TALLER DE GENETICA 2 EL ESTUDIO DE LOS CROMOSOMAS HUMANOS GUIA DE ACTIVIDADES 2012Material de lectura LOS CROMOSOMAS Y EL CARIOTIPO Los cromosomas son las estructuras en que se organiza la cromatina nuclear y que tienen una expresién dinémica en las distintas fases del ciclo celular. En la mitosis estas estructuras comienzan un proceso de compactacién que aleanza su maximo nivel en la metafase, Los eromosomas se tifien ficilmente cuando estén condensados y pueden ser individualizados con el microscopio éptico. Cada cromosoma contiene una molécula de ADN lineal asociado a distintas proteinas y el contenido de genes es variable aunque esté en relacién con su tamaflo. Por eso, cualquier alteracién en el numero o la estructura de los cromosomas puede ser causa de enfermedades. Para Ia deteccién de estas alteraciones se desarrollaron numerosas técnicas y todas ellas requieren de un observador entrenado que las interprete. La citogenética es la rama de la biologia que se encarga del estudio de los cromosomas y sus anomalias. Los humanos tenemos un ntimero total de 46 cromosomas y este nimero varia segtin las especies. Los 46 cromosomas estiin constituidos por 23 pares de homblogos y cada miembro del par proviene de un progenitor. El eariotipo es la constitucién cromosémica de un individuo y es un estudio de rutina en genética médica. Los cariotipos se pueden informar presentando todos los pares etomosémicos ordenados de acuerdo a su tamafio, que en un principio eran recortados de la fotografia de una metafase, y ahora se pueden hacer con analizadores automaticos. De los 23 pares, el par de cromosomas sexuales se sefiala por separado para indicar el sexo del individuo. Para citar el cariotipo de un individuo se indica primero el niimero total de cromosomas y seguidamente los componentes del par sexual precedido de una coma. Asi, el cariotipo normal de un vardn se escribe 46,XY y el de una mujer 46,XX. Las anomalias cromosémicas son una causa més importante de abortos espontineos, retardo mental y malformaciones. EL CULTIVO CELULAR Y EL PROCESAMIENTO DEL MATERIAL, Para el estudio cromosémico se debe realizar el cultivo un tejido del individuo donde las células crezcan y se dividan rapidamente, El tejido més accesible para ese fin es la sangre y las células que crecen son los linfocitos. La técnica comienza con la toma de ‘una muestra de sangre periférica por venopuntura con heparina como anticoagulante. Se siembran alrededor de 10 gotas en un medio enriquecido y se incuba a 37°C durante 72 horas. La estimulacién de la divisién celular se logra con la adicién de un factor mitogénico como es la fitohemaglutinina. Pasado ese tiempo, se agrega una solucién de colchicina al medio para detener la divisién celular y evitar que las células completen la mitosis. La colchicina actia inhibiendo la formacién del huso mitético y las oélulas que alcanzan la metafase se acumulan en el cultivo. Luego se agrega una solucién hipot6nica que hace que las células se hinchen y se las hace estallar con una ‘técnica de goteo sobre un portaobjeto y los cromosomas se liberan. Posteriormente el ‘material se fija y se tifien de acuerdo a las diferentes técnicas. EL_BANDEO CROMOSOMICO Con Ia técnica convencional de tincién con Giemsa los cromosomas se tifien intensamente y en forma homogénea y se los puede contar.y agrupar por su aspecto general y es0 era lo tinico que se podia hacer en los primeros cariotipos. La identificacién de cada cromosoma vino posteriormente con las técnicas de bandeo, Estes ‘téonicas que generan bandas transversales permiten definir a cada cromosoma y estudiar su estructura, Cada cromosoma tiene del patron de bandas caraeteristico y existen variastécnicas de tincién con fines especificos (Tabla 1), El bandeo G es el més utilizado en citogenética clinica. El bandeo G se logra con un tratamiento controlado con tripsina antes de Ia coloracién ‘con Giemsa y produce bandas claras y oscuras en los cromosomas. Las bandas oscuras contienen ADN rico en bases A-T que replica tardiamente y son pobres en genes onstitutivos y las bandas claras contienen ADN rico en G-C que replica tempranamente y tienen muchos genes constitutivos Cuando un cromosoma esti més elongado puede mostrar un mayor niimero de bandas y esto se aprovecha para estudiarlo con mayores detalles. Esta metodologia que permite buscar alteraciones estructurales mfnimas se conoce como bandeo de alta resolucién y se logra sincronizando el cultivo y con preparaciones hechas en profase 0 prometafase, es decir, antes que los cromosomas alcancen su compactacién méxima. Los cromosomas en la mitad de la metafase muestran un nivel de resolucién de 400 bandas mientras que Jos de alta resolucién alcanzan niveles de resolucidn de 550 y hasta de 850 bandas. Tabla I: Las técnicas de bandeo més usadas, Tincién con Giemsa previo tratamiento controlado con tipsina que Bandeo G: | degrada las proteinas y produce bandas claras y oscuras. A las oscuras se las llama G+. Tineién con Giemsa previo tratamiento con calor. El bandeo R es el Bandeo R: | reverso del bandeo G. Tincién con mostaza de quinacrina 0 acridina. Se examina con Bandeo Q: | microscopio de luz fluorescente y se ven bandas brillantes en distintas intensidades. Las bandas més brillantes se corresponden con las G+. Tincién con Giemsa o fluorocromos (actinomicina D 0 eromomicina) y tratamiento previo con calor 0 lcalis. Muestra las regiones cromosémicas que contienen heterocromatina que son las centromérieas de todos los cromosomas y las secciones en 1g, 9q, 169 y distal de Yq. Bandeo EL.CROMOSOMA METAFASICO Todos los cromosomas alcanzan en la metafase su méximo grado de organizacién, ordenamiento y compactacién. Cada cromosoma metafiisico esti constituido por dos cromatides unidas por el centrémero. Este centrémero o constriecién primaria divide al ‘cromosoma en dos brazos que se designan p (petit) para el brazo corto y q para el brazo largo. De esa manera, por ejemplo, 7p es el brazo corto del cromosoma 7 e Yq es el brazo largo del cromosoma Y. La posicién del centrémero permite clasificar a los cromosomas en tres tipos principales: Metacéntricos: cuando el centrémero es mas 0 menos central y los brazos son de aproximadamente igual longitud. Submetacéntricos: cuando el centrémero esti alejado del centro y los brazos son desiguales. Acroeéntricos: cuando el centrSmero est cerea de uno de Ios extremos y uno de los brazos es muy corto.4 Los cromosomtas acrocéntricos humanos tienen satélites unidos por un tallo, excepto el 'Y. Bllos son los cromosomas 13, 14; 15, 21 y 22 y dichos satélites estén constituidos por heteroeromatina, Fig. 1: Morfologia de tres tipos principales de cromosomas humanos. —_ Je MEtACENTIICO SUBMETACENTRICO ACROCENTRICO LOS GRUPOS CROMOSOMICOS Existen 24 cromosomas humanos distintos: los 22 autosomas, el X y el Y. Estos se pueden clasificar en 7 grupos, A, B, C, D, E, F y G, de acuerdo a su morfologia y su tamafto de mayor 2 menor. Estos grupos se conformaron de acuerdo a la tincién standard con Giemsa que no permitia reconocer a cada cromosoma individualmente y solo su pertenencia a un grupo. De todos modos, sigue siendo de utilidad para denominarlos por grupos cuando hay dificultades con el bandeo. Tabla 2: Los 7 grupos de cromosomas. Grupos ‘Cromosomas Morfologia Grupo A | 1, 2y3 Metacéntricos grandes GmpoB__|4y5 ‘Submetacéntricos grandes Grupo C_| 6al 12 X ‘Submetacéntricos medianos GrupoD _| 13, 14 y 15 Actocéntricos grandes GrupoE | 16, 17 y 18 Submetacéntricos pequefios GrapoF | 19y 20 Metacéntricos pequefios Grupo G_| 21, 226 Acrocéntricos pequetiosFig. 2: Muestra de un cariotipo hecho con la téenica del recortar cada cromosoma a partir de una fotografia de In metafase (Gentileza del Centro Nacional de Genética Médica). ewan De GeneTice WEDICE Weis AS aR eumo m 304A werarnse ws 9 P2/ Cariotipo: 46,xY uy 3% fa f =a ' & = = ie Uf if Vi ad ce ae ee 68 a¢ 64 86k aa ab 3 : ee 8% &A ae be ; 3 A NOMENCLATURA CROMOSOMICA INTERNACIONAL La terminologia basica para el bandeo cromosémico se establecié en Paris en 1971 y disefié en primer ideograma con las bandas tipicas de cada cromosoma a distintos niveles de resolucién. En sucesivas reuniones internacionales se fueron actualizando los criterios de la nomenclatura cromosémica. La iltima fue en 1995 y el informe se conoce como International System for Human Cytogenetic Nomenclature (ISCN). Las regiones y las bandas se enumeran a partir del centrémero y hacia los telémeros. Elcentrémero no constituye una banda,‘Tabla 3: Algunas abreviaturas de la nomenclatura eromosémica Pp ‘brazo corto del delecién fa | Braz largo t ‘translocacion Pter | terminal del brazo corto der | derivado cromosémico ter | terminal del braze largo dup | duplicacion cen | centromero inv inversion b heterocromatina ins insereién b+ +heterocromatina aumentada upd | disomia uniparental he | heterocromatina disminuida mat | origen mateo mar | marcador pat | origen paterno 4 Fig. 3: Ideograma del cromosoma 14 a distintos niveles de resolucién (400, 550 y 850 bandas) ilustrando a nomenclatura de Paris de brazo, regién, banda, subbanda y subsubbanda, re sie! woe aie Subsubbanda 2 Tomado dela revista Human Pathology, ¥ 12, 6:495 (1981). W. B. Saunders Company. (moditicado)Para designar una banda en particilar se acordé poner primero el nimero del cromosoma seguido del simbolo del brazo, el niimero de la regién, el ntimero de la banda, subbanda, etc., todo seguido y sin dejar espacios. Ejemplo, 14q32.3 es la designacién para la subbanda 3, de la banda 2, de la regién 3, del brazo largo del cromosoma 14. Al leerlo de corrido, los ntimeros que corresponden a regisn, banda y subbanda deben decirse separadamente y no como decenas. Las bandas permiten también el mapeo de genes en el cromosoma, es decir la designacién del locus (pI. loci). Muchos rearreglos cromosémicos han permitido la identificacién de genes debido a los efectos fenotipicos de la distupeién de estos. Fig.4: Interpretacin de la nomenelatura de bandas cromosémicas. 7931.2 L____ subtanga banda region brazo cromosoma Observacién: 7931.2 es el locus el gen de la Fibrosis Quistica, Cuando de describe la composicién cromosémica, o cariotipo, de un individuo ademas del niimero total de cromosomas y el par sexual se puede también indicar ganancia 0 pérdida de un cromosoma poniendo +13 0 -16 y se interpreta como la presencia de un cromosoma 13 extra o la ausencia de un cromosoma 16 respectivamente, o lo que es lo mismo una trisomia 13 0 una monosomia 16. Cuando ocurre una translocacién reofproca entre dos cromosomas se pone t(8:14)(q24;q32) que indica que los cromosomas involucrados son el 8 y el 14 y los puntos de ruptura estén en 8q24 y 14q32, Cuando hay aumento del bloque de heterocromatina en los cromosomas que normalmente lo cointicnen se usa colocar h+ junto al brazo del ese cromosoma, por ejemplo 9qh*, y se interpreta un polimorfismo ya que esta ¢s una variacién frecuente en la poblacién normal. Bjemplos del uso de la nomeclatura en algunas anomalias cromos6micas: a 47,XX,#21; trisomia 21 en una mujer (sindrome de Down). b-47,X¥,+18: trisomia 18 en un vardn (sindrome de Edwards), c- 48,X: monosomia del X (sindrome de Turner) d- 47,XXY: trisomia de cromosomas sexuales (sindrome de Klinefelter) €- 48,X¥,t(13314)(p10;p10): translocacién entre los cromosomas 13 y el 14 con los puntos de ruptura en sus tespectivos brazos cortos (translocacién robertsoniana), £-46,XX,del(6)(q24): delecién del brazo largo del eromosoma 6 desde la banda 24 hasta el telémero. Delecién terminal &-46,XX,,der(2),t(2512)(p245q21)mat : desbalance cromosémico en una mujer producto de una translocacién reciproca entre los cromosomas 2 y 12 heredada de la madre. Tiene una trisomia parcial del segmento 12q21 y una monosomia parcial de 2p24. h-45,X[4)/47,XXX[201/46,XX176]: mosaicismo de tres lineas eclulares diferentes. Los niimeros entre corchetes indican la cantidad de metafases con esos hallazgos. i- 69,.XXY: tripliodia. Hay tres juegos haploides de todos los cromosomas.Fig, 5; Ideograma de todos los cromosomas humanos a nivel de 400 bandas. Loa 9 “Tomado de la revista Human Pathology, V 12, 6:495 (1981). W. B. Saunders Company,EJERCICIOS 1- El ndimero de cromosomas varia en las distintas especies, incluso entre el hombre y ‘uestros parientes més cercanos los grandes simios. En el siguiente ¢jercicio, conecte los ejemplos de las distintas especies con los mimeros de cromosomas correspondientes. 1- Chimpanes 220 2 Cerdo b-60 3- Gallina e718 4 Lechuga 78 5- Mosquito e-48 6- Perro £6 7- Hombre 248 8+ Papa hes 9. Vaca i-46 2. Relacione las siguientes estructuras cromosémicas con su definicién. A: crométide, B: satélite, C: centrémero, D: telémero, C: heterocromatina 1- Estructura que se encuentra normalmente en el extremo de algunos eromosomas actocéntricos, : Respuest : 5 ; 2- Una de las dos copias en que se replica un cromosoma y Inego se separa durante Ja mciosis. Respuest 3+ Constriccién primaria que divide al cromosoma en dos brazos. Respuesta: 4- Componente que habitualmente rodea al centrémero y esté presente en cantidad importante en los cromosomas I, 9, 16 e Y. Respuesta: a Bete 5+ Cada uno de los extremos distales del cromosoma. Respuesta:. 3- Al transcribirse el siguiente texto sobre los cromosomas se han cometido varios errores. Encuéntrelos y reescriba el texto correetamente. Los cromosomas humanos son 48 en total y se los puetle observar al microscopic 6ptico durante Ia interfase. Se los clasifica en 5 grupos de acuerdo a la cantidad de bandas que contienen y el famatio de cada uno, yendo de menor & mayor. Para estudiarlos se cultivan globules rojos a 72 SC durante 37 horas y se detiene el ciclo celular con fitohemaglutinina, El bandeo C es el més uusado que permite identificar a cada cromosoma por la heterocromatina que contienen. En el Dandeo G las bandas oscuras son ricas en A-C y abundantes en genes y las bandas elaras son ricas en A-T pero escasas en genes, Para designar una banda se escribe primero la region y después la banda y por titimo el ntimero del cromosoma y su brazo,10 4 El cromosoma X es un cromosoma importante que pertenece al grupo C. Su centro de inactivacién (XIC) se encuentra en Xql3. Este cromosoma contiene muchos genes que pueden ocasionar enfermedades. Marque con una flecha los loci de los citados abajo. za Gen | Locus Enfermedad a Distrofina | Xp21.2 | Distrofia Muscular de Duchenne 8 Factor Vill | Xq28 | Hemofilia A (clisica) HA PHEX Xpi2.2 | Raquitisme hipofostarémico uv NEMO [Xp2 —Treoriens pigment * FRAXA | Xq27.3_| Sindrome de Fragilidad del X Be OPNILW | Xq28 | Daltonismo (protanope) 8 ARSE ‘Xp22.3-_| Condrodisplasia punctata (XR) 3 NYX Xpli4 | Ceguera noctura congénita tipo | ms OAl ‘Xp22.3 | Albinismo ocular tipo 1 » FGDI Xpli2i | Sindrome de Aarskog ae 5-Marque en el ideograma de todos los cromosomas los loci de los genes de las siguientes enfermedades: Acondroplasia: 4p16.3 Fibrosis Quistica 7931.2 ‘Neurofibromatosis 17ql1.2 Albinismo oculocuténeo 1gl4-q21 Huntington 4pl63 Fenilcetonuria 12924.1 Hiperplasia Suprarrenal Congénita 621.3 Sindrome de Marfan 15q21.1 Osteogenesis imperfecta 17q21.31-q22 Amemia faleiforme Lpis.s 6- Procure identificar a los siguientes cromosomas de acuerdo al ideograma. begs SRE ggtt 7- Relacione los cariatipos con los grupos de anomalias eromosémicas a- 45,XX,t(13;14)(p10;p10) 1. tetraploidia b-47,X¥#16 2-translocacidn desbalanceada c+ 46,XY,dér(1)t(1;3)(p22;q13) 3- trisomia autosémi d- 46,X,del(X)(q26q28) 4-delecion &- 45,X/46,.XX 5- translocacién robertsoniana £69,XYY 6 doble trisomia ABXX ADL 418 7- trisomia sexual a: 47,XXY 8 monosomia he 92.XXXY 9- mosaicismo ie A8,XY-22 10- triploidia 8- Esoriba of cariotipo de las siguientes anomalias cromosGmicas de acuerdo ala nomenclatura: Un varén de 3 afios con sindrome de Down por trisomia 21 libre, 2+ Un feto masculino nacido muerto con trisomia 13. 3- Una nifia recién nacida con trisomia 18 en mosaico, con una linea normal, 4- Un feto femenino malformado con 5+ Una mujer con sindrome de Down por translocacién entre los cromosomas 14 y cromosoma 10 con punto de ruptura en 425, 7- Una nifia con sindrome de Turner con monosomia del X en linea pura. Un nif con hidrocefalia y fisura labial con una translocacién reciproca entre los ‘ctomosomas 4 y 18 con puntos de ruptura en pl6 y q22. 9. Una mujer sana en la que se hallé inesperadamente una inversion de un segmento del brazo corto del cromosoma 2 que comprende las bandas entre 13 y 23 10-En un estudio prenatal se encontré en un feto femenino un rearreglo cromosémico desbalanceado producto de una translocacién materna entre los cromosomas 5 y 17. Fl feto tiene un cromosoma derivado del 5 y los puntos de Fuptura estén en 5p15.2 y 17q24.9- Esta es fa fotografia de una metafase. Trate de deducir el cariotipo bajo el supuesto de que todos los cromosomas son estructuralmente normales. Comience contando el niimero total de cromosomas y Iuego encuentre el par sexual. * f eS ‘ *~ 10- Coloque ef homélogo de cada eromosoma recortando y pegando los que se encuentran en la pagina siguiente. \ 7 ii Ft 1 = 3 4 5 “4 % » Pf 4g: ft 7 re ree | 6 7 8 9 10 11 12 okt } $4 13 14 15 16 17 18 s 3 a eae 5 19 20 24 22Recorte y pegue. Fs conveniente previamente numerar cada cromosoma.