Manual Bqmetabolica2019 2

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
UNIDAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

FACULTAD DE BIOANÁLISIS
REGIÓN XALAPA
BIOQUÍMICA METABÓLICA
“MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO”
M. EN C. LAURA CECILIA GONZÁLEZ SÁNCHEZ

Manual de laboratorio de bioquímica metabólica
ÍNDICE
I. Introducción
II. Fundamento
III. Objetivos
IV. Normas Generales del Laboratorio.
V. Manejo de RPBI
VI. Manual de Prácticas del Laboratorio de Bioquímica Metabólica.
1. Metabolismo de Carbohidratos
Práctica N° 1 Determinación de azúcares reductores

Práctica N° 2: Fermentación de la glucosa por levaduras
(Sacharomyces cerevisiae)
Práctica N° 3: Fermentación del vino.
2. Ciclo de Krebs
Práctica N° 4: Determinación de la actividad succinato deshidrogenasa.
Práctica N° 5: Respiración aerobia
Práctica N° 6: Respiración en células vegetales
Práctica N° 7: Respiración celular en plantas y animales
3. Cadena Transportadora de Electrones

Práctica N° 8: Estudio del bombeo de protones por levaduras; efecto de
los inhibidores de la cadena de transporte de electrones y de los
desacoplantes.
4. Metabolismo de los Lípidos

Práctica Nº 9: Radicales libres (lipoperoxidación).
Práctica N° 10: Conversión de lípidos a carbohidratos.
5. Metabolismo de los Aminoácidos y Nucleótidos

Práctica N°11: Transaminación.
2
INTRODUCCIÓN
La Bioquímica es la Ciencia que estudia los constituyentes químicos de los

seres vivos, sus funciones y transformaciones, es decir, estudia las bases
moleculares de la vida. Según se ha avanzado en el conocimiento científico, se
ha reconocido que gran parte de las enfermedades son consecuencia de
alteraciones moleculares y que se requieren sólidos fundamentos bioquímicos
para entender su fisiopatología, para llegar al diagnóstico y para desarrollar una
terapéutica adecuada. Todo ello ha contribuido a que la bioquímica tenga un
papel trascendental en el campo de la salud y por tanto resulte imperativo
proporcionar al alumno los conceptos teóricos adecuados en cuanto a las
principales rutas metabólicas de degradación y biosíntesis de biomoléculas, los
aspectos bioenergéticos, su regulación e interrelación que existe entre ellas,
así como complementar mediante la realización de experimentos que le
permitan desarrollar sus habilidades analíticas e integrar los conocimientos
adquiridos en sus cursos teóricos. Para lograr este objetivo es recomendable
que el estudiante haga una revisión y ampliación de la parte introductoria que
acompaña cada experimento y que sea capaz de aprender a aprender,
construir sus propios conocimientos y demostrar que la enseñanza estratégica
es integrada y aplicada a cada situación.
OBJETIVO
Ser un material de apoyo para la experiencia educativa, que permita al alumno

conocer a profundidad las rutas del metabolismo celular, con especial hincapié
en su regulación y en las interdependencias metabólicas entre diferentes
órganos, en situaciones de salud y enfermedad.
JUSTIFICACIÓN
Las prácticas de laboratorio en la enseñanza de la Bioquímica, tienen un rol
importante en el proceso de aprendizaje, a través del cual se busca motivar al
estudiante en la investigación con el desarrollo de experimentos y lograr con
ello promover el desarrollo del análisis y razonamiento vinculando teoría y
3
experimentación, siendo esto el motivo primordial que plantea la necesidad de

realizar un manual de prácticas que cumpla con dichos requerimientos, en
virtud de que en la actualidad no se cuenta con ningún material de apoyo
educativo que se apegue al programa de estudios de la experiencia.
Desde esta perspectiva, consideramos la necesidad de aplicar esta

herramienta de trabajo, con el compromiso de que se explote, investigue y
profundice los tópicos considerados adecuados a la experiencia educativa.
4
I. Normas Generales del

Laboratorio
5
NORMAS GENERALES DEL LABORATORIO
Se pretende que el alumno tome contacto con el laboratorio, para lo cual

se le indicarán las normas generales de comportamiento en el mismo, las
reglas de seguridad que hay que observar, así como las normas generales
para la realización de las prácticas de Bioquímica II.
A) NORMAS GENERALES DE COMPORTAMIENTO:
1. El alumno tiene la obligación de leer y estudiar con anticipación las

experiencias a realizar en el laboratorio. El fundamento teórico, si no lo
conoce, deberá buscarlo en los libros adecuados.
2. A la hora señalada para el comienzo de las prácticas el alumno deberá
estar en el lugar correspondiente y en su puesto. Será obligatorio usar
una bata blanca. No disponer de la bata blanca implica no poder realizar
la práctica de ese día.
3. Todo alumno deberá llevar cuaderno de prácticas y una libreta donde
hacer las anotaciones que estime oportunas, así como una calculadora.
4. Durante el horario de prácticas no se podrá salir del laboratorio sin pedir
permiso al profesor.
5. Está PROHIBIDO realizar pruebas diferentes a las indicadas en este
cuaderno de prácticas. El alumno se ceñirá escrupulosamente al mismo.
6. Se valorará la actitud que cada persona adopte durante la realización de
las prácticas, aspecto éste determinante de la nota final.
B) REGLAS DE SEGURIDAD:
1. En el laboratorio está PROHIBIDO comer, beber o fumar.

2. Se tomarán las precauciones necesarias al trabajar con ácidos, bases o
sustancias peligrosas para evitar accidentes. Si procede trabajar en
campana de extracción, usar guantes y gafas de protección.
6
3. En caso de introducción de alguna sustancia o disolución extraña en los

ojos, estos se lavarán con abundante agua utilizando un frasco lavador.
Posteriormente se aplicará un colirio neutro o suero salino fisiológico. Si
accidentalmente se ingiriera un ácido o base fuertes se administrará
abundante agua o leche y se acudirá a un centro médico. Las
quemaduras por sustancias corrosivas se tratarán lavándolas
adecuadamente y aplicando una pomada a tal fin. En todos los casos
es imprescindible el posterior examen en un centro médico. Ante
cualquier duda, incidencia o eventualidad se consultará y avisará al
profesor encargado del laboratorio.
4. Si fuera necesario calentar el contenido de un tubo de ensaye a la llama,
se hará con el tubo algo inclinado, agitando suavemente y con la boca
del tubo dirigida hacia un lugar en que no haya ninguna persona.
5. Los residuos líquidos se vertirán a las pilas del fregadero, previa dilución
con abundante agua.
6. Si se produce algún accidente, avisar rápidamente al profesor.
C) NORMAS GENERALES PARA LA REALIZACIÓN DE LAS PRÁCTICAS:
1. Antes de comenzar la práctica deberá revisar que dispone de todo el

material y productos necesarios para la misma, y que se encuentra
todo limpio y en orden. Se notificará al profesor cualquier anomalía.
Al finalizar la práctica entregará todo el material perfectamente
limpio y ordenado, avisando al profesor de haber terminado antes
de abandonar el laboratorio.
2. Las pipetas deben estar bien limpias y secas antes de ser utilizadas.
Pipetear siempre con la propipeta o perilla adecuada. No pipetear
entre varias personas.
3. Todos los frascos, botellas, etc., han de estar correctamente
etiquetados y cerrados, evitando que se confundan los tapones. Los
recipientes donde se almacenan sustancias y disoluciones se deben
marcar adecuadamente utilizando rotuladores, lápices de cera o
etiquetas. En cada caso se indicará la sustancia de que se trata y su
concentración, así como la fecha de preparación.
7
4. Se deben de anotar en el cuaderno de prácticas las disoluciones

preparadas y su concentración, así como el volumen preparado de
cada una.
5. Todos los frascos y botellas que contienen los reactivos preparados
deberán situarse en el sitio indicado por el profesor o encargado del
laboratorio.
6. Cada alumno (con independencia de que haya formado parte de un
grupo de varias personas) deberá presentar el informe
correspondiente a cada práctica el día de su realización, al finalizar la
misma.
7. Algunas de las preguntas de los cuestionarios se pueden responder
si se leen los métodos generales.
8. Ante cualquier duda preguntar al profesor de prácticas.
NOTA: SE RECUERDA QUE PARA SUPERAR LA ASIGNATURA ES

NECESARIO APROBAR LAS PRÁCTICAS.26
RESIDUOS BIOLOGICO-INFECCIOSOS (RPBI)

Podemos definir como residuos peligrosos biológico infecciosos (RPBI) a
aquellos residuos que contienen agentes infecciosos en concentración
suficiente para causar un daño directo a la salud que puede ser de naturaleza
viral, bacteriana o micótica, entendiendo que estos agentes se definen como
cualquier organismo capaz de transmitir una enfermedad, dichos residuos
provienen de actividades asistenciales o experimentales de salud ya sea en
humanos o animales. Resulta de suma importancia en el laboratorio el manejo
adecuado de los RPBI para logar dicho objetivo podemos seguir los siguientes
pasos:
1. Identificación de los residuos.
2. Envasado de los residuos.
3. Almacenamiento temporal.
4. Recolección y transporte externo.
5. Tratamiento
6. Disposición final.
8
El laboratorio de bioquímica metabólica será generador de RPBI en algunas

prácticas que se efectuaran, por lo que se abarcaran los puntos de
identificación y envasado de residuos se describe a continuación como se
deben cubrir estos procedimientos de manera adecuada para prevenir
cualquier tipo de accidente o mal manejo de dichos residuos. Se debe
identificar el desecho de forma inmediata una vez terminado el método de
donde se generó de su correcta identificación se derivara su correcto
envasado, los identificaremos de acuerdo a su estado físico ya sea liquido o
sólido.
Serán considerados RPBI en el laboratorio de Bioquímica Metabólica los
siguientes:
• Sangre y los componentes de ésta, sólo en su forma líquida, así como
sus derivados incluyendo las fracciones celulares o a celulares de la
sangre resultante (hemoderivados). La cual será inactivada antes de ser
desechada mediante la adición de hipoclorito de sodio a partes iguales
con un periodo de tiempo de diez minutos.
• Los residuos no anatómicos como recipientes desechables que

contengan sangre líquida. Los materiales de curación, empapados,
saturados, o goteando sangre o fluidos corporales.
• Los objetos punzocortantes que han estado en contacto con humanos o

animales o sus muestras biológicas lancetas, agujas de jeringas
desechables, agujas hipodérmicas, bisturís.
Los RPBI se deben separar y envasar de conformidad con sus características

físicas y biológicas observando lo establecido en la tabla No. 2 según la
NORMA Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002 como a continuación se
indica.
Tabla No 2.
TIPO DE RESIDUOS ESTADO ENVASADO COLOR
9
FISICO
Sangre Líquidos Recipientes Rojo
herméticos
Cultivos y cepas de Sólidos Bolsas de Rojo
agentes infecciosos polietileno
Sólidos Bolsas de Amarillo
polietileno
Patológicos
Líquidos Recipientes Amarillo
herméticos
Residuos no Sólidos Bolsas de Rojo
anatómicos polietileno
Líquidos Recipientes Rojo
herméticos
No se consideran residuos peligrosos biológicos infecciosos los siguientes:

• Torundas y gasas con sangre seca o manchada de sangre.
• Material de vidrio utilizado en el laboratorio.
• Muestras de orina y excremento utilizados en el laboratorio
10
II. Prácticas
1. METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS
11
Los carbohidratos pueden definirse como aldehídos y cetonas polihidroxílicos, y

sus derivados; reciben este nombre por la observación de que la formula
empírica de muchos integrantes de este grupo son: CnN2nOn , por lo tanto la
mayor parte de los carbohidratos consta de estos tres elementos. (1)
Todos los organismos obtienen energía de la degradación oxidativa de glucosa

y otros carbohidratos. Incluso para algunas células y organismos, como las
células del cerebro y muchas bacterias, esta es la principal o única fuente de
energía.
El metabolismo de los carbohidratos complejos, empieza en la boca, cuando la

saliva descompone los almidones. Después en el estómago, mediante la
acción del acido clorhídrico, el metabolismo continúa y termina en el intestino
delgado. Allí la amilasa (enzima del jugo pancreático), trasforma al almidón en
maltosa. La maltosa, pasa a ser trasformada en glucosa.
La glucosa pasa al torrente sanguíneo, y es oxidada en las células

proporcionándonos 4 kilocalorías por cada gramo. La glucosa que no es
quemada se transforma en glucógeno, el cual se almacena en hígado y en
músculos. (2)
Los niveles de glucosa también se pueden aumentar mediante síntesis

(gluconeogénesis) partiendo del piruvato o lactato. Además de su función tan
importante en el metabolismo energético, la glucosa también es un precursor
en la síntesis de polisacáridos estructurales como celulosa, disacáridos como
sacarosa y lactosa y de otros monosacáridos como galactosa y fructosa. A
continuación se exponen los detalles dela ruta glucolítica.3
12
Figura 1.1 Principales vías del metabolismo de glucosa en plantas y animales.3
La glucólisis es la vía metabólica por la que se degrada la glucosa;

filogenéticamente, es la vía más antigua y consiste en una secuencia de
reacciones enzimáticas en las cuales se degrada la glucosa.
La glucólisis puede dividirse en dos fases: una de activación y una oxidativa. La

fase de activación consiste en la transferencia de fosfatos a la glucosa con
gasto de dos ATP y en su ruptura en dos moléculas de gliceraldehído 3 fosfato;
en la fase oxidativa, el gliceraldehído 3 fosfato es transformado en piruvato con
la obtención de cuatro moléculas de ATP por fosforilación a nivel de sustrato. ()
Las reacciones de la glucólisis ocurren en el citoplasma y no están ligadas a

estructuras celulares. El producto de la vía es el piruvato, el cual puede seguir
diversos destinos según las condiciones de la célula.
13
PRÁCTICA No. 1
DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES
OBJETIVO:
Observar de forma cualitativa la existencia de los grupos aldehÍdos y cetonas.
Visualizar la demostración colorimétrica, que se basa en la variación de color
de diferentes sustancias químicas por el poder reductor del grupo carbonilo.
GENERALIDADES:
Una característica fundamental de los aldehídos y de las cetonas, es la
existencia en su estructura del grupo funcional carbonilo (C = O). Cuando el
carbonilo está asociado a un carbono primario forma los aldehídos, y cuando
está en un carbono secundario da lugar a las cetonas.
Los glúcidos monosacáridos (azúcares) según tengan el grupo funcional

aldehído o cetona, se dividen en aldosas o cetosas. Los aldehídos y las
cetonas de 6 o más carbonos forman estructuras cíclicas del tipo furanosa (5
vértices) o piranosa (6 vértices). La estructura abierta (no cíclica) de estas
moléculas se caracteriza por que el carbono del grupo carbonilo no es
asimétrico (2 valencias ocupadas por el oxígeno), pero cuando se forman los
ciclos, (estructura de Haworth) el carbono que forma parte del grupo carbonilo
se hace asimétrico (unido a cuatro grupos distintos), aumentando el número de
isómeros ópticos.
Las estructuras abiertas y cerradas son convertibles entre sí y existe un

equilibrio entre ambas formas. Para que un azúcar sea reductor debe tener el
grupo carbonilo libre, por lo que el carácter reductor está presente en los
monosacáridos. En el caso de los disacáridos, poseen carácter reductor
aquellas moléculas cuyo OH del carbono anomérico de la segunda molécula no
interviene en la reacción acetal, como es el caso de la maltosa (glucosa +
glucosa, enlace 1-4), mientras que la sacarosa (glucosa + fructosa, enlace 1-2),
14
pierde esta función por desaparecer el OH del carbono anomérico de la

fructosa.
Los monosacáridos más comunes son la glucosa, la fructosa, la galactosa y la

manosa. Un carbohidrato que puede ser hidrolizado en dos moléculas de
monosacáridos es llamado disacárido. Los más importantes son la lactosa
(presente en la leche), la sacarosa (presente en el azúcar común) y la maltosa.
Por su parte, aquellos carbohidratos que pueden ser hidrolizados en varias
moléculas de monosacáridos son llamados polisacáridos. Los más comunes
son el almidón y la celulosa, éste último es componente estructural de las
plantas.
Glucosa Fructosa
15
PRUEBA DE BENEDICT
Algunos azúcares tienen la propiedad de oxidarse en presencia de agentes
oxidantes suaves como el ion Fe3+ o Cu2+. Esta característica radica en la
presencia de un grupo carbonilo libre, el cual es oxidado y genera un grupo
carboxilo. Por lo tanto, aquellos azúcares con un grupo carbonilo libre son
llamados azúcares reductores y aquellos en los que el grupo carbonilo se
encuentra combinado en unión glicosídica se conocen como azúcares no
reductores. Existen varias reacciones químicas que permiten determinar si se
está en presencia de un azúcar reductor o no. La prueba de Benedict es una de
ellas y se basa precisamente en la reacción o no de un azúcar con el ion Cu2+.
El reactivo de Benedict contiene soluciones de carbonato de sodio, sulfato de
cobre, y citrato de sodio. El Na2CO3 confiere a la solución un pH alcalino
necesario para que la reacción pueda llevarse a cabo. El citrato de sodio
mantiene al ion Cu2+ en solución ya tiene la propiedad de formar complejos
coloreados poco ionizados con algunos de los metales pesados. Con el cobre
produce un complejo de color azul.
Si se le agrega al reactivo una solución de azúcar reductor y se calienta hasta
llevar la mezcla a ebullición, el azúcar en solución alcalina a elevadas
16
temperaturas se convertirá en D-gluconato y su ene-diol, rompiéndose luego en

dos fragmentos altamente reductores, los cuales con sus electrones expuestos,
reaccionarán con el Cu++. Se obtiene entonces un azúcar oxidado y dos iones
Cu+. Posteriormente el Cu+ producido reacciona con los iones OH- presentes
en la solución para formar el hidróxido de cobre. La aparición de un precipitado
amarillo, anaranjado, o rojo ladrillo evidencia la presencia de un azúcar
reductor.
MATERIALES Y REACTIVOS
1. -Reactivo de Benedict
a. Soluciones de carbohidratos al 2% (100 mL)
2. Glucosa
3. Fructosa
4. Galactosa
5. Sacarosa
6. Maltosa
7. Lactosa
8. 1 gradilla o vaso de precipitado
9. 6 tubos de ensayo de 15 x 150
10. 6 pipetas de 5 ml. y 6 de 2 ml.
11. 1 Tripie
12. 1 Tela de asbesto
13. 1 mechero
14. 1 vaso de precipitado de 500 ml
15. Pinzas para tubo
16. Perilla
17
PROCEDIMIENTO:
1. Depositar a cada tubo 2.5 ml del reactivo de Benedict

2. Adicionar a cada tubo 1 ml de un carbohidrato diferente procurando
marcar el tubo para identificarlo.
3. Observar el color que adopta.
4. Colocar los tubo en baño de agua hirviendo durante 5 minutos (uno por
uno)
5. Observar cualquier cambio de color durante el calentamiento (rojo,
anaranjado o verdoso)
6. Sacar el tubo y ponerlo en la gradilla y después de un corto tiempo
observar si se ha formado algún precipitado.
7. Anotar los resultados para cada tubo
RESULTADOS:
-Elaborar un cuadro con los carbohidratos que utilizó, si se formó un precipitado
y de qué color es el mismo.
PREGUNTAS:
-¿Concuerdan sus resultados con lo esperado teóricamente sobre
carbohidratos reductores? Explique.
-¿Qué otro reactivo se puede utilizar para el análisis de azúcares reductores?
-¿Porque es necesario el citrato de sodio en el reactivo de Benedict?
18
PRACTICA NO. 2
FERMENTACIÓN DE GLUCOSA POR LEVADURAS

(Sacharomyces cereviceae)
OBJETIVO:
Comprobar la producción de piruvato, acetaldehído y etanol durante la
fermentación de la glucosa.
GENERALIDADES:
La fermentación se define como un proceso de obtención de energía mediante
el cual las moléculas orgánicas servir como donantes de electrones y
aceptadores de electrones. (3)
En la fermentación las moléculas de ácido pirúvico se convierten en algo de
"residuos" de productos, y un poco de energía (sólo dos moléculas de ATP por
molécula de glucosa - en realidad cuatro son producidos en la glucólisis, pero
dos se utilizan) se produce. (4)
En muchos microorganismos que viven en condiciones anaeróbicas (sin
oxígeno), sirve como la principal vía productora de energía por catabolismo de
carbohidratos, lo que da por resultado la formación de productos metabólicos
finales específicos, como etanol, ácido láctico, glicerol y CO2.
El piruvato está situado en una verdadera encrucijada metabólica, y su destino,
entre otros factores, depende de las condiciones aerobias o anaerobias
existentes, así como de las características de las células donde se produce o
llega. (5)
De muchos tipos posibles de los procesos de fermentación, dos de los tipos
más comunes son la fermentación ácido láctica y la fermentación del
alcohol. (4)
+
2 ATP + glucosa + 4 ADP + 2 Pi + 2 NAD 2 ADP + 2 piruvato + 4 ATP + 2 NADH
19
REACTIVOS:
. Solución de glucosa al 1%
. Reactivo de Benedict.
. Levadura de panadero seca activa.
PROCEDIMIENTO:
1.- En un vaso de precipitado de 25 ml. Pipetear 10 ml de la solución de
glucosa y añadir 0.3 g (la punta de una espátula) de levadura. Mezcle
perfectamente hasta que la mezcla sea homogénea. Incubar a 37 grados
centígrados. Realizar una prueba de Benedict a esa mezcla a los 30 min., y a la
hora y media de incubación.
2.- Para verificar que la solución de glucosa es un azúcar reductor, realizar una
prueba de Benedict a la solución de glucosa.
3.- Para verificar que la levadura no contiene la presencia de ningún azúcar

reductor realizar un blanco de la siguiente manera:
Mezcle 0.3 g (la punta de una espátula) de levadura con 10 ml. de agua
destilada. Efectúe una prueba de Benedict tomando 0.5 ml de esta solución de
levadura.
INTERPRETACION:
1. Muestra no fermentada: reacción de Benedict positiva (rojo ladrillo)
2. Muestra fermentada: reacción de Benedict negativa (azul).
RESULTADOS:
OBSERVACIONES:
20
CONCLUSIONES:
PREGUNTAS:
1.-¿Qué es la glucólisis?
2.-¿Cuáles son los productos finales de la glucólisis en ausencia y presencia de

oxígeno?
3.-¿Cuántos ATP son sintetizados en la glucólisis?
4.-¿En dónde se lleva a cabo la glucólisis?
5.- ¿Qué es la fermentación?
PRACTICA No.3
FERMENTACIÓN DEL VINO
21
OBJETIVO:
Estudiar el efecto de la concentración de sacarosa en la fermentación del vino.
GENERALIDADES:
La fermentación alcohólica del vino es muy antigua y ya en la Biblia se hacen
numerosas referencias al proceso. Los griegos atribuían el descubrimiento de
la fermentación al dios Dionisio. (6)
El proceso principal mediante el cual se transforma el mosto de uva en vino, se

conoce con el nombre de fermentación alcohólica. La fermentación alcohólica
consiste en la transformación de los azúcares contenidos en la uva (glucosa y
fructosa) en alcohol etílico y anhídrido carbónico. (7)
Desde el punto de vista energético la fermentación alcohólica es una reacción

exotérmica, se libera una cierta cantidad de energía. La fermentación
alcohólica produce gran cantidad de CO2, que es la que provoca que algunos
vinos como el Champagne y el Cava tengan burbujas. (6)
El proceso de fermentación lo realizan las levaduras adheridas al hollejo de la

uva (mediante una capa cerosa denominada pruina) las que, para cubrir sus
necesidades de crecimiento, ayudan al proceso. Son levaduras del género
Sacharomyces las que suelen desempeñar la parte más importante de este
proceso. Son las verdaderas "obreras del vino.” (7)
El final del proceso de fermentación es cuando ya se han "desdoblado" casi

todos los azúcares y se detiene la ebullición. En bodegas esto se calcula
mediante los clásicos pesamostos o densímetros. Es importante también
controlar la temperatura de fermentación continuamente durante todo el
proceso, ya que cada vino requiere unos determinados márgenes de
temperatura. (7)
MATERIAL DE LABORATORIO:
22
- 1Probeta graduada de 250 ml

- Tubos de ensaye de 13 X 100
- 1Matraz Erlenmeyer
- 1Tapón de goma para el matraz
- Tubo Tygon
MATERIAL BIOLÓGICO:
- Levadura activa del vino seco
- Cepas de Saccharomyces ellipsoideus
REACTIVOS:
- Jugo de uva o de otra fruta
- Sacarosa
EQUIPO:
- Alcoholímetro (hidrómetro).
- Balanza
PROCEDIMIENTO:
1. Prepare el cultivo iniciador de levadura
• Mezcle 1 g del cultivo de levadura de vino seco en 100 mI de jugo de
uva. Vea la Nota 1.
• Deje la levadura crecer en un envase sin apretar a temperatura
ambiente por 24 horas.
2. Fermentación primaria
• Agregue bastante azúcar al jugo de uva para preparar los 4 substratos
como se muestra en la tabla 1.3, un litro por cada un
23
Sustrato Concentración de
Sacarosa
extra adicionada
A 0.0 g/l
B 100.0 g/l
C 200.0 g/l
D 300.0 g/l
Tabla 1.3 Concentración de sacarosa adicionada.
• Mida la gravedad específica y el valor de PA para cada uno de los

substratos iniciales con un alcoholímetro. Éste es el valor inicial de PA
que será utilizado más adelante para estimar el contenido en alcohol.
• Inocule cada botella con 20 mI del cultivo iniciador de levadura
preparado en el paso previo. Vea la nota 2.
• Tape la botella del jugo con un tapón de goma. Una pieza de tubo Tygon
es extendida del tapón para proporcionar un respiradero para el bióxido
de carbono desarrollado. El otro extremo del tubo se sumerge en agua
en un pequeño tubo de prueba tapado para la botella. El agua previene
la entrada del oxígeno, que altera el metabolismo de la levadura y
estropea el vino. Al mismo tiempo, el bióxido de carbono puede
escaparse de la botella.
• Fermente a temperatura ambiente por una semana.
3. Fermentación secundaria
• Al término de una semana, decante el jugo de la botella para limpiar los
envases temporales individuales.
• Mida los valores de PA para cada uno de los sobrenadantes con un
alcoholímetro. Estime el contenido en alcohol restando el valor final del
PA del valor inicial del PA.
• Deseche el sedimento y lave cada botella con agua.
• Vierta el jugo nuevamente dentro de la botella limpia. Ponga detrás el
ensamblaje limpio del tapón de goma y del tubo Tygon.
• Fermente lentamente por otras 4-6 semanas.
24
• Mida los valores del PA como antes cuando esté listo para consumir.
4. Pruebe el vino.
5. Pruebe con otros jugos de fruta.
NOTA 1. Las uvas frescas pueden ser machacadas para obtener el jugo. La
mayoría de los lagares agregan el dióxido de sulfuro como gas o como sal
sólida para prevenir el crecimiento de otras levaduras y bacterias que causen
los desperdicios. El dióxido de sulfuro también es producido por
Saccharomyces durante la fermentación. La fuente más simple del jugo es el
estante del supermercado. Utilice “Todo Natural” la variedad sin preservativos o
azúcar agregados.
NOTA 2. La levadura del vino seco se agrega directamente al jugo de uva en

un nivel de 1 g por 4 litros. Para mejores resultados, primero suspenda 1 g de
la levadura del vino seco en 10 mI del agua caliente cerca de 35 °C. Entonces
agregue el cultivo suspendido al jugo de uva
Hoja de resultados
1.- Anota en la tabla el contenido de alcohol que mediste.
Sustrato Contenido de alcohol en Contenido de alcohol en

Fermentación primaria Fermentación secundaria
C
D
RESULTADOS Y OBSERVACIONES
25
CONCLUSIONES
PREGUNTAS:
1.- ¿Qué es el efecto Pasteur?
2.-Comente sobre las maneras de mejorar el experimento.
3.-En una fermentación, ¿A una mayor concentración de glucosa esperaría

encontrar una mayor concentración de etanol?
4.- ¿Qué factores de experimentación deben controlarse durante el proceso de

fermentación alcohólica?
26
2. CICLO DE KREBS
En los organismos aerobios como el hombre, la energía se obtiene mediante la

transformación oxidativa de nutrientes y metabolitos hasta dióxido de carbono y
agua. En la matriz de la mitocondria se encuentran casi todas las enzimas que
participan en el ciclo de krebs. (5)
El ciclo toma su nombre en honor del científico anglo-alemán Hans Adolf Krebs,
que propuso en 1937 los elementos clave de la ruta metabólica. Por este
descubrimiento recibió en 1953 el Premio Nobel de Medicina
El ciclo de Krebs (conocido también como ciclo de los ácidos tricarboxílicos o

ciclo del ácido cítrico) es un ciclo metabólico de importancia fundamental en
todas las células que utilizan oxígeno durante el proceso de respiración celular.
El ciclo de Krebs es una ruta metabólica anfibólica, ya que participa tanto en

procesos catabólicos como anabólicos. Este ciclo proporciona muchos
precursores para la producción de algunos aminoácidos, como por ejemplo el
cetoglutarato y el oxalacetato, así como otras moléculas fundamentales para la
célula. (8)
El ciclo de Krebs se lleva a cabo por enzimas solubles (a excepción de la

succinato deshidrogenasa que es parte integral de la membrana interna) de la
matriz mitocondrial, figura 2.1.
Regulación del ciclo de Krebs. Por el hecho de que entrega NADH y FADH2 a
la cadena respiratoria y recibe de ella las mismas coenzimas oxidadas, el ciclo
de Krebs funciona bajo el control de la cadena respiratoria y depende en última
instancia de la fosforilación oxidativa. Sin embargo, el ciclo de Krebs responde
a moduladores alostéricos generados en el propio ciclo y también en otras vías
del metabolismo; son moduladores negativos NADH, ATP, citrato, succinil-CoA
y oxaloacetato y modulador positivo ADP.
27
Figura 2.1 Ciclo del ácido cítrico.
28
PRACTICA No. 4
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD SUCCINATO DESHIDROGENASA
OBJETIVO:
Comprobar el funcionamiento del Ciclo de Krebs por medio de la actividad de
una de las enzimas involucradas en dicho ciclo.
GENERALIDADES:
La conversión de succinato a fumarato, la tercera oxidación del ciclo del ácido
cítrico, es catalizada por la succinato deshidrogenasa, una flavoproteína y
oxidoreductasa que contiene FAD. ()
La parte final del ciclo consiste en la reorganización de moléculas a cuatro
átomos de carbono hasta la regeneración del oxalacetato. Para que eso sea
posible, el grupo metilo presente en el succinato tiene que convertirse en un
carbonilo. Estos tres pasos, además de regenerar oxalacetato, permiten la
extracción ulterior de energía mediante la formación de FADH2 y NADH. (11)
La enzima succinato deshidrogenasa es la única enzima del ciclo de Krebs que

no se encuentra en la matriz mitocondrial, sino que en la membrana
mitocondrial interna, con el sitio de unión del sustrato accesible desde la matriz.
Es además la única en el ciclo asociada a un grupo prostético flavínico (FAD)
mediante el cual los equivalentes de reducción del succinato son transferidos a
la ubiquinona, componente de la cadena de transporte de electrones. En
general la función bioquímica del FAD es oxidar alcanos a alquenos, mientras
que el NAD+ oxida alcoholes a aldehídos o cetonas. El malonato es un fuerte
inhibidor competitivo de la enzima. (10)
29
- Baño María
- 1 Mortero
- 1 Gradilla
- 2 Tubos de ensaye
- 2 Pipetas de 5 ml
- 1 Pipeta de 1 ml
- 1 Termómetro de 0 a 100°C
- Arena de vidrio.
- Aceite vegetal, 10 ml
- Músculo fresco de res o pollo, 1g
REACTIVOS:
(Para su preparación véase la preparación de soluciones).
- Ácido succínico al 3% neutralizado con hidróxido de sodio al 10% hasta pH
7.4, 50 ml
- Azul de metileno al 0.001%, 25 ml
- Ácido tricloroacético al 20%, 10 ml
PROCEDIMIENTO:
1. Triture cuidadosamente con arena de vidrio 1 g de músculo en un mortero,
añadiendo de 3 a 4 ml de la disolución de ácido succínico y filtre a través de
una gasa la mezcla.
2. El líquido homogeneizado se reparte en dos porciones iguales, las cuales se
pondrán en tubos de ensaye.
3. En el tubo control se añade 1 ml de disolución de ácido tricloroacético para
destruir la enzima.
4. Añada a ambos tubos de 1 a 2 gotas de azul de metileno y agítelos.
5. Sobre la superficie del líquido de cada tubo se vierten de 0.5 a 1 ml de aceite
con el fin de aislar el oxígeno del aire.
6. Los tubos se incuban en baño maria a 50° C durante 10 minutos.
30
7. Una vez transcurrido este tiempo, en el tubo de ensaye experimental se

observa la decoloración del azul de metileno
RESULTADOS:
1.- Anota los cambios de color en los tubos.
2.- Explica ¿Por qué el azul de metileno puede actuar como indicador cuando
la enzima está presente y activa?
OBSERVACIONES:
CONCLUSIONES
PREGUNTAS:
1.-¿Por qué se utiliza músculo como material biológico de experimentación?
2.-Nombra las enzimas del ciclo de Krebs e indica el tipo de reacción que
cataliza cada una. Indica ¿cuáles actúan como oxido-reductasas y cuál es su
cofactor?
3.-En la reacción en la cual la succinil-CoA es convertida a succinato una
molécula de GTP es producida. Es sabido que la producción de GTP es
equivalente a la de ATP. ¿Cómo puedes explicar esto considerando los
siguientes cambios de reacción?
GTP+ADP = GDP+ATP
4.-¿Qué es la succinato deshidrogenasa y en qué vía metabólica ejerce su
acción?
5.-¿Cuáles son los productos de su actividad?
31
PRACTICA No 5
RESPIRACIÓN AEROBIA
OBJETIVO: En qué condiciones se presenta la respiración aerobia
GENERALIDADES:
La respiración celular incluye todas las vías metabólicas que degradan
carbohidratos y otros metabolitos para la obtención de ATP. Cuando una
molécula de glucosa de seis carbonos se rompe, se transforma en moléculas
de ácido pirúvico de tres carbonos. Este proceso aerobio es denominado
glicólisis. La glicólisis se lleva a cabo en el citoplasma de las células y no
requiere de oxígeno; sin embargo, si hay oxígeno presente, el proceso de
liberación de energía continúa, ocurriendo la respiración aerobia que sucede en
la mitocondria.
En la respiración aerobia existen dos pasos después de la glicólisis. En el
primero se transforma el ácido pirúvico de tres carbonos en acetil coenzima A
de dos carbonos; el tercer carbono se ha transformado en CO2. El segundo
paso de la respiración aerobia es el ciclo del ácido cítrico que continúa
liberando moléculas de CO2 durante el proceso y formando moléculas de ATP.
Si no hubiera oxígeno disponible en el proceso de la respiración después de la
transformación del ácido pirúvico, se presenta un proceso anaerobio llamado
fermentación.
MATERIAL Y EQUIPO
-3 vasos de precipitado de 100 ml
-3 pipetas Pasteur con bulbo
-Indicador fenolftaleína
-NaOH 0.1 N (50 ml)
-Popotes
-Agua destilada
32
PROCEDIMIENTO
1. Rotula 3 vasos de precipitado de 100 ml y agrégales agua a la mitad de
su capacidad de agua destilada. Adiciónales unas 5 gotas de solución
de NaOH y agita. A continuación agregar 3 gotas de fenolftaleína y
agitar.
2. Toma la frecuencia cardiaca (pulso) de alguno de tus compañeros de
equipo en reposo y anota tus resultados. Haz que exhale el aliento de
una respiración en el vaso 1 ayudándose con un popote.
3. Pide a tu compañero que camine durante un minuto y vuelve a medir su
frecuencia respiratoria. Anota tus resultados y haz que exhale el aliento
de una respiración en el vaso de precipitado 2.
4. Pide ahora que realice ejercicio fuerte como correr o subir y bajar
escaleras durante 3 minutos, vuelve a tomar su frecuencia respiratoria y
haz que exhale el aliento de una respiración en el vaso de precipitado 3.
5. Compara tus observaciones
RESULTADOS:
OBSERVACIONES:
33
CONCLUSIONES:
PREGUNTAS:
1.- ¿Qué es la respiración?
2.- ¿Bajo qué condiciones se da la respiración aerobia?
3.-Defina y explique el concepto de coeficiente respiratorio.
4.- ¿Cuál es su utilidad práctica?
34
PRACTICA No. 6
RESPIRACION EN CELULAS VEGETALES
OBJETIVO:
Comprobar el evento de la respiración a través de la formación de un
subproducto natural como es el bióxido de carbono.
GENERALIDADES:
La respiración, proceso metabólico mediante el cual los organismos aerobios

obtienen energía, consta de tres fases:
Ciclo de Krebs, Cadena respiratoria, Fosforilación oxidativa.
Durante la misma se produce la formación de dióxido de carbono, agua y parte

de la energía liberada se utiliza para la formación de ATP. Este proceso se
alimenta de un importante metabolito, la Acetil-Coenzima A, compuesto que
puede proceder de la degradación de carbohidratos, lípidos y proteínas. Dentro
de los glúcidos se destaca el almidón por su abundancia.
El proceso respiratorio es continuo en todas las células aerobias y en los

vegetales se lleva a cabo tanto en raíces como en tallos, hojas, flores y
semillas. Estas últimas constituyen un importante reservorio de sustancias
oxidables entre las que se destacan el almidón y las grasas.
Cuando las semillas germinan, degradan una importante parte de estas

sustancias. El almidón se convierte por la acción de la amilasa y las diastasas
en glucosa la cuál se degrada por la combinación de la glucólisis y la
respiración hasta dióxido de carbono y agua.
La producción de dióxido de carbono se puede cuantificar mediante su reacción

con hidróxido de bario según la ecuación:
Ba(OH) 2 + CO 2 BaCO 3 + H 2 O
35
El exceso de hidróxido de bario se titula con ácido oxálico y de esta forma se

puede calcular la intensidad respiratoria de las semillas.
MATERIAL Y EQUIPO
4 frascos de boca ancha con tapa
4 pipetas Pasteur con bulbo
Probeta graduada de 50 ml
Balanza granataria
1 Bureta
Soporte para Bureta
Gasas
Hilo
REACTIVOS:
Semillas germinadas de fríjol o chícharo
Solución de Ba(OH)2 0.1 M
Solución ácido oxálico 0.1 M
Fenolftaleína
PROCEDIMIENTO:
I- COMPROBACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE CO2 DURANTE LA

RESPIRACIÓN.
1. En las gasas se colocan las semillas germinadas, 5 y 10 gr

respectivamente, posteriormente se cierra con el hilo y se cuelga de la
tapa del frasco.
36
2. Anote la masa de semilla pesadas en la balanza granataria y denótelo

como "c".
3. En dos de los frascos se introducen 25 ml de la disolución de Ba(OH)2 y
se tapa con el tapón en que están colocadas las semillas germinadas.
Se dejan en el puesto de trabajo durante una hora. Periódicamente se
agita el mismo para facilitar la reacción del CO2 desprendido.
4. Paralelamente se prepara otro frasco que contenga 25 ml de Ba(OH)2 y
se tapa, el cual se utilizará como testigo.
5. Después de transcurrida la hora se valoran los 3 frascos con Ácido
Oxálico previa adición de 2 ó 3 gotas de fenolftaleína.
6. Anote los volúmenes de ácido consumido en la valoración de los frascos
que contenían las semillas (b) y en el frasco testigo (a).
REPORTE DE LABORATORIO
I- Realice el cálculo de la intensidad respiratoria teniendo en cuenta los datos

obtenidos del experimento, mediante la siguiente fórmula: X= 2,2 (a - b) / c
a = ml de ácido oxálico consumidos en la valoración del frasco testigo (sin

semillas)
b = ml de ácido oxálico consumidos en la valoración del frasco con las semillas
c = masa de semillas (gramos)
X = Intensidad respiratoria. mg de dióxido de carbono desprendido por gramo

de semilla
37
2,2 = 1 ml de ácido oxálico c(x/z*) 0,1 mol/l equivale a 2,2 mg de dióxido de

carbono desprendido
Explique en qué etapas de la respiración se forma el Dióxido de carbono

desprendido.
RESULTADOS:
OBSERVACIONES:
CONCLUSIONES:
Preguntas:
1.- Mencione cuales son los productos finales en la respiración en plantas
2.- ¿Cuál es la diferencia encuanto la respiración en semillas y plantas?
38
PRACTICA No. 7
RESPIRACIÓN CELULAR EN PLANTAS Y ANIMALES
GENERALIDADES:
En la siguiente actividad, se comparará el proceso de respiración celular en
varios organismos que viven en agua dulce. El CO2 que producen estos
organismos durante la respiración celular se convierte en un ácido (ácido
carbónico), cuya concentración se medirá por medio de una titulación2 usando
un indicador de pH (fenolftaleína). Con este indicador se observará el punto de
cambio en pH, donde se obtiene el equilibrio entre pH ácido y básico. Este
cambio en pH sucede al añadirle una solución básica de NaOH a la muestra
ácida, y se observa por un cambio en color; de esta forma se podrá calcular la
producción de CO2 para cada organismo. Se estudiará una planta acuática
para determinar si lleva a cabo la respiración celular en la oscuridad y en
presencia de luz.
MATERIAL Y REACTIVOS:

-5 pipetas graduadas de10 ml
-1 bureta para titular de 10 ml
-1 soporte para bureta
-1 pinzas para bureta
-1 probeta de 100 ml
-1 perilla
-Papel de aluminio
-Fenolftaleína
-Solución de NaOH 0.25 M (para diluir 1:100)
-Anticloro
-Lámpara
39
MATERIAL BIOLOGICO
-Peces de agua dulce
-Caracoles de agua dulce
-Elodea fresca
PROCEDIMIENTO:
1. Determine el volumen que se añadió al producirse ácido carbónico en el

agua para cada organismo a utilizarse ( pez, caracol, Elodea ) y anote la
información en la Tabla 1
Para determinar el volumen siga estos pasos:
a. Añada el organismo a un vaso de precipitado de 100 ml con 50 ml de agua

corriente
b. Haga una marca donde queda el menisco.
c. Remueva el organismo.
d. Con una pipeta llena añada agua hasta llegar a la marca.
e. La diferencia de lectura en la pipeta indicará el volumen del organismo.
f. Repita para cada organismo.
2. Rotule cinco vasos de precipitado (150 ml) del 1 al 5 y añádale a cada uno:
1: 100 ml de agua + 1 pez

2: 25 ml de agua + un caracol grande (o dos caracoles pequeños)
3: 100 ml de agua + 5 cm de Elodea fresca
4: 100 ml de agua + 5 cm de Elodea fresca
5: 100 ml de agua
RECUERDE
· Hay que tratar el agua con anticloro antes de añadir los
animales. Siga las indicaciones del producto.
· NO deje morir los peces y los caracoles después del experimento;
devuélvalos a la pecera.
40
3. Tape la boca de los vasos con papel de aluminio, excepto el vaso 4 que se
cubrirá por completo para mantener la Elodea en oscuridad.
4. Coloque el vaso 3 cerca de una bombilla.
5. Después de 30 minutos, remueva los organismos y devuélvalos a los

recipientes correspondientes en la mesa del profesor.
6. Transfiera 25 ml de la solución del vaso 1 a un vaso pequeño.
7. Añada cuatro gotas de fenolftaleína y mezcle.
8. Llene la bureta de titulación con la solución de 0.0025 M de NaOH.
9. Mueva el vaso en círculos y añada gotas de la solución de NaOH hasta

obtener un color rosado persistente.
10. Anote en la Tabla la cantidad de NaOH que utilizó para la titulación.
11. Repita el proceso con los demás vasos.
12. Calcule la producción de CO2 para cada vaso mediante esta ecuación:
Producción [ml NaOH (experimental) - ml NaOH (control*)] x 2.5 ml NaOH

de = _________________________________________________
CO2
Volumen del organismo (ml)
*Se obtiene al titular el agua del vaso 5.
13. Coloque los resultados en la Tabla 1
RESULTADOS:
41
Tabla 1. Respiración celular aeróbica en plantas y animales

Vaso de Organismo NaOH Volumen del Cantidad de
precipitado (ml) Organismo(ml) CO2 (ml)
1 Pez
2 Caracol
3 Elodea en luz
4 Elodea en
oscuridad
5 Agua (control)
PREGUNTAS:
1.- ¿Qué organismo tiene el metabolismo más alto? ¿Por qué?
2.- ¿Qué organismo tiene el metabolismo más bajo? ¿Por qué?
3.- ¿Por qué la planta lleva a cabo fotosíntesis y también respiración celular?
4.- Compare los resultados de Elodea en la oscuridad y en la luz. ¿Cuál tiene

una mayor tasa de respiración celular? ¿Por qué?
42
3. Cadena Transportadora de Electrones
El flujo de electrones en las reacciones de óxido-reducción es responsable,

directa o indirectamente de todo el trabajo realizado en los organismos
vivientes. El flujo de los electrones en el metabolismo es un proceso complejo,
los electrones se mueven a partir de varios metabolitos intermedios a
acarreadores de electrones especializados en las reacciones catalizadas por
enzimas. Las células contienen una variedad de transductores de energía, los
cuales convierten la energía del flujo de electrones en trabajo.
El transporte de electrones, es la fuente principal de energía para las
actividades celulares, libera grandes cantidades de energía libre, la mayor
parte de la cual se almacena en forma de ATP en la fosforilación oxidativa. (15)
A partir de la membrana interna mitocondrial pueden ser aislados cinco
complejos enzimáticos denominados I,II, III, IV y V. Los complejos I-IV
contienen parte de la cadena de transporte de electrones, mientras que el
complejo V cataliza la síntesis de ATP por lo que no es propiamente un
componente de la cadena de transporte de electrones.
Reacciones de la cadena de transporte de electrones
Con la excepción de la coenzima Q, todos los miembros de esta cadena son

proteínas. Estas proteínas pueden funcionar como enzimas como en el caso de
varias deshidrogenasas, pueden contener fierro como parte de su centro fierro-
azufre o pueden contener cobre, como en el caso de los citocromos a y a3.
NAD+ es reducido a NADH por deshidrogenasas las cuales remueven dos

átomos de Hidrógeno de su substrato. Ambos electrones pero sólo un protón
(ion hidruro: H-) son transferidos al NAD+, formando NADH mas un protón libre,
H+, el cual es liberado al medio. (14)
43
Estructura de la cadena de transporte de electrones.

La cadena se puede dividir en cuatro complejos: el complejo I o NADH
deshidrogenasa (que cede sus electrones a la coenzima Q); el complejo II o las
deshidrogenasas que ceden sus electrones al FADH2 (como la succinato
deshidrogenasa) y a través de él a la misma coenzima Q; el complejo III o
citocromo c reductasa, y el complejo IV o citocromo c oxidasa, que transfiere
los electrones al oxígeno, que es el aceptor final.
La energía liberada en el curso de la transferencia de hidrógeno y electrones a
través de la cadena respiratoria se utiliza para la formación de ATP por la
llamada fosforilación oxidativa.
44
PRACTICA No 8
ESTUDIO DEL BOMBEO DE PROTONES
POR LEVADURAS; EFECTO DE LOS INHIBIDORES
DE LA CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES Y DE LOS
DESACOPLANTES
OBJETIVOS:
Ø Que el alumno relacione el consumo de glucosa con los cambios de pH
producidos por las levaduras.
Ø Que el alumno describa las vías por las cuales la glucosa genera los
cambios de pH.
Ø Que el alumno interprete el efecto de los inhibidores y los desacoplantes
sobre la salida de protones.
GENERALIDADES:
En los organismos aerobios es esencial que las enzimas del ciclo de
Krebs estén asociadas con las del sistema de transporte de electrones. Es a
través de esta oxidación que los nucleótidos de la piridina (NADP y NAD) y el
FAD, reducidos en el ciclo de Krebs, son devueltos a su forma oxidada.
La energía cedida en estas oxidaciones es utilizada en la síntesis de ATP.
El sistema transportador de electrones esta constituido por una serie
secuencial de enzimas del grupo de los citocromos, capaces de pasarse
electrones de uno a otro. Los electrones, tomados por aceptores de hidrógeno
(NADP, NAD, FAD) a partir de los pasos oxidativos de la respiración, acaban
pasando al sistema trasportador de electrones, en donde van “descendiendo” a
lo largo de la cadena de los citocromos.
Es especialmente importante para la célula viva el hecho de que en cada paso

de este sistema, el nivel de energía del electrón disminuye, de manera que
la diferencia de energía pueda ser trasformada en energía de enlace fosfato
por conversión de ADP en ATP.
Durante la reoxidación de ubiquinona reducida (UQ) los iones hidrógeno pasan

al citoplasma; solo los electrones circulan a lo largo de una serie de las
45
enzimas citocrómicas. Para cada par de electrones que pasan por este
sistema, se forman 3 moléculas de ATP. La síntesis de ATP tiene lugar en la
oxidación del NADH, en la oxidación de dos citocromos b y en la oxidación de
dos citocromos a.
Cuando alcanzan su nivel de energía más bajo, los electrones son pasados al
oxígeno desde el citocromo a3 reducido, activando así el oxígeno. En este
estado, el oxígeno puede aceptar iones libres de hidrógeno para formar agua.
REACTIVOS:
- Suspensión celular de Saccharomyces cerevisiae en agua destilada (2g/10
mL). Pesar lo necesario para 30 mL.
-Solución de glucosa al 10%
-Solución de azida de sodio (NaN3) 500 mM.
MATERIAL:
-2 vasos de precipitados de 30 mL
-Potenciómetro y amortiguadores de referencia para calibrar.
-1 parrilla con agitador magnético.
-1 cronómetro
-Micropipetas de 200 y 1000.
-Puntas para micropipeta
-Piceta con agua destilada
-1 Balanza granataria
46
PROCEDIMIENTO:
(Pardo y Martínez, 2009)
Experimento Control: Actividad de la H+ -ATPasa

1.-Calibre el potenciómetro
2. Diluya 5.0 mL de la suspensión de levadura con 40 mL de agua destilada.
3. Mantenga la suspensión en agitación constante ayudándose de una parrilla
con agitador magnético (En caso de no contar con esto, realizar la agitación
manualmente con o sin la ayuda de una varilla de vidrio).
4. Mida el pH de la suspensión en tres ocasiones, con intervalos de 3 minutos,
hasta obtener un valor basal (tiempo “cero”).
5. Sin retirar el electrodo de la muestra, añada 5 mL de glucosa al 1% e inicie
de inmediato el conteo del tiempo, esperar 5 minutos y determinar el pH de la
solución cada 5 minutos cuatro veces, y luego cada 10 minutos dos veces más.
6. Anote sus observaciones
Experimento con dinitrofenol 40 mM/L.

4. Posteriormente añada 0.2 ml de una solución de dinitrofenol .
47
solución cada 5 minutos dos veces, y luego cada 10 minutos dos veces más.
6. Anote sus observaciones.
Experimento con azida de sodio 400 mM/L.

4. Posteriormente añada 0.5 ml de una solución de azida de sodio por las
paredes del vaso con mucho cuidado*.
solución cada 5 minutos dos veces , y luego cada 10 minutos dos veces más.
6. Anote sus observaciones.
*La azida de sodio es un inhibidor de la citocromo oxidasa, que bloquea la

cadena respiratoria mitocondrial entre los citocromos a y a3 (Rikhvanov et al.,
2002). Este compuesto debe manejarse utilizando guantes y con precaución
debido a que es un potente veneno. La mezcla de azida de sodio y agua
origina ácido hidrazoico, que en presencia de metales, como el cobre, forma
azidas metálicas, sumamente explosivas.
48
Figura 3.3 Vías que siguen los protones en la levadura.
HOJA DE RESULTADOS
1.- Haga una gráfica de cada uno de los experimentos; utilizar los valores de
las lecturas de pH contra tiempo.
2.- Analizar el significado de los cambios de pH en el experimento control con
dinitrofenol como desacoplante y con azida de sodio.
3.- Hacer una relación de las vías que producen estos cambios; tomar en
cuenta que las levaduras poseen una ATPasa de protones en la membrana
mitocondrial que se encarga de sintetizar ATP y que tienen otra ATPasa de
protones en la membrana plasmática cuya función es similar a la bomba de
Na+/K+ en las células de los mamíferos.
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
CONCLUSIONES
49
PREGUNTAS:
1.- ¿Cuál es el efecto de cada uno de las siguientes sustancias en el transporte

de electrones y producción de ATP? Se especifico acerca de cual reacción es
afectada.
a) Azida
b) Antimicina A
c) Amital
d) Rotenona
e) Dinitrofenol
f) Gramicidina A
g) Monóxido de carbono
2.- ¿Por qué se puede usar el dinitrofenol como un medicamento de dieta?

3.- Indica las especies moleculares en el interior de la membrana de la
mitocondria las cuales sirven como bombas de protones o canales.
4.- Escribe la primer reacción en la ruta de transporte de electrones la cual
envuelve NADH y CoQ. Indica los agentes de oxidación y reducción de la
reacción.
5.- ¿Por qué la producción de ATP requiere una membrana mitocondrial
intacta?
6.- ¿Cuáles son las fuentes de carbono que usa la levadura?
7.- ¿Cuáles son las vías metabólicas que catabolizan a los carbohidratos?
8.- ¿En qué consisten la glucólisis y la fosforilación oxidativa?
50
4. METABOLISMO DE LOS LÍPIDOS

Los lípidos biológicos constituyen un grupo químicamente diversos de
compuestos, cuya característica común y definitoria es su insolubilidad en
agua. Las funciones biológicas de los lípidos son igualmente diversas. En
muchos organismos las grasas y los aceites son las formas principales de
almacenamiento energético, mientras que los fosfolípidos y los esteroles
constituyen la mitad de la masa de las membranas biológicas.
Las grasas y aceites, utilizados casi universalmente como formas de

almacenamiento de energía en los organismos vivos, son compuestos muy
reducidos derivados de los ácidos grasos. Se describen 2 tipos de compuestos
que contienen ácidos grasos, los triacigliceroles y las ceras.
Las células obtienen energía a partir de los ácidos grasos, los cuales pueden
proceder de diversas fuentes: grasas de la dieta, grasas almacenadas en las
células en forma de gotitas de lípidos y grasas sintetizadas en un órgano y que
se exportan a otro. (16)
La degradación de los ácidos grasos es la degradación de los triglicéridos

porque es así como se almacenan. Implica 3 pasos diferentes:
• Movilización de triglicéridos.
• Introducción de los ácidos grasos en el orgánulo donde se degradarán
(sólo en la mitocondria).
• Degradación de la molécula de ácidos grasos (b-oxidación de los ácidos
grasos). (17)
Los ácidos grasos almacenados en los tejidos son utilizados por la célula para
la producción de energía en magnitudes que varían de tejido a tejido, así como
del nivel metabólico del organismo. Son los músculos, principalmente el
cardiaco y el esquelético, los que más dependen de los ácidos grasos como
fuente de energía.
La mayoría de los ácidos grasos que se oxidan en los tejidos provienen de los
triacilglicéridos del tejido adiposo desde donde son liberados por la acción de la
enzima triacilglicérido lipasa sensible a hormonas y transportados en la
circulación como complejos albúmina-ácidos grasos. Al llegar al hígado, el
51
ácido graso es activado en el citosol del hepatocito mediante la acción de la acil

coenzima A sintetasa (tiocinasa) con gasto de ATP; en esta reacción se
produce un acil coenzima A (acil CoA) y AMP. El proceso de oxidación del
ácido graso se realiza dentro de la mitocondria; sin embargo, su membrana es
impermeable a los ácidos grasos y derivados del acil CoA, por lo que se
requiere de un transportador: la molécula de carnitina es la encargada de llevar
al ácido graso al interior de la mitocondria. Una vez dentro de la mitocondria, el
acil CoA sufre una serie de cambios que permiten obtener un fragmento de dos
carbonos, la acetil CoA.
Los cambios preparan al acilo para quedar nuevamente activado y éstos
son realizados por: a) una deshidrogenasa que trabaja con FAD y transforma al
grupo acilo en uno enoilo (molécula con un doble enlace entre el carbono alfa y
beta); b) una hidratasa que elimina la doble ligadura y deja un hidroxilo en el
carbono beta. Esta molécula se llama beta-hidroxiaciI CoA; c) otra
deshidrogenasa específica, cuya coenzima es el NAD+, la cual transforma el
grupo hidroxilo de la posición beta en un grupo ceto; d) una tiolasa que toma
una coenzima A (HSCoA) para unirla al carbono que tiene la nueva función
cetona y romper entre el carbono beta y alfa y dejar una molécula de acetil
CoA.
Estas cuatro enzimas siguen trabajando con el acil CoA que en cada
vuelta pierde dos carbonos como acetil CoA. Al mismo tiempo, el FADH2 y el
NADH obtenido en cada vuelta de la β-oxidación generan 5 ATP en la cadena
respiratoria y las acetil CoA entran al ciclo de Krebs para ser totalmente
oxidadas con
la ganancia de 12 ATP netos por cada acetil CoA que entra al ciclo. Así
tenemos que, por ejemplo, un palmitato (16 C)
genera al oxidarse hasta CO2 y H2O, 131 ATP. Si consideramos el gasto de la
fase de activación del ácido graso, obtenemos una ganancia neta de 129 ATP,
figura 5.1.
52
Síntesis de ácidos grasos.
Cuando el requerimiento de energía en la célula ha sido satisfecho y

existen suficientes sustratos oxidables, procede su almacenamiento bajo la
forma de triacilglicéridos que constituyen la reserva de energía a largo plazo
más importante de las células y del organismo. El primer paso de este proceso
es la biosíntesis de los ácidos grasos, la cual se realiza en el citoplasma celular
a partir de la acetil coenzima A, el ATP y el NADPH proveniente del ciclo de las
pentosas y de otros sistemas generadores de poder reductor.
La biosíntesis de los ácidos grasos se inicia con la salida de la acetil
CoA desde la mitocondria en forma de citrato y su transformación en malonil
coenzima A mediante la fijación del CO2 por una sintetasa dependiente de
biotina que utiliza ATP. Tanto la acetil CoA como la malonil CoA se unen a un
complejo multienzimático llamado sintetasa de los ácidos grasos. Este
complejo está formado por un conjunto de proteínas enzimáticas dispuestas
alrededor de la proteína transportadora de acilos (PTA). En pasossucesivos
ocurre la condensación de la acetil y la malonil CoA con desprendimiento de
CO2 y el resto del acetoacetilo de cuatro carbonos es llevado por el brazo
central de la PTA a los sitios activos de las enzimas del complejo para
53
transformarlo, sucesivamente, en hidroxiacilo, enoilo y acilo saturado, mediante

el gasto de dos NADPH. El ciclo se repite al incorporar dos carbonos del
malonil CoA en cada vuelta, hasta que se completa el ácido palmítico, un ácido
graso saturado de 16 C
El citrato desempeña un papel muy importante en la síntesis de los ácidos
grasos ya que al salir al citoplasma se convierte en acetil coenzima A y
oxaloacetato. Este proceso alimenta con carbonos a la síntesis de los ácidos
grasos y aporta NADPH por la acción de la enzima málica sobre el sistema
oxaloacetato-malato-piruvato. Por otra parte, el citrato es un modulador positivo
de la malonil coenzima A sintetasa (también llamada acetil CoA carboxilasa),
que es la principal enzima reguladora de la síntesis de los ácidos grasos, figura
5.3
Figura 5.3 Síntesis de los ácidos grasos
54
Síntesis y degradación de triacilgliceroles.
Una vez formados los ácidos grasos procede la lipogénesis o síntesis de

los triacilglicéridos: dos ácidos grasos activados como acil coenzima A
reaccionan con una molécula del glicerol fosfato para formar el ácido
fosfatídico.
Esta última molécula es precursora de los triacilglicéridos y de los
fosfolípidos. Para sintetizar los primeros se hidroliza el fosfato, con producción
del diacilglicerol, el cual recibe enseguida otra molécula de acil coenzima A,
con la cual se completa el triacilglicérido. La mayoría de las enzimas
participantes en este proceso son aciltransferasas y tiocinasas.
En el organismo humano la acción de la insulina estimula todo el proceso de la
lipogénesis al favorecer la entrada de la glucosa a los adipocitos, el ciclo de las
pentosas, la descarboxilación del piruvato, la biosíntesis de los ácidos grasos y
la acumulación de los triacilglicéridos.
La hidrólisis de los triacilglicéridos en el tejido adiposo, llamada también
lipólisis, es estimulada a nivel de la triacilglicérido lipasa en una acción mediada
a través de AMPcíclico, por numerosas hormonas entre las cuales se cuentan:
la epinefrina, el glucagón, los glucocorticoides, la tiroxina y el ACTH; mientras
que es inhibida por la insulina y por la concentración de ácidos grasos libres.
La hidrólisis se completa por la acción de la diacilglicérido lipasa y la
monoacilglicérido lipasa que en conjunto liberan un glicerol y tres ácidos grasos
de cada triacilglicérido, figura 5.3
55
PRACTICA No. 9
RADICALES LIBRES (LIPOPEROXIDACION)
OBJETIVOS:
Ø Mediante la determinación de malondialdehído el alumno constatará el
efecto de los radicales libres en la peroxidación de los lípidos
(lipoperoxidación).
Ø El alumno revisará algunos de los mecanismos protectores contra los
radicales libres.
Ø El alumno destacará la importancia de los antioxidantes naturales del
organismo para protegerse de los radicales libres.
GENERALIDADES:
Los radicales libres son átomos o grupos de átomos que tienen un electrón(e-)
desapareado en capacidad de aparearse, por lo que son muy reactivos.
Una vez que el radical libre ha conseguido robar el electrón que necesita para
aparear su electrón libre, la molécula estable que se lo cede se convierte a su
vez en un radical libre, por quedar con un electrón desapareado, iniciándose
así una verdadera reacción en cadena que destruye nuestras células.(18)
Las reacciones químicas de los radicales libres se dan constantemente en las células de
nuestro cuerpo y son necesarias para la salud, pero el proceso debe ser controlado con
una adecuada protección antioxidante.

Todas las células están rodeadas por una membrana celular que las separa del medio
extracelular. La membrana celular contiene enzimas, canales, receptores y antígenos
que juegan papeles vitales en la interacción de la célula con otras células, hormonas y
otros agentes reguladores del líquido extracelular. (19)

El proceso de oxidación de los ácidos grasos se denomina lipoperoxidación. Se
trata de una reacción en cadena o autocatalítica, es decir que, una vez
comenzada, continúa desarrollándose por sí misma. Por lo tanto el proceso
consta de tres etapas: iniciación, propagación y terminación.
56
La etapa de iniciación se produce cuando la unión C-H de los PUFA(PUFA -

polyunsaturated fatty acid) sufre la abstracción del hidrógeno de la doble
ligadura (hidrógeno alílico) susceptible de ser abstraido por los radicales libres,
fundamentalmente el HO., lo que genera un radical lipídico. El inicio se expresa
en la siguiente reacción:
RH+ HO. R. + H2 O
donde RH = PUFA y R. = radical de ácido graso.
La fase siguiente, de propagación, comprende una etapa en la que el R. se

combina con el oxígeno formando un lipoperóxido (ROO.)
R. + O2 ROO.
Este peróxido puede retirar un nuevo hidrógeno de otro carbono molecular. De

esta manera, persiste el proceso autocatalítico que convierte el carbono del
ácido graso de los fosfolípidos de membrana en hidroperóxidos.
ROO.+ RH ROOH+ R.
La lipoperoxidación sigue propagándose de esta manera y llega a su termino
cuando dos ROOH reaccionan entre sí dando un tetróxido o cuando son
neutralizados por los antioxidantes.
La gran mayoría de los métodos de laboratorio determinan el daño por RL o

cuantifican el estrés oxidativo, dosando los productos oxidados de los PUFA.
Estos métodos incluyen el dosaje de malondialdehido, el estudio de dienes
conjugados y la medición de la energía lumínica (fotoemisión) que producen
las moléculas terminales de la lipoperoxidación. (20)
La peroxidación lipídica es una reacción en cadena que produce un

suministro continuo de radicales libres que inician la peroxidación posterior.
La peroxidación de los lípidos expuestos al oxígeno es la causa, no sólo

del deterioro de los alimentos (rancidez), sino que también ocasiona en tejidos
in vivo importantes consecuencias fisiológicas y/o patológicas (cáncer,
enfermedades inflamatorias, aterosclerosis, envejecimiento, etcétera).
57
Estos efectos deletéreos son iniciados por los radicales libres. Un

radical libre es cualquier especie química, molécula o átomo, portadora de uno
o más electrones desapareados (la nomenclatura química indica el carácter de
radical libre de una molécula con la colocación de un punto al final de la
fórmula química: R*).
Un electrón desapareado es aquel que ocupa un orbital atómico o

molecular por él mismo (sólo él está en ese orbital), en lugar de los dos
electrones que habitualmente ocupan un orbital. El electrón no apareado
confiere una alta reactividad química a los radicales libres que buscan con
avidez completar su par electrónico.
En la materia viva, los radicales libres se originan generalmente en la
captura de átomos de hidrógeno (electrón más protón) a expensas de
moléculas orgánicas próximas.
Los ácidos grasos poliinsaturados de los sistemas vivos son muy
vulnerables
a la peroxidación. La base de este proceso es que el doble enlace carbono-
carbono debilita la unión carbono-hidrógeno del átomo de carbono vecino y lo
vuelve susceptible a la abstracción de hidrógeno por radicales libres y crea un
nuevo radical orgánico:
Una vez producida la abstracción, las reacciones pueden tener lugar en

cualquier secuencia y muchos de los productos de degradación reactivos
pueden contribuir a una mayor oxidación.
El oxígeno se puede unir a los ácidos de los que se ha abstraído el
hidrógeno, formando radicales libres que pueden reaccionar entonces con otra
molécula de lípido, lo que conduce a la abstracción de hidrógeno de la segunda
molécula. Los productos de esta reacción son un hidroxiperóxido de lípido en la
primera molécula y un nuevo radical libre en la segunda molécula atacada:
58
Las moléculas de hidroperóxido de lípido se rompen y forman dialdehídos, el

más prominente de los cuales es el malondialdehído (MDA). Este producto
puede formar enlaces cruzados entre varios tipos de moléculas, enlaces
que conducen a toxicidad, mutagenicidad, ruptura de membranas y
modificación de enzimas. El MDA también se polimeriza consigo mismo y con
otros productos de degradación tisulares formando un pigmento insoluble, la
lipofuscina, que se acumula en algunos tejidos envejecidos.
Por otra parte, se ha comprobado que la hepatotoxicidad producida por
el tetracloruro de carbono, por el halotano, la isoniacida y la bleomicina tiene,
como uno de sus factores importantes, la lipoperoxidación.
La presente práctica tiene como objeto medir el nivel de MDA (uno de los
productos de los lipoperóxidos), el cual ha sido considerado desde hace varios
decenios como un marcador de la presencia de la lipoperoxidación en los
tejidos. Para ello se utilizará el peróxido de hidrógeno, el cual se descompone
fácilmente en dos radicales libres llamados hidroxilos que son altamente
reactivos:
H2O2 => 2 •OH
Los radicales hidroxilo pueden atacar a las moléculas de su alrededor y,

en el caso de las células, su blanco preferencial serán los ácidos grasos de la
membrana y producirán en ellos una peroxidación. El MDA puede ser
detectado mediante su conjunción con dos moléculas de ácido tiobarbitúrico
(TBA) el cual da una coloración rosada al medio de reacción.
59
El binomio MDA-TBA es soluble en solventes orgánicos y puede

detectarse mediante un espectrofotómetro a 532 nm
Para controlar los efectos potencialmente devastadores de la peroxidación

lipídica, tanto en los seres humanos como en la naturaleza, se usan los
antioxidantes. El galato de propilo, el butilato de hidroxianisol (BHA) y el butilato
de hidroxitolueno (BHT) son ejemplos de antioxidantes utilizados como aditivos
en los alimentos. La fórmula química del BHT y el mecanismo antioxidante de
este compuesto es el siguiente:
.
BHT-OH + R02. => BHT – O + RO2 H
60
El BHT cede un átomo de hidrógeno al radical peroxilo (o dioxilo) e

interfiere con la propagación de la lipoperoxidación. El BHT-0 es un radical
estable poco reactivo.
Los antioxidantes naturales (medios de defensa en el organismo
humano) pueden incluirse en uno de los grupos siguientes:
1. Constituyentes presentes en la dieta, como los carotenos y retinoides
(vitamina A), el ácido ascórbico (vitamina C), los alfa-tocoferoles (vitamina E) y
algunos minerales, entre los que destacan el selenio, el cinc, el cobre y el
manganeso.
2. Proteínas y péptidos, como el glutatión (GSH), la ceruloplasmina, la ferritina
y la transferrina.
3. Enzimas, como la superóxido dismutasa, la glutatión peroxidasa, la glutatión
reductasa y la catalasa.
4. Ácido úrico.
MATERIAL Y REACTIVOS:
- 8 tubos de ensayo de 13 x 100 marca pirex o kimax
- 4 Pipetas graduadas de 1 ml
- 4 Pipetas graduadas de 5 ml
- 1 Pipeta Pasteur con bulbo
- 8 tapones de hule
- 1 mortero con pistilo
- 1 tripie
- 1 tela de asbesto
- 1 mechero Bunsen
-1 vaso de precipitado de 250 ml
-1 vaso de precipitado de 100 ml
BIOLÓGICO:
- Homogeneizado de hígado de pollo
REACTIVOS:
- Ácido tiobarbitúrico a 0.8% (TBA)
- Cloruro de potasio al 2%
61
- Ácido acético al 20%, pH 3.5

- Amortiguador tris 150 mM pH 7.4
- Butanol
- Butilato de hidroxitolueno BHT (antioxidante) 88 mg/ 10 ml de etanol
- Gotero con H2O2
EQUIPO:
- Centrífuga clínica
- Fotocolorímetro con filtro verde
PROCEDIMIENTO:
1. Homogeneizar aproximadamente 1 gr. de hígado de pollo en 9 ml de agua
destilada.
2. Filtrar el homogeneizado con una gasa.
3. Preparar la serie de tubos, como se indica en la tabla
Tubo 1 2 3 4
Homogeneizado 0.0 0.5 0.5 0.5
Amortiguador 2 1.5 1.4 1.3
Antioxidante -- -- -- 2 gotas
H 2O 2 -- -- 2 gotas 2 gotas
Preparación de los tubos (volumen en ml). Agitar y esperar 10 minutos.
4. Detener la reacción con 1.5 ml de ácido acético en cada uno de los tubos.
Agitar y agregar 1.5 ml de ácido tiobarbitúrico.
5. Tapar los tubos con canicas e incubar en baño María a ebullición durante 30
minutos.
6. Sacar los tubos y enfriar en el chorro de agua. Agregar 1 ml de KCI a 2% y
agitar. Observar la coloración y determinar cualitativamente la producción de
MDA.
7. En caso de que la coloración de la solución en los tubos no sea
suficientemente evidente para apreciar la diferente cantidad de MDA en cada
uno de ellos, continuar con el paso siguiente, el cual consiste en solubilizar en
62
butanol el binomio MDA-TBA (color rosado) para detectarlo

fotocolorimétricamente
8. Añadir 5 ml de butanol a cada uno de los tubos, tapar y agitar fuertemente;
por lo menos, durante un minuto.
9. Centrifugar 5 minutos a 3 000 rpm. Pasar a otro tubo la fase superior (color
rosa) con la ayuda de una pipeta Pasteur.
10. Leer la fase superior en el fotocolorímetro con filtro verde.
RESULTADOS Y OBSERVACIONES
CONCLUSIONES:
PREGUNTAS:
1.- ¿Qué es la lipoperoxidación?
2.- ¿Qué es un radical libre?
3.- ¿En dónde pueden encontrarse los antioxidantes naturales?
4.- La oxidación de ácidos grasos insaturados requiere exactamente el mismo

grupo de enzimas que la oxidación de ácidos grasos saturados. ¿Es esta
declaración es falsa o verdadera, porque?
5.- ¿Qué otras biomoléculas son afectadas por la formación de radicales libres
a nivel intracelular?
6.- ¿Cuál es la importancia de la lipoperoxidación en los sistemas biológicos?
63
PRÁCTICA No. 10
CONVERSIÓN DE LÍPIDOS A CARBOHIDRATOS
OBJETIVO:
Demostrar que en los vegetales se puede dar la conversión de lípidos a
carbohidratos.
GENERALIDADES:
Las plantas y algunas bacterias pueden usar la Acetil-ScoA derivada del
catabolismo de los lípidos (o de cualquiera otra sustancia) no sólo como fuente
de energía, sino también como fuente de carbono para la formación de casi
todas las otras clases de compuestos.
Los animales tienen casi la misma versatilidad, aunque son particularmente

ineficaces al usar el carbono lipídico para la formación de carbohidratos. Esto
se debe a que las plantas y las bacterias sintetizan dos enzimas auxiliares,
isocitritasa (o liasa del isocitrato) y cintaza del malato, pero ninguna de ellas se
forma en los animales. Junto con otras enzimas del ciclo de ácido. En las
semillas oleaginosas, el ciclo del glioxilato ocurre en un organelo aparte, el
glioxisoma. El resultado del ciclo del glioxilato es:
2 acetil-ScoA + fp + 2 NAD+ + 3 H2O ---à oxaloacetato + 2 CoASH + fpH2 + 2 NADH
La vía del glioxilato facilita el consumo de dos moléculas de acetil-ScoA; una

por condensación con oxaloacetato y otra por condensación con glioxilato. Esta
entrada no sólo genera intermediarios utilizables en la biosíntesis de
aminoácidos, sino que además da por resultado la producción neta de
oxaloacetato (OAA). De este modo, si se elimina uno de los intermediarios
previos al OAA, el ciclo del glioxilato tiene una reacción anapletórica intrínseca.
Además, el propio OAA puede convertirse ya sea en aminoácidos o en
carbohidratos.
64
- 2 Pipetas de 10 ml
- 2 Pipetas de 5 ml
- 1 Pipeta de 1 ml
- 2 Vasos de precipitados de 50 ml
- 10 Tubos de ensaye
- 4 Frascos de boca ancha
- 1 Bandeja
- Papel filtro
- Papel aluminio
- Gasa
- Semillas de ajonjolí y de soya
REACTIVOS:
- Mezcla cloroformo-metanol 2:1
- Fenol al 5%
- H2SO4 concentrado
- Solución amortiguadora de fosfatos 0.1M, pH 7.5, 3 mM de MgCl2
- Reactivo de Biuret
- Solución patrón de glucosa 100 μg /ml
- Solución patrón de caseína 20 mg/mI
- Solución de NaCl al 1%
- Sol. de hipoclorito de sodio al 1%
- Sulfato de sodio anhidro
EQUIPO:
- Estufa a temperatura constante 30° C y 28° C
PROCEDIMIENTO:
I.- Germinación de las Semillas.
65
Soya:
1. Pesar 3 lotes de semillas de soya de 2.5 g cada uno.
2. Lavar las semillas con 25 ml de solución de hipoclorito de sodio al 1% y
enjuagarlas con agua hervida y fría hasta que ya no huelan a cloro.
3. Colocar cada lote de semillas en un frasco de boca ancha y taparlo con gasa
detenida por una liga.
4. En una bandeja con un poco de agua colocar los dos frascos boca abajo a
manera de que las semillas estén en contacto con el agua.
5. Tapar los frascos con papel aluminio y guardar los lotes sobre la charola
durante 4 días a 30° C.
6. El día que se realizará la sesión experimental pesar otros 3 lotes de semillas
de 2.5 g cada uno, estos serán los controles (semillas sin germinar).
Ajonjolí:
1. Pesar 3 lotes de semillas de ajonjolí de 0.5 g cada uno.
2. Lavar las semillas con 25 ml de solución de hipoclorito de sodio y
enjuagarlas con agua previamente hervida y fría hasta que ya no huelan a
cloro.
3. Colocar cada lote de semillas en un frasco estéril de boca ancha cubierto
con papel aluminio, que contiene un disco de papel filtro humedecido.
4. Ponerlos en la estufa a 28° C durante 4 días
5. El día que se realizará la sesión experimental pesar otros 3 lotes de semillas
de 0.5 g cada uno, estos serán los controles (semillas sin germinar).8
II.-Preparación de los Extractos y Determinación de Biomoléculas

Antes de preparar los extractos secar con papel absorbente cada uno de los
lotes germinados de semillas, que se vayan a utilizar.
a) Proteínas
1. Homogenizar en un mortero, por separado y en frío, 2 lotes de semillas (1
lote sin germinar y 1 lote germinado) con 10 ml de solución amortiguadora de
fosfatos pH 7.5, MgCl2 3mM.
2. Centrifugar a 15000 rpm durante 15 minutos. Si es necesario, filtrar los
sobrenadantes a través de varias capas de papel filtro, a que los filtrados
salgan claros. Guardar los extractos en frío mientras se utilizan.
66
Determinación de Proteínas
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9
(ml)
Solución 0.25 0.5 0.75 1.0 ---- ---- ---- ---- ----
Patrón de
caseína
Extracto ---- ---- ---- ---- 1.0 ---- ---- ---- ----
enzimático
sin
germinar
Extracto ---- ---- ---- ---- ---- 1.0 ---- ---- ----
enzimático
germinado
Extracto ---- ---- ---- ---- ---- ---- 1.0 ---- ----
enzimático
sin
germinar
diluido
1:10
Extracto ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- 1.0 ----
enzimático
germinado
diluido
1:10
Cloruro de 5.75 5.5 5.25 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 6.0
sodio 1%
Reactivo 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
de Biuret
El tubo Número 9 corresponde al blanco. Después de 30 minutos leer a 540

nm.
NOTA: Se recomienda centrifugar el tubo número 6 en caso de que se note

turbia la solución.16
b) Carbohidratos
1.Homogenizar en un mortero, por separado y en frío, 2 lotes de semillas (1

lote sin germinar y 1 lote germinado) con 10 ml de etanol al 75% frío.
2. Filtrar los homogenizados, centrifugar a 15000 rpm durante 15 min.
67
Si es necesario, filtrar los sobrenadantes para que queden claros.
3. Guardar los extractos en frío mientras se utilizan.
4. Preparar tubos con los reactivos que se indican en la siguiente tabla:
Tubos (ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Sol. Patrón 0.0 0. 0. 0. 0. --- --- --- --- ---

5 1 2 3 4 - - - - -
de glucosa
Agua 0.9 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 1.
5 9 8 7 6 9 9 9 9 0
destilada
Ext.Enz. sin ---- --- --- --- --- 0. --- --- --- ---
germinar1:20 - - - - 1 - - - -
Ext.Enz. ---- --- --- --- --- --- 0. --- --- ---
germinado1:2 - - - - - 1 - - -
0
Ext.Enz. sin ---- --- --- --- --- --- --- 0. --- ---
germinar - - - - - - 1 - -
diluido 1:50
Ext.Enz. ---- --- --- --- --- --- --- --- 0. ---
germinado - - - - - - - 1 -
diluido 1:50
5. Agitar todos los tubos en el vortéx. Los siguientes pasos se realizan en la

campana de extracción.
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Fenol 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
5%(ml)
6. Agitar todos los tubos en el vortéx.
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Ac. 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8
sulfurico
conc.
68
7. Agitar los tubos en el vortéx con cuidado pues la reacción es exotérmica y la

temperatura puede aumentar hasta 110°C.
8. Colocar los tubos en un baño de hielo y dejar hasta que se enfríen. Leer a
485 nm en el colorímetro. El tubo 10 corresponde al blanco.8
c) Lípidos
1. Lavar y secar perfectamente dos vasos de precipitado de 50 ml, pesarlos y
rotularlos.
- Vaso 1:Lípidos de semillas germinadas.
- Vaso 2:Lípidos de semillas sin germinar.
2. Tomar los dos lotes de semillas restantes (uno sin germinar y otro
germinado) y pasar cada grupo de semillas por separado a un mortero para
macerarlas con 10 ml de solución de cloroformo-metanol fría. (Evitar que las
semillas germinadas lleven agua).
3. Separar el sobrenadante pasándolo a un tubo para centrífuga y rotúlelo.
4. Volver a homogenizar las semillas con 5 ml de cloroformo-metanol y pasar el
sobrenadante a su respectivo tubo de centrífuga.
5. Centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos.
6. Si se observa agua en el sobrenadante, agregar una cantidad conocida de
sulfato de sodio anhidro.
7. Pasar los sobrenadantes a sus respectivos vasos y eliminar los solventes
mediante calentamiento en baño maria y pesar los vasos.
8. Por diferencia de pesos entre los vasos vacíos y los vasos con los lípidos
después de eliminar los solventes, calcular la cantidad de lípidos en cada lote
de semillas (si uso sulfato de sodio, descuente su peso del peso final de su
vaso).
Hoja de trabajo
1.-Observe los resultados obtenidos y compare los lotes de semillas
germinadas contra los obtenidos en los lotes de semillas sin germinar.
69
Lotes de Proteínas Carbohidratos Lípidos

semillas (% p/p) (% p/p) (% p/p)
Germinadas
Sin germinar
2.- Compare los resultados con los obtenidos por sus compañeros.
3. Utilizando los resultados obtenidos y los datos siguientes proporcionados en
la tabla, identifique el tipo de vías metabólicas activas durante la germinación
de las semillas utilizadas en esta prácticas.
Tiempo de germinación 0 4
(días)
Condición de germinación - Oxalato + Oxalato
Enzima μg de producto/min/mg de proteína
α-cetoglut-deshidrogenasa 25 25 60
Malato sintasa 10 120 18
Malico deshidrogenasa 25 50 50
Trans GP* 35 60 150
PEPcinasa* 8 75 75
* Transaminasa glutámico pirúvica ** Fosfoenolpiruvato cinasa
CONCLUSIONES
70
PREGUNTAS:
1.-¿Es posible convertir ácidos grasos a otros lípidos sin intermediarios de acil-
CoA?
2.-¿Cómo se regula el ciclo del glioxilato?
3.-¿Cómo los animales pueden obtener carbohidratos a partir de compuestos

que no son carbohidratos?
4.-Explica como una dieta baja en carbohidratos y grasas ayuda a reducir la

grasa del cuerpo
5.- ¿En que organismos se lleva a cabo el ciclo del glioxilato?
6.- ¿Qué permite utilizar a las plantas y a los microorganismos dicho ciclo?
7.- ¿Cuáles son las dos enzimas características del ciclo del glioxilato.
71
5. METABOLISMO DE AMINOÁCIDOS Y NUCLEÓTIDOS
Los aminoácidos (aa) son moléculas orgánicas pequeñas con un grupo amino
(NH2) y un grupo carboxilo (COOH). La gran cantidad de proteínas que se
conocen están formadas únicamente por 20 aa diferentes. Se conocen otros
150 que no forman parte de las proteínas. (21)
Son importantes para el organismo, pues constituyen el sustrato para la

síntesis proteica, e igualmente para la síntesis de neurotransmisores en el
sistema nervioso central. (22) Todos los aminoácidos tiene la misma fórmula
general: (21)
Los aminoácidos participan en la liberación de insulina, hormona del

crecimiento, glucagón y de colecistoquinina. Esta última hormona favorece la
contracción de la vesícula biliar, y a nivel cerebral interviene en el control de la
ingesta de alimentos (hormona de la saciedad). Igualmente, los aminoácidos
favorecen la reducción del colesterol plasmático, y tienen funciones anabólicas
en tejidos periféricos. (22)
Los nucleótidos purínicos y pirimidínicos son metabolitos extremadamente

importantes que participan en muchas funciones celulares. Estas funciones
comprenden su actuación como precursores de los ácidos nucleicos, como
almacenes de energía, afectores, agentes de transferencia de grupos, así
como mediadores de la acción hormonal y neurotransmisora. Sus principales
funciones son:
72
1. Papel en el metabolismo energético: El ATP se genera en las células

mediante la fosforilación oxidativa y la fosforilación a nivel de sustrato.
2. Unidades monoméricas de los ácidos nucleicos: los ácidos nucleicos, DNA y

RNA, están compuestos por unidades monoméricas de los nucleótidos.
Mediadores fisiológicos: otras funciones de los nucleótidos son aquellas en las
que actúan como mediadores de procesos metabólicos clave.
3. Componentes de coenzimas: Coenzimas tales como el NAD, FAD y

coenzima A son constituyentes metabólicos importantes de las células que
están implicados en muchas rutas metabólicas.
4. 6. Efectores alostéricos: Muchos de los pasos regulados en las vías

metabólicas están controlados por las concentraciones intracelulares de
nucleótidos. (23)
73
PRÁCTICA No. 11
TRANSAMINACIÓN
OBJETIVO:
Obtener un extracto crudo de piruvicotransaminasa a partir de un producto
vegetal para medir la actividad de transaminación de la enzima por colorimetría
y determinar sus parámetros cinéticos.
FUNDAMENTO:
Una reacción de transaminación es la primera etapa de la desasimilación de los
aminoácidos, y sirve para encauzar los grupos amino hacia el α-cetoglutarato,
para transformarlo en glutamato que posteriormente será sometido a una
reacción de desaminación oxidativa, catalizada por la glutamato
deshidrogenasa, formándose un ión amonio que será utilizado para generar
urea.
aminoácido (1) + α-cetoácido (1) <==> α-cetoácido (2) + aminoácido (2) (24)
La primera es la reacción entre un aminoácido y un alfa-cetoácido, en la que el

grupo amino es transferido de aquel a éste, con la consiguiente conversión del
aminoácido en su correspondiente alfa-cetoácido.
Después de la formación de glutamato, éste transfiere su grupo amino

directamente a una variedad de alfa-cetoácidos por varias reacciones
reversibles de transaminación: donación libremente reversible de un grupo
amino alfa de un aminoácido al grupo ceto alfa de un alfa-cetoácido,
acompañado de la formación de un nuevo aminoácido y un nuevo alfa-
cetoácido. (25)
74
Todas las transaminasas utilizan el mismo grupo prostético, el piridoxal fosfato

(una forma coenzimática de la vitamina B6), que es transportador temporal del
grupo amino. El piridoxal fosfato se enlaza covalentemente con el grupo amino
ε de un residuo de lisina, en ausencia de sustrato (el aminoácido). (24)
- 1 Anillo de hierro
- 1 Bisturí
- 1Pipeta Pasteur
- 2 Cristalizadores
- 2 Pipetas de 1 ml
- 2 Pipetas de 5 ml
- 1 Pipeta de 10 ml
- 1 Probeta graduada de 50 ml
- 1 Termómetro -10 a 200° C
- 10 Tubos de ensaye
- 2 Vasos de precipitados de 250 ml
- Tela de asbesto
- Soporte universal
- Botella lavadora de 500 ml
- Bulbo 1 ml para pipeta Pasteur
- Embudo de vidrio de talle largo
- Gasa 4 cuadros de 10 x 10 cm
- Gradilla
- Hielo
- Mechero Bunsen
- Mortero con pistilo
- Chícharos frescos 10 g
REACTIVOS:
- Solución ácida de 2,4-dinitrofenilhidrazina 1.5 mM
75
- Solución amortiguadora de TRIS-HCl 40 mM, EDTA 0.25 mM pH 7.5

- Solución de NaOH 1 N
- Solución patrón de ácido pirúvico 2 mM
-Substrato: L-alanina 0.1 mM alfa-cetoglutarato 0.1 mM, Tris - HCl 0.1 M, pH
7.5
EQUIPO:
- Colorímetro
- Celdas de 1 cm
- Parrilla de agitación
PROCEDIMIENTO:
A) Obtención de extracto crudo de enzima
1. Coloque el tubo para homogeneizado o el mortero en una cama de hielo.
Coloque dos tubos de ensaye en la cama de hielo.
2. Con el bisturí pique finamente los chícharos y coloque el picado en el tubo
para homogeneizado o en el mortero.
3. Agregue 20 ml de la solución TRIS-HCl 40 mM pH 7.5. Homogenice el
picado manteniendo el tubo dentro del baño de hielo.
4. Coloque el embudo dentro de un tubo de ensayo de la cama de hielo,
coloque 4 capas de gasa sobre el embudo y filtre el homogeneizado a través
de las 4 capas de gasa.
5. Vierta el filtrado en un tubo de centrífuga y centrifugue a 3500 rpm durante 5
minutos.
6. Vierta el sobrenadante en un tubo de ensayo frío, mantenga el tubo de
ensayo en un baño de hielo.
B) Cinética de la transaminación
1. En un vaso de precipitados de 250 ml prepare un baño a 37° C.
2. Arme el soporte universal con el anillo de hierro y la rejilla de asbesto, ponga
a hervir agua destilada en un vaso de precipitados de 250 ml.
3. Tome 8 tubos de ensayo, etiquete los tubos del 1 al 8, en el tubo No. 8
agregue 1 ml de substrato, 0.2 ml de extracto y hierva el tubo a baño maria
durante 5 min.
76
4. En los tubos del 1 al 7 agregue los reactivos en el orden de la siguiente

tabla.
Volumen ml
Tubo Sustrato Tris-HCl
Extracto
1 0.00 1.00 0.2
2 0.05 0.95 0.2
3 0.10 0.90 0.2
4 0.20 0.80 0.2
5 0.40 0.60 0.2
6 0.80 0.20 0.2
7 1.00 0.00 0.2
5. Incube los 8 tubos 30 minutos a 37° C. Detenga la reacción colocando los

tubos en un baño de hielo
C) Curva de calibración y medición de actividad enzimática

1. Tome 6 tubos de ensayo y etiquete los tubos del 1 al 6.
2. En los tubos del 1 al 6 agregue los reactivos en el orden de la siguiente tabla
(Curva de calibración).
Volumen ml
Tubo Agua Patrón Sustrato
1 0.2 0.0 1.0
2 0.2 0.1 0.9
3 0.2 0.2 0.8
4 0.2 0.4 0.6
5 0.2 0.8 0.2
6 0.2 1.0 0.0
77
3. Adicione a los 14 tubos 1 ml de 2,4 dinitrofenilhidrazina 1.5 mM .

4. Agite vigorosamente los tubos para obtener una mezcla homogénea e
incube a temperatura ambiente durante 20 minutos.
5. Agregue a cada tubo 5 ml de solución de hidróxido de sodio 1 N, agite
vigorosamente cada tubo.
6. Incube a temperatura ambiente durante 5 min.
7. Calibre a 505 nm el colorímetro a 0 de absorbancia con el tubo 1 de la curva
de calibración. Lea la absorbancia a 505 nm de cada tubo.
HOJA DE TRABAJO
1.- Grafique la curva de calibración de A vs [ác. Pirúvico].
2.- Calcule la concentración de ácido pirúvico obtenido con cada concentración
de sustrato.
3.- Calcule la velocidad inicial de la reacción enzimática:
v = micromoles de ácido pirúvico/min y las unidades internacionales por
mililitro:
u.i. = micromoles/ml min
4.- Elabore la gráfica de Michaelis de [substrato] vs [ác. Pirúvico]
(micromoles/min).
5.- Calcule la Km y la Vmáx de la enzima.
6.- Interprete el significado de los valores de Km y de Vmáx.
7.- Explique el resultado obtenido en el tubo No. 8 de la cinética.
CONCLUSIONES
78
PREGUNTAS:
1.-¿Qué es la transaminación?
2.-¿Cuál es su importancia?
3.- Nombra los α-cetoácidos que se forman por transaminación de cada uno de
los siguientes aminoácidos:
a) Alanina d) Leucina
b) Aspartato e) Fenilalanina
c) Glutamato f) Tirosina
4.- Escriba la ecuación equilibrada para la conversión de aspartato en glucosa,

vía oxalacetato. Citar los coenzimas que participan en estas etapas.
5.- Escribir la ecuación equilibrada para la conversión de aspartato en

oxalacetato, vía fumarato.
6.- Proponga una función para el nitrógeno guanidínico, cargado positivamente,

durante la escisión del arginino-succinato en arginina y fumarato.
79

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UNIVERSIDAD VERACRUZANA

UNIDAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

“MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO”

M. EN C. LAURA CECILIA GONZÁLEZ SÁNCHEZ

IV. Normas Generales del Laboratorio.

VI. Manual de Prácticas del Laboratorio de Bioquímica Metabólica.

Práctica N° 1 Determinación de azúcares reductores

3. Cadena Transportadora de Electrones

4. Metabolismo de los Lípidos

5. Metabolismo de los Aminoácidos y Nucleótidos

La Bioquímica es la Ciencia que estudia los constituyentes químicos de los

Ser un material de apoyo para la experiencia educativa, que permita al alumno

experimentación, siendo esto el motivo primordial que plantea la necesidad de

Desde esta perspectiva, consideramos la necesidad de aplicar esta

I. Normas Generales del

NORMAS GENERALES DEL LABORATORIO

Se pretende que el alumno tome contacto con el laboratorio, para lo cual

A) NORMAS GENERALES DE COMPORTAMIENTO:

1. El alumno tiene la obligación de leer y estudiar con anticipación las

1. En el laboratorio está PROHIBIDO comer, beber o fumar.

3. En caso de introducción de alguna sustancia o disolución extraña en los

C) NORMAS GENERALES PARA LA REALIZACIÓN DE LAS PRÁCTICAS:

1. Antes de comenzar la práctica deberá revisar que dispone de todo el

4. Se deben de anotar en el cuaderno de prácticas las disoluciones

NOTA: SE RECUERDA QUE PARA SUPERAR LA ASIGNATURA ES

RESIDUOS BIOLOGICO-INFECCIOSOS (RPBI)

El laboratorio de bioquímica metabólica será generador de RPBI en algunas

• Los residuos no anatómicos como recipientes desechables que

• Los objetos punzocortantes que han estado en contacto con humanos o

Los RPBI se deben separar y envasar de conformidad con sus características

No se consideran residuos peligrosos biológicos infecciosos los siguientes:

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El metabolismo de los carbohidratos complejos, empieza en la boca, cuando la

La glucosa pasa al torrente sanguíneo, y es oxidada en las células

Los niveles de glucosa también se pueden aumentar mediante síntesis

Figura 1.1 Principales vías del metabolismo de glucosa en plantas y animales.3

La glucólisis es la vía metabólica por la que se degrada la glucosa;

La glucólisis puede dividirse en dos fases: una de activación y una oxidativa. La

Las reacciones de la glucólisis ocurren en el citoplasma y no están ligadas a

DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES

Los glúcidos monosacáridos (azúcares) según tengan el grupo funcional

Las estructuras abiertas y cerradas son convertibles entre sí y existe un

pierde esta función por desaparecer el OH del carbono anomérico de la

Los monosacáridos más comunes son la glucosa, la fructosa, la galactosa y la

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1. Depositar a cada tubo 2.5 ml del reactivo de Benedict

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-¿Porque es necesario el citrato de sodio en el reactivo de Benedict?

FERMENTACIÓN DE GLUCOSA POR LEVADURAS

3.- Para verificar que la levadura no contiene la presencia de ningún azúcar

2. Muestra fermentada: reacción de Benedict negativa (azul).

2.-¿Cuáles son los productos finales de la glucólisis en ausencia y presencia de

3.-¿Cuántos ATP son sintetizados en la glucólisis?

4.-¿En dónde se lleva a cabo la glucólisis?

5.- ¿Qué es la fermentación?

El proceso principal mediante el cual se transforma el mosto de uva en vino, se

Desde el punto de vista energético la fermentación alcohólica es una reacción

El proceso de fermentación lo realizan las levaduras adheridas al hollejo de la

El final del proceso de fermentación es cuando ya se han "desdoblado" casi

- 1Probeta graduada de 250 ml

Tabla 1.3 Concentración de sacarosa adicionada.

• Mida la gravedad específica y el valor de PA para cada uno de los