TEHNICI UTIL CELULARA 1. Microscopia optica - microscopia optica conventionala = microscopia cu contrast de faz’ ~ microscopia de fluorescenta (microscopia confocala, microscopia de fuorescenta de inaltd rezolutie - Premiul Nobel in Chimie 2014) 2. Microscopia electronica (TEM, SEM) 3. Tehnici de fractionare celulara 4, Metode de izolare §i purificare a materialului biologic 5. Tehnici de culturi celulare 6. Metode bazate pe folosirea izotopilor radioactivi si a anticorpilor 7. Tehnologia ADN recombinant OBTINEREA OMOGENATELOR CELULARE $I FRACTIONAREA LOR PRIN CENTRIFUGARE In cadrul tehnicilor specifice laboratorului de biologie celulara pot fi mentionate metodele de disociere a celulelor in elementele lor componente (structuri subcelulate, organite). Aceste metode au primit numele generic de metode de omogenizare, intrucat pornindu-se de la un organ sau fesut cu structura bine determinatd, se realizeaz’ o distrugere partial a acesteia, cu eliberarea in mediul de ‘omogenizare a organitelor dispersate in mod omogen. De asemenea in laboratoarele de biologie celulara se folosese tehnici ce permit fractionarea unor astfel de omogenate, conducdnd la objinerea unor preparate ce contin, intr-o fazi de puritate cat mai avansata, diferitele organite. In cursul manevrelor de prelucrare a materialului biologic organitele trebuie_si-si_pastreze structura nativa si integritatea functionala, astfel incdt s& poata fi supuse unor tehnici analitice ulterioare. Cele mai importante tehnici de fractionare sunt cele bazate pe centrifugare. Omogenizarea tesuturilor si celulelor WM Orice tehnicd de omogenizare trebuie s8 actioneze asupra celulelor intr-o maniera care si provoace ruperea suprafetei celulare si sa elibereze citosolul si organitele. ™ Principalul scop este acela de a gisi conditiile reproductibile in care ruperea celulelor si se produca cu eficiemé maxima, dar utilizand un minimum de forte distructive, asttel neat s& nui provoace leziuni ale organitelor de interes $1 54 Se evite denaturatea proteinelor. Selectarea unui anumit procedeu de omogenizare depinde de: Prezenta sau absenta organitelor intracelulare; ™ Prezenfa sau absenta unui perete celular; In cazul tesuturilor ~ organizarea lor structurala. Toate celulele EK (cu cateva exceptii, de ex. eritrocitele mature de om), contin pe angi membrana plasmatica numeroase organite intracelulare, astfel incét procedeul de omogenizare trebuie sa fie suficient de sever pentru a rupe eficient membrana celulara, dar in acelasi timp suficient de bland pentru a cauza leziuni minime organitelor eliberate. Bacteriile si eritrocitele umane, pe de alta parte, nu contin ‘membrane interne si prin urmare omogenizarea urmareste doar ruperea membranei celulare si formarea unor vezicule sau fragmente de membrana,Pentru obfinere omogenatului celular se porneste de la 2 component a) Organul, fesutul sau suspensia de celule, care sunt supuse omogenizar b) Mediul de omogenizare ce reprezinta solutia apoas& ce urmeazé a realiza dispersia efectiva a elementelor subcelulare. a) MATERIALUL BIOLOGIC - poate fi ales finand cont de mai multe criter ‘H S& contina organitele ce urmeaza a fi investigate in cantitate mare; Sa poata fi prelucrat cu un minim de dificultati tehnice, in condi reproductibile, care s& evite aparitia erorilor experimentale; Sa fie bine delimitat din punct de vedere anatomic gi relativ usor accesibil pentru a scurta timpul de prelevare si pentru a evita pericolul confuziei cu alte {esuturi sau organe, Prelevarea materialului biologic se va realiza intr-un timp ct mai scurt de la sacrificarea animalului, care se executd preferabil prin exsanguinizare urmati, eventual, de perfuzarea cu ser fiziologic sau alt mediu izotonic, pentru indepartarea singelui din organe. Solufia utilizata pentru perfuzare trebuie prerdcita (0-4°C) pentru reducerea temperaturii organelor interne in vederea reducerii fenomenului de autoliza. In functie de scopul urmarit si de tipul de celule ce sunt supuse omogenizarii, aceasta operatiune poate fi realizati utilizand instrumente diferite. Toate au fa bazd acelasi principiu: prin aplicarea unor forte de naturi diferite se realizeazi ruperea membranelor celulare, cu eliberarea in mediu a confinutului intracelular. controlate, Metode de distrugere a membranelor celulare Cele mai utilizate metode de distrugere a membranelor celulare sunt: © omogenizarea mecanicd * ruperea membranelor celulare prin ultrasonicare « -dezorganizarea membranelor celulare cu ajutorul detergentilor OMOGENIZAREA MECANICA: ¥_Omogenizator POTTER-ELVEHJEM MH Aparatul universal utilizat pentru omogenizarea unor cantitati reduse (grame) de tesut este “omogenizatorul Potter-Elvehjem format: = piston de sticla sau teflon; ~eprubeta de sticla, cu un joe foarte mic (~0,2 mm). Pistonul este antrenat de un motor electric, pentru a efectua omigcare de rotatie de cu circa 1000 ture/min si in acelas timp se realizeaza si o migcare in sus si in jos aa eprubetei ce contine mediul de omogenizare $i fesutul. Acesta din urma (fragmentele de tesut) este forjat si treacd prin spatiul dintre piston gi peretele interior al eprubetei, spatiu in care se dezvolta forte de forfecare extrem de mari, ce produc la | ~ ‘inceput marungirea fesutului si apoi ruperea membranelor celulare.™@ Mentinand timpul de omogenizare la nivelul a 0,5-1,5 minute si viteza de rotire a pistonului la circa 1000 ture/min, se asiguré o bund omogenizare a tesuturilor de tip parenchimatic (hepatic, splenic, cerebral, etc) cu conservarea structurii organitelor celulare. ® Cresterea exagerata a timpului sau a turatiei duce la distrugerea mai mult sau mai putin avansatd a structurii organitelor celulare delimitate de membrane. ™ Caldura produsa prin frecarea la interfata piston-lichid este preluaté de o baie de gheata in care este mentinut omogenizatorul. Y Omogenizator cu cutite (blender) ™ In cazul fesuturilor mai dure (miocard, tesut cartilaginos) se foloseste omogenizatorul cu cutite la care fortele de frecare amintite mai sus sunt suplimentate de cele de lovire si taiere produse de o serie de cutite ce se rotesc cu turatii de 10-40.000 rov/min. M Dac& se doreste mentinerea structurii organitelor celulare este necesar ca timpul de omogenizare intr-un astfel de aparat sa fie redus la cateva secunde necesare pentru obtinerea unei suspensii de particule suficient de mici pentru a putea fi manipulate de catre omogenizatorul Potter. In caz contrar, daca timpul de omogenizare va fi mai mare de 1,5-2,5 min se produce distrugerea practic complet a structurilor celulare si subcelulare ™ Aceste aparate sunt dotate cu o manta de racire, ce asigura preluarea intregii cantitati de caldura produsa in timpul procesului. RUPEREA MEMBRANELOR CELULARE PRIN ULTRASONICARE ¥ Omogenizarea prin ultrasonicare ™ Aplicarea de ultrasunete unui lichid conduce la producerea locala a unor presiuni de ordinul miilor de atmosfere, ce produc ruperea structurilor celulare si subcelulare; m Timpul de ultrasonicare este de 10-90 sec pentru fesuturile animale; M Procesul se desfisoard intr-o baie de gheat’; mi Este adecvata pentru omogenizarea drojdiilor si bacteriilor Inlocuirea proceselor fizice de omogenizare cu metode chimice sau enzimatice Pentru lizarea eritrocitelor, limfocitelor, trombocitelor — izolate din singe sia mitocondriilor separate prin alte metode — se foloseste adaosul de detergenti_neionici (Triton X-100, Tween 20-80, etc.) sau al digitoninei, un reactiv care are capacitatea de a complexa colesterolul prezent in structura membranelor biologice si pe care le dezorganizeaza, ™ Metodele enzimatice pot fi utilizate doar cu mari precautii deoarece in general enzimele adaugate pentru a se realiza lipoliza si proteoliza nu pot fi ‘indepartate din mediul de omogenizare si astfel ele impurifica preparatul. ) MEDIUL in care se realizeazd omogenizarea trebuie st indeplineasc& anumite conditi + mentinerea unor condifii cat mai apropiate de cele ale mediului intern al organismului (acest lucru se realizeaza folosind, pe de 0 parte, solutii tampon avand © valoare de pH de 7,2-7,4 continind — dac& suntem interesati in mentinerea organitelor celulare — agenti osmotici, de tip zaharoza 0,264 M, NaCl 0,15 M, etc. Cel mai frecvent, se folosesc solutii de tampon fosfat de potasiu 0,02M-0,05M dar exist si situajii in care se preferd ca agenti de tamponare pirofosfatul de potasiu sau Tris).