược liệu lá diễn như sau:
+ Mô tả: Cây thảo cao 30-80cm. Thân và cành non có 4 cạnh, có lông
tơ. Lá mọc đối, phiến lá hình trứng thuôn dài. Cụm hoa nhỏ ở ngọn. Quả nang
ngắn có lông tơ ở phía đầu. Hạt dẹt, hình thấu kính.
+ Vi phẫu: Phần gân lá: gân phía trên và dưới đều lồi, gân dưới lồi
nhiều hơn. Phần thân: hình tròn xẻ 4 thùy có nhiều lông che chở.
+ Bột: Màu xanh lục, có mùi thơm nhẹ của lá diễn, vị đắng. Quan sát
bằng kính hiển vi thấy các đặc điểm: Mảnh mô mềm mỏng, tế bào hình đa
giác, lông che chở đa bào, mảnh mạch, lỗ khí, mảnh bần…
+ Mất khối lượng do làm khô: không quá 12%.
+ Tro toàn phần: không quá 10 % .
+ Kim loại nặng: không quá 10ppm.
+ Tỷ lệ vụn nát: không quá 2 %.
+ Định tính: Có các phản ứng đặc trưng của Flavonoid.
+ Định lượng: Hàm lượng Flavonoid không ít hơn 0.20 % tính theo
dược liệu khô kiệt.
- Đã xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở cao khô phân đoạn từ dược liệu
lá diễn như sau:
+ Tính chất: Bột khô tơi, đồng nhất, màu nâu đỏ, dễ hút ẩm, có mùi
thơm đặc trưng của dược liệu, vị đắng.
+ Mất khối lượng do làm khô: không quá 5 % .
+ Độ mịn: 180/125 không ít hơn 95% phần tử qua được rây số 180 và
không quá 40% qua được rây số 125.
+ Độ pH: PH từ 7-7.6.
+ Định tính: Thể hiện phép thử định tính của Flavonoid từ cây Lá diễn.
+ Định lượng: Hàm lượng Flavonoid toàn phần trong cao không ít hơn
5.0 %.
+ Tro toàn phần: không quá 5% .
+ Kim loại nặng: không quá 10 ppm.
+ Độ vô khuẩn: Tuyệt đối vô khuẩn như với thuốc tiêm.

29
❖ Kiến nghị
- Tiếp tục nghiên cứu và nâng cao bộ tiêu chuẩn dược liệu và cao dược
liệu trên, cập nhật và sửa đổi để phù hợp với sự phát triển của khoa học kỹ
thuật.
- Vận dụng tiêu chuẩn xây dựng trong kiểm soát chất lượng dược liệu,
cao dược liệu.

30
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng việt

1. Bộ môn dược liệu (2010), Thực tập dược liệu, Trường đại học Dược Hà
Nội.
2. Bộ y tế (2007), Dược liệu học, Tập 2, Nhà xuất bản y học, Hà Nội,
tr.163-170.
3. Bộ y tế (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản y học, Hà Nội,
tr.68-79.
4. Bộ y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản y học, Hà Nội,
tr.857-862.
5. Bộ y tế (2013), Sổ tay đăng kí thuốc (ban hành kèm theo quyết định số
07/QD – QLD ngày 11/1 về việc ban hành sổ tay hướng dẫn đăng kí
thuốc), phục lục 8.
6. BYT (2010 ), Thông tư số 09/2010/TT của Bộ Y tế Hướng dẫn việc
quản lý chất lượng thuốc.
7. Bộ môn dược liệu (2004), Bài giảng dược liệu, Tập 1, Trung tâm thông
tin - Thư viện Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội
8. Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, NXB Khoa học và kỹ
thuật, tr.957.
9. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng
Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai,
Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2011), Cây
thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập III, Nhà xuất bản Khoa
học và kỹ thuật, Hà Nội, tr.479-480.
10. Đỗ Trung Đàm (2003), Sử dụng Microsoft Excel trong thống kê sinh
học, Nxb. Y học, Hà Nội, tr.15-24.
11. Nguyễn Trọng Điệp, Nguyễn Minh Chính, Nguyễn Tùng Linh (2013),
"Nghiên cứu chiết xuất flavonoid toàn phần từ Cúc hoa vàng
(Chrysanthemum indicum L", Tạp chí y – dược học quân sự(9), tr. 38-
45.
12. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Tập 3, Nhà xuất bản trẻ,
tr.73-74.
13. Phạm Thanh Kỳ (2007), Dược liệu Tập 2, NXB Y học.
14. Giang Thị Sơn và Phạm Hoàng Thủy (1998), "Nghiên cứu thành phần
hóa học của cây lá diễn", Tạp chí dược học.
15. Lương y Huyên Thảo (2013), " Lá diễn nhuộm xôi là một vị thuốc chữa
bệnh", Thuốc vườn nhà.
16. Ngô Vân Thu và Trần Hùng (2011), Dược liệu tập 1, NXB Y học, Hà
Nội.

31
17. Nguyễn Hữu Lạc Thủy và các cộng sự (2011), " Định lượng flavonoid
toàn phần trong lá trinh nữ hoàng cung".
18. Nguyễn Văn Thành, Nguyễn Hoàng Thanh và Đinh Hoa Lĩnh (2004),
"Luận văn Nghiên cứu một số bài thuốc, cây thuốc dân gian của cộng
đồng dân tộc thiểu số tại buôn Đrăng Phôk –vùng lõi vườn quốc gia
Yokđôn –huyện Buôn Đôn –tỉnh Đaklak".
19. Nông Thị Anh Thư, Đồng Văn Thành và Trần Thị Phương Linh,
"Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và khả năng
nhuộm màu của cây lá cẩm thu hái tại Thái Nguyên.", Khoa học và
công nghệ, tr. 325 – 329.
20. Phan Cảnh Trình (2014-2015), Xây dựng tiêu chuẩn Dược liệu Thuốc
dòi, Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh.
21. Viện Dược liệu (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của
thuốc từ thảo dược, NXB Khoa học và kỹ thuật, tr.139-141.

Tiếng anh.

22. Ahmad Bushra, Khan MR, Shah NA, Khan RA.BMC (2013), "In vitro
antioxidant potential of dicliptera roxburghiana", BMC complementary
and alternative medicine. 13(1), tr. 140.
23. Alessandra Braca và các cộng sự (2003), "Antioxidant and free radical
scavenging activity of flavonol glycosides from different Aconitum
species", Journal of ethnopharmacology. 86(1), tr. 63-67.
24. Gao YT, XW Yang và TM Ai (2006), "Studies on the chemical
constituents in herbs of ethanolic extract from herbs of Dicliptera
chinensis", Zhongguo Zhong yao za zhi= Zhongguo zhongyao zazhi=
China journal of Chinese materia medica. 31(12), tr. 985-987.
25. Jayanta kumar maji và Shukla v.J (2012), "pharmacognosy and
phytochemical study of trikarshika churna: a popular polyherbal
antioxidant", nternational research journal of pharmacy, Jayanta
kumar maji et al. IRJP tr. 183-189.
26. Liviual Marghitas, Dezmirean, daniel, ARGHITAS, (2009), "Validated
method for estimation of total flavonoids in Romanian propolis",
Bulletin of University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine
Cluj-Napoca. Animal Science and Biotechnologies. 64(1-2).
27. Prasad Satyendra K and etal (2012), "Physicochemical standardization
and evaluation of in-vitro antioxidant activity of Aconitum
heterophyllum Wall", Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine.
2(2), tr. S526-S531.
28. Teja Molakalapalli Lakshmi, M Chaitanya và A Ravi Kumar (2014),
"Pharmacognosy and study of trikarshika churna a popular polyherbal

32
 antioxidant", Indian Journal of Research in Pharmacy and
Biotechnology. 2(4), tr. 1345.
29. Zhang Kefeng, Ya Gao, Mingli Zhong, Yourui Xu, etal (2016),
"Hepatoprotective effects of Dicliptera chinensis polysaccharides on
dimethylnitrosamine-induced hepatic fibrosis rats and its underlying
mechanism", Journal of ethnopharmacology. 179, tr. 38-44.
30. Zhang X, Zhang J, Jia L, Xiao S (2015), "Dicliptera Chinensis
polysaccharides target TGF-β/Smad pathway and inhibit stellate cells
activation in rats with dimethylnitrosamine-induced hepatic fibrosis",
Cellular and molecular biology (Noisy-le-Grand, France). 62(1), tr.
99-103.

33
Phụ lục 1: Phiếu giám định tên khoa học

34