Medios auxiliares para el diagnéstico de _ las infecciones - & #10,. .* coun edicion Organizacién Mundial de la Salud GinebraEstas lémings ilustradas han sido proyectadas y confeocionadas por el Dr. Lawrence R. Ash, Profesor Emérito de Enfermedades infecciosas y Tropicales, Escusla de Salud Publica, Universidad de Califomia, Los Angeles, California (Estados Unidos de América); el Dr. Thomas C. Orihel, Profesor titular de la cdtedra Wiliam Vincent de Enfermedades Tropicales, Escuela de Salud Pubiica y Medicina Tropical, Universidad de Tulane, Nueva Orleans, Louisiana (Estados Unidos de América), ylos Dres. Andrea Bosman, Ell Renganathan y Francesco Rio, Grupo Organico de Enfermedades ‘Transmisibles, Organizacién Mundial de la Salud, Ginebra (Suiza). Nota de agradecimiento La Organizaci6n Mundial de la Salud desea expresar su gratitud al Banco Mundial, que ha financiado los, trabajos de preparacién de estos “medios auxiiares". ‘También se dan las gracias a las siguientes personas: Sra. Frangoise Ardoin (Francia), Dr. Peter Beales (Reino Unido), Dr. George Berlin (Estados Unidos de América), Dr. Wiliam Colins (Estados Unidos de América), Profesor Mario Coluzz!(taia), Dr. John Cross (Estados Unidos de América), Dr. Mark Eberhard (Estados Unidos de América), Profesor Giancario Major (tala), Dra. Patricia Holman (Estados Unidos de América), Dr. David Payne (Reino Unido), Dr. Jean-Claude Patithory (Francia), Or. Lorenzo Saviol (Organizacién Mundial de ia Salud, Ginebra), Dr. Andrew Spieiman (Estados Unidos de América) y Dr. Peter Trigg (Organizacién Mundial de la Salud, Ginebra). Catalogaci6n por la Biblioteca de la OMS. Medios auxizares para el diagnéstico de las infacciones palidicas. - 2a ed 1.Paludismo - diagnéstico 2.Paludismo - atlas 3.Plasmodium - citologia 4.Técnicas y procedimientos de laboratorio 5.Materiales de ensefianza 6.Manuales ISBN 92 4 2545248 (Casticacién NLM: WC 750) La Organizacion Mundial de la Salud daré consideracién muy favorable a las solicitudes de autorizacién para reproducir 0 traducir,jategramente o en parte, alguna de sus publicaciones. Las solicitudes y las peticiones de informacion deberén dirigirse a la Oficina de Publicaciones, Organizacién Mundial de la Salud, Ginebra, ‘Suiza, que tendré sumio gusto en proporcionar la informacién més reciente sobre cambios introducides en la obra, planes de reedicién, y reimpresiones y tracucciones ya disponibles. © Organizacién Mundial de la Salud 2000 Las publicaciones de la Organizacién Mundial de la Salud estén acogidas a la proteccién prevista por las isposiciones sobre reproduccién de originales del Protocolo 2 de ia Convencién Universal sobre Derecho de Autor. Reservados todos los derechos, La mencién de determinadas sociedades mercantilss 0 de nombres comerciales de ciertos productos no implica que la Organizacion Mundial de ia Salud los apruebe o recorniende con preferencia a otros anélogos no mencionados. Salvo error u omisién, las denominaciones de productos patentados levan on las publicaciones de la OMS letra inicial mayiscula. Portada anterior: Gametocitos de Plasmodium falciparum tefidos con colorante de Giemsa en una extensién de sangre en capa fina, Portada posterior: Trofozoites jévenes de Plasmodium vivax tefiidos con colorante de Giemsa en una lextensi6n de sangre en capa fina, Disefio e llustraciones: Servicios Graficos de la OMS.Bibliografia complementaria Ash LR,, Orihel, T.C. Atlas of human parasitology, * ed. Chicago, ASCP Press, 1997. ‘Ash LR, Orihel T.C, Parasites: a guide to laboratory proce- ‘dures and identification. Chicago, ASCP Press, 1991. -Métodos basicos de laboratorio en parasitologia médica Ginebra, Organizacién Mundial de la Salud, 1992. ‘Basic malaria microscopy. Part 1: Learner's guide. Ginebra, Organizacion Mundial dela Salud, 1991. Basic malaria microscopy. Part 2: Teacher's uide. Ginebra, (Organizacién Mundial dela Salud, 1991 [Normas de bioseguridad para laboratories de diagndstico investigacién que trabajan con el VIH. Ginébra, Organizacién ‘Mundial de la Salud, 1992 (Serie OMS sobre el SIDA, N°). Guidelines for the safe transport of infectious substances and diagnostic specimens. Ginebra, Organizacién Mundial de la Salud, 1997 (documento inédito WHO/EMCS7.3; puede solictarse al Departamento de Vigilancia de las Enfermedades Transmisibles y Respuesta, Organizacion “Mundial de la Salud, 1211 Ginebra 27, Suiza). Guia de métodos eficaces de esterilzacién y desinfeccién contra el virus de la immunodeficiencia humana (VIH), 2" ed. Ginebra, Organizacién Mundial de la Salud, 1990 (Serie de la (OMS sobre el SIDA, N° 2). ‘Manual de bioseguridad en el laboratorio, 2* ed. Ginebra, Organizacién Mundial dela Salud, 1994, Lopez Antufiano F-J, Schmunis, G., eds. Diagndstico de la ‘malaria. Washington, 0.C., Organizacién Panamericana de la Salud, 1988. Publicacién Cientifica N° 512. Preventing HIV transmission in health facilities. Ginebra, COrganizacién Mundial de la Salud, 1995 (documento inédito GPAPTCOMCS/95.16; puede solicitarse a la Oficina de VIH/ SIDA y Enfermedades de Transmisi6n Sexual, Organizacion ‘Mundial dela Salud, 1211 Ginebra 27, Suiza). Safety in health-care laboratories. Ginebra, Organizacién ‘Mundial de la Salud, 1997 (documento inédito WHO/LABY 97.1; puede solicitarse a Imaginologia Diagnostica y ‘Tecnologia de Laboratorio, Organizacién Mundial dela Salud, 1211 Ginebra 27, Suiza). Wernsdorfer W.H., McGregor |, eds. Malaria: principles and practice of malariology. Vol. 1. Vol. 2. Edimburgo, Churchill Livingstone, 1988.Lamina 1 Introduccion Entre 300 y 500 millones de personas del mundo entero resultan infectadas por el paludismo cada afio, yentre 1,5y 2.7 millones, principalmente nifios, mueren a causa de la enfermedad. La mayoria de los casos ocurren en los paises en desarrollo, particularmente de Africa. El paludismo es causado Por pardsitos protozoarios del género Plasmodium, que comprende cuatro especies importantes para el ser humano: P. falciparum (causante de la forma mas grave de paludismo y de la mayoria de las defunciones), P. vivax, P. ovale y P. malariae. El parasito ataca y destruye los glébulos rojos y puede afectar a érganos vitales, en particular el cerebro: la mayoria de las defunciones por paludismo falciparumsedeben a paludismo cerebral. Estos Medios auxiliares para el diagnéstico de las infecciones paliidicas presentan microfotografias -con textos explicativos ~ que muestran las diversas especies y formas morfolégicas de los pardsitos del paludismo humano en extensiones (frotis) de sangre en apa finay en capa gruesa. Se facilitan descripciones de P. falciparum, P. vivax, P. ovale y P. malariae, asi como instrucciones para la preparacién y utilizacién de soluciones amortiguadoras y de tincién. Las microfotografias, todas aumentadas mil veces yteftidasconcolorantesde Romanowsky, muestran muchas de las posibles variantes de los parasitos del paludismo. Las diferencias de los procedimientos de fijacién y tincién resultan en una coloracién de las extensiones muy variable; en consecuencia, el fondo de la extensién y los organismos pueden variar considerablemente de un Portaobjetos a otro. Los parasitos que se observan en las microfotografias de extensiones en capa gruesa (gota gruesa) suelen tener menor definicién que los de las extensiones en capa fina: una extensién de gota gruesa consta de varias capas de células, lo que hace difigl enfocar las diferentes capas. Estos medios auxiliares estén destinados a los laboratoristas encargados del diagnéstico del paludismo mediante el examen microsc6pico de frotis sanguineos, pero también serén utiles como material pedagégico. Los agentes de salud con experiencia a menudo pueden diagnosticar el paludismo por el aspecto y las manifestaciones del paciente. Para confirmar el diagnéstico, sin embargo, se debe hacer un andlisis de sangre: en consecuencia, se deben preparar extensiones en capa gruesa y en capa fina para la observacién microscopica, Unfrotisde gota gruesa por lo general permiteal microscopista con experiencia identificar las especies de Plasmodium, pero ‘cuando persiste alguna duda se debe examinar una extension en capa fina para confirmar la identidad. Esindispensable que el diagnéstico sea exacto, pues el tratamiento varia seguin las especies. Los errores de diagnéstico pueden ser fatales para el paciente, particularmente en el caso de infeccién por P. falciparum. La edici6n anterior de los medios auxiliares (Medios auxiliares para el diagndstico del paludismo), publicada por la OMS en 1988, contenia ilustraciones en color de las diferentes fases del ciclo biolégico de las cuatro especies de Plasmodium que causan el paludismo humano. En la presente edicion, las ilustraciones se han sustituido por microfotogratias en color, que ofrecen una representacion mas exacta de esas fases. Se han afiadido directrices de bioseguridad para la manipulacién de muestras de sangre, en vista de la incidencia creciente dela hepatitis y la infeccién por el virus de la inmunodeficiencia humana (ViHy/sindrome de inmunodeficiencia adquirida SIDA), Ciclo biolégico y diagnéstico El paludismo es transmitido por la hembra del mosquito anofeles. Un 70% de las aproximadamente 420 especies de Anopheles que existen en el mundoson vectores del paludismo humano, y alrededor de 40 de ellas revisten gran importancia, El mosquito se infecta con pardsitos del paludismo cuando pica a una persona cuya sangre contiene las formas sexuadas del pardsito (gametocitos). Los macrogametocitos femeninos ylosmicrogametocitosmasculinosas\ingeridos se ransforman ‘en gametos maduros en el intestino medio del mosquito. La fecundacién de un gameto femenino (macrogameto) por un gameto masculino (microgameto) da lugar a un cigoto mévil (ooquineto u oocineto) que emigra a la pared del estomago, donde se convierte en ooquiste (u oocisto). Por division asexuada se generan dentro del ooquiste hasta 10 000 esporozoitos alargados y fusiformes, que son liberados cuando el ooquiste finalmente se rompe y emigran por la cavidad corporal para acumularse en las glandulas salivales del mosquito. Cuando la hembra anofelina infectada vuelve a picar para alimentarse con sangre, inocula los esporozoitos en el torrente sanguineo del huésped humano. Por la sangre llegan al higado, del que invaden las células parenquimatosas, donde se transforman en esquizontes exoeritrociticos. Sigue una fase de multiplicacién, que suele durar entre 5 dias ymedioy 15 dias, segun laespecie de Plasmodium. Transcurrido ese lapso, el esquizonte maduro estalla, liberando miles de merozoites (hasta 30 000 en el caso de P. falciparum) en el torrente sanguineo. En el paludismo debido a P. vivax y a P. ovale, sin embargo, algunos esporozoitos no se transforman inmediatamenteen esquizontes; permanecen enestadolatente durante meses en las células hepaticas. A menos que estas formas latentes - hipnozoitos - sean destruidas en el higado por medicamentos antipaldicos especificos, su desarrollo ulterior da origen a las recaidas observadas en las infecciones por P. vivax y P. ovale, Como P. falciparum y P. malariae no producen hipnozoitos, no provocan recaidas, aunque la recrudescencia de esas infecciones es comin. Enel torrente sanguineo, los merozoitos invaden los glébulos rojos, en los que la hemoglobina les proporciona elementos nutritivos para su transformacion en trofozoitos; los trofozoitos j6venesse conocen como formas anulares (0 anillos) a causa de SU aspecto. Los trofozoitos se convierten en esquizontes durante esta fase eritrocitica (es decir, en los glébulos rojos) y producen pigmento palidico como subproducto de su metabolismo. La reproduccién en esta fase es por division asexuada (esquizogonia eritrocitica); después de varias divisiones, cada esquizonte maduro habitualmente contiene entre 6 y 24 merozoitos (margen de variacién 6-40), seguin la especie de Plasmodium de que se trate. Al romperse los gl6bulos rojos infectados, los merozoitos son liberados en el torrente sanguineo, donde infectan otros nuevos glébulos rojos dando comienzo asi a un nuevo ciclo eritrocitico. ta repeticion de este ciclo acarrea un aumento de la parasitemia, Después de varias series de esquizogonia eritrocitica, algunos de los merozoitos se diferencian en microgametocitos y macrogametocitos que, ingeridos por el mosquito hembra al alimentarse con sangre, dan origen aotro ciclo de transmisién del paludismo. coe wreLamina 1 Ciclo bioldgico del paludismo Figura reproducida, con pequefias modificationes, de Bruce-Chwatt's essential malariology, Londres, Arnold, 1993, con autorizacién de H.M. Gilles y D.A. Warrell, compiladores. EsqUZoNTES ExoenaCiNCOS FsquzoqoMa ERITROCITICA = 2 ‘Anopheles FecUNDACION GANETOS @)-— 02 voli eas POMCET cwttkik nk. Lecomte Lamina 2 Plasmodium falciparum Esta especie de Plasmodium es la mas importante de las cuatro especies causantes del paludismo humano. Su distribucion se concentra en las zonas tropicales y subtropicales del planeta, particularmente Africa y Asia. En el Africa subsahariana es responsable de casi todos los casos de paludismo registrados y, junto conelsarampién,lamalnutricién, ladiarreaylaneumonia, es causa de la mayoria de las defunciones denifios. En las zonas muy paluidicas, las mujeres embarazadas pueden contraer anemia grave; el paludismo es una causa importante de defuncién fetal. En las zonas de transmisién baja, todos los grupos de edad estan expuestosy, ocasionalmente, se producen epidemias de P. falciparum que causan la muerte de miles de personas. Unavez que el paciente es infectado por P. falciparum, losprimeros signos clinicos tardan entre 7 27 dias (en promedio 12) en aparecer (periodo de incubacién). Si el paciente carece de inmunidad, la infeccién puede adoptar rdpidamente una forma grave, produciendo seriosdaniosen elcerebro (paludismo cerebral) y otros érganos. El paludismo cerebral se caracteriza por el estado de coma, que puede conducir a la muerte. Algunos pacientes que se recuperan del paludismo cerebral pueden suftir secuelas neurolégicas por el resto de su vida. ‘Como en la infeccién por P. falciparum no hay hipnozoitos, s6lo se produce una generacién de parasitos, pero la recrudescencia puede sobrevenir hasta un afio después. En las extensiones de sangre, el microscopista suele observar s6lo trofozoltos jévenes (anillos). También pueden verse gametocitos; los trofozoitos mas maduros y los esquizontes se mantienen escondidos (secuestrados) en los Srganosdel cuerpo. En realidad, cuando se encuentran esquizontes en un frotis de sangre, ello suele ser signo de que la infeccion es grave y ha alcanzado un estadio critico. Ocasionalmente, el microscopista puede observar granos 0 actimulos de pigmento (hemoglobina digerida), producidos por el pardsito del paludismo, dentro del citoplasma de los leucocitos que han destruido pardsitos del paludismo maduros(h). En algunas extensionessélo se observan gametocitos. Los individuos infectados que sélo tienen gametocitos en circulacién pueden no presentar signos ni sintomas de la enfermedad, pero aun asi pueden infectar a los mosquitos anofeles que los piquen. El ciclo eritrocitico de P. falciparum dura alrededor de 48 horas (es decir que se repite cada tres dias), aunque también son posibles intervalos mas breves. Problemas de diagnéstico: Si en las extensiones de sangre solo se encuentran unas pocas formas anulares, puede ser dificil diferenciarlas de otras especies de parésitos del paludismo. La presencia de gran cantidad de anillos cuando no se observan otras fases es un fuerte indicio de infeccién por P. falciparum; las formas accolées 0 appliquées y la infecci6n multiple de los hematiesson elementos quehan de reforzar el diagnéstico. Los gametocitos no se observan al comienzo de la infeccién, por lo que su ausencia en los frotis sanguineos no debe inducir a desechar el diagnéstico de paludismo por P. falciparum. Ocasionalmente, en extensiones de sangre periférica se puede encontrar s6lo gametocitos. Preparacion de soluciones amortiguadoras para la tincién de parasitos del paludismo Para teftir los pardsitos del paludismo por el método de Giemsa es indispensable disponer de una solucién amortiguadora de fosfato bien equilibrada a pH 7,2. Preparacion de una solucion para el trabajo diario 1. Disolver 1,0 g de fosfato dis6dico (Na,HPO,) anhidro_y 0,7 4g de fosfato monopotasico (KH,PO,) en 1000 mi de agua destilada 0 desionizada. También puede usarse agua de lluvia filtrada 0 incluso agua del grifo sino se dispone de otra. 2. Determinar el pH con un pehachimetro 0 con indicadores colorimétricos. 3. Siel pHes inferior a 7,2, afadir pequefias cantidades de una solucién de Na,HPO, al 2%; si es superior a 7,2, afadir pequefias cantidades de una solucion de KH,PO, al 2%. 4. Una vez equilibrado el pH a 7,2, guardar la solucion en un frasco cerrado con tapén bien ajustado, preferentemente de vidrio oscuro, en un sitio fresco que no reciba la luz solar directa. Esta solucién se conserva bien durante algunas semanas, pero hay que examinarla regularmente para cerciorarse de que nose hayan desarrollomohos uotros organismos. Esto se comprueba agitandola; sise enturbia, deséchese. Preparacién de una solucién madre concentrada (itil para operaciones sobre el terreno o el envio a zonas distantes) 1. Disolver 3,09 de Na,HPO, anhidro y 2,1 g de KH,PO, en 25 ml de agua destilada o desionizada. 2. SielpHesinferior a7,2, ahadir pequefias cantidades de una solucién de Na,HPO, al 2%; si es superior a 7,2, afadir pequefias cantidades de una solucién de KH,PO, al 2%. 3. Guardar en frasco oscuro al abrigo de la luz solar directa; esta solucién se conserva bien durante varias semanas. 4, Para obtener una solucién de trabajo, diluir 1 ml del concentrado en agua destilada o desionizada hasta llegar a un volumen de 20 ml Preparaciéndeenvases conlascantidades pesadas previamente Cabe la posibilidad de pesar previamente las dos sales de fosfato y envasarlas juntas en un tubo o frasco provisto de un tapén ajustado 0 en una bolsa de plastico que cierre bien, rotulando claramente los envases y almacenandolos en un bocal con tapa de rosca. Para preparar la solucién, afiadase el contenido de los envasesa/litrode agua destiladao desionizada y ajustese el pH a 7,2. Tabletas amortiguadoras Los proveedores de laboratorios ya ofrecen tabletas amortiguadoras que al disoiverse producen una solucion de pH_ 7,2, pero su precio es bastante elevado.Ley Te ess Lamina 2 Extension en capa fina con Plasmodium falciparum 5 Od a | |i c ak: ofozoTtos: Los merous vader Tos lobule de alia dad. Uk Walntos de P Icha sn mis pequos au humary sun ee! un deca Tro anil de pls acon ma vacina na pominetemancha de ama je), Los lbs ojos ined condos mands de oman ler) ya venin multiple deo etrocto an caracarens euane da eaten, Lor us ro nicndorna aren agondomien Trsparstoss menu seencienonan el bore dels ertoots slams asta fomasacoeo applquses dy, Sucondmentaes il parc iagnésa, er algunes Tosde los domes parasitos del paludisno . | oe we " ‘ We e lid h é sad i505 estas formas marginales estn otablementsdesplazadas, de modo qu gran part del pardsto se extiende mas all del borde ceular (fg). {as manchas de Maurer, 9 aparecen nds tarde ena fect por. alprum ae lspunto de Suter en b nlc go visa. Las machas de Maur saber execs que onteen fiptozltos mes vejs y setinen mejor cuando el pits alcalin pH 7,2-7.6) Ens extensions de sangre peitéica nose suelen observa trofozotos an crecimiento ni madras a menos que @infeccn sea grave yl parasitemia alta. Ocastonalmente pueden verse grémuls de pigmento en el itoplasma de os granulacitos. = = > = r * _% Erg ee i es J k | z Esuizontes Se obsivaraamerteen sensors sre pa repo ne caOnS Gave UF STS ett a cmp coca eT: peer toyed contoranue toy te ervtos crpetevncoore 40) cB piven ev os eqieote see arojanave tn Ua rave mca Ottley pte Stedman currant eno nie . re \ e \ p oe ‘an © = ie - . B on Ow ‘Gametocitesrialmene son cusps edondeados que cecen de pignenioy no enenvacula.Ameeida que maduean, adguiren un pee fusiforme We) luegose comnierten encraceristioscerpos en formadebanaraosaehicha con losexiemosefondeados m-o), Con ecuanciase puede obser iamembrena dl lobo oj dura ‘Pmaduracon del gometccto (fect). Enos macrogametets, el ctelasma se ie de ly comatina eta concent en una masa vilacea (me lgmento cule ‘Starmas cocenfago qe en os micogametacos aparece en forma de granulo @astonclos equates enol ena cel part. £1 ctoplasra des mecogametoctos nerd un ura ese comet ear cn (9 ls gals denon er ma dapesn en os nacogrto, Gast, s spmetocitossueden adopts formas extrahas(p)(tithe kk Lamina 3 Preparacién de una extensidn en capa fina y una gota gruesa en el mismo portaobjetos Para el diagnéstico microscépico ordinario del paludismo se preparan una extension fina yuna de gota gruesa en el mismo portaobjetos. La primera sirve para marcar oidentificar el portaobjetos pero, si esta bien hecha, puede utilizarse también para confirmar la especie. El examen debe hacerse en la gota gruesa. Para preparar las extensiones de sangre senecesitan loselementos siguientes: portaobjetos limpios empaquetados, lancetas estériles, alcohol etilico al 70% y agua, algodén en rama absorbente, guantes de cirugia, pafio de algodén que no deje pelusa, estuche para los Portaobjetos (o cubierta para protegerios de las moscas y e! polvo), formulario o fichas de registro, lapiz de grafito blando y boligrafo. 1. Sosteniendo la mano izquierda del paciente, con la palma hacia arriba, elijase el dedo medio. (Si se trata de un nifio puede utilizarse el dedo gordo del pie. Nunca debe Utilizarse el pulger, ni en adultos ni en nifios.) impiese el dedo con un algodén ligeramente embebido en alcohol etilico al 70%, frotando la yema enérgicamente para eliminar la suciedad y la grasa. ‘Séquese el dedo con un pafio de algodén limpio, con movimientos enérs estimular la circulacién sanguinea 05 para 2. Conunalanceta estéril, punciénese la yema del dedo, haciendo unrapido movimiento de rotacién, Apretando ligeramente el dedo, hagase brotar la primera gota de sangre, que se enjugara con un algodén seco, cerciorandose de que no quedan adheridas hebras de algodén que luego puedan mezclarse con la sangre. 3. Utilizando portaobjetos limpios que se manipularan solamente por los bordes, recéjase rapidamente la sangre del modo siguiente: Apriétese suavemente el dedo y depésitese una pequefia gota desangre, aproximadamente deeste tamario e, en el centrode! portaobjetos. Esta gota se utiliza para la extensi6n fina, Apriétese otra vez para extraer ms sangre y depositense en el porjaobjetos dos o tres gotasmayores, aproximadamente de este tamario @, a 1 cmaproximadamente dela gota para la extension fina (véase lailustraci6n). Enjdguese con un algodén la sangre que quede en el dedo. 4. Extensién en capa fina. Colocando sobre una superficie plana y firme el portaobjetos que contiene las gotas de sangre, téquese la gota pequefia con el borde de otro Portaobjetos limpio de manera que la sangre se extienda a lo largo de ese borde, Deslicese con firmeza este “portaobjetos extensor" sobre el primero, manteniéndolo en un 4ngulo de 45°. Importa que durante toda la extension de la sangre los dos portaobjetos estén en contacto uniforme. 5. Gota gruesa. Manipilense siempre los portaobjetos por sus bordes o por un dngulo y procédase del siguiente modo. Utilizando un angulo del portaobjetos extensor, mézclense rapidamente las gotas de sangre y extiéndase la mezcla para obtener una pelicula gruesa y uniforme. No se debe remover demasiado la sangre, sino extenderla en forma circular o rectangular mediante tres a seis movimientos. La pelicula gruesa circular debe tener alrededor de 1 cm de digmetro. 6. Marquese la extensién fina seca con lapiz de grafito blando escribiendo en su parte més gruesa el nombre o numero del pacientey la fecha. No debe utilizarse boligrafo para rotular el portaobjetos. Déjese secar la gota gruesa en posicién horizontal, al abrigo de las moscas, el polvo.y el calor extremo. 7. Envuélvase el portaobjetos seco en la ficha clinica del paciente y enviese lo antes posible al laboratorio. 8, El portaobjetos utilizado para extender la sangre podra usarse ahora para recoger la sangre del paciente siguiente, empleando otro portaobjetos limpio del paquete para hacer la extension. ue wHezueigLamina 3 ® . ‘ Pn, a a b e . Ls aillos (a) suelen ser pequefios, a menudo numeross, can citoplasraescasoy delice. Los anillos las formas en come (anillos deformades) son frecuentes, pero bs anillos mas viejo pueden tener mds ctoplasma (a). Son comures os anillos con manchas de cromatina doles, La presenciade un gran mero de armas anulares en ausenda 4: otras fases morfoligices es generamente inakadora de esta expece ( 5 i ea e ¥ wa ; |e f bd Ev {as infecciones uertes, se pueden encontrar pequeios esquizontes compactos (,flachas), que por o general contionen entre 16y 24 merozoites (margen de vaiacén 0), ‘aracimados en torno aura nequenia masa oscra de pigmento (@: tambien se abservaun gran numero Ge anillae. Ee posibe encontrar formac anultoejanto con gametocte (ely en algunas infeciore, se pueden observar gametocit en un campo en ausenca deans. x °= Riss - Sypris tes Sei a~ 30, cuando esultan flechas en ausencia de formas anulars, pueden ser mas diiles de reconocer, | ; ) sf — ’ j k I &- Er infeccionesmintas por P. falciparum y . vivax Gl, son vibes un tpica gametedioy numeroto anilloe paquets de # faljparum junto can wn trofezcite de P. vivax flecha) Enki se observan alls yur gametoct junto con un gran tofozito de P.vitax lec) en) es visible un gametocito junto can un prominentetrofezito de P. viva (cha).See ey @ Lamina 4 Plasmodium vivax Plasmodium vivax se encuentra en las zonas tropicales y subtropicales y es también la especie predominante en los, climas templados. Es muy rara en Africa occidental. El periodo de incubacién por lo general dura entre 13 y 17 dias, aunque algunas cepas pueden tener periodos de incubacion prolongados, de hasta 6 a 12 meses. Una caracteristica importante de esta especie es la presencia y persistencia de fases exoeritrociticas (hipnozoitos) en el higado, que pueden producir recafdas de la infeccién repetidamente a lo largo de muchos afios. El ciclo eritrocitico suele durar alrededor de 48 horas y en la sangre periférica se pueden encontrar todas las fases morfolégicas caracteristicas: trofozoitos, esquizontes y gametocitos. Problemas de diagnéstico: Si en las extensiones sanguineas s6lo se encuentran unos pocos anillos, el diagnéstico es muy dificil Puede ser necesario realizar un examen més amplio de la muestra para encontrar otras fases, asi como el punteado de Schaffner. El examen de extensiones en capa gruesa puede ser necesario para determinarla presencia de otros pardsitos. Cabe recordar que en las extensiones en capa fina, la periferia de la extension puede estar poco lisada y los “fantasmas” de los hematies pueden revelar la presencia de organismos, asi como signos de punteado (lémina 5, f). Bioseguridad en la manipulacién de las muestras de sangre de los pacientes Los peligros a que esta expuesto el personal técnico de los laboratorios estén ampliamente reconocidos. Todos los laboratorios deben seguir pautas de seguridad nacionales 0 bien pueden aplicar directrices elaboradaslocalmente. La OMS ‘también ha facilitado una serie de directrices, por ejemplo Safety in health-care laboratories; Gula de métodos eficaces de esterilizacién y desinfeccién contra el virus de la inmunodeficiencia humana (Vin), 2*ed.; Normas de bioseguridad para laboratorios de diagnéstico e investigacion que trabajan con el VIH, y Preventing HIV transmission in health facilities (véase la seccién “Bibliografia complementaria”) Todas las muestras de sangre se deben considerar potencialmente infecciosas. Dos de las enfermedades més peligrosas transmitidas por la sangre son la hepatitis (causada principalmente por los virus de la hepatitis 8 y ) y el VIH/SIDA. Alrecoger muestrasde sangre parael diagnéstico de paludismo se deben observar las normas de bioseguridad pertinentes. El principal peligro para los laboratoristas que toman muestras de sangre es la contaminacién de las manos y de las mucosas de los ojos, la nariz y la boca por sangre infecciosa. Esa contaminacién se produce a raiz de lesiones penetrantes causadas por objetos punzantes o cortantes, y de derrames o salpicaduras de la muestra. En las directrices que se ofrecen ‘aqui se presentan practicas y procedimientos concebidos para reducir al maximo esos accidentes. 1. Todos los laboratoristas deben estar suficientemente capacitados en relacién con las tareas que desempefian y con todos los aspectos del trabajo de laboratorio. 2. Elprocedimientoestandar de funcionamiento, incluidastodas las etapas de las operaciones que han de realizarse, debe estar claramente consignado por escrito. 3. Enellaboratoriose debe usar tunica, batin o uniforme. Esta ropa de proteccién se quitard antes de salir del laboratorio. 4, Se deben usar guantes al tomar y manipular muestras de sangre. 5. Nose deben tocar los ojos, la nariz u otras mucosas expuestas nila piel con las manos enguantadas. 6. No se debe salir del lugar de trabajo ni caminar por el laboratorio con los guantes puestos. 7. Cuando se considere que los guantes se han contaminado, deben descartarse; es preciso lavarse las manos y ponerse guantes nuevos. 8. Sedeben iavar las manos con agua y jabén inmediatamente después de cualquier contaminacién y una vez finalizado el trabajo. Si se usan guantes, se lavarén las manos con agua y jabén después de quitados los guantes. 9. Lasheridas punzantes, los cortes y la piel contaminados por derrames o salpicaduras de sangre deben lavarse a fondo con agua y jab6n. Conviene hacer sangrar la herida. 10. Debe comunicarse de inmediato al supervisor del laboratorio todo derrame, accidente y contacto manifiesto o probable con muestras infecciosas, y se adoptarén las medidas apropiadas para evitar su repeticion en el futuro. 11. Las lancetas usadas se deben colocar en un recipiente resistente a los pinchazos, 12. Sedeben desinfectar las superficies de trabajo al concluir las ‘operaciones y al final del dia. Un desinfectante eficaz para todo uso es una solucién de hipoclorito cuya concentracion (1 gl) provee de un 0,1% de cloro disponible. 13. No se debe comer, beber ni fumar en el laboratorio. 14, Sélodebeteneraccesoal laboratorio el personalautorizado.Lamina 4 a b c Trofozoit «ecimiento teen una masa de coplasma mayor a \d >s merozoites por lo general invaden ls eftrocitosjovenes. Los hematiesinfectads se agyandan, muchas veces més de un 50% (apronimadamente el tamafo 4d an eucocte)y su forma puede variar de redonda a eval. Los trofeoitos muy venes (ails) habtualmente mien atededor de unterco del demetrodelos ematies; tenen luna prominente mancha de ciomatina roy un fino drclo de cteplasma azul (aed), Ocasionalmente pueden tener dos manchas de cromatina, Los tofovltosjovenes en 4 por lo general un aspecto ameboide iregula (e). Los trofozoltos mas viejos adquieren gran tamafo y un aspecto prenunciadamente ameboide y pueden ocupar totalmente el ldbulo rojo fh). Su masa de cromatina es arande y compacta; presentan a’anos de pigment dispersos en el cRaplasma y cas siempre une vacuola de ran tamafio (fh), {ostrofozoitos maduros pueden ser aficies de diferercar de los gametocitos (hm). En extensiones de sangre correctamenteteidas, se pueden ver ls purtos de Schifiner elas hematies que contenen trofozito ovenes (e+) y, raras veces, mas temprano(d), a | f i i ‘ i p i "@,® ‘metozoltos(margen de vaiacién 12-24) (eb). Enel escuizonte maduro puede haber uno o dos acmulos est compuesto de una mana de clomatin rodeada de una pequefa masa decitoplasma () El esau 1, El punteado de Schiffner suele ser patente en el hemate infectado(W) Esquizontes: A principio de wv desarvoo, el esquzcite es grande y ameboial La cromatna se aide en pequeras masas i jente madura por lo gener uses, pear fname ene 20 eplgmenta evel centro draco de meronaitos 0), Cada meorato loca todoe able 0 grandad m n oo - , 0 de forma redonda a oval yde contorno regular (mp). Los mact na excétrca,Presentanpigmento marron dsperso por cteplas Gametocitos: Los parilios wal ‘ecueria masa compacta de am: rogametoctos(m, a) zon por lo general grandes y azle= ay carecen de vacuoles, y tienen uno patésito madiro ocupa cas todo el glabulo "ojo agrandado (m, m); esta ase suele se’ cific de dstinguit de untrofozoto madre (h). Les merogametocitos (0, p) nen una gran masa dfusa de cromatina que Se ie ‘derosado y citcplasma azul dato a rosado 0 violace con grsnulos dispesos de pigmento oscuro. pone aD HoH LHLamina 5 La utilizacién de colorante de Giemsa es el procedimiento recomendado y mas fiable para tefiir extensiones de sangre en capa fina y en capa gruesa con objeto de detectar la presencia de parasitos del paludismo. El colorante se puede obtener en forma de solucién comercial ya preparada o en polvo; sin embargo, como la calidad del colorante puede variar, es conveniente adquirirlo a un fabricante reputado asi como evaluar cada lote que se prepare antes de utilizarlo para tenir gran cantidad de muestras. Se facilita masinformacién sobre la Preparacion del colorante y de soluciones amortiguadoras y sobre los procedimientos de tincién en !a publicacién de la OMS Métodos basicos de laboratorio en parasitologia médica (véase la seccién “Bibliografia complementaria”). reparacién desolucién madre decolorantede Giemsa Férmuladel colorante: polvo de Giemsa, 3,89; alcohol metilico, 250 mil; glicerol, 250 mi. Preparacién de colorante de Giemsa 1. Colocar en un frasco oscuro 50 perlas de vidrio. Si no se dispone de un frasco oscuro puede usarse un frasco de vidrio 0 polietilenotransparente, seco yquimicamente limpio, de tamafio apropiado. Aftadir la cantidad medida de alcohol metilico y el polvo de Giemsa. 2, Cerrar bien el frasco, Esperar a que el polvo se vaya hundiendo lentamente en el alcohol metilico hasta depositarse en el fondo. Agitar el frasco, imprimiéndole un movimiento Gircular, durante dos o tres minutos. 3. Afiadir la cantidad medida de glicerol y agitar otra vez Seguir agitando durante dos o tres minutos cada media hora por lo menos seis veces. 4. Guardar el frasco durante dos a tres dias, agitandolo periédicamente tres o cuatro veces por dia hasta que elcolorante esté completamente mezclado. Esta es la solucién madre Reservar una pequefa cantidad de esta solucién madre en un frasco pequeho para el trabajo corriente a fin de evitar la contaminacién de la solucién madre Cada lote recién preparado se debe rotular adecuadamente, indicando la fecha de preparacion, y someter a prueba para cerciorarse de que la dilucién y el tiempo de tincién son correctos. El frasco siempre debe guardarse, bien cerrado, en un sitio fresco, resquardado de la luz solar directa. Los frascos de vidrio claro se deben cubrir con un papel grueso y oscuro para que no les dé la luz. Técnica de tincién con Giemsa: método ordinario Para obtener una tincién de la mejor calidad posible, lo ideal es que la gota gruesa y la extension fina se hagan en portaobjetos separados. Como esto no suele ser posible, por lo general se preparan en el mismo portaobjetos, en cuyo caso essumamente importante tehir bien la gota gruesa. Déjese secar la gota gruesa en posicién horizontal yal abrigo de las moscas, el polvo yelcalor excesivo. Importa sefialar que en los paises tropicales puede producirse el fendmeno de autofijacion. Se trata de un proceso en el cual los frotis de sangre se fijan graduaimente al contacto ton la atmésfera. En condiciones tropicales, este proceso puede encontrarse muy avanzado incluso en frotis que sélo se han almacenado durante unos pocos dias. Cuando se almacenan extensiones en capa gruesa para tefirlas ulteriormente, es muy importante mantenerlasen una atmésfera seca; se puede usar para ello un desecador. Procedimiento de fijacién Una vez que la extensidn fina se ha secado, se fija afiadiendo unas gotas de alcohol metilico o sumergiéndola durante pocos segundos en un recipiente con alcohol metilico. Una fijacion prolongada puede dificultar la observacidn de los puntos de Schaffner y las manchas de Maurer. Déjese secar por completo la extension por evaporacién. Debe evitarse el contacto de la gota gruesa con alcoho! metilico 0 con vapores de alcohol metilico. Si el alcohol metilico fija la gota gruesa, la deshemoglobinizacién no sera posible. Procedimiento de tincion (para 20 portaobjetos o mas) Colocar los portaobjetos en una cubeta de tincién. Preparar tuna solucién de Giemsa al 3% en agua destilada o desionizada, amortiguada a pH 7,2, en cantidad suficiente para llenar la cubeta y cubrir los portaobjetos. Dejar tefiir durante 30 a 45 minutos, al abrigo de la luz solar. Verter con cuidado agua limpia en la cubeta para separar la espuma iridiscente de la superficie del colorante. Enjuagar répidamenteen agua limpia. Retirar los portaobjetos uno por uno y colocarlos en una gradilla para que escurran y se sequen, de manera que la extension de sangre quedehacia absjoperosintocarla gradilla. Resultados de la tincion En la gota gruesa, el fondo debe aparecer limpio y exento de residuos; los nucleos de los leucocitos deben aparecer tefiidos de unintenso color purpura oscuro, ylos pardsitos del paludismo deben verse con a cromatina de color rojo oscuroyel citoplasma azul purpureo palido. En la periferia de la gota gruesa, los eritrocitos no estan lisados y en las infecciones por P. vivax y P. ovale puede llegar a verse el punteado de Schaffner. Técnica de tincién con Giemsa: método raj Este es un procedimientosatisfactorio pero entrafia un gastode colorante mucho mayor que el método ordinario. Procedimiento de fijacién Una vez que la extension fina se ha secado, fijarla afadiendo unas gotas de alcohol metilico o sumergiéndola durante pocos segundos en un recipiente con alcohol metilico. La gota gruesa no debe fijarse para no impedir la deshemoglobinizacién; por consiguiente, hay que evitar su contacto con alcohol metilico 0 con vapores de alcohol metilico. Déjese secar completamente por evaporacion. Procedimiento de tincion Preparar una solucién de Giemsa al 10% en agua destilada 0 desionizada, amortiguada a pH 7,2;sise utiliza poca cantidad, tres gotas de colorante por cada mililitro de agua amortiguada darén la concentracion correcta de solucién de Giemsa. Un portaobjetos requiere aproximadamente 3 ml de colorante preparado. Verter con cuidado el colorante sobre el portaobjetos o utilizar una pipeta. Otra posibilidad es colocar el portaobjetos hacia abajo en tna bandeje detincién concavae introducir por debajoelcolorante. Tehir durante 5 a 10 minutos. Eliminar con cuidado el colorante afadiendo agua limpia gota a gota; nunca se debe eliminar directamente, inclinando el portaobjetos antes de lavarlo, ya que en este caso quedaria un depésito de espuma de colorante sobre la extension. Colocar el portaobjetos en una gradilla, con la extension hacia abajo, para que escurra y se seque, cerciorandose de que la extension no esté en contacto con la gradila Resultados de la tincién Son los mismos que los quese obtienen con el método ordinario, de tincién con Giemsa. 8on Lamina 5 Extensién en capa gruesa con Plasmodium vivax a - ae wre Las formas anularescaraceristicas (a), una de elas con i | ° - es exes dP. ovalsan ernst poss eta infor abs de Pole. Se senan dae eqns madres con poo pment (los tsuontes madros canteen ee 612 matey el get apace oo geefcomo una masa coneantada Se ede dst a onde Mado tn Sraiman compacts pen uno on Jos woterstes) eh enti neoaee ase * > or & | 8. So » * +. 4 k | 1s gametes inadurosy madues de ovale pied ser dfs de dstgul dels wooeatos midiox, Adan, lap garetocos de eta expec son de famafo y morologia similares alos de P. vivax, Dos gamtoctesredondeados con considerable pigmento grueso yun troforite fecha) Huston lo ic que es distin entre as fases, Son visibles dos trofzoltos y dos gametoctos (kl y tambien un gametocto nico con pigmento (CSS Lamina 8 Plasmodium malariae Este pardsito tiene una distribucion muy amplia en las zonas tropicales y subtropicales del mundo, en particular el Africa tropical, Asia sudoriental y, menos comunmente, las Américas. Su prevalencia es considerablemente inferior a la de P. vivax y falciparum. P. malariae tiene un periodode incubacién largo, normalmente entre 28 y 30 dias (margen de variacién 23-68). Como ocurre con P. falciparum, tiene sélo un ciclo de esquizogonia exoeritrocitica. Es posible la recrudescencia de la infeccién, araiz deinfecciones persistentes durante largo tiempo con niveles de parasitemia bajos 0 no detectables. Pueden ‘ocurrir infecciones mixtas, particularmente con P. falciparum. Todas las infecciones eritrociticas tienen lugar en la sangre periférica, La parasitemia es habitualmente baja. Los glébulos ojos infectados no se agrandan, y solo muy pocas veces se observa un punteado rosado palido (punteado de Zieman). El ciclo eritrocitico dura 72 horas. Problemas de diagnéstico: Las infecciones por P. malariae suelen presentar una parasitemia mas baja que las causadas por las, demas especies del paludismo humano y esto aumenta la dificultad de observar los organismos. En las extensiones en capa fina, la presencia de trofozoitos con la caracteristica forma en bande y de esquizontes dispuestos en roseta alrededor deun acimulo de pigmento es una caracteristica importante para el fiagnéstico. En los frotis de gota gruesa, los trofozoitos maduros pueden ser dificiles de diferenciar de los gametocitos de la misma especie. La fase mas distintiva de P. malariae en gota gruesa es el esquizonte maduro. Métodos de recuento de parasitos del paludismo en extensiones de sangre en capa gruesa ‘A menudo es necesario determinar la densidad de pardsitos de! paludismo en frotis de gota gruesa para que el médico conozca la gravedad de la infeccién palidica asi como la respuesta de los pardsitos al tratamiento, Para contar los pardsitos del paludismo en gota gruesa pueden emplearse dos métodos: a determinacién del nimero de pardsitos por ul de sangre y el sistema de cruces. 1. Ladeterminacién del nimero de parésitos por il de sangre se realiza haciendo el recuento de pardsitos en relacién con un numero estandar de leucocitos/i! (8000). Iniciaimente, se examina el frotis para determinar la presencia de pardsitos e identificar las especies. Utilizando dos contadores manuales, ‘uno para contar los leucocitos y el otro los parasitos, se seguird uno de estos procedimientos: i) sidespuésde haber contado 200 leucocitos se hanencontrado 10 0 més parésitos, se consignaré el resultado en la ficha indicando el numero de parasitos por 200 leucocitos; ii) sidespués de haber contado 200 leucocitossehanencontrado nueve parésitos o menos, se proseguirs el recuento hasta 500 leucocitos, y se consignaré el numero de pardsitos por 500 leucocitos. Después de los procedimientos i) 0 ii), se aplica una sencilla férmula matematica, multiplicando el numero de parésitos por 8000 y dividiendo luego la cifra obtenida por el nimero de leucocitos (200 6 500). El resultado es el numero de parasitos por ul de sangre. Es practica corriente contar todas las formas asexuadas de P. falciparum presentes. Esto es particularmente importante cuando se vigila la respuesta a medicaments esquizonticidas, que se prevé no tendran efecto alguno en los gametocitos. (pardsitos contados/niimero de leucocitos) x 8000 = pardsitosjul de sangre Ejemplo Si se han contado 200 leucocitos: (50 pardsitos x 800/200 leucocitos) = 2000 parésitos/ul de sangre Si se han contado 500 leucacitos: (5 parasitos x 800/500 leucocitos) = 80 pardsitos/ul de sangre 2. Un método mas sencillo de recuentg de parésitos en gota gruesaesel sistemade cruces. Estesistema es menossatisfactorio, empero, y debe utilizarse s6lo cuando no es posible hacer el recuento mas aceptable de parésitos por il de sangre. En este sistema se utiliza una clave de una a cuatro cruces de la siguiente manera + -10 parasitos por 100 campos de gota gruesa + 1-100 pardsitos por 100 campos de gota gruesa ‘+++ = 1-10 pardsitos por un campo de gota gruesa +++ = mis de 10 pardsitos por un campo de gota gruesa Recuérdese que para identifica adecuadamente los parésitos y hhacer un recuento fiable deben utilizarse portaobjetos limpios y frotis de gota gruesa bien preparados y bien tefiidos. ome &Medios auxiliares para Extension en capa fina con Plasmodium malariae Lamina & ~- w ] a b c d oe egg | ‘Trofozoitos: [os merozoites invaden los hematies maduros. Las formas anulares son bastante grandes y la mancha de cromatina 9 ‘mancha de cromatina puede estar stuada en el cento dela vacuola. Son poco comunes | suede ser perierca(a-d). casionalmenie, 3 las marchas de cromatinadables a invasion é los hematies por més deun organisa a) % 5 e f g os trofoatosrecen lntaneniey a menud se estion ao large del ecuador dle Os trofartes pueden presente on gan vocal odenda de plsmademoy madras ener una masa considerable de pigment gueso mare yocupan por ene eect, tie para producilascarateristcas formas en banda aseciadas con esta especie (gh) masa de cromatira alargada,loque les da una aparenciade canasta Los trofozitos | s % s Esqulzontes: Los esquizones inmaduros presentan menos divisions dela cromatina en tamanos y Tormas regulars (). Los esq TOmerozoites Imargen de variacion 8-12), que estan caractristicamentedispuestos en ulzontes maduros lenenpor io general 80 foxna de roseta alededor de una masa de igmento marén (k). Sinembargo, muchos. esquizamtes, que por lo comin ocupan todo el hemati jk), pueden tener el pigmento aghmerado en la periferia dsl organismo GD. a ® m n ° p ‘Gametocitos: En esa especie e dif de aiferencar ene gametocios y wolozotes. Losmacrogarietorits (m,n) tienen un ctoplasme més azul yl menichs de coreatine temas pequera, més roy mas compacta que la que se observa er fos micoganetocites. Elctoplasma de los microgametocitos es de colo rosaazulado clare(p)yIacronatina tes difusa, de calor azul rosaceo (0), Es muy visible & pigmento marrén con grinulos dispe'ss por todo el ctopasma (n-p).Medios auxiliares para el diagndstico de las infecciones Errores comunes en la preparacién de frotis sanguineos Al preparar los frotis es comin cometer ciertos errores, que pueden afectar al etiquetado, la tincion o el examen de las muestras, yen algunos casos a mas de una de estas operaciones. Frotis mal colocados Se debe tener cuidado en colocar correctamente los frotis sanguineos en el portaobjetos. De locontrario, puede ser dificil ‘examinar la gota gruesa. Ademés, alguna porcién del frotis puede incluso desaparecer durante el proceso de tincién o de secado. Exceso de sangre Después de tefl un frotis que contenga demasiada sangre, el fondo de la gota gruesa ser demasiado azul. Habra asimismo muchos leucocitos por campo de gota gruesa, que pueden oscurecer u ocultar los eventuales pardsitos del baludismo. Sila extension en capa fina es demasiado gruesa, os glébulos rojos quedaran encimados y sera imposible examinarlos adecuadamente después de la fijacion. Portaobjetos extensor con borde astillado Si el borde del portaobjetos extensor esta astillado, el frotis en capa fina no se extiende de manera uniforme, queda veteado ytiene muchas “colas”. La extensiéndela gota gruesa también puede resultar afectada, S55 = & = Extensién fina demasiado grande y gota gruesa desplazada Sila extension fina es demasiado ancha, la gota gruesa quedara_ desplazada y tal vez tan cerca del extremo del portaobjeto que no se podra ver con el microscopio. Durante la tincién o el secado es probable que algunas porciones de la gota gruesa sean raspadas por los bordes de la cubeta de tincién o el escurridor. Puede ser muy dificil, o imposible, colocar la gota {gruesa en la platina del microscopio en una posicién que permita su examen. Muy poca sangre Sialpreparar el frotisse ha utilizado muy pocasangre, no habré bastantes leucocitos en el campo de gota gruesa y no se podra examinarsuficiente sangre en el examen estandar. La extension fine también puede resultar demasiado pequefa para.utilizarla como etiqueta. Frotis extendidos en un portaobjetos grasiento En un portaobjetos grasiento, los frotis no se extienden de manera uniforme, lo que hace muy dificil el examen. Parte de la gota gruesa puede desprenderse del portaobjetos durante el proceso de tincién. Eee — —- § Otros errores comunes Otros errores que ocurren cominmente al preparar frotis de sangre son los siguientes: + Moscas, cucarachas u hormigas comen la sangre seca y dafan los frotis. * Los frotis se preparan en portaobjetos muy rayados 0 con superficie “escarchada” o iridiscente. * La gota gruesa se deja secar en forma despareja + Se produce la autofijacin de la gota gruesa por el transcurso del tiempo © por exposicion al calor, y la tincién resulta entonces dificil 0 insatisfactoria, + Los portaobjetos se empaquetan antes de que todos los frotis de gota gruesa estén suficientemente secos y se pegan unos con otros HOMak ee Las formas anulares suelen set pequeiasy poco nume'osas presentan grandes manchas de romatina yuna pequefacantidad dectoplasma, amenudo sn vacuola (a,b). Los anilos pueden carecer de un crculo completo de citoplasma (a), pero en un campo que contiene varios trafozoitos se puede ver una forma anular completa (b). Los trafozoitos |6venes (¢) pueden no tener vacuola, ! pigmenta se forma tempranamente en esta especie y se presenta en forma de granos yruesos y oscurcs (b, ¢) $- “4: 9 * Lostrofzoltes en crecimiento (de presentan formas ari h ables, Seobservan restrofozoitos edondeadospequefos(e, echas) "unesquizante f, flecha) que contiene 8 merozoftos yuna masa cempacta de pamento, junio con unos pacos trot zits redondeados y dos levcocites, 5), junto con un wofeoitoen crecimiento, Esvisible > « #& ’ * _% Sse observan esqulzontes madurs, que cantienen & merazol fesquizontey un trofezoteredondeada. Un esquizonteinmaduro Oi, fecha, se puede observa en el mismo campo Rs (9) en cada uno de os esquizontes hay pequefas mass oscras de pigmento concentradas. En (h) seven el que tes esquiontes maduos() J ° ey ky o = 3 sehr do guianes mas un aout, 0s gatos son masa 0 ue os fring pets Aletha) con formas anularespequetasywolozoitos en reimiento, ios gametacos pueden se dficles de dstnguirde bs tok ‘afanos de pigmento duros dstibuidos ex la perferia, pero no ast os trofozates, Tedondeados (fecha). Se veun gametocto (, ztos maduros los gametocitossuelenpresentatCero Lamina 10 Infecciones mixtas Enlas zonas donde dos o mas especlesson endémicassepueden presente. Cuandose tienen dudasacerca de la presencia de mas encontrar infecciones por mas de una especie de parasites del de una especie, la infeccién multiple se puede confirmar paludismo. Por diversas razones, esasinfeccionesavecesnoson mediante una detenida evaluacién de la extension fina advertidas por los microscopistas, Si para el diagnéstico s6lose _preparada en el mismo portaobjetos. preparan extensiones de sangre en capa fina, como sucede en muchos laboratorios, las parasitemias de baja intensidad de La infeccion mixta mas comin es probeblemente la de P. una especie u otra pueden quedar ocultas por la especie falciparumcon . vivax. Sin embargo, cualquier combinaciénes predominante. También puede ocurrir que los microscopistas posible, sein la zona geogréfica de que:se trate. Si bien las dejen de examinar un frotis sanguineo una vez que han _infecciones mixtas con dos especies plasmédicas son las mas encontrado e identificado el primer pardsito. En general, para _corrientes, muchas veces se observan también infecciones con detectar satisfactoriamente las infecciones mixtas suele ser tres especies. Las infecciones mixtas sobrevienen mas neceserioun examen méslargoy masdetenidodelasextensiones _comunmente en nifios que en adultos. Come en el diagndstico de que se dispone para el diagndstico. de toda infeccién palidica, la identificacién de las especies de las infecciones mixtas depende del reconocimiento de las fases Se preparan extensiones en capa finay en capa gruesade cada fundamentales para el diaanéstico (por ejemplo, esquizontes o paciente en el mismo portaobjetos. La gota gruesa debe _gametocitosen algunos casos) odelas aracteristicasdel parasito ‘examinarse primero. Las infecciones mixtas se descubren mas (por ejemplo agrandamiento de los eritrocitos y presencia o facilmente en los frotis de gota gruesa a causa del mayor _ausencia de punteado enalgunas especies). Las formasanulares volumen de sangre que se examina. Es mas probable que los (trofozoitos jévenes) de cada especie por lo general estan microscopistas que examinan extensiones en capa gruesa _distorsionadas en los frotis de gota gruesa y raramente son sistematicamente detecten parasitemias de baja densidad y utiles para determinar las especies. Las imagenes que se fengan_ mejores oportunidades de encontrar fases _presentan mas abajo ayudan a aclarar estos puntos. fundamentales para el diagndstico de cada especie paltidica ea . {nfeccion mixta en extensiones en capa fina: Gametocito de ,fleiparurien forma de salchica (a y tofczlt oven de P vivax lecha) en an ertrocito que muestraun letepunteadode Schiffner. Gametocio de Pfalcperurcon un wofozitomaduro dP iraxen un qldbulo rojo agrandado (b). Esquizonte madurade P. saxcon muchos merazotos yuna gran mara de pigmeto a un ado, yesquizontemas paquefo de P.malaizequecomiene menos nerozots J sla pequehes granules pigment (@).Trofozot de P malaioe forma de banda en un etracto de tama normaly trofozoto madure dP vivax mucho mayor en un labul oj agrandado en el que se obseva!puntado de Schnee. 7 Ree a ~ $ >. he ¥ > . " e J Infecciones mistas en extensiones en capa gruesa: Camente vibes, un pico gameoco de Pfalprum econ otras vee, ect grande) y eo cman (ech ecu de via juts uns ats, saute mad ane devon ftha gran) con pigments my wl. exqurote mad, malmente mas pequeto, de P. malariae, fecha pequei) Infection tiple (g), con un gametocto de P fajparum(g echa grance infer), un esqulzonte maura de 2, malariae (g, fecha grande superio),y dos roozotos maduros de P. viva, flechas pequefia).Ifeccién mista por P. vax P. malariae con Tuertesparastenias de ambos (hi; ene! cento del campo, esquizontes madutos de . vivax can muchos metozotesy pigmento muy visible, yun esquizante mas pequrfo de P. malariae adyacente (h, fecha PPequena); se abservan un segundo esquizonte de P. vivax (h echa grande) y trofezotos de ambas especies dspersos ene campo.Cee Lamina 10 Cuadro recapitulativo Fases del parasito en la sangre periférica Especie Trotezoita Esquizonte Gametocita s eOOPf stu Ee g\3 Fee dS & gis oo? ts WJ a scans ea of Jpeen z & | 3 | romano: pequeto a medio; muimero: a| Engerieral aociada 2 numerotas formas | Son infrecuentes las formas inmaduras de 2 | EF | menudo numeroson: forma: formas en] jovenes en anilo. Tamano. pequcn, [extremes puniagudos. formes matures 3 | 2 & | anioyencoma frecuentes; cromatina:a | compacto; nimero: pecs, infrecuentes, | redondeadas o en forma, de banana: E | 22 | menudo dos manchas: citoplasma:| generalmente en el paludismo grave: |cromatina: masa unica, bien datinida, B | 2 | regular ino a camoso; formas maduras| formasmaduras: 12-300mas merozoites | lgmento:dsperso, grues, ricforme & % | 2 | presentesa vecesen el paluaismo grave, | en racimo.compacto; pigmento: masa | ereshay ncorpuscus deenusonrosado. © | Compactas con pigmento en forma de | osura unica, A menudose ven formas erosionadas que 5 | masa de algunos granos gruesos 610 tener cromatinay plomento, Be] @@ ®t x [$22 § Ess B29 | camanor:pequnne’ a granoe; nomara:| Faroe gfane; numero {pxeso| tas: ron immeueas-ton atone a | 2 =| pocos 0 moderadamente numerosos; | moderadamente numerosos; formas | distinguir de los trofozaites maduros. 3+, &| forma: a menudo anillo roto o formas | maduras: 12:24 merozoites, en general | Formas maduras: redondas, grandes Fe E 2] irregulares;cromatina: unica, avecesdos; | 16, en racimo irreguiay; pigmento: masa | cromatina: unica, bien definida; FZ = £] ctoplasma: inegular 0 fragmentado; | poco compacta plgmento: disperse, fino. Hay formes ga © | formas maduras: compactas, densas; erosionadas con poco citoplasma o sin BF al clomento: disperso, fino. Citoplasmay solamente con ctomatina ae pigmenta, ee e%atoaw 38 an ‘ Bee] OO ge Ge eee Ise ° " = a ges § l2es 2 g |5a3 2 F @ | ¥ 23 | Tamano: puedeser menor queen vivax; | Tamar: bastante parecido a P. malariae; | Las formas inmadurss y algunas de las madras 3 °2| nimero: generalmente pocos; forma:| numero:. pacos, formas madras: 4-12 | son elles de dstingul de los ofovotes 5 8) onitlos formasredondeadas, compactas; | merozoitos, generaimente 8, en racimo | maduros. Formas maduras; redondas, 5 Z| cromatina: nica, prominente: | poco compacto; pigmento: masa | compacts comatns nica, ben defini: = £| citoplasma: bastante regular, camoso; | concentrada pigmento:disperso,qrueso,avecescistribuido 2 =| piamento: esperso, qrvso paifericamente Hay tormaterodonadascon ae cromatinay pigmento solamente. = oe see © | eoeee ee@or j & |e ee& oe S| 4 S| = _| tamario:pequeno:nimero:generalmente | Tamafto: pequerto, compacto; numero: | Las formas inmaduras y algunas de las E | = | pocos: forma: de anillo a redondeads, | generalmente pocos: Formas maduras: | maduras on dificiles de distinguie de los a | £ | formas compactas: cromatina: unica, [12 merozoites, generalmente 8, en |twofozcttes madutes. Formas maduras grande; citoplasma: regular, denso; pigmento: disperso, abundante, con un ‘inte amarileanto en las formas masviejas ‘acimo poce compacto; algunos parecen carecer de citoplasma; pigmento concentrade, redondas, compactas; cromatina: unica, bien definida; pigmento:disperso, grueso, 2 veces dstribuido periféricamente, Hay formas erosionadss con cromatina y pigmento solamente,Lamina 11 Limpieza y conservacion de los portaobjetos Preparacin Los portaobjetos para la preparacién de frotis sanguineos deben estar escrupulosamente limpios y exentos de grasa o humedad. Los frotis preparados en portaobjetos sucios 0 grasientos pueden desprenderse durante el proceso de tincién. No se deben utilizar portaobjetos rayados, de aspecto “escarchado” niiridiscentes para preparar extensionesde sangre (aunque pueden emplearse en el laboratorio con otros fines). Limpieza Los portaobjetos nuevos deben sumergirse en agua con un detergente apropiado durante 30 a 60 minutos. Se enjuagan luego en agua corriente del grifo 0 en un bafio de agua limpia que se renueva varias veces. Cada portaobjetos debe secarse con un pafio limpio que no deje pelusa. Los portaobjetos usados deben sumergirse durante al menos una horaensolucion de hipoclorito antes de lavarlos. Estos portaobjetos se deben sumergir en agua con detergente durante uno a dos dias. Con luna gasa 0 algodén se debe eliminar cualquier rastro de frotis anteriores y de aceite de inmersién. A continuacién se enjuagarén con agua corriente del grifo 0 en varios bafios de agua limpia. Los portaobjetos se deben secar uno por uno con tn patio limpio que no deje pelusa Conservacién Los portaobjetos limpios (nuevos o usados) se deben envolver, en paquetes de 10 unidades, en papel fino sujeto con cinta adhesiva o bandaselésticas; los portaobjetos se puedenconservar y transportar en estuches de carton para portaobjetos. En las Zonas tropicales y subtropicales, los portaobjetos limpios se deben guardar en un lugar seco 0 en un armario con aire caliente. Si quedan almacenados a temperatura ambiente con un alto porcentaje de humedad, los portaobjetos se pegaran unos con otros al cabo de unas pocas semanas. Cuidado del microscopio + Manténgase siempre el microscopio cubierto con una funda limpia de plastico o de tela mientrasnose utilice, para protegerlo del polvo, especialmente en los climas cAlidos secos., * Protéjase el microscopio de la proliferacion de hongosen los climas célidos himedos guardandolo en un cuarto con aire acondicionadoocon deshumidificacién permanente, colocando en la caja de! microscopio una bombilla de 15 w, que quede constantemente encendida, o conectando varias bombillas de 15 6 25 w, que queden constantemente encendidas, en un armario cuyas puertas cierren bien. impiese el aceite del objetivo de inmersién todos los dias. * Indiquese el nimero de modelo y, de ser posible, el numero de instrumento y de pieza cuando se pidan piezas de repuesto. * Nose debe desmontar el microscopio para limpiar partes de dificil acceso. + Nose debe utilizar alcohol para limpiar el microscopio. + No se deben limpiar los oculares con otra cosa que no sea papel especial para lentes seco. * No se deben dejar abiertos los portalentes; utlicese la tapa apropiada provista ouna cinta selladora para errarla abertura * No se deben intercambiar las lentes ni las piezas dei microscopio. + No se deben guardar los distintos oculares y objetivos sin antes haber colocado cada uno en un saco de plastico herméticamente cerrado, con una bolsita de gel de silice autoindicador. Este gel es azul cuando esta activo y vira al rosado cuando ha absorbido toda el agua posible. Puede reactivarse por calentamiento y volvera a tomar otra vez color azul * Nose debe guardar el microscopio en su caja durante largos periodos ni transportarlo sin ajustar el torillo que lo sujeta. a weet geaM et uccerkeel seneMes Mts ease de las infecciones paludicas Lamina 11 Babesiosis Lababesiosis humana (piroplasmosis) es una enfermedad animal que puede transmitirse ocasionaimente a los seres humanos (es decir, una zoonosis). Babesia spp. son protozoarios intraeritrociticos, pertenecientes al filo Apicomplexa, que infectan a los vertebrados en ef mundo entero. Las infecciones humanas comprenden las provocadas por 8. microti un parésito de los roedores, B. divergens, un parasito bovino y B. equi (reclasificada como Theileria equi), un pardsito equino. Como los pardsitos del paludismo humano, Bebesia spp. invaden les glébulos rojes; sin embargo, neproducen pigmientos ni causan el agrandamiento de los hematies huéspedes. Babesia spp. difieren de Plasmodium spp. por cuanto no tienen un ciclo hexoeritrocitico, una esquizogonia propiamente dicha ni gametocitos. La reproduccién es por “gemacién” y produce solo cuatro merozoites, que a menudo se disponen en forma de “cruz de Malta’ (e, flecha) o quedan dispersos al azar en los hematies (h). Sehan registrado casos en seres humanos en Asia, Europa y América del Norte, pero noen Africe. Dentro de los hematies huéspedes, los pardsitos son pequerios (1-2,5 micras de diémetro) y se parecen mucho a las tempranas formas anulares de P. falciparum, con las que muy a menudo se los confunde. En consecuencia, el diagnostico de Babesia spp. en frotis sanguineos suele ser dificil; ciertamente, muchas infecciones se diagnostican incorrectamente como causadas por Plasmodium spp., especialmente P. falciparum. Pocas veces se notifica la presencia de Babesia spp. en seres humanos. Los pacientes esplenectomizados tienen muchas mas probabilidades de contraer la infeccién. E| mayor conocimiento de esta enfermedad puede hacer aumentar la notificacion de casos, y los microscopistas deben estar atentos a la posible presencia de esta infeccion, ooze ee HEN Esiroétrinfectades por Bateia micoif) Minizcls omas alas que pudn sar contunddas con as dled formato anilo de Plolum falparum, son carats do ‘estinfecon core una gan varadénen fa motologiade Babes fo miso quelanecen milipede ls eitectos, eproducelafomaconenteada, pevonmes an recat ‘como en otras especies de Bobesia que infetan ast human. Obsénvesecémovata el ama delos organismos (ae, en parka las pequeias formas arulrcs que se obser en ‘ats etroctos con un aurento un poco mener. Tanibién seve cuatro organisms dente de un quem estan dspuestos en una ipia formaen tetrad, CCaracteristcasformas en tirada de Teleriaequliantes Babesia equ presente en tis de sangre humana (ef: otra fomas morflbgicas del patito son visiblesenvaios ‘ois entractas infectados, En una especie o desta de Babesiaprocedete de California (Estados Unidos de América se observa una formacionen tétrada en dos etoctos, {g). Organisms en forma de pea (h similares en su morfologia alos de Babesiadvgens en varios hematis de un frots de sangre humana.Erk ee Lamina 12 Utilizacion del microscopio Una combinacién de lentes consistente en un ocular 10x y un objetivo 100x, para obtener un aumento total de 1000x, es la norma a la que se ajusta la mayoria de los microscopios actualmente disponibles. £1 microscopio puede tener un ocular (monocular) 0 dos (binocular). Los microscopios binoculares son més faciles de utilizar y fatigan menos, sobre todo cuando seutilizan durante periodos prolongados. Todoslosmicroscopi necesitan una buena fuente de luz, ya sea natural (luz del dia) © artificial (una lampara de microscopio alimentada con electricidad de la red, pilas © un generador). Casi todos los microscopios modernos tienen una lampara incorporada. ‘Algunos microscopios tienen una lémpara desmontable que se puede sustituir por un espejo. Las lamparas de microscopio también deben tener un filtro “luz del dia” azul para convertir laluz “amarilla” delalamparaeléctrica en luz “blanca” natural. Estos filtros se utilizan para reducir al minimo las diferencias de color de los parésitos del paludismo tenidos en la extension sanguinea, lo que a su vez facilitael diagnéstico. La posibilidad de regular la intensidad de la fuente luminosa es indispensable para una buena microscopia, y la mayoria de las lamparas de microscopio tienen una emisién luminosa regulable. Todos los microscopios llevan incorporada una combinacién de condensador y diafragma iris con los que se logra la intensidad luminosa éptima final. Si se emplean un espejo y luz eléctrica, hay que utilizar el lado plano del espejo; con luz natural se utiliza el lado céncavo, prescindiendo del condensador. Para poner en funcionamiento el microscopio, se enciende la lampara o se pone el espejo en posicién adecuada para que refleje la luz. Se hace subir al maximo el condensador y se regula el diafragma iris en dos tercios de su apertura maxima. Luego se quita un ocular y se mira por el tubo. De ser necesario, se lineal condensadorilampara el condensadorlespejo para que la luz mas brillante llegue al centro del condensador. Se vuelve a poner el ocular en su sitio. Se aleja el objetivo de la platina. Se vierte una gota de aceite de inmersién en elextremo redondeado de la extensidn de sangre en capa fina. En algunos paisesse emplea anisol paratrabajar conel objetivode inmersion; este producto tiene el mismo indice de refraccién que el aceite deinmersion. Se coloca el portaobjetos en la platina. Mirando desde el lado del microscopio, con el tornillo macrométrico se hace descender el objetivo hasta que toque el aceite de inmersién. El frotis esta listo entonces para ser examinado. Accionando el tornillo micrométrico se enfoca el campo y se regula ta luz para tener una intensidad confortable. Se sequiré el mismo procedimiento para examinar la extensién en capa gruesa. Alfinal delasesion de trabajo, se deben limpiar adecuadamente las lentes de inmersion. Si se ha utilizado anisol, como esta sustancia se evapora del frotis sanguineo despues de cierto tiempo, no es necesario lavar la muestra y hay menos Posibilidades de que sufra dafio. Cuando se utiliza anisol tampoco es necesario limpiar el objetivo. Por otra parte, el aceite de inmersién se debe quitar con cuidado con papel especial para lentes ligeramente humedecido con xileno.. Sise desea conservar los frotis sanguineos examinados, se deben sumergiren xilenoysecar luego cuidadosamente con un pafiuelo de papel antes de guardarlos en el estuche correspondiente. Partes de un clésico microscopio compuesto 1.Tubo principal 2.Cuerpo (prisma) 3.Portaobjetivo giratorio 4.Objetivo 5,Platina (platina mecanica) 6.Condensador con diafragma iris 7.Espejo Pie 9.0cular (pieza éptica) 10.Brazo 11.Tornillo macrométrico 12.Tornillo micrométrico } cabeza inclinada peEUEIO ay veeMedios auxiliares para el diagnéstico de las infecciones palidicas Lamina 12 Artefactos y elementos celulares es teseiites en las extensiones de sangre m . are | iets biancos(eucoctos) en entersiones de sangre ad: euts a, un eso (nino Go Aula mas pequea) yn monoat (yun asia (se ‘encuentran corientemente al examinarextensiones sanguinss, eS oe ey of) g © o Paquetes (¢, ibs ents gldbulos jos: cuando varias plaquetas se syperponen sobre os eroctos(e), ost foman un racimo (M, se asenejan superfcaimenve alas esquizontes y pueden dentficarse equvocadamerte. Los anilos de Cabot(g, f), un tbo de cust celular d= (os hematies que a menudo adopt Ia forma de anillo ovalado, _apaecen en anemias graves y se piensa que son restos de fibasfusformes que se foman durante la mitoss o.-. 8) Se eo). “ ©, alle @ ©. ne > Los ce fi us “lly (i, granulos a se tifion ds pairpura y represontan fragmentas nucleares (ADN). A veces se. costes ‘con las manchas de cromatina crates de = ea pause. tos spperhemer son depositosbasolos pelos e tregulzes que se encuentran en los wats, a veces en Secon cos co Geol ly, oub se Cees ts ue ot publ even fot takin peda oe cavints om rots al Daur por mrscopitas con pos experienc he a \groenoneesongepue esr raniodpe acer se cbamaeroncesinracnodebacersupepuesascbre uneitocto im os fotsnmineosmal eonadosdesuie Eatoorat cecceueen come iconic oeras teers trae sin fread been ‘pepe oe emogep (re dnceotalirignnerroniesep' aes, Abdecaseratpacie ‘kde et casa See cee Ove nu coun mitogen ders Gpaana next sms gen usa Po ene nace.