) SUKSESI MIKROALGAE PADA INSULASI DINGIN DAN DINDING LUAR TANGKI LNG/LPG : SUATU PENDEKATAN MORFOLOGIS DAN MOLEKULAR Microalgae Succession on Cold Insulation and The Outer Wall of LNG/LPG Tank : A Morphological and Molecular Approach Juju Juarsih!, Irfan Dwidya Prijambada?, Donny Widianto? Program Studi Bioteknologi Sekolah Pascasarjana Universitas Gadjah Mada ABSTRACT Corrosion on metal equipment of natural gas industries, which is caused by microorganism activity, is preceded by the growth of pioneer microorganisms and then followed by the growth of other organisms. The purposes of this research are to reveal microalgae succession process on cold insulation and the outer wall of LNG/LPG tank, as well as to identify the microalgae that involved in the process. The microalgae samples were obtained from PT Badak NGL Bontang, East Kalimantan. Microalgae isolation and identification were done in Laboratory of Microbiology, Center for Biotechnology Study, Gadjah Mada University. Samples were taken from four locations, i.e., upper tank (dome), wet lower tank, dry lower tank and cold insulation, which have the highest microalgae growth. Sampling was done using community change ecological method within 1 m? plot. Sample plots were clean. The sampling were done every two weeks until two month. The obtained microalgae were identified based on morphological observation according to Humm (1980). Molecular analysis to detect the microalgae community was implemented by using RISA (Ribosomal Intergenic Spacer Analysis). Several kinds of microalgae were found two weeks after cleaning. There were found 4, 2, 4 and 3 genera respectively on dome, wet lower tank, dry lower tank and cold insulation. Four 1 Gang Haji Mansyur Syah Rt.04/02 Kedung Wuluh, Padalarang, Ciamis Selatan Jawa Barat ? Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada, Yogyakartaweeks after cleaning, on dome, wet lower tank, dry lower tank and cold insulation were found 3, 2, 2 and 2 genera respectively. Six weeks after cleaning, there were found 3, 4, 1 and 2 genera respectively on dome, wet lower tank, dry lower tank and cold insulation. In the end of the observation, eight weeks after cleaning, on dome, wet lower tank, dry lower tank and cold insulation were found 4, 4, 3 and 4 genera respectively. After identification, it was found that 61% microalgae not identified. Thirty nine percent microalgae were classified in to the genera of Chroacoccus, Lyngbya, Gloeocapsa, Oscillatoria, Gloeotrichia and Trentepohlia. Molecular analysis shows that for some DNA bands, Several kinds of bands were identified two weeks after cleaning. There were found 4, 3, 4 and 4 bands respectively on dome, wet lower tank, dry lower tank and cold insulation. Four weeks after cleaning, on dome, wet lower tank, dry lower tank and cold insulation were found 3, 3, 2 and 3 bands respectively. Six weeks after the cleaning, there were found 3, 2, 2 and 1 bands tespectively on dome, wet lower tank, dry lower tank and cold insulation. In the end of the observation, eight weeks after cleaning, on dome, wet lower tank, dry lower tank and cold insulation were found 2, 2,1 and 1 bands respectively. Both morphological observation and molecular analysis indicate the occurrence microalgae succession. The genera of Gloeocapsa were found to be the pioneer micrealgae which become dominant at the end of the observation at all sampling locations. Key words : corrosion, microalgae, succession, RISA. PENGANTAR Korosi dapat dijumpai pada bangunan-bangunan maupun peralatan industri yang memakai logam seperti seng, tembaga, besi, baja dan sebagainya. Proses korosi pada dasarnya merupakan reaksi logam menjadi ion pada permukaan logam yang kontak langsung dengan lingkungan berair dan oksigen (Warna, 2003). Korosi yang dijumpai pada industri besar seperti industri gas bumi yaitu, LNG (Liquefied Natural Gas) terutama terjadi pada peralatan pipa transfer dan tangki penyimpanan LNG yang terbuat dari carbon steel seperti di PT Badak NGL, Bontang, Kalimantan Timur ‘Amonim, 1999) dan di Southern California (SoCal) Gas Company ika Seri mne, 2005). i i gn ue pada peralatan operasional industri eg disebabkan oleh bahan kimia dan aktivitas ta area oC i ada’ iti: di perusahaan gas PT B c ; un ra menunjukkan adanya mikroorganisme seperti ee roalgae yang diduga memiliki peranan besar ae Seen ae jadi i 1 dingi dinding luar tangkt ner di pada insulasi dingin dan ia yan nel ini j mgkapkan proses sukse: ini bertujuan mengungkapkan Pp! i ir eae tambuh oh insulasi dingin dan dinding juar a ING / LEG serta mengidentifikasi mikroalgae yang terlibat dala: proses tersebut. CARA PENELITIAN Penentuan Sampling Penentuan lokasi sampling mengikuti aturan en likan tumbuhan lumut menurut Michael (1994). Penentuan Pe . aa ling dilakukan dengan melihat kondisi paling banyak ooo ia SE okeeenine. Petak tempat pengambilan cuplikan memiliki luas 1m? disetiap lokasinya. Pengambilan Cuplikan Cuplikan diambil dari insulasi dingin dan ee prelate ae coer epee Se merupakan i i dingin pipa transter ni : ee banyak ditambuhi mikroalgae. aaeeeee cuplikan dilakukan setiap dua minggy, dimulai a ae setelah lokasi pengambilan cuplikan dibersihkan. Na : LP — aa i mi berlangsung sampai empat kali dimul jai pade a se vember 2008 Masing-masing cuplikan dari tiap lokasi ore ; pee cara pengambilan kering dan basah. Dari ae diamati morfologi sel mikroalgae pembentuk komunt A ieee mikroskopik dan diidentifikasi sesuai dengan cara yang oleh Humm (1980).Penumbuhan Komunitas Mikroalgae yang diambil dengan cara basah segera dipindahkan ke dalam tabung Erlenmeyer, kemudian ditambah minggu. Seluruh cuplikan yang tumbuh dibawa ke Laboratorium Mikrobiologi, Pusat Studi Bioteknologi UGM, dalam tabung Komunitas mikroalgae menggunakan mikroskop. Komunitas mikroalgae yang tumbuh dalam medium BG 11 dipanen dengan sentrifugasi 13.000 rpm selama 3 menit untuk memperoleh pelet sel komunitas mikroalgae. Pelet yang diperoleh digunakan untuk isolasi DNA. Isolasi Mikroalgae Penyusun Komunitas Cuplikan yang diambil dengan cara kering (41 gram) disuspensikan dalam 9 ml air destilat dan dibuat rangkaian Pengenceran 107 sampai 105. Suspensi mikroalgae yang telah diencerkan ditumbuhkan Secara taburan pada medium BG 11 agar. memperoleh DNA isolat mikroalgae, dilakukan Pembiakan dalam medium BG 11 agar dengan metode goresan. Koloni dalam medium agar BG 11 diberi Jarutan 0,85% NaCl sebanyak 1 ml kemudian ditampung dalam tabung sentrifugasi. Dilakukan sentrifugasi 13,000 Ekstraksi DNA Pelet sel mikroalgae digerus dengan mortar + 5 menit kemudian sampel dimasukkan ke tabung sentrifugasi. Larutan buffer ekstraksi (sudah dipanaskan 65°C + 15 menit) sebanyak 300 dan 50ul lysozyme ditambahkan, lalu diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 jam. Ke dalam suspensi kemudian ditambah 75041 10% SDS dan diinkubasikan kembali pada suhu 37°C selama 1 jam. Inkubasi dilanjutkan pada suhu 65°C selama 2 jam sambil dilakukan dengan volume yang sama k: ara perlahan. Kloroform Lponceimagpnaeer te ih dan dilakukan pengocokan secara ae ae tangan sebanyak 100-150 kali dan dilanjutkan dengan oF asi Paul 13.000 rpm selama 7 menit. Pe cnait yang eat dipindahkan ke tabung sentrifugasi ue ie on i tam i ilakukan sentrifuga: i 0,6 volume isopropanol. Dilal k ae rpm selama 5 menit. Supernatan yang fa eee , Jet yang diperoleh dicuci dengan 100yl etanol 70 %, ae mee Es rif asi akhir pada 13.000 rpm selama 1 menit. Pelet dikering! aie dan setelah itu disuspensikan dalam 50yl bufer TE. Ekstraksi Fenol/Kloroform Hasil ekstraksi DNA diambil ae pease) iat a i volume menjadi 100u]. Campuran fen ow ul kemudian ditambahkan dan dilakukan Penal = ra hati-hati. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi pada a Bie selama 10 menit. Lapisan bagian atas diambil dan kemudian ; ire fad 0 , i i volume etanol a 7 i 3M sodium asetat dan 2 kali vol h porate dalam suhu -20°C semalam. Te een i i Jama 5 menit. Supe i i i kembali pada 13.000 rpm se meni eapea ey dibuang dan pelet yang diperoleh dicuci fee aoe a 70% kemudian disentrifugasi akhir pada 13.000 rpm eee ment. Pelet kemudian dikeringkan semalam dan set diresuspensikan dalam 25y] bufer TE. Ribosomal Intergenic Spacer Analysis a i Peeranerl acai mony hl Konan ig! Ee ames ita dtembahkan primer RISA SEBF dan SER masing-asing Baca a meni kemudian dimasukkan dalam mesin pendaur panas (DNA therma cycler).Metode Elektroforesis Gel agarose dengan konsentrasi 15% disiapkan den : melarutkan 0,6 gram agarose ke dalam 40 ml 1X TAE (stok 10X TAE | disiapkan dengan mencampurkan 5,6 ml asam asetat glasial; 2,35 g EDTA; 24,2 & Tris basa dalam air destilat sampai 500 ml). Larutan sampai gel menjadi padat, Sisir elektroforesis kemudian dilepas, gel - dipindahkan ke dalam bejana elektroforesis yang sudah diberi larutan TAE. HASIL DAN PEMBAHASAN : Pengamatan morfologi sel mikroalgae penyusun komunitas Pengamatan morfologi sel mikroalgae di beberapa lokasi Pengambilan cuplikan dilakukan dua minggu setelah waktu pembersihan. Lokasi pada dome (bagian atas tangki) memperlihatkan berbagai_ macam mikroalgae penyusun komunitas baik dari dua pergantian tumbuh jenis-jenis mikroalgae. Pada waktu pengamatan dua minggu setelah pembersihan telah berhasil diidentifikasi beberapa macam mikroalgae, 4 genus di dome dari kelompok algae hijau-biru (Gianobakteri) yaitu Chroococcus sp. (Gambar 1. A1) dan Lyngbya sp. (Gambar 1. A2) selebihnya belum teridentifikasi. Pada waktu pengamatan empat minggu setelah pembersihan, teramati 3 genus, Mikroalgae Chroococcus sp. menghilang tetapi terdapat jenis lain yang tumbuh yaitu Gloeocapsa sp. (Gambar 1. Bl) dan Oscillatoria sp. (Gambar 1. B2), selebihnya terdapat jenis mikroalgae yang belum teridentifikasi, Pada waktu Pengamatan enam minggu setelah pembersihan, terdapat 3 genus mikroalgae yang telah diidentifikasi dari genus Gloeocapsa dengan warna yang sedikit berbeda dari minggu pengamatan sebelumnya (Gambar 1. Cl). Pada waktu Pengamatan delapan minggu setelah pembersihan, teramati 4 genus mikroalgae. Ada genus mikroalgae yang termasuk dalam Oscillatoria hanya sedikit berbeda Pada warnanya dari minggu pengamatan sebelumnya (Gambar 1. D2). i ‘itas di dome dengan Gambar 1. Morfologi sel mikroalgae penyusun komunitas Hae il 5 42, dan 1000 {(y; um) a x aes dua minggu ere mbersihan, B = Waktu pengamatan empat minggu sae : re bersihan, C + Waktu pengamatan enam minggu setel al jpoiberstiaa| dan D = Waktu Pengamatan delapan minggu retelah pembersihan, BT = Belum Teridentifikasi. tan morfologi sel mikroalgae penyusun komunitas pada Gere bawah ieee basah (TBB) eee en mikroalgae dari kelompok algae hijau-biru (Gambar >. ea amatan dua minggu setelah pembersihan terdapat 2 genus shdkroalgae satu diantaranya adalah Gloeotrichia sp. (Gambar 2 Al) selebihnya “belum teridentifikasi. Pada Pengamatan ea minggu lah ibersihan, teramati 2 genus mikroalgae yang ber oe Sane eae sebelumnya yaitu Oscillatoria sp. (Gambar 2 aD dan Gloeocapsa sp. (Gambar 2. B2). Pada _enam ae pembersihan, terdapat 4 genus mikroalgae yaitu Lyngbya a ee. 2. C2) dan beberapa jenis mikroalgae yang belum terident 7akhir pengamatan delapan minggu setelah pembersihan, teramati 4 genus mikroalgae. Satu diantaranya dari genus Gloeocapsa yang berbeda bentuk dari waktu pengamatan sebelumnya dan beberapa jenis mikroalgae yang belum teridentifikasi. D1x.BT Gambar 2. Morfologi sel mikroalgae penyusun komunitas pada tangki bagian bawah basah dengan perbesarann 400 (x; >2,5um) dan 1000 (y; 1pm) kali. Keterangan : A = Waktu pengamatan dua minggu setelah pembersihan, B = Waktu pengamatan empat minggu setelah pembersihan, C = Waktu pengamatan enam minggu setelah pembersihan dan D = Waktu pengamatan delapan minggu setelah pembersihan, BT = Belum Teridentifi- kasi. Pengamatan morfologi sel mikroalgae penyusun komunitas pada tangki bawah yang kering (TBK) (Gambar 3.) pada dua minggu setelah pembersihan, terdapat 4 genus mikroalgae yaitu Gloeocapsa sp. (Gambar 3. A.1), Trentepohlia sp. (Gambar 3. A.2), Lyngbya sp. (Gambar 3. A.3) dan selebihnya belum teridentifikasi. Pada waktu pengamatan empat minggu setelah pembersihan, teramati 2 genus mikroalgae yaitu tumbuhnya Oscillatoria sp. (Gambar 3. B.2) dan mikroalgae dari genus Gloeocapsa dengan warna yang berbeda dari waktu pengamatan sebelumnya (Gambar 3. B.1). Tetapi pada waktu pengamatan enam minggu setelah pembersihan, teramati hanya satu genus mikroalgae yaitu Gloeocapsa sp. (Gambar 3. C.1). Mikroalgae pada waktu pe- ini agak berbeda warna dari waktu pengamatan "mye, Kemudian pada waktu pengamatan delapan minggu werelah pembersihan terlihat 3 genus mikroalgae. Muncul lagi genus ‘Trentepohlia sp. (Gambar 3. D.2) dan mikroalgae dari genus ra (Gambar 3. D1) dengan bentuk dan warna yang berbeda dari sebelummya, selebihnya masih belum teridentifikasi. i i da tangki Jogi sel mikroalgae penyusun komunitas pa aang sity ‘ewah kering dengan perbesaran A00 (x; >2,5m) dan 3000 {y; > lym) kali. Keterangan : ‘A = Waktu pengamatan dua minggu setelah pembersihan, B = Waktu pengamatan empat minggu setelah pembersihan, Cc = Waktu Pee — = mata! i setelah pembersihan dan D = Waktu pengamat n delapan minggu setelah pembersihan, BT = Belum Teridentifi kasi. tan morfologi sel mikroalgae penyusurt komunitas pada ae pace Jokasi yang terpisah 1 ae sebelumnya (Gambar 4). Pada waktu pengamatan dua she setelah pembersihan terdapat 3 genus mikroalgae eo oe (Gambar 4. A.1) dan Oscillatoria sp. (Gambar 4. 4.2) se! ov yi Lae belum teridentifikasi. Pada waktu Peet arate oe aoa pembersil lapat 2 genus yaitu ; pohlia apy BD) dan mikroalgae dari genus eis (Gambar 4. B-1). Begitu juga pada waktu pengamatan eee fa eee setelah pembersihan teramati 2 genus yang sama See oe pengamatan sebelumnya. Pada waktu pengamatan ae - : minggu setelah pembersihan tumbuh mikroalgae lain yaitu Lyng!m DiLy.Gloeocapsa sp. ‘D2xBr D3x.BT Daxlyngoya sp. Ca: 7 7 mbar 4, ee sel mikroalgae Penyusun komunitas pada insulasi ee lengan perbesaran 400 (% 2,5um) dan 1000 (y; Im) ponbeemangan f A = Waktu pengamatan dua minggu setelah an, B = Waktu pengamatan empat minggu setelah Pembersihan dan D i setelah pembersihan, BT = Belum Teedentiikeg jan minggu tangki LNG/ LPG. Proses komunitas yang telah mencapai keadaan seimbang (homeostatis). 8" Pengamatan dengan RISA (Ribosomal Intergenic Spacer Analysis) Pengamatan morfologi mikroalgae yang tumbuh pada insulasi dingin dan dinding Iuar tangki LNG/LPG sudah memperlihatkan suatu keanekaragaman. Keanekaragaman mikroalgae ini juga diamati secara molekuler, dengan memakai pendekatan ribosomal intergenic spacer analysis (RISA). M_ D2 D4 Do D8 B2 B4 Bo BS K2 K4 Ko K8 12 14 16 18 : Te Oe Gambar 5. Elektroforesis hasil PCR untuk melakukan RISA. Keterangan : M = marker; D = dome; B = tangki bawah basah; K = tangki bawah kering; I = insulasi. Nomor 2 s.d. 8 menunjukkan waktu pengamatan minggu ke-2 s.d. minggu ke-8, Marker lambda DNA yang, didigesti menggunakan enzim restriksi EcoRI+ Hasil RISA (Gambar 5.) menunjukkan bahwa macam mikroalgae pada lokasi ini sangat beragam. Pada waktu pengamatan dua minggu setelah pembersihan teramati 4 pita di dome, 3 pita di tangki bagian bawah yang basah, 4 pita di tangki bagian bawah yang kering dan insulasi dingin. Pada waktu pengamatan empat minggu setelah pembersihan teramati 3 pita di dome dan tangki bagian bawah yang basah, 2 pita di tangki bagian bawah yang kering dan 3 pita di insulasi dingin. Pada waktu pengamatan enam minggu setelah pembersihan teramati 3 pita di dome, 2 pita di tangki bagian bawah yang basah dan yang kering, serta 1 pita di insulasi dingin. Pada akhir waktu pengamatan delapan minggu setelah pembersihan teramati 2 Pita di dome dan tangki bagian bawah yang basah serta 1 pita di tangki bagian bawah yang kering dan insulasi dingin. Perubahan pita-pita DNA ini menunjukkan pola konvergensi.I solat yang selalu muncul Pada setiap waktu dan lokasi pengamata mn Pengamatan morfologi I i a ‘ gi sel terhadap mikroal, : eee oy Waktu dan Tokasi berbeda ditunjukkan ae eters t ‘ae yang diduga selalu muncul i vaktu dan lokasi pengamatan yang berbeda adalah eee i 7 1000 (B) kali. Tsolat mikroalgae i $ Penyusun komunita: sta an eet setelah pembersihan memiliki k ‘Oloni (data tidak ditunjukkan), Kar is dal . Karakte: i i a ciri khas pada jenis mikroalgae penal alan ae ee dalam medium BG 11 padat. Pada pace han ae ee yang berhasil diisolasi dari empat ae ay ae ha reagaead Sp. yang paling mudah untuk tumbuh. ikkan wa mikroal, mil iki i a sae Gloeocapsa sp. i ‘emampuan yang baik dalam beradaptasi dengan eat ae tumbuhnya. pada lokasi di dome karaKterisasi morfologi Hasil pengamatan secara morfologi maupun dengan pendekatan molekular, memberikan informasi adanya satu jenis mikroalgae yang mampu bertahan hidup di waktu dan lokasi yang berbeda. Hasil RISA dari isolat mikroalgae penyusun komunitas yang diidentifikasi sebagai spesies Gloeocapsa sp. menunjukkan adanya satu pita DNA yang berada pada posisi yang sama pada hasil RISA komunitas mikroalgae, dapat dilihat pada Gambar 7. D2 B2 K212 Perbandingan RISA Gloeocapsa sp. dan RISA komunitas mikroalgae dua minggu setelah pembersihan. Keterangan : GIns.6 = Gloeocapsa sp. yang diisolasi dari insulasi 6 minggu setelah pembersihan; GD6 = Gloeocapsa sp. yang diisolasi dari dome 6 minggu setelah pembersihan; D2 = komunitas mikroalgae di dome 2 minggu setelah pembersihan; B2 = komunitas mikroalgae di tangki bawah basah 2 minggu setelah pembersihan; K2 = komunitas mikroalgae di tangki bawah kering 2 minggu setelah pembersihan; 12 = komunitas mikroalgae di insulasi dingin 2 minggu setelah pembersihan. Gambar 7.Perbandingan pita-pita DNA pada Gambar 7., meng bahwa Gloeocapsa sp. merupakan mikroalgae yang ikut menyusun komunitas pada habitat yang dominan pada insulasi dingin dan. dinding luar tangki LNG/ LPG. Keberadaan Gloeocapsa sp., baik yang diamati secara morfologi maupun molekular, memberikan informasi bahwa pertumbuhan dari jenis algae ini mampu membentuk suatu suksesi ekologis untuk macam mikroalgae yang lain sehingga mikroalgae ini menjadi pionir. Dengan berjalannya waktu dan didukung oleh faktor lingkungan seperti air, udara maupun sinar matahari, maka jenis mikroalgae inj menjadi dominan. Berdasarkan pengamatan secara morfologi dan molekular, Gloeocapsa sp. diyakini sebagai mikroalgae pionir dan mikroalgae dominan yang tumbuh pada insulasi dingin dan dinding luar tangki LNG/LPG. Pembuktian Gloeocapsa sp. sebagai mikroalgae pionir dan dominan dari dua pendekatan tersebut menyebabkan terungkapnya proses suksesi mikroalgae. Pengungkapan proses ini diharapkan dapat mengatasi masalah korosi pada land equipment dengan mencegah tumbuhnya jasad pionir. KESIMPULAN Hasil pengamatan perubahan komunitas mikroalgae berdasarkan morfologi sel dan pendekatan molekular menggunakan metode RISA (Ribosomal Intergenic Spacer Analysis) mengindikasikan terjadinya suksesi mikroalgae pada imsulasi dingin dan dinding luar tangki LNG/LPG PT Badak NGL Bontang Kalimantan Timur. Pengamatan secara morfologi dan molekular menunjukkan bahwa genus Gloeocapsa merupakan mikroalgae pionir dan dominan. DAFTAR PUSTAKA Anonim. 1999. Corrosion of Carbon Steel. http://www.Key-to-Steel. com. Diakses 14 Mei 2005. Argonne. 2005. The mitigation and detection of microbial corrosion. http://www.,techtransfer.anl.gov. Diakses 17 Mei 2005. Humm, H.J. 1980. Introduction and Guide to The Marine Bluegreen Algae. John Wiley & Sons, Inc. Canada. i investigations. i P. 1994. Ecological methods for field and laboratory investigati a ee Ekologi untuk penyelidikan Jadang dan laboratorium, alih bahasa : Yanti R. Koestoer). Ul-Press. Jakarta. Warna. 2003 Jun 24. Korosi. http://www Reinfokus Edisi_20.com/ al Ls : Profile. Diakses 14 Mei 2005. i izati yf J. Lubeck and J. J. Kilbane. 2003. Characterization oO! ae a communities in gas industry pipelines. Appl. Environ. Microbiol. 69(9) : 5354-5363.