Professional Documents
Culture Documents
NGHIÊN CỨU VÀ CHẾ TẠO NANO BẠC ỨNG DỤNG TRONG SINH HỌC
NGHIÊN CỨU VÀ CHẾ TẠO NANO BẠC ỨNG DỤNG TRONG SINH HỌC
HÀ NỘI - 2011
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ
HÀ NỘI - 2011
Lời cảm ơn
Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Trần Đăng Khoa đã tận tình chỉ
bảo và hướng dẫn tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu để thực hiện khóa luận tốt
nghiệp này.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Thị Hoài Hà, Viện Vi sinh vật và Công
nghệ Sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội, đã nhận xét, góp ý cho khóa luận của tôi.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn KS. Phạm Thị Bích Đào, Viện Vi sinh vật và
Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội. CN. Nguyễn Thị Hòa, Khoa Vật lý kỹ
thuật và Công nghệ nano, Đại học Công nghệ, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã hướng dẫn,
tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện khóa luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tập thể các Thầy, Cô giáo và cán bộ của Khoa Vật lý
kỹ thuật và Công nghệ nano, Đại học Công nghệ, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã cung cấp
các kiến thức tiền đề để tôi hoàn thành khóa luận này.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi rất
nhiều trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận.
Tóm tắt nội dung
Trong những năm gần đây việc nghiên cứu hạt nano rất được quan tâm bởi những
tính chất đặc biệt và lý thú của nó. Trong số các loại hạt nano được nghiên cứu, ứng
dụng thì hạt nano bạc đã gây được sự chú ý đặc biệt bởi tính chất kháng khuẩn vượt trội.
Trên thế giới nano bạc đã được nghiên cứu, chế tạo và ứng dụng trong rất nhiều các sản
phẩm gần gũi với đời sống như: tẩm trên băng cứu thương, phủ lên các loại sợi vải, sử
dụng để chống nhiễm khuẩn nước sinh hoạt, các đồ dùng cho trẻ em... Ở Việt Nam, việc
nghiên cứu, chế tạo vật liệu nano nói chung, nano bạc nói riêng vẫn còn khá mới mẻ và
mới được tiến hành trong thời gian gần đây.
Với mục đích nghiên cứu những tính chất lý thú của keo nano bạc, tôi đã thực
hiện chế tạo hạt nano bạc bằng phương pháp hóa khử bọc PVP và PEG. Nghiên cứu,
khảo sát tính chất của hạt nano bạc bằng UV-vis và FE-SEM, tiến hành thử nghiệm khả
năng kháng khuẩn và tương tác của nano bạc chế tạo với nấm mốc và vi tảo.
Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan rằng đây là công trình nghiên cứu của tôi, với sự hướng dẫn của
TS. Trần Đăng Khoa. Các nội dung nghiên cứu và kết quả trong đề tài này là trung thực
và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào trước đây. Những
nội dung khóa luận có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các
tác phẩm, tạp chí và các trang web được liệt kê trong danh mục tài liệu tham khảo của
khóa luận.
Trang \
MỞ ĐẦU.................................................................................................................1
KẾT LUẬN...........................................................................................................41
PHỤ LỤC..............................................................................................................43
MỞ ĐẦU
Khoa học, công nghệ nano là một lĩnh vực khoa học và công nghệ mới, phát
triển rất nhanh chóng. Vật liệu được chế tạo bằng công nghệ này thể hiện nhiều tính
chất mới lạ do hiệu ứng kích thước. Khoa học và công nghệ nano trên cơ sở kết hợp đa
ngành đã tạo nên cuộc cách mạng về khoa học kỹ thuật. Hiện nay, nhiều quốc gia trên
thế giới xem công nghệ nano là mục tiêu mũi nhọn để đầu tư phát triển. Ước tính tổng
đầu tư cho lĩnh vực công nghệ nano trên toàn thế giới xấp xỉ 3 tỷ đôla và đã có hàng
trăm sản phẩm của công nghệ nano được thương mại, ứng dụng trong nhiều lĩnh vực
như điện tử, hóa học, y sinh, môi trường….[5,10].
Trong công nghệ nano thì hạt nano là một vật liệu quan trọng. Một trong những
hạt nano được sử dụng sớm và rộng rãi nhất là hạt nano bạc. Ở kích thước nano bạc
thể hiện những tính chất vật lý, hóa học, sinh học khác biệt và vô cùng quý giá, đặc
biệt là tính kháng khuẩn. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng khi ở kích thước nano, hoạt tính
sát khuẩn của bạc tăng lên khoảng 50.000 lần so với bạc ion [15,9]. Nhờ khả năng
kháng khuẩn tuyệt vời mà nano bạc đã được ứng dụng trong rất nhiều sản phẩm như:
tẩm trên băng cứu thương, phủ lên các loại sợi vải, sử dụng để khử trùng nước, các đồ
dùng cho trẻ em....
Trong những năm gần đây, việc gia tăng vi khuẩn siêu kháng thuốc kháng sinh,
các loại nấm gây bệnh thiếu thuốc đặc trị thì việc nghiên cứu chế tạo sản phẩm chứa
nano bạc để tiêu diệt chúng là hướng đi mới và cấp thiết [17].
Đó là lý do mà tôi quyết định chọn đề tài “Nghiên cứu và chế tạo nano bạc ứng
dụng trong sinh học”. Các nội dung của đề tại như sau:
+ Chế tạo hạt nano bạc bằng phương pháp hóa khử, sử dụng NaBH 4 làm
tác nhân khử, hạt được bọc bởi PVP và PEG.
+ Nghiên cứu, khảo sát tính chất của keo bạc nano chế tạo bằng phân tích
quang phổ hấp thụ UV-vis, và chụp ảnh bằng FE-SEM.
+ Ứng dụng để nghiên cứu khả năng diệt khuẩn và khả năng tương tác với
nấm mốc, vi tảo của keo bạc nano.
1
1.1. Khái quát về công nghệ nano
1.1.1. Lịch sử hình thành của công nghệ nano
Thuật ngữ công nghệ nano (nanotechnology) xuất hiện từ những năm 70 của
thế kỷ XX, chỉ việc thiết kế, phân tích, chế tạo và ứng dụng các cấu trúc, thiết bị và hệ
thống bằng việc điều khiển hình dáng, kích thước trên quy mô nanômét. Chúng có độ
chính xác rất cao 0,1 - 100nm, tức là chính xác đến từng lớp nguyên tử, phân tử.
Tiền tố nano xuất hiện trong tài liệu khoa học lần đầu tiên vào năm 1908, khi
Lohman sử dụng nó để chỉ các sinh vật rất nhỏ với đường kính 200nm. Năm 1974,
Tanigushi lần đầu tiên sử dụng thuật ngữ công nghệ nano hàm ý sự liên kết các vật liệu
cho kỹ thuật chính xác trong tương lai. Hiện tại trong khoa học, tiền tố nano biểu thị
con số 10-9 tức kích thước 1 phần tỷ mét. Cho tới nay, vẫn chưa có được một định
nghĩa thống nhất về công nghệ nano. Theo cơ quan Hàng Không Vũ trụ Hoa Kỳ
(NASA), công nghệ nano là công nghệ chế tạo ra các cấu trúc, vật liệu, thiết bị và hệ
thống chức năng với kích thước đo bằng (khoảng từ 1 đến 100nm) và khai thác ứng
dụng các đặc tính độc đáo của những sản phẩm này. Công nghệ nano cũng có thể hiểu
là ngành công nghệ dựa trên các hiểu biết về các quy luật, hiện tượng, tính chất của
cấu trúc vật lý có kích thước đặc trưng ở thang nano [4].
Có thể nói, trong thời điểm hiện tại, tiềm năng phát triển của một công nghệ
hay kỹ thuật mới rõ nhất qua nguồn ngân sách nghiên cứu hàng năm và doanh thu đem
lại từ các sản phẩm thương mại của nó. Được toàn thế giới nghiên cứu và đầu tư phát
triển, ngân sách đầu tư cho công nghệ nano của các tổ chức thuộc chính phủ đã tăng
khoảng 7 lần từ 430 triệu năm 1997 lên 3 tỉ USD năm 2003 [12,23].
2
ý nghĩa rất quan trọng trong các ứng dụng của vật liệu nano có liên quan tới khả năng
tiếp xúc bề mặt của vật liệu, như trong các ứng dụng vật liệu nano làm chất diệt khuẩn.
Đây là một tính chất quan trọng làm nên sự khác biệt của vật liệu có kích thước
nanomet so với vật liệu ở dạng khối [8].
+ Kích thước tới hạn: Kích thước tới hạn là kích thước mà ở đó vật giữ
nguyên các tính chất về vật lý, hóa học khi ở dạng khối. Nếu kích thước vật liệu mà
nhỏ hơn kích thước này thì tính chất của nó hoàn toàn bị thay đổi. Nếu ta giảm kích
thước của vật liệu đến kích cỡ nhỏ hơn bước sóng của vùng ánh sáng thấy được (400 -
700 nm), theo Mie hiện tượng "cộng hưởng plasmon bề mặt" xảy ra và ánh sáng quan
sát được sẽ thay đổi phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng xảy ra hiện tượng cộng hưởng.
Hay như tính dẫn điện của vật liệu khi tới kích thước tới hạn thì không tuân theo định
luật Ohm nữa. Mà lúc này điện trở của chúng sẽ tuân theo các quy tắc lượng tử. Mỗi
vật liệu đều có những kích thước tới hạn khác nhau và bạn thân trong một vật liệu
cũng có nhiều kích thước tới hạn ứng với các tính chất khác nhau của chúng. Bởi vậy
khi nghiên cứu vật liệu nano chúng ta cần xác định rõ tính chất sẽ nghiên cứu là gì.
Chính nhờ những tính chất lý thú của vật liệu ở kích thước tới hạn nên công nghệ nano
có ý nghĩa quan trọng và thu hút được sự chú ý đặc biệt của các nhà nghiên cứu [24].
3
nghệ nano, trường Đại học Công nghệ, Đại học Quốc Gia Hà Nội và Trung tâm Khoa
học Vật liệu, trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội báo cáo tại
hội nghị Vật lý toàn quốc lần thứ VI (2005). Tuy nhiên, công nghệ nano vẫn là một
điều gì đó mới lạ ở Việt Nam. Nói chung, công nghệ nano tại Việt Nam hiện chỉ mới
đang đặt những viên gạch móng đầu tiên.
Tình hình nghiên cứu ngoài nước:
Phương pháp chế tạo hạt kim loại nano nói chung và chế tạo nano bạc nói riêng
đã được rất nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu. Phương pháp thường được sử
dụng chủ yếu là: điện hóa, khử hóa học, khử nhiệt, sinh học, khử do bức xạ ion hóa…
Nguyên tắc chung của các phương pháp này là khử ion kim loại trong dung dịch thành
nguyên tử kim loại, sau đó các nguyên tử liên kết với nhau thành tập hợp rồi phát triển
kích thước thành các hạt nano và sử dụng polyme để ổn định hạt. Hướng nghiên cứu
ứng dụng chính của nano bạc tập trung vào khả năng kháng lại các loại vi khuẩn, virut,
các ứng dụng trong các thiết bị y tế và trong các thiết bị diệt khuẩn, lọc nước.v.v
Theo nhận định của nhiều chuyên gia, công nghệ nano sẽ tạo nên một cuộc cách
mạng đột phá trong nhiều ngành khoa học và đời sống, tạo tiền đề cho một “thế giới
nhỏ hơn và thông minh hơn” [7].
Từ thời Alexander Đại Đế (năm 356-323 trước công nguyên), con người đã biết
sử dụng các dụng cụ bằng bạc để đựng thức ăn và đồ uống góp phần làm giảm nguy cơ
gây độc. Qua thời gian những đặc tính quý giá của bạc đã được con người khai thác và
sử dụng tạo ra nhiều sản phẩm hữu ích.
4
+ Bạc có ký hiệu là Ag, số nguyên tử 47 thuộc phân nhóm IB trong bảng tuần hoàn
các nguyên tố hóa học, bạc có khối lượng phân tử là 107.868 (đơn vị C).
+ Cấu hình electron [Kr]4d105s1 , có số oxi hóa là +1 và +2, phổ biến nhất là trạng
thái oxi hóa +1.
+ Trong tự nhiên, bạc tồn tại hai dạng đồng vị bền là Ag-107(52%) và Ag-
109(48%). Bạc không tan trong nước, môi trường kiềm nhưng có khả năng tan
trong một số axit mạnh như axit nitric, sufuric đặc nóng .v.v.
Ngày nay những thuộc tính quý của kim loại này được thể hiện tối đa khi chúng
được chế tạo bằng công nghệ nano. Và trên thị trường cũng đã xuất hiện nhiều sản
phẩm chứa nano bạc như băng gạc y tế, nước tẩy trùng bề mặt, hay hiện diện ngay
trong gia đình bạn như tủ lạnh, máy gặt .v.v.
1.2.2. Các phương pháp chế tạo vật liệu nano bạc
Có 2 phương pháp để điều chế hạt nano kim loại bạc: phương pháp từ dưới lên
và phương pháp từ trên xuống. Phương pháp từ dưới lên “bottom-up” là phương pháp
tạo hạt nano từ các nguyên tử hoặc ion kết hợp lại với nhau. Phương pháp từ trên
xuống “top-down” là phương pháp tạo các hạt nano từ vật liệu khối ban đầu. Đối với
hạt nano bạc, người ta thường điều chế bằng phương pháp từ dưới lên. Nguyên tắc là
khử ion Ag+ thành Ag. Các ion này sau đó liên kết với nhau tạo thành hạt nano và các
hạt nano này sẽ được bọc bởi các chất ổn định như PVP, PVE, chitosan.v.v. Các
phương pháp từ trên xuống ít được sử dụng vì nano bạc chế tạo bằng phương pháp này
thường có kích thước hạt lớn và không đồng đều. Hiện nay các vật liệu kim loại nano
như vàng (Au), Sắt (Fe), đồng (Cu), bạc (Ag) dưới dạng bột hay dung dịch keo được
chế tạo chủ yếu bằng các phương pháp sau:
5
+ Kỹ thuật đồng ngưng tụ: tương tự như ngưng tụ khí trơ nhưng quá trình
hình thành và phát triển hạt xảy ra trên lớp bằng dung môi thích hợp.
Kỹ thuật ngưng tụ khí trơ và đồng ngưng tụ được thực hiện ở nhiệt độ cao
(>2.0000C), sản phẩm tạo ra có độ tinh khiết cao, kích thước hạt nano bạc trung bình
75nm(phương pháp ngưng tụ khí trơ), 12nm (phương pháp đồng ngưng tụ) [9].
Ag+ + e- → Ag0
Thông thường, nguồn cung cấp ion Ag + là các muối của bạc như AgNO 3. Các
tác nhân khử thường dùng là: natri bohydrua, focmandehyt, xitrat, etylen glyxerol,
NaBH4, ethanol,…. Gần đây có một số công trình nghiên cứu chế tạo keo nano bạc và
bột nano bạc từ bạc nitrat nhưng sản phẩm trung gian là oxit bạc (Ag 2O) rồi từ Ag2O
tiếp tục khử về Ag0 nhằm thu được keo bạc có nồng độ cao. Để các hạt nano bạc phân
tán tốt trong dung môi mà không bị kết tụ thành đám, người ta bao phủ hạt nano bạc
bằng một lớp polyme, điều này giúp cho các hạt được bảo vệ tốt hơn tránh hiện tượng
kết tủa, hơn nữa phương pháp này có thể làm cho bề mặt hạt nano có tính chất cần
thiết.
6
+ Các tác nhân khử:
Tác nhân khử Sodium citrate “C6H5O7Na3” Trong quá trình khử, bề mặt của hạt
nano bạc hấp thụ các ion Ag+ tạo ra lớp ion dương trên bề mặt. Tiếp đó các ion âm
citrate có nghiệm vụ bám xung quanh các hạt nano bằng lực hút tĩnh điện ngăn không
cho chúng kết hợp lại với nhau. Nhờ vậy mà bề mặt của hạt nano bạc có một lớp keo
citrate giúp chúng lơ lửng và phân tán đều trong dung dịch. Citrate trong quá trình vừa
đóng vai trò làm tác nhân khử ion Ag+ để tạo thành hạt nano bạc, vừa đóng vai trò làm
chất ổn định cho hạt nano bạc.
Tác nhân khử NaBH4 khác với phương pháp sử dụng Sodium citrate, ở phương
pháp này sau khi kết thúc phản ứng khử, người ta sử dụng các polyme như PVP, PVA,
PEG, Chitosan…, làm tác nhân ổn định. Các polyme này bao bọc hạt nano bạc, ngăn
chúng kết tụ với nhau, vì vậy mà hạt nano được bảo vệ tốt và tránh kết tủa.
7
Một khi lỗ hổng đã phát triển quá mức, ngay cả trong trường hợp cường độ siêu âm
thấp hay cao, nó sẽ không thể hấp thụ năng lượng siêu âm một cách có hiệu quả được
nữa. Và khi không có năng lượng tiếp ứng, lỗ hổng không thể tồn tại lâu được. Chất
lỏng ở xung quanh sẽ đổ vào và lỗ hổng bị suy sụp. Sự suy sụp của lỗ hổng tạo ra một
môi trường đặc biệt cho các phản ứng hoá học - các điểm nóng (hot spot). Hóa siêu âm
được ứng dụng để chế tạo rất nhiều loại vật liệu nano như vật liệu nano xốp, nano
dạng lỏng, hạt nano, ống nano.
PVP được tổng hợp từ phản ứng trùng hợp các vinyl pyrolidon, là các polyme
ưa nước và hòa tan trong nước, không độc, được sử dụng phổ biến trong lĩnh vực y tế
[20].
Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, các hạt bạc hấp thụ mạnh lên bề mặt của PVP,
chuỗi polyvinyl pyrolidon tạo ra hiệu ứng không gian, ngăn cản sự kết hợp giữa các
hạt [20]. Cơ chế ổn định hạt bạc của PVP gồm các giai đoạn:
+ Đầu tiên, PVP chuyển một cặp electron từ nguyên tử oxi và nitơ trên
mạch sang các orbital s và p các ion bạc tạo nên kiên kết phối trí với ion bạc.
+ PVP thúc đẩy sự hình thành nhân của kim loại bạc do phức ion Ag + -
PVP dễ bị khử hơn so với ion Ag + tự do trong dung dịch vì ion Ag + nhận điện tử từ
PVP.
+ Chuỗi PVP ngăn cản sự kết tụ của các hạt bạc do hiệu ứng không gian.
8
Hình 1.2. Cơ chế ổn định hạt nano bạc của PVP [20]
PEG có nhiều ứng dụng hữu ích trong y sinh do PEG có nhiều đặc tính cốt lõi
liên quan đến những lợi ích đối với các protein sử dụng trong điều trị và còn rất nhiều
ứng dụng khác trong các lĩnh vực khác nhau. PEG được sử dụng như một chất khử cho
việc chuẩn bị các hạt kim loại ở nhiệt độ cao (>170 0C) và không hoạt động để giảm
lượng Ag+ ở 800C. Đáng ngạc nhiên hơn, Ag+có thể được giảm xuống đều đặn để tạo
hạt nano bạc tại cùng một điều kiện trong PEG 2000 Da. Nghiên cứu sâu hơn đã chứng
minh rằng tỷ lệ giảm của Ag+ để tạo thành hạt nano bạc được tăng cường đáng kể với
sự gia tăng chiều dài chuỗi polymer của PEG. Kích cỡ hạt nano phụ thuộc vào nhiệt độ
9
phản ứng và nồng độ của tiền chất và sự gia tăng nhiệt độ ảnh hưởng đến sự thay đổi
của phạm vi kích thước hạt từ 10-80nm.
Hiện nay, trên thế giới đã sản xuất nhiều sản phẩm tiêu dùng có chứa nano bạc
như hộp đồ đựng thức ăn, bình sữa trẻ em làm bằng nhựa có pha thêm nano bạc, hay
các thiết bị gia đình như mấy giặt, tủ lạnh.v.v. đếu sử dụng nano bạc để diệt khuẩn.
Ứng dụng trong y tế
Trong lĩnh vực y tế nano bạc được sử dụng để tẩm vào các loại băng, gạc băng
bó vết thương nhằm tránh nhiễm trùng. Hay như việc chế tạo khẩu trang có tẩm nano
bạc dùng để diệt vi khuẩn, bảo vệ con người.
10
Hình 1.5. Khẩu trang nano bạc
Thiết bị điện tử: Các nhà khoa học cũng đang nghiên cứu ứng dụng nano bạc để
sản xuất linh kiện điện tử phục vụ nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng. Các
thiết bị điện tử ứng dụng công nghệ nano sẽ có kích thước nhỏ gọn hơn nhưng lại có
tốc độ xử lý và tuổi thọ cao hơn các thiết bị sử dụng các công nghệ truyền thống
11
không khí, kể cả những nơi có điều kiện sống khắc nghiệt như trên miệng núi lửa hay
trên băng tuyết.v.v. Có rất nhiều chủng vi khuẩn, và mỗi chủng vi khuẩn đều có sự
khác nhau về đặc tính và hình thái.
Vi khuẩn có nhiều hình dáng: vi khuẩn có nhiều hình dáng khác nhau và được
gọi với tên gọi theo hình dạng của chúng như trực khuẩn (bacillus), hình cầu, xoắn
khuẩn (spirillum), hình que, cầu khuẩn (coccus)… hình dáng vi khuẩn là một đặc điểm
quan trọng để nhận dạng các chi được đặt tên theo hình dạng.
Vi khuẩn có ích hoặc có hại cho môi trường, thực vật và động vật bao gồm cả
con người. Một só tác nhân gây bệnh như bệnh uốn ván (tetanus), sốt thương hàn
(typhoid fover), giang mai (syphilis), tả (cholera), lao (tuberculosis)…
12
Đặc điểm:
E.coli hay còn gọi là vi khuẩn đại tràng, là một trong những loài vi khuẩn chính
ký sinh trong đường ruột của người và động vật máu nóng. Chúng được phát hiện đầu
tiên vào năm 1885 do Escherich phát hiện, thuộc họ vi khuẩn Enterobacteriaceae.
Chúng là các trực khuẩn Gram âm. Kích thước trung bình (2-3µm) x 0.5 µm. Trong
những điều kiện không thích hợp vi khuẩn có thể dài như sợi chỉ.
Đặc điểm:
Staphylococcus hay tụ cầu khuẩn là những vi khuẩn hình cầu, có đường kính từ
0.8 – 1.0 µm, và thường tập trung thành từng chùm như những chùm nho, bắt màu
Gram dương [3]. Tụ cầu khuẩn có ba loại có ý nghĩa với y học là tụ cầu vàng
(S.aureus), tụ cầu da (S. epidermidis) và S. saprophyticus. Hai trong ba loại này có thể
13
gây ra các bệnh nhiễm trùng cơ hội: S.epidermidis gây nhiễm khuẩn da và viêm nội
tâm mạc, S.saprophyticus gây nhiễm khuẩn tiết niệu. Sự cư trú trong cơ thể và môi
trường bệnh viện giữa các loại tụ cầu khuẩn tiết niệu dẫn tới sự truyền cho nhau khả
năng kháng thuốc, làm cho sự kháng kháng sinh tăng lên, nhất là trong bệnh viện, càng
làm cho việc điều trị chúng bằng kháng sinh khó khăn hơn.
Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng diệt khuẩn của keo nano bạc
Kích thước, hình dạng hạt, nồng độ và sự phân bố là các yếu tố ảnh hưởng trực
tiếp đến tính kháng khuẩn của keo nano bạc.
14
+ Kích thước hạt nano bạc là yếu tố quan trọng quyết định khả năng diệt
khuẩn của chúng. Hạt nano bạc có kích thước càng nhỏ thì khả năng diệt khuẩn của
chúng càng mạnh, vì khi ở kích thước càng nhỏ thì tỉ số giữa diện tích bề mặt và thể
tích càng lớn và hạt cũng có thể dễ dàng tương tác với vi khuẩn hơn. Tuy nhiên các
hạt có kích thước nhỏ lại có khuynh hướng liên kết với nhau trong quá trình lưu trữ
tạo thành các hạt lớn hơn gây ảnh hưởng tới khả năng diệt khuẩn và bảo quản keo
nano bạc. Do đó trong quá trình chế tạo chúng ta phải tìm ra các phương pháp vừa tạo
ra hạt nano bạc có kích thước nhỏ vừa bền vững.
+ Các hạt nano có thể có rất nhiều hình dạng khác nhau như hình que,
hình cầu, hình tam giác,… Và sự thể hiện của các hạt nano bạc với cùng nồng độ, sự
phân bố nhưng với các hình dạng khác nhau là không giống nhau. Các hạt nano bạc có
hình tam giác cụt tính kháng khuẩn cao hơn các hạt hình cầu và các hạt nano que có
tính kháng khuẩn thấp nhất.
+ Keo nano bạc có nồng độ càng cao và sự phân bố đều thì khả năng diệt
khuẩn càng tốt. Tuy nhiên khi nồng độ quá cao, do năng lượng bề mặt hạt nano lớn,
nên các hạt nano bạc sẽ va chạm vào nhau và phá vỡ cấu trúc nano. Vì vậy chúng ta
cũng cần tìm nồng độ thích hợp để các hạt phân bố đồng đều, và tránh kết tủa.
15
phẩn có liên quan đến lên men đều cần tới sự có mặt của vi sinh vật trong đó có nấm
mốc. Nấm mốc cũng giúp tổng hợp kháng sinh, một số enzym và các hoạt chất khác
dùng trong công nghiệp thực phẩm, y dược và sử dụng rộng rãi trên khắp thế giới.
Chủng nấm mốc được sử dụng để nghiên cứu là Aspergillus còn gọi là mốc
tương. Sợi nấm có vách ngăn, cuống mang bào tử bụi phồng lên ở ngọn. Các chuổi
bào tử bụi từ đầu phồng mọc tỏa khắp mọi hướng. Bào tử bụi có thể màu vàng
(Aspergillus flavus), màu đen (Aspergillus niger). Nấm Aspergillus oryzae là loài mốc
chính trong quá trình chế tạo tương. Hai loài không độc làm tương là Aspergillus
oryzae và Aspergillus sojae có hình thái và màu sắc rất giống với 2 loài rất nguy hiểm
là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus sản sinh ra độc tố Aflatoxin gây bệnh
ung thư.
16
đoàn, đa dạng. Cấu trúc tế bào vi tảo lục có tốc độ tiến hoá khác nhau. Chúng phân bố
rộng khắp từ nước ngọt nghèo dinh dưỡng đến nước lợ, nước biển. Một số bộ chỉ sống
trên vật ẩm hay sống ngay dưới mặt đất. Hình dạng cấu trúc chung của tế bào vi tảo
lục rất đa dạng, có thể có dạng đơn độc hay tập đoàn: có dạng sợi, dạng hạt, dạng ống,
dạng màng,...Phần lớn tảo lục có dạng hình cầu, hình bầu dục, hình vuông, hình chữ
nhật, hay hình lưỡi liềm.
Tảo lục có vai trò quan trọng trong tự nhiên và đời sống nhân loại [6]. Tảo lục
là nguồn thực phẩm giàu chất dinh dưỡng cho người và động vật, chúng có khả năng
xử lý ô nhiễm môi trường, dùng làm chất chỉ thị sinh học.v.v.
+ Đặc điểm:
Vi tảo Chlorella là một chi tảo đa dạng, được Beijerinck mô tả lần đầu tiên vào
năm 1890, vi tảo Chlorella hiện có tổng cộng 38 loài. Chúng gồm các tảo tế bào đơn
bào có hình cầu hay hình ovan, không di động, đường kính không vượt quá 15 µm.
17
Màng tế bào vi tảo Chlorella mỏng chứa cellulose, tế bào chất là dịch trong suốt, chứa
thể màu hính chén chứa chlorophyll a và b, thể màu lớn, chiếm phần lớn thể tích tế bào
với một hạt tạo bột (pyrenoid). Tế bào chỉ có một nhân, thường không nhìn thấy rõ [1].
Vi tảo Chlorella có phương thức sinh sản vô tính nên tính trạng di truyền của
chúng là ổn định. Vi tảo Chlorella rất phổ biến, sinh trưởng nhanh, hệ số sử dụng năng
lượng ánh sáng cao và không đòi hỏi khắt khe về điều kiện sống [2]. Những đặc tính
này khiến cho vi tảo Chlorella được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu ứng
dụng.
Về mặt sinh lý, quá trình quang hợp của tảo vi tảo Chlorella cũng diện ra tương
tự như với các thực vật bậc cao. Vi tảo Chlorella có thể quang hợp tốt trong điều kiện
bình thường, hệ số sử dụng năng lượng mặt trời còn cao hơn cả thực vật bậc cao. Ở
Việt Nam, vi tảo Chlorella đã được nhập nội để nghiên cứu và ứng dụng từ đầu những
năm 1960 [2]. Chúng được sử dụng chủ yếu vào mục đích xử lý nước thải.
18
Chương 2. VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
VÀ THỰC NGHIỆM
Phòng thí nghiệm micro-nano, khoa Vật lý kỹ thuật & Công nghệ nano, trường
Đại học Công nghệ, Đại học Quốc gia Hà Nội: Máy khuấy từ có gia nhiệt RCT
basic, máy đo pH để bàn sension3, máy ảnh canon power shot G10, kính hiển vi
Zeiss, tủ nuôi cấy Class II, buồng đều nhiệt có lắc Shaking Incubator, lò vi sóng
Microwave, cân phân tích GR-200, tủ ấm BD 115.
Phòng thí nghiệm quang tử, khoa Vật lý kỹ thuật & Công nghệ nano, trường
Đại học Công nghệ, Đại học Quốc gia Hà Nội: Máy đo quang phổ hấp thụ
UV/VIS/NIR V-570.
Phòng Sinh học tảo, Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật và các phòng khác thuộc
Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội: Buồng đếm
Neubauer, kính hiển vi quan học (Zeiss), Máy đo pH Osi.
Máy FE-SEM 4800, tại viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Các môi trường nuôi cấy: Nuôi cấy tảo BBM, BG II, C (xem phụ lục C), nuôi
cấy khuẩn LB đặc, LB lỏng (xem phụ lục A), nuôi cấy nấm mốc Czapek (xem
phụ lục B).
19
2.1.3. Các đối tượng nghiên cứu
Vi tảo dùng trong nghiên cứu này là loài Chlorella elipsoidea. Được cung cấp
bởi phòng Sinh học Tảo, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc Gia
Hà Nội.
Hai chủng vi khuẩn E.coli VTCCB 883, Staphylococus aureus VTCCB 484, và
chủng nấm mốc ASP.Nigger-F15. Được cung cấp bởi Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật
học, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng trong chế tạo keo nano bạc
20
+ Kết thúc khuấy từ, cho dung dịch khấy từ xuống và cho vào ống falcon 50ml
bảo quản ở nơi khô mát, tránh ánh sáng.
Cơ chế phản ứng:
+ Trong quá trình phản ứng trên NaBH4 đóng vai trò là tác nhân khử, khử ion Ag +
thành Ag0. Phương trình phản ứng như sau:
21
2.2.2. Phân tích bằng máy quang phổ hấp thụ UV-vis
Phương pháp này dựa vào việc do cường độ dòng ánh sáng còn lại sau khi đi
qua dung dịch chất phân tích. Phương pháp đo UV-vis dùng để định tính, định lượng
các chất có màu và dung dịch keo dựa vào chiều cao giá trị bước sóng hấp thụ cực đại
(λmax), mật độ quang (E) và bề rộng hấp thụ.
Với mẫu keo nano bạc chế tạo, để ổn định trong điều kiện bình thường 24 giờ,
pha loãng đi 2 lần bằng nước, đưa vào cuvet thạch anh có chiều dày 1cm, ghi phổ UV-
vis trong dải bước sóng từ 300-700nm.
Dựa trên kết quả cường độ hấp thụ E và bước sóng hấp thụ cực đại (λ max) của
dung dịch keo nano bạc, suy đoán sự thay đổi kích thước hạt bạc.
2.2.4. Khảo sát hiệu quả kháng khuẩn của nano bạc
Thử nghiệm hiệu quả kháng khuẩn của 2 mẫu nano bạc (bọc PEG, PVP) với hai
loại vi khuẩn E.coli và Staphylococcus được tiến hành trên đĩa LB đặc. Sử dụng 6 đĩa
LB đặc cho thí nghiệm này, 3 đĩa nuôi E.coli và 3 đĩa nuôi Staphylococcus thử nghiệm
khả năng kháng khuẩn nano bạc bằng phương pháp đục lỗ, nhỏ vào mỗi lỗ 50µl nano
bạc, và nuôi cấy sau 12 giờ ở buồng nuôi cấy, nhằm tìm ra mẫu keo nano bạc có tính
kháng khuẩn mạnh hơn, để tiếp tục sử dụng mẫu đó cho các thí nghiệm tiếp theo. Các
bước tiến hành thí nghiệm:
22
Cấy trải vi khuẩn
+ Sử dụng pipet cho 200 µl dịch khuẩn lên bề mặt đĩa LB agar đặc.
+ Sử dụng que cấy trải (đã khử trùng) để trải đều vi khuẩn ra toàn bộ mặt đĩa.
+ Kết thúc cấy trải.
Phương pháp đục lỗ
+ Sau khi cấy trải vi khuẩn, sử dụng dụng cụ để đục 1 lỗ nhỏ tại tâm đĩa
+ Dùng pipet nhỏ 50µl nano bạc vào lỗ đợi 15 phút cho nano bạc khuếch tán
ra toàn bộ mặt đĩa.
+ Cho vào tủ nuôi qua đêm ở nhiệt độ 370C.
2.2.5. Thử nghiệm sự tương tác giữa keo nano bạc với nấm mốc
Nấm mốc được sử dụng trong thí nghiệm này là chủng Aspergillus niger do
Viện vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội cung cấp.
Chúng tôi tiến hành thử nghiệm khả năng tương tác của nấm mốc Aspergillus
niger với mẫu nano bạc bọc PEG. Nấm mốc được nuôi trên đĩa thạch bằng môi trường
Czapek. Tiến hành thí nghiệm với 2 đĩa, một đĩa đối chứng và một đĩa để thử nghiệm
với nano bạc. Các bước tiến hành như sau:
+ Với mẫu đối chứng: dùng que cấy thu các bào tử nấm từ đĩa giữ giống sau
đó chấm thành 11 điểm trên đĩa nuôi cấy.
+ Với mẫu thử nghiệm với nano bạc: chuẩn bị ống eppendorf 1ml có 0.8ml
nước cất và 0.2ml keo nano bạc, dùng que cấy thu các bào tử nấm từ đĩa
giống sau đó cho vào ống eppendorf lắc đều. Đợi 30 phút để các bào tử nấm
mốc lắng xuống. Sau đó dùng que cấy trải thu các bào tử nấm mốc và chấm
thành 11 điểm trên đĩa nuôi cấy.
+ Cả hai đĩa được nuôi trong tủ giữ nhiệt ở nhiệt độ 260C.
23
Đếm mật độ tế bào bằng buồng đếm Neubauer [29]
- Cấu tạo buồng đếm Neubauer
Buồng đếm Neubauer là một tấm thủy tinh dày khoảng 3mm, được chia ra làm
3 phần. Các phần bên ngăn cách với phần giữa bởi hai rãnh dọc. Phần giữa được chia
đôi do một rãnh ngang và thấp hơn hai phần bên 0.1mm, tạo ra hai ngăn đếm giống
nhau. Mỗi ngăn đếm được chia thành 9 ô vuông lớn mỗi ô có diện tích 1mm 2. Mỗi
ngăn đếm hình vuông, được chia thành 16 ô lớn. Riêng ngăn đếm hình vuông ở chính
giữa được chia thành 16 ô trung bình, mỗi ô trung bình lại được chia thành 16 ô nhỏ.
Tổng số ô nhỏ ở ngăn đếm chính giữa là 16x16=256 ô nhỏ.
Mỗi ô nhỏ này có diện tích là 1/400mm2 , và chiều cao là 1/10mm2.
Như vậy thể tích của ô nhỏ này là:
1/400 x 1/10 = 25.10-5 mm2
Thể tích của một ngăn đếm là:
25.10-5 x 256 = 64.10-3 mm-3 (=64.10-6ml)
Mật độ tế bào trong 1ml được tính theo công thức:
D = (A/64).106
Trong đó:
b
Hình 2.1. : Buồng đếmNeubauer
24
a- Buồng đếm nhìn thẳng và nhìn nghiêng
b- Buồng đếm đưới kính hiển vi
Để lập chu kỳ sinh trưởng của tảo, chúng ta sẽ tiến hành đếm mật độ tế bào tảo
bằng buồng đếm Neubauer. Bắt đầu đếm từ ngày tiến hành nuôi cấy (ngày số 0), tiến
hành đếm theo chu kỳ 2 ngày 1 lần cho tới khi mật độ tế bào tảo đạt giá trị cực đại.
Trên cơ sở dữ liệu thu được qua các ngày đếm, lập đường cong sinh trưởng bẳng cách
đặt trên trục tung chỉ số mật độ tế bào, đặt trên trục hoành chỉ số thời gian (ngày) nuôi
tảo.
2.2.7. Sự tương tác giữa keo nano bạc với tảo vi tảo
Lập đường chuẩn hóa giữa độ hấp thụ quang với mật độ vi tảo
25
Mật độ vi tảo Chlorella elipsoidea trong môi trường nuôi cấy tỉ lệ tuyến tính
với mật độ quan hấp thụ nên khi biết được hệ số tỷ lệ chúng ta có thể biết được mật độ
vi tảo thông qua mật độ quang hấp thụ, và ngược lại.
Để xây dựng được đường chuẩn hóa chúng ta sẽ tiến hành đo giá trị mật độ
quang hấp thụ ở bước sóng 650nm ứng với các ngày đếm mật độ. Từ đó xác định được
các điểm trên đường chuẩn hóa.
Bảng 2.2. Bảng thí nghiệm tương tác của các thể tích keo nano bạc
với vi tảo tại các pha sinh trưởng
T1-1 0 ml
T1-2 0.1ml
TN1
T1-3 1ml
T1-4 5ml
T2-1 0 ml
T2-2 0.1ml
TN2
T2-3 1ml
T2-4 5ml
T3-1 0 ml
26
T3-2 0.1ml
TN3
T3-3 1ml
T3-4 5ml
\
- Khả năng tương tác của keo nano bạc với vi tảo khi tẩm lên màng xốp
Thấm ướt tấm màng xốp bằng 30ml keo nano bạc rồi đem sấy khô bằng tủ sấy.
Sau đó dùng 30ml dung dịch tảo với mật độ 10.5 x 10 6 tb/ml đô lên màng sao cho tảo
được giữ lại trên màng. Tiến hành nuôi tảo dưới điều kiện nhiệt độ phòng, ánh sáng
đèn neon với cường độ sáng là 10000-20000 Lux theo chu kỳ quang là 10 giờ chiếu
sáng và 14 giờ tối.
a b
27
Hình 3.1. Kết quả chế tạo keo nano bạc
a - Mẫu bọc PEG
b - Mẫu bọc PVP
Kết quả chế tạo thực nghiệm mẫu keo nano bạc sử dụng NaBH 4 làm tác nhân
khử bọc PVP và bọc PEG bằng phương pháp hóa khử cho thấy dung dịch keo bạc có
màu vàng tươi đồng nhất không xuất hiện kết tủa với pH=7.0 (Hình 3.1). Hạt nano bạc
được bao bọc tốt bởi PVP và PEG.
Sử dụng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-vis và phương pháp chụp ảnh
FE-SEM để nghiên cứu tính chất của keo nano bạc chế tạo.
Hình 3.2. Kết quả đo UV-vis thực nghiệm keo nano bạc
a - Mẫu bọc PEG
b - Mẫu bọc PVP
28
Sử dụng máy quang phổ hấp thụ (UV/VIS) để xác định tính chất quang của
dung dịch keo nano bạc. Kết quả ở hình 3.2. cho thấy cường độ hấp thụ của keo nano
bạc được bọc bởi PEG sau khi pha loãng 2 lần có giá trị khoảng 0,72 tại bước sóng
400nm. Với mẫu keo nano bạc bọc PVP sau khi pha loãng 2 lần có giá trị thấp hơn
khoảng 0,66 tại bước sóng 413nm . Như vậy, kích thước hạt nano bạc ở mẫu bọc PVP
lớn hơn đã làm giảm mật độ quang và tăng bước sóng hấp thụ UV-vis so với dung dịch
keo bạc được bọc bởi PEG. Kết quả đo quang phổ hấp thụ UV-vis của keo nano bạc có
đỉnh hấp thụ cực đại trong khoảng 400-413nm phù hợp với các kết quả nghiên cứu đã
được công bố. Từ kết quả này có thể nhận định hạt nano bạc được bao bọc bởi PEG có
kích thước hạt nhỏ hơn và phân tán tốt hơn so với hạt nano bạc bọc bởi PVP.
29
b
Hình 3.3. Kết quả chụp ảnh FESEM mẫu nano bạc
a - Mẫu bọc PEG
b - Mẫu bọc PVP
Kết quả ở chụp FESEM ở hình 3.3 cho thấy kích thước hạt nano bạc bọc PVP
khoảng 25-50nm (Hình 3.3.-b). Hạt nano bạc phân tán tốt trong dung dịch. Với hình
3.3.-a mẫu nano bạc bọc PEG ta ta có thể xác định được kích thước của hạt nano bạc
khoảng 15-50nm. Hạt tương đối đồng đều và phân tán tốt trong dung dịch.
3.4. Khả năng kháng khuẩn của các dung dịch keo nano bạc
30
a b c
31
d e f
Hình 3.4. Kết quả thí nghịêm kháng khuẩn với dung dịch nano bạc
a - E.coli cho nano bạc bọc PEG d - Staphylococcus cho nano bạc bọc PVG
b - E.coli cho nano bạc bọc PVP e - Staphylococcus cho nano bạc bọc PVP
c - E.coli không cho nano bạc f - Staphylococcus không cho nano bạc
Từ kết quả thử nghiệm kháng khuẩn ở hình 3.4 của keo nano bạc đối với
Staphylococcus và E.coli ta thấy cả hai mẫu nano bạc bọc PVP và PEG đều cho kết
quả kháng khuẩn với cả hai loại vi khuẩn. Tuy nhiên mẫu nano bạc bọc PEG thể hiện
khả năng kháng khuẩn tốt hơn mẫu nano bạc bọc PVP. Sau một đêm nuôi cấy với mẫu
nano bạc bọc PEG tạo vòng kháng khuẩn khoảng 2.2cm với E.coli và khoảng 2.0cm
với Staphylococcus. Mẫu nano bạc bọc PVP tạo vòng kháng khuẩn tương ứng là 1.5cm
với E.coli và 1.3cm với Staphylococcus. Từ thử nghiệm này, chúng tôi sử dụng mẫu
keo nano bạc bọc PEG cho các thí nghiệm tiếp theo về khảo sát khả năng tương tác
của nano bạc với nấm mốc và tảo.
3.5. Sự tương tác giữa keo nano bạc với nấm mốc
a b
Hình 3.5. Kết quả thí nghịêm kháng khuẩn với dung dịch nano bạc sau 4 ngày nuôi cấy
a – Mẫu không có nano bạc
b – Mẫu có nano bạc
32
Qua hình 3.5 ta thấy với mẫu thí nghiệm không có nano bạc nấm phát triển tốt
đều khắp bề mặt đĩa. Với mẫu có nano bạc nấm mốc bị ức chế và phát triển rất chậm.
Kết quả này chứng tỏ khả năng tương tác của nano bạc với nâm mốc.
Mật độ tế bào (x 106/ml) trên các nuôi trên bốn môi trường
Thời gian nuôi cấy khác nhau
(ngày)
BG II C BBM
0
1.35 1.35 1.35
2
1.3 1.35 1.25
4
2.05 1.75 1.95
6
3.35 2.85 3.1
8
4.95 3.4 3.75
10
6.3 4.2 5.25
12
8.2 5 6.35
14
10.5 7.4 9
33
16
15.45 10.8 13.15
18
21.15 14.5 17.45
20
27.15 19.05 21.65
22
35 26.35 29.9
24
43.8 34.65 38.8
26
53.05 40.2 44.65
28
58.35 37.45 48.35
30
55.3 34.8 43.85
32
52.4 33.55 41.55
Từ kết quả bảng 3.1 và hình 3.6 Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, thời gian nuôi
cấy đạt tới đỉnh sinh trưởng là tương đối dài (sau 26-28 ngày). Sinh trưởng của vi tảo
Chlorella elipsoidea trong các môi trường dinh dưỡng khác biệt nhau một cách đáng
kể, vi tảo sinh trưởng tốt nhất trong môi trường BG II, mật độ tại đỉnh sinh trưởng đạt
58.35 x 106 tb/ml, với môi trường BBM mật độ này đạt 48.35 x 10 6 tb/ml, còn trong
môi trường C mật độ này là thấp nhất 40.2 x 106 tb/ml. Tảo Chlorella elipsoidea ở cả 3
môi trường đều sinh trưởng mạnh khi bước vào ngày thứ 6, ở đó có sự phân biệt rõ rệt
giữa các môi trường mật độ vi tảo trong các môi trường BG 11, BBM, C lần lượt là
34
3.35 x 106 tb/ml, 3.1 x 106 tb/ml và 2.85 x 106 tb/ml. Từ kết quả này chúng tôi sử dụng
môi trường BG 11 để nuôi vi tảo Chlorella elipsoidea cho các thí nghiệm tiếp theo.
a b c
Hình 3.7. Tảo Vi tảo Chlorella elipsoidea nuôi ở ngày thứ 22
a – Môi trường BG11 b – Môi trường C c – Môi trường BBM
Bảng 3.2. Bảng tương quan giữa mật độ vi tảo và giá trị OD650nm qua các ngày
OD650nm Mật độ
6.80 58.35
5.97 53.50
4.99 43.80
4.12 35
2.97 27.15
2.58 21.15
1.82 15.45
1.36 10.50
0.77 6.30
0.58 4.95
0.38 3.35
0.24 2.05
0.15 1.35
35
0.00 0.00
Hình 3.8. Đường chuẩn hóa mật độ tảo và mật độ quang hấp thụ tại các pha sinh trưởng của
vi tảo Chlorella elipsoidea
Từ số liệu đo giá trị mật độ quang hấp thụ tại các pha sinh trưởng của vi tảo
Chlorella elipsoidea.Ta xây dựng được đường chuẩn hóa giữa mật độ tế bào với
OD650nm tương ứng của vi tảo trong các pha của vi tảo Chlorella elipsoidea.
3.7.2. Khả năng tương tác của keo nano bạc với vi tảo trong dung dịch
T1 T2 T3
Ngày
36
Hình 3.9. Khả năng tương tác các nồng độ Nano bạc với vi tảo tại pha thích ứng
Qua bảng 3.3 và hình 3.9 ta thấy với thí nghiệm T1-1 không có nano bạc trong
môi trường nuôi, vi tảo phát triển theo đúng đường cong sinh trưởng, sau 8 ngày nuôi
cấy mật độ vi tảo tăng từ 1,48 x 106tb/ml lên 4,96 x 106tb/ml. Với thí nghiệm T1-4 cho
5ml nano bạc ta thấy giá trị OD 650nm giảm mạnh qua các ngày và ở ngày thứ 8 nuôi cấy
giá trị này là 0,014 tương ứng với mật độ vi tảo khoảng 0,12 x 10 6tb/ml. Còn với hai
thí nghiệm T1-2 và T1-3 cho tương ứng 0,5ml và 1ml nano bạc đường giá trị mật độ
quang hấp thụ thấp hơn so với thí nghiệm T1-1, sau 8 ngày nuôi cấy mật độ vi tảo ở thí
nghiệm T1-2 khoảng 4,42 x 106tb/ml, và ở thí nghiệm T1-3 khoảng 2,00 x 106tb/ml.
Hình 3.10. Khả năng tương tác các nồng độ nano bạc với vi tảo tại pha sinh trưởng
37
Qua bảng 3.3 và hình 3.10 ta thấy sự tương tác của nano bạc ở thí nghiệm T2
khi vi tảo ở pha sinh trưởng có sự khác biệt với T1 khi tảo ở pha thích ứng. Với mẫu
thí nghiệm T2-4 cho 5ml nano bạc ta thấy giá trị OD650nm giảm qua các ngày (từ 0,91
xuống 0,51), tuy nhiên tỷ lệ giảm không nhanh như ở T1-4 thể hiện qua độ dốc của đồ
thị. Và sau 8 ngày nuôi cấy mật độ vi tảo ở thí nghiệm T2-4 khoảng 4,44 x 106tb/ml.
Hình 3.11. Khả năng tương tác các nồng độ nano bạc với vi tảo tại pha thích ứng
Qua bảng 3.3 và hình 3.11 ta thấy thí nghiệm T3 khi vi tảo ở pha suy vong vì
vậy ở thí nghiệm T3-1 không cho nano bạc giá trị OD650nm giảm sau 8 ngày (từ 6,55
xuống 5,57), tương ứng mật độ vi tảo giảm từ 57,13 x 10 6tb/ml xuống 48,52 x
106tb/ml. Với các thí nghiệm T3-4 tốc độ giảm là nhanh nhất mật độ vi tảo giảm từ
57,14 x 106tb/ml xuống 9,5 x 106tb/ml. Ở hai mẫu thí nghiệm còn lại ta thấy tốc độ
giảm mật độ vi tảo chậm hơn so với thí nghiệm T3-4, ở thí nghiệm T3-2 giảm từ 56,78
x 106tb/ml xuống 39,11 x 106tb/ml và T3-3 mật độ vi tảo giảm từ 56,61 x 10 6tb/ml
xuống 31,44 x 106tb/ml.
Như vậy ở cả ba thí nghiệm T1, T2 và T3 ta thấy có sự tương tác giữa nano bạc
với vi tảo làm mật độ vi tảo giảm thấp hơn so với mẫu không cho nano bạc. Sự tương
tác này nhận thấy rõ rệt nhất với lượng nano bạc là 5ml. Với hàm lượng này ở cả ba
giai đoạn sinh trưởng đều có sự suy giảm đáng kể về mật độ vi tảo so với thời điểm bắt
đầu cho nano bạc. Tuy nhiên sự suy giảm này ở các pha khác nhau là không giống
nhau. Sự giảm mật độ vi tảo diễn ra nhanh nhất với thí nghiệm T3 khi vi tảo đang ở
pha suy vong và diễn ra chậm hơn với thí nghiệm T2 khi vi tảo ở pha sinh trưởng.
38
a b
Hình 3.12. Ảnh tảo Chlorella elipsoidea ở mẫu thí nghiệm T1-4 trước và sau khi
cho nano bạc 8 ngày (vật kính 40)
a - Bình không cho nano bạc
b - Bình cho 5ml keo nano bạc
Hình 3.12 cho ta thấy sau khi cho nano bạc vào trong môi trương nuôi tảo, các
hạt nano bạc đã tương tác với tảo làm tế bào vi tảo mất màu chất diệp lục chlorophyll
từ đó ức chế quá trình quang hợp của tảo. Tuy nhiên hình dạng của tế bào vi tảo không
bị phá vỡ như vi khuẩn.
3.7.3. Khả năng tương tác của keo nano bạc với vi tảo khi tẩm lên màng xốp
a b
Hình 3.13. Khả năng tương tác của nano bạc với vi tảo khi tẩm lên màng xốp
a- Ngày thứ 0
b- Ngày thứ 6
Qua hình 3.13 ta thấy nano bạc thể hiện khả năng tương tác với vi tảo khi tẩm
vào màng xốp. Sau 6 ngày nuôi cấy ta thấy vi tảo vẫn sống trên miếng xốp không có
nano bạc thể hiện qua máu xanh diệp lục trong khi đó với miếng xốp tẩm nano bạc
39
chúng ta không còn nhìn thấy màu xanh trên miếng xốp. Như vậy nano bạc được cố
định trên sợi của màng xốp đã tác động trự tiếp tới sự phát triển của vi tảo.
KẾT LUẬN
Đã chế tạo được keo nano bạc bằng phương pháp hóa khử, sử dụng PVP và
PEG làm chất bọc.
Đã khảo sát được các tính chất của keo nano bạc bằng phân tích quang phổ hấp
thụ UV-vis và chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử FESEM.
Keo nano bạc bọc PVP và PEG cho thấy khả năng kháng khuẩn như vi khuẩn
E.coli và vi khuẩn Staphylococcus.
Kết quả thử nghiệm khả năng tương tác của keo nano bạc với nấm mốc
Aspergillus niger cho thấy nano bạc có khả năng ức chế sinh trưởng của nấm mốc.
Kết quả thử nghiệm khả năng tương tác của keo bạc nano với vi tảo Chlorella
elipsoidea cho thấy nano bạc đã ảnh hưởng tới sự phát triển của vi tảo.
40
HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
Cần tiếp tục hoàn thiện các phương pháp chế tạo hạt nano bạc để thu được các
hạt nano bạc nhỏ hơn, đồng đều hơn.
Tiếp tục nghiên cứu cơ chế ảnh hưởng của nano bạc ở mức độ phân tử.
Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng khả năng kháng nấm mốc và tảo của nano bạc
trong điều kiện thực tế.
41
PHỤ LỤC
A. Phụ lục 1: Thành phần các môi trường LB nuôi cấy vi khuẩn
B.Phụ lục 1: Thành phần các môi trường nuôi cấy nấm mốc
42
STT Hóa chất Hàm lượng/l
1 Saccroza 30g
2 NaNO3 3g
3 K2HPO4 1g
4 MgSO4 0.5g
5 KCl 0.5g
6 FeSO4.7H2O 0.05g
7 Thạch 15g
8 Nước cất 1l
9 pH 6.0
C. Phụ lục 1: Thành phần các môi trường nuôi cấy vi tảo
Môi trường C
43
PIV metals
1 25mg
NaNO3
17.5mg
2 KH2PO4
3 10mg
K2HPO4
7.5ml
4 MgSO4.7H2O
5 2.5mg
CaCl2.2 H2O
2.5mg
6 NaCl
7 31mg
KOH
0.498mg
8 FeSO4.7H2O
9 1.142mg
H3BO3
0.882mg
10 ZnSO4.7H2O
44
11 0.144mg
MnCl2.7H2O
0.071mg
12 MoO3
13 0.157mg
CuSO4.5H2O
0.049mg
14 Co(NO3)2.6H2O
15 5mg
Na2EDTA
100ml
16 Distilled water
45
STT Hóa chất Hàm lượng/l
1 H3BO3 2.86g
2 MnCl2 1.81g
3 ZnSO4 0.222g
4 Na2MoO4 0.4mg
5 Na2MoO4.2H2O 0.079g
6 Na2EDTA 0.049g
Tiếng Việt
[1] Dương Đức Tiến, Võ Hành, Tảo nước ngọt Việt Nam-Phân loại bộ tảo lục
(chlorococcales), NXB nông nghiệp, 1998.
[2] Đặng Đình Kim và Đặng Hoàng Phước Hiền, Công nghệ sinh học vi tảo, NXB
Nông nghiệp, 1998.
[3] Lê Huy Chính(chủ biên), Vi sinh y học, Nxb y học, 2003.
[4] Lê Thị Thu Hiền, Nông Văn Hải, Lê Trần Bình, Bài tổng quân công nghệ sinh
học nano, Tạp chí công nghệ sinh học 2(2), 2004, Tr. 133-148.
[5] Nguyễn Đức Nghĩa , hóa học nano-Công nghệ nền và vật liệu nguồn, NXB
Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội, 2007.
[6] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thị Hoài Hà, Vi tảo (Microalgae), 2006
[7] Uldrich.J và Newberry.D, Công nghệ nano-Đầu tư & đầu tư mạo hiểm, Sách
dịch, NXB Trẻ, 2006.
[8] Vũ Đình Cự, Nguyễn Xuân Chánh, Công nghệ nano điều khiển đến từng
nguyên tử, phân tử, Nhà xuất bản khoa học kĩ thuật, 2004.
Tiếng Anh
46
[9] Badr.Y, mahmoud.M.A. Enhancement of the optical propertied of poly vinyl
alcohol by doping with silver nanoparticles, J. Appl. Polym. Sci, 99, 2006,
pp.3068-3614.
[10] Chmielewski A.G, “Worldwide developments in the field of radiation
processing of materials in the down of 21 st century”, Nukleotika,
51(supplement 1): S3-S9, 2006
[11] Liuchia-I, ph.D, Wen-Yih Jeng, Ph.D, and Andrew H.-j. Wang, ph.D, Mary E.
Hensler, Ph.D, and Yongcheng Song, Ph.D, and Fenglin Yin, Ph.D, Novel
Approach Strips Staphylococcus aureus of Virulence, National Institute of
General Medical Sciences.
[12] Mihail.C, Roco, “Converging science and technology at the nanoscale
opportunities for education and training”, Nuture biotechnology volume 21,
2003, pp.1247-1249.
[13] Pavel Pribyl & Vladislav Cepak, Chromium influences growth and cell
morphology but itself does not induce gametogenesis in three scenedesmus
obliquus strains, Czech phycology, 5, 2005, pp.91-100
[14] Shrivastava. S, et al, “Characterization of enhanced antibacterial effects of
novel silver nanoparticles”, nanotechnology, 18, 2007, pp.225103/1-225103/9.
[15] Singh. M,et al “Nanotechnology in medicine and antibacterial efect of silver
nanoparticles”, Digest journal of Nanomaterials and Biostructures,
carbohydrate Polymers,2008.
[16] Taneja. B, Ayyub. B, Chandra. R, Size dependence of the optical spectrum in
nanocrytalline silver, Physical Review B, Vol. 65, 2002, pp.245412.1-6.
[17] Tiwari. DK, Behary. J, Sen. P, “Time and dose-dependent antimicrobial
potential Ag nanoparticles synthesized by top-dow approach”, Current Science,
95(5), 2008, pp.647-655.
[18] Weast, R.C, J.A. Spadaro, R.O.Becker, et al, ”Handbook of Chemistry and
Physics”, 69th edu CRC press, Inc, Boca Raton, FL, 1988-1989, pp.127-128.
[19] William Dunn, “Application of nanoparticles in biology and medicine”,
Journal of Nanobiotechnology, Ivol.16, 2004, pp.38-42.
[20] Yu. H, et al, “Preparation and antibacterial effects of PVA_PVP hydrogels
containing silver nanoparticles”, J. Appl. Polym. Sci, 103, 2007, pp.125-133.
Internet
[21] http://www.catalogueoflife.org/details/species/id/19266
[22] http://plantphys.info/plant_biology/labaids/zygnemophyceae.shtml
[23] http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/ công _nghệ_sinh_học_nano
[24] http://www.drthuthuy.com/reseach/PEG_Tothon.html
[25] http://vi.wikipedia.org/wiki/ công_nghệ _nano
47
[26] http://vi.wikipedia.org/wiki/T%E1%BA%ADp_tin:EscherichiaColi_NIAID.jpg
[27] http://vi.wikipedia.org/wiki/Tao_luc
[28] WWW.pgodoy.com
[29] http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/cellcounting.html
48