ODREĐIVANJE -AMINO AZOTA U SLADOVINI I NJEGOV

UTJECAJ NA STABILNOST PIVA

Rijad Arnautović1, Zoran Iličković2

1
- Pivara Tuzla; 2- Tehnološki fakultet Tuzla

SADRŽAJ

Jedinjenja sa azotom, kojih ima u sladovini i pivu obuhvataju aminokiseline, peptide,

proteine, nukleinske kiseline i njihove derivate, amonijumove soli, nitrate, alifatične i
aromatične amine, heterociklične supstance. U praksi su od posebnog značaja aminokiseline,
peptidi, proteini i amonijumove soli. Aminokiseline i amonijumove soli su najvažniji izvori
azota za kvasac koji, putem sudjelovanja u metabolizmu kvasca, zavisno od vrste i prisutne
količine, imaju odlučujući uticaj na nastajanje sporednih proizvoda vrenja. Jedinjenja sa
azotom srednjih i velokih molekulskih masa (peptidi i proteini) su naročito značajna s
obizrom na kloidnu stabilnost (trajnost), punoću ukusa i stabilnost pjene. Usljed svega toga,
pored određivanja sadržaja ukupnog azota, treba da se obavi i odgovarajuća diferencijacija
jedinjenja sa azotom. Količina azotnih materija se najčešće određuje u cilju ocjenjivanja
efekta stabilizacije piva, a njihov značaj se ogleda u biološkoj i fizičko-hemijskoj stabilnosti
piva, trajnosti pjene i formiranja boje i arome.
Količina rastvornog (ukupnog) azota u zahmeljenoj sladovini kreće se od 900–1100 (mg/l).
Koagulirajući azot je dobar pokazatelj intenziteta i dužine kuhanja sladovine. Normalne
vrijednosti za sadržaj koagulirajućeg azota u 12% zahmeljenoj sladovini iznose 15-20 (mg/l).
Određivanjem aminokiselinskog azota u sladovini (Formolni i α-amino azot) dobija se
podatak o količini azotnih jedinjenja koje kvasac koristi za ishranu u toku fermentacije.
Količina α-amino azota u 12% sladovini treba da iznosi
- kod sladovine od čistog slada 200-250 (mg/l)
- kod sladovine sa učešćem nesladovanih žitarica, najmanje 170 (mg/l)

TEORIJSKI DIO

Bjelančevine utiču na ukus piva u pogledu punoće i zaokruženosti ukusa, od značaja su i za

pjenu piva, djeluju kao puferne komponente boje, služe kao hrana za kvasce. Između
razgradnje skroba i razgradnje bjelančevina u toku procesa komljenja postoje bitne razlike.
Dok je sladni skrob jedinstvena, relativno jednostavno građena supstanca, koja ulazi u proces
komljenja, dotle bjelančevine prisutne u sladnom zrnu predstavljeju smješu raznih jedinjenja
koja sadrže azot. One sadrže nerazgrađene sirove bjelančevine ječma, niže razgradne
proizvode, a i aminokiseline, kao najniže razgradne proizvode. Zbog toga enzimi koji
obavljaju razgradnju bjelančevina nisu, kao amilaze, dva potpuno definisana enzima, već su
endopeptidaze i egzopeptidaze čitava grupa različitih enzima, koji mogu da djeluju pod
različitim uslovima. Pored toga, dio bjelančevinastih sastojaka ponovo se taloži pod
djelovanjem temperature ili pH komine. Prilikom postupka ukomljavanja u kominu prelaze
najprije azotne supstance koje su razgrađene u toku sladovanja. Tek po dostizanju zadane
temperature, u toku komljenja dolazi do razgradnje proteina na grupe jedinjenja sa manjim
molekulima putem djelovanja proteolitičkih enzima, tako da se količina aminoazota, kao
krajnjeg proizvoda ove razgradnje, povećava.

Djelovanjem endopeptidaze količina rastvorljivog azota se povećava. Pri tome se, u prvom
redu nerazgrađeni polipeptidi dužim djelovanjem enzima razgrađuju na nižemolekularne
frakcije, na koje dalje djeluju karboksidaze, odvajajući slobodne aminokiseline. Međutim,
razgradnja do asimilabilnog azota (formolni i amino azot) je, relativno mala po dostizanju
pauze na 70ºC nema više povećanja sadržaja asimilabilnog azota. U ovoj tački, količine amida
čak i opadaju. Čak ni na temperaturi pauze za razgradnju bjelančevina, izgleda, da ne dolazi
do opadanja vrijednosti visokomolekularnih azotnih supstanci. Mada se teži da se postigne što
više slobodnog aminoazota, tako da dolazi do razgradnje i bjelančevina tkiva, i
makromolekularnih peptida, ipak, čini se da su bar ovi produkti nestabilni jer se jedan dio
visokomolekularnih frakcija azota taloži pod uticajem toplote, dok se drugi gubi usljed
reakcije sa polifenolima iz slada. Frakcije nižih molekulskih masa, nasuprot tome, ostaju u
rastvoru.

Cilj razgradnje bjelančevina je, najprije, obezbjeđenje određene količine slobodnog

aminoazota, koji je potreban za vođenje vrenja i za dobru ishranu kvasca, a samim tim utiče i
na stvaranje normalnog spektra sporednih proizvoda vrenja. Pored niskomolekularnih frakcija
azota, u sladovini je potrebno obezbjediti i dovoljne količine visokomolekularnog azota, i to
onih frakcija koje utiču na pjenu, a naročito onih čije su molekulske mase u rasponu od
10.000-60.000. Dalja razgradnja bjelančevina može dovesti do smanjivanja količine
jedinjenja koje utiču pozitivno na pjenu piva, a isto tako i na punoću ukusa i recentnost piva.
Na ovu razgradnju utiču postupak komljenja i kvalitet slada.

Nedostaci nedovoljne razgradnje bjelančevina ogledaju se prije svega u nedovoljnom

obezbjeđenju aminokiselina za kvasac, što izaziva sporo vrenje, produženo naknadno vrenje i
nastajanje nepoželjnih sporednih produkata vrenja. Usljed slabijeg vrenja nemogu u
potpunosti doći do izražaja ni prednosti slabije razgrađenog slada u pogledu uticaja na
osobine pjene piva.

Kontrola razgradnje bjelančevina u rutinskoj laboratiriji pivarskoj kontroli obavlja tako, da se

vrši frakcionisanje prisutne količine rastvorljivog azota, pri čemu se dobijaju frakcije koje su
prikazane na slici 1.

7% - koagulirajući

20 % - makromolekularni

20 %
- srednjomolekularni

60 % - niskomolekularni

33 % - formolni azot

22 % - slobodni aminoazot

Slika 1. Frakcije azota nekuhane sladovine proizvedene od 100% slada

EKSPERIMENTALNI DIO

U ovom radu vršeno je određivanje -amino azota u različitim uslovima komljenja

(temperatura, dužina pauze za razradnju bjelančevina, pH) te praćen njegov utjecaj na
stabilnost piva.

Metod rada

Za određivanje slobodnog α-amino azota primjenjuje se reakcija sa ninhidrinom koja je

najpoznatija bojena reakcija aminokiselina. Ninhidrin je oksidaciono sredstvo koje izaziva
oksidativnu dekarboksilaciju aminokiselina uz odvajanje CO2 i NH3 i nastajanje aldehida koji,
u odnosu na polaznu aminokiselinu, ima jedan C atom manje. Redukovani ninhidrin reaguje
sa neredukovanim ninhidrinom i oslobođenim NH3 dajući plavo odnosno žuto (sa prolinom)
obojeno jedinjenje. U ovoj bojenoj reakciji sudjeluje i fruktoza kao redukciono jedinjenje. U
rastvoru za razblaživanje kalijum jodat održava ninhidrin u oksidisanom obliku pa se ove
sekundarne reakcije sprečavaju. Rastvor koji se ispituje zagrijava se sa ninhidrinom pri pH
6,7, i dobijena boja se mjeri spektrofotometrom na 570 mm. Metodom se obuhvataju
aminokiseline, amonijak, kao i terminalne α-amino grupe peptida i proteina.

Aparati i uređaji

 Spektrofotometar,
 Kivete, debljina sloja 10 mm
 Epruvete 16 x 150 mmsa brušenim zapušaćima
 Pipete sa lopticompo Peleusu ili uređaj za automatsko pipetiranje
 Vodeno kupatilo

REZULTATI I DISKUSIJA

Od uslova komljenja su od najvećeg značaja temperatura i dužina pauze za razgradnju

bjelančevina. Kao što je kod pojedinih grupa enzima opseg temperatura za razgradnju
bjelančevina od 40-60ºC je srazmjerno veliki, ali se na temperaturi od 50ºC postiže izrazit
maksimum. Ispod temperature 40ºC proteoliza je još slaba, a na temperaturama 60ºC ona se
stalno smanjuje, tako da na 80ºC potpuno prestaje. Stepen razgrađenosti bjelančevina
prilikom primjene pauze za razgradnju na različitim temperaturama dat je u tabeli 1.

Temperatura (ºC) 40 45 50 52,5 55 60 65 70

Ukupni azot, (mg/100 ml) 60,0 62,5 67,5 72,5 71,5 70,0 68,5 67,5

Slobodni amino-azot (mg/100 ml) 13,7 14,0 15,2 15,5 16,3 13,8 12,4 11,6

Tabela 1. Količine ukupnog azota i slobodnog aminoazota koje prelaze u rastvor prilikom
izotermnog procesa komljenja

Iz rezultata prikazanih u tabeli može se zapaziti jak porast sadržaja ukupnog azota u komini
prilikom povećanja sa 50 na 52,5ºC i njegov samo lagani pad na temperaturama 60-70ºC.
Ovo potkrepljuje pretpostavku da se razgradnja bjelančevina odvija u početku pod uticajem
rastvornih i lioenzima prisutnih u aktivnom obliku. Količine slobodnog aminoazota se sa
porastom temperature od 40 do 55 ºC povećavaju, a sa daljim porastom temperature vrlo
izrazito se smanjuje. Od koristi je i primjena temperatura ukomljavanja nižih od stvarnih
temperatura pauza za razgradnju bjelančevina, u tom slučaju, sastojci endosperma
omekšavaju, enzimi se rastvaraju, pa nastupa intenzivna razgradnja, koja se ispoljava u
povećanju aktivnosti endopeptidaza i karboksipeptidaza. Iz tabele 2. vidi pri tome dolazi do
osiromašenja sladovine sa visokomolekularnim azotom, ali se oslobađa više aminoazota.

Temeperatura ukomljavanja ºC 35 50 65
Ukupni azot (mg/100 ml) 108,5 102,4 90,3
Slobodni amino-azot (mg/100 ml) 24,2 22,1 17,4
Valin % od ukupnog azota
Leucin % od ukupnog azota
Izoleucin % od ukupnog azota

Tabela 2. Zavisnost sadržaja aminoazota od intenziteta komljenja

Iz rezultata prikazanih u tabeli 2. može se vidjeti da se veći sadržaj aminoazota dobija kod
nižih temperatura ukomljavanja, ali da je porast sadržaja valina, leucina i izoleucina, kao
aminokiselina kje su neophodne za razmjenu materija u vrenju apsolutan, ali ne i
procentualan. Kod dekokcionog postupka komljenja ima, takođe, uticaja na razgradnju
azotnih supstanci interval temperature između pauze za razgradnju bjelančevina i sljedećeg
temeraturnog stepena.

1. ostatak komine ºC - 47 -
2. ostatak komine ºC 60 65 70
Ukupni azot (mg/100 ml) 102,5 99,9 98,7
Visokomolekularni zot (mg/100 ml) 21,5 21,7 22,1
Formolni azot (mg/100 ml) 29,3 27,8 27,1

Tabela 3. Uticaj intervala temperatura kod dekocionog postupka komljenja na razgradnju

azotnih supstanci (u vrućoj hmeljenoj sladovini)

Iz podataka datih u tabeli 3. vidi se da što je veća razlika temeperatura 1.-vog i 2.-gog ostatka
komine, to je razgradnja azotnih supstanci slabija, pri čemu se povišava udio
visokomolekularnog azota u ukupnom rastvorljivom azotu.

Uticaj pH komine veoma bitno djeluje na najvažnije enzime za razgradnju bjelančevina, jer
oni imaju optimum pH na 5,0-5,2. Ako se pH komine približi vrijednosti 5,0 bilo korekcijom
vode za proizvodnju piva, bilo dodatkom biološki dobijenih kiselina, sve se više povećavaju
količine svih frakcija dobijenih razgradnjom bjelančevina. Zakišeljavanje komine u
granicama u praksi (sa pH 5,7 na 5,4) pri tome ima za posljedicu iste efekte u pogledu
razgradnje bjelančevina, kao npr. produžavanje pauze za razgradnju bjelančevina, pri čemu,
međutim, nije zabilježeno procentualno povećanje slobodnog aminoazota. Prilikom promjene
pH količine ukupnog azota i slobodnog aminoazota mjenjaju se u istim odnosima.

Količina nesladovanih sirovina koja se može koristiti kao zamjena dijela slada u uvarku je
prema istraživanjima praktično neograničena, ukoliko se primjenuju enzimi. Smatra se da je
poželjno da se primjeni određeni udio slada, jer to obezbjeđuje bolju klajsterizaciju skroba i
unošenje onih enzima kojih nema u upotrebljivim kombinovanim enzimskim preparatima.
Ukoliko se ne koristi enzimi, tada bi granica smjela biti 40-50% preko koje se ni primjenom
slada iz šestorednog ječma ne može ostvariti besprijekorna klajsterizacija, ošećerenje i
dovoljna količina aminokiselina u sladovini.

U tabeli broj 4. je prikazano kretanje α-amino azota od varionice, naknadnog vrenja i piva u
boci u odnosu na različite odnose usipka slada i krupice.

Varionica Naknadno vrenje Pivo u boci

Odnos slada i krupice
α-amino azot α-amino azot α-amino azot
55 : 45 129,80 39,55 36,89
60 : 40 159,84 45,78 39,50
70 : 30 171,05 79,53 63,41

Tabela 4. Prikaz α-amino azota kroz različite tehnološke faze proizvodnje u odnosu na usipke
slada i krupice

ZAKLJUČAK

1. Da bi se u toku termičke obrade sirovina bez problema odvijali procesi razgradnje skroba i
bjelančevna treba da se koristi kvalitetan slad
2. Optimalni pH za razgradnju bjelančevina odnosno dobijanja α-amino azot je od 5,0 – 5,2
3. Optimalna temperatura komljenja za nastajanje α-amino azota je od 35 do 50ºC
4. Optimalni temperaturni interval za razgradnju bjelančevina odnosno za nastajanje α-
amino azota je porast sa 50 na 52,5ºC
5. Iz dobijenih rezultata za različite odnose sirovina (slad:krupica) se vidi da se kod odnosa
slada i krupice (70:30) u sladovini dobiju najveće vrijednosti α-amino azota, te se na
osnovu toga dobija pivo stabilnije pjene i kvaliteta.

LITERATURA

1. Pivarski priručnik, K. Štefanić i V. Marić

2. Tehnologija proizvodnje sladovine, Narzis, 1988
3. Elucidation of the Role of Nitrogenous wort components in yeat fermentation C. Lekkas,
G.G. Stewart, A.E. Hill, B. Taidi and J. Hodgson
4. Brewing yeast and fermentation, Chris Boulton and David Quain
5. Tehnologija slada i piva, P.M Malcev