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PRACTICA N° 6. EXTRACCIÓN DE ADN VEGETAL

Elaborado por: Luciano López

I. FUNDAMENTO

La extracción de ADN en células vegetales es el punto de partida para el análisis del genotipo.
El enfoque para la preparación del ADN a partir de plantas está determinado por la especie, el
tipo de tejido o muestra disponible y el análisis requerido en el ADN. Por ejemplo, la extracción
de ADN de la hoja de un cereal para análisis mediante una prueba robusta puede requerir una
técnica muy diferente de la requerida para el aislamiento de ADN de la corteza de un árbol para
el análisis del polimorfismo de longitud de fragmento amplificado (AFLP)

Se puede considerar que el proceso de aislamiento del ADN de los vegetales comienza cuando
la planta se muestrea en el campo o en el laboratorio. La recolección y el almacenamiento
apropiados son esenciales. El etiquetado también es un tema importante, especialmente cuando
se analizan grandes cantidades de muestras. Las muestras se deben congelar para su
almacenamiento. La muestra debe permanecer congelada hasta la extracción de ADN, ya que la
descongelación del tejido congelado a menudo provoca la degradación del ADN.
Alternativamente, el ADN puede extraerse de material fresco o tejido que se haya secado para
su almacenamiento.

Las muestras frescas se pueden extraer inmediatamente o almacenar durante horas o días a bajas
temperaturas antes de la extracción. La refrigeración (4 ° C si es posible) generalmente permite
que la extracción se retrase durante varios días. Se debe propiciar las condiciones de
almacenamiento que no estimulen el crecimiento de hongos en estos tejidos. Se puede usar
alcohol para ayudar a preservar algunos tejidos para el análisis. El análisis de tejido fresco es
probablemente la opción preferida para la extracción de ADN en la mayoría de los casos.

El conocimiento de varios protocolos o procedimientos de extracción o aislamiento de ADN

vegetal permite escoger cual ha de aplicarse según las necesidades y recursos disponibles en el
área de trabajo.

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II. OBJETIVOS

 Realizar la extracción de ADN a partir de muestras vegetales (arvejas frescas)

 Conocer la importancia de los diferentes reactivos utilizados

III. MATERIALES

REACTIVOS MATERIALES EQUIPOS

Alcohol Tubos Eppendorf 1.5 y 2 ml Micropipetas
SDS (sodio dodecil sulfato) Puntas Microcentrifuga
0.5%
Buffer de extracción: (Tris- Vórtex
HCl pH 8 100 Mn; NaCl
500Mm
Buffer TE (Tris-HCl 10mM
Ph8; EDTA 1mM)

IV. PROCEDIMIENTO

1. Pesar 50 mg de muestra y transferirlos a un tubo Eppendorf de 1.5 ml y adicione 300 μl

de buffer de extracción
2. Macerar mediante un pistilo estéril con la ayuda del rotor hasta obtener una masa
homogénea y dar vórtex por 30 s
3. Incubar en congelación por 10 min
4. Centrifugar a 12.000 rpm por 10 min
5. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y agregue 200 μl de alcohol al 100% frio
(etanol o isopropanol)
6. Mezclar suave por inversión durante 30 s e incubar en congelación por 5 min
7. Centrifugar a 12,000 g durante 5 min y desechar el sobrenadante
8. Lave el sedimento dos veces con etanol al 70% (v / v), agregando 1 ml y mezclando por
vórtex por 10 s.
9. Centrifugar a 12,000 g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
10. El ADN puede resuspenderse en un volumen de 50 μl de tampón TE (Tris-HCl 10 mM,
EDTA 1 mM, pH 8,0) o solución apropiada para la aplicación prevista.
11. Incubar a -20°C hasta su uso.

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Figura 1. Etapas de la extracción de ADN (fuente: Alejos et al., 2006)

V. CUESTIONARIO

 ¿Cuál es la reacción química de neutralización que se realiza al iniciar el aislamiento?

 ¿Qué funcionalidad tiene cada uno de los reactivos utilizados en la práctica?
 Consulte otros protocolos para aislar ADN vegetal. Relacione el nombre del autor,
bibliografía y procedimiento. Si se consulta en internet, especifique todos los datos de
la página y el procedimiento.
 En que se diferencian los protocolos consultados con el que usted realizó en el
laboratorio, y por qué es necesario “realizar” inversión suave durante el procedimiento.

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