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INTRODUCCIÓN
Nivel de Bioseguridad 1: En este nivel se trabaja con agentes que presentan un peligro
mínimo para el personal del laboratorio y para el ambiente. En este nivel no se requiere
equipo especial ni tampoco un diseño específico de las instalaciones. El laboratorio no
está necesariamente aislado de las demás instalaciones del edificio. El trabajo se realiza
generalmente en mesas de trabajo abiertas. Por lo general, los materiales contaminados
se desechan en recipientes de residuos abiertos. Incluye varios tipos de bacterias y virus
como la hepatitis canina, Escherichia coli no patógena, Staphylococcus epidermidis,
Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus lactis, Sacharomyces cerevisiae, Penicillium
roqueforti, así como algunos cultivos de células.
Nivel de Bioseguridad 4: Este nivel es el que se utiliza para trabajar con agentes
biológicos que representan un alto riesgo individual de contagio y que además son un
riesgo para la vida. Por lo regular los científicos que trabajan aquí, utilizan trajes
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especiales que cubren la totalidad de sus cuerpos y que además tienen una leve
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sobrepresión para evitar que entren partículas infecciosas------ al mismo si es que éste llega
a desgarrarse. Además, las instalaciones están en un edificio separado o en un área
controlada dentro de un edificio, que está completamente aislado de las demás áreas
del edificio. Las enfermedades infecciosas que se manejan en el nivel 4 son: Virus de
la viruela, Virus de la fiebre hemorrágica de Crimea (Congo), Virus de Marburg, Virus
Ébola.
OBJETIVO GENERAL
Aprender las normas de bioseguridad aplicadas al laboratorio de inmunología.
Objetivos Específicos.
Familiarizar al estudiante con las normas de bioseguridad en el laboratorio de
inmunología.
Hacer conocer la importancia de los riesgos biológicos del manejo de material
infeccioso.
Aplicar los conocimientos en la resolución de casos de accidente ocupacional
con material infeccioso.
RECOMENDACIONES:
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protección, se desaconseja el pantalón corto o el calzado abierto.
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3. El cabello largo debe estar atado atrás o arreglado ------de manera que no entre en
contacto con las manos, con las muestras, con los contenedores ni con el
equipo.
4. Para trabajar, se colocan las muestras, reactivos etc. en la parte delantera de
la zona de trabajo, así se evita golpearlos con los brazos en un descuido.
5. Antes de utilizar un reactivo, se observa si tiene símbolos y avisos sobre su
toxicidad y riesgo de manejo (generalmente en recuadros de color naranja).
6. En el laboratorio no se debe comer, beber, aplicarse cosméticos u oler
reactivos o muestras directamente.
7. No arrojar a la papelera o desagüe material usado sin consultar al profesor.
Los residuos y el material punzante (puntas de pipeta, agujas, hojas de bisturí,
cubreobjetos y similares) se desechan en los contenedores repartidos por las
mesas.
8. La ropa protectora (bata) no debe ser usada en las áreas que no son de
laboratorio (pasillos, biblioteca, etc.).
9. Las manos deben ser lavadas después que se han quitado los guantes y antes
de dejar el laboratorio, así como en cualquier momento después de manipular
material conocido o sospechoso de estar contaminado.
10. Las superficies de trabajo deben estar limpias y descontaminadas con un
desinfectante adecuado (etanol 70%) al final del trabajo y después de
cualquier salpicadura de material potencialmente infeccioso.
11. Todo material contaminado, sólido o líquido, debe ser descontaminado antes
de descartarlo o de reusarlo.
ACCIDENTES:
Los residuos peligrosos biológico infecciosos (RPBI), son los que contienen bacterias,
hongos, virus, parásitos, microorganismos capaces de causar infecciones, efectos
nocivos para la salud y el medio ambiente.
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Color y tipo de envase requerido para cada uno de los tipos de RPBI:
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SEÑALIZACIÓN EN EL LABORATORIO
Requisitos de utilización
CLASIFICACIÓN DE PICTOGRAMAS:
1. Señales de advertencia
Forma triangular.
Pictograma negro sobre fondo amarillo, bordes negros.
2. Señales de prohibición.
Forma redonda
Pictograma negro sobre fondo blanco, bordes y banda rojos
3. Señales de obligación.
Forma redonda
Pictograma blanco sobre fondo azul
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TAREAS DE LABORATORIO:
1. Esquematizar dos pictogramas de cada uno de los 5 tipos expuestos
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PRÁCTICA 02
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INTRODUCCIÓN
Los glóbulos rojos, los glóbulos blancos y las plaquetas que conforman la sangre se
producen en la parte esponjosa (médula roja) de algunos huesos del esqueleto (esos
son: el esternón, los huesos del cráneo, las costillas, el hueso ilíaco y las terminaciones
de los huesos de los miembros superiores e inferiores.
Usualmente en adultos se utilizan las venas del pliegue antecubital del brazo, pero
también pueden ser otras zonas como, por ejemplo: del antebrazo, dorso de la mano,
dorso del pie, etc.
MATERIAL Y MÉTODOS
1. Equipo necesario para la venopunción: Equipo Vacutainer.
Tubos de vacío diseñados para llenarse con un volumen predeterminado de
sangre por medio de vacío, esto garantiza una adecuada relación entre sangre y
anticoagulante. Los tapones de goma están codificados por color de acuerdo con
el aditivo que contienen así, por ejemplo, los tubos morados (EDTA) son los más
utilizados para hematología rutinaria y los tubos celestes (citrato) para pruebas
de coagulación.
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__ Agujas especiales para adaptador.
Adaptador para tubos de vacío.
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Jeringuillas de 3, 5 y 10 cc.
Agujas: Están numeradas dependiendo de su calibre. Para colección de sangre
para hemogramas, se recomienda una aguja de diámetro de 0.8mm (21G) para
evitar daño a las células. Las agujas de 0.9-1.1mm de diámetro (20G-19G) se
utilizan normalmente para punción venosa en adultos.
Torniquete: Generalmente una liga plana de látex.
Alcohol: Etílico o isopropílico al 70%.
Algodón
Gasas y/o vendas adhesivas
Dispensador de agujas
Un adecuado etiquetado de los tubos es esencial para que los resultados de los
análisis concuerden con el paciente correcto. Los elementos clave en el
etiquetado para garantizar la calidad de la muestra pre-analítica son:
Nombre o iniciales del paciente
Número de identificación del paciente
Fecha y hora de la toma de muestra
Iniciales del flebotomista
3. Punción venosa
La punción venosa permite extraer una mayor cantidad de sangre para las
pruebas necesarias en hematología. Las venas de elección suelen ser las de la
cara anterior del antebrazo (vena cubital, vena cefálica y la vena basílica)
porque resulta fácil acceder a ellas.
4. Punción capilar
Metodología
Tome la muestra de las yemas de los dedos o lóbulo de la oreja.
Desinfecte el sitio de la punción, séquelo y puncione la piel con una
lanceta estéril que no debe penetrar más de 2 mm.
Deseche la primera gota de sangre. Tome las gotas subsecuentes en un
microtubo y prepare las laminillas con esa muestra.
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__ 5. Algunos anticoagulantes utilizados en el laboratorio
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Oxalatos: Los oxalatos de amonio y potasio se utilizan
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del primero por 2 del segundo. La sal de amonio aumenta el volumen de los
GR y la de potasio lo disminuye, por tanto, es muy usado en hematología. El
oxalato de potasio sólo se utiliza en bioquímica.
Citratos: Se utiliza la sal disódica al 3.8% (peso x volumen) en proporción
de una parte de la sal por nueve de sangre.
Dextrosa-citrato ácida: En las transfusiones de sangre y en pruebas
hematológicas para preservar los antígenos de los GR.
Sequestrene: Sal dipotásica o disódica del EDTA. Por quelación impide que
se ionice el calcio por lo que ejerce una acción anticoagulante muy intensa.
Fluoruro: Se combina con el calcio impidiendo s u acción. Puede usarse
también como conservador cuando la muestra tenga que ser guardada.
Desfibrinación: Se lleva a cabo en un matraz utilizando perlas de vidrio, a
las cuales queda adherido la fibrina formada por coagulación. Este proceso
es útil para el estudio de GB, GR y plaquetas. Se obtiene también buena
cantidad de suero.
CUESTIONARIO:
2. ¿Por qué se utiliza una ligadura en el brazo para realizar la extracción sanguínea?
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7. Componentes de los tubos vacutainer que se muestran y sus usos:
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COLOQUE SUS FOTOS DE LA PRÁCTICA TOMA DE MUESTRA
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PRÁCTICA 03
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EL HEMOGRAMA
INTRODUCCIÓN
En los frotis muy gruesos, los leucocitos son pequeños, difíciles de teñir, siendo
imposible su reconocimiento. Aun en los mejores frotis, a causa de la diferencia de
tamaño, densidad, etc., los leucocitos muestran una distribución particular. Los
monocitos grandes y los polimorfonucleares (PMN) predominan en los bordes y al
final de la extensión, mientras que los linfocitos, más pequeños, se distribuyen en
forma más uniforme en la parte media.
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Por ejemplo:
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Si se tiene 60% de neutrófilos segmentados y el recuento ------ total de leucocitos es
MATERIAL Y MÉTODOS:
1. PREPARACIÓN DE EXTENDIDOS:
MATERIAL:
Sangre total (con anticoagulante).
Láminas portaobjetos.
PROCEDIMIENTO:
Preparar una lámina cuyo ancho se ha reducido unos 5 mm. y que servirá como
"lámina extensora".
Colocar a 1 cm. del extremo de una lámina bien limpia y seca, una gota pequeña
de sangre total o directamente de la aguja, jeringa o del dedo; por delante de
ella colocar un extremo de la lámina extensora en ángulo de 30º y retroceder
hasta que toque la gota que se extenderá a lo ancho de la primera lámina, luego
deslizar la lámina extensora siempre en ángulo de 30º, en forma rápida y
uniforme hacia el otro extremo.
Si el ángulo entre las láminas es mayor, el frotis será más grueso y viceversa.
Dejar secar las láminas a temperatura ambiente y rotular.
PROCEDIMIENTO:
PROCEDIMIENTO:
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4.__-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RECUENTO DE GLÓBULOS BLANCOS ------
MATERIAL:
PROCEDIMIENTO:
PROCEDIMIENTO:
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Si en 100 G. R ----------- ------
10 plaquetas
En 3' 850 000 G.R. x mm3 ----------- X
Fórmula Leucocitaria:
Como los granulocitos generalmente están en los márgenes del extendido y los
linfocitos en el centro, se recomienda el método utilizado por Schíling, que consiste en
tomar cuatro puntos marginales distintos recorriendo el campo en zig-zag desde el
borde hacia la parte central, y contar 25 a 50 elementos en cada uno de los cuatro
puntos.
TIPO CELULAR %
Linfocitos 20 a 45
Monocitos 4a8
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Estas cifras pueden variar por condiciones climáticas, altura, ------ raza, emociones, dolor,
edad, etc. Conociendo la relación numérica y la cantidad total de leucocitos por
milímetro cúbico, es fácil establecer la fórmula absoluta de cada tipo celular de la
siguiente manera:
CÁMARA DE NEUBAUER
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TÉRMINOS USADOS: ------
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CUESTIONARIO
3. Ud. cuenta 10 campos de 100 G.R. c/u y cuenta un total de 25 plaquetas. Si se tiene
el dato que el paciente tiene 40 de Hto. ¿Cuál es en Nro. de plaquetas por mm3?
Escriba sus cálculos
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PRÁCTICA NO. 04
INTRODUCCIÓN
La bioética tiene como objetivo conectar la reflexión ética con la investigación científica,
con la finalidad de construir una ciencia con conciencia al servicio integral del hombre.
La experimentación clínica, constituye un valor en sí misma que debe ser buscado
lícitamente por los científicos y que no se contrapone con la instancia ética en cuanto
al objetivo común de ambas que es la búsqueda de la verdad para el hombre y para su
salud.
OBJETIVO
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2. Inoculación intraperitoneal en ratón, rata o cobayo. Sujete al animal con la mano,
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con la parte ventral hacia arriba, incline la cabeza hacia ------ abajo, con la idea de que
las vísceras se desplacen hacia abajo, limpie la región peritoneal con una torunda
y agua caliente; posteriormente, con una torunda desinfecte la zona, con la ayuda
de una jeringa tipo tuberculina con aguja delgada, se procede a la inoculación de
la sustancia a probar. Al introducir la aguja debe percibir que perfora los dos planos
(piel y pared abdominal).
5. Punción cardiaca. Anestesiar al animal, limpiar la zona izquierda del tórax, localizar
el corazón y extraer lentamente la sangre usando una jeringa con aguja del número
20 x 32.
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PUNCIÓN CARDIACA
INOCULACIÓN INTRAMUSCULAR
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CUESTIONARIO:
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PRÁCTICA 05 ------
FAGOCITOSIS IN VIVO
INTRODUCCIÓN
Es en ese punto de movilización lenta cuando los fagocitos, atraídos por gradientes de
concentración de las quimiocinas, atraviesan el epitelio vascular hacia el foco de
infección patógena. Los receptores sobre la membrana de los fagocitos actúan como
mecanismos de adherencia sobre los microorganismos, sea a productos microbianos
específicos o sobre opsoninas (opsonización) del sistema inmune del hospedador.
OBJETIVO
1. Comprender el proceso de fagocitosis in vivo y aplicar los conocimientos en
casos de daño tisular, o invasión de múltiples microorganismos o sustancias.
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MATERIAL Y MÉTODOS: ------
1. De laboratorio:
Tubos de ensayo.
Mechero y asa bacteriológica, en anillo.
Centrífuga
Solución salina fisiológica estéril
Tubo Nº 3 de Mc. Farland
Estufa y Baño María
Agujas hipodérmicas
Tabla de disección
Estuche de disección
Láminas porta-objetos
Soporte de coloración
Colorante de Wright y azul de metileno
Agua destilada
Microscopio
Aceite de cedro
2. Biológico:
Cultivo de Escherichia coli
Rata blanca adulta
PROCEDIMIENTO:
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TAREA DE LABORATORIO ------
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5.- DIBUJAR SUS OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS, ------ SEÑALANDO LO QUE
OBSERVA
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PRÁCTICA 06
INTRODUCCIÓN
La unión Ag.-Ac. (Anticuerpo tipo IgE) es uno de los mecanismos fisiopatológicos más importantes
que se involucran en el desarrollo de la anafilaxia, por lo cual los modelos que desarrollan las
reacciones de hipersensibilidad tipo1 asociadas a esta interacción han cobrado vital
importancia en la evaluación preclínica de sustancias con efectos antianafilácticos.
OBJETIVO
MATERIALES
Ovoalbúmina
Cobayo
Mechero y asa bacteriológica, en anillo
Solución salina fisiológica estéril
Agujas hipodérmicas N°21
Jeringas de 5 ml
Equipo de disección
Algodón
Alcohol yodado
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PROCEDIMIENTO
TAREA DE LABORATORIO
SINTOMAS OBSERVACION
Intranquilidad,
Disnea
OTROS:
NECROPSIA OBSERVACION
Corazón
Pulmones
Hígado
Riñones
Otros órganos
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4. Colocar sus fotos de la fase desencadenante (síntomas ------ y necropsia)
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PRÁCTICA DE LABORATORIO No.11 ------
PRACTICA Nro. 07
INTRODUCCIÓN:
El sistema del complemento, fue identificado hace muchos años como un principio termolábil
que “complementaba” a los anticuerpos en la función de destruir patógenos (de ahí se origina
su nombre). Ahora se conoce que esta no es su única función y que no depende siempre de
anticuerpos para actuar. El sistema del complemento juega un rol importante en la defensa
del huésped ante microorganismos y en los procesos inflamatorios. Está compuesto por
más de 30 pequeñas proteínas de superficie celular y plasmáticas, principalmente
sintetizadas en el hígado y que se encuentran normalmente como precursores inactivos
(zimógenos o pro-proteínas) que, ante la presencia de ciertos estímulos, por ejemplo,
agentes patógenos, se activan secuencialmente en forma de una cascada enzimática similar
a aquellas de la vía de la coagulación, fibrinólisis, entre otras.
II. OBJETIVO:
Determinar la integridad funcional de la vía clásica del sistema del complemento
mediante la técnica de inmuno hemólisis o capacidad hemolítica 50 (CH50).
Usar este método para comparar la actividad del complemento en distintas especies
de animales.
FUNDAMENTO DE LA PRÁCTICA
La técnica CH50 o capacidad hemolítica del complemento mide la habilidad del suero del
paciente para lisar (destruir) 50% de una suspensión de eritrocitos cubiertos con anticuerpos,
es decir valora la integridad de activación del complemento, en este caso por la vía clásica.
A pesar de que se han descrito muchas variantes, el protocolo del ensayo por inmuno
hemólisis conserva su base conceptual: realizar diluciones de la muestra (con el
complemento) a ser analizada, propiciar una reacción antígeno-anticuerpo y medir la
respuesta.
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El __-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
método CH50 utiliza distintas diluciones para determinar------la cantidad de complemento
necesaria para producir la lisis del 50% de eritrocitos. Este tipo de lisis, mediada por el
complemento se denomina inmuno hemólisis y refleja la integridad funcional de los 9
componentes del sistema de la vía clásica. Si en estos existiera un déficit, la cadena de
proteínas no se activaría correctamente y habría ausencia de inmuno hemólisis, que se
puede observar a simple vista o medirse por espectofotometría, expresándose como
porcentaje de hemólisis. Hemólisis menores de 50% indican deficiencia del complemento,
pero no permite determinar qué componente es el que está deficitario.
MATERIAL Y EQUIPOS
PROCEDIMIENTO
Luego de la incubación, centrifugar todos los tubos a 1500 r.p.m. por 5 minutos con
el fin de sedimentar los restos de eritrocitos y los eritrocitos no hemolisados.
Observar la coloración del sobrenadante de cada tubo.
Recoger el sobrenadante de cada tubo con una pipeta y en un espectrofotómetro
medir la densidad óptica del sobrenadante a 540 nm, construyendo una curva de
porcentaje de hemólisis utilizando la siguiente fórmula:
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__ DOo = Densidad óptica tubo control positivo (100%)
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PRÁCTICA 08 ------
INTRODUCCIÓN
La nomenclatura aceptada en 1928 por la Liga de las Naciones fue la de Jansky, quien propuso
cuatro grupos sanguíneos: (A, B, O, AB). El descubrimiento de los grupos sanguíneos revolucionó
la práctica de la transfusión sanguínea puesto que ya con este hallazgo era posible seleccionar los
donantes mediante pruebas pretransfusiónales in vitro. El avance en la tecnología permitió el
almacenamiento seguro de sangre y dio lugar a la formación del primer banco de sangre en
Estados Unidos en el Cook Country Hospital de Chicago en 1937. En los últimos años se ha
logrado avanzar al grado de permitir la transfusión de múltiples fracciones de sangre.
Las membranas de las células del organismo humano, incluyendo los eritrocitos, están
formadas por varias capas de moléculas lipídicas, proteicas, y carbohidratos distribuidos en tal
forma que permiten una separación entre el medio intracelular y el medio extracelular. Muchas de
estas sustancias, es decir, glicolípidos y glicoproteínas tienen capacidad antigénica y constituyen
los llamados grupos sanguíneos. Se cree también que algunos grupos sanguíneos son
proteínas puras, pero es posible que dichas sustancias solo sean las portadoras de los
determinantes antigénicos y que siempre necesiten de lípidos o carbohidratos para efectuar
como antígenos completos.
Estos antígenos de la membrana están determinados genéticamente. Los genes que
controlan la estructura de un antígeno en particular, ocupan un lugar correspondiente
(loci) en un par de cromosomas homólogos, en esta forma para todos los genes que se
encuentran en cromosomas autosómicos un individuo puede ser homocigoto o
heterocigoto. El único grupo sanguíneo que no es autosómico es el sistema XG
cuyos genes están en el cromosoma X.
Estos antígenos pueden formar parte de la membrana del glóbulo rojo como ser el
antígeno Rh que es una lipoproteina o estar adherido a la superficie de los glóbulos rojos,
como los antígenos ABO que químicamente son lipopolisacáridos. Algunos antígenos
sanguíneos (Ej. ABO) están presentes en la mayoría de los tejidos y líquidos corporales
y otros como el Rh, K, etc. limitados y formando parte de las membranas de los glóbulos
rojos. Hoy en día se conocen más de 15 sistemas de grupos sanguíneos distintos como
muchas variantes dentro de cada sistema, la mayoría tienen 2 o 3 alelos pero por ejemplo
el Rh tiene por lo menos 28 alelos.
Los antígenos A y B son glicoproteínas, producidas por genes alelicos en un locus único,
localizados en la parte proximal del brazo corte del cromosoma 9. Los antígenos
correspondientes se encuentran aparentemente adheridos a la membrana de los glóbulos
rojos. La especificidad antigénica es conferida por el azúcar, terminal; Ej. Azúcar N-
aceteilgalactosamina proporciona la especificidad antigénica A y el azúcar galactosa
determina la actividad B. Los antígenos ABO están presentes en todos los tejidos excepto
el sistema nervioso central, de donde se deduce la importancia de dicho sistema en
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transfusión de eritrocitos, leucocitos, plaquetas y transplantes
__----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------ de tejidos, también se
encuentran presentes en las secreciones, como polisacáridos solubles. El polisacárido
presente en las secreciones es químicamente idéntico al presente en los glóbulos rojos.
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OBJETIVOS
1. Adiestrar al alumno en la determinación del grupo sanguíneo ABO y Rh
2. Capacitar al alumno en la interpretación clínica de resultados en relación al sistema
ABO y Rh
MATERIAL
PROCEDIMIENTO
TAREA DE LABORATORIO
1. Explique a qué tipo de reacción serológica corresponde la determinación del grupo
sanguíneo.
2. Explique porque una persona del grupo A no puede ser donador para un receptor del
grupo B.
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4. Explique porque el grupo “AB” es considerado como receptor universal.
7. Con esquemas, explique en qué consiste la eritroblastosis fetal, proceso que puede
presentarse en algunos embarazos como consecuencia del factor Rh.
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Sistema ABO
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Grupo Genotipo
"A" AA, AO
"B" BB, BO
"AB" AB
"O" OO
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PRACTICA Nro. 09
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PRUEBAS CRUZADAS MAYOR Y MENOR Y PRUEBAS DE COOMBS
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donador como del receptor.
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Obtención de suero de donador y receptor
Tubos 13 x 100 mm
Baño maría a 37°C
Suero de Coombs (antiinmunoglobulina)
INTERPRETACIÓN
Aglutinación o hemólisis: significa que los GR del donador (paciente) tienen
Acs. Incompletos adheridos a sus glóbulos rojos. INCOMPATIBILIDAD
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Centrifugar a 2000 rpm durante un min.
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Remover suavemente los eritrocitos sedimentados
Lavar con solución isotónica 3 veces
Añadir una gota de suero de Coombs. Mezclar y centrifugar.
Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y observar si existe aglutinación o
hemólisis
INTERPRETACIÓN
Aglutinación o hemólisis: significa la presencia de anticuerpos incompletos
en el suero del donador. INCOMPATIBILIDAD.
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TAREA DE LABORATORIO
1. Colocar los resultados obtenidos
PRUEBA RESULTADOS
Prueba cruzada mayor
Prueba cruzada menor
Prueba de Coombs directa
Prueba de Coombs
indirecta
Coombs indirecta
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4. Coloque fotos del material y resultados observados
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PRÁCTICA Nro. 10 ------
INTRODUCCIÓN:
LA PROTEINA C-REACTIVA (PCR); es una proteína sanguínea que forma parte de las
denominadas Proteínas de Fase Aguda que tiene la propiedad de precipitar los
polisacáridos somáticos de los neumococos. La PCR comúnmente se encuentra
aumentada en artritis reumatoidea activa, infecciones virales, tuberculosis, fiebre
reumatoidea activa, infarto agudo del miocardio, luego de una operación quirúrgica y de
transfusiones sanguíneas. La determinación de PCR indica la intensidad de la
enfermedad y la respuesta del paciente a un tratamiento dado. La PCR se detecta en
suero por reacción con un anticuerpo específico adsorbido sobre un soporte inerte de
látex. La PCR se une a los anticuerpos adsorbidos produciendo la aglutinación de las
partículas de látex, visible macroscópicamente.
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Aunque estas pruebas habitualmente se negativizan después
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pacientes persisten reactivas por el resto de su vida, pero con títulos bajos. Un descenso
no significativo de los títulos o un nuevo ascenso después del tratamiento, hace
sospechar fracaso terapéutico o reinfección.
El objetivo de la práctica es:
1. Realizar in vitro pruebas serológicas como criterios de diagnóstico.
MATERIAL Y MÉTODOS:
2. PROTEÍNA C – REACTIVA
Los sueros positivos pueden titularse efectuando diluciones seriadas de: 1:40,
1:80, 1:160, etc.
3. ARTRITEST:
Diluir una muestra de suero 1: 20 con buffer glicina. En una placa de vidrio
colocar separadamente el suero diluido 1 gota (50 uL) y una gota de reactivo
de látex-globulina. Mezclar con un palillo descartaba hasta obtener una
suspensión uniforme,
Inmediatamente disparar el cronómetro, balanceando suavemente la placa de
vidrio observando el resultado dentro de los dos minutos.
Para la titulación de los sueros se hacen diluciones en tubos, colocando 1,9
mL de buffer glicina en el primer tubo y 1 mL en los restantes.
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Agregar 0,1 mL de suero al tubo Nº 1 mezclando, luego transferir 1 mL de la
dilución al tubo Nº 2, y así se continua con el resto de los tubos. Se obtienen
diluciones de 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, etc.
Negativo: No se ve aglutinación.
Positivo: Aglutinación dentro de los dos minutos.
Título: Inversa de la máxima dilución en la que se produce aglutinación.
4. ANTIESTREPTOLISINA-O (ASO)
Llevar los reactivos y la muestra a temperatura ambiente. Agitar el Reactivo A antes
de usar, vaciando previamente la pipeta del gotero.
En uno de los sectores delimitados de la placa adjunta al equipo colocar: 1 gota
del Reactivo A (25 ul) más la muestra ycontroles 25 ul.
Mezclar con palillo descartable (uno para cada muestra) hasta obtener una
suspensión uniforme en la superficie delimitada de la placa.
Inmediatamente disparar un cronómetro, balancear suavemente la placa y
observar macroscópicamente el resultado dentro de los 2 minutos.
En una lámina colocar una gota de suero más una gota del reactivo RPR,
agitar constantemente por 5 minutos y observar floculación visible.
Para titulación del suero se hacen diluciones en SSF al ½, ¼, 1/8, 1/16, 1/32,
colocando una gota del suero diluido más una gota del reactivo RPR.
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TAREA DE LABORATORIO:
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6. Coloque fotos de material usado en la práctica
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PRACTICA Nro. 11
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PRUEBAS DE PRECIPITACION: INMUNODIFUSION DOBLE
INTRODUCCION
El principio de la inmunodifusión es la precipitación, la cual consiste en la unión del
antígeno soluble, con el anticuerpo (también soluble) y que lo diferencia de la
aglutinación donde el antígeno es forme. Esta reacción antígeno-anticuerpo se torna un
complejo insoluble que precipita. Esta es una técnica que permite determinar cualitativa
y cuantitativamente la concentración de un antígeno o de un anticuerpo y que utiliza un
soporte o matriz de agar en el que difunden Ag y Ac. Es un método sensible que es
usado clínicamente para detectar niveles de proteínas plasmáticas. En la zona del agar
es en donde se establece el equilibrio entre las concentraciones de Ag y de Ac y se
observa una banda de precipitado. La difusión puede realizarse en una (simple) o dos
dimensiones (doble) o radial y puede realizarse tanto en tubo y en placa.
Las reacciones en geles fueron utilizadas primero para estudios inmunoquímicos a
mediados de la década de 1940, cuando Oudin introdujo la inmunodifusión “simple” en
tubos conteniendo gel de agar. El demostró que un sistema sencillo Ag-Ac daba lugar a
una banda de precipitación y que la mezcla de sistemas en el mismo tubo daba bandas
múltiples e independientes. Con estas observaciones, las reacciones de precipitación se
desarrollaron tanto cualitativas como cuantitativas.
Los métodos en gel tienen significativamente mayor sensibilidad y mayor poder de
resolución que las técnicas sin medio de soporte. Además, los resultados en los geles
actuales pueden ser fotografiados y almacenados, ya que los inmunoprecipitados
insolubles que se forman en la zona de equivalencia, son atrapados permanentemente
en la matriz del gel.
La difusión doble en agar se realiza sobre un soporte de agarosa fundida sobre una
lámina portaobjeto o placa Petri. En la agarosa se cortan pequeños pozos que rodean a
un pozo central. En el centro se coloca el Ag o Ac de concentración conocida, alrededor
se coloca la contraparte a distintas diluciones (constituye el problema que se va a
cuantificar). Ambos difundirán (doble) y al encontrase (zona de equivalencia), se produce
la reacción Ag-Ac y precipitan. Habrá complejos Ag-Ac en la zona circundante al pozo
central, distinguibles solo aquellos donde hay equivalencia. Esta es conocida como la
zona de equivalencia.
OBJETIVOS
Entender la naturaleza de la reacción de precipitación in vitro.
MATERIALES
Agarosa al 3% o agar noble al 4 %
Suero humano, de cobayo y de rata.
SSF
Suero antihumano (Antiglobulina humana)
Cámara húmeda
Lámina porta objetos de vidrio
Pipetas automáticas de 20 uL
Pipetas serológicas de 10 mL
Rosetones para perforar las láminas de agarosa
PROCEDIMIENTO
Barnizar las láminas portaobjetos con agarosa al 1% y secar al horno
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Fundir agarosa al 1% y en caliente se colocan 5 ml sobre la lámina portaobjeto sin
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derramar. Dejar que solidifique. Si usa caja petri se llenan hasta una altura de 1 a 2
mm con la solución de agar aún caliente.
Si las láminas no se van a utilizar el mismo día, pueden guardarse en cámara húmeda
a 4ºC.
Hacer varias perforaciones: una central y dos o más alrededor de ésta. Se debe
mantener una distancia de aproximadamente 0.5 cm entre pozo y pozo.
En el pozo central se coloca el antisuero humano y en los pozos periféricos se
colocan diversos sueros: humano, cobayo, rata y SSF.
Colocar la lámina en cámara húmeda e incubar a temperatura ambiente por 24 hrs.
RESULTADOS:
Observar la banda de precipitación en el lugar que corresponde a la unión del
antisuero humano con su respectivo Ag (suero humano)
TAREA DE LABORATORIO
1. Interprete los resultados obtenidos
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2. Exprese sus resultados en fotos o dibujos e interprétalo.
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PRÁCTICA Nro. 12 ------
ELISA
INTRODUCCIÓN:
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sustancia reveladora de haber ocurrido la reacción enzimática. Se realiza la lectura del color
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en __-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
forma visual (cualitativa) o usando lectores especiales------ para cuantificar. En caso de
negatividad, no aparecerá ningún color.
3. ELISA Indirecto
Objetivo de la práctica:
1. Conocer las técnicas y el fundamento que se usan para los distintos ELISA.
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I.__-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
MATERIAL Y MÉTODOS ------
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II. TAREAS DE LABORATORIO
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2. Colocar sus fotos de la práctica
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PRÁCTICA 13 ------
INTRODUCCIÓN
DIAGNÓSTICO DE EMBARAZO:
La prueba utiliza dos líneas para indicar el resultado. La línea de la prueba utiliza una combinación
de anticuerpos que incluyen un anticuerpo monoclonal hCG para detectar selectivamente niveles
elevados de hCG. La línea de control está compuesta por anticuerpos policlonales de cabra y
partículas coloidales de oro. El ensayo se realiza añadiendo la muestra de orina o suero al pocillo
de la placa y observando la formación de líneas de color.
También son de gran utilidad en el momento del parto, especialmente para el diagnóstico de
mujeres que no hayan sido controladas durante el embarazo. Por otra parte, estas pruebas
rápidas constituyen una herramienta diagnóstica que puede desempeñar un papel importante en
campañas de prevención y diagnóstico en entornos clínicos y no clínicos, facilitando de esta
manera, la detección precoz de la infección.
WL Check HIV 1+2 es un ensayo inmunocromatográfico "in vitro", de lectura visual, para la
detección cualitativa de anticuerpos contra los virus HIV-1 y HIV-2 en suero, plasma y sangre
entera. La prueba consta de un cassette plástico que contiene: - una membrana de nitrocelulosa
sensibilizada con antígenos recombinantes para HIV-1 (gp41) y HIV-2 (gp36) en la zona de
prueba "T", conjugados a oro coloidal. La muestra y el buffer se agregan en el pocillo de
muestra "S" solubilizando y mezclándose con el conjugado de antígenos recombinantes.
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__ Seguidamente, esta mezcla migra por capilaridad a través de la membrana de
nitrocelulosa. Si la muestra es reactiva, los anticuerpos anti HIV-1 y HIV-2 presentes, formarán un
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complejo con los antígenos conjugados a oro coloidal. Este complejo ------ se unirá posteriormente a
los antígenos inmovilizados en la zona de prueba "T" de la membrana de nitrocelulosa,
formando así una línea de color rosa-rojo púrpura. La ausencia de dicha línea indica un resultado
negativo. Como control de procedimiento, la prueba incluye una zona de control "C" de color
celeste que cambia a color rosa-rojo púrpura tras el paso de la muestra. La ausencia de esta
línea invalida los resultados.
OBJETIVO:
MATERIALES
PROCEDIMIENTO
Deje que la placa, la muestra de orina o suero y/ó los controles alcancen la temperatura
ambiente (15- 30°C) antes de realizar la prueba.
Deposite 3 gotas de orina o suero (aproximadamente 100 μL) en el pocillo de la placa
(S) y ponga en marcha el cronómetro. Evite que queden retenidas burbujas de aire en el
pocillo de la placa (S).
Espere hasta que aparezcan una o dos líneas coloreadas. Los resultados deberán
leerse a los 3 minutos cuando se analice orina o a los 5 minutos cuando se analice una
muestra de suero.
NOTA: Una concentración baja de hCG podría dar lugar, después de un periodo de
tiempo prolongado, a la aparición de una débil línea en la región de la prueba (T); por
tanto, no interprete el resultado después de 10 minutos.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
POSITIVO: Aparecen dos líneas coloreadas distintas. Una línea quedará en la región
de control (C) y otra línea quedará en la región de la prueba (T).
NEGATIVO: Una línea coloreada aparece en la región de control (C). No aparece
ninguna línea coloreada en la región de la prueba (T).
NO VÁLIDO: No aparece la línea de Control. Un volumen de la muestra
insuficiente o una técnica incorrecta son las razones más frecuentes del fallo de la
línea de control.
MATERIALES
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Contenedor para la recolección de la muestra
Cronómetro
PROCEDIMIENTO
Los reactivos y las muestras deben estar a temperatura ambiente (18-30o C) antes de
utilizar.
Agregar la muestra (dos gotas) sobre la superficie absorbente del pocillo de
Iniciar el cronómetro.
Leer los resultados entre los 20 y 30 minutos. No leer pasado los 30 minutos ya que
pueden obtenerse resultados erróneos.
Algunas muestras positivas reaccionan inmediatamente mientras que otras lo hacen
más lentamente dentro del tiempo de lectura indicado.
El cassette cuenta con una línea de color celeste en la zona de control "C" que al realizar
el ensayo debe cambiar a color rosa-rojo púrpura. Este cambio de color confirma que
se ha agregado el volumen adecuado de muestra, que su migración fue apropiada y
que la realización del procedimiento fue correcta.
Resultado Positivo (2 líneas): se observan 2 líneas de color rosa-rojo púrpura,
una en la zona de prueba "T" y otra en la zona de control "C". El resultado es positivo,
aunque las intensidades del color de las líneas "T" y "C" sean diferentes.
Resultado Negativo (1 línea): se observa solamente una línea de color rojo-rosa
púrpura en la zona de control "C".
Resultado Inválido: la ausencia de la línea de color rosa-rojo púrpura en la zona de
control "C" invalida el resultado, aunque esté o no presente la línea de color rosa-rojo
púrpura en la zona de prueba "T".
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COLOQUE SUS FOTOS DE LA PRÁCTICA
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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS CONSULTADAS ------
Enlaces:
1. http://asignatura.us.es/mbclinica/docs/recursos/12/tema-07.pdf
2. http://anatobioterio.blogspot.com/2011/03/tecnicas-de-inoculacion.html
3. http://www.uap.edu.pe/intranet/fac/material/04/20122BX040104234040104011/2012
2BX04010423404010401137640.pdf
4. http://www.healthsystem.virginia.edu/uvahealth/peds_hrpregnant_sp/autohub.cfm
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