Terapi Modulasi Saraf Pada Artritis Gout: Target Peningkatan Ekspresi sFRP2 Di

Ganglion Akar Dorsal Yang Mengatur Polarisasi Makrofag Dan Meringankan Kerusakan
Endotel

Abstrak
Gouty arthritis (GA) adalah bentuk radang sendi yang disebabkan oleh deposisi asam urat di
persendian yang mengakibatkan peradangan dan rasa sakit yang hebat. Bukti menunjukkan
pentingnya sinyal neuron sensorik pada sel-sel imun dengan melepaskan neuropeptida dan
kemokin untuk mengatur respons imun-inflamasi yang terkait. Dalam studi ini, diselidiki
pentingnya neuropeptida neuron sensorik dan sinyal kemokin pada polarisasi makrofag yang
diinduksi peradangan selama GA.
Metode
Kami memeriksa profil ekspresi mRNA selama GA dalam neuron dorsal root ganglion (DRG)
untuk mengidentifikasi kandidat yang paling mungkin yang memediasi komunikasi neuro-imun.
Kemudian, kami membungkam ekspresi gen spesifik dalam DRG oleh vektor lentiviral dalam
model tikus GA yang diinduksi monosodium urate (MSU) dan mengevaluasi perubahan dalam
respon inflamasi. Secara in vitro, makrofag primer digunakan untuk menyelidiki dampak saraf
pada polarisasi subtipe M1 / M2, produksi sitokin proinflamasi dan kerusakan endotel hilir.
Mekanisme dimana inflamasi makrofag diinduksi dalam DRG dievaluasi oleh Western blot,
immunofluorescence, dan immunopresipitasi.
Hasil
Kami menemukan bahwa protein 2 (sFRP2) yang terkait frizzled yang disekresikan adalah gen
yang paling diregulasi dalam neuron dorsal root ganglion (DRG) sebagai respons terhadap
deposisi monosodium urate (MSU). Injeksi LV-sFRP2-shRNA ke dalam L4 dan L5 DRG secara
signifikan menekan infiltrasi sel inflamasi dan polarisasi M1 dalam membran sinovial,
menipiskan hiperalgesia dan pembengkakan pergelangan kaki pada model tikus GA. Secara in
vitro, DRG neuron-diturunkan sFRP2 mempromosikan polarisasi M1 dan migrasi makrofag,
sehingga mengatur produksi sitokin proinflamasi dan mencegah apoptosis endotel. Lebih lanjut,
sFRP2 yang diturunkan DRG mengaktifkan jalur faktor nuklir (NF) -𝜅𝜅B dengan mengacaukan
kompleks β-catenin dan p65.
Kesimpulan
Kami menunjukkan keterlibatan sensor neuron-makrofag sensorik dalam patologi GA yang
diatur oleh ekspresi sFRP2 dengan cara parakrin. Menargetkan peningkatan ekspresi sFRP2 di
DRG memberikan wawasan baru untuk penelitian GA di masa depan dalam kedua pengurangan
nyeri dan pengobatan peradangan asam urat.

Pendahuluan

Gouty arthritis (GA), dengan peningkatan prevalensi> 1% di sebagian besar negara maju, telah
membedakan dirinya sebagai yang paling umum dan menonaktifkan keluhan muskuloskeletal
[1]. Sebagai konsekuensi dari gangguan kronis dan peningkatan kadar hiperurisemia, GA terjadi
secara langsung karena deposisi kristal monosodium urate (MSU) dalam jaringan artikular dan
periartikular, menyebabkan inflamasi sendi akut [2]. Makrofag atau monosit residen telah
terbukti bereaksi terhadap kristal MSU yang disimpan melalui tol-like receptor 2 (TLR2) dan
TLR4 [3, 4], menunjukkan peran penting dalam inisiasi kaskade inflamasi makrofag oleh kristal
MSU. Makrofag memperoleh fenotip M1 proinflamasi dan bukan fenotip M2 antiinflamasi
setelah stimulasi MSU [5, 6]. Selanjutnya, sel endotel diaktifkan dan dirusak oleh mediator
inflamasi ini [7, 8]. Setelah M1 kerusakan sel endotel makrofag di GA, makrofag M2 terlibat
dalam remodeling dan perbaikan jaringan [9, 10].

Sebagai fitur yang menarik dari gout, proses peradangan diakui sebagai serangan terbatas, yang
secara spontan hilang dalam sepuluh hari tanpa intervensi medis [11], memberikan potensi untuk
mengembangkan terapi baru yang menargetkan mekanisme resolusi spontan pada GA akut. Di
sini, berbagai mekanisme penutupan potensial, seperti pengikatan kristal apolipoprotein B / E
(Apo B / E) [12], penipisan kemokin [13], dan apoptosis neutrofil [14], telah diusulkan.
Meskipun demikian, rangsangan mengganggu tertentu dalam lingkungan mikro GA, seperti
inflamasi sinovial, saraf teriritasi dan disfungsi reaksi endokrin, pasti mengakibatkan gangguan
homeostasis artritis. Selain itu, sedikit yang diketahui tentang regulator utama ini yang
mendorong polarisasi M1 / M2 makrofag yang signifikan setelah deposisi MSU di GA,
mendorong peluncuran berbagai studi praklinis mendalam di GA.

GA pada awalnya ditandai dengan nyeri hebat dan tiba-tiba bersamaan dengan pembengkakan
dan kemerahan, menunjukkan aktivasi sistem saraf selama peradangan. Selain aktivasi nyata dari
induksi nyeri, penelitian juga mengungkapkan interaksi antara sistem saraf dan inflamasi [15,
16]. Secara histologis, sel-sel inflamasi dalam GA, seperti makrofag, sel mast, dan neutrofil,
sebagian besar terletak di dekat serat saraf perifer. Setelah makrofag mengenali rangsangan
berbahaya ekstraseluler, mereka melepaskan faktor terlarut yang mengarah ke sensitisasi saraf
nosiseptif perifer secara langsung [17]. Sebuah penelitian sebelumnya menunjukkan infiltrasi
makrofag yang signifikan ke dalam ganglion dorsal akar dorsal (DRG) ipsilateral dan
kontralateral dalam model tikus arthritis yang diinduksi antigen, menghasilkan generasi
hiperalgesia pada sisi bilateral [18]. Selain itu, sel-sel inflamasi juga diatur oleh sistem saraf.
Potensi aksi yang memediasi sensasi nyeri merangsang pelepasan neuropeptida seperti kalsitonin
gen-related peptide (CGRP) dan substansi P, yang berikatan dengan reseptor yang diekspresikan
pada sel imun bawaan seperti makrofag untuk mengaktifkan peradangan [19]. Borovikova et al.
menunjukkan bahwa aktivasi saraf vagus dapat menghambat polarisasi makrofag M1 yang
diinduksi endotoksin, mempolarisasi makrofag ke fenotipe M2 melalui aktivasi Janus kinase 2
(JAK2) / transduser sinyal dan aktivator transkripsi protein 3 (STAT3) faktor transkripsi [20]. G.
Trevisan et al. melaporkan bahwa nociception GA-elicited yang sedang berlangsung dan respon
inflamasi berkurang dengan blokade dari potensi reseptor sementara ankyrin 1 (TRPA1) yang
diekspresikan pada neuron sensorik primer [21]. Pengamatan ini menunjukkan hubungan intim
antara saraf sensorik dan GA. Namun, mekanisme yang mendasari dimana saraf sensorik
mempengaruhi proses inflamasi makrofag, terutama polarisasi M1 / M2, tidak sepenuhnya
dipahami.

Saat ini, penargetan DRG memegang janji besar untuk perawatan nyeri yang tepat dan tahan
lama tanpa melemahkan sistem saraf pusat (SSP) [22]. Diseberang oleh sawar darah-otak di SSP,
DRG dan akson perifer tidak memiliki sawar neurovaskular yang efisien [23]. Selain itu, kapsul
jaringan ikat permeabel dan kepadatan tinggi kapiler darah di ganglion memungkinkan berbagai
pendekatan terapi atau diagnostik yang menargetkan DRG termasuk pemberian sistemik, injeksi
lokal, terapi sel induk, dan terapi siRNA [24-26].

Mengatur sekitar 400 gen, jalur pensinyalan Wnt / β-catenin terlibat dalam pertumbuhan sel,
fungsi imun, diferensiasi, dan apoptosis [27]. protein sFRP (sFRP1-sFRP5) tampaknya mewakili
keluarga terbesar dari modulator Wnt [28]. Di sini, kami pertama kali menemukan bahwa protein
2 (sFRP2) frizzled-secreted yang disekresikan dari neuron DRG adalah regulator utama yang
memodulasi polarisasi M1 / M2 makrofag yang diinduksi MSU berikutnya. Oleh karena itu,
kami mempresentasikan strategi interferensi RNA untuk meredakan respons inflamasi GA
dengan membungkam ekspresi sFRP2 dalam neuron DRG baik in vivo dan in vitro. Pekerjaan
kami menyoroti peran penting saraf sensorik dalam polarisasi makrofag melalui sekresi sFRP2
untuk mengaktifkan makrofag melalui interaksi Wnt-β-catenin / NF-κB, lebih lanjut mengurangi
kerusakan inflamasi sel endotel di GA, tidak diragukan lagi memberikan target yang valid untuk
pengobatan GA di masa depan.

Bahan dan Metode

Tikus C57BL / 6 (6 minggu, jantan) dibeli dari Shanghai SIPPR-Bk Lab Animal Co., Ltd. dan
dipelihara di fasilitas hewan laboratorium bebas-patogen spesifik Shanghai Ninth Rumah Sakit
Rakyat. Semua tikus digunakan di fasilitas selama tujuh hari sebelum percobaan in vivo. Untuk
isolasi neuron sensorik tikus primer dan makrofag, tikus C57BL / 6 (pria, 4 minggu) dikorbankan
dengan overdosis anestesi.

Semua prosedur eksperimental dan protokol perawatan hewan di atas ditinjau dan disetujui oleh
Institusi Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan (IACUC) Rumah Sakit Rakyat Shanghai
Ninth. Semua tikus diizinkan akses ad libitum ke makanan dan air sebelum dan sepanjang
protokol eksperimental.

Sel, Media, dan Reagen

Untuk isolasi neuron sensorik tikus primer, DRG dari semua level tulang belakang dibedah dan
dikenai campuran enzim kolagenase 0,1% (Sigma-Aldrich, SCR103), 200 U / mL DNase
(Sigma-Aldrich, 10104159001), 0,25% trypsin (Sigma-Aldrich, T2600000) pada 37 ° C selama
45 menit. Selanjutnya, selubung mielin dan sel yang tidak diinginkan sebagian habis melalui 5-
menit 200 g kepadatan-gradien sentrifugasi dengan 15% percoll (Biosharp, 10243024). Neuron
sensoris primer ditangguhkan dalam media campuran DMEM / Ham F12 1: 1 yang mengandung
10% FBS, suplemen N2 (Gibco, 1950299) dan 50 ng / mL β-NGF (Peprotech, 450-01). 100 μM
Ara-C (Sigma-Aldrich, C1768) ditambahkan untuk menghambat proliferasi sel-sel non-neuronal
dan kemudian dihapus dua hari sebelum percobaan lebih lanjut.

Makrofag yang diturunkan dari sumsum tulang (BMM) dikeluarkan dari tulang paha dan tibiae
tikus. Setelah kultur 1 hari di MEM-α dengan 10% FBS, 30 ng / mL M-CSF (Sistem R&D,
Q3U4F9), sel suspensi diunggulkan ke dalam 6-well plate. Untuk diferensiasi makrofag, sel
dikultur dalam media kultur tersebut selama lima hari sampai perawatan lebih lanjut. M0
dipolarisasi menjadi M1 menggunakan 20 ng / mL LPS (Sigma-Aldrich, L2630) ditambah 20
ng / mL IFN-γ (Peprotech, 315-05), dan ke M2 menggunakan 20 ng / mL IL-4 (Peprotech, 214-
14) selama dua hari.

Media MEM-α bebas serum diganti untuk

24 jam untuk menghasilkan media terkondisi. Media terkondisi disaring dengan 0,2 μm mikron
syringe filter untuk menghindari kontaminasi silang sel. Untuk kultur sel selanjutnya, medium
terkondisi diencerkan 1: 1 dengan medium kultur segar. Untuk pengujian Luminex, media
terkondisi dari makrofag terstimulasi dikumpulkan seperti yang disebutkan di atas. Pengujian
dilakukan sesuai dengan protokol pabrikan menggunakan Bio-Plex Pro Mouse Cytokine Grp (#
M60009RDPD) dengan sistem Luminex 200 (Austin, TX, USA) di Wayen Biotechnologies
Shanghai, Inc.

HUVEC (HUVEC-20001) dibeli dari Cyagen Biosciences dan dikultur dalam MEM-α
(Invitrogen, 11090081) ditambah dengan 10% FBS. Kristal MSU dibeli dari Sigma-Aldrich dan
disiapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya [29].

Transduksi Lentivirus secara in vitro dan in vivo

Kultur neuron tikus DRG dipersiapkan seperti yang disebutkan di atas. Selanjutnya, kultur sel
ditransduksi dengan berbagai lentivektor yang dimodifikasi dengan adanya 6 μg / mL polybrene
(Solarbio, H8761). Dua puluh empat jam setelah onset transduksi, kami mengangkat virus dan
diganti dengan media neurobasal yang ditambahkan. Setelah kultur 72 jam, fluoresensi Zsgreen1
langsung diperiksa dan difoto di bawah mikroskop fluoresensi untuk menentukan efisiensi
transduksi berbagai vektor lentivirus-vektor pada neuron DRG tikus.

Transduksi DRG in vivo dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [30]. Singkatnya, kami
membius tikus dengan natrium pentobarbital 1% dengan dosis 50 mg / kg. Otot paraspinal
lumbar bawah dipisahkan untuk mengekspos foramina intervertebralis L4-L5 untuk injeksi
mikro. Persiapan lentiviral (5 × 108 unit per mL) adalah 1: 1 diencerkan dengan 20% manitol.
Kemudian tikus disuntikkan baik 2 lL sediaan lentiviral atau salin, dalam kedua kasus yang
mengandung 100 ng polybrene, ke dalam kedua L4 dan L5 DRGs secara sepihak. Dengan
demikian, viral load adalah 1 × 106 unit transfeksi untuk setiap tikus.

Model hewan arthritis gout pergelangan kaki yang diinduksi MSU

Satu minggu setelah prosedur transduksi in vivo, semua tikus yang ditransfusikan dan kelompok
kontrol dibius. Dan kemudian diberikan 20 μL kristal MSU (10 mg / mL) ke dalam sendi
pergelangan kaki kanan bawah untuk membentuk model hewan arthritis gout pergelangan kaki.
Ambang batas dan penarikan kaki dari sendi pergelangan kaki yang diinjeksi diukur setelah 1, 3,
dan 5 hari setelah injeksi MSU. Selanjutnya, lima tikus dari masing-masing kelompok
dikorbankan untuk evaluasi histologis.

Pengurutan

Setelah berhasil membuat artritis gout pergelangan kaki yang diinduksi MSU berhasil, total RNA
diekstraksi dari DRG kontrol dan tikus GA menggunakan reagen TRIzol (Invitrogen, 15596026)
sesuai dengan instruksi pabrik. Sistem Agilent 4200 TapeStation menawarkan kontrol kualitas
sampel untuk berbagai aplikasi ukuran untuk RNA. Bacaan berpasangan diperoleh pada Illumina
PE150 di Shenzhen HaploX Biotechnology Co., Ltd. Program Hierarchical Indexing untuk
Penyelarasan Tersambung Transkrip (HISAT2) digunakan untuk menyelaraskan bacaan ke
genom referensi mouse mm10 UCSC. Kelimpahan transkrip (diwakili oleh Baca Per Kilobase
Juta, RPKM) diukur. Gen dan transkrip dengan nilai RPKM lebih rendah dari lima dikeluarkan
dari analisis. R (3.0.2) menghasilkan analisis korelasi Pearson dan peta panas.

Evaluasi histologis

Jaringan sinovial dan DRG dibedah dan direndam dalam paraformaldehyde 4% dalam PBS
selama 4 jam. Kemudian eksplan tertanam di O.C.T. Senyawa (Tissue-Tek, 4583) dibekukan di
sebelah cryoprotection dalam larutan sukrosa 20% semalam dalam suhu kamar. Untuk
pewarnaan imunofluoresen, spesimen sendi pergelangan kaki dipotong secara sagital untuk
mendapatkan irisan setebal 50 μm yang mengambang bebas untuk penglihatan yang lebih baik
dari serat saraf dalam jaringan sinovial dari sendi pergelangan kaki, sementara eksplan DRG
dibagi menjadi irisan setebal 3,5 μm dan keduanya diwarnai untuk β-III-Tubulin (Teknologi
Sinyal Sel, D71G9, 1: 400), sFRP2 (Abcam, ab86379, 1: 100) dalam tabung Eppendorf. Untuk
pewarnaan makrofag M1 / M2 dalam jaringan sinovial, irisan setebal 3,5-m diperoleh untuk
CD16 / 32 (Abcam, ab25235, 1:20), CD206 (Abcam, ab64693, 1: 100) dan pewarnaan
hematoxylin dan eosin. Zeiss LSM710 confocal microscope digunakan untuk pencitraan
confocal sampel pada pembesaran asli × 40 dan perangkat lunak Zen.

Von Frey

Kami menggunakan von Frey untuk menguji perilaku nyeri tikus seperti yang dijelaskan
sebelumnya secara rinci [31]. Teknisi tidak mengetahui tentang perawatan untuk memastikan
pengacakan tes. Tes dimulai dengan penyajian filamen 0,4 g dan ditempatkan pada permukaan
mid-plantar dari kaki belakang mouse sampai menekuk. Presentasi filamen yang disajikan dan
selanjutnya disajikan konsisten dengan metode "naik-turun". Kemudian ambang penarikan
penarikan 50% dihitung menggunakan rumus:

Ambang batas 50% (g) = 10 (X + kd) / 104

X = nilai (dalam unit log) dari filamen von Frey akhir, k = nilai tabular untuk pola respons dan d
= kenaikan rata-rata (dalam unit log) antara filamen von Frey.

Karakterisasi Fenotipik Makrofag M1 / M2

Untuk menilai polarisasi makrofag menjadi fenotipe M1 atau M2, sitokin atau BMM primer
yang diterapi kristal dipanen, dicuci dengan PBS dan diinkubasi dengan buffer penyekat (1%
serum kambing dan 1% BSA di PBS). Sel diwarnai dengan CD68 (BD Horizon, 566388),
CD16 / 32 (BD Pharmingen, 561727, 2 μg / mL), CD206 (BD Pharmingen, 565250, 2 μg / mL)
sesuai dengan protokol pabrikan. Sebuah cytometer aliran FACScan (BD, CA, USA) selanjutnya
digunakan untuk menganalisis sampel.

Imunositokimia dilakukan untuk mengakses penanda spesifik pada makrofag. Makrofag difiksasi
dalam paraformaldehyde 4%, diblokir dan ditembus dengan penyangga pemblokiran (1% serum
kambing, 1% BSA, dan 0,1% Triton X100 dalam PBS). Kemudian sel diinkubasi dengan CD16 /
32 (Abcam, ab25235, 10 ug / mL), CD206 (Abcam, ab64693, 1: 2000) semalaman pada 4 ℃,
diikuti dengan antibodi sekunder yang sesuai (IgG anti-tikus kambing (Abcam, ab150157, 1:
1000), IgG anti-kelinci kambing (Abcam, ab150080, 1: 1000)) selama 2 jam pada suhu kamar.
Gambar diperoleh dengan Zeiss LSM710, dianalisis dengan perangkat lunak Zen.

Uji Migrasi

Delapan μm-pori transwell sisipan (Corning, CLS3428) dilapisi dengan matriks Matrigel (BD
Life Sciences, 356234) yang 1: 4 diencerkan dengan MEM-α. 700 μL media terkondisi
ditambahkan ke masing-masing sumur dari pelat 24-sumur diikuti dengan penambahan sisipan
berlapis. Kami menambahkan 105 BMM untuk setiap sisipan dan dikultur dalam 5% CO2 pada
37 ° C selama 12 jam untuk migrasi. MCP-1 (Peprotech, 250-10, 20 ng / mL), 200 μg / mL
MSU, dan media terkondisi dari DRGs digunakan. Kemudian sisipan dicuci dan diperbaiki
dengan paraformaldehyde 4% diikuti dengan pewarnaan dengan kristal violet 0,2% (Sigma-
Aldrich, C6158). Sel-sel di bagian atas sisipan dikeluarkan menggunakan kapas dan hanya sel-
sel yang bermigrasi melintasi membran yang dikuantifikasi. Membran selaput transwell dipotong
dengan hati-hati menggunakan pisau bedah. Gambar digital diambil dengan Olympus IX71.
Nomor sel dihitung dengan perangkat lunak Image J.

Analisis Apoptosis HUVEC

5 × 105 HUVEC diunggulkan di piring 6-sumur dan distimulasi dengan media berikut. Group1,
media lengkap; Kelompok 2, 1: 1 campuran medium lengkap dan terkondisi dari makrofag
distimulasi dengan 200 μg / mL MSU; Kelompok 3, 1: 1 campuran medium lengkap dan
terkondisi dari DRG dan makrofag terkompresi dirangsang dengan 200 ug / mL MSU;
Kelompok 4, 1: 1 campuran media lengkap dan terkondisi dari DRG yang ditransduksi shRNA
dan makrofag terstimulasi dengan 200 μg / mL MSU.

Tingkat apoptosis sel HUVEC ditentukan oleh flow cytometry melalui pewarnaan Annexin V /
PI seperti yang dijelaskan sebelumnya [32].

Pewarnaan TUNEL dilakukan menggunakan TUNEL apoptosis assay kit (Beyotime, C1086)
sesuai dengan protokol pabrik. Sel-sel TUNEL-positif diidentifikasi oleh adanya fluoresensi.

RT-PCR kuantitatif

RNA dari berbagai kelompok neuron DRG, makrofag, HUVEC diekstraksi menggunakan reagen
TRIzol (Invitrogen, 15596026) sesuai dengan instruksi pabrik. Secara singkat, setelah Trizol,
kami menambahkan kloroform dan disentrifugasi pada 4 ℃ 12000 g selama 15 menit dan
memisahkan fase berair bening atas yang mengandung RNA. Tambahkan 0,5 mL isopropanol ke
fase berair, diinkubasi selama 10 menit. Kemudian kami disentrifugasi selama 10 menit pada
12000g setelah pencucian dua kali dengan etanol 75%. Selanjutnya, sintesis cDNA dilakukan
menggunakan hexamers acak, dan qPCR dilakukan menggunakan SYBR® Premix Ex Taq ™
(Takara Bio, RR420A) pada sistem PCR real-time (Applied Biosystems, USA, ABI 7500). Kami
menormalkan ekspresi gen menjadi rata-rata geometri GAPDH. Primer yang digunakan
tercantum dalam Tabel S1.

Western Blot dan Analisis ELISA

Makrofag diobati dengan MSU dan media terkondisi dari DRG dilisiskan dalam buffer RIPA
(Beyotime, P0013C) ditambah dengan 1 mM PMSF (Beyotime, ST506). Kami juga
menggunakan supernatan biakan neuron DRG untuk analisis sFRP2-linked immunosorbent assay
(ELISA) analysis (LifeSpan Biosciences, LS-F34960). Antibodi berikut digunakan untuk
mendeteksi protein. β-catenin (Teknologi Signaling Sel, 8480, 1: 1000), sFRP2 (Abcam,
ab86379,1: 500), Wnt9a (Abcam, ab125957, 1: 1000), FZD2 (Abcam, ab109094, 1: 1000),
DVL2 ( Abcam, ab124933, 1: 1000), Cyclin D1 (Teknologi Signaling Sel, 2978, 1: 1000), C-myc
(Signaling Cel Teknologi, 5605, 1: 1000), p-IκBα (Cell Signaling Teknologi, 2859, 1: 1000),
IκBα (Cell Signaling Teknologi, 2859, 1: 1000), p65 (Teknologi Signaling Sel, 8242, 1: 1000),
Histone H3 (Teknologi Signaling Sel, 4499, 1: 1000), GAPDH (Signaling Cell Teknologi, 5174,
1: 1000). Antibodi sekunder termasuk IgG anti-kelinci kambing (Invitrogen, 35568, 1: 30000),
IgG anti-tikus (Invitrogen, G-21040, 1: 30000). Kami melakukan western blotting seperti yang
dijelaskan sebelumnya [33], dan intensitas relatif band dinormalisasi dengan yang dari band
GAPDH atau Histone H3.

Co-IP

Makrofag dikultur dalam kontrol, 200 μg / mL MSU dan 200 μg / mL MSU dalam media
terkondisi dari DRG. Lisis sel total diinkubasi semalaman pada suhu 4 ° C dengan P65
(Teknologi Signaling Sel, 8242, 5 ug) atau IgG normal (Teknologi Signaling Sel, 2729, 5 ug)
sebagai kontrol. Kompleks antibodi-antigen didahului dengan Crosslink Magnetic IP / Co-IP Kit
(Thermo Fishernilmiah, 88805). Setelah beberapa kali pencucian, sampel direbus dan dianalisis
dengan immunoblot.

Analisis statistik

Untuk studi in vitro, percobaan dilakukan dalam rangkap tiga biologis. Untuk percobaan in vivo,
lima tikus ditugaskan untuk masing-masing kelompok, dan 40 tikus digunakan secara total.
Hasilnya disajikan sebagai sarana ± standar deviasi setelah dianalisis oleh perangkat lunak SPSS
13.0 (Paket Statistik untuk Ilmu Sosial, AS). Data parametrik dianalisis menggunakan uji-t
Student atau ANOVA satu arah diikuti dengan uji Tukey post hoc untuk membandingkan dua
kelompok. Tingkat signifikansi ditetapkan pada P <0,05 dan ditunjukkan oleh "#" untuk
perbandingan antara kelompok kendaraan dan kelompok kontrol dan "*" untuk perbandingan
antara kelompok perlakuan dan kelompok kendaraan. P <0,01 ditunjukkan oleh "**" untuk
perbandingan antara kelompok perlakuan dan kelompok kendaraan.

Hasil

Kristal MSU menginduksi produksi sFRP2 dalam neuron DRG

Neuron DRG primer dipisahkan dari kontrol dan tikus GA akut yang diinduksi kristal MSU, dan
uji RNA-Seq serta profil ekspresi dilakukan (Gambar 1A) Gen Sfrp2, yang menyandikan protein
sFRP2, modulator larut pensinyalan Wnt, termasuk di antaranya. gen yang paling diregulasi.
Selanjutnya, jaringan DRG primer diisolasi dan dimurnikan untuk percobaan in vitro.
Immunostaining dari marker neuro-specific PGP9.5 dilakukan untuk mengidentifikasi morfologi
sel (Gambar 1B) [34]. Setelah tujuh hari pengobatan dengan reagen anti-mitosis, kultur sel
sebagian besar terdiri dari neuron, dengan kurang dari 1% sel nonneuronal, menunjukkan
kemurnian tinggi neuron DRG untuk percobaan berikutnya (Gambar 1C). Selanjutnya, uji
viabilitas sel dilakukan untuk menentukan sitotoksisitas kristal MSU terhadap neuron DRG. Pada
Gambar 1D, kristal MSU tidak menunjukkan sitotoksisitas terhadap DRG pada konsentrasi 12,5
hingga 200 μg / mL setelah 24 jam pengobatan. Oleh karena itu, 200 μg / mL kristal MSU
digunakan untuk penelitian selanjutnya. RT-PCR mengungkapkan peningkatan signifikan 7,9 ±
0,4 dalam ekspresi mRNA Sfrp2 dalam neuron DRG yang diperlakukan dengan 200 μg / mL
kristal MSU selama 24 jam (Gambar 1E), berbeda dengan peningkatan yang relatif lebih ringan
di Ngf, Enpg2, Ereg, Ptgs, Mmp9 , dan ekspresi Grem1. Selain itu, ekspresi protein sFRP2 dalam
neuron DRG juga dievaluasi, yang terdiri dari pewarnaan imunofluoresensi pada Gambar 1F.
Selain itu, Gambar 1G menggambarkan bahwa, dibandingkan dengan kelompok kontrol,
kelompok terkena stimulasi 24 jam dengan kristal MSU menunjukkan peningkatan 6,1 ± 0,7 kali
lipat dalam ekspresi sFRP2 dalam neuron DRG in vitro. Karena sFRP2 adalah protein sekresi
neuron DRG, ELISA juga dilakukan. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1H, kristal MSU
menginduksi produksi sFRP2 yang kuat dari DRG dalam cara yang tergantung dosis.

Knockdown yang dimediasi oleh virus dari sFRP2 di DRG melemahkan peradangan pada
GA

Untuk mengevaluasi lebih lanjut peran potensial sFRP2 in vivo, kami menyuntikkan 2 μl
persiapan lentiviral / saline normal ke dalam L4 dan L5 DRG untuk mengirimkan vektor
penargetan sFRP2 pada tikus (Gambar S1). Tiga minggu setelah transduksi in vivo, model hewan
GA yang diinduksi MSU didirikan dengan menyuntikkan kristal MSU ke dalam pergelangan
kaki kaki belakang ipsilateral. Untuk mengevaluasi efisiensi transduksi in vivo, bagian DRG
yang disuntikkan (L4 dan L5) diisolasi. Gambar representatif (Gambar 2A) dari bagian dari DRG
yang terinfeksi menunjukkan ekspresi ZsGreen1 positif yang dikolocalisasikan dengan β-tubulin,
menunjukkan bahwa LV-SFRP2-shRNA1 mampu mentransduksi neuron DRG in vivo. Selain
itu, injeksi kristal MSU secara signifikan menginduksi ekspresi sFRP2 dalam DRG. Sebaliknya,
ekspresi sFRP2 jelas ditekan dalam kelompok knockdown (KD) sFRP2 dibandingkan dengan
kelompok sham, dan penindasan ini tidak dipengaruhi oleh stimulasi MSU. Selanjutnya, kami
menodai bagian sendi pergelangan kaki untuk memeriksa persarafan saraf dari membran
sinovial. Gambar confocal mengungkapkan pola yang sama dari ekspresi sFRP2 dalam serabut
saraf perifer dalam sinovium (Gambar 2B), menunjukkan bahwa ekspresi sFRP2 yang meningkat
ditemukan baik dalam sel DRG vertebrata dan jaringan sinovial, meskipun sFRP2 tidak secara
signifikan berubah pada sel imun. dalam sinovium (Gambar S2).