Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa

2014/2015

Bioquímica II

Sebenta Beta

Elisa Reis
1
 Prefácio
Caros colegas,
Devido ao sucesso que teve a sebenta de Imunologia dentro do ano 2013/2018, aqui têm a vossa
próxima ajuda para Bioquímica II. Não se habituem mal! Mais uma vez peço-vos que sejam
críticos em relação ao que estão a ler, torna-se meio caminho andado para entenderem melhor
a matéria.

A sebenta foi feita tendo em conta as sebentas já existentes e a tão útil Wikipédia. O meu
conselho é complementarem esta sebenta com os slides e com vídeos do youtube (acreditem,
ajuda imenso).

Das poucas falhas que eu posso encontrar é a parte final da matéria estar um bocado
incompleta, sintam-se livres de pegar nisto com tempo e completar. Estou-me a referir às aulas
do “Desenvolvimento do Sistema Nervoso” e da “Diferenciação celular”, vejam os slides disto
mesmo.

Por último, peço desculpa por qualquer erro ortográfico ou gramatical cometido. Votos de um
bom exame!

“Dos fracos não reza a história” - Saudações leoninas,

Elisa Reis

2
 Índice
Índice
Visão geral dos processos da genética molecular ......................................................................... 4
Estrutura dos Ácidos Nucleicos ..................................................................................................... 4
O DNA e a sua dupla hélice ........................................................................................................... 5
Organização do material genético ................................................................................................ 6
DNA: Replicação .......................................................................................................................... 13
DNA: Transcrição ......................................................................................................................... 20
DNA: Tradução ............................................................................................................................ 34
miRNA: a sua importância ........................................................................................................... 42
Direccionamento e Degradação de Proteínas............................................................................. 48
Transporte Biológico ................................................................................................................... 59
Sinalização Celular ....................................................................................................................... 67
Bases Bioquímicas duma Célula Nervosa .................................................................................... 83
Degenerescência e Morte Celular ............................................................................................... 90

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 Bioquímica dos Ácidos Nucleicos
Visão geral dos processos da genética molecular

Os ácidos nucleicos são moléculas vitais responsáveis pela função celular. Estes, no geral, são
polímeros de nucleótidos. Estas macromoléculas contêm a informação para determinar a
sequência de aminoácidos e a função da proteína que se irá formar. Catalisam um número
fundamental de várias reações químicas nas células, incluindo a regulação da expressão dos
genes.

O DNA é uma molécula que contém a informação necessária para a produção de todas as
proteínas do organismo. Porções da sequência nucleotídica são copiadas em moléculas RNA
mensageiro (RNAm) que são diretamente sintetizadas numa proteína específica. Esta síntese
baseia-se em dois processos: transcrição e tradução da informação genética inicial contida no
DNA. A molécula de RNAm é lida por uma nova molécula de RNA, o RNA transferência – RNAt.
Este processo contém a ajuda do RNA ribossomal – RNAr – que promove a associação de vários
componentes.

Estrutura dos Ácidos Nucleicos

Os ácidos nucleicos são polímeros de unidades complexas chamadas nucleotidos. Cada
nucleotido é um agrupamento molecular formado por três subunidades: uma base azotada, um
açúcar com cinco átomos de carbono e um grupo fosfato. As bases azotadas classificam-se em
dois grupos: as bases púricas, cujo componente central da molécula possui dois anéis, e as bases

4
pirimídicas, que contêm apenas um anel
central. As bases púricas são a adenina e
a guanina. A citosina, a timina e a uracila
(ou uracil) são as bases pirimídicas.
Destas bases, 3 são encontradas tanto no
DNA como no RNA (A,C e G), a T apenas é
encontrada no DNA e a U é encontrada
no RNA. Outra diferença entre o DNA e o
RNA baseia-se no açúcar, o DNA contém
uma desoxirribose e o RNA uma ribose
(contém mais um oxigénio do que o
açúcar do DNA). A acidez dos nucleótidos
deve-se ao grupo fosfato que, nas
condições intracelulares normais, liberta
o ião H+, deixando o fosfato carregado
negativamente.

A estrutura química destes nucleótidos

mostra um grupo hidroxilo na terminação
3’ e um grupo fosfato na terminação 5’. A
ligação química entre nucleótidos
adjacentes é chamada de ligação fosfodiéster.

O DNA e a sua dupla hélice

O modelo de Watson e Crick propunha que o DNA era constituido em duas cadeias
polinucleotidicas que se enrolam formando uma dupla hélice. Os esqueletos de açúcar-fosfato
encontra-se virado para fora e as bases projectadas para dentro. A orientação destas cadeias é
antiparalela, ou seja, a sua direcção 5’-3’ é oposta. As cadeias são unidas devido à sua
complementaridade de bases, isto é, a A liga-se à T com duas ligações de hidrogénio e a base G
é emparelhada com a C através de 3 ligações de hidrogénio. Ligações hidrofóbicas e interacções
van der Waals entre as bases adjacentes estabilizam a estrutura da dupla hélice.

Regra de Chargaff

A composição em bases do DNA é sempre igual independentemente da idade, estado de

nutrição ou mudanças ambientais. Erwin Chargaff chegou à conclusão que a quantidade de
Adenina é igual à de Timina e a de Guanina é igual à de Citosina.

5
Organização do material genético
O DNA celular contém tanto genes codificantes como regiões não codificantes. Genomas
complexos exigem uma maior complexidade na organização cromossómica.

Um gene é definido como uma porção do cromossoma que determina um único carácter ou
fenótipo. O DNA contém outros segmentos que apresentam funções reguladoras, estas podem
fornecer informações que influenciam a transcrição dos genes.

Geral
O termo “cromossoma” é usado para se referir à molécula do ácido nucleico onde está
depositada a informação genética. Os cromossomas aparecem durante a divisão mitótica,
quando a célula não se está a
dividir, o material genético,
chamado de cromatina, não se
encontra condensado.
Portanto, à medida que as
células se preparam para dividir,
a cromatina condensa-se e
organiza-se num número bem
definido de cromossomas.

A cromatina consiste em fibras

de proteínas e DNA. O DNA na
cromatina está fortemente
associado a histonas, que
empacotam e ordenam o DNA
em unidades estruturais,
chamadas de nucleossomas.

As histonas são proteínas que se associam ao DNA eucariótico. São ricas em aminoácidos básico
que lhes confere carga positiva, estas contactam com os grupos fosfato carregados
negativamente do DNA.

Quando a cromatina é extraída do núcleo e examinada ao microscópio electrónico, a sua

aparência depende da concentração de soluto a que é exposta. A baixas concentrações de Mg2+,
a cromatina encontra-se estendida como se fosse um “colar de contas” (imaginem que as contas
são os nucleossomas e o fio do colar o DNA linker. A cromatina isolada em altas concentrações
iónicas encontra-se condensada.

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Resumo das várias fases do processo de enrolamento do DNA:

1. O DNA é enrolado à volta das histonas para formar uma cadeia de nucleossomas, cadeia
essa que se mantêm linear

2. A cadeia de nucleossomas enrola-se numa estrutura solenoide que é estabilizada pela

histona H1.

3. A estrutura solenoide é condensada por arranjamento em vários loops

Resumo dos vários níveis de organização molecular:

 Cromassoma
 Cromatídio
 Fibra de Cromatina
 Nucleossomas em cadeia
 Nucleossoma
 DNA cromossomal

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A organização celular é essencial devido ao grande comprimento nuclear de DNA. A tarefa da
compactação e organização celular deve-se às histonas. O complexo de histonas e DNA é
chamado de cromatina. Quando a célula não se encontra em divisão mitótica esta encontra-se
dispersa no núcleo, mas durante a fase mitótica encontram-se visíveis os cromossomas.

Nucleossomas
Um nucleossoma consiste numa proteína
nuclear com DNA à sua volta. O núcleo é um
octâmero que contém duas cópias de cada
uma das histonas H2A, H2B, H3 e H4. O DNA
que contém o nucleossoma consiste em
147bp (pares de bases). O DNA linker é que
é mais variável, podendo ter entre 15 a 55
bp.

 É o primeiro nível de compactação

do DNA
 Constitui numa barreira de
acessibilidade ao DNA

Histonas
Tal como já dito em cima, as histonas são proteínas que se associam ao DNA eucariótico. São
ricas em aminoácidos básico que lhes confere carga positiva, estas contactam com os grupos
fosfato carregados negativamente do DNA.

O enrolamento do DNA requer uma molécula de histona H1 por nucleossoma e a enzima

topoisomerase II.

 H2A, H2B, H3 e H4 - histonas nucleares – core (fazem parte do núcleo do nucleossoma,

não confundir com núcleo da célula)
 H1 - histona ligante

Cada histona nuclear contém uma cauda ou N-terminal – NTD’s. Estas são essenciais para a
compactação da cromatina.

As caudas NTD’s das histonas não são observáveis: não têm uma estrutura definida,
encontram-se “para fora” no núcleo e são móveis. A superfície do nucleossomas providencias
uma estrutura de interface bastante larga para interacções entre proteínas. Como dito, as

8
NTD’s são os domínios de interacção proteína-proteína e proteína-DNA e são constituídas por
aproximadamente 30 aminoácidos.

Cada uma das histonas (H1,H2a, H2b,H3,H4) pode existir em diferentes formas porque as
cadeias laterais podem ser modificadas por metilação, ADP-ribosilação, fosforilação ou
acetilação. Tais modificações alteram a carga eléctrica, a forma e outras propriedades das
histonas, com como as propriedades estruturais e funcionais da cromatina, possibilitando uma
regulação do metabolismo do DNA/RNA.

Acetilação

Um dos aminoácidos básicos constituintes dos NTD’s é a lisina. Adicionando um grupo acetil à
lisina, a carga desta fica neutralizada, inibindo a interação com o DNA. Quando isto acontece, a
cromatina tende a ficar numa conformação menos condensada, favorecendo os fenómenos de
transcrição e replicação.

Este processo é levado a cabo pela HAT –

Histone acethyltransferase – faz a
transferência do acetil da Ac-CoA para a
lisina; e pela HDAC – Histone
deacyltransferase – transfere o acetil da
lisina para a CoA. Assim, as HAT podem ser
chamadas de activadores de transcrição,
enquanto as HDAC são vistas como
repressoras desta.

Metilação

É um processo baseado na transferência de grupos metilo para os aminoácidos das histonas, tal
como acontece com a acetilação, a metilação de histonas tanto pode aumentar ou diminuir o
processo de transcrição de genes.

As histonas podem ser metiladas

tanto no aminoácido lisina como a
arginina, apesar de ser mais
frequente utilizando a lisina. Cada
grupo metilo que é adicionado
requer um conjunto de enzimas
específicas que incluem a PRMT –
arginine methyltransferase (para a
arginina) e a HMT – histone
methyltransferase (para a lisina).

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Resumo geral

Cadeias de Nucleossomas
Uma cadeia de nucleossoma é
constituída por um complexo
DNA+histonas nucleares espaçadas
aproximadamente por 200bp diferentes
ao longo da molécula de DNA. Este
substrato é essencial para fenómenos
como a transcrição e a replicação. Como
já foi referenciado, estas têm a forma de
um colar de pérolas.

A sua estrutura é bastante dinâmica. Tal

como já foi dito, esta pode variar de
acordo com as condições fisiológicas.
Uma grande concentração iónica promove a condensação. Na ausência de sais, a estrutura de
“colar de pérolas” é favorecida – folding da cadeia de nucleossomas. Existe um equilibro entre
condensado e não condensado, este deve-se à neutralização de cargas através dos catiões (
entre nucleossomas da mesma fibra ou entre fibras diferentes).

Fibras de Cromatina
Existem dois tipos básicos de cromatina:

 Eucromatina – é o tipo de cromatina envolvido na síntese proteica. É predominante

durante a interfase.
 Heterocromatina – é mais condensada que a primeira e tem como função principal o
envolvimento da adição de proteínas às histonas.

Para além das histonas e de toda a sua importância com o nucleossoma, este também se pode
associar a proteínas não histónicas, para facilitar a sua tarefa nos processos de síntese proteica.
Os nucleossomas, juntamente com outras proteínas não histónicas formam as fibras de
cromatina. Devido aos diferentes tipos de associações com diferentes proteínas existem vários
tipos de fibras de cromatina.

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Portanto, as proteínas associadas à cromatina são:

 Histonas linker (H1) – proteína ligante

 HMGs – high mobility group
 Proteínas heterocromatina
 Factores de transcrição/enzimas

Histonas Linker – H1

Têm como função principal a estabilização da cromatina.

Têm uma porção que interage com o nucleossoma e
outra que interage com o DNA linker para possibilitar a
conformação do nucleossoma.

HMGs – grupo de alta mobilidade

Estas tendem a descompactar o DNA, aumentando a sua acessibilidade, antagonizando a função

das H1, competindo pelo local de ligação.

Proteínas heterocromatina

Estas são importantes componentes na compactação da heterocromatina, rica em centrómeros

e telómeros. Estas podem interagir com os componentes de modificações estruturais de
histonas, como a metilação, favorecendo a condensação e compactação do DNA.

Resumo

A imagem em baixo faz um resumo das proteínas/enzimas que favorecem/desfavorecem a

compactação do DNA e a sua consequente transcrição de genes. Enzimas como a HAT, HMT,
HDAC, HP1, já foram faladas em cima.

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Cromossoma e sua arquitectura
Tal como já é conhecido, o cromossoma não é nada mais nada menos do que cromatina
condensada, ou seja, o nível de compactação imediatamente a seguir à cromatina corresponde
à sua condensação em cromossomas.

A associação dos nucleossomas é feita por um processo chamado de oligomerização, que é

baseado em interacções nucleossoma-nucleossoma. Estas interacções dependem das NTDs das
histonas e são facilitadas pelas histonas de ligação. No final temos uma estrutura oligomérica.

Resumindo…

A arquitectura cromossómica é um fenómeno importante pois mecanismos como a regulação

da síntese proteica são feitos através da condensação cromossómica. A condensação e
compactação do DNA é essencial para os mecanismos fisiológicos da célula. Assim, esta deve-se
a fenómenos físicos, metabólicos e funcionais.

Concluindo, a organização do DNA é importante pois o seu grau de compactação também regula
o processo de transcrição. Uma enzima como a Polimerase II não consegue aceder ao DNA para
iniciar a transcrição, este tem de ser minimamente descompactado para esta se processar. Os
níveis de compactação do DNA também pode regular o metabolismo do DNA condicionando as
interacções entre nucleossomas (alterando as NTDs que são as responsáveis pela “formação”
dos nucleossomas).

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DNA: Replicação
Replicação semi-conservativa
A hipótese da replicação semiconservativa foi
proposta por Watson e Crick e consistia que em cada
cadeia da dupla hélice de DNA molde gerava duas
novas moléculas de DNA. Esta hipótese foi
demonstrada por Meselson e Stahl, estes fizeram
crescer a E.Coli num meio com amónia com azoto
marcado radioactivamente, até que todo o DNA
contivesse o isótopo H. As células foram transferidas
para um meio com o isótopo L. Resultado: as
moléculas de DNA filhas era híbridos com uma cadeia
leve e uma cadeia pesada.

Assim, cada cadeia de DNA serve de molde para a

síntese da nova cadeia, produzindo 2 novas moléculas
de DNA, cada uma com uma nova cadeia de DNA e
uma cadeia pré-existente.

Replicação Bidireccional
A replicação começa a ser feita num ponto
de origem e prossegue
bidireccionalmente, ou seja, as duas
cadeias de DNA são replicadas
simultaneamente em ambas as
orientações a partir duma origem de
replicação.

Replicação Semi-descontínua
Uma nova cadeia de DNA é sempre sintetizada na direcção 5’-3’, com a extremidade 3’ sendo o
lugar em que o DNA é elongado. Como as duas cadeias de DNA são antiparalelas, a cadeia que
funciona como molde está a ser lida da sua extremidade 3’ para a 5’.

Durante este processo temos a formação de dois tipos de cadeias: leader strand e lagging
strand. A leader strand é sintetizada continuamente e a lagging strand descontinuamente. A
leader strand é aquela que é sintetizada continuamente na direcção 5’-3’, ou seja, na direcção
do movimento do garfo de replicação (local onde as proteínas se encontram para proceder à
elongação). A lagging strand é sintetizada em pedaços pequenos – fragmentos de Okazaki,
numa direcção oposta, estes fragmentos vão ser posteriormente ligados pela DNA ligase. (mais
à frente volto a explicar melhor este mecanismo)

Enzimas associadas à replicação

Para que ocorra uma replicação eficiente, a molécula tem de ser desenrolada ou partida. Este
processo de desenrolamento é feito pela helicase, iniciando-se no local que é chamado de
origem de replicação. Feito o desenrolamento, uma RNA polimerase específica – primase –
forma um pequeno primer de RNA complementar com a cadeia molde, este primer vai ser

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elongado pela DNA polimerase, formando uma cadeia filha. Outra enzima importante neste
processo é a topoisomerase I, esta possui a capacidade de aliviar a tensão provocada pelo
desenrolamento da dupla hélice de DNA.

Aqui, podemos fazer já um resumo dos requisitos já necessários para a replicação:

 DNA polimerase
 Cadeia de DNA molde
 Primer: sequência de ácidos nucleicos com a posição 3’-OH livre que se vai ligar à cadeia
molde complementar, funcionando como ponto de adição de nucleótidos para a cópia
da cadeia molde.
 dNTPs: nucleótidos de DNA que servem para elongar o primer (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)

Nota: queria só chamar à atenção que a partir daqui todo o processo de replicação vai ter por
base o processo de replicação da E.Coli, ou seja, dos procariotas e só depois faço a comparação
com o processo de replicação dos eucariotas.

A replicação do DNA na E.Coli é catalisada pela acção cooperante de mais ou menos 30

proteínas, formando um complexo chamado replissoma, entre elas:

 DNA polimerase I, II e III: sintetiza as duas cadeias complementares

 DNA helicase: separa as duas cadeias da dupla cadeia de DNA, usando ATP
 Primase: sintetiza os pequenos primers de RNA para a síntese dos fragmentos de
Okazaki, estes depois são substituídos por DNA pela DNA polimerase I
 Single stranded DNA binding proteins (SSB): estabilizam as cadeias simples
 Exonucleases e ligases: as ligases completam a cadeia depois do primer ser removido
 Topoisomerases: libertam a tensão associada ao desenrolamento

Mecanismo da DNA Polimerase

A sua função é elongar o primer na direcção 5’-3’, direcionando a utilização de dNTPs como
substratos.

A reacção fundamental é um ataque nucleofílico pelo grupo 3’OH do nucleótido da cadeia de

DNA em síntese no fósforo do dNTP, resultando no elongamento da cadeia de DNA por 1
nucleótido e na libertação de fosfato. Esta reacção apresenta um balanço energético em que
uma ligação fosfodiéster é formada e outra é destruída.

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Por isto, o primer que for utilizado para
marcar o inicio da replicação tem de
conter um grupo 3’-OH livre ao qual os
nucleótidos podem ser adicionados.

O número médio de nucleótidos

adicionados, antes que a DNA polimerase
se dissocie define a processividade.

A replicação é um processo de alta

precisão. Para além doutros factores,
esta característica também se deve a
esta enzima.

Um mecanismo intrínseco a
praticamente todas as DNAs polimerases
é uma actividade exonucleásica 3’-5’ separada, que funciona como verificação dupla depois de
cada nucleótido ser adicionado. Esta actividade remove o nucleótido errado.

Estrutura da DNA Polimerase

 Finger domain: interacções entre cadeia
molde e dNTPs
 Palm domain: reacção da fosforil
transferase (durante a adição de dNTP)
 Thumb domain: processividade e
translocação
 Fragmento Klenow: fragmento grande
que resulta quando o domínio
exonucleásico 5´-3´ é removido

Na E.Coli foram descobertas várias DNA

Polimerases com funções diferentes:

 DNA polimerase I
 DNA polimerase II
 DNA polimerase III

A DNA polimerase I não é a principal enzima de replicação, em vez disso, ela realiza várias
funções de limpeza durante a replicação e reparo, devido à sua função exonucleásica 5’-3’
(diferente da actividade de revisão 3’-5’). A maioria
das outras DNA polimerases não possui uma
actividade exonucleásica 5’-3’. A DNA polimerase III
é muito mais complexa do que a DNA polimerase I e
é constituída por 10 subunidades diferentes, esta
tem como principal função a polimerização do DNA.
A DNA polimerase II está envolvida na reparação do
DNA.

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NOTA: diferença entre função exonucleásica e endonucleásica – uma exonuclease quebra
nucleótidos no fim da cadeia (tanto na terminação 5’ como na 3’); uma endonuclease quebra
nucleótidos dentro da cadeia.

Resumindo o que foi dito até agora…

Restantes Enzimas
Helicase

Basicamente a sua função é de separar a dupla hélice do DNA hidrolisando o ATP quebrando as
ligações de hidrogénios entre as bases nucleotídicas. A helicase desenrola a cadeia dupla e
transforma-a em cadeias simples. São constituídas por 6 subunidades idênticas. O mecanismo
de separação das cadeias de DNA envolve apenas uma das cadeias de DNA, sendo a outra
excluída. Esta tem a capacidade de desenrolar a
cadeia dupla de DNA, uma vez que produz uma
força de deslocamento unidirecional.

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Primase

Tendo o molde de DNA para se iniciar a replicação é necessário um primer para que se inicie a
actividade da DNA polimerase. Este primer é fornecido pela primase. Usualmente esta aparece
associada à helicase.

A primase consegue reconhecer sequência específicas de uma cadeia simples de DNA,

sintetizando pequenas porções de RNA com nucleótidos como substratos. Mais tarde este
primer de RNA é removido pela função exonucleásica 5’-3’. Este primer é depois elongado pela
DNA polimerase para dar inicio à replicação.

Tal como já tinha dito antes, até agora têm-se sempre falado de mecanismos ocorridos nos
procariotas. Nos eucariotas, a replicação é mais complexa e mais lenta. No que toca a enzimas
existem diferenças.

 DNA polimerase α: uma subunidade tem actividade de primase e a subunidade larga

tem actividade de polimerização. Não possui actividade de “proofreading” 3’-5’.
Sintetiza apenas os primers para os fragmentos de Okazaki
 DNA polimerase β: envolvida na reparação do DNA (e não na replicação)
 DNA polimerase δ: Tem actividade de proofreading (semelhante à DNA polimerase II)
 RNAse H: nucleases que removem primers de RNA
 Ligases
 Helicases
 Topoisomerases

Replicação nos Eucariotas

Iniciação

Nos eucariotas, o inicio da replicação é marcado pela “escolha” do sítio em que esta se vai iniciar.
Devido à sua dupla ligação de hidrogénio, as sequências usadas como iniciadoras da replicação
estão ricas em bases de adenina e timina. Após o reconhecimento da origem de replicação, a
cadeia dupla de DNA é separada.

Elongação

Este processo consiste na polimerização da cadeia de DNA a ser formada. Esta é lida no sentido
3’-5’ para ser formada no sentido 5’-3’. Tal como já foi dito anteriormente, este processo
necessita num grupo 3-OH livre para a síntese ser iniciada.

Após a separação das cadeias dá-se o inicio da formação da leading strand (formada
continuamente a partir dum único primer) e da lagging strand (formada descontinuamente a
partir de vários primers de RNA, formando os fragmentos de Okazaki). A leading strand é a
cadeia molde que é sintetizada na mesma direcção que o garfo de replicação, a DNA polimerase
lê o molde, adicionando nucleótidos num processo contínuo, completando a eloganção desta.
Por outro lado, a lagging strand é sintetizada em fragmentos curtos – fragmentos de Okazaki,
que são posteriormente ligados pela DNA ligase.

Terminação

Nos eucariotas a replicação pode ter vários pontos de origem, então os garfos de replicação
começam e acabam em vários pontos do cromossoma. Como os eucariotas possuem
cromossomas lineares, estes possuem terminações especiais – telómeros. Estes são

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constituídos por sequencias oligoméricas repetidas (GGGTTA). A replicação do DNA não
consegue chegar ao fim dos cromossomas o que leva a um encurtamento sequencial das cadeias
filhas, para evitar este processo, utiliza-se uma enzima – telomerase- com capacidade de
transcriptase reversa modificada, que adiciona nucleótidos à extremidade 3’ da cadeia
encurtada.

Assim, o molde interno de RNA da telomerase sintetiza DNA complementar à sequencia

nucleotidica da cadeia atrasada. Após esta elongação, a DNA polimerase pode fazer a síntese de
DNA no mesmo sentido. Este processo de elongação telomérica vem contrariar a tendência dos
cromossas ficarem mais curtos após cada replicação.

Eficácia da Replicação do DNA

A adição de nucleótidos pode, como é obvio, ocorrer de um modo correto, se existir
complementaridade de bases, ou de maneira incorrecta. A adição incorrecta dá-se a uma
velocidade muito mais baixa do que a adição correcta e o nucleótido correcto liga-se mais
fortemente à DNA polimerase. Mas, a enzima tem uma capacidade muito reduzida para reparar
o erro. Como a DNA polimerase tem actividade exonucleásica, é possível corrigir certos erros,
esta tem um domínio exonucleásico que aumenta a exactidão da síntese por remoção dos
nucleótidos incorrectos a partir da extremidade 3’, esta movimenta-se entre os locais activos da
polimerase e da exonuclease, deslocando-se para o local da exonuclease apenas quando ocorre
uma adição incorrecta.

Reparação do DNA
Os erros na sequência de DNA
podem ser espontâneos ou
induzidos por factores ambientais.
Os sistemas de reparação de DNA
actuam nos seguintes casos:

 Mistach repair
 Base-excision repair
 Nucleotide-excision repair
 Direct repair

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Para além da acção da DNA polimerase já descrita em cima, um erro é reconhecido por um
“scan” sendo removidos e substituídos pela síntese de DNA dirigida pelo molde certo, esta
correcção é feitas por outras proteínas.

Recombinação do DNA
O genoma pode mudar duma geração para outra por recombinação, que corresponde a um
rearranjo da informação genética entre e dentro de moléculas de DNA.

Existem 3 classes de recombinação do DNA:

 Homóloga ou recombinação geral: envolve trocas genéticas entre 2 moléculas de DNA

que partilham uma região de aproximadamente a mesma sequência.
 Localmente específica: a troca ocorre apenas numa sequencia particular de DNA
 Transposição de DNA: envolve um pequeno segmento de DNA com a capacidade de se
mover de uma localização do cromossoma para outra.

A recombinação consiste num rearranjo de sequencias nucleotidicas obtidas por troca genética
entre duas sequencias homologas de DNA, geralmente localizadas em duas copias do mesmo
cromossoma. Este crossing-over ocorre durante a formação de gâmetas e permite que
diferentes versões (alelos) do mesmo gene sejam testadas em novas combinações. Este
processo também ocorre em bactérias e vírus.

(Esta última parte da matéria não é muito falada nos slides das aulas e está explicada muito por
alto, se quiserem completar espreitem o Lehninger que tem esta parte bem pormenorizada)

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DNA: Transcrição
A expressão da informação num gene normalmente envolve a produção de uma molécula de
RNA transcrita a partir de um molde de DNA.
A conversão da informação codificada no
DNA em proteínas requer um processo inicial
– transcrição, seguido da tradução da
informação genética.

Duma maneira geral, na transcrição a região

codificada do gene é copiada em RNA pela
RNA polimerase, o RNA obtido é processado
num RNA mais pequeno – RNA mensageiro
(RNAm) que se move para o citoplasma. Aí
este, com a ajuda do ribossoma, irá ser
traduzido, ligando os aminoácidos pela
ordem ditada pelo RNAm, formando as
proteínas.

RNA: introdução
Como vocês já sabem, o ácido ribonucleico – RNA – é uma molécula que possui várias funções
biológicas tanto na expressão dos genes como na sua regulação. Tal como o DNA, o RNA é
composto por uma cadeia de nucleótidos, mas, ao contrário do DNA, este é composto por cadeia
simples. O RNA contém uma ribose o que o torna menos estável em relação ao DNA. Outra
diferença baseia-se na complementaridade de bases, a base complementar da adenina deixa de
ser a timina e passar a ser o uracilo.

De acordo com as suas funções, podemos ter várias classes de RNA:

 RNA mensageiro – RNAm: especifica a ordem

dos aminoácidos; única classe de RNA codificante
 RNA transferência – RNAt: dadores de
aminoácidos na síntese proteica
 RNA ribossomal – RNAr: moléculas de RNA que
fazem parte estrutural e funcional dos ribossomas
(80-90% do total de RNA celular).
 Small RNA – snRNA: moléculas RNA não-
codificantes localizadas no núcleo, componentes das
ribozimas associadas às snRNP (small nuclear
ribonucleoproteins); incluem microRNAs – miRNA e
small interference RNAs – siRNAs.

Transcrição: elementos essenciais

Dum modo geral, a síntese de RNA é catalisada por uma enzima – RNA polimerase – que usa o
DNA como molde por um processo – transcrição. A inicio da transcrição começa com a ligação
da enzima a um promotor sequencial de DNA, normalmente encontrado a montante no gene.
A molécula de DNA é quebrada pela helicase (num mecanismo semelhante ao da replicação),
facilitando a síntese da cadeia complementar de RNA no sentido 5’-3’.

20
Antes de falar sobre o processo de transcrição propriamente dito é preciso entender que
existem várias proteínas e enzimas que fazem parte da maquinaria celular essenciais para o
início da transcrição e importantes para que ela ocorra. Factores como os factores de
transcrição e a RNA polimerase precisam de ser explicados primeiro.

RNA Polimerase

É uma enzima que sintetiza RNA usando um molde de DNA pela transcrição. Nos eucariotas
podemos encontrar vários tipos de RNA Polimerase que irão sintetizar diferentes classes de RNA.

 RNA Polimerase I: localizada no núcleo; sintetiza RNAr’s 28S, 18S e 5.8S

 RNA Polimerase II: sintetiza precursores do RNAm, snRNA e microRNAs
 RNA Polimerase III: sintetiza RNAt e RNAr

Pode-se ver a RNA Polimerase II como a mais importante destas pois é aquela que tem o papel
principal na síntese de proteínas. Esta contém uma estrutura de 12 subunidades:

 Núcleo Promotor
 Subunidades comuns às outras RNA polimerases
 Subunidades específicas da iniciação
 C-terminal domain (CTD) – domínio com um grupo carboxilo terminal que vai ser
importante para a actividade desta enzima; coordena o processo de transcrição; é um
local de ligação de factores de processamento

Factores de Transcrição

São proteínas essenciais à transcrição que se ligam a sequências específicas de DNA - promotor,
controlando o processo da transcrição da informação do DNA para o RNAm. Existem factores
gerais e específicos:

 General Transcription Factors-GTFs: necessários à transcrição de todos os genes;

participam na formação de um complexo de iniciação
 Factores específicos: estimulam (ou reprimem) a transcrição de genes particulares por
ligação às sequências reguladoras

Portanto, resumindo o que já foi dito até aqui, a iniciação da transcrição envolve a RNA
Polimerase II que reconhece o promotor, ligando-se a este, procedendo à separação das cadeias
de DNA. De seguida, inicia a síntese de RNA, sempre no sentido 5’-3’, formando-se um híbrido

21
de RNA-DNA de aproximadamente 8 pares de base. As cadeias de DNA hibridam então e a cadeia
de RNA é libertada.

Portanto, até agora temos que existem vários componentes essenciais ao processo de
transcrição, já falámos da RNA Polimerase II e dos factores de transcrição, mas tal como foi dito
em cima, a presença de um promotor (sequencia de DNA) é essencial para o inicio do
mecanismo.

Sequência de DNA - Promotores

O promotor é uma região de DNA que inicia a transcrição dos genes. Este encontra-se localizado
próximo do sítio de transcrição e montante na cadeia de DNA. A RNA polimerase vai ligar-se a
este em conjunto com os factores de transcrição. O DNA codifica vários elementos que são
importantes na transcrição:

 Core promoter (núcleo do promotor): sequência de DNA necessária a uma iniciação da

actividade da polimerase II; local onde se vão ligar os GTFs
 Proximal promoter (região próxima do promotor): afecta a eficiência do inicio da
transcrição
 Enhancers e silencers: sequência de DNA que estimula ou reprime a transcrição a partir
de um promotor

ELEMENTOS DO NÚCLEO DO PROMOTOR

 Inclui o sítio onde ocorre a transcrição e os elementos a montante deste local.

 Local de ligação da RNA polimerase
 Nos eucariotas, contém uma sequência de bases TATAAA – TATA box – onde se vão ligar
GTFs como a TATA-binding protein – TBP (subunidade do TFIID); contém também um
B recognition element - BRE – que é reconhecido pelo factor de transcrição TFIIB.
 Tanto a TATA box como BRE localizam-se mais ou menos 30-40 pares de bases acima do
local de transcrição

22
ELEMENTOS DA REGIÃO PRÓXIMA DO PROMOTOR

Os mais importantes são as ilhas CpG (Cytosina-phosphate-Guanine) ricas em sequências de

citosina e guaninas posicionadas aproximadamente 100 pares de bases acima do local de
iniciação da transcrição. É o local de ligação do factor de transcrição Sp1, este recruta as
proteínas para a formação do complexo de pré-iniciação – PIC.

ELEMENTOS ENHANCER

Os enchancers estimulam a expressão génica. É uma região curta de DNA que fornece o local
onde se ligam as proteínas activadoras da transcrição. Localizam-se muito longe do local de
transcrição tanto a montante como a jusante deste.

Normalmente, vários enhancers actuam de forma combinada com proteínas activadoras para
estimular a expressão de um promotor – enhanceossoma.

ELEMENTOS SILENCER

Os silencers são locais que se ligam às proteínas repressoras. A sua função é análoga aos
enhancers, mas com o efeito contrário. O mecanismo de repressão actua afectando a
estrutura da cromatina e/ou impossibilitando o recrutamento da polimerase II.

Para terminar a compreensão de todos os componentes do complexo pré-iniciação falta-nos

falar em pormenor dos factores de transcrição que têm a capacidade de se ligar ao promotor e
aos seus componentes – GTFs

Factores de Transcrição Gerais – GTFs

É uma classe de proteínas que se ligam a sítios específicos do promotor para activarem o
processo de transcrição. Estas ligam-se ao núcleo do promotor de modo a gerar o PIC. Nas
bactérias, estas só precisam de um único GTF: factor sigma. Nos eucariotas, o mecanismo de
iniciação da transcrição requer uma RNA polimerase e uma série de factores de transcrição:

 TFIIA
 TFIIB
 TFIID (contém a TBP)
 TFIIE
 TFIIF
 TFIIH

23
Após a presença destes factores todos encontram-se as condições necessárias para se formar o
complexo de pré-iniciação da transcrição.

Complexo de Pré-Iniciação - PIC

É um complexo grande de proteínas com funções como a ligação à RNA Polimerase II, a
desnaturação do DNA e o seu posicionamento para o sítio da transcrição. Este é formado através
da ligação dos vários factores de transcrição, esta ligação é ordenada da seguinte maneira: TFIID,
TFIIA, TFIIB, RNA Pol II, TFIIE e TFIIH.

Falando dos factores de transcrição mais ao pormenor:

TFIID

É o primeiro factor a ligar-se e vai catalisar a

ligação dos outros factores. É constituído pela
TBP – TATA box Binding Protein e por TAFs.

A TBP liga-se à TATA box e provoca o

desenrolamento do DNA. O complexo DNA-TBP
serve de plataforma para a ligação dos TFIIA e
TFIIB. É considerado do factor de transcrição
universal.

Os TAFs são factores associados ao TBP que

ajudam ao reconhecimento dos elementos do
núcleo do promotor, estes são constituídos por
histonas dobradas. São recrutados para os
promotores pelos activadores, funcionando
assim como co-activadores da transcrição.

 TAF1 e TAF2 ligam-se ao INR (initiator)

 TAF6 e o TAF9 ligam-se ao DPE
(downstream promoter element)
 TAF12 interage com as proteínas
activadoras complexadas com o
enhancer

Os promotores podem ser independentes dos

TAFs, mas possuem a TATA-box onde a TBP se
pode ligar. Se os promotores não tiverem a
TATA-box, requerem obrigatoriamente os TAFs,
possuindo outra sequência para ocorrer a
ligação.

TFIIA

Constituído por 3 subunidades, tem como função a promoção da estabilidade do complexo TBP-
DNA, ligando-se ao núcleo do promotor. Bloqueia os inibidores de transcrição.

TFIIB

Uma subunidade. Liga-se à BRE (região que se encontra antes da TATA-box no promotor), à TBP
e à RNA Pol II. Regula a libertação do promotor, quando a RNA Pol II se afasta do resto da PIC.

24
TFIIF

É um dímero, liga-se à RNA Pol II acompanhando-a até ao PIC (análogo do factor gama nas
bactérias). Facilitar a abertura do promotor, promovendo a separação das cadeias de DNA.

TFIIE

É um heterodímero, cria o local de ligação para o TFIIH. Liga-se ao promotor perto do local de
iniciação da transcrição.

TFIIH

É um grande complexo com 10 subunidades. Tem como principais funções a promoção do

desenrolamento da cadeia de DNA do promotor e a saída da RNA polimerase, a reparação do
DNA e a progressão do ciclo celular. Uma das principais actividades deste factor é a de, através
da fosforilação, fazer a Pol IIA (específica para a iniciação) ser convertida na Pol IIO (crucial para
a elongação).

Por último, os componentes que foram falados em cima são essenciais para a transcrição e para
a formação do Complexo de Pré-Iniciação da transcrição. Estes funcionam associados a outros
já mencionado, tais como, os factores de transcrição específicos e os activadores de
transcrição.

Factores de Transcrição Específicos

São factores de transcrição que reconhecem sequências especificas de DNA a montante do local
de transcrição. Ex: Sp1. A utilização destes pode ser essencial para o controlo dos parâmetros
da transcrição, tanto podem ser activadores como repressores deste processo. Os receptores
nucleares são um tipo desta classe de factores de transcrição. Estes tem a capacidade se ligar
directamente ao DNA e regular a sua expressão.

Activadores de Transcrição

A sua função é promover o processo de transcrição e recrutar a Pol II. Não confundir com os
Factores de Transcrição, estes são essenciais para o processo e sem alguns, esta não ocorre. Os
activadores actuam lado a lado com o factores e promovem a função destes últimos.

Síntese de RNA
Tal como na replicação, o processo de transcrição pode ser dividido em 3 passos: iniciação,
elongação e terminação.

Iniciação

A transcrição começa com a ligação da RNA Polimerase II aos GTFs para formar o PIC, ocorrendo
isomerização. O complexo de iniciação abre-se e permite a ligação de ribonucleótidos de
trifosfatos (NTPs), ao mesmo tempo, a RNA Polimerase dissocia-se, dando-se uma reiniciação
do processo.

25
Elongação

Baseia-se no processo de adição de nucleótidos (NTPs) para alongar a cadeia de RNA. O

complexo dissocia-se, ocorre a separação da RNA Polimerase II (ocorre fosforilação do terminal
CTD desta) dos GTFs e a remoção do promotor. Os factores de elongação associam-se à Pol II,
aumentando a sua actividade, promovendo a síntese de RNA.

Terminação

A transcrição termina quando é transcrita uma

sequência de genes que promove o fim deste
processo. Neste caso, a transcrição termina quando
ocorre uma sequencia sinal Poli(A), esta sequência
encontra-se na região 3’ não traduzida (UTR) – região
logo após o codão stop.

Após este processo, o fim da síntese de RNA é

marcado pela libertação da RNA Polimerase II, esta
sofre uma mudança conformacional depois da
fosforilação e é libertada. A dupla hélice DNA é
reestabelecida e a molécula de RNA e a Pol II são
libertadas.

Transcrição: Processamento RNAm

Todas as moléculas de RNA nos eucariotas após serem sintetizadas são processadas, após este
processo são transportadas para o citoplasma onde vão ser traduzidas. Uma molécula de RNA
recém-sintetizada é chamada de pré-RNAm. Aqui os intrões são removidos e os exões
posteriormente ligados. Este processo é levado a cabo pelo spliceossoma, um complexo
constituído por snRNPs – small nuclear ribonucleoproteins.

Dum modo geral, temos de ter noção que existem outros mecanismos que têm de acontecer
antes de o splicing propriamente dito ocorrer. Portanto, podemos dividir o processamento do
pré-RNAm em três partes, que não ocorrem propriamente com uma ordem definida:

 Capping da extremidade 5’ – encapsulamento da extremidade 5’ por parte dum

complexo metilado.
 Processamento da extremidade 3’ – poliadenilação da extremidade 3’
 Splicing – quebra interna para a remoção dos intrões e posterior ligação dos exões

No fim deste processo, dum maneira

simples, podemos dizer que temos um
RNAm constituído (do sentido 5’-3’) por
uma cápsula, uma região que não irá ser
traduzida (UTR) que acaba na região
codificantes do codão de iniciação, exões,
outra UTR que começa na região
codificante do codão stop e uma cauda
poli-adenilada.

26
Capping da extremidade 5’

Tal como disse em cima, ocorrem duas modificações no pré-RNA em cada extremidade. Na
extremidade 5’ ocorre a formação do 5’-cap, este complexo encontra-se associado à RNA
Polimerase II e consiste num nucleótido de guanina que é metilado na posição N-7 – 7-
metilguanosina. Para além da metilação da guanina, também são adicionados grupos metil ao
primeiro e ao segundo nucleótido do próprio RNAm.

Este capping protege o RNAm da degradação enzimática, inibindo a acção da exonuclease 5’-3’,
auxilia na sua exportação para o citoplasma e promove a ligação deste RNAm com os
ribossomas, ligando-se a factores de tradução.

Este processo baseia-se na formação de uma ligação

5’-5’ trifosfasto, para que esta ligação ocorra é
necessária a presença de duas enzimas: CE - Capping
Enzyme (tem duas actividades) e a MT -
Metiltransferase.

 Um dos grupos fosfato terminais (pppN) é

removido pela RNA 5’ trifosfatase
(componente da CE), resultando num grupo
bifosfato (ppN)
 O GTP (guanosine triphosphate) é adicionado
ao terminal bifosfato pela RNA
metiltransferase (componente da CE), isto
resulta numa ligação 5’-5’ trifosfato
 Por último, ocorre a metilação pela Metiltransferase.

Esta enzimas são recrutadas pelo CTD (C-terminal domain) da RNA Polimerase II quando este é
fosforilado.

O processo da síntese proteica pode ser inibido modificando estas reacções enzimáticas. A
enzima RNA Trifosfatase é inibida na presença de iões metálicos, tornando-se um alvo para
certos fármacos (isto acontece nas leveduras).

Poliadenilação

A poliadenilação é a adição de uma cauda Poli A com cerca de 200 adenosinas à terminação 3’
da molécula de RNAm. Este mecanismo protege a molécula de RNAm da degradação enzimática
no citoplasma, favorece a exportação do RNAm do núcleo e a sua tradução.

Este processo é levado a cabo por uma série de factores que primeiramente clivam a terminação
3’ e aí adicionam a cadeia poliadenilada. Estes factores estão intimamente associados à RNA
Polimerase II e são:

 CPSF – cleavage/polyadenylation specificity factor

 CstF – cleavage stimulation factor
 PAP – polyadenylate polymerase
 PABII – polyadenylate binding protein 2
 CF1 – cleavage factor I
 CF2 – cleavage factor II

27
O CPSF reconhece a sequência AAUAAA (localizada antes do local de clivagem) e cliva o
precursor do RNAm funcional, onde irá ser posteriormente adicionada a cauda Poli A. Este factor
é constituído por 4 proteínas, umas delas é a CPSF-73. Esta proteína liga-se directamente ao
local de clivagem e a sua função é dependente de zinco. A CPSF encontra-se associada à RNA
Polimerase II desde a transcrição, só se dissocia desta quando reconhece a sequência para
promover a formação da cadeia poliadenilada. Outros factores de poliadenilação juntam-se
então ao CPSF.

Outras proteínas adicionam especificidade à ligação ao RNA: CstF e CF1. A CstF liga-se a uma
região rica em GU abaixo do local de ligação da CPSF, esta proteína é necessária para que a
clivagem ocorra. A CF1 e a CF2
estabilizam este complexo e ajudam na
ligação da poliadenilação com os
precursores de RNAm.

Quando o RNA é clivado, a

poliadenilação começa e é catalisada
pela PAP (polyA polymerase)
adicionando unidades de adenosina.
Outra proteína PABII liga-se à nova,
curta, cadeia Poli A e aumenta a
afinidade à PAP, quando esta atinge os
250 nucleótidos a poliadenilação pára.

A RNA Polimerase II não funciona

independentemente deste processo, a
transcrição e o processamento ocorrem
simultaneamente, pois o terminal C da RNA Pol II contacta com vários factores de
poliadenilação. Quando a RNA Polimerase chega a uma sequência terminal, a transcrição acaba.

A poliadenilação revela-se importante na regulação da expressão genética, na transcrição

genética e na estabilização do RNAm. Nos eucariotas, existem locais Poly(A) alternativos que
dão origem a diferentes proteínas com diferentes estabilidades, de acordo com o local de
poliadenilação, obtemos ora proteínas secretoras (factor CstF está em menores quantidades)
ora proteínas membranares (factor CstF não está limitado).

(https://www.youtube.com/watch?v=YjWuVrzvZYA –
espreitem este vídeo que resume bem o que já foi dito até
aqui sobre o processamento)

Splicing

É a fase mais importante do processamento e a última.

Consiste na remoção dos intrões (regiões não condificantes)
do pré-RNAm, permitindo a maturação do RNAm. Este
processo ocorre apenas nas células eucariotas. Um RNA
maduro pode dar origem a várias proteínas devido ao
splicing.

28
INTRÕES

Os intrões são sequências de DNA de um gene que não codificam qualquer parte da proteína
produzida pelo gene e separa as porções que são codificadas: os exões. Diferentes tipos de
intrões podem ser identificados:

1. Intrões do grupo 1: não necessitam de enzimas para serem eliminados – self-splicing.

2. Intrões do grupo 2: também fazer o self-splicing
3. Spliceosomal intron: sofrem acção do spliceossoma
4. RNAt intrão: sofrem splicing de acção enzimática

Os intrões mais comuns nos eucariotas são aqueles que sofrem acção do spliceossoma. Estes
são caracterizados por terem sequências específicas que são reconhecidas pelo spliceossoma
iniciando as reacções que compõem o splicing. Existem três sequências importantes para que o
splicing ocorra:

 Na extremidade 5’ do intrão – sequência GU

 Na extremidade 3’ do intrão – sequência AG
 Ponto de ramificação: CURAY

SPLICEOSSOMA

É um complexo grande que se encontra no núcleo das células eucariotas. É constituído por
snRNAs e outros complexos proteicos. Apenas os eucariotas contém spliceossomas.

Cada spliceossoma é composto por 5 small nuclear RNAs (snRNA) que associados a
ribonucleoproteínas formam um complexo RNA-proteína – snRNP. Os snRNAs que compõem o
spliceossoma são os U1,U2,U4,U5 e U6.

29
MECANISMO DE FORMAÇÃO DO SPLICEOSSOMA

1. Emparelhamento de bases dos snRNPs U1 e U2 ao

pré-mRNA. O U1 liga-se ao local de splice 5’ e o U2
liga-se ao local de splice 3’
2. Ligação dos snRNPs U4 e U6, formando-se um
complexo que se associa ao snRNP U5
3. Ligação do complexo U4/U6/U5 ao complexo
anteriormente formado U1/U2/pré-RNAm
formando o spliceossoma

MECANISMO DO SPLICING

O splicing propriamente dito envolve duas reacções de

catálise (reacções de transesterificações, havendo
substituição de ligações fosfodiéster).

1. Ataque hidrofílico pela adenina do ponto de

ramificação ao local de splicing 5’
2. Ataque hidrofílico do 3’–OH do exão que foi
separado no passo 1 ao local de splicing 3’
3. Junção dos exões e libertação do intrão

Há que referir que o mecanismo de splicing que foi falando em cima refere-se àquele em que é
essencial a presença de um spliceossoma, tal com foi dito em cima, existem intrões que fazem
self-splicing.

SELF-SPLICING

Este ocorre raramente com intrões que produzem uma

ribozima, fazendo as funções do spliceossoma neste caso.
Neste grupo de intrões que fazem o seu splicing sozinhos
temos os intrões do grupo I e II, estes são estruturalmente
análogos aos snRNAs (catalisadores da reacção com o
spliceossoma).

30
SPLICING ALTERNATIVO

Uma das características do splicing é ter a capacidade de gerar diferentes proteínas através do
mesmo gene. Através de um mesmo gene, se fizermos diferentes splicings, consegue-se obter
diferentes RNA’s, originando diferentes proteínas. A isto chama-se splicing alternativo que
permite compreender a diversidade de proteínas com um número mínimo de genes nos
eucariotas.

Existem vários tipos de splicing alternativos, que podem ser compreendidos na figura abaixo.
(Vejam isto a cores).

Regulação do Splicing

O splicing é regulado por proteínas que tanto podem actuar como repressores ou activadores.

Splicing silencers são sítios onde as proteínas repressoras de splicing se podem ligar, diminuindo
a probabilidade daquele sítio ser usado como local de clivagem, estes tanto se podem encontrar
no intrão em si – ISS – intronic splicing silencers, como num exão vizinho – ESS – exonic splicing
silencers. A maior parte dos repressores de splicing são hnRNPs – heterogeneous nuclear
ribonucleoproteins.

Splicing enhancers são sítios onde as proteínas activadoras se ligam. Estas também se podem
encontrar no intrão em si – ISE – ou no exão vizinho – ESE. A maior parte dos activadores de
splicing fazem parte das SR proteínas

31
Transcrição: Processamento tRNA, rRNA e miRNA
Até aqui temos falado sobre do processamento para a produção de um mRNA funcional, mas
também os outros tipos de RNA precisam de sofrer este mecanismo para completar a sua
síntese.

Processamento do tRNA

Este ocorre sem a necessidade de uma maquinaria complexa como o spliceossoma. Existem 4
mudanças sequenciais:

1. Remoção do terminal 5’ da sequência pela RNAse P

2. Substituição dos resíduos U da extremidade 3’ pelo terminal CCA
3. Splicing do intrão por uma endonuclease e ligação dos exões por uma ligase
4. Modificação nas bases (metilação, desaminação e redução)

(this paint skills lol)

Processamento do rRNA

Nos eucariotas, o pré-rRNA é processado no

nucléolo. Os genes que codificam o rRNA estão
organizados em unidades de transcrição que são
separadas por NTS – nontranscribed spacer. Cada
unidade de transcrição contém sequencias que
codificam para 18S, 5.8S e 28S rRNA. O
processamento dos precursores de rRNA envolve
exo e endonucleases guiadas por snoRNA – small
nucleolar RNAs.

32
Processamento do miRNA

MicroRNA – miRNA, é o nome dado a uma pequena molécula de RNA não codificante que tem
como função a regulação da expressão génica. O precursor do miRNA sofre os mesmos
mecanismos para a sua síntese que os restantes RNA’s. A síntese do miRNA pode ser resumida
nesta sequência: pri-miRNA -> pré-miRNA -> miRNA

A dupla cadeia do pri-miRNA é reconhecida por uma proteína nuclear conhecida como DGCR8,
esta associada à enzima Drosha, uma proteína que corta o RNA, formam um “microprocessor
complex”. Neste complexo a DGCR8 orienta o domínio catalítico da Drosha que cliva o RNA
formando o pré-miRNA. De seguida, este é orientado para o citoplasma onde vai sofrer o resto
do processamento. Já no citoplasma, o pré-miRNA é clivado pela enzyma Dicer, formando o RNA
maduro.

(A imagem simplifica bem o que já sabemos até agora sobre o miRNA)

33
 Bioquímica da Síntese Proteica
DNA: Tradução
O processo de tradução baseia-se da produção de proteínas por parte duma descodificação da
mensagem genética incluída no mRNA. Este processo acontece devido à presença de um
ribossoma, produzindo uma cadeia de aminoácidos específica que originará um polipéptido.

Antes de falarmos de como se processa o mecanismo de tradução em si é necessário conhecer

melhor os seus componentes e entender o seu papel neste mecanismo:

 Ribossomas: constituído por duas subunidades, a maior e menor, que interagem com o
tRNA e o mRNA, respectivamente
 mRNA: contém a sequência que vai ser descodificada – codões – sequência de 3
nucleótidos (tripleto) que especifica um aminoácido
 tRNA: o aminoacil-tRNA consiste numa associação do aminoácido ao tRNA e é este que
transporta o aminoácido que será adicionado à cadeia polipeptídica em crescimento

RNA de Transferência (tRNA)

É a molécula que faz a ligação física entre os ácidos nucleicos e a sequência de aminoácidos das
proteínas. O seu mecanismo baseia-se na ligação do aminoácido à proteína que está a ser
sintetizada, com a ajuda do ribossoma. Assim, os tRNAs são um componente essencial para a
tradução das proteínas, uma síntese que é feita de acordo com o código genético.

A sequência nucleotidica do mRNA especifica a sequencia de aminoácidos que vai ser

incorporada na proteína. Uma sequência de 3 nucleótidos do tRNA – anti-codão – corresponde,
segundo o código genético ao tripleto no mRNA – codão. Cada tripleto codifica um aminoácido.
Existem mais de 31 tRNAs, que codificam para um total de 20 aminoácidos, existindo 61 codões.

Estrutura

O tRNA tem uma estrutura em forma de trevo,

constituído por 4 troncos em cadeia dupla e nas
extremidades existem 3 loops, onde não ocorre
emparelhamento. A extremidade 3’ de todos os tRNAs
têm a sequência CCA, a ligação do aminoácido a essa
sequencia dá origem a um aminoacil-tRNA. Na
extremidade oposta, temos o anticodão que
reconhece o codão.

34
Formação do Aminoacil-tRNA

Um dos processos mais importantes que envolve o tRNA é a síntese da sua forma activada –
aminoacil-tRNA. Este é formado quando o aminoácido se liga ao tRNA. Este processo é mediado
pela aminoacil tRNA sintetase. Esta reacção ocorre em dois passos:

1. A enzima activa o aminoácido, através da transferência de AMP para a extremidade do

mesmo. Resultando um aminoacil-AMP, como tal, é um processo que usa ATP
2. O aminoacil-AMP reage com o tRNA apropriado. O grupo carboxilo do aminoácido
reage com a extremidade 3’-OH do nucleótido terminal do tRNA

Esta reacção é específica para cada aminoácido, ou seja, normalmente existe uma única
aminoacil tRNA sintetase para cada reacção que liga um específico aminoácido.

Ribossoma
É uma parte principal da síntese proteica pois é aqui que ocorre a tradução do mRNA.
Estruturalmente, o ribossoma dos eucariotas é constituído por 2 subunidades:

 Subunidade maior: (60S) constituída por rRNA 5S, 28S

e 5.8S
 Subunidade menor: (40S) constituído por rRNA 18S

Antes de falar do que acontece no ribossoma em si, é

importante distinguir a diferença estrutural dos ribossomas dos
eucariotas para os procariotas. (imagem ao lado)

Usando o mRNA como molde, o ribossoma traduz cada codão

(3nucleótidos) do mRNA, emparelhando-o com o aminoácido
especifico do aminoacil-tRNA, este contém um anticodão
complementar num extremidade e o aminoácido
correspondente na outra.

Em termos funcionais, a subunidade menor lê os codões (local

de ligação do mRNA) enquanto na subunidade maior, onde se
encontra a peptidil-transferase, vai haver a transferência do aminoácido do tRNA para a cadeia
polipeptídica. Nota: o ribossoma contém 3 locais de ligação onde este processo todo ocorre:
local de ligação A (onde de liga o aminocail), P (local de formação do péptido) e E (exit).

35
Depois de vermos os componentes da tradução, há que entender como é que se estes se
interligam e o seu papel neste mecanismo de síntese.

Tradução
Dum modo geral, podemos definir que a tradução é o processo de síntese de proteínas por parte
dos ribossomas. Nos eucariotas, a tradução ocorre no citosol. Podemos dividir a tradução em 3
etapas:

1. Iniciação: o ribossoma é formado pelas duas subunidade associando-se ao mRNA; o

primeiro tRNA é ligado ao codão iniciador (AUG) que leva o aminoácido correspondente
(metionina)
2. Elongação: o mRNA é percorrido e descodificado, sendo novos aminoácidos adicionados
para a formação do péptido
3. Terminação: inicia-se quando o codão stop chega ao ribossoma, resultando na clivagem
e afastamento do péptido formado.

Iniciação

Para que a tradução se inicie, tal como na transcrição, existem alguns factores que induzem o
inicio desta – eIF – eucaryotic initiation factor. Normalmente é neste passo que se dá a
regulação da tradução. Duma maneira geral, a iniciação da tradução processa-se em 3 passos:

1. Preparação do complexo ternário e ligação do tRNA com metionina à subunidade

ribossomal menor
2. Docking da subunidade ribossomal, ligando-se o complexo formado anteriormente à
extremidade 5’ do mRNA – 5’ cap
3. Pesquisa pelo codão iniciador (AUG), indo o complexo e a subunidade maior do
ribossoma pesquisar todo o mRNA até o encontrar.

Em primeiro lugar ocorre a formação do complexo ternário, este é constituído pelo tRNA (ligado
a uma metionina), um factor de iniciação (eIF2) e GTP (energia), que se liga posteriormente à
subunidade menor do ribossoma, com a ajuda de outros factores de iniciação. É este conjunto
de componentes que se vai ligar à extremidade 5’ do mRNA.

36
Antes desta ligação ocorrer é preciso ocorrer uma modificação na extremidade 5’ do mRNA,
para tradução dependentes deste processo, à extremidade 5’ do mRNA vai-se ligar um complexo
Cap-binding, que é constituído por vários factores que se ligam à subunidade 5’.

De seguida, a este local vai-se ligar o complexo ternário associado à subunidade menor do
ribossoma, formando o Complexo de Pré-Iniciação. (atentem que até aqui só a subunidade
menor do ribossoma é que entrou no processo)

Após o complexo de pré-iniciação se formar este vai fazer um scanning ao mRNA até encontrar
o primeiro codão de iniciação (AUG). Após isto acontecer a subunidade maior liga-se ao
complexo de pré-iniciação, levando à hidrólise do GTP e afastamento dos factores de iniciação.
Forma-se o Complexo de Iniciação.

Neste momento, este complexo encontra-se com o local P ocupado (com o tRNA ligado ao
aminoácido metionina porque foi reconhecido o AUG) e com o local A à espera do próximo tRNA
respectivo, e com o local E liberto. Estes locais encontram-se por esta ordem: A-P-E.

No programa existe muito a comparação com os procariotas, tudo o que foi dito acima é
relacionado com os eucariotas, mas em comparação com os procariotas, o mecanismo de
tradução tem poucas diferenças:

 O mRNA é ligado à subunidade 30S na

sequência Shine-Dalgarno (local de ligação do
ribossoma) localizado acima do codão de
iniciação. Esta sequencia é complementar à
sequencia localizada no rRNA 16S da
subunidade menor.
 O tRNA com fenilmetionina e os factores de
iniciação ligam-se ao complexo mRNA-
subunidade 30S – complexo de pré-iniciação.
 Este liga-se à subunidade 50S, hidrolisando o
GTP e provocando a libertação dos factores
de iniciação

(a imagem ao lado mostra o mecanismo de iniciação

da tradução nos procariotas, é igual para os
eucariotas só se altera o nome dos componentes)

37
Elongação

À medida que o ribossoma percorre a cadeia de mRNA, um aminoacil-tRNA novo liga-se à cadeia
na posição A do ribossoma. Este processo é catalisado por factores de elongação – EF.
Simultaneamente, o grupo de aminoácidos já formado liga-se ao aminocil-tRNA e forma uma
nova ligação peptídica.

Posteriormente, ocorre uma translocação do ribossoma para a codão seguinte, passo este
catalisado pelo GTP. O polipéptido que está em crescimento está sempre ligado ao tRNA que
trouxe o último aminoácido.

Portanto, na elongação temos como peças principais: os factores de elongação e o mecanismo

em si que se dá o nome de ciclo de elongação.

FACTORES DE ELONGAÇÃO

Em cima tinha dito que os factores de iniciação promoviam a formação do complexo ternário,
mas para além destes, a formação do complexo ternário também faz parte das funções dos
factores de elongação, permitindo assim a especificade do tRNA minimizando os erros de
translação. Ao EF – elongation factor – que tem esta função dá-se o nome de EF-Tu (para os
procariotas) e EF-1 (para os eucariotas).

Para além disto, na translocação, o EF-G (nos eucariotas tem o nome de EF-2) liga-se ao local A
e desloca o tRNA para a posição P.

CICLO DE ELONGAÇÃO

1. O ciclo começa com um tRNA ligado ao mRNA na posição P do ribossoma

2. Ligação do aminoacil-tRNA, juntamento com o EF-Tu e GT, à cadeia na posição A
3. Verificamos que o aminoacil-tRNA fica ligado à cadeia de mRNA, enquanto o EF-Tu e o
GTP ficam livres para o próximo complexo aminacil-tRNA
4. Ligação do EF-G e de uma molécula de GTP à cadeia de mRNA. Esta ligação provoca uma
deslocação da cadeia de mRNA ao longo do ribossoma e uma translocação do primeiro
tRNA para a posição E do ribossoma.
5. O EF-G e o GTP dissociam-se e dão lugar ao novo tRNA juntamente com o EF-Tu e o GTP
6. O novo tRNA acomoda-se na posição A e o primeiro desliga-se da cadeia de mRNA e do
ribossoma

38
Terminação

Quando o ribossoma chega a um codão stop (UGA, UAG ou UAA), a tradução é terminada com
a ajuda de factores de terminação – TF ou RF.

Ocorre hidrólise do peptidil-tRNA no ribossoma, com a libertação do polipéptido completo e do

último tRNA, seguida da dissociação das duas subunidades ribossomais. Este passo final requer
a hidrólise do GTP.

Código Genético
A síntese proteica é possível devido à existência de um código genético. Este consiste num
conjunto de regras que fazem correspondência entre a linguagem genética e a linguagem
proteica. Como já foi dito em cima, um tripleto (codão) de um determinado mRNA codifica a
síntese de um aminoácido.

Dos 64 codões possíveis, 3 são codões stop (não codificam qualquer aminoácido) e 1 é codão
de iniciação (codifica a metionina). Pode-se então concluir que apenas 61 dos 64 codões
codificam aminoácidos.

39
O código genético inclui várias características:

 Universal – o aminoácido
correspondente para cada codão é
aproximadamente igual para todos os
organismos
 Redundante – há vários codões
específicos para o mesmo aminoácido

Com tudo o que sabemos até agora, o código

genético baseia-se no emparelhamento de
bases ditado pela lei de Watson & Crick, como é
que este então pode ser redundante? Tal como
já foi dito em cima, um codão é constituído por
3 nucleótido (3 posições diferentes). O
emparelhamento de bases na primeira e na
segunda posição é específico e segue
estritamente a regra acima enunciada, mas a terceira posição é menos restrita, ou seja, uma
mudança nesta 3ª posição pode não alterar o aminoácido que este codão irá codificar! Assim, o
tRNA pode emparelhar com 2 ou mais codões que diferem apenas na 3ª base, reduzindo o
número de tRNAs necessário para descodificar os 61 codões (20 aminoácido) para 31 tRNAs.

Erros da Tradução
O processo de síntese proteica na sua generalidade é um processo que ocorrem sem erros, mas
se estes ocorrem, existe uma maquinaria celular capaz de reparar qualquer erro que tenha
ocorrido.

Na tradução, os erros que podem ocorrer baseiam-se na alteração na sequencia de aminoácidos

que codificam determinada proteína.

 Mutações significativas – mutações que alteram um codão de modo a este codificar um

diferente aminoácido
o Substituição de bases: alterações na primeira ou segunda base do codão,
resultam na incorporação do aminoácido errado.
o Alterações na 3º posição: pode ocorrer uma mutação silenciosa, se criar um
codão que especifica o mesmo aminoácido
o Alterações na incorporação de aminoácidos: pode criar uma mutação neutra
se a incorporação ocorrer com um aminoácido com as mesmas características
químicas
 Mutações non-sense – mutação que
altera um codão de modo a este
codificar um codão stop, resultando
na produção de péptidos sem
função ou com função alterada
 Frame shifting – Eliminações de
algumas bases, alterando a
sequência de aminoácidos

40
Regulação da Tradução
Na transcrição, os mecanismos eram muito baseados na capacidade “proofreading” das enzimas
componentes do processo. Em relação à tradução, a regulação deste processo ocorre
praticamente na fase de iniciação da tradução.

 Actividade do complexo cap-binding

 Processo de scanning do mRNA
 Reconhecimento do codão de iniciação

Esta regulação pode ser geral ou específica para um determinado mRNA:

 Geral (ocorre para todos os mRNAs):

o Modificações dos factores de iniciação
o Interacção competitivas
o Ausência de nutrientes (estímulo externo), infecções virais, hormonas
 Específico (ocorre para determinados mRNAs):
o Inexistência de controlo geral
o Scanning-initiation
o Existem estruturas secundárias (ORF) que se ligam ao RNA, interferindo com o
cap-binding complex.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3610329/ - (este artigo explica bem os vários

mecanismos de regulação da tradução, aconselhava a dar uma vista de olhos, os tópicos que
aqui estão mencionados, estão bem explicados neste artigo)

Inibidores da Tradução
É necessário compreender bem os mecanismos da síntese proteica para compreender onde
“atacá-lo” se quisermos provocar a sua inibição. Normalmente, as substâncias que inibem a
síntese proteica inibem a acção do ribossoma, mas também podem actuar em praticamente
todas as fases e componentes.

Inibidor Mecanismo de acção

Cloranfenicol/Macrólidos Inibe a actividade da peptidil-transferase
Estreptomicina Impede a transição iniciação-elongação
Neomicina Actividade semelhante à estreptomicina
Tetraciclina Impede a ligação do aminoacil-tRNA
Eritromicina Inibe a translocação
Toxina da Difteria Inibe um factor de elongação
Cicloheximida Inibe a translocação
Ricina Provoca a clivagem de mRNA
Puromicina/Macrólidos Induz a terminação prematura das cadeias
peptídicas
Aminoglicosidos Inibem o proofreading

41
miRNA: a sua importância
O miRNA é uma molécula pequena de RNA não-codificante cuja função baseia-se na regulação
da expressão genética ao nível de modificações pós-transcrição. Em vez de serem traduzidos
para proteínas, o ssmiRNA – single stranded miRNA liga-se a mRNAs interferindo com o
processo de tradução. 1/3 dos genes codificados são regulados pelo miRNA.

Recordando o processo de síntese de um miRNA: (o seu processo de síntese já foi falado na

parte do processamento dos vários tipos de RNA)

Portanto, a maioria dos genes de miRNA deriva de unidades de tradução independentes.

Explicando o que foi dito anteriormente, os miRNAs são transcritos de regiões de longas
moléculas de RNA com mais de 1000 nucleótidos chamados de pri-miRNA (primary miRNA).
Estes são depois processados pelo Drosha, resultando num miRNA de entre 70 a 100 nucleótidos
em forma de gancho – pré-miRNA (pré-miRNA). Estes são então exportados para o citoplasma
pela Exportin-5.

No citoplasma, o Dicer, interagindo com outras proteínas conservadas, as argonautes, cliva o

pré-miRNA originando uma cadeia dupla de miRNA. Este é então processado, resultando na
estabilização de uma cadeia (miRNA maturo) e eliminação de outra.

Após a formação do miRNA maturo estes são transferidos para as argonautes, num miRISC –
miRNA-induced silecing complex, servindo de guias para o silencing do RNA. É este complexo
que actua no mRNA. (Tenham em atenção que o miRNA actua no mRNA, ou seja, antes de este
ser traduzido)

42
Mecanismos de acção do miRNA
Os miRNAs conseguem reduzir a expressão genética através de vários modos e utilizando várias
vias. Estes actuam na forma de complexos efectores: miRISC ( com miRNPs associadas). Tal
como já foi dito em cima, o miRNA actua, sobretudo, sobre o mRNA. Uma das características
essenciais para que isto aconteça baseia-se no emparelhamento imperfeito de bases do mRNA
por parte do miRNA, este reconhecimento de bases pode ter vários efeitos, entre eles, a própria
excisão do mRNA ou o silenciamento do gene (se a região reconhecida for uma UTR –
untranslated region).

Esta associação pode ocorre em diferentes fases da síntese proteica. (A imagem abaixo traduz
o que acontece quando o miRNP se associa ao mRNA em diferentes fases da expressão genética)

Resumindo um bocado o que foi dito até agora, os miRNAs funcionam via emparelhamento de
bases com o mRNA. Estas moléculas de mRNA são silenciadas por um destes processos:

 Clivagem da cadeia de mRNA

 Destabilização do mRNA através do encurtamento da sua cauda poli adenilada
 Tradução menos eficaz

Os miRNAs assemelham-se aos siRNAs – small interfering RNAs do iRNA – RNA interference,
excepto que os miRNAS derivam de regiões do RNA transcriptas mais pequenas do que as dos
siRNAs.

Os miRNAs encontram-se bem conservados tanto nas plantas como nos animais e existem
diferenças no mecanismo de acção destes em cada um deles.

43
Nas plantas, o miRNA têm um emparelhamento quase perfeito com os mRNAs alvos, o que induz
à repressão genética por degradação deste. Por outro lado, nos animais, os miRNAs têm a
capacidade de conhecer o mRNA usando 6/8 (região seed) na extremidade 5’ deste, que não
não tem um grau de emparelhamento suficiente para induzir a clivagem.

Relação entre o miRNA e o siRNA

Agora nesta última parte falei do siRNA e ainda não tinha falado deste género de RNA. Fazendo
uma pequena introdução, o siRNA – small interference RNA é uma molécula de RNA pequena,
com cadeia dupla, que tem como função principal ser a componente principal da via do RNA de
interferência (RNAi), interferindo na expressão de genes específicos. Esta via tem como
objectivo a inibição da tradução, ocorre portanto após a transcrição. (ponto de informação: este
RNAi não é um tipo de RNA mas sim
um método de regulação da
expressão génica).

Agora sim, com o que já sabemos do

miRNA e do siRNA podemos
comparar estes dois. Dum modo
geral, podemos dizer que se houver
uma complementaridade perfeita
entre a cadeia de miRNA e a de
mRNA, a via utilizada é a de siRNA.
Por outro lado, uma
complementaridade imperfeita leva
a uma repressão de tradução.

44
As principais diferenças entre os miRNAs e os siRNAs estão evidenciadas na tabela em baixo:

microRNAs
Sempre endógenos
Derivam de loci genómicos diferentes dos
genes reconhecidos
Formados a partir de RNA local em forma de
gancho
Altamente conservado entre espécies
Processado no núcleo pelo Drosha e no
citoplasma pelo Dicer
Desempenha funções quer de supressão da
síntese proteica quer de clivagem do mRNA
siRNAs
Pode ser endógeno ou exógeno
Normalmente derivam de mRNAs,
transposões ou vírus
Formados de longas moléculas de dsRNA
Raramente conservado
Processado no citoplasma pelo Dicer
Desempenha funções pela clivagem do
mRNA

Funções do miRNA
Estes mecanismos de regulação produzem vários resultados em vários aspectos da maquinaria
celular:

 Controlo da proliferação celular e da morte celular

 Regulação de eventos programados
 Regulação da embriogénese e da diferenciação
 Papel funcional no envelhecimento, sinalização celular e cancro
 Controlo do desenvolvimento das folhas e das flores nas plantas

Os miRNAs têm como alvo importantes proteínas reguladoras envolvidas na apoptose e nas vias
de sobrevivência. Em alguns casos são capazes, por si só, de induzir a apoptose ou a
sobrevivência. Uma desregulação dos miRNAs envolvidos nos processos vitais pode levar a um
mecanismo de iniciação de patogenicidade de muitos cancros humanos. É daqui que surge o seu
atractivo alvo terapêutico.

microRNAs oncogénicos e supressores de tumor

Alguns miRNAs podem regular a proliferação celular e apoptose, dois processos essenciais na
formação de um tumor, funcionando como oncogenes ou como supressores de tumores.
“Overexpressed” miRNAs em cancros podem funcionar como oncogenes e promover o
desenvolvimento regulando negativamente genes supressores de tumor e/ou genes que
controlam a apoptose. “Underexpressed” miRNAs funcionam como supressores de tumor e
inibem a formação de cancros regulando oncogenes e/ou genes que controla a proliferação
celular.

45
Terapêutica com microRNAs

Esta imagem resume os papéis que um miRNA pode desempenhar:

46
Resumindo um bocado a imagem que está na página anterior:

 Anti-miRNA: impede a acção excessiva do miRNA

 miRNA-mask: actua como protector “mascarando” o sítio de ligação do miRNA
bloqueando a sua função
 miRNA sponges: cria vários sítios de ligação artificiais de miRNA
 miRNA mimics: introdução de double stranded miRNA mimetics, equivalente ao
produto Dicer endógeno e analógo estruturalmente ao siRNA

Para terminar este tema convém só evidenciar as vantagens deste tipo de terapia genética:

 miRNAs regulam muitos componentes da mesma via/processo celular

 Efeito duradouro
 O alvo é definido
 Eficácia in vivo

(Podem dar uma vista de olhos aos slides das aulas para entenderem melhor a componente
terapêutica do miRNA, eu decidi pôr na sebenta uma generalização desta coisa toda, rezem para
que a prof não pegue muito nisto, mas se tiverem tempo de estudo, Google it amigos)

47
Direccionamento e Degradação de Proteínas
Após vermos os mecanismos todos de síntese de proteínas e seus mecanismos reguladores,
chegamos a uma pergunta: o que é que acontece às proteínas?

Endereçamento proteico
A distribuição de proteínas codificadas no núcleo de células eucariotas segue duas vias
principais:

 Transporte pós-tradução: proteínas destinadas a permanecer no citosol ou a ser

incorporadas no núcleo, na mitocondria ou em
peroxissomas são sintetizadas nos ribossomas
livres e libertadas para o citosol
 Transporte simultâneo à tradução: proteínas
destinadas à secreção ou à incorporação no RE,
complexo de golgi, lisossomas ou membrana
plasmática são transferidas para o RER enquanto
são traduzidas nos ribossomas membranares; as
proteínas entram no RER sendo depois
transportadas por vesículas até ao complexo de
golgi, onde se deslocam para a superfície da célula
em vesículas scretoras que se fundem com a
membrana plasmática para libertar o seu conteúdo
para fora da célula

48
Resumindo a imagem da página anterior que traduz as vias de transporte de proteínas após a
sua síntese…

Os ribossomas que se encontram a sintetizar cadeias polipeptídicas crescentes são

direccionadas para o RE por uma sequência sinal. Depois de completada a tradução no RE, as
proteínas são transportadas por vesículas para o complexo de Golgi, onde são processadas e
organizadas, sendo depois transportadas para o seu destino.

Em relação à síntese de proteínas que não possuem sequência sinal para o RE, quando a síntese
destas é finalizada nos ribossomas livres, as proteínas são libertadas para o citosol. As que
contem uma sequencia sinal para um organelo específico são direccionadas para a mitocondria,
cloroplasto, peroxissoma ou núcleo.

Normalmente, as proteínas das mitocôndrias e dos cloroplastos passam as membranas externa

e interna para a matriz ou espaço estromal, respectivamente. Algumas permanecem aí e outras
seguem para outros compartimentos. Ao contrário das proteínas das mitocôndrias e
cloroplastos, que são importadas antes do folding estar completo, as proteínas peroxissomais
atravessam a membrana completamente agregadas. As proteínas entram no núcleo sob a forma
de proteínas ribonucleicas, e através dos poros nucleares.

Modificações pós-traducionais
As modificações pós-traducionais baseiam-se em modificações, geralmente, enzimáticas das
proteínas durante ou após a sua síntese. Estas transformam as proteínas em produtos maturos,
importantes na sinalização celular. Estas modificações podem ocorrer na cadeia de aminoácidos
ou na parte C-terminal ou N-terminal. A fosforilação é o mecanismo mais comum de PTM –
post-translational modification.

Para algumas proteínas, a remoção da sequência sinal para o RE no grupo N-terminal da cadeia
crescente é a única clivagem proteolítica necessária para activar a proteína. No entando,
algumas proteínas são sintetizadas como precursores inactivos – pró-proteínas. Estas
necessitam de posterior processamento proteolítico para originar a forma activa da proteína.

Portanto, estas modificações pós-traducionais tem como objectivo a adequação da proteína às

suas funções, promovendo a sua activação. Estas podem ocorrer durante ou depois das tradução
e incluem modificações covalente de resíduos de aminoácidos ou quebra de ligações peptídicas.

 Remoção do N-terminal
 Remoção da sequência sinal
 Adição de grupos prostéticos
 Proteólise de precursores inactivos
(zimogénios e pró-proteínas)
 Formação de pontes dissulfito
 Reacções de fosforilação,
carboxilação, hidroxilação,
metilação, glicosilação, sulfação,
acilação, prenilação.

49
Podemos tomar como exemplo de uma modificação pós-
traducional, o processamento proteolítico por clivagem da
insulina. O precursor da insulina, pré-pró-insulina, contém
uma sequencia sinal para o RE, que é removido durante a sua
transferência para o RE, originando um segundo precursor –
pró-insulina. Esta vai ser convertida a insulina pela remoção
proteolítica de um péptido interno e pela formação de pontos
dissulfito.

No programa foram dados como dois exemplos de

processamentos proteico, o processamento contínuo da pró-
albumina e o da secreção regulada da pró-insulina. Este
processo inclui endoproteases que clivam as sequencias de
dois aminoácidos básicos consecutivos.

No caso da pró-albumina, a endoprotease furina actua em

precursores de proteínas destinadas à secreção.

No caso da pró-insulina, duas

endoproteases PC2 e PC3, actuam
em precursores de proteínas
reguladas destinadas à secreção.

O processamento final de muitas

destas proteínas é catalisado por uma
carbopeptidase que remove
sequencias de dois aminoácidos
básicos consecutivos no C-terminal
de um polipéptido.

50
Folding Proteico
O folding proteico é o processo pelo qual uma proteína passa até atingir a sua conformação
funcional. Cada proteína, após a sua síntese, existe numa forma desenrolada, esta conformação
contém uma falta de estabilidade. Ocorre uma
interacção entre os aminoácidos para produzir uma
estrutura tri-dimensional – estado nativo. Esta
conformação é determinada pela sequência de
aminoácidos- Dogma de Anfinsen.

O processo de “folding” começa durante a

tradução, este é levado a cabo com ajuda de
proteínas especializadas – chaperones.
Normalmente este mecanismo começa
primeiramente com a formação de estruturas
secundárias (mais simples) para a formação de
estruturas quaternárias (mais complexas).

CHAPERONES

As chaperones são proteínas que assistem as

reacções covalente em que se baseia o processo de
folding proteico. Uma das suas principais funções é
prevenir que uma proteína não se torne
disfuncional, contrariando a sua agregação. É por
esta razão que estas são chamadas “heat shock proteins”, pois não são funcionais em condições
de temperatura, e a tendência de agregação vai aumentando à medida que esta também
aumenta.

O folding é um processo espontâneo, influenciável pelas condições ambientais, independente

de energia, este normalmente é guiado por interacções hidrofóbicas, formação de pontes de
hidrogénio e forças de van der Waals.

Agregação proteica

Este fenómeno anda em conjunto com o folding proteico, pois em certas condições, as proteínas
não entram em processo de folding mas sim de agregação.

A cadeia polipeptídica não agregada (U) pode adquirir um estado intermediário (I) parcialmente
agregado antes de assumir o estado nativo (N). A cadeia polipeptídica e o seu intermediário
parcialmente agregado podem constituir agregados desorganizados ou protofibras e fibras
amiloides, por um mecanismo de nucleação e crescimento.

51
Existe um equilíbrio entre os intermediários monoméricos que origina o núcleo de agregação.
Há uma associação sequencial ao núcleo de agregação, que termina com a formação do
polímero (fibra). A formação de uma fibra amiloide a partir de um precursor proteico solúvel
segue os seguintes passos:

 A proteína precursora é convertida num intermediário amiloidogénico

 Os intermediários agregam-se formando protofibras e consequentemente fibras
amiloides

52
Estabilidade Proteica
Como vimos em cima, as proteínas são bastante susceptiveis às condições externas. Daí que o
seu armazenamento necessita de vários cuidados:

 Temperaturas acima de 37ºC causam desnaturação

 Pequenas moléculas reactivas causam oxidação, desaminação, glicação, nitrosilação, etc
 Enzimas que possam alterar proteínas, como protéases e quinases
 Sais (dissociação) ou ácidos gordos (solubilização)
 Proteína desagregadas, que ligam a outras e funcionam como cadeias polipeptídicas
crescentes

Degradação de Proteínas
Os níveis de proteínas nas células não são só regulados pela sua síntese, mas também pela sua
degradação, tendo a última um importante papel na regulação celular. Assim, proteínas
defeituosas ou danificadas são rapidamente reconhecidas e degradadas pelas células, evitando
possíveis consequências por erros durante a síntese proteica.

A degradação proteica pode ter lugar dentro da célula ou fora desta. Esta processa-se por
clivagem proteolítica onde a proteína é clivada em pequenos péptidos e aminoácidos.

Proteólise Intracelular

A proteólise é o processo feito por proteases que catalizam a quebra de ligações peptídicas. As
protéases podem ser: endopeptídase (quebram qualquer ligação peptídica) e exopeptidases
(quebram ligações peptídicas no C-terminal ou no N-terminal do péptido). Podem ser
classificadas de acordo com a especificidade para o substrato (protéases de serina, de aspartato,
de cisteína e metaloproteases)

53
Vias de Degradação de Proteínas
Nas células eucariotas existem duas vias principais de degradação de proteínas: via ubiquitina-
proteassoma e a proteólise endolisossomal.

Via da Ubiquitina-Proteassoma

É a principal via selectiva de degradação proteica em células eucariotas, utilizada para a

degradação de proteínas citosólicas e nucleares, através da sua marcação com ubiquitina.

PAPEL DA UBIQUITINA

É uma proteína com cerca de 70 aminoácidos, extremamente estável com o calor. Liga-se às
proteínas no grupo amino da cadeia letral de um residuo de lisina. O seu C-terminal liga-se à
proteína que vai ser degradada por uma ligação isopeptídica. As cadeias poli-ubiquitinas
formam-se a partir da adição de moléculas de ubiquitina ao resíduo de lisina. Estas cadeias de
proteínas são reconhecidas e degradadas por um complexo multiproteico – proteassoma. A
ubiquitina é libertada no fim deste processo para ser usada noutro ciclo. Este processo requer
ATP.

MECANISMO

O processo de ubiquitinação ocorre de acordo com 3 etapas fundamentais:

1. Activação da ubiquitina pela enzima activadora de ubiquitina (E1), que leva à formação
de uma ligação tio-éster entre um resíduo cisteína de E1 e a C-terminal da ubiquitina
2. Trans-acilação para resíduo de cisteína de E2 – enzima conjugadora de ubiquitina, da
qual existem pelo menos 10 isoformas, apresentando especificidade em relação à
função da ubiquitinação
3. A E3 (ubiquitina-proteína ligase) é uma enzima chave pela sua especificidade face ao
substrato proteico, catalisa uma ligação isopeptidica entre o resíduo lisina da proteína-
alvo e o C-terminal da ubiquitina.

Há enzimas E2 que transferem

ubiquitina para proteínas básicas,
como as histonas, na ausência da
enzima subsequente (E3). A E3
possui dois domínios que conforme
o que estiver activado vai processar
o passo final da ubiquitinação de
maneiras diferentes. Este processo
ocorre por intermédio de um
complexo enzimático.

54
A via da ubiquitina/proteassoma degrada centenas ou milhares de proteínas, incluindo
proteínas reguladoras ou com folgding imperfeito. O substrato liga-se ao proteossoma através
de receptores para a ubiquitina ou de proteínas adaptadoras de partícula reguladora – RP. Esta
normalmente associa-se com ambas as proteínas poliubiquinadas e unidades proteassómicas
específicas.

O substrato é clivado e a ubiquitna é reciclada por DUBs – deubiquintinylating enzymes, na

partícula reguladora do proteassoma. As ATPases da partícula reguladora desdobram e
translocam o substracto para a CP – core particle proteassome, para ocorrer a clivagem, antes
da “descarga” de pequenos péptidos.

PAPEL DO PROTEOSSOMA

O proteassoma 26S é um complexo de proteínas capaz de degradar praticamente qualquer

proteína em oligopéptidos de 7 a 9 aminoácidos com consumo de ATP. O complexo reconhece
especificamente proteínas ubiquinadas, excepto uma: a ornitina descarboxilase proteolisada
associada à antizenzima do seu inibidor. O equivalente nos procariotas ao proteossoma 26s é o
complexo pan 20s.

O proteossoma 26S é constituído por um complexo proteico catalítico central chamado 20S,
preso por dois lados a complexo reguladores 10S. O complexo 20S, por sua vez, é formado por
2 anéis α e 2 anéis β, na sequencia α-β-β-α. Cada anel é formado por 7 subunidades distintas,
sendo os anéis α estruturais e os anéis β catalíticos. Diferentes subunidades β realizam
diferentes clivagens da proteína. As subunidades α estabilizam as unidades β e ligam o complexo
19S. O proteossoma 26S tem um formato de tubo, com duas entradas nas extremidades 19S.
Um subcomplexo da 19S ancora a cadeia de poliubiquitina, por vezes com a ajuda de proteínas
auxiliadoras, e anexa-se à superfície da 20S, usando energia para desenrolar a proteína e
preparar o canal que leva à câmara proteolítica de 20S.

55
O complexo 20S mantém as protéases no interior do compartimento proteossomico. Este possui
3 locais activos para a degradação de proteínas, estando um total de 6 locais activos nos anéis
β.

O complexo 19S é o complexo regulador

e possui 18 subunidades. Tem uma
porção inicial onde se dá a ligação do
substrato proteico ubiquinado.
Apresenta uma porção junto das
subunidades α do complexo 20S,
responsável pelo desenrolamento da
proteína através de um processo ATP-
dependente. Possui ATPases que
translocam a proteína em direcção à
subunidade 20S de modo a ser
degradada.

PAPEL DO ATP

O ATP tem um papel muito importante na regulação da degradação proteica, principalmente na

organização do complexo 19S. Desta forma, aquando da ligação do ATP, a “porta” do canal abre-
se e dá a passagem para o complexo 20S. Na ausência de ATP (presença de ADP) esta passagem
não é possibilitada.

(Não confundam protéases com o proteossoma, as protéases fazem “cortes”, os proteossomas

degradam progressivamente em pequenos péptidos)

PROTEÍNAS QUE VÃO SER AFECTADAS POR ESTE MECANISMO

 Produtos oncogénicos e supressores de tumor: p53 e Mdm-2 (que degrada o p53); c-

fos, c-jun, c-Mos)
 Reguladores do ciclo celular: inibidores da CDK (p27, p21, ciclinas, etc)
 Reguladores da transcrição: Ikb e NF-kb (controladores da inflamação); HIF1 (controlo
da resposta à hipoxia); proteínas STAT (controlo da resposta ao interferão); β-
cateninas(cruciais na neoplasia)

As proteínas que não sofreram folding ou outras proteínas aberrantes devem ser eliminadas
para prevenir a agregação e toxicidade. A c-fos e a c-Myc são degradadas pela via da ubiquitina-
proteossoma, com padrões temporais de degradação distintos.

O NF-kb é activado quando o proteossoma degrada a proteína inibidora Ikβα. Muitos sinais
extracelulares podem induzir a activação do NF-kb, estes sinais activam o complexo I-kb quinase
que fosforila dois resíduso serina no N-terminal. Quando a Ik-b está fosforilada, ela é
ubiquitinada e degradada pelo proteossoma. A remoção da I-kb revela os locais de ligação ao
núcleo nas subunidades p50 e p60 da Nf-kb. A NF-kb entra no núcleo, liga-se a sequencias
especificas de DNA e regula a transcrição. – É um caso duma proteína reguladora afectada pelo
mecanismo da ubiquitina/proteossoma.

A importância da degradação por este sistema de proteínas que não tem o folding correcto é
fulcral na prevenção de doenças neurodegenerativas. Várias delas são caracterizadas pela
presença de corpos de inclusão de proteínas com o folding errado.

56
Proteólise Endolisossomal

A proteólise endolisossomal (não selectiva) ocorre nos lisossomas das células eucariotas,
contendo várias enzimas digestivas. As principais enzimas dos lisossomas são hidrólases ácidas
porque actuam ao pH ácido dos lisossomas mas não inactivas ao pH neutro do citosol:

 Fosfatase ácida
 Lípases
 Esterases
 Fosfolipases
 Ribonucleases e desoxirribonucleases
 Galactose e glucose amenidade
 Glucosidade
 Glururonidade e hialuronidade
 Aril e condrosulfatase
 Catepsina (A,B,D,H,L e S)

Esta via é utilizada para degradar

proteínas membranares da
própria célula, proteínas
extracelulares apreendidas por
endocitose e destruição de
bactérias por fagocitose. Para
serem degradadas por esta via,
as proteínas celulares tem que
ser incorporadas nos lisossomas.
Uma via para esta incorporação,
a autofagia, envolve a formação
de vesículas – autofagossomas,
que incorporam as proteínas e
que, então, se fundem com os
lisossomas. Aí, as enzimas lisossimas digerem o seu conteúdo.

(esta imagem resume um bocado o que foi dito até agora sobre o endereçamento proteico)

57
Vias de Apresentação de Antigénios
As duas vias abordadas de degradação proteica desempenham papéis fundamentais na
apresentação de antigénios. O proteossoma é usado como sistema de informação para a
presença de proteínas anormais. Em situações que o exijam, o SI altera o proteossoma com o
objectivo de melhorar a sua eficiência face a vírus e bactérias. No tratamento de inflamação com
interferão-gama são formados novos proteossomas (imunoproteossomas) com diferentes
locais activos. A eficiência para gerar péptidos para apresentação de antigénio aumenta
bastante.

Inibição do Proteossoma
Os inibidores do proteossoma são de elevada importância no tratamento de cancros, na medida
em que inibem a degradação proteica. Nestas patologias, a degradação proteica encontra-se
aumentada, uma vez que já há necessidade metabólicas superiores. Um exemplo de fármaco
aprovado para o tratamento do mieloma foi o PS-341, ele inibe o NF-kb, estabiliza as proteínas
reguladoras do ciclo celular e induz a apoptose.

58
 Organização e Funcionamento
Subcelular
Transporte Biológico
(Esta parte da matéria é um bocado matéria do secundário e/ou bases que já têm doutras
cadeiras do curso, portanto vai estar um bocado copy-paste da sebenta que já há)

Tal como já sabemos, existem vários tipos de gradientes nas células:

Permeabilidade das bicamadas lipidicas

A permeabilidade selectiva das membranas para pequenas moléculas permite que a célula
mantenha a sua composição interna.

 Moléculas polares difundem-se muito lentamente para dentro da célula.

 As moléculas não-polares difundem-se mais rapidamente, pois conseguem dissolver-
se na região lipídica da membrana (região não-polar)

Concluindo, o aumento da lipossolubilidade de uma substância aumentará o número de

moléculas dissolvidas na
membrana lipídica e com isso
aumenta o seu fluxo através
desta.

59
Sistemas de Transporte Passivo
O transporte de pequenas moléculas com carga faz-se por transporte passivo, mais
precisamente por difusão simples. Este faz-se a favor do gradiente químico, utilizando este
gradiente como fonte de energia para o transporte.

As moléculas polares grandes fazem-nos por difusão facilitada. Este transporte faz-se através
de proteínas membranares específicas que actuam como transportadoras e que vão determinar
a permeabilidade selectiva das biomembranas. As proteínas transportadoras formam um canal
hidrofílico através da bicamada lipídica. A energia de activação para o transporte baixa visto que
as moléculas passam a ter acesso a um meio de passagem facilitado. Por este meio podem
passar moléculas como açúcares, aminoácidos, nucleósido, iões, etc.

Difusão facilitada

O processo desta já foi descrito

em cima.

Existem dois tipos de proteínas

transportadoras da membrana:
as proteínas de canal (canais
proteicos) e as carrier proteins
ou proteínas transportadoras.

As carrier proteins ligam-se selectivamente a moléculas especificas transportando-as, agindo

como enzimas para facilitar a passagem de moléculas específicas através das membranas. As
carrier proteins aquando da ligação sofrem mudanças conformacionais que abrem os canais
através dos quais a molécula a ser transportada pode passar para a membrana e ser libertada
do outro lado. Este transporte acontece de acordo com o gradiente químico.

Já os canais proteicos formam poros abertos na membrana, permitindo a difusão livre de

moléculas de tamanho e carga apropriada. Permitem a passagem de iões inorgânicos como Na+,
K+, através das membranas. Este tipo de transporte é muito rápido e bastante selectivo. Podem
ser activado por neurotransmissores ou por voltagem. Estes poros não estão permanentemente
abertos, eles alternam entre o estado aberto ou fechado em resposta a sinais extracelulares,
permitindo à célula controlar o
movimento de iões através da membrana
– regulação do potencial de membrana.

60
Patch Clamp

Nos anos 80 desenvolveu-se uma técnica que permite monitorizar as propriedades de canais
iónicos individualizados – patch clamp. Baseia-se na colocação da ponta de uma pipeta de vidro
numa pequena região da superfície da
membrana plasmática e aplicação de
uma leve sucção, de modo a que um
retalho de membrana fique selado nas
bordas da pipeta e permaneça aí
quando a pipeta é tirada. Visto que os
iões têm uma carga eléctrica, o fluxo de
iões através de um canal iónico nesse
retalho produz uma corrente eléctrica
que pode ser monitorizada.

Nesta técnica verificou-se que o fluxo

decorrente era intermitente,
comprovando a teoria de que ocorre
uma abertura e um fecho do canal iónico, a amplitude da corrente depende do grau de
permeabilidade do canal.

Ionóforos

A permeabilidade da membrana pode ser aumentada utilizando esta moléculas. Os ionóforos

são pequenas moléculas hidrofóbicas que se dissolvem na bicamada e aumentam a
permeabilidade a iões. Estes podem ter transportadores de iões (esquerda) ou formadores de
canais (direita).

Gradientes de iões e Potencial de

membrana
Todas as células em condições de repouso têm
uma diferença de potencial entre um lado e o
outro das suas membranas plasmáticas, com o
lado de dentro negativamente carregado em
relação ao seu lado de fora – potencial de
membrana. A magnitude do potencial de
membrana em repouso é de -60mV.

61
O potencial de membrana pode-se
transformar em potencial de acção.
Estes potenciais de acção ocorrem
devido à existência de canais
dependentes de voltagem – canais
de sódio e de potássio são deste
género. À medida que a célula
despolariza, os canais de sódio
abrem-se, e move o potencial de
membrana em direcção ao potencial
de equilíbrio do sódio. O potencial
de acção termina quando os canais
de sódio se fecham e os canais de
potássio se abrem, reestabelecendo
a condição de equilíbrio.

A informação nas células nervosas é

codificada por sinais eléctricos –
correntes iónicas de Na+ (que entra)
e de K+ que sai e provocam
alterações no protencial de membrana, esta informação é transmitida ao longo da célula
nervosa provocando a propragação do estímulo nervoso.

Selectividade dos canais de Na+

Os canais de sódio fazem parte das proteínas membranares, conduzindo iões de sódio através
da membrana plasmática. Estes são classificados como canais dependentes-voltagem. Em
células excitáveis, os canais de sódio são os responsáveis pelos potenciais de acção.

Recordando o que já sabem de fisiologia, antes de um potencial de acção se iniciar, a membrana

encontra-se no seu potencial de repouso, durante este os canais de sódio encontram-se no seu
estado desactivado. Em resposta à corrente eléctrica (potencial de acção), os canais de sódio
abrem-se, permitindo a passagem de iões de sódio para dentro da célula – célula despolarizada.

62
Os poros dos canais de sódio contem um filtro de selectividade feito de resíduos de aminoácidos
carregados negativamente, que atraem iões positivos de sódio e mantêm de fora iões
carregados negativamente como o Cl-. A selectividade destes canais apenas permite a passagem
de iões de sódio solvatados, ou seja, num solvente, neste caso a água. Os iões de potássio, por
serem maiores, não conseguem passar entre os poros destes canais.

Selectividade dos canais de K +

Os canais de potássio permitem a condução de

iões de potássio através de um gradiente
químico, rapidamente e selectivamente.

Os iões de potássio removem a camada de

hidratação do ião quando este entra no filtro de
selectividade. A sua selectividade deve-se à
presença de grupos carbonilo no interior do
poro, estes permitem que os iões entrem
desidratados, sem solvatação, ou seja, uma
solvatação iónica não é favorecida nestes
canais, que é o que acontece com os iões de
sódio.

Sistemas de Transporte Activo

Estes sistemas transportam substâncias contra o seu gradiente químico utilizando uma fonte de
energia para este transporte. Temos dois tipos de transporte activo: primário e secundário.

Transporte Activo Primário

Este usa directamente a energia metabólica das moléculas transportadas pela membrana. A
maior parte das enzimas que usam este tipo de transporte são ATPases transmembranares.
Uma ATPase universal é a bomba de sódio-potássio, que ajuda à manutenção do potencial da
célula.

Este mecanismo de transporte activo pode recolher energia de outras fontes: energia de redox
e energia de fotões (luz). Um exemplo de transporte activo primário que usa a energia redox é
aquele utilizado na cadeia transportadora de electrões nas mitocôndrias que usa a redução de
energia do NADH para mover os electroes ao longo da cadeia. Um exemplo de transporte activo
devido à uma reacção de fotões é a utilizada na fotossíntese.

63
O transporte de iões hidrogénio contra o gradiente electroquímico usa a hidrólise de ATP. A
carrier protein sofre uma fosforilação e a ligação do ião de hidrogénio induz uma mudança
conformacional que leva ao transporte do ião de hidrogénio contra o seu gradiente.

Resumindo, as bombas utilizam como fonte de energia o ATP celular e acoplam o movimento
das espécies à hidrólise de 1 ATP, dando origem a gradientes iónicos nas células. Existem vários
exemplos:

 Bomba de Na+/K+: retira Na+ e introduz K+ nas células, criando gradientes. K+ está muito
concentrado no meio intracelular e o Na+ no extracelular
 Bomba de Ca2+: retira o ião cálcio do citoplasma
 Bomba de H+: retira H+ do citoplasma

BOMBA DE SÓDIO-POTÁSSIO

Para manter o potencial eléctrico da célula, esta precisa de uma baixa concentração de iões de
sódio e de uma elevada concentração de iões de potássio, dentro da célula.

Fora das células existe uma alta concentração de sódio e uma baixa concentração de potássio,
pois existe difusão destes componentes através de canais iónicos. Para manter as concentrações
ideiais dos dois iões, a bomba de sódio bombeia sódio para fora da célula e potássio para dentro
desta. Portanto, este transporte é contra o seu gradiente normal de concentração.

Uma consequência dos gradientes de sódio e de potássio é a propagação de sinais eléctricos no

nervo e no músculo – potenciais de acção. O papel da bomba é manter o equilíbrio osmótico e
manter o volume celular.

64
Transporte Activo Secundário

Este transporte baseia-se em sistemas dissipadores. Estes utilizam uma fonte de energia
secundário que deriva directamente da actuação das bombas. Dissipam gradientes iónicos
criados após a actuação das bombas, acoplando o
movimento a favor do gradiente desses iões ao
movimento contragradiente da espécie do substrato
a transportar. Este tipo de transporte pode ser:

 Sinporte – quando o ião e o substrato vão

na mesma direcção
 Antiporte – quando o ião e o substrato vão
em direcções opostas

Um dos exemplos deste transporte é o da glucose é

feito por transporte activo secundário utilizando a
energia produzida pelo gradiente de sódio (formado
pela bomba), para transportar contra o seu gradiente de concentração. Explicando isto melhor,
a glucose é transportada contra o seu gradiente de concentração devido à energia associado ao
transporte por difusão facilitada do sódio (que é transportado de acordo com o seu gradiente
de concentação).

Este sistema é responsável pela absorção de glucose no lúmen intestinal. Ao ligar-se transporta
1 molécula de glucose a cada 2 de sódio que são transportadas para o interior da célula. Este
transporte da glucose é um tipo de transporte sinporte, pois tanto a glucose como o sódio são
transportados de fora da célula para dentro.

65
Um exemplo de transporte antiporte é o transporte Ca2+/Na+ nas células cardíacas.

Durante o potencial de repouso, a concentração

extracelular de sódio é elevada, concentração essa
que é favorecida pela movimentação de acordo com
o seu gradiente de concentração. A bomba Ca2+/Na+
usa este mecanismo a seu favor, pois se há um
movimento antiporte, este movimento do sódio
para dentro da célula favorece a expulsão do ião
cálcio para fora da célula.

Durante o movimento de potencial de acção nas

células cardíacas, há um grande influxo de iões de
sódio para dentro da célula, aumentando a
concentração de sódio intracelular, provocando uma
inversão no mecanismo desta bomba, esta passa a
expulsar os iões para fora da célula e a provocar a
entrada de iões de cálcio.

Transporte de Água
Estes tipos de transporte transmembranares são importantes a vários níveis de regulação do
metabolismo corporal. Um dos mais importantes baseia-se no transporte de água ao nível dos
túbulos renais, favorecendo o equilíbrio ácido-base.

A reabsorção de água e de sódio é feita através de

canais de sódio e canais de água (aquaporinas). Já que
já falámos dos canais de sódio anteriormente, falta
apenas falar do mecanismo utilizado pelas
aquaporinas.

Aquaporinas

No rim existem aquaporinas que são um grupo de

proteínas membranares que formam canais através
dos quais a água se pode difundir. A existência destas
aquaporinas no rim é essencial para que haja
reabsorção de água, promovendo a reabsorção de
sódio também para manter o equilíbrio osmótico,
controlando, assim, o volume celular.

As aquaporinas formam tetrâmeros na membrana celular, onde cada monómero actua como
canal de transporte de água. As diferentes aquaporinas contem diferenças na suas sequencias
peptídicas, permitindo diferentes no tamanho dos seus poros. As APQ1 são selectivas para a
água, excluindo outros iões com diâmetro superior ao da molécula de água.

66
Sinalização Celular
A sinalização celular faz parte de um complexo sistema de comunicação que governa e coordena
as actividades e funções celulares.

Estes mecanismos de sinalização celular é feito devido à existências de vias de transdução de

sinal que se definem como uma série de eventos intracelular acoplados, activados pela ligação
de uma molécula sinalizadora a um receptor, que ocorre de forma sequencial de modo a
converter um sinal extracelular numa resposta celular.

Portanto, uma via de transdução de sinal passa por vários processos relacionados com
diferentes componentes, demonstrados no esquema em cima.

Num mecanismo de transdução de sinal, os sinais extracelulares são o primeiro passo para este
se iniciar, estes são moléculas sinalizadoras envolvidas na mediação de uma resposta celular ao
ambiente externo ou a outras células. Estes podem ser:

 Factores de crescimento
 Neurotransmissores
 Prostaglandinas
 Citocinas (interleucinas, interferões)

Estes sinais vão actuar sobre receptores intracelulares, estes têm na sua constituição proteínas
de sinalização intracelular, estas são moléculas sinalizadoras envolvidas na mediação da
resposta celular ao ambiente externo ou a outras células. Estas incluem: componentes proteicos
das vias de transdução de sinal e segundos mensageiros.

A sinalização através de sinais extracelulares (moléculas endógenas ou exógenas) ocorre através

de curtas distâncias (autócrina e parácrina) até distâncias longas (endócrina). Pode haver
sinalização directa célula a célula ou indirecta (as que já foram mencionadas)

67
Tipos de sinalização
Sinalização endócrina

As moléculas sinalizadoras – hormonas – actuam nas células

alvo localizadas longe do local de síntese – órgãos
endócrinos. Um exemplo desta sinalização é o do epidermal
growth factor – EGF – que pode interagir directamente com
os receptores de uma célula adjacente, mas uma vez
libertada, o EGF secretado actua como sinal endócrino.

Sinalização parácrina

As moléculas sinalizadoras libertadas por uma célula apenas

afectam as células alvo próximas desta. Um exemplo deste
tipo de sinalização é o mecanismo de condução de um
impulso nervoso de um neurónio para uma célula muscular
– sinapse. Este tipo de sinalização é mediado por
neurotransmissores e neurohormonas.

Sinalização autocrónica

As células respondem a sinais libertados por elas próprias.

Os factores de crescimento actuam baseando-se neste tipo
de sinalização. As células tumorais costumam produzir e
libertar factores de crescimento em excesso, que estimulam a proliferação inapropriada e
desregulada destas e das céulas normais adjacente.

Tal como foi dito em cima, os mecanismos de sinalização celular vão actuar nos receptores das
suas células alvo.

A resposta celular a uma determinada molécula sinalizadora extracelular depende da sua ligação
a um receptor específico. Alguns sinais podem desencadear respostas diferentes em diferentes
células-alvo, por interacção com diferentes receptores proteicos. Normalmente, os sinais
interagem com receptores similiares, que, contudo, desencadeiam respostas celulares
diferentes.

Exemplo da acetilcolina: esta causa contracção do músculo-esquelético, mas no músculo

cardíaco provoca o relaxamento deste e ainda provoca a secreção celular noutros componentes.

Tipos de Receptor
O receptor proteico pode estar localizado na superfície da célula-alvo, no núcleo ou no citosol.
A ligação do ligando inicia uma serie de reacções sequenciais que alteram as propriedades do
receptor que, por sua vez, sinaliza uma modificação na função celular. Alguns sinais ligam-se a
receptores de superfície celular e outros a receptores intracelulares.

68
Receptores Intracelulares

Um exemplo de células que utilizam este mecanismo são as

hormonas esteroides, que circulam com o auxílio de proteínas
transportadoras, estas difundem-se através da membrana e
ligam-se a receptores específicos localizados no citosol ou no
núcleo. O complexo receptor-hormona actua no DNA nuclear
de forma a alterar a transcrição de genes específicos. Como
exemplos disto temos os esteroides, tiroxina e o ácido
retinóico.

Receptores Superfície Celular

Estes são utilizados por moléculas que não se conseguem

difundir através da membrana plasmática – solúveis em água.
Estes moléculas podem ser de dois grupos: hormonas
peptídicas e as pequenas moléculas carregadas. Isto origina
uma alteração da concentração de segundos mensageiros,
activação de proteínas cinases ou modificação do potencial membranar. Como exemplo disto
temos a insulina, as hormonas do crescimento (hormonas peptídicas), a epinefrina, a histamina
(pequenas moléculas carregadas) e prostaglandinas.

A imagem em baixo generaliza um bocado os tipos de receptores celulares.

69
TIPOS DE RECEPTORES DE SUPERFÍCIE CELULAR

 Canais iónicos – o ligando consegue alterar a conformação do receptor, de forma a

haver passagem de iões específicos através deste, altera-se o potencial eléctrico da
membrana. Ex: receptor acetilcolínico da junção neuro-muscular
 Actividade enzimática intrínseca – activação da guanilato ciclase ou da proteína
fosfatase. Noutros receptores, a ligação activa proteínas cinase. Nestes 3 casos ocorre
dimerização e posterior activação dos receptores RTKs. A autofosforilação das RTKs
origina locais de ligação para várias enzimas. Estas enzimas dão origem a segundos
mensageiros. Ex: receptores para a insulina e muitos factores de crescimento
 Associados à proteólise – a clivagem proteolítica intramembranar do receptora activa
a proteína que, posteriormente, funciona como um factor de transcrição ou co-
activador para factor de transcrição nucleares. Ex: receptores no TNF-α, que activa o Nf-
kB e os receptores Notch que, uma vez, activados, libertam o seu domínio citosólico
 Ligados à proteína G – o ligando consegue activar a proteína G que activa ou inibe uma
enzima que origina um segundo mensageiro especifico. Ex: receptores da epinefrina,
da serotonina e do glucagon.

70
Em cima foram enunciados os vários receptores de superfície celular dum modo geral, estes
usam vários mecanismos para promoverem a resposta celular.

Receptores com actividade de Tirosina-Cinase

A maior parte dos RTKs existe em monómeros. Cada monómero tem 3 domínios:

 Extracelular: interage com o ligando específico

 Intramembranar
 Citosólico: é o que contem a actividade tirosina-cinase

Em bioquímica, uma cinase é um tipo de enzima que transfere grupos fosfato de moléculas como
o ATP até moléculas alvo especificas – fosforilação. Enzimas cinase que fosforilam aminoácidos
tirosina são as tirosina-cinases.

Quando um factor de crescimento se liga ao domínio extracelular de um RTK ocorre uma

dimerização, esta leva a uma rápida activação do domínio citoplasmático da cinase – auto-
fosforilação.

Este processo inicial da activação dos RTKs vai provocar a activação de várias vias de transdução
de sinal.

Activação da Proteína Ras

A proteína Ras é uma proteína associada à membrana e a sua activação é seguida da ligação de
uma hormona a um receptor tirosina-cinase. Após ocorrer os fenómenos de dimerização e a
auto-fosforilação dos resíduos de tirosina dos receptores, ocorrem os seguintes passos para
activação desta proteína:

 A proteína adaptadora GRB2 liga-se a uma fosfotirosina específica no receptor RTK

activado e também à proteína SOS.
 A proteína SOS interage com uma proteína Ras-GDP inactiva
 A actividade que a SOS tem de mudança nos nucleótidos de guanina promove a
activação do Ras-GDP a Ras-GTP e, finalmente, dissocia-se da proteína Ras activa.

71
Activação de MAPKs

As MAPKs são proteínas activadoras de

mitogénese. Após o processo inicial de
dimerização, autofosforilação e activação
do domínio citosolico dos RTKs, esta via
segue os seguintes passos:

 Ligação da GRB2 (proteína

adaptadora), pelo domínio SH2, a
uma fosfotirosina especifica no
receptor tirosina-cinase activado.
 Ligação da GRB2, pelo domínio SH3,
à proteína SOS que actua como um
factor de troca de nucleótidos de
guanina
 A proteína SOS interage com a
proteína RAS, que vai ser activada
pela troca de GDP por GTP.
 Um sinal complexo é transmitido,
que leva à activação da MAPL por
fosforilação dos resíduos de
treonina e tirosina.
 As proteínas MPAK activam
directamente factores de
transcrição no núcleo, por
fosforilação ou através da proteína
Rsk.

Activação da JAK-STAT

Via de transdução de sinal que promove a transcrição activando sequencias especificas no DNA.
Consistem em 3 componentes maioritários: receptor, “Janus kinase” e um “Signal Transducer
and Activator of Transcription” – STAT.

A ligação de citocinas activa e fosforila o receptor nos resíduos de tirosina. Isto faz com que as
proteínas JAK associadas ao receptor sejam activadas e, posteriormente, o STAT. Este activa,
directa ou indirectamente, factores de transcrição e sequencias especificas de DNA.

72
Antes de continuar na caracterização das várias vias de transdução de sinal, falta só caracterizar
as moléculas sinalizadoras que vão induzir uma resposta celular ao estímulo – segundos
mensageiros. (Decidi colocar os segundos mensageiros aqui pois a maior parte deles provêm de
activação de vias relacionadas com receptores acoplados a proteínas G)

Segundos Mensageiros
Consiste numa molécula sinalizadora cuja concentração aumenta, ou diminui, em resposta à
ligação de um ligando extracelular a um receptor da superfície celular. É capaz de mediar a
resposta celular a esse ligando. Segundos mensageiros mais comuns:

 AMPcíclico
 DAG (diacilglicerol)
 IP3 (inositol trifosfato)
 Ião cálcio

73
Receptores Acoplados a Proteínas-G
Há duas principais vias de transdução de sinal envolvendo receptores acoplados a proteínas G:

 Via do AMPc
 Via do Inositol-lípido

Um GPCR é activado por um sinal externo na forma de ligando. Esta ligação cria uma mudança
conformacional no receptor, causando a activação da proteína G. Esta é um heterodímero
constituídos por 3 subunidades: alfa, beta e gama.

Este tipo de receptores tem vários componentes, proteínas transmembranares (atravessam a

membrana citoplasmática e uma proteína efectora – adenilciclase; proteínas na superfície
citosólica (transducing proteins Gs, importante para transmitir o sinal).

A acção dos receptores associados a proteínas G baseia-se nos seguintes passos:

1. O ligando provoca uma alteração conformacional no receptor

2. O receptor liga-se à proteína G
3. O GDP ligado à Gs é substituído por GTP, havendo dissociação da subunidade α do
complexo
4. A subunidade Gs liga-se à adenilciclase, promovendo a síntese do segundo mensageiro

Do que foi dito em cima um dos passos importantes é a activação da Adenilciclase. Esta
promove a formação de uma forma activa da Gsα. A hidrólise de GTP a GDP é catalisada pela
própria Gsα. Se estiver com GTP, está activa e activa a adenilciclase. O domínio GβƳ inibe a
activação da adenilciclase.

A toxina colérica actua neste ponto, modificando irreversivelmente a Gs de tal modo que se liga
ao GTP mas não o consegue hidrolisar.

74
 (Esta imagem resume os mecanismos que podem regular a produção ou não de AMPc
bloqueando a activação da adenilciclase)

Um dos resultados deste processo destes receptores é a activação de segundos mensageiros,

tal como já foi dito anteriormente, um destes segundos mensageiros é o AMPc.

Via do AMPc

75
Os mecanismos iniciais da activação
desta via já foram descritos em
cima, tal como está desmonstrado
na imagem da página anterior, o
AMPc pode activar outras cinases –
PKA – protein kinase AMPc-
dependent.

Estas PKAs contem 2 subunidades

com locais de ligação para o AMPc –
R - e duas 2 subunidades catalíticas
– C. A activação de PKA dá-se pela
saída de R e da entrada das
subunidades C no núcleo.

Tal como há a via da adenilciclase

para a formação do AMPc, para a
formação do IP3, via do inositol-
lipido, primeiramente tem de
ocorrer a activação da fosfolipase C.

A fosfolipase C é análoga à adenilciclase, em termos funcionais e em termos estruturais. O

ligando pode dirigir-se a um receptor acoplado a uma proteína G e activar o PLC-β

Via do Inositol-lípido

76
Nesta via, o inositol-lipido – IP3 – sinaliza a via, havendo formação de IP3, DAG e cálcio. Após a
activação da fosfolipase C esta cliva o PIP2 a inositol trifosfato – IP3 e a DAG.

O IP3 difunde-se para o citosol e interage com canais de cálcio sensíveis ao IP3 na membrana
do RE, causando a libertação dos iões cálcios armazenados, este actua também como segundo
mensageiro. Este cálcio libertado associa-se à enzima calmodulina e activa outras proteínas que
respondem a este complexo ou que são activadas pela proteína cinase C.

Passando para outro tipo de sinalização celular utilizando receptores à superfície – clivagem
proteolítica

Sinalização por clivagem proteolítica

77
Estas vias de sinalização celular são importantes no metabolismo do organismo pois induzem
uma resposta celular. Ou seja, são importantes mecanismos para a regulação da maquinaria
celular. Vamos ver alguns exemplos de regulação utilizando estes mecanismos.

Regulação da Glicémia

Comparação entre insulina e glucagon

78
Regulação do Glicogénio pelo AMPc
Os níveis elevados de AMPc aumentam os níveis de glucose no sangue, actuando o catabolismo
do glicogénio e inibindo a sua síntese. Os níveis baixos de AMPc diminuem os níveis de glucose-
1-fosfato, inibindo o catabolismo do glicogénio e activando a sua síntese.

79
(Fiz esta parte demasiadas vezes a escrever e a tentar explicar isto, pelo meio desisti, mas as
imagens estão bem claras, basta entenderem bem o mecanismo de acção por segundos
mensageiros)

Sinalização Celular e Regulação do Ciclo Celular

Recordando as fases do ciclo celular,

80
Sinalização celular em G1

A sinalização da via MAPK é activada, activando por sua vez a transcrição de genes e proteínas
necessárias para a progressão do ciclo de G1 para S. Estes genes incluem um promotor da fase
S – S-MPF. Este é um complexo proteico que inclui uma ciclina, uma cinase dependente da ciclina
– cdk – a proteína 107, o factor de transcrição nuclear – E2F e proteínas supressoras tumorais
– pRB e p53.

Sinalização celular em G1-S

O controlo da transição nesta fase é feita pelo

S-MPF (ciclinas e cdks). A sua actividade é
regulada pela fosforilação/desfosforilação do
pRB. Quando está fosforilado (inactivo)
permite a activação do E2F. O pRB é fosforilado
por acção das MAPK.

81
Regulação do ciclo celular pelo pRb

Este actua como um intervlao para a

progressão do ciclo celular. A sua inactivação
activa os factores de transcrição necessários
para a progressão do ciclo celular. Este
continua na sua forma activa (desfosforilado)
através da acção da fosfatase p21.

Sinalização celular em S-G2

A transição entre S e G2 é
controlada pelo M-MPF. A
actividade é finalmente
regulada pela
fosforilação/desfosforilação
da cdk e pela proteólise da
ciclina.

82
Bases Bioquímicas duma Célula Nervosa

Sinapses e a transmissão do impulso

As sinapses são junções onde os neurónios passam sinais a células alvo, podendo elas ser outros
neurónios, células musculares e glandulares. Na maioria destas junções, o neurónio liberta
neurotransmissores químicos e ocorre uma sinape química que actua na célula alvo. Muito mais
raras, mas de uma funcionalidade mais simples, as sinapses eléctricas são aquelas em que o
potencial de acção é transmitido directamente e muito rapidamente da célula pré-sináptica para
a pós-sináptica.

Os sinais são transmitidos por uma sinapse

eléctrica em poucos segundos porque os iões
fluem directamente da célula pré-sináptica
para a pós-sináptica através de uma junção
gap. Os sinais transmitidos por sinapse
química demoram cerca de 0,5s. Este é o
tempo necessário para a secreção e difusão
do neutransmissor e resposta da célula pós-
sináptica.

Sinapse Química
Estas podem ser rápidas ou lentas,
excitatória ou inibitórias, podendo ainda exibir um sinal de amplificação ou de computação.

Nas sinapses excitatórias ou inibitórias, a acção do neurotransmissor promove ou inibe a

geração de um potencial de acção na célula pós-sináptica, por ligação do neurotransmissor a um
receptor excitatório ou inibitório, respectivamente.

 Excitatório: acetilcolina para receptores nicotínicos, glutamato para receptores NMDA

e não-MDMA, serotonina para receptores 5HT3
 Inibitório: acetilcolina para receptores muscarínicos, GABBA para receptores classe-A

Nas sinapses rápidas, a ligação do neurotransmissor causa uma mudança conformacional

imediata nos receptores. Estes são canais iónicos activados por ligando. Nas sinapses lentas, os
receptores dos neurotransmissores estão acoplados a proteínas G. O mesmo neurotransmissor
liga-se a muitos tipos de receptores.

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Mecanismo de libertação de neurotransmissores

As vesículas importam neurotransmissores do citosol usando um transportador por antiporte

H+/neurotransmissor. O baixo pH intravesicular, que é gerado por uma ATPase na membrana
da vesícula, possibilita a importação do neurotransmissor.

As vesículas, posteriormente, movem-se para a zona activa próxima da membrana plasmática,

ligando então a ela em locais definidos por interacção com proteínas específicas. Um aumento
do cálcio citosólico induz a fusão das vesículas com a mebrana e a libertação dos
neurotransmissores na fenda sináptica.

As proteínas das vesículas sinápticas são especificamente recuperadas por endocitose,

normalmente em vesículas revestidas por clatrina. O revestimento de clatrina é então
despolimerizado, originando vesículas que são do mesmo tamanho de vesículas sinápticas, que
será preenchidas com neurotransmissores.

Resposta estimulada pela Acetilcolina

A acetilcolina no musculo esquelético produz uma rápida despolarização pós-sinaptica. Os
receptores nicotínicos de acetilcolina nestas células são canais iónicos activados por ligando. A
ligação da acetilcolina abre o canal, permitindo a passagem tanto de sódio como de potássio.

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Estrutura do receptor nicotínico da acetilcolina

Abertura dos canais iónicos induzida pela acetilcolina e junção neuromuscular

A chegada de um potencial de acção ao terminal de um axónio pré-sináptico de um neurónito

motor induz a abertura de canais de cálcio dependentes da voltagem e, consequentemente, a
libertação de acetilcolina. Esta despoleta a abertura dos receptores nicotínicos dependentes
do ligando na membrana plasmática muscular. O indluxo de sódio resulta numa despolarização
localizada da membrana, levando à abertura dos canais de sódio dependentes da voltagem –
formação de um potencial de acção. O alastramento da despolarização leva à abertura dos
canais de cálcio, libertando cálcio do retículo sarcoplasmático no citosol. O aumento da
concentração de cálcio induz a contracção muscular.

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Abertura dos canais de potássio induzida pela acetilcolina e membrana plasmática do músculo
cardíacos

Os receptores muscarínicos de acetilcolina no

musculo cardíaco activam uma proteína G que, por
sua vez, abre canais de potássio. A acetilcolina liga-
se ao receptor muscarínico e activa uma proteína
G, catalisando a troca de GDP por GTP na
subunidade alfa. Induzindo a abertura do canal de
potássio. O aumento da permeabilidade a potássio
leva a uma hiperolarização da membrana,
reduzindo a frequência de contracção do músculo
cardíaco.

Acção moduladora de uma sinapse de serotonina

O receptor de serotonina modula a função do canal potássio através da activação da
adenilciclase.

A serotonina secretada por um neurónio facilitador

activado vai-se ligar a receptores de serotonina
acoplados a proteínas, levando à activação da
adenilciclase. Isto leva, por sua vez, ao aumento do
AMPc no neurónio sensorial.

A fosforilação das proteínas do canal de potássio

dependente da voltagem ou uma proteína que se
liga a estes evita a sua abertura, levando a uma
despolarização prolongada.

Isto leva a um aumento da secreção do

neurotransmissor glutamato, que estimula o
neurónio motor.

Memória e Neurotransmissores
A aprendizagem é o processo através do qual nós modificamos o nosso comportamento como
o resultado de uma experiencia ou da aquisição de informação sobre o meio ambiente. A
memória é o processo através do qual esta informação é retida e armazenada. A memória pode
ser a curto prazo ou a longo prazo.

A memória resulta de mudanças na estrutura ou função de sinapses particulares. A memória a

longo prazo envolve a formação ou eliminação de sinapses especificas no cérebro e a síntese de
novos mRNAs e proteínas. Por outro lado, a memória a curto prazo é muito rápida e envolve
mudanças na libertação de função dos neurotransmissores em sinapses particulares.

86
Receptores de Glutamato numa potenciação a longo prazo
O hipocampo está associado a muitos tipos de memória a curto prazo. A potenciação a longo
prazo – LTP é um tipo de memória a curto prazo.

Numa potenciação a longo prazo, a estimulação contínua de um neurónio pós-sináptico torna-

o mais sensível a estimulações subsequentes dos neurónios pré-sinápticos. Os dois tipos de
receptores de glutamato no neurónio pós-sináptico combinam para gerar uma potenciação de
longo prazo: receptores NDMA e não-NDMA.

Dois tipos de receptores de glutamato na potenciação a longo prazo

O canal iónico no receptor NMDA está normalmente bloqueado pelo Mg2+. Contudo, o
glutamato libertado pelos neurónios pré-sinápticos leva à abertura dos receptores de glutamato
não-NMDA. O resultado é um influxo de sódio que despolariza parcialmente a membrana.

Se muitos neurónios pré-

sinápticos dispararem
sincronizadamente, a
membrana da célula pós-
sináptica torna-se
suficientemente despolariza
para que o Mg2+ que estava a
bloquear os receptores NMDA
seja removido. Assim, ambos os
receptores de glutamato,
NMDA e não-NMDA abrem em
resposta ao glutamato.

O cálcio, tal como o sódio,

entram através dos canais
NMDA. Estes causam, assim,
uma resposta aumentada nas
células pós-sinápticas. A sinapse
“aprende” a ter uma resposta
aumentar aos sinais eléctricos
das células pré-sinápticas.

87
Sistemas de transdução sensorial
O sistema nervoso recebe estímulos de uma série de recptores sensoriais. Temos, por exemplo,
os foto-receptores que se encontram no olho, os receptores do paladar e os receptores do odor,
os receptores do tacto, estes monitorizam vários aspectos do ambiente exterior.

Para converter o estímulo num sinal eléctrico ocorre uma ligação indirecta de uma proteína de
um receptor sensorial e o canal iónico. Isto é, o receptor sensorial activa uma proteína G, que,
por sua vez, directa ou indirectamente, induz a abertura ou fecho dos canais iónicos.

Como exemplos, temos os receptores da luz nos bastonetes da retina do olhos dos mamíferos
e os receptores olfactivos no nariz.

Sistema Visual
A retina humana contém 2 tipos de células fotorreceptoras: os bastonetes (estimulados por
luz fraca) e os cones (envolvidos na visão a cores).

Os bastonetes fazem sinapses com os neurónios que, por sua vez, fazem sinapse com outros de
modo a levar o impulso ao cérebro.

No escuro, o potencial de acção da membrana de um bastonete é de -30mV, este secretam

constantemente neurotransmissores. Um fraco estímulo luminoso pode causa imediata
despolarização da membrana do bastonete e o decréscimo da libertação de
neurotransmissores. A luz leva ao fecho dos canais de sódio, daí a hiperpolarização.

Cascata de transdução do sinal visual

Esta cascata ocorre entre a isomerização da retina pela rodopsina e a interpretação da imagem
pelo cérebro.

A rodopsina é o foto-receptor dos bastonetes, sendo formada por 11-cis-retinal e opsina, uma
proteína transmembranar. A absorção de luz causa uma rápida fotoisomerização do cis-retinal
para o isómero trans, formando um intermediário instável, a meta-rodopsina II ou opsina
activada. Mais tarde, há uma dissociação espontânea que origina opsina e all-trans-retinal.

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Esta imagem ilustra o acoplamento da absorção de luz pela rodopsina e a activação da GMPc
fosfodiesterase. Nos bastonetes adaptados ao escuro, o nível de GMPc actua de modo a manter
os canais abertos e a membrana despolarizada, comparativamente com o potencial de repouso
das outras células.

A absorção de luz leva a activaçao da opsina e à conversão da transducina inactiva por estar
ligada a GDP ao seu estado activo, ligado ao GTP, sendo esta conversão acompanhada da
dissociação de Gbetagama

O Gtalfa livre, então gerado, activa a GMPc fosfodiesterase – PDE, ligando-se e dissociando as
suas duas subunidades inibidoras gama. Resultante disto, as subunidade catalíticas libertadas
do PDE activo consegue converter o GMPc em GMP.

O consequente decréscimo de GMPc causa dissociação de GMPc no canais da membrana

plasmática. Os canais, então fechados, fazem com que a membrana fique hiperpolarizada.

Papel da fosforilação da opsina na adaptação dos bastonetes às alterações da luminosidade

89
Degenerescência e Morte Celular
Existem vários tipos de morte celular: necrose, autofagia, apoptose, entre outros.

Apoptose
A definição de apoptose baseia-se num processo programado, altamento organizado e
geneticamente controlado, iniciado por uma variedade de estímulos quer fisiológicos ou
fisiopatológicos, que conduzem à morte celular.

A morte celular programada é comporta por 4 fases:

 Iniciação
 Comprometimento celular
 Execução
 Eliminação

O mecanismo de apoptose demonstra-se muito importante tanto em mecanismos fisiológicos

normais, como nos mecanismos de regulação de síntese de vários tipos de células, como em
mecanismos de defesa da remoção celular.

Existem vários agentes indutores da apoptose, provenientes de várias naturezas:

 Activadores fisiológicos: TNF, TGF-β, neurotransmissores

 Indutores relacionados com danos: choque térmico, infecção viral, toxinas bacterianas,
oncogenes
 Agentes associados a terapia: drogas quimioterapeuticas, radiações

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Vias da Apoptose

(esta parte da matéria está um bocado generalizada nos slides)

A imagem em cima traduz dum modo geral as vias da apoptose:

1. Extrinseca (utiliza receptores)

2. Intriseca (mitocondria)

Vamos já caracterizar os componentes principais destas vias.

Via Extrinseca

 Transmite sinais de sinalização de morte celular

 A activação de caspases é induzida pela ligação de ligandos aos seus receptores (TNFR e
Fas)
 Formação de um DISC – death inducing signaling complex
 Activação da caspase 8

A via extrinseca pode estar relacionada com a via intriseca (mitocondrial), pois a caspase-8,
activada através da ligação dos death-receptors, cliva a Bid provocando a sua activação, esta vai
actuar na permeabilidade da membrana mitocondrial, favorecendo a formação de poros.

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Via Intrinseca

Caspases

São protéases de cisteína que clivam depois do aspartato. 7 são importante para a apoptose
(2,8,9,10,3,6,7). As capases são proteoliticamente inactivas.

Existem caspases iniciadoras (2,8,9,10) e efectoras (3,6,7). As caspases iniciadoras têm a região
N-terminal mais longa com um ou mais domínios adaptadores. Estas activam-se a si próprias e
são reguladas por interacções proteína-proteína. As caspases efectoras contêm 20-30
própeptidos com resíduos longos, sendo activada por clivagem proteolíticas das caspases
iniciadoras.

A activação de uma caspase pode-se dar de 3 modos:

 Clivagem pela caspase a montante

 Proximidade induzida (activação cruazada)
 Conformação induzida (não há proteólise)

As caspases vão incidir sobre os seus substratos, proteínas que são clivadas por caspases e que
vão sofrer apoptose. Estas proteínas pertencem a várias classes:

 Sinalizadoras de apoptose (IAPs, Bcl-2)

 Proteínas quinases (FAK, PKC)
 Proteínas estruturais (gelosina, laminina)
 Proteínas reparadoras celulares (PARP, ATM)
 Proteínas do ciclo celular (p21, p27)

A maioria das proteínas é inactiva após a cliagem da caspase (ICAD, IAPS, PARP). Contudo,
algumas são activadas (procaspases, BID)

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MECANISMO DE ACÇÃO DAS CASPASES

 Inactivação dos inibidores de apoptose ICAD, estes são clivados e inibidos pelas
caspases, deixando o CAD livre para cortar o DNA genómico entre os nucleossomas
 Desagregação de estruturas celulares
 Desregulação da actividade da proteína, através da PARP

Família Bcl-2

Os vários membros da família Bcl-2 têm, pelo menos, um domínio bcl-2 homólogo (BH1,
BH2,BH3, BH4):

 BH1 e BH2: levam a formação de canais iónicos

 BH3: “domínio suicida” que regula a morte celular
 BH4 confere a actividade anti-apoptótica

FUNÇÃO

 Activação ou inactivação da permeabilidade da membrana mitocondrial, envolvendo a

regulação da matriz de cálcio
 Induzir (pró-apoptose) ou inibir (anti-apoptose) a libertação do citocromo C no citosol
 A inibição de Rho reduz a expressão das Bcl-2 anti-apoptóticas e aumenta os níveis das
pro-apoptoticas Bid

P53

https://www.youtube.com/watch?v=ZvcIBZ6LQp0 – (vejam para perceberem melhor)

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