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Diagnóstico de enfermedades

Chapter · November 2014

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5 authors, including:

Manuel de Jesús Bermúdez Guzmán Mario Orozco-Santos

INIFAP Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agricolas y Pecuarias INIFAP Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agricolas y Pecuarias
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SEE PROFILE SEE PROFILE

Miguel Angel Manzanilla-Ramírez Manuel Robles

INIFAP Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agricolas y Pecuarias Universidad Nacional Autónoma de México
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 EL LIMÓN MEXICANO
(Citrus aurantifolia)
Mario Orozco-Santos, Marciano Manuel Robles-González, José Joaquín Velázquez-
Monreal, Miguel Ángel Manzanilla-Ramírez, Manuel de Jesús Bermúdez-Guzmán, Silvia
Heréndira Carrillo-Medrano, Víctor Manuel Medina-Urrutia, Luis Martín Hernández-
Fuentes, Rafael Gómez-Jaimes, Gilberto Manzo-Sánchez, Javier Farías-Larios, Daniel
Nieto-Ángel, Edgar Mijangos-Hernández, Julio Alejandro Sánchez-de la Torre y
Sóstenes Varela-Fuentes

Centro de Investigación Regional Pacífico Centro

Campo Experimental Tecomán
Tecomán, Colima, México. Noviembre de 2014
Libro Técnico Num. 1, ISBN: 978-607-37-0389-5
 SECRETARÍA DE AGRICULTURA, GANADERÍA, DESARROLLO RURAL, PESCA Y
ALIMENTACIÓN

Lic. Enrique Martínez y Martínez

Secretario
Lic. Jesús Aguilar Padilla
Subsecretario de Agricultura
Prof. Arturo Osornio Sánchez
Subsecretario de Desarrollo Rural
Lic. Ricardo Aguilar Castillo
Subsecretario de Alimentación y Competitividad
T.A. Carlos Salazar Preciado
Delegado de la SAGARPA en Colima

INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES FORESTALES, AGRÍCOLAS Y PECUARIAS

Dr. Luis Fernando Flores Lui

Director General
Dr. Manuel Rafael Villa Issa
Coordinador de Investigación, Innovación y Vinculación

Dra. Bertha Patricia Zamora Morales

Encargada del despacho de los asuntos de la Coordinación de Planeación y Desarrollo
Mtro. Eduardo Francisco Berterame Barquín
Coordinador de Administración y Sistemas

Lic. Elisa Concepción Elguezabel Dávila

Titular de la Unidad Jurídica

CENTRO DE INVESTIGACIÓN REGIONAL PACÍFICO CENTRO

Dr. José Antonio Rentería Flores

Director Regional del CIRPAC
Dr. Gerardo Salazar Gutiérrez
Director de Investigación del CIRPAC
MC. Primitivo Díaz Mederos
Director de Planeación y Desarrollo
Lic. Miguel Méndez González
Director de Administración
MC. Isaac Vizcaíno Vargas
Director de Coordinación y Vinculación en Colima
 EL LIMÓN MEXICANO
(Citrus aurantifolia)

EDITORES

Mario Orozco-Santos
Marciano Manuel Robles-González
José Joaquín Velázquez-Monreal
Miguel Ángel Manzanilla-Ramírez

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias

Centro de Investigación Regional Pacífico Centro
Campo Experimental Tecomán
Tecomán, Colima, México
Noviembre del 2014
 EL LIMÓN MEXICANO
(Citrus aurantifolia)
No está permitida la reproducción total o parcial de esta publicación, ni la transmisión de
ninguna forma o por cualquier medio, ya sea electrónico, mecánico, por fotocopia, por
registro u otros métodos, sin el permiso previo y por escrito de la institución.

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias

Progreso No. 5. Barrio de Santa Catarina. Delegación Coyoacán
México, D.F. CP 04010
Teléfono: (55) 3871-8700 conmutador
www.inifap.gob.mx. Correo-e: contactenos@inifap.gob.mx

Primera Edición: Noviembre de 2014

Impreso en México. Printed in México
ISBN: 978-607-37-0389-5
Libro Técnico Núm.1
Noviembre de 2014

CAMPO EXPERIMENTAL TECOMAN

Km. 35 carretera Colima-Manzanillo. Apartado postal 88
Tecomán, Colima, México. C.P. 28100. Tel. y Fax: (313) 324 01 33 y 324 30 82

La presente publicación se terminó de imprimir en el mes de noviembre de 2014 en los

Talleres Gráficos de Prometeo Editores, S.A. de C.V. Libertad 1457, Col. Americana,
Guadalajara, Jalisco, C.P.44160 Tel. 01 (33) 38262726.
Su tiraje consta de 2000 ejemplares.
La cita correcta de esta obra es:

Orozco-Santos, M., Robles-González, M.M., Velázquez-Monreal, J.J., Manzanilla-Ramírez,

M.A., Bermúdez-Guzmán, M.J., Carrillo-Medrano, S.H., Medina-Urrutia, V.M., Hernández-
Fuentes, L.M., Gómez-Jaimes, R., Manzo-Sánchez, G., Farías-Larios, J., Nieto-Ángel, D.,
Mijangos-Hernández, E., Sánchez-de la Torre, J.A. y Varela-Fuentes, S. 2014. El limón
mexicano (Citrus aurantifolia). Libro Técnico Núm. 1. SAGARPA, INIFAP, CIRPAC, Campo
Experimental Tecomán. Tecomán, Colima, México. 477 p.
 AUTORES
MC Manuel de Jesús Bermúdez-Guzmán
Biotecnología
INIFAP, Campo Experimental Tecomán
Tecomán, Colima, México
E-mail: bermudez.manuel@inifap.gob.mx
Dr. Javier Farías-Larios
Manejo Agronómico
Universidad de Colima, FCBA
Tecomán, Colima, México
E-mail: gilberto_manzo@yahoo.com
MC Miguel Ángel Manzanilla-Ramírez
Manejo Agronómico
INIFAP, Campo Experimental Tecomán
Tecomán, Colima, México
E-mail: manzanilla.miguel@inifap.gob.mx
Dr. Víctor Manuel Medina-Urrutia
Fisiología
Universidad de Guadalajara, CUCBA
Zapopán, Jalisco, México
E-Mail: vmmedinau@gmail.com
Dr. Mario Orozco-Santos
Fitopatología
INIFAP, Campo Experimental Tecomán
Tecomán, Colima, México
E-mail: orozco.mario@inifap.gob.mx
MI Julio Alejandro Sánchez de la Torre
Biotecnología
Colaborador invitado
Tecomán, Colima, México
E-mail: videocalli@yahoo.com.mx
Dr. José Joaquín Velázquez-Monreal
Fitopatología
INIFAP, Campo Experimental Tecomán
Tecomán, Colima, México
E-mail: velazquez.joaquin@inifap.gob.mx
Dr. Rafel Gómez-Jaimes
Fitopatología
INIFAP, Campo Experimental Santiago Ixcuintla
Santiago Ixcuintla, Nayarit, México
E-mail: gomez.rafael@inifap.gob.mx
Ing. Silvia Heréndira Carrillo-Medrano
Biotecnología
INIFAP, Campo Experimental Tecomán
Tecomán, Colima, México
E-mail: carrillo.silvia@inifap.gob.mx
Dr. Luis Martín Hernández-Fuentes
Entomología
INIFAP, Campo Experimental Santiago Ixcuintla
Santiago Ixcuintla, Nayarit, México
E-mail: hernandez.luismartin@inifap.gob.mx
Gilberto Manzo-Sánchez
Biotecnología
Universidad de Colima, FCBA
Tecomán, Colima, México
E-mail: gilberto_manzo@yahoo.com
Daniel Nieto-Ángel
Enfermedades en postcosecha
Colegio de Postgraduados
Campus Montecillo
Montecillo, Texcoco, edo. de México
E-mail: dnieto@colpos.mx
Dr. Marciano Manuel Robles-González
Biotecnología
INIFAP, Campo Experimental Tecomán
Tecomán, Colima, México
E-mail: robles.manuel@inifap.gob.mx
Dr. Sóstenes Varela-Fuentes
Entomología
Universidad Autónoma de Tamaulipas
Cd. Victoria, Tamaulipas, México
E-mail: svarela@uat.edu.mx
Ing. Edgar Mijangos-Hernández
Manejo agronómico
Colaborador invitado
Tecomán, Colima, México
E-mail: tehemi-678-mhe@hotmail.com
 PRÓLOGO

Las cadenas productivas del sector agropecuario día con día están enfrentan nuevos retos
para la incrementar la productividad y calidad de los cultivos en un escenario de apertura
comercial y globalización de los mercados. El compromiso del Instituto Nacional de
Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) es generar conocimiento y
desarrollar la tecnología necesaria para aumentar la productividad y calidad de los
productos y con ello mejorar la competitividad de las cadenas de valor y los ingresos de los
productores, sin olvidar el cuidado del ambiente y los recursos naturales.

En la región costera del Pacífico de México se cultivan 83,317 ha con limón mexicano,
[Citrus aurantifolia (Christm) Swingle. Los antecedentes de este cultivo en México
demuestran que periódicamente se han enfrentado amenazas para su permanencia como
actividad agrícola importante para Colima Michoacán, Guerrero y Oaxaca. Hasta 1970, la
mayoría de las plantaciones de este cítrico en el país se establecían con árboles de pie
franco y por lo tanto se vieron afectadas por la gomosis o pudrición de raíz, causado por
Phytophthora parasítica (Dastur). Esta enfermedad provocaba la muerte de ramas y
finalmente del árbol completo causando pérdidas de hasta el 30 % en el rendimiento en las
plantaciones. En 1981 los árboles se vieron afectados por la ‘bacteriosis’ la cual en su
momento generó incertidumbre entre los productores y cierre de la frontera de Estados
Unidos para la fruta cítrica proveniente de nuestro país, afectando así a todos los
productores de cítricos mexicanos. En 1995 arribó y se estableció el minador de la hoja
(Phyllocnistis citrella Stainton) que en los primeros años causó fuertes daños físicos a las
hojas del limón mexicano y con ello una fuerte preocupación entre los productores. El virus
de la tristeza de los cítricos se ha mantenido como amenaza latente para los cítricos en
México, especialmente para el limón mexicano, que es altamente sensible a esta
enfermedad viral. Se han detectado rasas suaves del virus y recientemente la presencia del
pulgón café de los cítricos (Toxoptera citricida Kir.) vector del virus en varios estados
productores de cítricos del país.

El reto más reciente y tal vez el más complejo es la llegada a la región de la enfermedad
del huanglongbing o HLB y que ha generado gran incertidumbre entre los productores y
que aunque no ha sido tan devastadora como se pronosticó si está teniendo graves
consecuencias para el cultivo y sido necesario modificar el manejo de las plantaciones
principalmente lo relacionado con la nutrición de los árboles con el propósito de convivir con
esta enfermedad y mantener la producción de limones.

La investigación sobre limón mexicano en Colima se inicio en la década de los años 70s, lo
cual ha permitido generar la tecnología necesaria para superar los problemas antes
mencionados y generar un paquete tecnológico que sumado a la buena disposición de los
productores, quienes lo han aceptado, ha ayudado a incrementar los rendimientos y la
calidad de la fruta. Con la tecnología generada, el promedio estatal de rendimiento pasó de
10 Toneladas por hectárea que se obtenían en los años 70´s, a 23.9 toneladas por
hectárea registradas en el 2011. En el presente libro “El Limón mexicano (Citrus
aurantifolia)”se plasman los resultados de más 40 años de investigación, con la finalidad
de aportar información para que los técnicos y los productores tengan elementos para
hacer un manejo sustentable del cultivo de limón mexicano. Se espera que sirva de guía
lograr el manejo eficiente del cultivo y particularmente del HLB con el propósito de
mantener la productividad de las plantaciones y mitigar los efectos de esta enfermedad.
Con esta obra se espera contribuir con una parte importante de nuestra misión que es la
de poner a disposición de productores, técnicos y tomadores de decisión los productos de
la investigación.

Atentamente
Dr. Antonio Rentería Flores
Director del CIRPAC
Capítulo 13
Diagnóstico de Enfermedades
Manuel de Jesús Bermúdez-Guzmán
Mario Orozco-Santos
Joaquín Velázquez-Monreal
Miguel Ángel Manzanilla-Ramírez
Marciano Manuel Robles González

INTRODUCCIÓN

La mayor parte de las enfermedades en las plantas son ocasionadas por

microorganismos infecciosos como hongos, bacterias, nematodos, protozoarios,
fitoplasmas, virus y viroides. Los cítricos son los frutales que probablemente albergan
la mayor cantidad de enfermedades, principalmente de origen viral, ya que estas
pueden atacar ocasionar daños al cultivo desde vivero hasta la fase productiva. Los
órganos o tejidos afectados son la raíz, tronco, ramas, hojas, flores y frutos.
Actualmente en México la principal enfermedad de mayor importancia económica que
afecta a los cítricos es el Huanglongbing (HLB) (Guzmán-Piedrahita et al., 2009;
Muhammad et al., 2012).

El diagnóstico de enfermedades implica la integración de conocimientos teóricos y

prácticos sobre el hospedero, patógeno y condiciones ambientales en que se
desarrolla la interacción, dando como resultado la expresión de la enfermedad
(Barnes, 1994; Bergamin-Filho et al., 1995). Sin embargo, en ocasiones las
enfermedades no son detectadas por la manifestación de síntomas en las plantas, por
lo que se requiere utilizar otros procedimientos para realizar su diagnóstico. También
factores abióticos, como el clima, toxicidad por plaguicidas y deficiencias nutricionales
pueden ocasionar desordenes en las plantas (Guzmán-Piedrahita et al., 2009). Un
diagnóstico oportuno que detecte el agente causal de un evento patológico es
fundamental para el manejo del problema, y ello contribuye a generar medidas de
control efectivas, ya que permite la optimización de los recursos, la reducción de los
efectos negativos en el medio ambiente y a la vez origina información respecto a la
interacción patógeno-hospedero (Barnes, 1994).

Hasta hace aproximadamente tres décadas, la detección de fitopatógenos dependía

de métodos convencionales que requerían de mucha experiencia, habilidad y
conocimiento de la taxonomía de los microorganismos por parte del fitopatólogo.
Además, aun con toda esta vasta experiencia se podían cometer errores debido a
que los síntomas pueden ser muy parecidos entre enfermedades. En la actualidad,
existen varios procedimientos para determinar la etiología de las enfermedades en las
345
plantas: la observación al microscopio compuesto, técnicas serológicas, bioquímicas,
moleculares y microscopía electrónica. El método a utilizar dependerá de los objetivos
que se quieran alcanzar, el número de muestras que se desea analizar,
infraestructura con que se cuenta, entre otros. Las técnicas serológicas y moleculares
han permitido diagnosticar de forma rápida y eficiente diversos virus, viroides,
bacterias y fitoplasmas que producen enfermedades de importancia económica en los
cítricos a nivel mundial (Roistacher, 1991; Pupiro et al., 2003). Debido a la
importancia y al papel que desempeña en la fitoprotección un diagnóstico oportuno, el
objetivo de este capítulo es ofrecer información general sobre los métodos de
diagnóstico de enfermedades más utilizados en cítricos para que puedan ser
ampliados y utilizados para el manejo preventivo de enfermedades y programas de
certificación; esta última actividad de vital importancia para garantizar que el material
de propagación que se lleve a campo esté sano. Además se da una breve explicación
del principio teórico de la metodología y se citan algunos ejemplos de enfermedades
detectadas en cítricos, por lo general HLB y virus de la tristeza de los cítricos (VTC),
ya que son las más estudiadas y de las que mayor información hay disponible.
Adicionalmente, y de acuerdo a normas internacionales se anexa una tabla de la
Organización Norteamericana de Protección a las Plantas (NAPPO, por sus siglas en
inglés ―North American Plant Protection Organization‖), donde se hace un resumen de
todas las enfermedades que afectan a los cítricos así como las pruebas de
diagnóstico validadas.

Diagnóstico visual de enfermedades comunes de cítricos en campo

El diagnóstico visual nos da una primera aproximación del problema. En campo se

lleva a cabo lo que se conoce como diagnóstico macroscópico, el cual se basa en la
observación de síntomas. Resulta de vital importancia la experiencia del técnico
fitopatólogo y del conocimiento de las variables que inciden en la enfermedad. Se
deben de tener en cuenta los siguientes aspectos:

1. Examinar el campo y los alrededores.

2. Identificación de la especie o variedad enferma.
3. Patrones de anormalidad, distribución geográfica de la enfermedad en el
campo y comparación de plantas.
4. Examinar plantas individuales, posición de síntomas y signos.
5. Prácticas agrícolas del cultivo: fertilización, riego y control químico.

Bajo condiciones de campo y con experiencia, es factible identificar en cítricos

enfermedades como antracnosis, fumagina, mancha gracienta, muerte de ramas,
gomosis, entre otras.

346
En limón mexicano con la experiencia que se tiene del HLB es posible realizar un
diagnóstico preliminar o presuntivo para detectar la enfermedad del HLB basado en
sus síntomas típicos. En árboles de cítricos con estados avanzados de la enfermedad
se puede perder follaje, sufrir engrosamiento y aclaración de las nervaduras,
asimetría y difusión de colores en las nervaduras y foliolos, así como hojas pequeñas
y rectas. En lo que respecta a los frutos, su desarrollo se detiene y pueden presentar
deformaciones, tienen una coloración atípica y pueden sufrir aborto de semilla. En
limón mexicano no se han observado los daños mencionados anteriormente, el
síntoma mas común en éste es el moteado irregular que aparece en las hojas
maduras de 40 a 60 días de edad. Sin embargo, las deficiencias nutricionales de
micro y macroelementos genera patrones cloróticos similares a los causados por la
bacteria Candidatus liberibacter asiaticus. Debido a lo anterior, puede resultar muy
fácil confundirse, por lo que se recomienda realizar un diagnóstico más preciso si no
se cuenta con la experiencia suficiente para detectar la enfermedad en campo (Figura
106).

A B C

D E F
Figura 106. Síntomas de HLB: A) y B). Deficiencias nutricionales en hojas de limón
mexicano: C) Manganeso (Mn); D) Zinc (Zn); E) Hierro (Fe) y F) Magnesio (Mg).

Si este fuera el caso, se deben de llevar algunas muestras al laboratorio para ser
analizadas con más detalle, estas deben examinarse para descartar otro tipo de
problemas como pueden ser daño por animales, factores nutricionales o ambientales.

347
La muestra colectada debe presentar el daño o síntomas más distintivos del problema
observado.

Plantas indicadoras o indexado biológico

Las plantas indicadoras son aquellas que presentan una reacción rápida y
característica a un cierto patógeno que puede no ofrecer síntomas en la planta del
cultivo que se desea diagnosticar. Una planta indicadora debe reaccionar a la
posterior inoculación del agente infeccioso mediante la formación de lesiones locales.
La selección de una planta indicadora adecuada para un patógeno determinado en
ocasiones no está relacionada botánicamente con la planta de cultivo afectada. Por lo
anterior la experiencia del técnico fitopatólogo es escencial para determinar que
planta indicadora utilizar basado en la suceptibilidad de ser infectada (Barnes, 1994;
Martínez-Espinoza et al., 1997; Guzmán-Piedrahita et al., 2009). En cítricos el
diagnóstico mediante indexado biológico ha sido el método más utilizado para
detectar la presencia de patógenos transmisibles por injerto, entre los que se
encuentran bacterias, fitoplasmas, virus y viroides. Esta técnica clásica está basada
en la utilización de plantas indicadoras de especies de cítricos injertadas con
muestras que se desea diagnosticar o estudiar (Roistacher, 1991; Roistacher, 1998;
NAPPO, 2013 a). Cada muestra se inocula en dos o tres plantas y se conservan
otras sin inocular como testigo. Debido a la baja tasa de transmisión de la bacteria
asociada al HLB por injerto, la tasa de éxito del indexaje biológico para HLB es
variable.

Las plantas indicadoras idóneas son naranjo dulce o tangelo Orlando para la raza
africana y naranjo dulce o mandarina Ponkan para la raza asiática. Mediante esta
técnica la presencia del VTC puede interferir en la expresión de síntomas del HLB; en
estos casos, la toronja puede utilizarse como indicadora. La técnica más utilizada de
inoculación es el injerto lateral y como alternativo, injertos de hoja. Las plántulas
indicadoras conservan un solo tallo principal y se mantienen a 25-32ºC. Los síntomas
normalmente se presentan entre 8 a 12 semanas después de la inoculación
(Roistacher, 1991; Roistacher, 1998; NAPPO, 2012; Muhammad et al., 2012). Otras
enfermedades diagnosticadas mediante plantas indicadoras son tristeza de los
cítricos, hoja rugosa, enanismo de la mandarina satsuma, achaparramiento del
citrange, manchado foliar, mosaico amarillo, exocortis, cancrosis, escoba de bruja,
enanismo clorótico, muerte regresiva australiana, corteza gomosa, entre otras
(Roistacher, 1991; Roistacher, 1998; NAPPO, 2012; NAPPO, 2013 a; NAPPO, 2013
b). Actualmente existe un importante grupo de enfermedades poco caracterizadas
cuyo diagnóstico está limitado al uso de plantas indicadoras (ver anexo) (NAPPO,
2013 a). Las metodologías basadas en el indexado biológico tienen el inconveniente
de ser laboriosas y costosas, debido al requerimiento de instalaciones con
temperatura controlada, período prolongado para la manifestación de síntomas y la
necesidad de utilizar plantas indicadoras específicas para cada enfermedad. Se ha
observado, además, que algunos patógenos pueden interferir en la expresión de los
348
síntomas cuando el material que se va a diagnosticar posee infecciones mixtas
(Barnes, 1994; Martínez-Espinoza et al., 1997; Valenzuela-Herrera et al., 2003;
Guzmán-Piedrahita et al., 2009).

Diagnóstico serológico

Las pruebas serológicas de ELISA (acrónimo del inglés ―Enzyme-Linked

ImmunoSorbent Assay‖, Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a Enzimas) están
basadas en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de tal
manera que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como
enzimática. Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con
una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoabsorbente), la reacción
antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada
mediante la adición de un sustrato específico que al momento de actuar la enzima
produzca un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un
lector de placas de ELISA (Figura 107 A y C) (Barnes, 1994; Martínez-Espinoza et al.,
1997; Guzmán-Piedrahita et al., 2009).

A B

Figura 107. Ensayo serológico para la detección de fitopatógenos. A) Placa de ELISA; B) Kit
para ELISA (AGDIA); C) Lector de placas de ELISA.

349
Existen kits comerciales como los distribuidos por la casa comercial AGDIA
(http://www.agdia.com) los cuales son específicos para una gran cantidad de
microorganismos patógenos en diversos cultivos, incluido limón; estos kits contienen
un control positivo del patógeno para realizar la comparación de las muestras
analizadas (Figura 107 B). Sin embargo, la principal limitante en la práctica con estas
metodologías es que en ocasiones pueden arrojar falsos negativos cuando las
muestras no alcanzan la concentración mínima para que reaccione el complejo
antígeno-anticuerpo. Esta reportado que esta técnica no detecta virus en plantas si su
concentración es menor de 0.1 ng de virus/mL, mientras que el grado óptimo de
sensibilidad de la técnica serológica es de 1-10 ng de virus/mL (Bermúdez-Guzmán et
al., 2011). Teniendo en cuenta la disponibilidad actual de anticuerpos específicos,
algunos patógenos detectados en cítricos mediante esta metodología son Ca.
Liberibacter asiaticus (NAPPO 2012; NAPPO 2013 a), el VTC (Matthews et al., 1997;
Cambra et al., 2000; NAPPO 2013 b), el virus de la psorosis de los cítricos (Martín et
al., 2002; Martín et al., 2004), el virus variegado de los cítricos (Djelouah et al., 2004),
Xanthomonas citri subsp. citri (Haelteman et al., 2004), Xylella fastidiosa (Janse y
Obradovic, 2010), entre otros. La limitación más importante para la detección de VTC
por ELISA convencional es la necesidad de preparar extractos de las plantas a
diagnosticar. Por ello, se han desarrollado variantes como la inmunoimpresión-ELISA,
que es una técnica que utiliza membranas de captura que no requieren la trituración y
homogenización de las muestras, permitiendo el análisis de miles de muestras de
forma sencilla y rápida (Cambra et al. 2000).

El proceso consta de cuatro etapas básicas y secuenciales:

1. Recolección e impresión de muestras de membrana.

2. Bloqueo de la membrana impresa y reacción.
3. Lavado
4. Revelado y lectura de resultados.

Las ventajas mencionadas anteriormente han propiciado la gran aceptación del

método de inmunoimpresión para la detección de VTC en los programas de vigilancia
y las prospecciones masivas del virus de la tristeza de los cítricos en varios países.
Por otra parte, resulta un procedimiento adecuado en investigaciones epidemiológicas
o aquellas dirigidas al estudio de la distribución y localización de patógenos en los
tejidos del hospedero.

Diagnóstico por microscopía óptica y electrónica

Consiste en observar estructuras del microorganismo fitopatógeno directamente al

microscopio de luz, para el caso de las bacterias, hongos, nemátodos o al
microscopio electrónico para identificar a los virus. Éste último tiene la desventaja de
ser muy costoso, por lo que su uso en programas de diagnóstico masivo ha sido muy
limitado (Barnes, 1994; Guzmán-Piedrahita et al., 2009).
350
Para el diagnóstico de los hongos se necesita la formación de estructuras
reproductivas, como esporas o conidios, las cuales son generadas en cámara
húmeda. Cuando se trata de las bacterias, el proceso de identificación debe
complementarse con pruebas bioquímicas, para lo cual el primer paso consiste en el
aislamiento del microorganismo.
Comúnmente es necesario aplicar los postulados de Koch, para determinar con
exactitud la naturaleza del problema (Martínez-Espinoza, et al, 1997). Postulados de
Koch:

1. El microorganismo debe estar presente en todos los individuos enfermos.

2. El microorganismo debe poder aislarse del hospedante y crecer en cultivo
puro.
3. La inoculación del microorganismo crecido en cultivo puro debe provocar la
aparición de síntomas específicos de la enfermedad en cuestión.
4. El microorganismo debe ser reaislado del hospedante infectado de forma
experimental.

Estos principios de patología vegetal sobre los que se apoyan gran parte de las
investigaciones no pueden ser aplicados para los virus debido a su reducido tamaño y
su condición de parásitos endocelulares obligados (no pueden ser aislados en medios
de cultivo artificial). En el caso de la bacteria Ca. Liberibacter asiaticus, agente causal
del HLB, hasta el momento aún no se ha podido aislar en medios de cultivo
artificiales, aunque está publicado el procedimiento para hacerlo (Sechler et al.,
2009).

Para la detección de VTC, el procedimiento de microscopía óptica de mayor

aplicación es la observación de inclusiones virales que aparecen como grandes
agregados en forma de bandas, localizados en el tejido del floema (Grimaldi y Catara,
1988). También es posible la detección de Xylella fastidiosa, Spiroplasma citri,
Phytoplasma auratifolia, Ca. Liberibacter sp., virus de la psorosis de los cítricos
(CPsV) y virus de la leprosis de los cítricos (CiLV), entre otros patógenos (Martín et
al., 2002; Martín et al., 2004; Janse y Obradovic, 2010; NAPPO, 2013 a)

Diagnóstico molecular

El diagnóstico basado en la detección de ácidos nucleicos (AN), ya sea ácido

desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), presenta numerosas ventajas
sobre los métodos descritos con anterioridad. El uso de las metodologías basadas en
Biología molecular para la identificación de los microorganismos constituye hoy en día
la forma más precisa y confiable de determinar los agentes causales prácticamente
de cualquier enfermedad de origen biótico: hongos, bacterias, virus, fitoplasmas. Lo
anterior se debe a la elevada sensibilidad y especificidad que tienen los AN,
característica conferida por la comlementariedad de sus bases nitrogenedas. La
351
mayoría de estas técnicas están basadas en la hibridación de los AN y principalmente
en la PCR. Ambos métodos presentan numerosas variantes que se emplean para la
detección de fitopatógenos, pero tienen el inconveniente de ser costosos. (Figura
108).

Figura 108. Manipulación de muestras en laboratorio para diagnóstico de enfermedades por

PCR.

Hibridación de los ácidos nucleicos

La hibridación de los AN es una técnica basada en el principio de complementariedad

de las bases nitrogenadas que forman los nucleótidos de las moléculas de ADN.
Interacciones moleculares conocidas como puentes de hidrógeno mantienen unidas
las bases nitrogenadas en pares que siempre son T-A (Timina-Adenina) y C-G
(Citosina-Guanina). Esta metodología básicamente permite la unión del AN genómico
del patógeno, previamente fijado a un soporte sólido (membrana de nitrocelulosa o
nylon), con AN complementarios denominados sondas. La sensibilidad del método
depende de la concentración y distribución del patógeno, del método de extracción de
ADN de la muestra y de la calidad de la sonda empleada. Las variantes más
empleadas del método son ―Southern-blot‖, para ADN, y ―Northern-blot―, para ARN
(Barnes, 1994; Martínez-Espinoza et al., 1997; Guzmán-Piedrahita et al., 2009). Estos
métodos muestran altos porcentajes de eficacia y se utilizan para detectar viroides y
352
virus de ARN, son muy útiles para detectar patógenos presentes en bajas
concentraciones y limitados al floema y virus en su insecto vector. La hibridación de
los AN se ha utilizado para la detección del VTC, virus de la psorosis de los cítricos
(Martín et al., 2004), virus del mosaico amarillo de los cítricos (Gopi et al., 2010) y
algunos viroides.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), por sus siglas en inglés

―Polymerase Chain Reaction‖ es la técnica molecular más utilizada para la detección
de patógenos. Permite amplificar millones de veces un fragmento de interés
correspondiente al genoma del microorganismo. Esta técnica trabaja bajo el principio
de la complementariedad de las bases de los AN y la capacidad de síntesis del ADN
por la enzima ADN polimerasa. Para la amplificación del fragmento de ADN de
interés, se utilizan oligonucleótidos que se unen a ambos lados de la cadena de
nucleótidos. Este proceso se realiza mediante ciclos sucesivos de desnaturalización
térmica del ADN, unión de los oligonucleótidos a las secuencias complementarias y
extensión de los oligonucleótidos mediante la enzima ADN polimerasa (Barnes, 1994;
Martínez-Espinoza et al., 1997; Guzmán-Piedrahita et al., 2009). A nivel mundial el
diagnóstico de patógenos no cultivables in vitro como fitoplasmas y algunas bacterias
confinadas a los haces vasculares de las plantas, se realizan fundamentalmente
mediante esta técnica debido a su elevada especificidad. Por medio de la variante
convencional de PCR se han diagnosticado los patógenos de cítricos Xylella
fastidiosa (Janse y Obradovic, 2010), Spiroplasma citri (Yokomi et al., 2008),
Phytoplasma aurantifolia, Ca. Liberibacter sp. (Wang et al., 2006; Li et al., 2007),
Guignardia citricarpa (Peres et al., 2007), Xanthomonas citri subsp. citri
(Lertsuchatavanich et al., 2007), virus del mosaico amarillo de los citricos (Gopi et al.,
2010), Candidatus Phytoplasma (Ghosh et al., 2013), entre otros. En la figura 109 se
muestra un gel típico obtenido a partir de los productos de la técnica de PCR para
detectar el agente causal del HLB, la bacteria Ca. Liberibacter asiaticus. El
diagnóstico del patógeno se realiza con base a la presencia o ausencia de un patrón
de bandas que se generan. Estas bandas son comparadas con otras, llamadas
marcador de peso molecular (MPM), cuyo peso es conocido (el ADN se mide en
pares de bases (pb)).

Las bandas resultantes deben tener un determinado peso; en este caso la literatura
indica que la banda debe pesar 703 pb. Si coinciden los pesos entonces se puede
interpretar la presencia de la banda en las muestras analizadas como positivas a Ca.
Liberibacter asiaticus, por lo que el diagnóstico para la enfermedad del HLB es
positivo para las muestras 3-9 de limón mexicano (Figura 109). Para este tipo de
pruebas es recomendable utilizar un control positivo (carril 1), el cual corresponde a
una muestra de la cual se tiene la seguridad que está infectada con la bacteria y un
control negativo, correspondiente a una muestra sana de limón mexicano (carril 2). La

353
banda generada en el control positivo debe coincidir con el patrón de bandas
generado en las muestras analizadas.

Figura 109. Patrón de bandas obtenido de la PCR para diagnosticar Ca. Liberibacter asiaticus,
agente causal del HLB. MPM: Marcador de peso molecular. pb: pares de bases.

Transcripción Inversa - Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR)

La mayoría de los virus de las plantas y todos los viroides tienen un genoma de ARN,
lo cual imposibilita utilizar la metodología de la PCR para su detección, ya que esta
necesita como punto de partida ADN. Debido a lo anterior antes de llevar a cabo la
PCR se realiza una reacción de transcripción inversa (RT, por sus siglas en inglés,
―Reverse Transcription‖), en la cual el ARN es convertido a ADNc (ADN
complementario), por medio de la enzima reverso transcriptasa (Barnes, 1994;
Martínez-Espinoza et al., 1997; Guzmán-Piedrahita et al., 2009). Luego de sintetizado
el ADNc, se procede a su amplificación mediante el procedimiento clásico de PCR
descrito anteriormente. La RT-PCR se ha aplicado en cítricos para el diagnósticco de
las enfermedades del VTC (Matthews et al., 1997; Roy et al., 2005), enanismo de la
mandarina Satsuma (Shimizu et al., 2011), psorosis (Martín et al., 2004; Roy et al.,
2005), exocortis (Ito et al., 2002; Madhurababu-Kunta y Skaria, 2007), Cachexia
(Madhurababu-Kunta y Skaria, 2007), achaparraiento del citrange (Hailstones et al.,
2000; Ito et al., 2002; Roy et al., 2005), hoja rugosa (Bennani et al., 2002; Roy et al.,
354
2005), mosaico amarillo (Roy et al., 2005), entre otras. También se ha empleado para
detectar los patógenos causantes de varias anormalidades de crecimiento y
sintomatologías relacionadas con viroides de los cítricos (Ito et al., 2002; Cao et al.,
2009; NAPPO, 2013 a).

PCR en tiempo real

Esta técnica novedosa permite adicionalmente a la detección del patógeno, la

cuantificación del ADN del mismo. Otra de sus ventajas es que permite el análisis de
un mayor número de muestras en menor tiempo ya que no es necesario realizar la
electroforesis en gel de agarosa, procedimiento que consume mucho tiempo, sin
embargo, el principal inconveniente son los elevados costos de los insumos. La PCR
en tiempo real se ha aplicado exitosamente en la detección cuantitativa de numerosos
patógenos, entre ellos el VTC (Bertolini et al., 2007) y las bacterias causantes del
HLB (Wang et al., 2006). Otros patógenos que han sido identificados con esta
metodología son el virus de la psorosis de los cítricos (Barragan et al., 2008), Xylella
fastidiosa (Janse y Obradovic, 2010), virus de la mancha de hoja de los cítricos (Ruiz-
Ruiz et al., 2009), entre otros.

LITERATURA CITADA

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ANEXOS
Anexo 1. Patógenos causantes de enfermedades en cítricos y sus métodos de
diagnóstico y clasificación alfanumérica de los países miembros de la NAPPO
(NAPPO, 2013).
VIRUS
Enfermedad Patógeno Presencia/ausencia Prueba de
USA MEXICO diagnóstico
Tristeza de los Citrus tristeza virus P4 y P9 P4 y P9 Indexado en lima
cítricos (CTV) (CA) mexicana
ELISA
Psorosis A y B Citrus psorosis virus P4 P4 Indexado en plántulas
(CPsV-A, CPsV-B) de naranjo dulce

Variegado Citrus Variegation Virus P5 (FL) Ab1 Indexado en plántulas

infeccioso (CVV) de limón (eureka),
Hoja rugosa Citrus Leaf Rugose naranja agria y cidro
Hoja arrugada Virus (CLRV)
Citrus Crinkly Leaf Virus
(CCLV)

Leprosis Citrus Leprosis Virus Ab3 y Ab7 P5, P9 Nuclear: Microscopía de

Tipo nuclear (CiLV-N) o (FL) (CHIS, Transmisión Electrónica
Tipo citoplasmático QRO, Citoplasmática: RT-PCR
(CiLV-C) TAB,
VER)
Enanismo del Satsuma Dwarf Virus Ab1 Ab1 Indexado en mandarina
Satsuma (SDV) Satsuma, cidra Tangor
Dweet, Sésamo blanco
ELISA
Hoja distorsionada/ Apple Stem Grooving P5 (CA, Ab1 Indexado en citrange
achaparramiento del Virus (ASGV) Syn. AZ, TX, Rusk, Citrus excels
citrange Citrus Tatter Leaf Virus FL)
(CTLV)

359
Manchado foliar y Citrus Leaf Blotch Virus P5 (FL) Ab1 Indexado en Dweet
moteado del Dweet (CLBV) y Dweet Mottle tangor
Virus (DMV) RT-PCR

Mosaico amarillo Citrus Yellow Mosaic Ab1 Ab1 Indexado en plántulas

Virus (CYMV) de naranja dulce o
pomelo
ELISA

VIROIDES
Enfermedad Patógeno Presencia/ausencia Prueba de
USA MEXICO diagnóstico
Exocortis Citrus Exocortis Viroid P4 P4 Indexado en cidro Etrog
(CEVd) Arizona 861-S1

Cachexia Hop Stunt Viroid (HSVd) P4 P4 Etrog cidra Arizona 861-

Xyloporosis Variantes de cítricos de S1 para producción de
HSVd: tejido utilizado en RT-
Citrus Viroid IIb (CVd-IIb) PCR, hibridación sobre
Citrus Viroid IIc (CVd-IIc) improntas o indexado en
parson´s special
injertado en limón
rugoso

Varias Citrus Bent Leaf Viroid P4 Ab1 Indexado en Etrog cidra

anormalidades de (CBLVd) P4 Ab1 Arizona 861-S1 y
crecimiento y Citrus Dwarfing Viroid P4 Ab1 producción de tejido
sintomatologías (CDVd) P4 Ab1 utilizado en RT-PCR o
relacionadas con Citrus Bark Cracking Viroid P4 Ab1 hibridación sobre
viroides de los (CBCVd) Ab1 Ab1 improntas para la
cítricos Citrus Viroid-IIa (Variante de variante HSVd-Citrus:
HSVd) CVd-IIa
Citrus Viroid V (CVd-V)
Citrus Viroid VI (CVd-VI)

BACTERIAS
Enfermedad Patógeno Presencia/ausencia Prueba de
USA MEXICO diagnóstico
Cancro de los cítricos Xanthomonas citri subsp. P5, P9 Ab1 Indexado en hojas
citri (FL, LA) de lima mexicana
o pomelo
Cultivo
ELISA
PCR

Huanglongbing Candidatus Liberibacter P5 Y P9 P5 (Ca. L. Indexado en

asiaticus, (Ca. L. asiaticus en plántulas de
Ca. L. africanus asiaticus YUC, naranjo dulce
Ca. L. americanus en CA, QROO, q PCR
360
 FL, LA, NAY, JAL, PCR
SC, GA, COL, SIN, Hibridación
PR, TX, MICH,
USVI) CHIS,
CAMP,
BCS, HGO)

Clorosis variegada de Xylella fastidiosa subsp. Ab1 Ab1 PCR +

los cítricos (CVC) pauca secuenciación
Cultivo

MOLLICUTES
Enfermedad Patógeno Presencia/ausencia Prueba de
USA MEXICO diagnóstico
Stubborn Spiroplasma citri P5 (CA,
AZ) Ab1 Cultivo

Escoba de bruja Candidatus Phytoplasma Ab1 Indexado en

aurantifolia Ab1 lima mexicana
PCR

HONGOS
Enfermedad Patógeno Presencia/ausencia Prueba de
USA MEXICO diagnóstico
Mancha negra Guignardia citricarpa P5 y P9 (FL) Ab1 PCR
Cultivo

Roña de la naranja Elsinoë australis P5 y P9 (TX, P5 (SON, PCR

dulce AZ, MS,LA, VER, BCS,
FL) NL, JAL,
NAY, SLP,
PUE, MOR,
QROO,
QRO, GRO,
BCN)

NO CARACTERIZADOS - DESCONOCIDOS
Enfermedad Patógeno Presencia/ausencia Prueba de
USA MEXICO diagnóstico
Enanismo clorótico Aún no caracterizado, Ab1 Ab1 Indexado en limón
probablemente virus rugoso
(Citrus Chlorotic Dwarf
Virus)

Muerte repentina Desconocido, Ab1 Ab1 Ningún método de

probablemente Tymovirus diagnóstico aceptado
(Muerte repentina de los Para detectar la
cítricos – virus presencia de
361
 relacionados) Tymovirus: PCR

Muerte regresiva Aún no caracterizado, Ab1 Ab1 Indexado en naranjo

australiana probablemente fitoplasma dulce o pomelo
PCR

Punteado entre Desconocido, P5 (CA) P5 (CA) Indexado en lima

nervadura, agallas probablemente Luteovirus mexicana, naranja
de la madera agria

Corteza gomosa Desconocido, Ab1 Ab1 Indexado en naranjo

probablemente la variante dulce
CVd_IIc

Blight Desconocido P5 (FL) P5 (FL) Ningún método de

diagnóstico aceptado
Concavidad gomosa Desconocido, similar a P5 (CA) P5 (CA) Indexado en plántulas
virus de naranjo dulce

Cristacortis Desconocido, similar a Ab1 Ab1 Indexado en naranjo u

virus Orlando tangelo

Impietratura Desconocido, similar a Ab1 Ab1 Indexado en naranjo

virus dulce
Wood pocket Probable desorden P11 (CA, P11 Síntomas en campo
genético en lima persa FL) (CA, FL)

362
En el proceso editorial de la presente publicación participó el siguiente personal:

EDICIÓN Y COORDINACIÓN DE LA PUBLICACIÓN

Dr. Gerardo Salazar-Gutiérrez
Dr. Mario Orozco-Santos
Dr. Marciano Manuel Robles-González
Dr. José Joaquín Velázquez-Monreal
MC Miguel Ángel Manzanilla-Ramírez
MC Manuel de Jesús Bermúdez-Guzmán

REVISIÓN TÉCNICA
MC Sergio Alberto Curti-Díaz
Dr. Mario Alberto Miranda-Salcedo

SUPERVISIÓN
Dr. José Antonio Rentería Flores
Dr. Gerardo Salazar-Gutiérrez
MC Isaac Vizcaíno-Vargas
Dr. Mario Orozco-Santos

FOTOGRAFÍA
Dr. Mario Orozco-Santos
Dr. Marciano Manuel Robles-González
Dr. José Joaquín Velázquez-Monreal
MC Miguel Ángel Manzanilla-Ramírez
MC Manuel de Jesús Bermúdez-Guzmán

CORRECCIÓN DE ESTILO
Veronica Ochoa Chavez
Para mayor información escriba, llame o acuda al:

CENTRO DE INVESTIGACIÓN REGIONAL DEL PACÍFICO CENTRO

INIFAP
Interior del Parque Los Colomos S/N
Colonia Providencia
Guadalajara, Jalisco, México
CP. 44660
Teléfono: (33) 36 41 35 75, 36 41 22 48, 36 41 20 61
Fax: (33) 36 41 35 98

CAMPO EXPERIMENTAL TECOMÁN. CIRPAC. INIFAP

Kilómetro 35 Carretera Colima-Manzanillo
Apartado postal 88
Tecomán, Colima, México
C.P. 28100
Teléfono: (313) 324 01 33, 324 30 82, 324 05 28
Fax: (313) 324 01 33
 El Limón Mexicano
(Citrus aurantifolia)
Mario Orozco-Santos
Marciano Manuel Robles-González
José Joaquín Velázquez-Monreal
Miguel Ángel Manzanilla-Ramírez
Manuel de Jesús Bermúdez-Guzmán
Silvia Heréndira Carrillo-Medrano
Víctor Manuel Medina-Urrutia
Luis Martín Hernández-Fuentes
Rafael Gómez-Jaimes
Gilberto Manzo-Sánchez
Javier Farías-Larios
Daniel Nieto-Ángel
Edgar Mijangos-Hernández
Julio Alejandro Sánchez-de la Torre
Sóstenes Varela-Fuentes

Esta obra se terminó de imprimir en los talleres gráficos de la imprenta:

Libertad No. 1457, Col. Americana, Guadalajara, Jalisco, México CP 44160

Tel. (33) 38 26 27 26 y 38 26 27 82

Tiraje de 2,000 ejemplares

Noviembre del 2014

Impreso en México Printed in Mexico

 AGRADECIMIENTOS

Al Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, institución

donde se ha generado el mayor conocimiento científico-tecnológico de limón
mexicano en el mundo. Agradecimiento especial por el apoyo económico para la
impresión de este libro.

A la Fundación Produce Colima A.C. por el financiamiento de los proyectos de

investigación orientados a la búsqueda de estrategias de manejo del huanglongbing y
su vector el psílido asiático, las cuales son plasmadas en este documento.

Al Fondo Institucional de Fomento Regional para el Desarrollo Científico, Tecnológico

y de Innovación (FORDECyT) del CONACYT por el financiamiento del proyecto No.
139259: Desarrollo y evaluación de tecnología para el manejo sustentable del
huanglongbing (Candidatus Liberibacter) y su vector (Diaphorina citri) en los cítricos
ácidos del Pacífico de México. Parte de la información descrita en este libro es
producto de investigaciones del citado proyecto.

Al Consejo Estatal de Productores de Limón de Colima (COEPLIM) por su apoyo

incondicional e interés en la generación de tecnología en limón mexicano. Esta obra
está dedicada a los “limoneros” mexicanos, esperando que la información contenida
les sea útil para implementar un manenjo eficiente y sustentable del cultivo de limón
mexicano y con ello coadyuve a mejorar sus ingresoso.

Agradecimiento especial a las diferentes empresas líderes de productos agrícolas

para el campo mexicano por su apoyo económico. En especial a Total México, Bayer
de México, Syngenta, Dow AgroSciences, ADAMA y Yara.
INSTITUCIONES PARTICIPANTES Y PATROCINADORES

FORDECyT

ADAMA
 WWW.INIFAP.GOB.MX

El INIFAP a través del campo Experimental Tecomán

ha generado tecnología de producción del cultivo de
limón mexicano durante más de cuatro décadas y que ha
sido adoptada por productores de este cítrico en toda la
costa del Pacífico Mexicano, desde el estado de Colima
hasta Oaxaca. Este 40 aniversario, lo celebramos con la
presentación y entrega a los limoneros de México del
libro “EL LIMÓN MEXICANO (Citrus aurantifolia)",
el cual contiene información de su origen y ubicación
taxonómica, así como de los principales componentes
del manejo agronómico del cultivo, desde la producción
de la planta, hasta la cosecha del fruto. Esperamos que
los técnicos y productores encuentren en esta obra
información útil que les ayude a realizar un manejo
eficiente y sustentable que mejore los rendimientos y la
calidad de fruta, para que al final se traduzca en mejores
ingresos para las familias limoneras.

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