Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 1

Aplicaciones de las enzimas:

Como catalizadores industriales: biotransformaciones de sustancias a gran escala,
generalmente de la industria de la alimentación.
Como catalizadores para la producción de compuestos de alto valor añadido, usos
clínicos o detección enzimática. Generalmente: aplicaciones clínicas, analíticas
o de síntesis.

Actividades enzimáticas más utilizadas:

Hidrolasas
Proteasas
Lipasas
Esterasas
Oxidoreductasas
Oxigenasas
Liasas, transferasas, isomerasas
Nitrilasas
Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 2

Relación coste-producción
Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 3

Enzimas más utilizadas en la industria

Enzima Uso
α-amilasa Hidrólisis de almidón
Glucosa isomerasa Producción de fructosa
Proteasas del cuajo y sustitutos fabricación de queso
β-galactosidasa Hidrolisis de lactosa
Aminoacilasa prod. L-aminoácidos
Aspartasa prod. L-aspártico
Catalasa Antioxidante en alimentos
Celulasa Prod. alcohol y glucosa
Ficina, papaina Tratamiento carne
Invertasa Hidrólisis de sacarosa
Lactasa Hidrólisis de lactosa
Lipasa Fabricación de queso
Pectinasa Clarificación de zumos, prod. alcohol
Proteasa Detergentes
Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 4

Reactores enzimáticos

Sistemas
Discontínuos: la reacción se produce
en un tiempo determinado en
recipientes. Tras el proceso el
enzima se descarta o se recupera
para iniciar un nuevo proceso.

Contínuo: el enzima permanece

confinado frente a sustrato y
producto que fluyen en la fase
móvil
Factores:
Costes
de purificación del enzima
de inmovilización
de preprocesamiento del sustrato
(eliminar inhibidores etc)
Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 5

Tipos de inmovilización de enzimas

Podemos considerar cuatro tipos de inmovilización:

• Insolubilización de enzimas
• Compartimentación mediante membranas semipermeables
• Unión del enzima a Soporte sólido fijo
• Unión a soporte sólido móvl

También es posible inmovilizar organismos vivos o inactivados

• Biofilms: células vivas unidas a un soporte sólido que permite su crecimiento
• Formación de agregados celulares
• Inmovilización de material celular inactivo
Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 6

Características de los soportes

Según su morfología: Porosos- permiten una mayor carga de enzima por unidad de
volumen. Son mas caros
No porosos: tienen como ventaja menos efectos difusionales
negativos
Según su estructura:
Soportes orgánicos Biopolímeros Soportes inorgánicos

Poliestireno Celulosa Esferas de vidrio (poroso o

no poroso)
Nylon Polidextranos (sephadex) Acero

Resinas de fenol- Agarosa Óxidos metálicos (cerámicas

formaldehido eg. TiO2, Al2O3, NiO)

Copolímeros acrílicos Colágeno Arena

(poliacrilamida)

Factores importantes respecto al soporte:

• Estabilidad
• Compatibilidad con el enzima
• Compatibilidad con el sustrato y el material a procesar
 Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 7

Métodos de inmovilización

Iónica Intercambiadores Intercambiadores

aniónicos catiónicos
Hidrofóbica (amino, guanidino y aminas (sulfato, fosfato, carboxilo)
cuaternarias)
Interacciones con iones metálicos DEAE-Celulosa CM-celulosa
DEAE-sephadex CM-sephadex
DEAE-bio-gel SP-Sephadex
Inmovilización Amberlite IRA Amberlite IRC
de proteínas de Dextran sulfato
membrana,
lipasas..
Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 8

Ejemplo de inmovilización en matrices quelantes de cationes metálicos

Acetil-colinesterasa 6xhis

Istamboulie et al.
Biosensors and Bioelectronics
Volume 23, Issue 4, 30 November 2007,
Pages 506-512
Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 9

Inmovilización por unión covalente

Monopunto Multipunto Grupos reactivos en

proteínas:
Amino terminal

Es necesario un grupo reactivo en el soporte y Carboxilo terminal

otro en el enzima. Normalmente los soportes no amino (Lys)
contienen grupos reactivos: es necesario
activarlos. Tiol (Cys)
Carboxilo (Asp, Glu)
Fenol (Tyr)
Guanidino (Arg)
Imidazol (His)
Disulfuro (Cys)
Indol (Trp)
Tioeter (Met)
Hidroxilo (Ser)
 Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 10

carbonato
(inerte)
Ejemplo de las H2O
OH CNBr O CN OCONH2
reacciones de activación
para la unión covalente OH OH
OH
de enzimas a soportes
H2 O
sólidos: activación de
grupos hidroxilo con
CNBr O
C NH
O
Imidocarbonilo
(reactivo)

NH
OC NH E Isoureas
O H2 N E
C NH
OH
O

O
C N E Imidocarbonatos
O

O CONH E Carbonatos

OH
Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 11

Entrecruzamiento “Crosslinking”

HOC(CH2 )3 CHO + H2 N E NH 2

Ejemplo: glutaraldehido como

agente intercalante

CH N E N CH(CH 2 )3 CH N E

N
CH
Base de Schiff
(CH2 )3

CH
N

CH N E N CH(CH 2 )3 CH N E
Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 12

Reticulación

Ejemplo de inmovilización por atrapado de enzimas en polímeros:

AWP: fotopolímero soluble en agua basado en polivinilalcohol

Istamboulie et al.
Biosensors and Bioelectronics
Volume 23, Issue 4, 30 November 2007,
Pages 506-512
 Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 13

Formación de microesferas por cambio de fase

Solución acuosa Solución hidrofóbica

Ejemplo: formación de
“esferozimas de lipasas”

Actividad en heptano saturado con agua

Entrecruzamiento

Brady et al.
BMC Biotechnology 2008, 8:8 Microesferas 20% lipasa 80% albúmina teñido con azul de coomasie A y al
microscopio electrónico B
Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 14

Efectos de la inmovilización en la actividad enzimática

Conformación tras
unión a soporte
sólido

Aumento de la
estabilidad:
Temperatura
pH
Fuerza iónica

Aumento de vida
media de la actividad
enzimática
Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 15

Efectos cinéticos

Accesibilidad al sitio activo: cambios en Km

Efectos de partición: Ocurren cuando las concentraciones de reactivo son

diferentes en la superficie del soporte sólido que en el grueso de la solución.

Efectos difusionales o de transferencia de masa:

• Externos: proviene de la presencia de una película de líquido inmóvil

alrededor de la partícula de enzima inmovilizada

• Internos: ocurre cuando las enzimas quedan atrapadas en polímeros.

En ambos casos si la velocidad de transformación de sustrato es superior a la

velocidad de difusión se observan cambios en Vmax consecuencia de la
disminución efectiva de reactivo
Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 16

Ejemplo de efectos sobre la actividad: alfa-amilasa inmovilizada en poli(metil

metacrilato-acrílico) microesferas

Cambio en el óptimo de pH

Aumento de
estabilidad/incremento
del óptimo de
temperatura

Aksoy et al,
J. Biotechnology, 1998, 60, 37-46

CDI: activación de microesferas con carbodiimida; SOCl2: activacióón con tionilcloruro

Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 17

Ejemplo de efectos sobre la actividad: alfa-amilasa inmovilizada en poli(metil

metacrilato-acrílico) microesferas

Incremento de Km tras
inmovilización
Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 18

Producción de jarabe de fructosa a partir de almidón

1º α-amilasa (endo) termoestable de Bacillus: rompe enlaces α1-4: se obtiene glucosa,

maltosa y maltodextrinas (β-amilasa exo: no se utiliza)

2º Isoamilasa y pululanasa (rompen enlaces α1-6)

3º Amiloglucosidasa (=glucoamilasa): (exo) enlaces α1-4 de maltosa y dextrinas, también

actividad limitada sobre enlaces α1-6

4º Glucosa isomerasa de bacillus o streptomyces: transforma glucosa en fructosa.

Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 19

Enzimas utilizadas en la hidrólisis de almidón

EC
Enzyme Source Action
number
Only α-1,4-oligosaccharide links are cleaved to give α-
Bacillus
dextrins and predominantly maltose (G2), G3, G6 and G7
amyloliquefaciens
oligosaccharides
Only α-1,4-oligosaccharide links are cleaved to give α-
α-Amylase 3.2.1.1 B. licheniformis dextrins and predominantly maltose, G3, G4 and G5
oligosaccharides
Only α-1,4 oligosaccharide links are cleaved to give α-
Aspergillus oryzae,
dextrins and predominantly maltose and G3
A. niger
oligosaccharides
Saccharifying Only α-1,4-oligosaccharide links are cleaved to give α-
B. subtilis
3.2.1.1 dextrins with maltose, G3, G4 and up to 50% (w/w)
α-amylase (amylosacchariticus)
glucose
Only α-1,4-links are cleaved, from non-reducing ends, to
β-Amylase 3.2.1.2 Malted barley
give limit dextrins and β-maltose
α-1,4 and α-1,6-links are cleaved, from the nonreducing
Glucoamylase 3.2.1.3 A. niger
ends, to give β-glucose
Only α-1,6-links are cleaved to give straight-chain
Pullulanase 3.2.1.41 B. acidopullulyticus
maltodextrins
Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 20

Producción de jarabe de fructosa a partir de almidón

Past a de almidón
pH4.2 NaOH NaOH
Ca2 + Mg 2+ Desio niz ar
HCl

8 -1 0 DE >9 5 % Dx 4 2 % Fruct osa

pH 6 , 95 -10 0 ºC, 9 0 min pH 4 .5 , 6 0 -6 2 ºC, 1 2 -9 6 h pH 7-8 .5, 5 5 -60 ºC

alf a-amilasa ( Bacillus Glucoamilasa ( Aspergillus niger) Glucosa isomerasa
lic henif or m is) Pululanasa ( Bacillus deramif icans) ( St rept omyces )
( enzima soluble) ( Enzima inmovilizada)

DE: equivalent e de dext rosa, medida del número de ext remos reduct ores present es en
el hidrolizado. Almidón no hidrolizado: DE aprox = 0 ; t ot alment e hidrolizado DE aprox =10 0

% Dx: % de dext rosa en la solución

Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 21

Inmovilización de glucosa isomerasa

Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 22

Comparación de rendimientos de glucosa isomerasa no inmovilizada e

inmovilizada para la producción de HCFS

Batch Batch Continuous

Parameter
(soluble GI) (immobilised Gl) (PBR)

Reactor volume (m3) 1100 1100 15 All processes

start with 45%
Enzyme consumption (tonnes) 180 11 2 (w/w) glucose
syrup DE 97
Activity, half-life (h) 30 300 1500 and produce
Active life, half-lives 0.7 2 3 10000 tonnes
per month of
Residence time (h) 20 20 0.5 42% fructose
2+
Co (tonnes) 2 1 0 dry syrup.
Mg2+ (tonnes) 40 40 7 Some of the
improvement
Temperature (°C) 65 65 60 that may be
pH 6.8 6.8 7.6 seen for PBR
Colour formation (A420) 0.7 0.2 < 0.1 productivity is
due to the
Filtration - - substantial
C-treatmenta C-treatment C -treatment development of
Product refining
Cation exchange Cation exchange - this process
Anion exchange Anion exchange -
Capital, labour and
5 5 1
energy costs, £ tonne-1
Conversion cost, £ tonne-1 500 30 5

http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/hfcs.html
Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 23

Producción de aminoácidos

Aminoácido Aplicación
ala Potenciador de sabor
arg Terapia de enfermedades hepáticas
asp Potenciador de sabor
asn terapia
cys producción de pan,
glu Potenciador de sabor
Uso en alimentación

gly síntesis de edulcorantes

his terapia de úlceras antioxidante
ileu Infusiones
leu Infusiones
lys aditivo en alimentos
met aditivo en alimentos
phe Infusiones
pro Infusiones
ser Cosméticos
thr aditivo en alimentos
trp Infusiones, antioxidantes
tyr Precursor de L-DOPA
val Infusiones
Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 24

Obtención de isómeros
Aminoacilasa

(D,L) R CH COOH + H 2 O (L) R CH COOH + (D) R CH COOH + R'COOH

NHCOR' NH 2 NHCOR'

acil-D,L-aminoácido L-aminoácido Acil-D-aminoácido

Métodos de biosíntesis de L aminoácidos con enzimas

inmovilizadas
Aminoácido material de partida enzima matriz

L-aspártico fumarato amónico aspartasa poliacrilamida

poliuretano
triacetato de celulosa
L-triptófano indol y L-serina Triptófano sinatasa triacetato de celulosa
L-triptófano indol, piruvato y NH3 Triptofanasa Sepharosa activada CNBr
L-tirosina fenol, piruvato y NH3 β-tirosinasa Sepharosa activada CNBr
Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 25

Obtención de isómeros

Aspartasa L-aspártico descarboxilasa

E. coli Pseudomonas dacunhae
HOOC CH CH COOH + NH3 HOOC CH2 CH COOH CH3 CH COOH
Fumárico NH2 NH2
L-alanina
Racemasa L-aspártico
Alanina racemasa

HOOC CH2 CHOH COOH

D-alanina

Málico
Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 26

Utilización de lipasas

•Las reacciones son enantiómero-específicas

•Son estables en disolventes orgánicos
•No requieren cofactores
•Tienen una especificidad de sustrato amplia

Aplicaciones como hidrolasas:

9Aditivos en detergentes
9Ingredientes en alimentos: Enriquecer en ácidos
grasos poliinsaturados a partir de lípidos de
vegetales y animales.
9Producción de fármacos: anticolesterolémicos,
trombolíticos y antiinflamatorios.
9Industria papelera: Eliminación mediante hidrólisis
de triglicéridos y ceras de la pulpa de papel
Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 27

Uso de enzimas para análisis

Biosensores basados en sistemas enzimáticos

Determinación de ácido úrico con urato oxidasa

O
NH NH
NH2 H2NCONH O
O + O2 + H2O + H2O2 + CO2
NH NH
O NH Urato O
Urato oxidasa Alantoína

Ácido úrico absorbe a 293 nm

Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 28

Biosensores basados en sistemas enzimáticos

Determinación de glucosa con hexoquinasa y glucosa 6-fosfato deshidrogenasa:

Hexoquinasa
Glucosa + ATP → Glucosa -6-P + AD

Glucosa 6-P deshidrogenasa

Glucosa-6-P + NADP+ + H2O → 6-fofogluconato + NADPH + H+

se mide NADPH a 350 nm

Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 29

Sistemas enzimáticos acoplados detectores electrónicos

A: Bioreceptor
B: transductor
C: amplificador
D: procesador
E: Salida digital o analógica
 Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 30

Biosensores Potenciométricos
Potencial eléctrico
Tipos:
9Electrodos de vidrio para cationes: el
elemento sensor es una membrana de
vidrio que genera un potencial
eléctrico debido a la competición entre Electrodo de referencia
cationes por los sitios de unión
específicos
9Elecrodos de vidrio recubiertos por
membrana permeable a gases
selectiva para CO2, NH3 o H2S. La
difusión del gas produce un cambio de
pH que detecta el electrodo
9Electrodos sólidos donde la
Electrodo Ag/AgCl interno
membrana de vidrio es reemplazada
por un conductor específico hecho de
HCl diluído
una mezcla de sulfuro de plata y
haluro de plata. Sensible a I- en la
reacción de la peroxidasa y a iones Membrana semipermeable
Membrana selectiva del pHmetro
cianuro
Enzima
Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 31

Biosensores potenciométricos
Reactions involving the release or absorption of ions that may be utilised by
potentiometric biosensors.
(a) H+ cation,
glucosa oxidasa H2O
D-glucose + O2 → D-glucono-1,5-lactone + H2O2 → D-gluconate + H+

penicillinasa
penicillin → penicilloic acid + H+

ureasa (pH 6.0)a

ATP+ H2NCONH2 + H2O + 2H+ → 2NH4+ + CO2 + ADP + H2PO4
ureasa (pH 9.5)b
ATP+ H2NCONH2 + 2H2O → 2NH3 + HCO3- + H+ + ADP + HPO4 2-

lipasa
neutral lipids + H2O → glycerol + fatty acids + H+
Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 32

Biosensores potenciométricos

(b) NH4+ cation,

L-amino acid oxidase
L-amino acid + O2 + H2O → keto acid + NH4+ + H2O2
asparaginase `
L-asparagine + H2O → L-aspartate + NH4+
urease (pH 7.5)
ATP + H2NCONH2 + 2H2O + H+ → 2NH4++ HCO3- + ADP + H2PO4-
(c) I- anion,
peroxidase
H2O2 + 2H+ + 2I- → I2 + 2H2O
(d) CN-anion,
b-glucosidase
amygdalin + 2H2O → 2glucose + benzaldehyde + H+ + CN-
Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 33

Biosensores amperométricos

Reacciones:

Anodo: 4Ag + 4Cl- Æ 4AgCl + 4 e-

Cátodo: 4H+ +4 e- +O2 Æ2H2O

Total: 4Ag + 4H+ + 4Cl- +O2 Æ 4AgCl + 2H2O

glucosa oxidasa
D-glucose + O2 → D-glucono-1,5-
lactone + H2O2
Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 34

Biosensores amperométricos

http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/piezo.html
Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 35

Generación
Biosensores amperométricos:
transferencia mediada o directa de
electrones
1

3
 Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 36

Ejemplos de biosensores amperométricos y potenciométricos

Stabiliy (days)
Sensor Enzyme Immobilizalio Device
n
100
Glucose Glucose oxidase Covalent Oxygen elec.
120
Ethanol Alcohol oxidase Cross-linked Oxygen elec.
10
Pyruvate Pyruvate oxidase Adsorption Oxygen elec.
120
Uric acid Uricase Cross-linked Oxygen elec.
70
L-Amino acid L-Amino acid oxidasa Covalent Ammonia gas
2
L-Glutamine Glutaminase Adsorption Ammonium ion
elect.
2
L-Glutamic Glutamate dehydrogenase Adsorption Ammonium ion
acid elect.
30
L-Asparagine Asparaginase Entrapment Ammonium ion
elect.
20
L-Tyrosine L-Tyrosine decarboxylase Adsorption C02 gas elec.
-
L-Lysine L-Lysine decarboxylase, amine Cross-linked Oxygen elec.
oxidase
-
L-Arginine Arginine decarboxylase, amine Cross-linked Oxygen elec.
oxidase
-
L-Phenylalani L-Phenylalanine ammonia lyase - Ammonia gas elect.
ne
90
L-Methionine Methionine ammonia lyase Cross-linked Ammonia gas
Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 37

Biosensores termométricos

⎛B B⎞
R2 = R1 exp ⎜ − ⎟
⎝ T2 T1 ⎠

A: muestra
B: recipiente aislado
C: intercambiador de calor
D: bloque de aluminio
E: termistor de referencia
F: bioreactor empaquetado 1 mL
G: termistor
H: salida Ejemplo: Acetilcolinesterasa
I: dispositivo electrónico: mide la Acetilcolina + H2 O = colina + acetato.
diferencia de resistencia entre
los termistores
Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 38

Otros biosensores

Piezoeléctricos
Ópticos
Inmunosensores
Resonancia de plasmón
superficial (surface
plasmon resonance)
Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 39

Biosensores piezoeléctricos

La frecuencia de resonancia (f) de un cristal piezoeléctrico varía cuando se

adsorben o separan moléculas a la superficie del cristal, según la relación:

Kf 2 ΔM
Δf =
A

Δf: variación en la frecuencia de resonancia (Hz)

ΔM: variación en la masa del material adsorbido
K: constante dependiente del tipo de cristal
A: área de la superficie de adsorción (cm2)
Tema 3 Aplicaciones industriales de enzimas 40

Biosensores basados en interacciones sustrato-proteína

9Proteínas unidas a
fluoroforos
9Metaloproteínas
9Proteínas con grupos
indicadores internos