A.E.F.I. ASOCIACION ESPANOLA DE FARMACEUTICOS DE LA INDUSTRIA. VALIDACION DE METODOS ANALITICOS AUTORES Generalidades, materias primas y especialidades farmacéuticas Leticia Aguirre Ortega Maribel Martin Pomar F. Javier Garcia Garcia Begofa Mateos Pérez Tetesa Garcia Junca Cristina Ochoa de Echaguen Aguilar Mique! tilera Fontanet Miguel Angel Ortega Sanchez Marta Juncadella Roca Marti Pujol Forn Monica Lizondo Carbo Marisa Reig Serrat ‘Anna Maria Liuch Sanfeliu Marta Torres Gontaus Métodos en Microbiologia ‘Susana Antinez Moreno Cesca Niubé Prats ‘Ana Maria Carro Vinaras Maria Pilar Oliver Aguera Antonia Garcia Avila Métodos en Bioandlisis Me Cruz Caturla Perales Carlos Nieto Abad Carles Cetma Lezeano José Antonio Pérez Cuadrado Gregorio Encima Garcia Maria Rovira Guerin Josep M. Jansat Rufach Digna Tost Robusté Estadistica aplicada y tablas estadisticas Rogelio Cortés Loras COORDINADORES José Antonio Pérez Cuadrado, voca' ae 160 ae ls Seccin Caaiana de AEFI Marti Pujol For, vocal de Conte Caidad dels Secciin Coat de AEFILa Asociacion Espajiola de Farmacéuticos de la Industria-AEFI, agradece la inestimable colaboracién de las siguientes empre- sas que han facilitado la edicion de esta monografi Agilent Technologies Innovating the HP Way analitica MERCK AGILENT TECHNOLOGIES Carretera Nacional VI - Km 18,200 28230 Las Rozas (Madrid) Tel.: 91 631 30 42 MCC ANALITICA, S.A. C/. Ganduxer 129 08022 Barcelona Tel.: 93 212 00 33 MERCK EUROLAB Distribucion material para laboratorio Pol. Merck 08100 Mollet del Vallés (Barcelona) Tel.: 93 565 55 00 PERKIN ELMER, S.L. Av. Universitat Autonoma 3A 08290 Cerdanyola del Vallés (Barcelona) Tel.; 93 582 45 22 PH-C Laboratorio de analisis C/. Esmeragda 19-21 08950 Esplugues de Llobregat (Barcelona) Tel.: 93 473 96 62 SOCIEDAD DE VALIDACION DE SISTEMAS, S.L. C/. Fedanci 8-10 — Baixador de Sant Joan 08190 Sant Cugat del Vallés (Barcelona) Tel.: 93 675 25 24INTRODUCCION: OBJETO, AMBITO DE APLICACION Y CONTENIDO DE LA MONOGRAFIA En el afio 1989 un grupo de profesionales integrantes de la Seccion Catalana de AEFI (Asociacion Espanola de Farmacéuticos de Industria) preparé una. monografia sobre “Validacion de métodos analiticos”. Por aquel entonces era un tema de gran actualidad pero estaba lejos de su regulacion y habia muchas opiniones divergentes de su necesidad 0 de como llevarla a cabo. Estaba muy extendida la idea de que la validacién analitica era un {ramite burocratico, con poca 0 ninguna implicacién por parte del laboratorio y que bastaba incluiria en los dosiers de Registro Los objetivos primordiales de aquella publicacién fueron + Aportar una vision global y sistematizada de la validacion analitica. ‘ * Orientar a los técnicos de los laboratorios de control e 1D que se enfrentaban, en su trabajo diario, a la problematica de la validacién. EI ambito de aplicacién de a monografia’ se dirigié principalmente hacia los métodos analiticos de tipo quimico e instrumental de uso mas comun: control de materias primas. producto terminado y estudios de estabilidad y de desarrollo galénico, : Los métodos analiticos de tipo microbiolégico y los destinados a estudios de metabolismo. farmacocinética y bioequivalencia podian presentar particularidades que no se contemplaban en aquel trabajo. Desde entonces y hasta la actualidad la situacién ha cambiado radicalmente, de tal forma Que hoy en dia no se concibe la idea que un laboratorio pueda utilizar un método analitico que no haya sido objeto: previamente de algun tipo de validacion, transferencia o, simplemente, comprobacién. La bibliografia cientifica en este campo es tan abundante que se hace dificil seleccionar los trabajos mas interesantes. Actualmente el tema esta bien regulado, con monografias de caracter obligatorio como las publicadas en las Farmacopeas Europea y Americana o bien con textos de cumplimiento recomendable como son las Normas ICH (Intemational Conference Harmonisation) o las guias editadas por las agencias. teguladoras. A pesar de todo ello, de forma periédica_y desde diferentes sectores, se han venido fecibiendo peticiones de actualizacién de la Monografia AEFI. Las Vocalias de Control de Calidad e 1+D de AEFI Catalana decidieron finaimente acometer de forma conjunta ta confeccién de una nueva Monografia y crearon una comisién de trabajo con este fin A grandes rasgos el planteamiento de la Comisién se basé en que la Monografia debia ‘cumplimentar los puntos siguientes: 1) Ambito de aplicaci6n amplio, con inclusion de todos los campos analiticos de las areas quimica, galénica. microbiolégica y farmacolégica. 2) Explicacién y desarrollo de los principales conceptos tedricos. 3) Inclusion de ejemplos, 4) Explicacién de los éonceptos estadisticos necesarios para una buena comprensién de la parte teorica y de los ejemplos ’For motivos practicos, la Comision se dividié en cuatro Subcomisiones (Especialidades y La segunda parte trata de la Validacién de métodos analiticos de tipo quimico e instrumental para especialidades y materias primas. So desarrollan los parametros fundamentales de la validacion (selectividad, linealidad Precision, exactitud y limites de Geteccion y cuantificacion) y una serie de temas relacionados. idenenica de los sistemas, La cuarta parte trata de la Validacién de métodos analiticos para los estudios de Farmacologia, Farmacocinética y Bioequivalencia y se basa en of eetecio y comentario Critico del borrador de la FDA (Food and Drug Administration) sobre “ ioanalytical Methods Validation for Human Studies": Validacion durante la tase previa a un estan (selectividad, curva de calibracion, precision, exactitud, recuperacidn, estabilidad de las muestras), validacion durante la fase de realizacion del estudio y documentacion Finalmente la quinta parte sobre Estadistica aplicada incluye una exposicion de los desenige- stadisticos fundamentales (poblacion y muestra, indices estadisticcs fegresion y disefios factoriales, Finaliza con una resefia de k estadisticos disponibles en el mercado. La Comision agradece especialmente ta colaboracién de las empresas que han Maansorzado el proyecto, gracias a la cual se favorecera la difusién y distnibucion de 14 MonografiaINDICE GENERAL ABREVIATURAS_.......-. . i: GLOSARIO ... oe eed PARTE| — GENERALIDADES PARTE II: VALIDACION DE METODOS DE ANALISIS EN MATERIAS PRIMAS Y ESPECIALIDADES FARMACEUTICAS PARTE Ill: VALIDACION DE METODOS DE ANALISIS EN MICROBIOLOGIA PARTE IV: VALIDACION DE METODOS EN BIOANALISIS PARTE V: — ESTADISTICA APLICADA. APENDICE " 19 39 136. 209 249 315a (=a) b (=B) e e% gl (=v, DF) kK miz eS oe x N Abreviaturas y simbolos. 7 ABREVIATURAS Y SIMBOLOS Termino independiente en una recta de regresién o curva de calibracion Pendiente en una recta de regresién o curva de calibracion. Diferencia significativa en una prueba estadistica v)) Residual en la recta de regresion Error en porcentaje. { Factor de respuesta | \ Grados de libertad. Factor de‘tapacidad.” Relacién masa/carga en espectrometria de masas. Generalmente coincide con la masa de un ién (si la carga es la unidad), Tamaho de la muestra; numero de valores ‘de una serie; numero de réplicas de un tratamiento. Nanogramo, Nanémetro, Probabilidad de que un estadistico determinado sea mayor que el valor observado. Partes por millon (equivalente a pg/mL 0 g/g). Partes por billon anglosajén (1x10) (equivalente a ng/mL. 0 ng/g). Coeficiente de correlacién. Coeficiente de determinacion. Desviacion estandar de una muestra Variancia de una muestra, Desviacién estandar de la media Estadistico de Student. Tiempo de retencién de un analito. Tiempo muerto (tiempo en el que un compuesto no retenido pasa por el interior del sistema). Variable independiente (valor nominal), Media de una muestra. Valor estimado 0 calculado de la variable independiente. Variable dependiente (valor experimental). Valor estimado 0 calculado de la variable dependiente. Variable tipificada de la curva de Gauss 0 normal.8 Abreviaturas y simbolos ‘AAPS American Association of Pharmaceutical Scientists. AOAC Association of Official Analytical Chemists. ‘ANOVA Analisis de la variancia. BPL (=GLP) Buenas practicas de laboratorio. CCF (=TLC) Cromatografia en capa fina. cr lonizacién quimica (método de ionizacion en Espectrometria de Masas) CLE Concentracién limite de endotoxinas (método LAL), CSE Endotoxina estandar de control (método LAL). CV (=CV%) Coeficiente de variacién D Estadistica de la prueba de normalidad de Kolmogorov. DAD Detector de diodos. DF Grados de libertad DLs Dosis letal 50. eC Electroforesis capilar : EMEA Agencia Europea de Medicamento. EPA Environmental Protection Agency, eu Unidades de endotoxina (método LAL). EP(=Eur. Pharm.) Farmacopea Europea. ER% Error relativo porcentual. Se utiliza especialmente en Bioandlisis, F Valor de la distribucién de Snedecor-Fisher. FDA Food and Drug Administration. FTIR Espectrometria IR con transformada de Fourier. 6 Estadistico de la prueba de homogeneidad de variancias de Cochran GC(=CG) —_Cromatografia de gases. ‘ Gc-Ms Acoplamiento de cromatografia de gases con espectrometria de masas. om Media geométrica (método LAL) HPLC Cromatografia liquida de alta resolucién, He Hipotesis nula. Hy Hipotesis alternativa. IC(=LC) —_Intervaio de confianza. ICH International Conference of Harmonisation. tupac International Union of Pure and Applied Chemistry, kK Numero de grupos. LAL Lisado de amebocitos de Limulus. LC (-LOQ) Limite de cuantificacion. LD(=LOD) Limite de deteccién Lims Laboratory Information Management Systems,Mc (=Ms) MDv Ms Ms-MS N NIST NMP RSE SC (=Ss) SIM T TSA TSB UFC usp uv a B v (=gl 6 DF) Zann m M ug (=meg) ¥ Abreviaturas y simbolos 9 Media cuadratica (en ANOVA). Maxima dilucion valida (método LAL). Espectrometria de masas. . Espectrometria de masas en tandem Numero de platos tebricos National Institute of Standards and Technology. Numero mas probable de microorganismos. Patron de referencia de! método endotoxina (LAL). Pass/Fail Cutoff (método LAL). Estadistico del test de recorrido de Dixon, Porcentaje de recuperacién Resolucién (cromatogfafia). Endotoxina estandar de referencia (método LAL). ‘Suma de cuadrados en ANOVA. Monitorizacion selectiva de iones (método de adquisicién de elevada sensibilidad en espectrometria de masas). Factor de asimetria Agar triptona soja. Caldo triptona soja. Unidades formadoras de colonias. Farmacopea de los Estados Unidos Ultravioleta. ‘Anchura de pico cromatografico. Error de tipo | (falso positivo), Error de tipo II (falso negativo). Grados de libertad, Longitud de onda. Sensibilidad del lisado (LAL). Estadistico de la distribucion de Poisson. Desviacion estandar de la poblacién. Variancia de la poblacion. ‘ Media de la poblacion. Microgramo. Estadistico de Chi cuadrado.Glosario 11 GLOSARIO El presente glosario se limita a los términos estadisticos y propios de, ja validacién analitica En los casos procedentes se indica entre paréntesis la expresién equivalente en lengua inglesa. Analito (Analyte) sustancia contenida en la muestra sometida a andlisis. Blanco de matriz biolégica (Blank matrix). Matriz biolégica (normalmente sangre, plasma, suero u orina) libre de los analitos a cuantificar. Blanco, placebo o matriz de la muestra (Blank, placebo, sample matrix). Muestra Preparada para la lectura final pero que no contiene analitos. Puede ser un blanco de los Feactivos 0 bien un blanco de la muestra problema que contenga todos los ingredientes de la muestra problema excepto los analitos. En este’ ultimo cago se denomina placebo o matriz de la muestra, - Este concepto de _matriz no puede aplicarse a las plantas medicinales, ya que no es posible Separar los analitos del resto de componentes. ‘En el ambito de plantas el término matriz se utiliza como sinénimo de muestra representativa, Cantidad declarada o nominal (Labeled amount). Es la cantidad 0 concentracién tedrica de un analito. Cuando se trabaja con concentraciones relativas se le da valor 100. Cantidad estimada 0 calculada. Contenido, riqueza, potencia. Es la cantidad o concentracién de analita hallada tras la ejecucion del método analitico, ya sea por un método directo 0 por comparacién con un estandar o varios estandares (interpolacion en una curva de calibracién), Coeficiente de variacion o desviacion estandar relativa (Coefficient of variation or relative standard deviation). Es la desviacién estandar expresada como funcion de la media. Normaimente se exptesa en porcentaje. cr ea= **100 Desviacién estandar (Standard deviation). Estadistico basico indicativo de la dispersién variabilidad de los resultados. ' - EOP, [ne Gy? TT ae Desviacién esténdar de la media o error estandar (Standard error of the mean). La desviacién estandar de una media de n resultados se obtiene a partir de la siguiente expresion: In Disefio factorial (Factorial design). Plan de experimentacién cuya caracteristica mas destacable es que los valores de todos los factores se van moviendo simulténeamente. En la experimentacion los disefios mas utiizados son los de dos niveles, de forma que un diseno factorial completo de K factores con dos niveles por factor, conduce a un numero de experimentos igual a 2"12 Glosinn. Disefio factorial fraccionac.» (Fractional factorial design). Los disefos tactoriales fraccionados permiten estudiar un numero elevado de factores con un numero de experimentos mucho menor de lo que requeriria un factorial completo. Si el numero de niveles es 2, el nlimero de factores a estudiar es K y el grado de fraccionamiento es P. el numero de experimentos a realizar es 2**. Al reducir el numero de experimentos se Presentan una serie de confusiones, que pueden afectar a la puesta en evidencia de las interacciones entre los efectos principales. Distribucion de probabilidad . Modelo matematico que relaciona los valores de una variable con su probabilidad de ocurrencia en la poblacién. Las distribuciones mas frecuentes son la normal, la { de Student, la F de Snedecor y la chi-cuacrado entre otras. Efecto de la dilucién (Dilution effect). El rango de una recta 0 curva de calibracion debe abarcar el rango de las concentraciones esperadas de analito en las muestras problema, No es recomendable extrapolar resultados por debajo ni por encima del rango estudiado en la linealidad. Cuando ta concentracion de la muestra problema es superior al limite superior de! rango de linealidad se puede diluir 1a muestra convenientemente (con agua o con blanco, seguin los casos) y reanalizarla. Conviene demostrar que el efecto de la dilucién no afecta la exactitud y precision de! método mediante el analisis de muestras con patrones o placebos cargados con analito sometidas al proceso de dilucion. Error relativo porcentual (Relative error in percentage), Desviacion en porcentaje de los valores experimentales frente a los valores tedricos. e%=ER' [(Valor experimental- valor teérico)/valor tedrico}*100 En el caso de una curva de calibracién el error relativo porcentual de cada uno de los Patrones se halla mediante la expresi6n: ER% = [s cu), 100 x siendo x, los valores tedricos y i; los valores experimentales estimados Por aplicacién de la ecuacién que define la curva de calibracion. (Si es una recta: x; = (y;-a)/b ). Error, Error sistematico, Error aleatorio (Systematic error, Random error). Los errores analiticos, que se cometen al efectuar los analisis, pueden ser determinados o indeterminados. Los errores determinados 0 sistematicos van en una sola direccién y se deben a fallos de instrumentos, personas 0 métodos. Deben eliminarse (0 corregirse sus efectos) puesto que afectarian la exactitud del método. Los errores indeterminados 0 aleatorios son de origen desconocido, actuan en ambas direcciones y determinan la variabilidad de los resultados 0 precisién del método. Los errores indeterminados son objeto de los tratamientos estadisticos (no confundir los errores analiticos con los errores «ty fb 0 riesgos de los tests estadisticos). Estabilidad de la muestra (Sample stability). Es un requerimiento basico la demostracién de la estabilidad de la muestra y de los patrones durante el tiempo comprendido entre su Preparacién y la finalizacion del analisis, especialmente cuando se utilizan equipos automaticos en donde las muestras pueden permanecer horas antes de ser analizadas. En el Ambito bioanalitico ta estabilidad es un parametro fundamental. Estandar de referencia. Estandar de trabajo (Primary reference standard. Working standard). Un estandar de referencia 0 patron primario es un producto homogéneo con Propiedades especificas (identidad, pureza y riqueza) que ha sido analizado y certificado por un organismo cualificado y homologado (reconocido oficialmente),Glosario 13 Un esténdar de trabajo o patron secundario es un estandar cuya riqueza (u otras caracteristicas), ha sido comprobada y calibrada mediante un metodo validado frente a un patron de referencia Exactitud (Accuracy). Expresa la proximidad entre el valor que es aceptado Convencionalmente como’ valor verdadero, valor nominal, teérico un valor de referencia y el valor encontrado experimentalmente. Capacidad de! método analitico para proporcionar resultados lo mas cercanos posibles al valor tedrico 0 nominal. Matematicamente se expresa como el valor numérico del error sistematico (diferencia entre el valor medio hallado y el verdadero) o bien como error relativo porcentual, En Microbiologia. cuando se trata de efectuar contajes microbianos, Ja exactitud se define como el porcentaje de recuperacién frente al valor del inoculo. En Materias primas y Especialidades se utiliza también el porcentaje de recuperacion como expresion equivalente a la exactitud si bien el concepto de recuperacion puede ser diferente a la exactitud en otros ambitos de trabajo (Bioandlisis, Plantas medicinales, etc). Véase el término de “recuperacién’ de este glosario, Factor de capacidad (Capacity factor). En un método cromatografico es el numero de vollmenes de fase mévil necesarios para eluir un compuesto después del volumen inicial contenido en la columna. Factor de simetria, factor de asimetria o factor de cola. (Tailing factor). Medida de la asimetria de la sefial generada por el pico cromatografico. Fiabilidad (Reliability). Capacidad de un método analitico para mantener durante periodos Ge tiempo apropiados los cntenos tundamentales de validacion. La fiabilidad indica les Prestaciones del método para uso rutinario. . Grados de libertad (Degrees of freedom). Numero de categorias independientes que definen una muestra o una poblacién. En el cdlculo de la desviacion estandar significa el numero de desviaciones independientes con respecto a la media y vale n-1. En el caleuls de {a recta de regresién, el numero de grados de libertad es n-2 Homogeneldad de variancias (Variance homogeneity). En muchos tests estadisticos es mer esario comprobar previamente la homoscedasticidad (nomogeneidad de variancias) de las muestras mediante tests especificos (F de Snedecor, Cochran, Barielt. Levene. etc). La Condicion de variancias diferentes recibe el nombre de heteroscedasticidad Idoneidad det sistema (System suitability test). Conjunto de ensayos que permiten comprobar en el momento de utiizacién del, método que el Incertidumbre de una medida (Uncertainty). Estimacién del intervalo dentro del cual se encuentra el valor verdadero de la cantidad medida una vez efectuadas las correcciones debidas a errores sistematicos. en magnitud entre la mayor y isfactoriamente con adecuada Si bien la denominacién rango es muy comin, deberian utiizarse los términos intervalo, amplitud 0 recorrido como mas apropiados para esta definicion (Rango es el equivalente inglés del término “Rank” que significa niimero de orden dentro de una serie). Intervalo de confianza o limites de confianza (Confidence interval o confidence limits) Intervalo en torno al valor estimado que contiene el valor real con una probabilidad determinada. Se aplica en diversas situaciones: limites de confianza de ure determinacion individual, de una media de resultados, de una variancia, de una recta de tegresion, etc,V4 neain: Limite de cuantificacién (Limit of quantification), Minima cantidad de analito que puede determinarse cuantitativamente con una adecuada exactitud y precision Limite de deteccién (Limit of detection). Minima cantidad de analito que puede ser Getectado aunque no necesariamente cuantificado con precisién y exactiud tinealidad (Linearity). Capacidad del método para proporcionar resultados que son Girectamente (o por medio de transformaciones ‘matematicas) Proporcionales a la Concentracion del analito en la muestra dentro de un rango establecido Marcador de calidad, En el andlisis de ciertas plantas medicinales y con el objeto de definir de cae ticaciones de calidad se determinan analitos presentes en la planta (marcadores de calidad) que no son los causantes de la actividad terapeutica, Media aritmética (Mean, average). Valor de centralizacién de una muestra 0 poblacién. Equivale a la suma de todas las observaciones dividida por el numero de las mismae Método analitico © ensayo (Analitycal procedure, analitycal method, test Procedure). Procedimiento que explica delalladamente todas las operaciones necssariae para efectuar un analisis concreto. Método bioanalitico (Bioanalityeal method). Método destinado a la determinacién de analitos presentes en matrices bioldgicas, normalmente sangre, plasma, suero u orn Método de referencia (Referece method). Método validado del que se sabe que resulta adecuado para efectuar un cierto tipo de analisis. Método indicativo de estabilidad (Stability indicating method). Método altamente Selective en el que la presencia de impurezas y productos de degradacion influye on los resultados obtenidos. Muestra (Sample). Producto resultante de una operacién de muestreo. El muestreo debe seaigeresentativo y con un determinado caracter aleatorio si bien, en algunos tipos de analisisy en aplicacién de la flosofia del peor caso, se propician muestreos sesgados Muestra de contro! de calidad (en bioandlisis), (Quality contro! sample). Muestra de raz Blologica con una concentracién conocida de uno o varios analtos que se utiliza para comprobar la precisién y exactitud del método asi como la estabilidad de los analitos, No se utiliza para la determinacién de la curva de calibrado, Muestra de patrén de calibrado, (en bioanélisis), (Calibration standard sample); Muesta de matriz biolégica con una concentracion conocida de uno 0 varios analitos. Se utllina exclusivamente para la determinacién de la curva de calibrado. Muestra real, analitica 0 problema (en bioanilisis),"{Analityeai sample, real sample). Muestra biolégica susceptible de ser analizada. No se refiere a muestras de patron de alibrado 0 a muestras de control de calidad preparadas con blancos de una matris biolégica, Ponderacién, modelos de regresién ponderada (Weighting method). Se aplica para forreait la heteroscedasticidad 0 falta de homogeneidad de variancias en las respuestas de igs distintos niveles de una curva de calibracign. Se emplea en Bioandlisis al ser muy amplio el rango de concentraciones. Dado que en la regresion por minimos cuadrados las diferencias entre los valores experimentales y los valores calculados suelen ser mucho Trayores en los valores altos de concentracién, la ponderacién equilibra el peso de las distintas concentraciones de la curva de calibrado. Los factores de ponderacion mas utiizados son 1/Concentracion y 1/Concentracion al cuadrado.Glosario 15 Precision (Precision). Capacidad de un método para proporcionar resultados proximos entre si. Grado de, dispersién de los resultadas analiticos respecto.a su valor medio. Se puede estudiar a tres niveles: Repetibilidad. Evalua la precision de! método efectuando una serie de analisis sobre la misma muestra en las mismas condiciones operativas (aparatos, reactivos, analista) en un mismo laboratorio y en un periodo de tiempo corto. Precision intermedia: Evalua la precision del método frente a variaciones internas del laboratorio (analista, dia, instrumento, etc.). Es la precision intralaboratorio. Reproducibilidad: Evalda la precision entre laboratorios diferentes. Recta de regresién (Recta de calibracidn, Curva de calibracién). (Regresién line, Calibration line, Calibration curve). Relacién entre las respuestas instrumentales que Produce un analito y las concentraciones del mismo. Siempre que sea posible se buscaré una respuesta de tipo lineal. Cuando no lo sea se podran efectuar transformaciones matematicas para “rectificar” la curva de calibracion o bien se ajustara a funciones mas complejas. Cuando el rango de trabajo sea muy amplio se pueden utilizar factores de ponderacion. Recuperacién (Recovery). Se define como eficacia en el rescate del analito de la matriz de ‘a muestra. Es un parametro que se debe estudiar durante el desarrollo de! método analitico La recuperacion ideal es de! 100%. Recuperaciones mayores indican interferencias debidas a la matriz o errores determinados que deben eliminarse; recuperaciones menores indican pérdidas de analito durante las fases de preparacion de la muestra Cuando la recuperacién no es satisfactoria pero es reproducible cabe la posibilidad de utilizar ef método analitico empleando un factor de correccién que compense las pérdidas de analito. De esta forma no se ve afectada la exactitud. Es el caso por ejemplo de métodos analiticos para validar la limpieza de equipos. Lo mas habitual, sin embargo, es que el Propio método analitico incorpore mecanismos que eliminen el error de recuperacién, por ejemplo rectas de calibracién realizadas con la matriz, métodos de adicion de esténdar 0 métodos con estandar interné. Relacién sefal-ruido. Ruido de fondo (Signal to noise ratio, background noise). En temas instrumentales es la sefial residual o linea de base registrada con concentracin cero de analito. Es decir, es la sefial ruido que proporciona un blanco o placebo. Matematicamente suele expresarse como la desviacion estandar de la respuesta de un cierto numero de blancos. Réplicas y repeticiones. En la presente monografia se entiende como “réplicas” o replicados a los analisis sucesivos de una muestra en las mismas condiciones utilizando el metodo analitico completo, desde la preparacién de la muestra hasta la medicion final de analito. Las inyecciones repetidas de la muestra final (duplicado, triplicado) que se realizan para mejorar la precision instrumental no son réplicas, sino repeticiones que dependeran de la Precision del sistema instrumental empleado, Residual (Residual). Es la diferencia entre el valor observado experimentalmente y el valor estimado en una recta de regresién o curva de calibracion Resolucién (Resolution). Medida de la separacién entre dos picos cromatograticos. El valor de resolucién ideal es aquel que permite la resolucién hasta la linea de base entre los picos de interés, Revalidacion (Revalidation). Repeticion total o parcial de la validacion de un método analitico debido a modificaciones en el propio método, equipos, muestras a analizar. etc. al objeto de garantizar que los resultados contintian siendo fiables,16 Glosario Robustez (Robustness). Medida de la capacidad de un método analitico para permanecer inalterado ante pequefias pero deliberadas variaciones en cierlos parametros Proporcionando idea de su fiabilidad o estabilidad durante su empleo en rutina, No debe confundirse con el término Ruggedness, citado.en la Farmacopea USP que seria asimilable al término reproducibilidad. Selectividad (Selectivity). Capacidad de un método analitico para medir ylo identificar Simultanea 0 separadamente los analitos de interés de forma inequivoca sin interferenciae ge impurezas , productos de degradacién. compuestos relacionados, excipientes u olrce sustancias presentes en la matriz de la muestra. Capacidad del método para producir una respuesta para el analito de interés distinguible de {odas las otras respuestas de los demas componentes de una mezcla potencialmente compleja, La especificidad se utiliza como sindnimo de la selectividad aunque deberia reservarse para aquellas situaciones donde la respuesta obtenida sélo se puede producir con una trica entidad quimica Sensibilidad (Sensitivity). Capacidad de un método analitico para detectar pequeas concentraciones de analito, Serie analitica 0 ensayo de lote de muestras en bioandlisis (Analitycal run, analytical batch): conjunto de muestras formado por al menos una curva de calibracion identica a ta ulizada en la validacién, muestras de control de calidad y muestras problema, procesadas conjuntamente. ‘Sesgo (Bias). Error sistematico o deterr inado. (Véase “error’ en este glosario). Suma de cuadrados (Mean square). En Estadistica y especialmente en ANOVA, una suma Ge cuadrados es la suma de los cuadrados de las diferencias entre los componentes de una serie y su media aritmética, La suma de cuadrados dividida por los correspondientes grados de libertad da el valor de la ‘media cuadratica o variancia. . Test o Prueba de Hipétesis (Hypothesis testing), Prueba que permite decidir con un Gierto riesgo de error cual dé las hipétesis (nula o alternativa) es la verdadera La hipétesis nula se designa por H, y es la que se debe probar o contrastar. La hipétesis alternativa es la complementaria y se designa por Hy. Esta hipotesis no se somete directamente a prueba pero es la mas verosimil cuando la prueba estadistica nos conduce a rechazar la hipotesis nula. ee . Tests unilaterales y bilaterales (one sided, two sided tests). En los tests bilaterales las diferencias de las muestras a comparar son en ambos sentidos; en los unilaterales en un solo sentido. Asi en una prueba teral para comparar dos desviaciones estandar (2 colas) Hipétesis nula Ho: 0; = 62 Hipotesis alternativa Hy: 6; + 02 En una prueba unilateral (1 cola a la derecha o la izquierda): Hipotesis nula Ho: 6; < 62 Hipétesis alternativa 0; > a Transferencia de un método analitico. Proceso de demostracién y verificacion dentro de un laboratorio que un método previamente validado en otro ambito conduce a resultados fiablesGlosario 17 Validacién (Validation). Establecimento de la evidencia documental que un procedimiento analitico conducira con un alto grado de seguridad a la obtencion de resultados precisos y exactos dentro de las especificaciones y atributos de calidad previamente establecidos Obtencién de pruebas documentadas de que un método analitico es lo suficientemente fiable como para producir el resultado previsto dentro de los intervalos definidos. Valor estimado en una recta de regresion (Expected value). En una recta de regresion de ecuacién y= bx + a, son los valores estimados de la variable dependiente ( ) obtenidos al aplicar dicha ecuacién sobre los valores tedricos x, Valor recalculado en una curva de calibracién (Back calculated values). En una recta de regresién de ecuacién y= bx + a, son los valores estimados de la variable independiente (*) obtenidos al aplicar dicha ecuacion sobre los puntos experimentales y,. Es decir, son los resultados de las concentraciones de los patrones recalculados utilizando la propia ecuacion de la curva de calibracién: Valor verdadero asignado (Assigned Value). En la determinacién de la exactitud es el valor que se asigna ala muestfa de concentracion conocida, es decir, el valor de concentracién que se acepta como verdadero en dicha muestra Variancia (Variance). Cuadrado de la desviacién estandar. LX n-1 n(n=1)GENERALIDADESINDICE: PARTE I Generalidades 1. GENERALIDADES.. 1.1. Validacién de métodos analiticos 1 Definicion 4.1.1. Definicion general 1.4.2. Definicion analitica ei 4.1.3 Otros terminos relacionados con la validacion 2 Razones que justifican la validacion de métodos analiticos 1 3 1 1 2.1 Métodos susceptibles de ser validados. Entorno legal — 3.1. Requerimientos para el registro . . 3.2 Normas de Correcta Fabricacion de Medicamentos 1.3.3. Farmacopeas. —s 1.2 Organizacion: buenas practicas de laboratorio. 1.2.4. Organizacién y personal 1.2.2 Instalaciones rece - 1.2.3 Cuidado, alojamiento y confinamiento de los elementos utilizados en los sistemas experimentales biologicos es 1.2.4 Aparatos, reactivos, material y especimenes. 1.2.4.1 Aparatos - a 1.2.4.2 Reactivos... 1.2.4.3 Material y especimenes... 1.2.5 Sistemas experimentales cece 1.2.6 Productos de referencia y muestras de ensayo 1.2.7 Documentacién. Procedimientos escritos 1.2.8 Archivo de documentos 1.2.9 Verificacion de los resultados. 1.2.10 Autoinspeccion . 13 Fases en el desarrollo de un método analitico y criterios de validacion 1.3.1. Definicién de las caracteristicas de practicabilidad ... 1.32 Estudios de estabilidad de la muestra preparada para analisis .. 1.3.3 Puesta a punto. Caracteristicas de idoneidad 1.3.4 Caracteristicas de fiabilidad . 1.4 Documentacién de la validacion 1.4.1. Protocolo de validacion . Soe 1.4.2 Realizacién de la validacién y evaluacion de los resultados 1.4.3 Informe de validacion....... 1.4.4 Certificado de validacién 1.4.5 Archivo 1.5 Revalidacion ...Generalidades 23 1. GENERALIDADES Este capitulo de introduccion general ha sido redactado basicamente desde el Punto de vista Gel andlisis de materias primas y de especialidades farmacéuticas. Por este motivo, muchos. Ge los procedimientos descritos no son aplicables en el eniomo de la validacon oc metodos poanalltcos © microbiolégicos. Los conceptos, procedimientos y parliculeriaades ae este ‘po de validaciones se comentaran de forma exhaustiva en los capitulos correspondientes. 1.1 Validacién de métodos analiticos 144° Definicion El Kérmino validacién ha sido definido en la literatura, de diversas maneras y Por numerosos autores. Aunque los términos dadés son diferentes el significado de las misnos cx siempre el mismo: a) especificar e implementar, b) aprobar y c) documentar. ‘Veamos dos de las posibles definiciones de validacién 14.4.1 Definicién general Segiin las Normas de Correcta Fabricacién (edicién 99): Validacién: Obtenci6n de pruebas con arreglo a las Normas de Correcta Fabricacion, de arian Guiet procedimicnto, proceso, equipo, material, actividad o sistema Produce en realidad el resultado previsto. 1.4.1.2 Definicién analitica ' Es el establecimiento de la evidencia documental de que un procedimiento lucira, con un alto grado de seguridad, a la obtencién de resultanoc Precisos y Sxactos, dentro de las especiticaciones y los attibutos de calidad previamronte establecidos. 14.4.3 Otros términos relacionados con la validacién Gallbracién: Conjunto de operaciones que determinan, bajo condiciones previamente definidas. la relacién entre los valores indicados por el vistors de medicién y los valores Conocides correspondientes a un patron de referencia (NCF. ed 99). En resumen, los términos “validacién, cualificacion y calibracién’, son conceptos que suelen emplearse de forma indistinta, sin embargo conceptuaimento son jiferentes, Validar es verificar documentaimente que un método 0 proceso hace lo que tiene que hacer. 0.05). La homogeneidad de variancias se comprueba con la prueba F de Snedecor: Prueba de homogeneidad de variancias F de Snedecor Estadistico F de Snedecor 0.3333333 Valor P 0.8734150 Se acepta el supuesto de homogeneidad de variancias, dado que el resultado de la prueba F de Snedecor es no significativo (P > 0.05) Se realiza una prueba t de Student-Fisher de comparacin de dos medias con grupos independientes: Prueba t de Student-Fisher de comparacion de dos medias con grupos independientes Estadistico t de Student-Fisher 7.745967 Valor P 0.000016 La prueba bilateral efectuada encuentra para una prueba de un riesgo a del 5% (4=0.05) diferencias significativas en la determinacién del principio activo segun Se realice’en presencia o ausencia de la matriz de excipientes.Selectividad ‘Materias primas y especialidades 53 Cuando la prueba realizada muestra diferencias estadisticamente significativas €5 oportuno estudiar la magnitud de la desigualdad y su intervalo de confianza. Placebo cargado Principio activo solo 6 6 Medi 16.10 15.90 Desviacién estandar 0.05477 0.03162 Diferencia entre medias D = |16.10-15.90) = 0,20 Error estandar combinado EE= Estadisticotde Student titen22ja0as = 2.2281 Intervalo de confianza del 95% para la dif encia entre medias IC95%: D +t + EE > 0.20 ¢ 2.2281-0.02582 + de 0.14 a 0.26 Conclusién: Con una confianza del-95%, el aumento en el volumen consumido de solucién valorante para la determinacién del principio activo en presencia de la matriz de excipientes se situa entre 0.14 y 0.26 ml. La aparicion de significacién estadistica permite establecer, con un porcentaje de Confianza establecido, que los dos grupos de valores observados provienen de Poblaciones distintas. La evaluacién de la magnitud de sesgo observado y su Posible posterior aceptacién dependera en cada caso del criterio técnico que se aplique y no se debe sujetar exclusivamente a la prueba estadistica. En este caso, el sesgo maximo posible, con una confianza del 95%, es de 0.26 mi, lo que fepresentaria aproximadamente un 1.6% sobre una valoracién del 100%. La aceptacién de este porcentaje de discrepancia dependera en cada caso de la tolerancia maxima preestablecida Si las interferencias no estan disponibles se puede realizar la comparacion de los resultados del método con un segundo procedimiento oficial o bien caracterizado. La siguiente tabla indica los criterios de aceptacién recomendables. No todos los parémetros son de aplicacion en todos los casos. Parametro, ~Griterio de aceptacion propuesto Capacidad de discriminacion del procedimiento Suficiente Desviacién frente a determinaciones sin interferencias < 2% (< 4%) Resolucion cromatogréfica entre picos cercanos > 1.5 (>2) Factor de cola cromatografico <2 N° de platos tedricos cromatogréficos > 2000 Identidad del pico cromatografico Pureza de pico. ausencia de coelucién Nota: Los valores indicados entre paréntesis hi 'acen referencia a los criterios maximos aceplables en determinados casos,4 Materias pias y especialidades Selectividag Un Principio activo o forma farmacéutica. Se debe comprobar, a ser posible, la identidad del Sralte ¥. gue la sefial proviene sélo de él. Las condiciones ae estrés para lograr una degradacién del orden del 10-20% en la mayoria de principios activos son: Condiciones itica Condiciones para la materia prima salor (40-70°C) Calor (40-100°C) Luz Luz Humedad relativa (85%) Acido (HCI 0.1N) Base (NaOH 0.1N) Oxidante (HO; 3%) no permite su clara Separacién. Sino es posible una Perfecta separacién debe demostrarse ue el valor de la interferencia no es superior al 0.5%. pa Gvaluacion de la degradacién se puede determinar comparando los Perfiles obtenidos del Froducto estresado y no estresado. Con esta finalidad puede ser de interes ve superposicién de los distintos cromatogramas obtenidos. Dichos cromatogramas se adjuntarén en el informe a una escala razonable que permita la pertecta visualizocion aul Perfil obtenido. La siguiente tabla indica tos eriterios de aceptacion recomendables, No todos los parémetros Son de aplicacién en todos los casos, Parametro Criterio de aceptacién propuesto apecidad de dsciminacién del procsdimiento El metodo ha de ‘permit det SGU SAS todas las posibles especies quimicas que Puedan generarse Resolucién cromatogratica entre picos cercanos * 1.5 (> 2) Factor de cola cromatogratico <2 N° de platos teéricos cromatograficos > 2000 Identidad det pico cromatogrético Pureza de pico, ausen Nota: “Los valores indicado: de 0.14 20.26 Conclusién: Con una confianza del:95%, el aumento en el volumen consumido de solucién valorante para la determinacién del principio activo en presencia de la matriz de excipientes se situa entre 0.14 y 0.26 mi. La aparicion de significacién estadistica permite establecer, con un porcentaje de confianza establecido, que los dos grupos de valores observados provienen de poblaciones distintas. La evaluacion de la magnitud de sesgo observado y su Posible posterior aceptacién dependera en cada caso del criterio tecnico que se aplique y no se debe sujetar exclusivamente a la prueba estadistica. En este caso, el sesgo maximo posible, con una confianza del 95%, es de 0.26 ml, fo que fepresentaria aproximadamente un 1.6% sobre una valoracion del 100%. La aceptacién de este porcentaje de discrepancia depender en cada caso de la tolerancia maxima preestablecida Silas interferencias no estan disponibles se puede realizar la comparacion de los resultados del método con un segundo procedimiento oficial o bien caracterizado. La siguiente tabla indica los criterias de aceptacién recomendables. No Yodos los parémetros son de aplicacién en todos los casos. Parametro _ Criterio de aceptacion propuesto Capacidad de discriminacion del procedimiento Suficiente Desviacion frente a determinaciones sin interferencias < 2% (< 4%) Resolucién cromatogréfica entre picos cercanos >15(>2) Factor de cola cromatografico <2 N° de platos tedricos cromatograficos > 2000 Identidad del pico cromatografico Nola: Los valores indicados entre determinados casos, Pureza de pico. ausencia de coelucién aréntesis hacen referencia a los erilerios maximos aceptables en24 Matenias pumas y especialidades Selectividag erate UP!0 activo o forma farmacéutica. Se debe comprobar. 2 cer Posible, ta identidad del analito y gue la seal proviene solo de él. Las condiciones de estrés para lograr una 1.5(> 2) Factor de cola cromatogratico <2 N° de platos tedricos cromatograticos > 2000 Identidad del pico cromatogratico Pureza de pico, ausencia de coelucién Nota: “Los valores indieados entre parent Feferencia a los criterios maximos aceplables on 0.999, aunque en el caso de impurezas se admite > 0.990, La informacion obtenida mediante el calculo de r es limitada y No justifica por si sola la linealidad, siendo *? coeficiente de determinacién el que aporta una mayor significacion estadistica ya que expresa la proporcién de la variacién total de y explicada por el modelo. 3.3.2.3 Variancia residual constante (homoscedasticidad) La representacion de los residuales e aporta mucha informacion acerca de la validez de! modelo. De entre las diversas formas de hacerlo la mas habitual consiste en representar los. residuales (eje de ordenadas) frente a los valores estimados (eje de abcisas). La distribucion de los puntos deberia ser aleatoria y no reflejar ninguna tendencia. 3.3.2.4 Anall de la Variancia: ANOVA. Para poder realizar una ANOVA se deben cumplir los siguientes supuestos: a) Homogeneidad de variancias b) Normalidad de los residuales a) Homogeneidad de variancias La homogeneidad de variancias se puede comprobar aplicando, por ejemplo, un test de Cochran que indicara si el factor concentracién tiene alguna influencia en la variabilidad de los resultados. Estadisticamente seria mas correcto normalizar previamente las respuesta, Ya que de Io contrario se comparan coeficientes de variacién que corresponden a medias de concentracién diferentes entre si. De todas formas es habitual efectuar el test sin cumplir este requisito cuando el intervalo de concentraciones no es excesivamente amplio. El valor de Geis Se calcula de la siguiente formaUnealidad y rango Variancia de cada grupo K S"nera™ Variancia maxima de los K grupos Gains (02=0.05, Las variancias no deben ser estadis OS ante diferentes entre si para el grado de Significacion escogido, generalmente a= 0.08 (véase el ejemplo), Una vez comprobados estos supuestos, se alcularan los estadisticos F, y F; tal y como se indicd del ANOVA, Frew > Frise demuestra la existencia de una Pendiente distinta de 0 Fae 0.310 5 3506 5 0.311 6 3504 6 0.308 7 3506 7 0.306 8 3504 8 0.310 9 3509 9 0.309 10 3507 40 9.312 ‘Area media 3507 Valor medio 0.309 CV (%) 0.12 CV (%) 0.70 4.3.2. Repetibilidad del método EI ensayo de repetibilidad del método se efectéia sobre una serie de alicuotas de una muestra homogénea que se analiza independientemente desde el principio (preparacion de muestra) hasta el final (lectura de resultados) por el mismo instrumento y el mismo analistaIIIS I Ln Precision Materias primas y especialidades 71 Se proponen dos alternativas para realizar este estudio: + Un minimo de 6 muestras a la concentracién nominal. * Un minimo de 3 muestras a tres niveles de concentracién cubriendo el intervalo especificado (un total de 9 muestras). La estimacion de la repetibilidad del método se realiza con el calculo del coeficiente de variacién de las respuestas obtenidas y Con los intervalos de confianza a cada nivel de concentracién estudiado, a) Coeficiente de variacion El célculo del coeficiente de variacién permite deducir el nimero de replicados que se deben ‘ealizar en el método de ensayo para un determinado intervalo de aceptacion, Esta relacion se establece segin la formula siguiente (aplicable a principios activos): aD (Camacho et al, 1993) CV = [100 - La} Donde: LA= valor limite aceptado. n= numero de replicados que se deben realizar en el metodo de analisis. Z (a= 0.01) = 2.58 fir la tabla 3 se relaciona el coeficiente de variacién con el nimero de replicados aplicando {a ecuacién anterior. Por ejemplo si al determinar la repetibilidad del método se obliere an cosficiente de variacién de 0.50% para un intervalo de aceptacién del 99,0-101 0% el numero de andlisis recomendable sera de dos. Tabla 3. Valores orientativos del nimero de réplicas en funcion de la repelibilidad del método. Intervalo de CV (%) maximo aceptable aceptacién (%) n=t n=2 n=3 Ne n 99.0- 101.0 0.39 0.55 0.67 0.78 0.87 98.5- 101.5 0.58 0.82 1.04 1.16 1.30 98.0- 102.0 0.78 1.10 1.34 1.55 1.73 95.0- 105.0 1.94 2.74 3.36 3.88 4.33 90.0- 110.0 3.88 5.48 671 7.75 8.67 85.0~ 115.0 5.81 8.22 10.07 11.63 13.00 Los valores aceptables del coeficiente de variacion del sistema instrumental deben ser inferiores a los valores que se aceptan para el cosficiente de variacién der método. La epresion matematica que permite relacionar ambos coeficientes de variacion es: C¥ método = CV sistema J (Carporal-Gautier et al, 1992)72 Materias primas y especialidades Precision A partir de esta expresion se pueden deducir los valores de la tabla 2 para el coeficiente de variacion instrumental Para el analisis de impurezas y/o productos de degradacién, la Association of Official Analitycal Chemists (AOAC) propone una serie de valence limite de coeficiente de variacion Tabla 4. Limites del coeficiente de variacién para andlisis de Impurezas en funcién de la concentracién del analito Hanalito a 10 28 1 27 0.1 37 0.01 5.3 0.001 7.3 0.0001 Ww 0.00001 15, 0.000001 24 0.000001 30 ——a 8 ») Intervalos de confianza predeian GH 228 fecomienda introducir los intervalos de confianza en el estudio de la Precision. Estos itervalos deben determinarse para cada nivel de concentracion cote Los intervalos de confianza se calculan’a partir de: * Los resultados individuales Fires + Los resultados promedios etre media de una serie de resultados obtenidos en un mismo nivel de concentracién valor de la t de Student de tablas para n-1 grados de libertad y a= 0.08 numero de andlisis desviacion estandar wnaacién Se presenta un ejemplo de repetibilidad del método (ejemplo 3) donde se A conti Getermina el cloroformo residual de un principio activo por cromatogratie de gases. A partir de los resultados obtenidos se determina el coeficiente de variacién, (a) y los intervalos de confianza (b),Precisién Materias primas y especialidades 73 Elemplo 3: Determinacién de la repetibilidad de! método (3 concentraciones con 5 replicados) Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 (5 ppm) (25 ppm) (50 ppm) Area Ceaunis__ Area Ceseuada _ 1264 4.94 5906 26.21 1265 490 5862 25.78 1292 5.07 5915 26.25 1328 5.24 5376 24.70 _ 1272 02 5906 26.41_ 25.87 a) Coeficiente de variacion Segun la tabla 4 para impurezas de un nivel de concentracién proximo a 100 ppm el valor de Coeficiente de variacién aceptable es 5.3%, aunque para la concentracién de § ppm se podria aceptar como limite el valor 7.3%. Por lo tanto, los resultados mostrados en el ejemplo cumplen las especificaciones establecidas. b) Intervalos de confianza Las concentraciones mostradas en el ejemplo 3 han sido.obtenidas a partir de la recta de Ia linealidad. Estas concentraciones han sido normalizadas para obtener los resultados del intervale de confianza. Aplicando los siguientes intervalos de confianza de las medias de cada concentracién se obtiene: Ci(S ppm) 4.85 ~ 5.16 ppm C2 (25 ppm) 24.24 - 26.89 ppm C3(50 ppm) 48.07 - 50.74 ppm 4 Precisién intermedia | objetivo de! estudio de ta precision int ectuando una serie de andlisis sobre | ondiciones operativas diferentes, termedia es determinar la variabilidad del método la misma muestra, en un mismo laboratorio pero en nel estudio de la precision intermedia se deben considerar aquellas circunstancias en las 28 Se pretende desarrollar el método de ensayo. El analista debe evaluar los efectos lusados al variar una serie de factores. Tipicos factores a estudiar incluyen el dia, el talista, el instrumento, etc. (ver tabla 1). No es necesario estudiar cada uno de estos Giores individualmente sino que es suficiente comprobar que la variabilidad aportada por el injunto de factores esta dentro de los limites establecidos,74 Materias primas y especialidades disefio experimental (ejemplo 4) donde se 's, analista e instrumento. En este modelo variacién de los resultados obtenidos al Considerar dos analistas, dos instrumentos y realizando el andlisis hee dias diferentes, Elemplo 4. Precision intermedia Instrumento A Analista X DiatDia2 Dias _ Analista Y Diat___Dia2__Dia3 Instrumento 8 Analista X DiatDia2Dia3 Analista Y Diat _Dia2___—Dia3 lat Dia? ia La estimacion de la precisién intermedia se realiza con el céiculo del Coeficiente de variacion global de las respuestas obtenidas, es decir, consideraros cada resultado independientemente. Generalmente se aceptan valores de coeficiente de variacion de la precision intermedia inferiores al doble del coeficiente de variacién de la repetibilidad der método. En caso de que Poco eanhla es necesario evaluar cual es el factor responsable de sta variabilidad. Se paramienda, ademas, determinar el coeficiente de variacion para cada grupo de analisis Petoae Prba" ue se cumplen las especificaciones establecidas en le repetibilidad del método, En el ejemplo 5 se presenta un caso de repetibilidad intermedia basado en el disenio matricial propuesto en el ejemplo 4 Elemplo 5. Precisién intermedia _ Diat_ Dia2 98.8 97.5 Analista X 97.9 97.3 98.0 96.9 Instrumento A a CV(%)=0.5 CV (% 97.5 98.7 Analista Y 97.2 98.4 97.8 99.0 CV (%)=0.31___ OV (%): 96.9 99.0 Analista X ‘972 98.2 98.0 98.5 Instrumento B ee CV (%)=0.22 CV (%)=0.41 97.8 98.5 . Analista Y 98.2 98.3 100.0 97.6 99.2 98.9 CV(%)F031___ CV (%) A8__CV (%)=0.55 CV (%o)orecsin intermedia = 0.76Precision ‘Materias primas y especialidades 75 45 Reproducibilidad La reproducibilidad estudia la variabilidad de los resultados inter-laboratorio. El objetivo de @sle estudio es verificar que el método de analisis proporciona los mismos resultados en diferentes laboratorios. La reproducibilidad de dicho método de analisis se determina analizando una serie de alicuotas procedentes de lotes homogéneos en diferentes laboratorios, diferentes analistas y utilizando condiciones operativas y ambientales distintas Pero siguiendo el procedimiento descrito en el método (ver tabla 4). Estas condiciones operativas y ambientales diferentes (Huber, 1999) pueden ser: + Humedad y temperatura ambiental diferente * Analistas con diferente experiencia + Instrumentos de caracteristicas diferentes (volumen muerto en un HPLC) + Variaciones de condiciones instrumentales (composicién de la fase mévil, pH flujo) * Variaciones de detalles experimentales no especificadas en el método + Equipos y fungibles de diferente antigiiedad + Columnas cromatograficas de distintos lotes y/o proveedorés + Disolventes y reactivos de diferente calidad Este estudio es necesario si se pretende realizar el método en diferentes laboratorios o si se quiere estandarizar un procedimiento analitico, por ejemplo para incluirlo en las Farmacopeas. 4.6 Comentarios y conclusiones La precision estudia la variabilidad que existe entre los diferentes resultados, pero sin tener en cuenta su proximidad al valor real. La precision se determina con el calculo de la Cesviacion estandar relativa 0 coeficiente de variacién, y se expresa dando el valor medio obtenido junto con el mas-menos de la variabilidad de los resultados. Los resultados obtenidos en la repetibilidad instrumental dependen del instrumento, por clemplo no Se puede obtener el mismo coeficiente de variacién en un equipo con inyecan que con inyeccién manual. La repetibilidad del metodo depende generalmente del proceso de preparacién de la (husstia: Es decir, cuanto mayor sea la manipulacién de la muestra mas probable es que la Variabilidad de! método aumente. El parémetro de la reproducibilidad no es de obligado cumplimiento y se debe realizar solamente en aquellos casos en que se quiera transferir el método a otros laboratorios © incluirlo en guias oficiales.76 Materias prmas y especialidades Exactitud 5. EXACTITUD 5.1. Definicién y generalidades La exactitud de un procedimiento analitico expresa la proximidad entre el valor que es aceptado convencionalmente como valor verdadero o un valor de referencia y el valor experimental encontrado, No deben confundirse exactitud y precision. La precision esta relacionada con la dispersién de una serie de mediciones, pero no da ninguna indicacién de lo cerca que esta del valor verdadero, Se puede tener mediciones muy precisas pero poco exactas; sin embargo, para que un método sea exacto se requiere un cierto grado de precision. De la definicion de exactitud surge el principal problema: {cual es el valor verdadero del analito en la muestra?. Por desgracia el valor verdadero en muchos casos se desconoce como, por ejemplo, en la industria alimentaria debido a la gran variedad de matrices posibles ¥ due practicamente no existen patrones de referencia certificados por organismos oficiales, No obstante, cuando se dispone de patrones de referencia certificados (caso a, Figura 1), el valor de dicho patron es el que se acepta como valor verdadero y la exactitud puede evaluarse aplicando el método sobre dicho patrén (caso a.1.) 0 bien analizando muestras de Placebo 0 de problema a las que se ha afiadido una cantidad conocida de dicho patron (caso a.2. y a.3.). También se acepta la comparacién de los resultados con un método de referencia validado del que.ya se ha demostrado su exactitud (caso b, Figura 1); entonces el valor verdadero es el que se obtiene'con dicho método de referencia y se compara con el valor hallado con el método nuevo que se quiere validar. VALOR DE REFERENCIA ‘ACEPTADO caso a) caso b) Método de referencia patrén | Método de referencia validado 1) Principio activo (analito puro) 2) Placebo cargado con el analito 3), Muestra problema cargada con el analito Figura 1. Concepto de valor de referencia aceptado 5.2 Ambito de aplicacién Seguin la guia (ICH, Q2A) debe ensayarse la exactitud en métodos de analisis para la valoracion en materia prima y en producto acabado y en métodos de andlisis de cuantificacién de impurezas. Seguin la USP 24 también debe evaluarse la exactitud en los métodos de andlisis de estudios de velocidad de disolucion.Exactitud ‘Materias primas y especialidades 77 5.3 Procedimientos de determinacion de la exactitud La exactitud debe demostrarse en todo el ran; fecomiendan un minimo de 9 determinacione: que cubran el rango especificado, 1go especificado para el método analitico. Se 'S Sobre 3 niveles de concentracion del analito Por ejemplo 3 determinaciones x 3 niveles de Concentracién, que podrian ser la concentracién central y las concentraciones en los extremos del rango. En funcién del tipo de método a validar y de cada caso concreto se deberd tener en cuenta el rango de concentraciones de trabajo: ' 1) Riqueza de un principio activo en materia prima o en producto acabado: 80-120%. 2) Impurezas: desde el 50% del nivel de especificacion hasta el 120% de dicho nivel. 3) Ensayo de disolucién: si se trata de un producto:de liberacién inmediata seria de Q-20% a Q+20%; si se trata de un producto de liberacién controlada, sobre cada limite de disolucién en cada periodo de tiempo se aplicaria (+20%), La exactitud se expresara como porcentaje de recuperacién en Ia valoracién de una cantidad conocida de analito ariadida sobre la muestra o como la diferencia entre la media obtenida y el valor aceptado como verdadero junto a los intervalos de confianza (ver Figura 2). Porcentaje de recuperacién (R) Diferencia = xm -p Donde: Xm = valor medio hallado jalor aceptado como verdadero Figura 2. Expr 5.3.1. Riqueza de un principio activo 5.3.1.1 Aplicacién del método analitico a una muestra de riqueza conocida ara evaluar la riqueza de un tilizacion de un método absoluto, lemostrar la exactitud del método onocida y se compara el valor hal Principio activo 0 de una materia prima es habitual la Por ejemplo una valoracion acido-base. En este caso para Puede valorarse un patron de referencia de concentracion lado con el valor verdadero conocido. No obstante, como 2 se ha comentado anteriormente, en muchos casos no existen patrones de referencia ficados por un organismo oficial, como los patrones del NIST (National Institute ot tandards and Technology) 0 los suministrados por las diferentes Farmacopeas (EP. USP andards, BP standards). Entonces la evaluacién de la exactitud puede llevarse a cabo por comparacién con un método de referencia validado como se describe mas adelante sando se trata de un principio activo nuevo d ®parar un patron de referencia y valorar su riqu mo, por ejemplo, lesarrollado por primera vez, seria posible 1eza mediante una combinacién de métodos 'a valoracion absoluta junto con una cromatografia en diferentes78 Materias primas y especialidades Exactitud Condiciones de elucién para demostrar su pureza junto con otr identidad y estructura: la espectroscopia de infrarrojo, andlisis elemental, etc. fos métodos que aseguren su la resonancia magnetica nuclear, el 5.3.1.2 Comparacién con un método de referencia validado Se comparan los resultados obtenidos con el método analitico obtenidos con un método de referencia, cuya exactitud esta Ambos métodos deben ser independientes, que se quiere validar con los bien determinada o definida. Elemplo 1: Comparacion de 2 métodos anallticos a una concentracion tnica de anal. Se realizan 6 determinaciones por método. Un método es el que se estadistico de comparacién de dos medias de series no at test de t con la variancia conjunta). _N_ Método A 1 2 99.8 101.3 3 100.9 100.5 4 989 . 1006 5 100.6 99.2 6 101.0 100.0 media 100.30 100.47 s 0.80 0.78 s 0.6480 6146 Test de F Feap = 82 = 0.6480 _ 4 o549 si 0.6146 Fratias (Qla=6-1=5; gly=6-1 ),.05)= 5.05 Foup* Fusies significa que ambos métodos tienen variancias estimadas iguales y Por lo tanto, precisiones semejantes. Testdet Como consecuencia de que las variancias son homogéneas se puede aplicar e! Siguiente test de t (en caso contrario aplicar un test de t para variancias no homogéneas). Xa Xb s? st + no” ne siendo s? la variancia,conjunta que se calcula a partir de la expresién:eee ee ae Exactitud Materias primas y especialidades 79 (na —1)s3 + (ne ~1)s2 (1-1) (m1) = 0.6313 [100.30 -100.47| ia fe 313 0.6313 6 6 aus (gI=6+6-2=10; a=0,05/2)= 2.228 0.3633 lep< tabies Significa que no hay diferencia entre las dos medias. 53.2 Determinacién cuantitativa de un analito en un producto acabado El enfoque es similar al que se plantea para evaluar la exactitud de un método para la "nqueza de un principio activo pero en este caso se trabaja sobre el producto acabado 53.2.1 Aplicacién del método analitico a una muestra de concentracién conocida La muestra de concentracién conocida se prepara a partir de un placebo cargado con cantidades conocidas de analito, o in, cuando es dificil o imposible obtener un placebo Feroblgenteng@ el analito en cuestion, se puede usar el método de adicién de patron sobre el problema. lberacion controlada que constan de pellets 0 de comprimidoe eon recubrimientos Polimericos o también las formulas transdérmicas (Hokanson, 1994)80 Materias primas y especialidades, Ejemplo 2: Placebo cargado y evaluacién estadistica. Se parte de un placebo preparad Io del problema, y se le ahad conocidas de analito patron Exactitud jen car oa Concentracién teérica (ug/ml) ——Nvelt Nivel 2 Nivel 3 10.20 20.12 30.28 Respuesta 10.76 20.36 30.00 10.12 20.28 30.16 EI analito se determina en cada muestra utilizando el mismo mét evaluar y se calcula la recuperacién, (odo analitico a Cone. Area media dos Cone $*__ Recuperacion a _inyecciones hallada (1 (%) 2191755 10.04 88.43 Nivel 4 2308145 10.58 0.2802 98.33 BNNs te 100.59 20.14 100.10 20.45 100.44 20.21 _ 99.65 30.59 101.02 64918110 30.20 02043 © 10067 _.648741.0 30.417 100.03 Media (%) 99.918 CV (%)= 0.960 Para determinar si el factor con resultados se utiliza un test de ‘muestrales del mismo tamafio como \centracion tiene alguna infl igualdad de variancias de puede ser el test de Cochran. Soe 0.2802 7 Si+s?+s? 0.2802+0.1626 +0.2343 G, 41386 Grasine(8=0.05; k =3; 0.8709 - Donde k el numero de grupos y n el numero de determinaciones por Al ser Gea utiizadas son equivalentes, es decir, variabilidad de los resultados. La recuperacién es satisfactoria (media=99.918%). * Para confirmar se aplica un test de t: {100 xf*vnr {100 -99.918|« v9 feep = = 9148 cv. 0.960 frases (=0.05; gl = 2.306 AN ser lop trois NO existe diferencia significativa entre la recuper 100, por lo que la exactitud es correcta, luencia en los varios grupos F grupo. *< Gracies significa que las variancias de las tres concentraciones que el factor concentracién no influye en la acion media yea Exactitud Materias primas y especialidades 79 (Me ~1)s3 + (ne~1)s? (n.=1)-+(ne=1) 0.6313 [100.30 - 100.47} 0.6313 0.6313 6 6 .05/2)= 2.228 = 0.3633 tiaios (QI=6+6-2=10; {em< taias. Significa que no hay diferencia entre las dos medias. 53.2 Determinacién cuantitativa de un analito en un producto acabado El enfoque es similar al que se plantea para evaluar la exactitud de un método para ta “aueza de un principio activo pero en este caso se trabaja sobre el producto acabade 53.2.1 Aplicacién del método an: ico a una muestra de concentracién conocida La muestra de concentracién conocida se prepara a partir de un Placebo cargado con Cantidades conocidas de analit, o bien, cuando es dificil o imposible obtener we placebo Siprobloma "22 &! analito en cuestién, se puede usar el método de adicion de patter cotre el problema, a) Método del placebo cargado. Se Prepara un placebo del problema que contiene todos los ingredientes excepto el analito a determinar. Sobre dicho placebo se afladen cantidades conocidas de Tango a estudiar. El ensayo de recuperacion se reall80 Materias primas y especialidades Exactitud om Elemplo 2: Placebo cargado y evaluacion estadistica, Se parte de un placebo preparado del problema y se le afaden cantidades conocidas de analito patron. —___. —____Concentracién teérica (jig/ml) nee Nivel 1 vel Nivel 3 10.20 30.28 Respuesta 10.76 30.00 40.12 30.16 El analito Se determina en cada muestra utiizando el mismo método analitco a evaluar y se calcula la recuperacion. Cone. ‘Area media dos Cone! ‘s” _ Recuperacion ee inyecciones hallada (g/m!) (%) 219975.5 a 98.43 Nivel 1 2308145, 10.58 0.2802 98.33 7 2222718 1018 _ 4348905 20.14 100.10 Nivel 2 4412380, 20.45 0.1626 100.44 nae 4362620 20.21 9965 "687696.0 30.59 101.02 Nivel 3 649181.0 30.20 0.2343 100.67 ___648741.0 30.17 100,03, Media (%) = 99.918 CV (%)= 0.960 Para determinar si el factor concentracién tiene alguna influencia en los resultados se utiliza un test de igualdad de variancias de varios grupos Muestrales del mismo tamafio como puede ser el test de Cochran Si 0.2802 Gey =, Sm = 0.41386 wP s?+s2 +s?” 0.2802 +0.1626 +0.2343, Gstias(0=0.05; )= 0.8709 Donde k el numero de grupos y n el numero de determinaciones por grupo, Al Set Geo< Gratis significa que las variancias de las tres concentraciones uilizadas son equivalentes, es décir, que el factor concentracion no influye en la Variabilidad de los resultados. + La recuperacién es satisfactoria (media=99.918%), * Para confirmar se aplica un test de t: hoo» o0-99.918|+-vo cv 0.960 = 2.306 fen = 148 Al Ser lao tae NO existe diferencia significativa entre la recuperacién media y 100, por.lo que la exactitud es correcta,Exactitud Materias primas y especialidades 81 b) Método de adicién de patron. Se utiliza esta aproximacién cuando no es posible Preparar un placebo de la matriz de la muestra que no contenga el analito. Este podria ser el caso de las muestras lioflizadas en los que la presencia o ausencia del analito es Significativamente distinta. Se afiaden sobre una o varias muestras cantidades conocidas de un analito patron a tres niveles de concentracién dentro del rango a estudiar. Se fealizan como minimo 3 replicados para cada nivel y se analizan las muestras adicionadas y no adicionadas segun el método analitico calculando finalmente la recuperacién. Este método tiene 1a ventaja de utilizar muestras reales y no requiere la Preparacion especial de un placebo cargado. No obstante, también debe hacerse la misma reflexion que para el método del placebo cargado, ya que la adicion de un patron sobre una muestra no es exactamente lo mismo que el producto acabado real Elemplo 3: Adicién de patron y evaluacion estadistica (Woodget, 1987). Se parle de una muestra de concentracién desconocida (blanco de concentracién x ppm en analito). Se afaden cantidades conocidas de analito a tres alicuotas de esta muestra y se analizan por triplicado. La recta de calibracién efectuada con soluciones patrén del analito (1-10 ppm) es: Y=164.3x+2.4 (r=0.9998) Para determinar la exactitud se hallan las respuestas experimentales netas para 2, 4 y 6 ppm y se comparan con los resultados obtenidos por interpolacion on la ‘recta de calibracién para las mismas concentraciones de analito: Concentracién «Respuesta exp neta - blanco Interpolacion _ Recuperacion i %) 2 ppm 435.7-108=327.7 0 a 4 ppm 761.7-108 y 99.1 6 ppm 1075.7-108=967.7 97.9 : 98.7 0.67 + Larecuperacién es satisfactoria (media=98.7%), * Para confirmar se aplica un test de t fto0-s}*vn f100-98.7]« V5 83 361 cv 0.67 ‘ ties (0.05; gle: =2) = 4.303 Al Ser loo< tasias NO existe diferencia Significativa entre la recuperacién media y 100, por lo que la exactitud es correcta82 Materias prmas y especialidades Exactitue 5.3.2.2 Comparacién con un método de referencia validado S resultados obtenidos con el método analltico Que se quiere validar con los n Método di Se comparan Io: obtenidos con ur Ccterencia, cuya exactitud esta bien determinaca 0 definida, ‘Ambos métodos deben ser independiente. Ejemplo 4: Comparacién de métodos con 2-4 concentraciones, respectivos coeficientes de variacién para cada Concentracién se toman como Season ,Ce, l@ tepetiblidad. Un test de F y, Posteriormente, un test de t aplicados a cada concentracion indicara, fespectivamente, si existen diferencias oo Precision y exactitud entre ambos métodos y si cl factor concentracién influye Sobre estos pardmetros (ver ejemplo 1) Elemplo §: Comparacion de métodos con § 0 mas concentraciones (regresion lineal y intervalos de confianza) Concentracion Método a Método b ee 603 359 612 593 60 504 59.6 608 59.0 _ 596 608 — 80.6 80.3 80.5 80.5 80 795 813 81.0 795 a 813 208 100.0 100.6 99.5 1005 989 99.1 ues 101.0 101.1 100.0 2 99.4 ~ 121.6 120.5 1213 i208 1201 1199 uJ 119.9 121.3 _ 1203 1205 1500 150.6 1502 1508 150.8 1499 ed 151.6 151.0Exactitud Materias primas y especialidades 83 En abcisas se representan los valores del método de referencia (a) de precision y exactitud conocidas y en ordenadas los valores correspondientes del metodo a evaluar (b). i Si el diagrama de puntos es curvado indica que los métodos conducen a resultados diferentes. Si se observa una linea recta que se curva a partir de un Gierto punto, este punto de desviacion indica un limite de linealidad. Si ambos métodos son equivalentes, se obtiene una recta de pendiente igual a 1 y ecuacion y=x. Cuando la equivalencia no es buena la ordenada en el origen no sera cero y/o la pendiente sera distinta de 1. La recta de regresion que se obtiene es: y= -0.7727 + 1.0063x a interpretacion estadistica se basa en el calculo de los intervalos de confianza de la pendiente b y del termino independiente a. + Para b: bites, donde t es tats (a=0.05/2;gl=n-2) 1 bites,= 1.0063 + 2.069+0.0062 (0.9934, 1.0192) * Para a: att+s, donde t es tatis (0°=0.05/2;gl=n-2) attess= -0.7727 42.069+0.6675 (-2,1535, 0.6081) Si los intervalos de confianza de b no incluyen el 1, significa que b es diferente de 1 para a=0.05 bilatgeral y existe un error proporcional a la concentracion del analito Si los intervalos de confianza de a no incluyen el cero, significa que a es diferente de cero para «=0.05 bilateral y existe un error sistematico por exceso 0 por defegto, 5.3.3 Determinacién cuantitativa de impurezas Se aplican los mismos métodos que para principio activo 0 producto acabado pero se utiizan muestras (principio activo/producto) cargadas con cantidades conocidas de. impurezas. En la determinacién de impurezas suele ser mas habitual utilizar el método de adicion de patron de la impureza patron sobre la muestra de principio activo o producto acabado. Deben tenerse en cuenta las mismas consideraciones que en el apartado 5.3.2. En los casos en que es imposible obtener muestras con cantidades conocidas de impurezas 2 productos de degradacién, por ejemplo cuando no se puede obtener la impureza aislada, Se considera aceptable comparar los resultados obtenidos con un segundo método independiente. Como los métodos de determinacién de impurezas son, en general. métodos clomatograficos, puede usarse el factor de respuesta relativo al principio activo, es decir, utlizar como patron de referencia un patrén del principio activo diluido a la concentracion limite de la impureza que se quiere determinar. Deberia quedar bien definido cémo se calcula el valor individual o total de impurezas (Peso/peso 0 tanto por ciento) respecto a la cantidad mayor de analito presente en el Producto.84 Materias primas y especialidades Exactitud 5.4 Criterios de aceptacién @) Valores orientativos aceptables en la industria farmacéutica Tipo Coef. Recuperacion (%) Materia prima 99.0 101.0 Formulado farmacéutico 97.0- 103.0 ‘Trazas (0.1-10ppm) Min. 90% Trazas (<0.1 ppm) Min. 75% eT Min. 75% ») Valores orientativos aceptables segin la AOAC (Asociacién Oficial de Quimicos Anallticos), en funcién de la concentracién del analito (AOAC, 1993; Huber, 1999) % Analito _Relacion ' Unidades _ Factor recuperac n (%) 100 1 100% 98-102 210 10" 10% 98-102 21 107 1% 97-103 201 10° 0.1% 95-105, 0.01 10% — 100 ppm 90-107 0.001 10° 10 ppm 80-110 0.0001 10° 1 ppm 80-110 0.00001 107 100 ppb 80-110 0.000001 10° 10 ppb 0.000001 10° 1 ppb ©) Valores orientativos aceptables para los métodos descritos en EPA: el porcentaje de la recuperacion debe estar entre el 50 y él 150 % del valor tebrico (Wiliams, 1983), ®) Ottos autores recomiendan que la recuperacién expresada como Porcentaje sea +4CV Gel valor teérico en todos los niveles, siendo CV el coeficiente do variacion en porcentaje obtenido en el ensayo de la precisién del método (Debesis, 1982).* Exactitud Materias primas y especialidades 85 55 Comentarios y conclusiones {a exactitud nos indica si los resultados que se obtienen con un método analitico estén Byoximos al valor verdadero o al que se acepta convencionalmente como valor verdadere Este puede obtenerse de distintas formas. Una alternativa es comparar los resultados del método a evaluar con otro método de referencia validado, cuya exactitud haya sido Gemostrada. Otra alternativa es analizar una muestra de concentracién conocida, es deci, un patrén de referencia certificado. En el caso de la determinacién de un analito en un Producto acabado, ya sea un principio activo, un excipiente o una impureza, la muestra de No siempre se obtienen valores de recuperacién cercanos al 100%, ya que ésta depende de 'a matriz de la muestra, de la efectividad del método de preparacion y extraccion y de la ‘concentracién del analito. la desviacion de la exactitud por exceso se produce cuando existen interferencias yla telectividad del método no es la adecuada, entonces se obtienen resultados Superiores al (alr verdadero. En este caso, si es posible, se deberian modificar las condiciones del nétodo para optimizar la selectividad o bien cambiar a otro alternativo que sea selective, a desviacion de la exactitud por defecto suele producirse cuando la matriz de la muestra Scomplele y la extraccion del analito requiere varios pasos obteniéndose recuperaciones nis bajas. Cuando esto ocurre seria conveniente intentar optimizar la preparacion do ses pata mejorar el factor de recuperacién. Si esto es muy costoso 0 no es posible85 Materias primas y especialidades Limite de deteccién y cuantiticacién 6. LiMITE DE DETECCION Y LiMITE DE CUANTIFICACION 6.1 Definicion y gener: Dado un método a dicho metodo, la minima cantidad de ana Cuantificar, bajo las condiciones experimental El limite de cuantificacién es por tanto un término cuantitativo deteccién es sélo cualitativo, concentraciones en el que si bie razonable certeza, si puede detectar: Re esta definicion general se derivan, no obstante una serie de Cuestiones previas a resolver, tales como cuando es necesario establecer ls limites de cuantinew ses y deteccion Falicangmetode de andlisis y cual es el interés en su determinacién; es dear qué aporta ala Validacion del método estabiecer dichos limites Gomo ya se ha apuntado con anterioridad, a quia tripatta ICH establece como necesaria la Geterminacién del limite de deteccién en métodos de andlisis doctinadce la evaluacién de impurezas mediante ensayos Esto es, ensayos en los que simplemente se determina sila cantidad de impureza presente en la muestra es superior o na limite establecido en purezas conocidas y fesconocidas junto, con la suma total de éstas, y parece obvia que si se ha de dara Limite de deteccién y cuantiticacién Materias primas y especialidades 87 Por otra parte, cuando el método se define como un método de analisis de valoracién de contenido en el cual siempre se trabaj Es importante recordar Parametro de validaci 7 0 8@ Modifique el modelo de equipo empleado en el andlisis (ej: tansferencia de métodos analitcos interlaboratorio) tina vez se ha visto la importancia de estos parémetros de validacion, se tratara de Gesarrollar los diferentes métodos a través de los cuales pueden establocerce Ne obstante, rocedimientos de analisis y sistemas instrumentales hay de muy diversa indole y sus caracteristicas definen en muchos casos cual es el método dptime a seguir de entre los posibies. 63. Procedimientos de determinacién del LD y LC 6.3.1 Método basado en el examen visual Si definido, se deberia puntualizar que este procedimiento es el mas indicado en el caso de Iélodos de analisis no instrumentales, en los que no se tiene una seftal numérica, y que en icultad que puede entrafiar nor que permite ser detectada. Seguidamente debe com tlisis de un numero adecuado de réplicas a esta cone wr, 1990). 9 ejemplo muy frecuente y que sigue el mismo wacién volumétrica con un indicador visual de color.88 Matenias primas y especialidades Limite de deteccién y cuantiicacién 6.3.2 do basado en la relacion sefialiruido Este método, uno de los mas conocidos y empleados, requiere que el procedimiento de anilisis Sea instrumental que proporcione una sefial blanco, un nde de fonds © una linea Ge base, es decir una sefial residual a concentracion cero de anallo. Es el cove de métodos instrumentals tan empleados en el campo quimico-farmacéues como la “sPectrofotometria UV-visible o la cromatografia de gases 0 liquida (HPLC), Fuando el método de andlisis se basa en alguna de estas técnicas, puede establecerse el limite de deteccién y cuantiticacion de forma tebrica mediante el siguiente procedimiento: fone, Sefal-uido es mas costoso, pero una vez establecido este valor puede conciares co forma tedrica y aproximada que el LC sera igual a la concentracion de onatite que Grohe sade ds myschal 10 veces superior (en ocasiones se admite hasta un valor de 20) # Gicho ruido de fondo, y que el LD seré igual a la concentracién de analito due Proporcione sea asphal 3 veces superior a éste. La justificacion a estos valores fue establocde do acuerdo a los interyalos de confianza de una distibucién normal (Long, 1983), LC = 10 veces seftal del ruido LD =°3 veces sefial del ruido| aa Limite de deteccién y cuantiicacién ‘Materias primas y especialidades 89 que no sea necesario alcanzar el verdadero limite del método siempre y cuando el LC encontrado sea inferior al 50% del valor limite de las es Pecificaciones de impurezas, 63.3 Método basado en la desviacién estandar de la respuesta, del blanco y la Pendiente de la recta de calibrado calibrado det anaiit. 2 exPresion a aplicar para este célculo varia en funcién de si el método instrumental empleado corrige la sefial frente a un blanco o no 63.3.1 Métodos instrumentales que corrigen la sefial frente aun blanco Este primer caso corresponderia a un método sespectrofotométrico en el que se podria calcular e! LD y LC teéricos mediante la expresion se Conetaniacién de analito en el limite de cuantificacién 0 deteccién, K= Constante que usualmente se considera i desviacion estandar correspondiente a la 43.2 Métodos instrumentales que no Corrigen la sefial frente a un blanco [caso en que no se realiza correccién frente a un blanco es tipicamente el de métodos fombaraticos GC 0 HPLC. En éstos se ha de tener on Cuenta también la sefial media "lenida del anélisis correspondiente al placebo, es decir, el ruido de fondo 0 background {sistema (Yu) con lo que la expresion final sera entonces: Cy = YeH(K #55) ° = Yet (Ks, b be i‘40 Materias prmas y especialidades Limite de deteccién y cuantiticacién La aplicacion de estas formulas sélo es valida si la mayor fuente de variacion es debida a la desviacién estandar del blanco: Su1>> Say Sy >> Sp De lo contrario, con el fin de considerar también ta falta de linealidad y la existencia de 3.590 habria que sustituir en las expresiones anteriores la desviccion estandar del blanco Sa, Por el término’ sisi +(albye xs? Este procedimiento, al igual que el de ta relacion Sefia/ruido, plantea el problema de como calcular la sefal media de un blanco asi como su desviacion estandar. Es decir como caleular el ruido de fondo 0 background y su correspondiente desviacion estandar. Para ello pueden seguirse las pautas que a continuacién se detallan wi t t > we 1984), v 20 W1 620 w2 ») En la regién delimitada puede medirse la sefial del blanco como la ‘mayor fluctuacion Gn COs (Ne) © como la mayor fluctuacion de la sefal frente al cero en valor absoluto (N,). Del analisis reiterado de la muestra placebo se obtiene ure sone media y en Sater oie una desviacién estandar para la linea de base o ruido de fonder sistema, Estos seran los valores que deberan introducirse en ne expresiones anteriormente descritas.Umite de deteccién y cuantiticacion Materias primas y especialidades 91 Wu Aa Nz Now. Hay que aclarar que estos calculos no son mas que aproximaciones basadas en el andlisis de muestras placebo y que se evalua la altura de las fluctuaciones de la sefial aunque despues el método de analisis se valide tomando como sefial habitualmente el area de los bicos cromatograficos; por todo ello SIEMPRE es necesario tras el calculo tedrico, una comprobacion experimental del resultado obtenido, analizando a la concentracién de! LC {e6rico sucesivas muestras y’estudiando su precision y exactitud, asi como confirmando que 'a concentracién establecida para el LD es realmente la minima aceptable. 63.4 Método basado en Ia extrapolacion de la recta de calibrado a concentracién cero i Se trata de un procedimiento aplicable también a métodos analiticos instrumentales que proporcionan resultados numéricos y dirigido a evitar el calculo, en ocasiones costoso en tiempo, como se ha podido observar, de la sefial media del blanco y su desviacién estandar. Para ello el método utiliza igual que el expuesto con anterioridad la pendiente de una recta de calibrado realizada a niveles de concentracién cercanos a los limites esperados, pero sustituye el valor real de la sefial del blanco por el resultante de la extrapolacién de dicha recta. La interseccién con el ejé “Y" correspondera tedricamente al valor de la respuesta a concentracién cero de analito. De la misma manera se sustituye en la formula, la desviacién estandar del blanco por la obtenida de estimar a partir de esta recta la de un hipotetico blanco. Experimentalmente, consiste pues en analizar muestras con concentraciones conocidas Proximas al limite de cuantificacién y calcular la ecuacién de la recta Respuesta frente a Concentracion, y aplicar las mismas férmulas que las expuestas en el apartado anterior. Elemplo 1: Método por HPLC para determinar el LD y LC de un principio activo Para llevar a cabo una Validacién de Limpieza. La recta de calibrado obtenida en el estudio de la linealidad del principio activo es: Area = 30.05 [ppm cone] + 2.50 Se preparan para calcular estos limites tres muestras a concentraciones que se Suponen cercanas al LC y se analizan en las condiciones descritas en el método obteniendo la siguiente tabla de resultados:92 Materias primas y especialidades Limite de deteccién y cuantificacion Concentracién Area Area media Desv. estandar em) ——— 25 76.0 785 7 772 7.253 5.0 182.1 155.0 148.8 151.9 3.102 10.0 300.1 293.5 309.1 300.9 7.831 De este pequefo estudio de linealidad a concentraciones bajas se deduce una nueva recta de calibrado que serd la que se extrapola: Area = 29.82 [ppm cone} + 2.73 (= 0.9991) Extrapolando a concentracién cero la ecuacién de esta recta, se obtiene como Sefial ruido la correspondiente al término independiente, es decir: Yo= 2.73 Para el calculo de la desviacion estandar de la sefial proporcionada por el ruido Se debe construir ta recta calculada tomando como eje de ordenadas las desviaciones estandar de las respuestas y como eje de abcisas las concentraciones estudiadas. De esta forma se obtiene una recta de ecuacion: Y=0.887X-1.11 (r=0.9983) Se considera que la desviacién estandar de las respuestas corresponderé al valor de la ordenada en el origen de esta recta: Sy 21.11 Una vez calculado el valor medio de la seftal del ruido por extrapolacién y la desviacion estandar de esta sefial, se pueden calcular los limites tedricos de detec: i 2734 3*1.11) cu = 22 +G*11) _ 9 12 ppm 29.81 *v3, Lc (K=10) 73+ (10*1.11) _ 9 97 ppm 29.81+V3, 6.3.5 Método experimental de célculo para el LC (Método EURACHEM) Cuando no se existe la posibilidad de tener una muestra placebo o cuando se especifica un crlerio concreto de precisién y exactitud, un método experimental, sencillo y eficaz, para el célculo de! LC eg el método EURACHEM (Eurachem, 1993): Gonsiste en preparar una serie de muestras con cantidades decrecientes de analito y analizar cada una de ellas 6 veces consecutivas, representando CV (%) de la precision frente a la concentracién de cada muestra,Limite de deteccién y cuantiticacion Materias primas y especialidades 93 CV (%) 10% Cone Le ‘Cone (ppm) Normaimente se fija un criterio de precisién de un CV=10% en el limite de cuantificacion, aunque se puede llegar a aceptar hasta un 20%, en funcién de las caracteristicas del metodo. Como es obvio habra también que fijar un criterio de exactitud que puede aso siguiente intervalo de confianza: se al RytCV#tr Ry -CVet] va vn Donde: Rm = recuperacién media n= numero de ensayos tar= tde Student para n-1 grados de libertad Siempre que el valor del 100% esté incluido dentro del intervalo puede considerarse exacto en el nivel de concentracién propuesto. Otra posibilidad pasa por considerar como aceptable la exactitud si la recuperacién media se encuentra entre los margenes establecidos en la siguiente tabla que fija su relacion con la Concentracién de analito en la muestra (AOAC, 1993): —% Concentracién _Unidades __% Recuperacion admitido 100 100% 98-102 >10 10% 98-102 >4 1% 97-103 >0.4 0.1% 95-105 0.01 100 ppm 90-107 0.001 10 ppm 80-110 0.0001 1 ppm 80-110 0.00001 100 ppb 80-110 0.000001 10 ppb 60-115 0.000001 1 ppb 40-12094 Matenias primas y especialidades Limite de deteccién y cuantificaciés Elemplo_2: Método HPLC para ta determinacién de un conservante a Concentracién nominal 0.05 mg/ml (50 ppm) Se prepara una bateria de diluciones que serén analizadas bajo las condiciones Geseritas por el método por sextuplicado, oblenionds una tabla con los siguientes resultados: Concentracion (100%) pm 10pm __Sppm__1.0 ppm 1625.0 320.1, 160.1 30.2 1620.8 325.2 162.2 32.5 Area 16276 321.6 165.5 35.6 16222 3238 = 196 «= 30.7 1629.1 32691657 208 16228 3201 1698 334 1624.6 304.5 463, —3.336 3.309 . 2.38 A la vista de estos resultados se puede establecer el limite de cuantificacién en 0.5 bpm considerando como aceptable un coeficiente de variacion mnferen al 10% Yuna recuperacién media de 100.9% 6.4 Comentarios y conclusiones Imprescindible de cualquier preparado farmacéutico, En este sentido es de destacar la importancia que adquieren e! LD y LC como herramientas indispensables en cualquier método analltico, ya que es cada vez mae frecuente y necesario Se Puede garantizar que es valido para evaluar el contenido en productos de degradacién de una especialidad, lo que a su vez permite controlar la estabilidad. iRobustez Materias primas y especialidades 95 7. ROBUSTEZ 74 Definicion La guia ICH, Q2A define la robustez de un método analitico como la medida de su capacidad para permanecer inalterado ante pequenas pero deliberadas variaciones en ceatcemmat fesultados validos en presencia de pequetios cambios Fespecto de las condiciones descritas en el método, susceptibles de producirse durare su utilizacion. obligando a la consiguiente revalidacion de los ies. Se considera por tanto que antes de fijar los Pardmetros anallticos y fedactar el método a validar, es recomendable hacer un estudio de robustez de forma que on ¥e2 fijados los margenes en los que el método es Fobusto, se pudieran incluir éstos96 Materias primas y especialidades Robustez impone son realmente hécesarios o limitan la realizacién del método a unas condiciones escasamente reproducibles. Todos los metodos, sea cual sea la técnica empleada, son susceptibles de ser sometidos a un estudio de robustez. Algunos pueden tener muchos pardmetros sobre los que actuar y otros menos. Ademas éstos no tienen por qué ser s6lo factores relacionados con la medida final, sino qué pueden ser de cualquier etapa del procedimiento analitico, como por ejemplo la preparacion de la muestra. Por esto, la primera etapa del estudio es precisamente analizar todo el método y definir qué factores son los que se espera que influyan mas en el resultado final. 7.3 Procedimiento de determinacién de la robustez 7.3.1 Factores y niveles de influencia Antes de definir los factores de variacion, hay que establecer donde se quieren estudiar su influencia, Dicho de otra forma, qué parametros se van a medir en cada ensayo. En el caso de un analisis cuantitativo resulta evidente que se debe analizar la influencia de cada variable sobre la concentracién de analito calculada. Pero en el caso de la cromatogratia, Por ejemplo, si hay presente mas de un analito interesard estudiar la influencia de cada factor sobre,los parametros que después definiran el test de idoneidad del método, como Pueden ser la resolucién entre dos picos préximos, la eficacia de la columna (N), el factor de Capacidad (k’) 0 el factor de asimetria. El estudio de {a influencia sobre varios parémetros NUNCA implica la realizacion de mas ensayos, sino que se puede hacer a partir de los mismos. Los factores a evaluar en cualquier método de analisis pueden ser tanto factores Cuantitativos (ej. influencia del valor de pH, del valor de temperatura, porcentaje de Componente organico en una fase mévil HPLC, etc.) como cualitativos (ej. fabricante de la columna cromatografica, fabricante de un determinado reactivo, etc.). Algunos ejemplos de los factores més cominmente evaluados dependiendo de la técnica analitica empleada son (Van der Heyden, 2000) n de fa fase movil: + Porcentaje de organico ‘+ Concentracién de sales en el tampén (fuerza iénica) + Concentracién de aditivos (e). aminas) * En gradientes: Composicion inicial y final de la fase rhévil y pendiente del gradiente + Volumen de inyeccién + pHdela fase movil © Temperatura de la columna © Flujo * Tipo de columna: * Fabricante de la fase estacionaria * Lote de columna + Antigdedad de la columna + Detector: Variacién de longitud de onda (UV) o voltaje (Deteccién electroquimica) ‘+ Sensibilidad de integraciénRobustez ‘Materias primas y especialidades 97 ic Flujo de gas portador Gradiente de flujo del gas portador: + Flujo inicial * Flujo final * Pendiente de la curva de flujo Flujo del split ‘+ Temperatura del inyector + Temperatura del detector * Volumen de inyeccién * Programacién de temperatura: * Temperatura inicial * Temperatura final * Gradiente de temperatura * Tipo de Liner * Tipo de columna: * Fabricante de la fase estacionaria * Lote de columna * Leves variaciones de longitud, * Antigdedad de la columna * Sensibilidad de integracion qc + Variaciones en la composicién del eluyente + pH de la fase mévil + Temperatura * Distancia de desarrolio + Forma y tamario de la mancha “+ Volumen de muestra + Lote de placa cromatogratica * Condiciones de secado + Condiciones de revelado + Concentracién de electrolito + pH del tampon * Concentracion de aditivos (surfactantes, solventes orgéinicos etc.) * Temperatura + Voltaje * Tiempo de inyeccion * Concentracién de ta muestra * Concentracion de los liquidos de tavado. + N°de lavados * Longitud de onda del detector98 Materias primas y especialidades Robustez * Factores de integracién + Tipo de capitar: * Fabricante * Lote ie ez Cefinidos los factores que pueden influir en el andlisis se ha de fjar entre qué margenes de variacién se quieren evalyar: : sormraimente los margenes de fluctuacién de cada factor cuantitativo se distribuyen simétricamente respecto al valor nominal descrito en el método de andlisis (e}, pH # 0-1 u) Lo que resulta algo mas dificil es fijar el intervalo de variacién; en teorla se deberia establecer la incertidumbre asociada a cada uno de los pasos involucrados en la medida de on cuenta ésta, Se puede defini el intervalo como el producto de dicha incertidumbre por un foeficiente de seguridad que habitualmente se define por defecto como K=5 (Van der Heyden, Nilhuis, 2000). En muchas ocasiones es la propia experiencia del analista la que Permite establecer unos margenes razonables de fluctuacion en cada factor. ZTias establecer los factores a estudiar la forma aparentemente mas sencilla de comprobar la influencia de cada uno de ellos sobre el método seria comparar los resultados obtenidos modificando dicho factor, pero manteniendo constantes los demas. No obstante esto conlieva dos problemas: * El efecto de modificar mas de un factor a la vez puede ser diferente de lo observado al modificarlos de uno en uno. * Cuando hay bastantes factores esto representa mucho trabajo, tiempo y dinero. La forma mas eficaz de estudiar la robustez es pues efectuar un disefo factorial. De esta forma, a menudo, sin realizar todas las combinaciones posibles, se puede concluit con un numero asequible y razonable de experimentos qué variables son las que mas influyen en el resultado y en qué magnitud. 7.3.2 Disefios factoriales fraccionados Normaimente se utilizan dos tipos de disefios factoriales: * _Disefios factoriales completos y fraccionados + _Disefios de Plackett-Burman y Youden-Steiner, Los mas habituales y sencillos son los disefios de Plackett-Burman, con los que a partir de {"1) experimentos se pueden llegar a evaluar el efecto de { factores, la desventaja es que en estos disefios, a diferencia de los disefios fraccionados, los efectos de las interacciones entre 2 0 mas factores quedan confundidas con los efectos principales, es decir, no puede evaluarse el efecto de las interaccignes entre factores. No obstante, también ha de Sefialarse que dicho efecto suele ser en la practica casi siempre despreciable.Robustez Materias primas y especialidades 99 Como no se trata en esta guia de profundizar en exceso en el disefio factorial sino de establecer unas pautas de cémo evaluar cada parémetro dentro de la validacién, se limitard a explicar algunos ejemplos sencillos. Por razones de interpretacién estadistica, el numero de factores a evaluar es conveniente que sea como minimo de tres y de ocho el numero minimo de experimentos: 7.3.2.1 Disefio factor de tres factores. completo de ocho experimentos (2°) para evaluar la influencia Mediante la matriz resultante de! andlisis factorial para este caso, se puede establecer la influencia de tres factores A, B y C asi como de sus interacciones dos a dos, La interaccién 4e los tres conjuntamente también puede ser tenida en cuenta: i Factores Interacciones N? Ensayo A BO AB AC BC ABC 1 - : + +> + = 2 + : : rs 3 - po 5 4 pean ec! rs 5 5 | + + ane oer 6 +] + =| = 7 Te ae 7 Ee neal 8 + [+ a El signo contenido en las columnas A, B, C es el correspondiente a la desviacién disehada Gel factor respecto a su valor nominal. La columna Interaccién AB.es el resultado del Producto algebraico de los signos de las columnas A y B. Y de la misma forma la de la columna ABC es el correspondiente al producto de cada una de las columnas A, B, C. Cada linea representa un experimento a realizar. Por ejemplo, el factor A puede ser el pH de la fase movil en HPLC, que segin el método analitico debiera ser 3.5. El signo “-" indica que en ese experimento el valor de pH sera 3.2, ¥ $i el signo es “+” el pH sera 3.8. B corresponde al porcentaje de organico en la fase mévil (25 + 2%) y C al flujo (1 + 0.1 ml/min. ). De esta forma el experimento 4 se realizara en las siguientes condiciones: pH = 38 % organico = 27% Flujo = 0.9 mi/min, Se realizan los ocho ensayos segtin indica cada linea de la matriz, con lo que se obtendran ocho resultados para contenido en principio activo, o cualquiera de los parémetros que nos interese analizar (N? platos, resolucién, factor asimetria, elc.): Rt, R2, R3, R4. RS, RG, RY y RB. Una vez obtenidos los resultados el siguiente paso es realizar la evaluacion estadistica que evidencie cual de los factores, 0 que interaccion entre ellos tiene una influencia significativa.100 Materias primas y especialidades Robustez Una forma sencilla de llevarla a cabo seria calcular la influencia de cada factor de la siguiente manera (Caporal-Gautier, 1992): Influencia del factor A; A= 1/4 -R1 + R2-R3+R4—R5+R6—R7 + RB) Influencia del factor B: B= 1/4 (-R1-R2+R3+ R4—R5-R6+R7 + RB) La influencia sobre el parémetro de la interaccién entre el factor A y B sera: AB = 1/4 (#R1— R2—R3 + R4 + R5— RG —R7 + RB) ASI se calculan los efectos principales y las interacciones entre los diferentes factores, de forma que puede ya intuirse cuales de ellos pueden tener realmente relevancia, En cualquier caso una manera también sencilla de comprobar la importancia del efecto generado consiste en calcular para cada caso el correspondiente intervalo de confianza: Por ejemplo para el factor A: Sen Attest in Donde: . '= Coeficiente de Student para probabilidad (1-(a/2)) y el nimero de grados de libertad de Sexp Sem = desviacion estandar de los resultados de los experimentos. n= nde experimentos Si 21 intervalo de confianza del efecto de un factor contiene el cero, este efecto puede considerarse como negligible. Si el cero no se encuentra dentro del intervalo el resultado det analisis significa que se halla influenciado por la variacién del factor en cuestin. De esta forma todos aquellos factores cuyo intervalo de confianza excluya el cero deberdn ser fijados con gran exactitud en el procedimiento de andlisis, 7.3.2.2 Disefio factorial fraccionado de ocho experimentos (2“') para evaluar la influencia de cuatro factores La interaccién ABC obtenida en el disefio desarrollado con anterioridad es una interaccion de tercer orden. Estas interacciones se producen muy raramente, y como en el caso de Producirse, suelen ser despreciables, esto nos permite fraccionar el disefio factorial pasando de un disefio para evaluar tres factores a un disefo para evaluar cuatro, pero manteniendo el mismo numero de experimentos. Para ello se puede sustituir el efecto de la interaccién ABC, por considerarlo muy improbable, por el de un nuevo factor D (al que se llamard generador), de forma que mediante igualmente 8 experimentos ahora se conseguiria una matriz que permitirA evaluar la influencia de cuatro factores. EI inconveniente en este caso serd que las inleracciones de este nuevo factor con los anteriores también se han de tener presentes, con lo cual:Robustez Materias primas y especialidades 101 Factores Interacciones NeEnsayoo A | B c D(ABC) AB+CD AC+BD AD+BC Si tras realizar los ensayos correspondientes se observa algun efecto significativo, ya no se Puede atribuir la influencia a una sola interaccién sino a la suma de las dos. Para evitar esta ambigiedad y este cumulo de posibles confusiones, siempre existe ta posibilidad sencilla en la mayoria de las ocasiones de sustitdir la interaccién ABC por un factor D del cual se sepa Seguro que no puede interaccionar con los otros tres; por ejemplo en el caso tipico de la cromatografia liquida HPLC, los factores que pudieran influir en el resultado del contenido en principio activo podrian ser: A: Porcentaje de solvente organico en la fase movil B: Flujo de fase movil C: Volumen de Inyeccion D: Tiempo de extraccién durante la preparacién de la muestra La influencia que puede ejercer el factor D nunca sera resultado de la interaccién con A, B 0 C, los cuales entre ellos si que pueden interaccionar. De esta forma se elimina la interaccién del cuarto factor con los anteriores y se consigue una matriz con el menor grado de confusion posible: ' T { Interacciones NEnsayo | AC = 4 2] = _ 3 - + : 4 * + So = - 6 +] — 7 + e+ | + + + A partir de aqui la evaluacién estadistica seria idéntica a la de los casos anteriores Otra posibilidad seria realizar la misma técnica empleada con la interaccién de tercer orden n las de segundo orden, con lo que se podria evaluar 7 factores con 8 experimentos. En este caso las interacciones resultantes empiezan a ser indescifrables y la confusion puede conducir a un callején sin salida102 Materias primas y especialidades * Robustez ! Factores ‘| A Bf Cc T »p Ej FTG Abr) ABS AF* AG _ABY Ace) Ber Imteracciones; CF+ | CG+ BG+ | Br+ cbs | por | AD+ bG DF DE cE Fo | EG EF En estos casos, cuando el numero de factores a evaluar es superior a 4, se puede recurrir a Gisehos factoriales que por no tener en cuenta el posible elect ae las interacciones simplifican mucho el analisis de los resultados. 7.3.2.3 Disefios factoriales de Plackett-Burman Los diseftos de Plackett-Burman son quizés los mas empleados. Permiten evaluar ta influencia a dos iveles de 3 a 23 factores con f+1 experimentos (un nimern superior 24 combinadas entre ellos. Para generar ta matriz que permite construir ol disene colo oe siguiente Perec ia distribucién de ta primera columna de cada matriz, que seria la Siguiente (Plackett, 1946): N= N° ensayos eeiepepe eee a a i= eT EET ree tet 1 jletele GT pet +e ETE GT TPG pete A partir de esta tabla se puede construr cualquier matriz tniendo en cuenta que: * Fas siguientes columnas de la matriz se obtienen por una permutacién ciclica de una posicién con respecto a la columna anterior. La ultima fila se completa con todes ioc signos *-", ‘Ejemplo: La matriz en un disefio de 7 factores, 8 experimentos seria: 1A IF IE aaa T= i= 2 [+ + |- 3 | : + 4 5 f+ + fe 6 |. + + 7 + + al. : : * Guando el n° de factores es inferior a 7, se pueden completar mediante factores ficticios “dummys” que no tienen sentido ni relevancia analitica, * Como en los casos anteriores, se trataria de realizar aleatoriamente los experimentos Seguin indica la matriz del diseno y proceder tras ello a la evaluacion estadistice ie los resultados.Robustez Materias primas y especialidades 103 Primero se calcula el efecto de cada factor mediante la expresi6n: Dw) TO Ve ne nla 2 5 Donde: E, = efecto del factor x ZY (+) = suma de los resultados del factor x en el extremo superior del intervalo definido ZY (-) = suma de los resultados del factor x en el extremo inferior del intervalo definido 11= n° total de experimentos Este efecto puede normalizarse al dividirlo por la respuesta media del experimento realizado a valor nominal ¥(0) de forma que: %Ex= * +100 Y) Asl, se puede ver facilmente cual es el porcentaje de influencia ejercido por un determinado factor y considerarlo significativo o no incluso sin realizar una interpretacién estadistica mas compleja. 7.3.2.4 Disefios factoriales de Youden-Steiner Este es uno de los métodos clasicos para estudiar la robustez (Youden, 1975). Permite estudiar la influencia 0 efecto resultante de la modificacion de 7 factores descritos en el método mediante 8 experimentos. Los valores nominales indicados para cada factor en el método corresponden a las letras mayisculas (A, B, C. etc.). Los valores alternatives o modificados estan indicados por letras minusculas (a, b, c, etc.). En.los 8 experimentos a ‘ealzar tiene que haber 4 parémetros en mayisculas (valores nominaies) y 4 en minusculae (valores alternativos) no tratandose pues de evaluar un intervalo simétrico de varlabilided sino un valor concreto. La matriz resultante es: i Factores Exp. Ala Bib Cie Did Ele Fit Gig RESULTADO aaa B Cc D E F G s 2A B Cc D e t a t SaEmrAl b =c d E f 9 uv 4A b c d e F G v Sa B Cc d e F “9 w 6a 8 Cc d E f G x 7a b i D e f G ~y Smee b c D E F Q z Para cada factor se calcula el efecto que supone utilizar el valor indicado en el método (Vp) y él alternativo (V4). Dicho efecto se calcula como la media de los resultados obtenidos on los experimentos en los que se ha utilizado. Por ejemplo, el efecto de cambiar el valor “D” por “d” se calcula:104 Materias primas y especialidades Robustez — Gettyes)_ (evans) Fas dliferencias més elevatas indicaran que los factores correspondientes tienen mayor influencia que el resto sobre la precision de! método. Estadisticamente una forma de decidir sila influencia de un factor es relevante consiste en comparar el valor del efecto con la expresién sV2, donde s es la desviacién estandar obtenida en el ensayo de repetibilidad del método. Las diferencias superiores en valor absoluto al resultado de esta expresin se consideran significativas, El sistema de Youden-Steiner como ocurre también con el disefio de Plackett-Burman, puede aplicarse cuando el n® de factores es inferior a siete. En este caso a los factores que Auedarian sin variable se les debe asignar una operacién sin influencia analitica ("dummy"). Logicamente, la diferencia para estas variables debe ser irrelevante iemplo En un método destinado al andlisis de un principio activo por HPLC se quiere evaluar el efecto sobre la eficacia de la columna (N) de los siguientes factores: omposicion de la fase mévil tiempo de espera antes de inyectar la muestra ‘Se define que los valores nominales y alternativos de estos factores son: Factor | Valor (nominal) Factor | Valor (alternativo) aA | 1.0 mifmin a 4.5 ml/min B | 40°C je ~ 25°C. c | 10 nl ; oe 20 u! D | Fabricante X loa | Fabricante Y —e | 76 } e 74 F | 70/30 ; ¢ 65/35 (Tampén 50 mMoi pH7.6/ACN) | | (Tampén 60 mol pH 7.SIACN ) cs | Thora a | 12 horas Se realizan los 8 experimentos, descritos en la matriz, de forma aleatoria y se Obtione los siguientes resultados respecto a la eficacia de la columna:Robustez Materias primas y especialidades 105 Experimento Resultado ——__(N) 6540 6250 4789 4890 4985 5010 6589 6160 ——_2__6160__ Se puede ahora calcular el efecto de cada factor: loNOaken| Efecto A = 1/4 (6540+6250+4789+4890) - 1/4 (4985+5010+6589+6160) = -68.75 Efecto B = 1/4 (6540+6250+4985+5010) - 1/4 (4789+4890+6589+6160) = 357 Efecto C = 1/4 (6540+4789+4985+6589) - 1/4 (6250+4890+5010+6160) = 1650 Efecto D = 1/4 (6540+6250+6589+6160) - 1/4 (4789+4890+4985+5010) Efecto E = 1/4 (6540+4789+5010+6160) - 1/4 (6250+4890+4985+6589) Efecto F = 1/4 (6540+4890+4985+6160) - 1/4 (6250+4789+5010+6589) = -63 Efecto G = 1/4 (6540+4890+5010+6589) - 1/4 (6250+4789+4985+6160) = 845 A simple vista puede observarse que el factor D (fabricante de la fase estacionaria) influye significativamente sobre la eficacia de la columna. 7.4 Comentarios y conclusiones Los estudios de robustez de un método de analisis permiten, por una parte, conocer la estabilidad de dicho método ante pequefias modificaciones de las condiciones descritas en ¢1y por tanto su independencia frente a éstas. Por otra parte, también permiten conocer en muchos casos las condiciones de trabajo éptimas en cada paso del procedimiento de andlisis. Por todo ello, la robustez no debe considerarse como un parametro de validacion en si Iana®: Sino como el estudio que permitiré conocer cuales son las condiciones optimas de trabajo para tas diferentes variables estudiadas, asi como cudles de ellas son criticas y han de ser mas estrechamente controladas. Se trata de validar el mejor de los métodos posibles, el método "éptimo".106 Materias primas y especialidades Idoneidad del sistema 8. IDONEIDAD DEL SISTEMA (SYSTEM SUITABILITY TEST) 81 Definicion entender como parte integrante del procedimiento de analisis y requisito previo @ su fealzacion. En la practica, podria equipararse a una cualificacion del proceso analltico (PQ) © una “revalidacién en continuo”, ya que proporciona la seguridad de que en el momento de iniciar el ensayo, e| conjunto del sistema continua siendo *valido" para el propésito para el que fue concebido. 82 Ambito de aplicacion El test de idoneidad del sistema es susceptible de emplearse en cualquier procedimiento de medida en el que las condiciones analiticas puedan estar sometidas a variacion de las condiciones operacionales. Por ejemplo, en procedimientos analiticos volumétricos se incluye la evaluacion del blanco y una precisi6n de los resultados obtenidos. Sin embargo, 2s en las técnicas cromatograficas donde éste tipo de pruebas se emplean con mayor asiduidad, Este test no solo debe circunscribirse al ambito de la determinacién final sino que puede disefiarse con el fin de comprobar la idoneidad de cualquier etapa del procedimiento, como or ejemplo la preparacién de la muestra. 8.3 Procedimiento de determinacién de la idoneidad EI test de idoneidad del sistema debe encontrarse vinculado de forma directa a las caracteristicas del método analitico para el que se establecié, ya que debe reflejar su viabilidad en el momento de empleario. Los requisitos que debe cumplir el método analitico se establecen desde la primera fase de desarrollo, aunque en esos momentos no es posible concretar la prueba que permitira comprobarios. Durante este periodo sera suficiente el registro de la evolucién de los distintos parémetros analiticos a Io largo del tiempo y la comprobacién de la precisién del sistema realizando medidas repetidas de una misma preparacién de muestra. Posteriormente, los resultados del estudio de robustez permitirin adquirir el conocimiento necesario para establecer los factores criticos y el impacto que éstos han tenido sobre el comportamiento del método. Este es el momento de disefiar las pruebas a realizar y establecer los criterios que permitan asegurar que los requisitos establecidos se cumpliran mas allé del momento concreto en el que se lleva a cabo la validacion propiamente dicha, Los ensayos de idoneidad del sistema que se establezcan vendrin dados por el conocimiento adquirido del método y la viabilidad de su empleo en rutina debiendo corresponderse con los valores minimos para los que los parametros estudiados Permanecen dentro de las especificaciones establecidas.LL eee ldoneidad del sistema ‘Materias primas y espécialidades 107 Estos ensayos no solo demuestran que el sistema se encuentra en perfectas condiciones ara realizar el andlisis sino que tambien permiten establecer el criterio por el que modificar is condiciones analiticas descritas en el procedimiento con el fin de slesnser is idoneidad. acciones a realizar en caso de no cumplirse 84 Parametros de evaluacion Los parametros de evaluacién de los ensayos de idoneidad se pueden agrupar en tres categorias: + Precision * Parametros cromatograficos: ~ Factor de capacidad (k’) » Numero de platos teéricos (N) * Factor de asimetria o de cola = Resolucién + Limites de deteccion o cuantificacien, Como se puede observar, las pruebas de idoneidad encuentran su mayor difusion dentro de las Sécnicas separativas, y por ello los parémetros de evaluacion son principalmente de Fite de aeieettenecientes a dos categorias, por ejemplo precision y résolucion Precision y limite de deteccién, 84.1 Precision del test de idoneidad del sistema @eeficiente de variacion igual o inferior al 2% en la inyeccion de ¢ replicados (0 real sobre 6 replicados si el requerimiento es superior al 2%) La guia de la FDA (Nov. 1994) recomienda un coeficiente de Variacion inferior al 1% para un imisimo de cinco inyecciones en el caso de principio active, ‘aceptando valores del 5-15% cuando se trata de impurezas o productos de degradacion.108 Materias primas y especialidades Idoneidad del sistema Numero de inyecciones 3 4 CV (%) maximo per 02% 0.30 0.37 215 0.31 0.44 0.55 #20 0.41 0.59 0.73 0.85 £25 0.52 0.74 0.92 1.06 #30 0.62 0.89 4.40 4.27 — $30 __062 obo tz La precision es el parémetro de mas amplia aplicacion para la evaluacién de la idoneidad det sistema. Aunque habitualmente se estudia sobre el area del pico cromatogréfico, también Puede evaluarse sobre la altura o el tiempo de retencién. Este ultimo permite dar una idea de la estabilidad del sistema en un momento determinado aunque sera dificil utilizarlo como un referente entre dias, porque sus cambios no tienen porqué afectar al resultado obtenido, Si la precision del tiempo de retencién se considera un factor critico es mas aconsejable expresarlo como tiempo de retencién relativo o factor de capacidad, o mejor atin, calcular la resolucion entre los picos de interés, 8.4.2 Parametros cromatograficos 8.4.2.1 Factor de capacidad (k’) EI factor de capacidad, también definido como relacién de distribucién de masa (D), se interpreta como el numero de volimene’ de fase mévil necesarios para eluir un compuesto después del volumen inicial contenido en la columna (tq). Este factor determina la retencién de un soluto y puede ser calculado como: te Roto Donde: tiempo en el que un compuesto no retenido pasa por el interior del sistema tiempo de retencién del compuesto considerado, Valores bajos de k’ indican que el pico eluye muy proximo al frente de solvente, pudiendo verse comprometida la selectividad. Son recomendables valores de k’ superiores a 1, consiguiéndose una éptima resolucion con valores mayores de 2. 8.4.2.2 Numero de platos teéricos (N) EI numero de platos teéricos es una medida de la eficacia del sistema cromatografico, que expresa el nimero de picos que pueden aparecer en el cromatograma por unidad de tiempo Y, Por lo tanto, de la capacidad del sistema de proporcionar bandas de elucion estrechas, El calculo de! numero de platos teéricos se basa en la relacién entre el tiempo de retencién y la anchura del pico cromatografico pudiendo emplearse distintas formulas tales como las que a continuacién se detallanOO _ TLL Woneidad del sistema * Materias primas y especialidades 109 [+ Farmacopea Europea y Japonesa ANCHURA 01 50% (Opcional en USP para integradores electrénicos). eh temo oe R,¥ RETENCIGN N= ay] Donde: Ry = tiempo de retencion W= anchura de pico al 50% de la ae altura Anche SD ‘elo are > eee ANCHURA por TANGENTES RY waio-(Fr) TeMPo De RETENOON Donde: R, = el tiempo de retencién I W= la anchura del pico en la linea de 7 base determinado por ta SA Bot tangente ajustada a un % de la altura del pico Otros calculos se basan en la asimetria del pico (Foley, 1983) 0 en la extrapolacién de éste auna campana de Gauss. {es parametros sobre los que se puede incidir para modificar el numero de platos tebricos sen la columna o soporte (longitud, calidad, tamafio de particula) y las diversas condiciones fomatograficas definidas en el método (temperatura, flujo, fase movil, etc.) Elnimero de platos teéricos depende del tiempo de elucién pero en general se recomienda Que sea superior a 2000. Este parametro tiene especial interés en las Pruebas de idoneidad te! sistema donde existe un solo pico de interés dentro del cromatograma y en el estudio ag tazas como complemento a la comprobacién del limite de deteccion, En otros casos es mas fecomendable el estudio de la resolucién. 84.2.3 Factor de asimetria o de cola factor de asimetria o de cola es una medida de la asimétrica de la sefal generada por el analto. Existen varias férmulas de célculo que toman la anchura de ambos lodee del pico a Gistintas alturas, siendo la mas habitual en las Farmacopeas.110 Materias primas y especialidades Idoneidad del sistema Woos TOF Donde: Woes= anchura de pico al 5% de la altura del pico. F= distancia entre la perpendicular ae I tazada desde el maximo del oe pico y el frente al 5% de la altura leanctuna est —o] del pico. Un pico perfectamente simétrico tendra un factor de cola de 1.0. Un pico que presente un ensanchamiento por el inicio del pico tendra valores inferiores a la unidad, mientras que si presenta cola el factor de asimetria serd superior a la unidad. ‘Como norma general el factor de asimetria deberia encontrarse entre 0.8 y 1.5, aunque pueden aceptarse valores de hasta 2.0. Las sefiales simétricas son preferibles porque minimizan las imprecisiones en la deteccion del inicio y el final del pico por parte de los sistemas de integracién. Por lo tanto, permiten tuna mejor y mas precisa cuantificacién del area bajo la curva. Accontinuacién, se muestran dos cromatogramas: ‘+ Cromatograma A: tres picos perfectamente simétricos (factores de cola de 1.0) + Cromatograma B: los mismos tres picos pero variando sus factores de asimetria: Pico 1: factores de cola de 1.0 Pico 2: factores de cola de 2.0 Pico 3: factores de cola de 4.0 PoIdoneidad del sistema Materias primas y especialidades 111 EI pico 3 del cromatograma B no tendra una precision tan buena como su homélogo del Gomatograma A al presentar mayor dificultad para detectar el inicio y final por el sistema Ge integraci6n, La presencia de picos asimétricos también puede incrementar el limite de deteccién, Gifcultar ta tesolucién entre picos y la reproducibilidad a largo plazo debida a la variabiiced entre lotes de columnas con distintos efectos de retencién secundaria, Otras posibles causas de asimetria en los picos se pueden atribuir a + Muesira sobrecargada, disolvente inapropiado o mal inyectada + Suciedad en los fitros (fritados) * Volumen vacio 0 suciedad en cabeza de columna + Envejecimiento de ta columna * Calidad de la columna (contenido en metales pesados, silanoles libres) ‘+ PH de la fase mévil (tampén) El test de idoneidad del sistema permite el control del factor de cola y establece las Pautas Para corregir la aparicién de picos asimétricos. 8.4.2, 4 Resolucién La resolucién es la medida de la separacién entre dos picos. Este parémetro resulta muy util para comirolar el comportamiento de posibles interferencias. La formula de caloulo para la resolucin es: Cw bee a tre Rs7 112 Materias primas y especialidades Idoneidad del sistema salen tery tke= tiempo de retencién (tiempo de elucién del maximo del pico medido desde el inicio de la inyecci6n), ta <'tee C= constante cuyo valor varia seguin el criterio con el que se mida la anchura de pico Wy W2 = anchura del pico a media altura, C=1.18 (EP y JP) W1 y W’ = anchura del pico por tangentes, C=2.0 (USP) Para realizar el calculo la anchura de pico y el tiempo de retencién se deben expresar en las. mismas unidades. El valor minimo de resolucién aceptable deberia ser aquel que permita la resolucion a linea de base entre los picos de interés. Se entiende como resolucién a linea de base la obtenida cuando la sefial correspondiente .a las ultimas trazas de analito llega a linea de base antes de que las primeras trazas del siguiente analito en eluir sean detectadas. Ahi Rs=1,.0 Rs-1.5 Ris=2.0 Para picos de tamatio similar se alcanza una resolucién a linea de base con valores de 1.5, ‘aunque es deseable fijar una resolucion mayor de 2.0 0 si se espera la aparicin de posibles‘doneidad de! sistema Materias primas y especialidades 113 lente, producto de degradacién, patrén interno, etc.). Se Guede considerar que la resolucion se encuentra minimamente afectada por la relacicn de areas entre compuestos, aunque si la relacién es muy desproporcionada, cong ones Pre ctv © impurezas, se debe tener en cuenta que la posible asimetria del Mayoritario no afecte al menor. 8.4.3 Limites de deteccién o cuantificacion Fata determinadas aplicaciones puede ser interesante el control de otros parémetros Simllares como el ruido de fondo y la deriva de la linea de base, por ejemplo para controle: {a estabilidad de la temperatura, la mezcla de fase mévil o la estabiliday de algunos detectores (indice de refraccion), Por la naturaleza de este parémetro su aplicacion sera de eleccion en cualquier método (cromatogratico 0 no) utiizado para la determinacién de impurezas. Una vez establecide Io Solucién de prueba del nivel adecuado, a comprobacién y célculo del limite se realizara Por cualquiera de los sistemas propuestos en esta Monografia: 8.5 Comentarios y conclusiones Las pruebas de idoneidad del sistema han de ser entendidas como parte integrante de! Procedimiento de analisis y en general su realizacién es un paso previo a la aplicacién fulinaria del método. Sus resultados permiten demostrar que los equipos funcionan correctamente y que la determinacion se realizara en las condiciones descritas durante la validacién. No deberian considerarse validos aquellos resultados obtenidos sin superar estas pruebas. EI ambito de aplicacién de las pruebas de idoneidad del sistema no debe centrarse exclusivamente en las técnicas cromatograficas, ya que pueden establecerse Comprobaciones similares en otras técnicas analiticas distintas. Para que las pruebas de idoneidad del sistema cumplan su funcién deben disefarse Considerando las caracteristicas de cada anélisis. Para ello, es importante que se basen en ies resultados obtenidos en el estudio de la robustez. Los requisitos minimos a cumplit (Precision, resolucion, limite de deteccién, etc.) dependeran de la exigencia necesaria para Cada aplicacién, Por este motivo no es recomendable la utilzacién de limites genéricos para todos los tipo de determinaciones. Las pruebas de idoneidad del sistema deberian incluir las iniciaciones de ajuste a realizar ‘cuando los criterios establecidos no se hayan cumplido.r 114 Materias primas y especialidades Transferencia de métodos analiticos 8. TRANSFERENCIA DE METODOS ANALITICOS 94° De i6n y generalidades Después de haber validado un método analitico, en un laboratorio puede surgir la necesidad @ransferirlo a otro centro. La transferencia de un método consiste en demostrar que el laboratorio receptor puede obtener resultados analiticos comparables a los det laboratorio emisor. Dicho de otra manera, es el proceso de verificar, dentro de un laboratorio, que un método previamente validado en otro ambito conduce a resultados flables (Rius, 2000), Aunque alin no hay ninguna guia sobre transferencia de métodos analiticos realizada por Seneral eect eon caph '@ ICH, 0 las Farmacopeas oficiales, existen opiniones generalizadas de como deberia hacerse (Lanese, 1998). Cuando se realiza una transferencia, lo mas habitual es que el emisor sea el laboratorio de HO que ha desarrollado y validado el método analitico y que el receptor sea el laboratorio de {anol de calidad, Pero no siempre es asi, ya que también puede darse el caco en que el laboratorio emisor sea un laboratorio que previamente ya haya transferdc, el metodo actuando como receptor 0, que se trate de laboratorios de analisis de companias diferentes. Es importante remarcar que el laboratorio receptor que desea utilizar Para el analisis de tuna un método analitico previamente validado, es el responsable de asegurar que dicho 92 Ambito de aplicacién No todos los métodos analiticos necesitan ser transferidos Ensayos que requieren transferencia analitica incluyen: * aguéllos donde se valora la riqueza y/o sustancias relacionadas en una ‘materia prima * 2s principios actives, conservadores y/o sustancias relacionadas on una especialidad farmacéutica * aquellos que se consideran crticos para el producto o bien que Fequieran especial Cuidado (viscosidad), ; Los métodos analiticos estandar como Monografias de Farmacopea no necesitan ser transferidos ni los de tipo cualitativo o semicuantitativo de loe que hay amplia experiencia (metales pesados, cloruros, pH, etc.). En cualquier caso ve tomaran las precauciones habituales de cuando se analiza algo desconocido por primera vez, Antes de iniciar ta transferencia analitica el laboratorio de origen 0 emisor debe suministrar: a) una copia vigente de! Método analitico (por lo tanto, con las modificaciones realizadas) 5) una copia del informe de validacién de dicho método <) Palrones de referencia con su correspondiente certilicado de ahdlisisTransferencia de métodos analiticos Materias primas y especialidades 115 Si se diera el caso de que el método ha variado, debe haber una revalidacién de éste o bien, una justificacién de que los cambios no afectan la validacion, La documentacién necesaria durante una transferencia analitica puede dividirse en cinco Categorias (Nordic Committee on Food Analysis, 1997): 1) Procedimiento analitico segin el formato del laboratorio receptor, reflejando los, Getalles concretos de la metodologia analitica para asegurar qué el mated oo aplica siempre del mismo modo, 2) Protocolo: éste debe ser claro, conciso y aprobado por ambas partes. Se incluye tun modelo de protocolo de transferencia (ejemplo 1). 8) Documentacién de los datos primarios (raw data) del trabajo experimental, 4) Documentacién de la evaluacion de los resultados. 5) Informe final, que incluiré una recopllacion de los resultados de la transferencia, La documentacién debe incluir también el informe de ta validacién analtica, el Protocolo 0 Procedimiento de transferencia aplicado, los responsables de la transferencia, los mucatran Ge an sido analizadas, los resultados del andlisis levado a cabo, como se han trsteds dichos resultados y el criterio de aceptacion.eyes -sojdeoes ouo}e0qe7 eyes yosiwe ouoye109e7 souojeioge] soqwe @P | eoueiut ig | pepl SeIpaW! :]UB EIDUEIE,IG | ugisioaiq, Jeuy oUO;UY Yo seBSqUD exed oyu) EYDO Jeuy aw0}U| [2 J808y ap opeByeoUe oLO}eI0qe7 ISIIPUE SO] SopO) Je}9\duiOD e1ed eyUUI) EYE (910 “O1dH SeuUIN|Od ‘elouBJaje4 ap sprepue}s ‘seNSENU) soNstUJUNS JeIAUE eIed ayiLU)| eYDe4 - ‘OPIN 9000014 Ne FOUBTOUEH OOOOHIG ST orauary ~_ ae -Transferencia de métodos anailticos ‘Materias primas y especialidades 117 9.3. Procedimiento Asi pues. la transferencia se efectuard de acuerdo con un Protocolo especifico que transcurre en dos etapas principales. 1) Bemostrar que se mantienen controlados los pardmetros de idoneidad (suitability), es decir que en el nuevo laboratorio el método analitico mentions ioe Parmetros 0 rattnarig. [12408 en su validacién y que funciona correctamente antes de su ulligeco, futinaria Comprobar de manera no exhaustiva: * La selectividad [2 linealidad (al menos a valor nominal y en los extremos del rango) * [2 precision (ya que permite estimar la variabilidad ‘de. los resultados intralaboratorio) * El limite de deteccion y cuantificacién (cuando se requiera trabajar en niveles cercanos a estos valores) Elemplo 2: Comparacion de los resultados obtenidos por dos laboratorios, gmisor (A) ¥ receptor (B), a una concentracién unica de analitd. Se realisen 3 determinaciones por lote y se trabaja con 3 lotes distintos. Laboratorio emisor. A B j——— oratorio recepios Be Lote | x Y z Zz Muestra 1) 99.91% 100.58% 101.53% | 10030% 100.30% 10.60% Muestra2) 98.70% 98.02% 98.90% | 100.20% 101,80% 10.60% Muestra3| 101.82% 98.70% 99.92% | 100.10% 00.40% 10.60% ee 10.60% Cv | 157% 1.34% 133% | 0.10% 083% 0.00% ee x oY 2 Diferencia medias entre laboratorios (%) cree ae Para calcular la diferencia entre medias se utiliza la siguiente formula: XanXy = *100 (x4 +9) 2 Si se desea ser mas ANOVA. 'guroso desde el punto de vista estadistico podria realizarse uné. 19 Materias primas y especialidades Transferencia de métodos analiticos 94° Criterios de aceptacion los criterios de aceptacion deben ser coherentes y de acuerdo con las especificaciones del Producto y los parametros del método analitico validado. A continuacién se presentan algunos criterios de aceptacién que pueden orientar en la estimacion de la equivalencia entre resultados obtenidos por dos laboratorios )__Diferencia medias entre laboratorios Principio activo 2-3 < la mitad del limite de especificacion” Conservante 23 < la mitad del limite de especificacién* Impurezas 10-20 | 10% relativo * Por ejemplo, la mitad del limite de especificacion es 2.5% si las especificaciones son 95-105%, Respecto @ los criterios de aceptacién de la linealidad, precision, limite de deteccion, selectividad, etc. seran los mismos que los establecidos para la validacién de un método analitico, 98 Comentarios y conclusiones En el informe final aprobado por ambos laboratorios debe quedar claro si el método se considera transferido correctamente o no, Si se diera el caso de que los resultados obtenidos por ambos laboratorios no fuesen Saujualentes, deberian ponerse en contacto y analizar el porqué de dicha situacion, Algunos é los motivos por los cuales se puede dar esta sitvacién son la no equivalencia entre Giubes, el distinto nivel de entrenamiento del personal, fa documentacion inconsistente y la fata de coordinacién entre laboratorios,Métodos de Farmacopea Materias primas y especi 10. METODOS DE FARMACOPEA 10.1 Ambito de aplicacién Muchos paises 0 grupos de paises tienen Farmacopeas donde se describen los métodos oficiales para analizar materias primas y/o formas farmacéuticas. Esto no quiere decir que {as autoridades no admitan métodos de andlisisaltemativos pero, en este caso, deben over validados, En el caso de la EP, los fabricantes de materias primas pueden caietes un 10.2 Procedimiento, Los métodos de las Farmacopeas se consideran validados: Asi pues, no es necesario realizar ninguna revalidacién a la hora de poner el método en marcha en cualquier laboratorio. Generalmente, estos métodos han sido sometidos a ensayos interlaboraturios para confirmar su buen funcionamiento al ser utilizados en diferentes centros de trabajo, bien, se consideran validados por su utilizacion a lo largo del tiempo. 10.2.1 Materias primas Aates de decidir que a una materia prima se le aplicaré una Monografia en la Farmacopea, Se debe comprobar que los métodos descritos en ella son adecuados. Por ejemplo. e¢ Posible que una molécula, por su ruta sintética 0 proceso de purificacién, tenga impurezas que no se pueden determinar por el método oficial. Esto es, que el método oficial no sea Selectivo para esta materia prima. En este caso habria que desarrollar un método alternative y validarlo. Para el resto de ensayos si se podria aplicar la Monografia oficial, siempre y ‘cuando las impurezas distintas de las descritas en la Farmacopea no influyan en los estos. For esta raz6n, la Farmacopea Europea emite los a los fabricantes que lo solicitan, el {Cattficado de idoneidad’, siempre y cuando su materia prima pueda ser analizada segin la Monografia correspondiente, sin ningun tipo de interferencia y proporcionando resultados fables. A la hora de aplicar la Monografia a materias primas no certificadas, habria que evaluar qué parémetros deben ser validados. El listado de materias primas certificadas se Publica en Pharmeuropa. 10.2.2 Especialidades Algunas Farmacopeas como la estadounidense 0 a briténica publican Monografias para el analisis de especialidades farmaceuticas. Estas pueden tener composiciones diferentes, a nivel cualitativo (excipientes) y/o cuantitativo. Es evidente que, para estos productos con matrices variables, fa Monografia puede tomarse como punto de partida, con el consiguiente ahorro de costes en el desarrollo del método. Seguidamente, y como en el caso de materias. primas, se debera evaluar qué parametros son necesario validar, siendo la exactitud y la selectividad los mas habitualmente afectados.120 Materias primas y especialidades ‘Métodos de Farmacopea 10.3 Ajustes en métodos cromatograficos de Farmacopea Es posible que a la hora de seguir un método cromatografico de Farmacopea en nuestro laboratorio se necesite ajustar algun parametro para cumplir el test de idoneidad del sistema. En los métodos cromatograficos hay un gran numero de variables que entran en |uego. Por ejemplo, no todos los instrumentos tienen el mismo volumen muerto o longitud de la celda del detector. Puede haber gran diferencia entre el mismo tipo de fase estacionaria adquirida a diferentes fabricantes de columnas. Es frecuente, por lo tanto, que siguiendo el metodo descrito en la Farmacopea no sea posible cumplir el ensayo de idoneidad del sistema. Esto puede implicar que la separacién no sea correcta por lo que el ensayo no deberia continuarse. En este caso habria que modificar alguna de las condiciones operacionales de! método, planteandose la duda sobre si es necesario realizar la correspondiente revalidacién de los parametros que puedan verse afectados (Furman, 1998). Para solucionar estos problemas, la Farmacopea Europea permite a partir del 1 de Enero de 2001 (USP lleva tiempo con su versién en borrador publicada en Pharmacopeial Forum, vol 26, 2000, pero sin aprobacién por el momento) realizar ajustes en los parametros Gromatograficos hasta unos valores maximos fijados sin necesidad de revalidar el método. Estos s6lo se pueden realizar cuando se dispone de estandares de referencia de todos los analitos y demuestran que dichos ajustes han mejorado la calidad de la cromatografia. Los auustes maximos permitidos indicados a continuacién corresponden a Farmacopea Europea 2001. A continuacién se detalian los ajustes maximos permitidos: cuando los limites establecidos por EP y Pharmacopeial Forum no coinciden, este ultimo se sefiala entre paréntesis. 10.3.1 Métodos HPLC -pH del tampén acuoso: 202 #1.0 sise analizan analitos neutros (40.2 segin Pharmacopeial Forum) ~Concentracién de sal en eltampén: 10% (siempre que se cumpla el requisito de pH) -Composicién de la fase mévil: Los componentes minoritarios se pueden ajustar en £30% en calculos relatives 6 +2% en absolutos, Ejemplo: Tampén/metano! 80/20 Variacién metanol relativa (30% de 20): #6 (14-26) Variacién metanol absoluta: #2 (18 - 22) Sin embargo, el cambio en ningun componente Puede exceder e! 10% absoluto (ni disminuir su Pfoporcién a cero, sein Pharmacopeial Forum) + Longitud de onda del detector: No se puede modificar. (EI error en la longitud de onda del instrumento no puede ser superior a +#3nm segin Pharmacopeial Forum) Longitud de la columna: 470% - Diametro interno de la columna +#25% (£50% segun Pharmacopeial Forum)SIS er mo Métodos de Farmacopea -Tamafio de particula: = Flujo: - Volumen de inyeccién: = Temperatura; 10.3.2 Métodos GC - Longitud de la columna: Diametro interno de fa columna: + Tamafio de particula: - Espesor de la pelicula: ~ Flujo: = Volumen de inyecci6n: - Temperatura de la columna: + Programa de temperaturas del horno: Materias primas y especialidades 121 Puede reducirse hasta el 50% No se puede aumentar 50% Se puede reducir sin limites mientras la precision y el limite de deteccién sean satisfactorios. (Se puede aumentar hasta el doble mientras no afecte a la linea base, forma de picos, resolucién, linealidad o tiempos de retencién, segun Pharmacopeial Forum) £10% (420°C segun Pharmacopeial Forum) 470% 425% (450% segun Pharmacopeial Forum) Puede reducirse hasta el 50%. No se puede aumentar (Pharmacopeial Forum no considera este pardmetro) Desde -50% hasta +100% (Pharmacopeial Forum no considera este pardmetro) 50% Se puede reducir sin limites mientras la precision y ellimite de deteccién sean satisfactorios. (Se puede aumentar hasta el doble mientras no afecte a la linea base, forma de picos, resolucion 0 tiempos de retencion, segun Pharmacopeial Forum) #10% (42% segun Pharmacopeial Forum) (Seguin Pharmacopeial Forum, las temperaturas bueden variar en 42% y los tiempos en +20%) 10.3.3 Métodos TLC y cromatografia en papel {La cromatografia de capa fina no estén contemplados en Pharmacopetal Forum ~ pH del tampon acuoso: ~ Concentracién de sal en el tampon: £02 + 1.0 si se analizan analitos neutros + 10% (siempre que se cumpla el requisito de pH)122 Materias primas y especialidades ‘Métodos de Farmacopea - Composicion de la fase movil: io se puede ajustar en s 6 42% en absolutos. inguin otro componente puede modificarse - Volumen de aplicacién: Se puede reducir hasta el 20% si se utilizan placas de menor tamafio de particula (2 ~ 10um) - Distancia de migracion: La distancia de migracién del frente no debe ser inferior a 50mm, 10.3.4 Métodos en cromatografia de fluidos supercriticos La cromatogratia de fluidos supercriticos no estan contemplados en Pharmacopeial Forum, ~ Composicién de la fase mévil Con columnas empaquetadas, el componente minoritario se puede ajustar en +30% en calculos relatives 6 +2% en absolutos Con columnas capilares no se permite ninguna modificacién - Longitud de onda del detector: No puede modificarse - Longitud de fa columna: 470% : ~ Didmetro interno de la columna: 425% para columnas empaquetadas 50% para columnas capilares - Tamajio de particula: Puede reducirse hasta el 50%, no pudiendo aumentarse (para columnas empaquetadas) * - Flujo: 450% - Temperatura: 410% = Volumen de inyecci6n: Se puede reducir siempre que el limite de deteccién y la repetibilidad sean satisfactorios Estos limites maximos dificilmente pueden ser el resultado de realizar ensayos de robustez en todas las Monografias susceptibles de ser ajustadas, sino més bien fruto de un Consenso. Esto quiere decir que no todos los métodos se comportaran igual ante un mismo ajuste. En algunos métodos una ligerisima variacion puede dar un resultado éptimo, mientras en otros quizas haya que ajustar un parémetro hasta su limite maximo permitido ara llegar a cumplir el ensayo de idoneidad requerido por la Monografia. En cualquier caso "se debe demostrar que los ajustes han contribuido a mejorar la cromatografia’. Cuando los ajustes excedan ios limites maximos permitidos, habria que realizar una revalidacion, por lo menos parcial. En el capitulo "revalidacion” se describe algunas orientaciones acerca de qué pardmetros pueden verse afectados al realizar determinados ajustes.Métodos de Farmacopea Materias primas y especialidades 123 10.4 Comentai sy conclusiones Las Farmacopeas proporcionan métodos oficiales de andlisis que no necesitan validarse. No obstante, puede ser necesaria una comprobacién o revalidacion de algun parametro para confirmar la validez de los métodos en casos concretos, Los métodos cromatograficos de Farmacopea se pueden y deben ajustar en caso necesario para cumplir el ensayo de idoneidad del sistema. En dicho caso se debe demostrar que los ajustes realizados son adecuados. Esta filosofia se puede extrapolar a a transferencia de métodos analiticos ya que durante el proceso de transferencia, los laboratorios emisor y receptor pueden acordar y aceptar los ajustes que se consideren necesarios,124 iaaterias primas y especialidades Revalidacion 11. REVALIDACION 11.1 Definicion método analitico previamente validado, continua sieree Suficientemente fiable en el tiempo o tras realizar modificaciones respecto al método inicia! 11.2, Ambito de aplicacion Se puede requerir una revalidacién en tos siguientes casos (Huber, 1998): * Paso del tiempo: Para demostrar que el método sigue siendo Valido. * Cambio de instrumentos 0 materiales: Cuando se produzcan cambios sustanciales en 'os instrumentos 0 materiales utilizados, * Cambio de laboratorio: Es necesario demostrar que un método validado sigue siendo fable cuando se aplica en otro laboratorio (ver capitulo de transferencia de métodos). * Modificaciones de parametros analiticos: Después de haber val lado un método, puede decidirse realizar alguna modificacién en algun parametro come tiempos de agitaci Proceso de extraccién, concentracién, etc. 11.3, Procedimiento Los pasos a seguir seran: a) Definir el cambio y documentario, ) Ver si el cambio esta dentro del ambito de aplicacién, parametros y limites establecidos en el método. ©) Determinar el grado de revalidacién a realizar en funcién del cambio/s. 4) Realizar la validacion de los pardmetros elegidos, ©) Definiry realizar los correspondientes tests de idoneidad del sistema. Ei grado de revalidacién requerida depende de la naturaleza de los cambios realizados y del cflerio de la persona responsable pudiendo reducirse para algunos Parémetros el trabajo experimental necesario. A continuacion, y a modo de ejemplo, se resumen algunos cambios indicando que parametros es recomendable revalidar.Revalidacién Materias primas y especialidades 125 * Cambio de matriz: * Selectividad Exactitud Linealidad y rango (s6lo cuando se determina en presencia de la matriz) Limites de cuantificacion y deteccion (si procede) Cambio sustancial en instrumentos (por ejemplo cambio de detector en cromatografia): Selectividad Linealidad y rango Precision Limite de deteccién y cuantificacion (si procede) * Cambio de condiciones operacionales que puedan afectar significativamente al método (cambio de tipo de columna cromatografica) * Selectividad * Precision + Limite de deteccién y cuantificacion (si procede) | + Cambio en la preparacion de la muestra: * Selectividad * _Linealidad y rango + Exactitud * Limite de deteccion y cuantificacion (si procede) 11.4 Comentarios y conclusiones La revalidacién viene determinada por el critetio, experiencia y conocimiento del método de la Persona responsable, siendo fundamental que esté justificada y documentada adecuadamente.126 Materias prmas y especialidades Plantas medicinales y extractos 12.PLANTAS MEDICINALES, EXTRACTOS Y ESPECIALIDADES FITOTERAPEUTICAS Particularidades de las plantas medicinales y sus preparados farmaceuticos, 12.4. Definicién cas plantas medicinales son productos vegetales de origen natural y de composicion sonable no totalmente definida. Es decir, son seres vivos que varian constantements eu aturaleza, del tiempo de insolacién, de la cantidad y calidad de! agua de lego, de las caracteristicas del suelo, de la época de recoleccién, ete., su composicion quinice vans Gualitativamente y cuantitativamente. Ademas, las distintas partes de une tiems planta (hojas, raices, efc.) también tienen distinta composicién, Por todo ello resulta bastante ut6pico suponer que se conoce la composicion quimica exacta de todos y cada uno de los componentes de una planta. No obstante gracias a recientes estudios exhaustivos se ha lograde determinar la composicién quimica de muchos de cliee 12.2 Ambito de aplicacién y caracteristicas de las plantas medicinales . Seglin la EMEA (agencia europea del medicamento) cuando se habla de plantas medicinales se refiere a: * Planta medicinal propiamente dicha (materia prima) * Preparados a base de plantas medicinales, como son extractos, infusiones, ete. * Especislidades farmacéuticas elaboradas con plantas medicinales o con preparados de éstas |" Frecuentemente se desconoce con exactitud qué principios actives (generalmente mas de 20) Son los responsables de la accién terapéutica. En estos casos se elige la determinavion Ge un 'marcador de calidad’, es decir un analito presuntamente estable que est@ presente iante la valoracién de con el mismo grupo funcional (flavonoides, etc.) lo que de selectividad. De esta forma quedan definidas lasPlantas medicinales y extractos Materias primas y especialidades 127 especificaciones de calidad de muchas plantas medicinales, desde el punto de vista de materias primas, en distintas Monografias presentes en Farmacopeas. Los analitos presentes en las plantas medicinales se hallan en el interior de su estructura y 20 de forma aislada como sucede en una mezcla de analitos y excipientes, por lo que deben far extraldos de su interior. La principal dificultad de extraccién del analito no radica en et iento del preparado a base de plantas medicinales, sino en el de la propia materia prima. A causa de esta caracteristica, a menudo deben aplicarse tratamientos de muestra [argos y agresivos, lo que puede provocar pérdidas importantes de analito. Todo ello hace que los porcentajes de recuperacién sean generaimente bajos. En las plantas medicinales no se puede aplicar el concepto de matriz entendido como el conjunto de todos los componentes exceptuando el analilo, ya que es imposible separar el Frere analito (Principio activo 0 marcador) del resto de componentes. Es por ello que el termino matriz se utiliza como sinénimo de muestra representativa Una dificultad adicional en los estudios de validacién de métodos analiticos de plantas medicinales radica en la falta de homogeneidad y representatividad de la muestra Lac de homogeneizacién (ej. estado liquido), continua persistiendo la incertidumbre sobre su Nn quimica es realmente homogénea. 12.3 Particularidades en los estudios de validacién de métodos analiticos de valoracién de analitols en planta medicinal, considerada como materia prime a) SELECTIVIDAD La determinacién de Ia selectividad en métodos analiti farea complicada por varios motivos: icos de plantas medicinales es una * A diferencia de las especialidades farmacéuticas, no se puede Preparar una matriz o placebo sin analito/s. ‘ * En muchos casos no existen patrones de referencia: * Muchos de los métodos descritos en Farmacopeas para el control de calidad de las Plantas medicinales, como materias primas, son poco selectivos y se limitan a valorar el Contenido en un conjunto de sustancias quimicas:con un grupo funcional delerminade, Ademés, los métodos analiticos a aplicar para el control de calidad de una planta medicinal son de muy diferente naturaleza:128 Materias primas y especialidades Plantas medicinales y extractos 1) Métodos de identificacion. Se utilizan tecnicas macroscépicas, microscépicas, reacciones quimicas, métodos cromatograticos, etc. Dada la importancia que en muchos casos tienen las posibles falsificaciones o adulteraciones, las técnicas selectivas (cromatogratia en capa fina) al igual que las reacciones de identificacion son 1 muy utlizadas. 2) Criterios de pureza microbiolégicos. 3 Criterios de pureza quimicos (sustancias extrafas, Productos de degradacién, Plaguicidas, metales pesados, micotoxinas, humedad, cenizas, elc.) que pueden Tequerir la utiizacion de técnicas sofisticadas como ‘cromatografia de gases en ? presencia de patrones de referencia. 4) Valoracién del contenido de analito/s. Puede analizarse el contenido de un analito marcador, de un analito-principio activo o bien de un grupo de sustancias con un mismo grupo funcional presente en ia planta. Las ICH para plantas medicinales indican que Ia aplicacion de un método cuantitativo poco selectivo (espectrofotometria UV. visible o colorimetria) debe ser complementado con un método de identificacion mas selectivo (ejemplo: cramatografia de capa fina o andlisis cromatografico con detector Selectivo, como por ejemplo un HPLC con detector DAD o acoplado a un masas, etc), Por todas estas razones, la selectividad del método analitico a aplicar en cada caso no es Siempre la idénea, lo que hace que este parémetro deba ser estudiado de acuerdo con un ccriterio racional, b) LINEALIDAD Y RANGO Para el estudio de este parametro en el andlisis de plantas medicinales es fundamental: * Conocimients (seleccién) de analito 0 conjunto de analitos con el mismo grupo funcional @ valorar, al igual que las especificaciones de contenido en la propia planta + Representatividad y homogeneidad de la muestra * Posibles interferencias segun el método analitico a aplicar y analito/s a valorar * Zxistencia ‘en el mercado comercial de material o patron de referencia a utilizar, homogeneidad en el proceso de extraccién y similitud de interferencias con la matriz enalizar El estudio de ta linealidad y de! rango puede efectuarse con diferentes sustratos de acuerdo con el siguiente orden de preferencias: + En métodos poco selectivos: 1) Material de referencia certificado: matriz con una concentracién conocida de analito, 2) La propia planta: mediante 1a preparacién de distintas diluciones, de forma que no se eliminen las posibles interferencias inherentes a la propia matriz, 3) Extracto de la propia planta: suele ser el menos adecuado de los tres debido a que la Preparacién de un extracto conlleva la modificacién de la matriz. + En métodos selectivos se utiliza patrén de referencia quimicamente puro. Para el estudio de la linealidad y del intervalo de trabajo, se preparara un blanco y distintas Soluciones cuya concentracién vendra determinada por la concentracion esperada de analitoFn createdog re aq nattiz Sobre Ia que se aplica el método a validar. Se aplicaran a los resultados de los andlisis los correspondientes calculos estadisticos. las medicinales y extractos ‘Materias primas y especialidades 129 ©) PRECISION ¢ brecisian de los métodos analiticos de plantas medicinales y sus preparados se entiende cer gcPelibilidad del método, expresado matematicamente como el coeficiente. de variacién, Para ello. siendo imprescindible la utiizacién de una muestra homogenea, se recomienda (ealizar todo el estudio con una muestra unica previamente homogeneizada. De no ser Liaimente posible, los limites de aceptacion del coeficiente de variacion deben cor superiores @ los considerados como aceptables para los métodos de analisis de matenas Primas quimicamente puras ode sus mezcias. 4) EXACTITUD El estudio de la exactitud de los métodos analiticos de plantas medicinales y Sus preparados se determina evaluando el porcentaje de recuperacién de analil, realizandose meccrcc el glade de “adicion de patron" (0 muestra) o bien por comparacion de resultados con los e) LIMITE DE GETECCION Y DE CUANTIFICACION En andlisis de impurezas 0 de trazas de analito en plantas Medicinales, la mayor dificultad Para la determinacién de estos limites es la elevada presencia de interferencias, pot lo que f) ESTABILIDAD DE LA MUESTRA Como ya se ha indicado con anterioridad, siendo las plantas medicinales: productos naturales 0 biolégicos ‘de composicién variable y no totalmente conocida, es practicamenteivy Matenas prmas y especialidades Plantas medicinales y extractos iaposible prever la estabilidad de una muestra Ya que se desconocen las posibles tratormen cette 108 multiples componentes de to misma antes y después de los ratamientos analiticos (reacciones quimicae entre distintos componentes, procesos de oxidacién por luz o temperatura, ete.) 12.4 Revalidacién A’ igual que en el resto de materias primas Y especialidades farmacéuticas, como ya se ha indicado en el correspondiente capitulo, se aconseja tener definido un protocolo de revalidacién para cada una de las distintag \atlaciones que se puedan producir (como por Glemplo cambios de matriz). Este parametro es muy importante debido a la existencia de tina gran variedad de géneros y especies de plantas medicinales. 12.5 Conclusiones y comentarios felisticadas y de bajo costo, como puedo vo la cromatografia de capa fina y la Espectrofotometria UV-visible, tal y como ehcontramos en la mayoria de las Monografias de plantas medicinales presentes en las diferentes Farmacopeas.la ‘Materias primas y especialidades 131 ia BIBLIOGRAFIA + AOAC Peer-Verified Method Program "Manual on policies and procedures" Arlington, Va. USA, November 1993. British Pharmacopoeia 1999. Brittain H.G., “Validation of Analytical Methodology”, J. Val. Tech., 3 (3), 275-280, 1997. Camacho M.A., Torres A.|., Gil M.E., Obregon M.M., and Ruz V. “Validation protocol of analitycal methods for finished pharmaceutical products." S.T.P. 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CEPAS CONTROL, MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES.. . seseaennntn 149 23.1 Preparados por un laboratorio externo fabricante de medios de cultivo, 149 2.3.2 | Preparados en el laboratorio a partir de medios deshidratados... 149 2.3.2.1 Medio sdlido 0 liquido. Comprobacion de las propiedades nutritivas.. 149 2.3.22 | Medio sdlido o liquido. Comprobacion propiedades selectivas ..... 150 2.3.3, Fichas de medios de cultivo y diluyentes 3 150 24° Diluyentes: ; _ 150 24.1 Utiizacién de un diluyente no recomendado por Farmacopea 151 2.4.2 Microorganismos de ensayo y diluyente estandar 24.3. Material 7 2.4.4 Procedimien 2.4.5 Resultados ... . — 2.4.5.1 Tratamiento estadistico de los resultados 24.6 Adicién de neutralizante - USP 24 3.__ ESTERILIDAD... 3.4 Introduccion : 3.2 Ensayo de validacién 3.3 Interpretacion y comentarios, 4. ENDOTOXINAS BACTERIANAS 4.1 Introduccién 4.2 Armonizacion 43° Generalidades........... sessees 4.4 Método gel punto final (GEL-CLOT). 4.4.1 Reactivos y material, 44.2 Requisitos previos 4.4.3 Control de pH .. 3 : — 158 4.4.4. Estandarizacion de la CSE frente a la PBR (Endotoxina) 458 4.4.8. Confirmacién de ta sensibilidad del lisado 159, 4.4.6. Factores de interferencia ... 161 4.4.7 . Desarrollo de la Validacién del Ensayo del LAL.45 45.1 Objetivo... E 48.2 Material y equipamiento. 45.3 Procedimiento......... 5.2.1 Introduccie: 5.2.2 Métodos.. 5.23 Numero de réplicas. 524 Material... : 52.5 Microorganisms de ensayo 5.2.6 Preparacion det indcul 5.2.7 Procedimiento....... 5.2.8 Validez del ensayo. 53 5.3.1 Introduccién...... 5.3.2. Numero de réplicas 5.3.3 Material... 5.3.4 Microorganismos de ensayo, 5.3.5 Preparacién del inéculo. 5.3.6 Procedimiento. 5.3.6.1 Determinacién cualitativa 5.3.6.2 Determinacién cuantitativa . 5.3.7 | Validez del engayo........ 5.3.7.1 Determinacién cualitativa . 5.3.7.2 Determinacién cuantitativa -__VALORACION Mic! 7.1 Introduccién 7.2 Generalidades. 7.3 Métodos...... 7.4 — Factores.deter 7.8 _ Validacion 7.5.1 Linealid 7.5.2. Repetibilidad (Pre 753° Exactitud 4.4.8 Guia de Validacién det GRADO DE CONTAMINACION MICROBIANA, 5.1.1 Exactitud y Precision, ensayo en gel 44.8.1 Consideraciones tedricas ..... 4.4.8.2 Ensayo del producto... 448.3 Periodicidad de la validacion Método turbidimétrico... 4.5.3.1 Validacién de ia curva estands 45.3.2 Factores de interferencia, 4.5.3.3 Preparacién a examinar Recuperacion microbiana Ensayo de deteccion de A... 5.2.7.1 Para’ productos que no requieren filtracion., 5.2.7.2 Para productos que requieren fitracion . 5.2.7.3 Deteccién de Salmonella sp. 8.2.7.4 Deteccion de Ecol : 5.2.7.5 Deteccién de S.aureus... 5.2.7.6 Deteccién de P.aeruginosa, Ensayo de determinacién cualitativa y cuantitaliva de enterobacterias.75.4 Selectividad 7.6 — Ensayo del producto...... 7.7 Periodicidad de la validacion 7.8 EjempioIntroduccién Microbiologia 141 1. INTRODUCCION La validacion de los métodos de control microbiolégico persigue los mismos objetivos que la yalidacion quimica y, en este sentido, existe un paralelismo evidente, Et trabajo en Microbiologia, sin embargo, tiene unas peculiaridades que es necesario destacar res conceptos de organizacién y garantia de calidad aplicables a un laboratorio ‘oblolégico no differen conceptualmente de los aplicables en ottos laboratorios. Existon filracién. equipos para identificacion de microorganisms, cabinas de seguridad, etc.), y ‘eactivos y materiales (medios de cultivo, diluyentes, cepas control, fitros, etc ). propios del ena microbiolbgico que requieren, igualmente, la aplicacion de los prineipiog de ine Bie En Microbiologia, mas que Quimica, es necesario estandarizar cuidadosamente todos los, {clores que intervienen en las tareas a realizar (tiempos, ciclos de esteriizacion, numew oo Subcultivos de microbios, formacién y cualificacién del personal, etc.) ya que al trabajar con microorganismos la variabilidad es mucho mayor. tgualmente se deben evaluar cuidadosamente los criterios de repeticién de un ensayo Cuando un primer analisis ha sido incorrecto ya que: * fos ianalisis microbiolégicos necesitan mas tiempo que los quimicos para tener resultados. repeticion del ensayo con una segunda muestra al cabo de 15 dias o 1 mes del ensayo inicial, puede conducira resultados diferentes. * Existen controles microbiolégicos (esterilidad) para los cuales la Tepeticion sélo es posible si se demuestra claramente que el laboratorio ha cometide on error: (falso ositivo). En resumen, la obtencién de resultados seguros y fables, depende en gran medida de la correcta aplicacién de las BPL en el ambito microbiolégico. 2 puesta en marcha de un procedimiento de andlisis, ya sea quimico © microbiolégico, consta de tres etapas sucesivas y bien definidas: fase de desarrolla ¥ prevalidacién, fase de validacién y fase de aplicacién de rutina. ta primera fase debe tener en cuenta una serie de consideraciones de tipo metodologico y bractico: * Instrumentacién a utilizar. + Microorganismos: sensibilidad, rango de recuperacién, inéculos, estabilidad, + Tiempo (periodo de incubacién, tiempo de analista requerido), * Coste. *) Seguridad e implicaciones medioambientales. + Robustez del método. EI conocimiento de este parametro ayudaré a ajustar y mantener bajo control los parémetros de las variables o factores de Mayor influencia (pH, femperaturas, concentracién de indculos, etc.)142 Microbiologia Introduccion <1225 >) indica que cuando se usan ¢ abe validar la exactitud ri ta precision pero si verifcar co (USP 24 <1227>) hace referencia a las la deteccién de microorganismos eticacia de conservadores y del ensayo de esteriinicg En Microbiologia los parametros de validacién clave son la exactitud y la precisién, La exactitud en el caso de validaciones de antibidticos es similar al concepto quimico: Soncordancia entre la concentracion. de analito hallado y el valor verdadero; en el caso de otfos ensayos microbiolégicos se definira como Porcentaje de recuperacion frente al valor de! indculo. Si existen errores determinados, que afecton s Is exactitud, deben eliminarse a través de disefios idéneos. La precisién es la medida de error indeterminado del Método, siendo los conceptos de weneien G2 Precision intermedia y reproducibildad, equivalents © los utilizados en guimica. Debido a la mayor variabilidad de los sistemes ata ‘biolégicos, los limites aplicables a la exactitud y precision son muchos mas amplion igualmente si la formulacién de producto acabado presents Propiedades bacteriostaticas 0 ungistéticas y, en caso afirmativo, buscar la manera de anuleriog £3 linealidad se debé determinar en el caso de valoraciones de antibiéticos y requiere ta utllzacion de logaritmos de las concentraciones para obtener regresiones lineales, Los limites de deteccién y cuantificacién estan implicitos y no precisan por lo general de una determinacion especial, Esta parte de la monografia, dedicada a métodos microbiolégicos, se inicia con un capitulo de introduccién que comenta los temas de BPL especificos ce Microbiologia (cepas control, reeeensiones normalizadas, medios de cultivos, diluyentes), asi como algunos aspectos relacionados con su validacién, inuacién, siguen una serie de capitulos que Tecopilan sistematicamente los 7108 2 utilizar para validar los ensayos de esterilidad, grado de contaminacién Imicrobiana, Test LAL, eficacia de conservadores y valoracién de antiteaeesI NS Cepas control, medios de cultivo y diluyentes Microbiologia 143 2, CEPAS CONTROL, MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES 24° Cepas contro! Las farmacopeas aconsejan para los distintos ensayos, unas cepas determinadas que se enumeran a continuacion: ‘USP 24 Farmacopea Europea 3° edicién Staphylococcus aureus ATCC 6538 ' Staphylococcus aureus ATCC 6538 6 aTec! 6538P Z j Escherichia coli ATCC 8739 Escherichia coli ATCC 8739 | [Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 | Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 | Salmonella. sp. “| Saimonelfa abony NCTC 6017 Bacillus subtilis ATCC 6633 | Bacillus subtilis ATCC 6633 (suspension de | esporas) Clostridium sporogenes ATCC11437 ___| Clostridium sporogenes ATCG 19aoa | Micrococcus luteus ATCC 9341 | Bacteroides vulgatus ATCC8482 (Candida albicans ATCC 10231 ‘Candida albicans ATGC 2091 6 ATCC 10231 Aspergillus niger ATCC 16404 Aspergillus niger ATCC 16404 Clostriaium perfringens ATCC. 13124 | Zygosaccharomyces rouxii NCYC 381 » Las cepas de microorganismos debs estabilidad bioquimica que minimice El crecimiento y la prepa células, el cual tiene influen Gok ensavos microbiolégicos no utiizan células indviduales sino poblaciones de células. Los ates ganerados en estos ensayos son moned variables al las poblacones sointoe, coe homogéneas.144 Microbiologia Cepas control. medios de cultvo y diuyentes Segun se indica en Farmacopea Europea y en USP el cultivo de un ‘microorganismo que se Subeuteee come inéculo en una validacién debe proceder de una cepa due na, haya sido Subcultivada mas de 5 veces desde la cepa de referencia original. Un subcultivo se define desc igroorganismos que se conservan congelados cada ciclo ae congelacién, descongelacion y revivificacion se considera un subcultive 2.4.2. Cultivos de origen Se Entiende como tales, los descritos en Farmacopeas y que Proceden de colecciones auugatzadas como American Type Culture Collection (ATCC), Coleccion Espafiola de Fiscae oy cn forma de asas en cuyo extremo hay el cultivo lisfiizado, otfos en forna de discos y otros en ampollas con el microorganism lifilzado en su intron nes del proveedor para su recuperacién (medio de Trantenimiento, temperatura y atmésfera de incubacién). Para comprobar la pureza de la $#P8, °° aconsejable sembrar por agotamiento a partir de este cultivo original Es conveniente ideintiicar las colonias de este aislamiento mediante tinciones y pruebas bioguimicas. 2.4.3 Conservacién y archivo El método que describimos a continuacién consta de dos partes, una de ellas es el Mantenimiento de microorganismos de trabajo y la otra la conservacion de lac cepas L2 Conservacién se puede efectuar por congelacion o por lioflizacién, El método de fofiizacién consiste en inocular el microorganismo en un medio erioprotector, hecer ucg Congelacion rapida con nitrégeno liquido y después pasarlo al lioflizador, Be explica el metodo por congelacién por ser el mas asequible para un laboratorio de control bioldgico. 2.1.3.1 Congelacién de microorganismos 2.4.3.1.1 Medios de congela in Para la congelacién se utilizan medios crioprotectores, como por ejemplo: * Caldo de TSB mas un 10- 15% de glicerol, * Caldo infusion corazén-cerebro mas un 10-15% de glicerol. * Medio selectivo adecuado mas un 10-15% de glicerol.Cepas control, medios de cultivo y diluyentes Microbiologia 145 Se pueden preparar en el laboratorio, repartiéndolos en viales con 2-4 ml y esterilizandolos en autoclave a 121°C, 20 minutos. Adualmente en el mercado existen viales con medio crioprotector y unas bolitas de material Inerie Que actiian como soporte de los microorganismos. Estos viales se inoculcn a partir de colonias aisladas en medio sdlido. 24.3.1.2 Método Se toman cuatro 0 cinco colonias (0 mas segin el tamarto) del aislamiento y Se suspenden Secs“ 108 caldos erioprotectores. Se dejan en incubacion durante 24 hore entre 30 y 35°C © en las condiciones mas idéneas para el crecimiento del microorganismo y Posteriormente se congelan entre -15 y -50°C Se preparan suficientes viales para disponer de una fuente de cepas patron durante el ‘empo en que se compruebe la viabilidad del microorganismo o coms marirne ve affo. ynunca recongelarse. También puede resembrarse en medio liquido 0 sdlido “rascando” parte del congelado y devolviendo el vial al congelador. El ultivo obtenido por uno de estos procedimientos sera el Cultivo primario de trabajo. 24.3.1.3 Cultivos de trabajo A partir del cultivo primario puecen realizarse cuatro subcultivos de trabajo y de éstos {ealzar dos o tres siembras, seguin las necesidades. Aumontey oF numero de resiembras deeds ua Cl riesgo de alteracién fenotipica. Se recomienda no recline, mas de 5 pases desde la cepa original. Para obtener un subcultivo de trabajo, se siembra sobre medio inclinado o placa a partir del cultvo primario, Se incuba en las condiciones que Fequiera el microorganismo hasta obtener el crecimiento adecuado. los subcultivos pueden conservarse a temperatura ambiente durante 4 semanas, si bien es Preferible mantenerlos en nevera a 2-8°C. 24.4 Validacién del archivo de microorganismos méroorganismos que el laboratorio utilice para sus controles internos146 Microbiologia Copas control, medios de cuttivo y diuyentes 2.4.5 Confirmacién de la pureza e identidad de un cultivo Elemplo: PREPARACION DE UNA SUSPENSION ESTANDARIZADA Se Gescribe la preparacién de una suspension de Staphylococcus aureus en agua de peptona 0.1%. 1-Material necesario EI propio de un laboratorio de microbiologia 2-Suspensiones Se han preparado 10 suspensiones de S.aureus en agua de peptona 0.1%. Una vez diluidas se han ajustado al 70% de transmisién en espectrofotémetro regulado a una longitud de onda de 580 nm. Posteriormente se han diluido estas ‘Suspensiones y se ha efectuado un recuento de las células viables presontes,a Cepas control, medios de cultivo y diluyentes Microbiologia 147 3- Resultados de los recuentos |_ Suspension n°iplaca_| Resultados (UFG/mh dilucion 10° ; t wt 136 112 i 145 i media 187,45 desviacién st. 23,84 Coeficiente Variacion 12,72 El resultado final sera pues que la suspensién contiene aproximadamente (1.87 + 0.24) * 10° UFC/mi. 4- Conelusién ga Suspension de S. aureus en agua de peptona 0.1% dl 70% de transmision a 580 nm contiene aproximadamente 2°10° UFC/mi, El ensayo se considera valido con una precision del 12.7%.148 Microbiologia Cepas control, medios de cuttivo y diluyentes Elemplo: PREPARACION DE UNA SUSPENSION DE ESPORAS Se describe fa preparacién de una suspension de esporas de Bacillus subtilis, 1-Material necesario El propio de un laboratorio de microbiologia 2-Cuttivo de partie Se recoge el crecimiento del cultive de trabajo con 2 mi de agua estéril, Esta Suspension se inocula en el fr Teno Se, Roux de forma que se distribuya por toda ta superficie del agar. Se incuba a 35°C durante 7 dias para obtener una buena esporulacion, 3-Preparacién de la suspension el numero de esporas que inte es de unas 10° ufciml). Se le S-Registro de la preparacién de la suspensién La Preparacién de la suspension se anota en la libreta de laboratorio i Tacannige ante. La informacion que debe contener el registio Para no perder trazabilidad es la siguiente: Bacillus subtilis ATCC 6633 Codigo identificativo de la cepa Fecha de la resiembra en el frasco de Roux a partir del cultvo de trabajo Fecha de la preparacién de la suspension Nimero de preparacién o lote del agar triptona soja, agar triptona soja con sulfato de manganeso y de la solucion de peptona y elorure ode Analista que prepara la suspension Recuento de microorganismos en el moment Recuento de mi to de la preparacién de la suspension lcroorganismos al cabo de tres mesesCepas control, medios de cultivo y diluyentes Microbiologia 149 2.3. Medios de cultivo Antes de afrontar una validacién de un método microbiolégico se debe tener la seguridad de ue los medios de cultivo que se van a utilizar tienen una calidad adecuada. Esta calidad viene definida por sus propiedades nutritivas y selectivas. En consecuencia se debe establecer un programa de control de los medios de cultivo. ‘Se pueden obtener de medios de cultivo de dos:maneras 2.3.1. Preparados por un laboratorio externo fabricante de medios de cultivo Se exigira un certiticado de andlisis de cada lote de medio (se entiende por lote los medios preparados en las mismas condiciones y esteriizados en una misma carga de autoclave) donde consten los resultados obtenidos en los ensayos de esterilidad y de las propiedades nutritivas y selectivas, asi como breve descripcién del método de control (inéculo, cepas etc.) y la fecha de caducidad. Es aconsejable que los controles se realicen como minimo con las cepas de microorganismos que se especifican en las Farmacopeas, (vease apartado de Cepas control). Ademas es recomendable efectuar controles periddicos en el momento de la recepcidn en el laboratorio para comprobar la calidad de los medios. Se realizaran controles visuales (aspecto, color), controles de esterilidad y controles de crecimientolinhibicion similares a los que se describen para los medios ‘preparados a partir de medios deshidratados. 2.3.2 Preparados en el laboratorio a partir de medios deshidratados tos medios se preparan seguin las indicaciones del fabricante utilizando agua purificada {como minimo de la calidad Farmacopea Europea). En este caso se exigira el cerlificado analltico:de cada lote de medio deshidratado. Ademés, el laboratorio debera efectuar ensayos que demuestren la esterilidad y las propiedades nutritivas y selectivas de los medios de cultivo preparados a partir de medios deshidratados, Para los medios nutritivos generales sé utilizaran las cepas que se indican en la Farmacopea (véase apartado cepas control). Para los medios selectivos se utllzaran micfoorganismos que presenten buen crecimiento y otros cuyo crecimiento esté inhibido en misma carga de autoclave). Es aconsejable también asignar a los medios Preparados en el laboratorio una fecha de caducidad. Esta fecha dependera del medio de que se trate y las condiciones de conservaci6n. ; 2.3.2.1 Medio sélido o liquido. Comprobacién de las propiedades nutritivas Para comprobar las propiedades nutritivas se preparan suspensiones de microorganismos vreanade naan aproximadamente 10° ufciml. Se inocula con 1 mide suspension y por Separado una placa de agar (en profundidad o en superficie) 0 un tubo ifrasco de medio. oe suelen utilizar Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus para medios de recuerlo total y Candida albicans para medio de recuento de hongos. Se incuban en las condicenes adecuadas para el microorganismo y se comprueba la presericia de crecimiento.150 Microbiologia ‘Cepas control, medios de cuttvo y diuyentes microorganismo inoculado, Se debe mantener un registro de Preparacién de medios de cutive asi como de todos los controles efectuados., 2.3.3 Fichas de medios de cultive y diluyentes Proveedores, qu hivaran conjuntamente con las fichas y’podran ser consultados frente a cualquier anomalia observada. Se archivarén también los certificados de analisis emitidos por el proveedor de los medios Preparados 0 deshidratados, 24 Diluyentes Ga funcion de un diluyente es dispersar 0 diluir 2! Producto a examinar. Las farmacopeas Ofiiales recomiendan varios diluyentes, los cuales estan ya validados en el sentido de que 1 Interfieren en ta viabilidad de microorganismoc USP 24 [Farmacopea Europea 3* edicion ; Solucion peptonada con tampon de fostatos y | cloruro sédico pH 7.0 | Solucién peptonada con tampén do Tostatos, Cloruro sédico y polisorbato 80 (0.1%, 12%) pHi 7.0 Caldo lactosado | Caldo lactosado Solucion tampon de fostatos pH 7.2 | [raldo con peptonas de caseina y soja, Lecitina (0.5%) y polisorbato 20 (4.00%) Existen productos que por sus dace cristicas precisan para su disolucién o dilucién lluyentes “que no estan recomendados en lac farmacopeas oficiales. En este caso, antes e validar el método de andlisis, debe realizarse ie validacién del diluyenteLL Cepas contro, medios de cutv y diyyentes Microbiologia. 151 Como ejemplo de diluyentes que deben ser validados podemos citar: iluyente de Berens Caldo Letheen Solucién salina isoténica Soluci6n de Ringer La adicién de inactivadores especificos a un diluyente de la farmacopea 244 Utllizacién de un diluyente no recomendado por Farmacopea 24.2 Microorganismos de ensayo y diluyente estandar Los microorganismos recomendados por la Farmacopea Europea 3* se describen en las cepas control. Como diluyente estandar se toma uno de los recomendados en las farmacopeas y se utiliza en paralelo con el diluyente a validar. 2.4.3, Material * Tubos con 10 mi de un diluyente estandar * Tubos con 10 mi del diluyente a validar * Resto de material propio de un laboratorio de Microbiologia 2.4.4 Procedimiento diluyente ‘se realiza comparando la recuperacién de @ validar en relacién con la del diluyente estandar. Se preparan suspensiones estandarizadas de los. microorganismos, por separado, tal y Samo Se describe en el apartado cepas patron. Se realizan diluciones, en paralelo, con el diluyente a validar y el estandar hasta obtener una concentracién celular aproximada de 100 UFCimI, Se efectia un recuento en placa de la illima dilucion de los dos diluyentes, utilizando como medio de soporte de crecimiento para bacterias TSA, incubando a 30-35°C, y para hongos ¥ levaduras agar de Sabouraud con cloranfenicol, incubande 2 20-25°C. Se siembran 10 Placas por diluyente y microorganismo.152 Microbiologia Cepas control. medios de cutive y diluyentes 2.4.5 Resultados Eiemplo: Tene™os un diluyente A de Farmacopea y uno B que es el que vamos a validar, En primer lugar hacemos un ensayo de recuperacion con un determinado Microorganismo. - . Con los resultados obtenidos aplicamos un test de t-Student Datos (CFU/m)) DituyenteA | DiluyenteB |Cepas control. medios de cuttivo y diluyentes Microbiologia 153 Resolucion: En primer lugar veamos si se puede considerar que hay iqualdad de variancias: 2.66 => Fo,05,9,9 = 3.1789 Luego podemos trabajar con la hipétesis de igualdad de variancias. Al ser las variancias homogéneas, se calcula la desviacién estandar combinada de las dos muestras mediante la formula siguiente (aplicable si n,=ny): Realizamos el contraste de hipotesis de las medias de los contajes. = media de la poblacion ¥=media de la muestra =0.26=919.95/9, 1g na np V0 10 Luego puede afirmarse que el uso de un diluyente u otro no afecta a la pcuberacién de los microorganismos (P es muy superior 0.05: el valor exacto de P calculado con un software estadistico es de 0.3989), 2.4.6 Adicién de neutralizante - USP 24 Seguin USP 24 el procedimiento para la validacion de un diluyente al cual se ha afiadido un neutralizante especifico de las propiedades antimicrobianas del producto debe demostrar al ‘mismo tlempo la eficacia y la toxicidad de dicho neutralizante sin impedit la Tecuperacion deTo setcrODIgis Cepas control, medios de cutivo y diluyentes las cepas control. Para ello propone comparar la fecuperacién microbiana en los casos siguientes: 2) Diluyente estandar + indculo 5) Diluyente + neutralizante + indculo ©) Dituyente + neutralizante + producto + inéculo Elnumero de réplicas es de 3 para cada ensayo a), b yo) El promedio de UFC recuperadas a partir del producto testado c) no debe ser inferior al 70% Tespecto al recuperado a partir del inécuilo control b) inte una t de Student si se comparan pares de resultados, 0 bien mediante un analisls ao 'a variancia (ANOVA) si se gnc wan rupos de resultados. En este iltimo caso. si exisien diferencias significativas intre los distintos grupos, se aplicara el test de Dunnett utilizando a) como control.Esteriidad Microbiologia 155 3. ESTERILIDAD 3.4 Introduccion la referencia para el ensayo de esterilidad y su validacion es Farmacopea Europea ‘suplemento 2000 y no hay cambios en el suplemento 2001 La Validacion se efectua: 1) Cuando se aplica el ensayo de esterilidad a un nuévo producto o cuando hay un cambio significativo en la formulacién de un producto, 2) Cada vez que se realiza una modificacién en las condiciones experimentales del ensayo. La validacion puede desarrollarse simultaneamente con el ensayo de esterilidad de rutina, Pero los resultados estarén condicionados a los obtenidos en la validacion. Asi en la validacion del ensayo de esterilidad del producto, se debe obtener un crecimiento comparable al del control en maximo 3 dias para las bacterias y maximo de 5 dias para los hongos. Si los resultados no son comparables el producto,posee propiedades antimicrobianas que deben eliminarse, por lo que las condiciones en las que se ha efectuado el ensayo de esterilidad deben modificarse. En la tabla siguiente se resumen los microorganismos adecuados para utilizar en el ensayo de crecimiento (propiedades nutritivas de los medios de cultivo) y en el ensayo de Validacién. Tabla 1. Microorganismos utilizados en la Validacién del ensayo de esterilidad. | Microorganismo. T Incubacién Medio Especie i Cepa ‘Temp °C_' Duracién CaldoTiogiicolate Bacterias aerobias | ] : S. aureus _ ATCC 6538 | |B subtilis (*) + | ATCC 6633 | 92.5425 | 3dias | P. aeruginosa Atcc 9027 | Caldo con peptona de |Bacterias anaerobias | | caseina y de soja |.C. sporogenes _ ATCC 19404 | 325+25. 3dias THongos: | t 'C albicans ATCC 10231 22.5425 Sdias A. niger ATCC 16406 | B.sublilis(*)-crece en TSB 3.2. Ensayo de validacién Para cada uno de los microorganismos especificados en la tabla, realizar un ensayo de eer eas como se indica en Farmacopea, utilzando el método habitual, con las siguientes modificaciones: + Filtracion a través de méinbrana156 Microbiologia Esterlidad Después de fitrar a través de membrana los contenidos del envase o envases a ensayar, se ereeenen, des. de ls lavados que indica la Farmacopea y en la tercera fraction del lifes de ‘avado se aftade un inéculo de 10 a 100 UFC de uno de los microorganismes. de ensayo. +, Inoculacién directa espués de transfert los contenidos del envase o envases a ensayar aun medio de cutvo, 88 affade Un indculo de 10 a 100 UFC de microorganismos viables : i Go ambos casos_fitracion membrana e inoculacion directa) se realiza en paralelo un control se crmramiento (con ausencia de producto) como control positive. Se incuba segun tas especificaciones de la tabla, Si espués de la incubacién no se obtiene un crecimiento rapido, el producto posee actividad antimicrobiana que no ha sido eliminada, por lo tanto se han de modificar lec condiciones de! ensayo, Los métodos de eliminacién de propiedades antimicrobianas pueden ser: 1) Neutralizacién quimica. 2) Neutralizacién por dilucién. 3) Eliminacién de las propiedades de inhibicion, 3.3 Interpretacién y comentat La interpretacién del ensayo de esterilidad de un producto que tenga propiedades antimicrobianas y un producto que no las tenga, debe ser distinta, por lo que el diseno del protocolo varia, Si un producto no tiene propiedades antimicrobianas, es légico efectuar la validacién del ensayo una vez (un ensayo, una réplica de cada microorganismo, no es necesar‘o ampliar el numero de muestras para obtener mas informacién, es un resultado cualitatio del todo o nada) S| el Producto posee propiedades antimicrobianas, cuestiona tnicamente la resistencia que puedan presentar los cultivos al manipular la muestra para neutralizarla y por consiguiente una evaluacién de crecimiento diferente. Aqui si que estamos afadiendo una variable mas seidesde homogeneidad o no de la muestra, tras su pretratamiento pare el ensayo de validacion y esto nos obliga a ampliar el nimero de ensayos. La validacion en este caso se deberia efectuar con tres lotes de producto, En funcién de los resultados’ de los distintos microorganismos también tendremos que ampliar el nimero de réplicas de los microorganismos que presenten resistencias. Una recomendacion importante es que el tiempo trascurrido entre la fecha de fabricacién del lote y la de la realizacién del ensayo de validacién no debe ser superior a tres meses,Endotoxinas bacterianas Microbiologia 157 4, ENDOTOXINAS BACTERIANAS 44 Introduccion El ensayo se fundamenta en la capacidad de las endotoxinas de origen bacteriano de coagular una proteina procedente de un lisado de amebocitos del cangrejo Limulus poliphemus (LAL). La adicién de una solucion conteniendo endotoxinas, a una solucién que contiene el lisado, produce turbidez, precipitacién o gelificacion de la mezcla. La reaccion fequiere la presencia de ciertos cationes divalentes, de un sistema enzimatico precoagulante ye una proteina coagulable que es proporcionada por el lisado. 42> Armonizacién El ICH (International Conference on Harmonization), ha confiado a la Farmacopea Japonesa, la direccién de la armonizaci6n del test de las endotoxinas bacterianas. Este texto sera el documento LAL mas importante desde la publicacién del “ Guideline” FDA, (1992), dela quia SFSTP (1994) y del texto 2.6.14 de la Farmacopea Europea de 1998. El texto definitive ha salido publicado en el Suplemento 2001 de Farmacopea Europea, apartado 2.6.14, 43 Generalidades Hasta la fecha se han descrito 6 métodos: a) Gel punto final b) Gel punto final semicuantitativo ©) Turbidimetria cinética 4) Colorimetria cinética e) Colorimetria punto final f) Turbidimetria punto final El ensayo puede ser realizado por uno de los seis métodos. Sin embargo el método a) es el de referencia, salvo indicacién contraria de la monografia. 4.4 Método gel punto final (GEL-CLOT) El ensayo limite de gelificacién de endotoxinas bacterianas es el métoda dé analisis de la Farmacopea Europea mas ampliamente utilizado para la deteccién de endotoxinas. Se ensaya igual volumen de producto- muestra y de lisado (100 1!) en tubos de 'vidrio apirogeno de 10x75 mm. La muestra se incuba en bafio Seco 0 en bafio de agua sin agitacién a 37°C. durante una hora, al final de la cual se invierte el tubo 180°. Si se ha formado un gel sdlido ue no cae‘al invertir el tubo, el resultado se considera positivo, si por el contrario se desliza 0 esta liquido, el resultado se considera negativo.158 Microvwoiogia Endotoxinas bacterianas 4.4.1 Reactivos y material * Endotoxina Standard PBR (Patron biolégico de Referencia): calibrada en unidades intermacionates, * _Lisado: a confirmar la sensibilidad, * Agua calidad LAL. Todos los materiales requeridos para el ensayo del LAL, deben estar cualificados para el Glade gai. tubos. pipetas, puntas, reactivos: agua para la reconstituclon del lisado, qitcign de muestra y nivel de sensibilidad escogida: endotoxina ectarcer PBR, lisado, acido Clorhidrico 0.1 M, Hidréxido sédico 0.1M, 4.4.2 Requisitos previos * El equipo usado no adsorbe endotoxina + La sensibilidad del lisado + Ausencia de factores de interferencia 44.3 Control de pH payfeaccion LAL, por ser una reaccién enzimética requiere unas condiciones de PH entre £.0-8.0 Si @ necesario, ajustar el pH, se recomienda Acido Clorhidrice 0 1 M, Hidréxido s6dico 0.1M. 444° Estandarizacién de la CSE frente a la PBR (Endotoxina) . La endotoxina patrén PBR se usa como la preparacién de referencia. Se ha calibrado frente A patten Internacional de Endotoxina de la OMS y su potencia se expresa en Unidede, Internacionales de endotoxina por milli, NOTA: Una unidad interacional (U1) de endotoxina es igual a una Endotoxin Unit (Eu). £2t2 tutina se puede utilizar otra preparacion de endotoxina (Endotoxina Control estandar- GSE), siempre que se haya calibrado frente al patrén intemacional de endotoxins o a eoes y Su potencia se exprese en Unidades Internacionales de endotoxina, La estandarizacién consiste en contrastar la endotoxina standard de control (CSE), frente a a de referencia (PBR). Para ello, se efectian una serie de diluciones con las dos endotoxinas a comparar por Separado y cada una de ellas se aflade a un tubo de LAL. Después de incubar se bosons a decane aCiones ha habido gelificacion y se realizan los calculos para saber la activided de CSE,Endotoxinas bacterianas Microbiologia 159 LAL sensibilidad: 0.125 EU/ mi, lote: PBR= EU/mi, lote CSE= Pesoing, lote: . Concentracién PBR (EU/ml) Concentracion CSE (ngimi) Repl 0.50 0.25 0.125 0.06 0.03 , 0.050 0.025 0.0125 0.006 ape se 2 fe ltt Pop or: Se ee Ce ee ee Log 0.125: -0.90 Log 0.0125: -1.90 Repl PBR CSE “i -09. ~~ ~4g9 Se ; 2 -09 19 tet faa 7s 3 -0.9 4.9 Ant e/f (GM) fi 5 aca eg 0.125 0.0125 La potencia de endotoxina CSE es el cociente entre la media geométrica de PBR y la media geométrica de la CSE. La media geométrica es el antilogaritmo de la media de punto final de la gelificacién de cada dilucion de endotoxina. GM: ntilog T elf = logaritmo de la dilucién mas alta que gelifica f= némero de réplica Potencia de CSE= GM PBRIGM CSE= EUing 0.425 EUIm 0.0125 ng/ml Potencia de CSE= GM PBRIGM CSI =10EUing 4.4.5 Confirmacién de la sensibilidad del lisado La confirmacién de la sensibilidad del lisado (A) expresado como EU/ml de cada nuevo lote de reactivo, también sirve para cualificar al personal para la utilizacién de, esta técnica, El LAL, se contrasta frente a un lote de CSE en uso, realizando diluciones de endotoxinas equivalentes a 2A, 2, 0.52, 0.252. Este ensayo, segun las recomendaciones de los fabricantes, se efecttia por cuadruplicado en tubos de 10x75 mm. La mayor dilucién de estandar que da resultado positivo se anota, se calcula su logaritmo y la media de todos los logaritmos que han dado positive e/f. El antilogaritmo de la media geométrica es igual a la Sensibilidad del lisado expresada como EU/mi. Si el resultado no difiere en mas de un factor de 2 de la sensibilidad tedrica, esta queda confirmada,160 Microbiologia Ejemplo: Sensibilidad del lisado CSE: Potencia 10/EUing LAL: 0.125 EU/mi 0.903090 = antilog (-0.903090)= 0.125 Endotoxinas bacterianas Pto. Gelificacion —_ Log (log.)? 125 - 0.903090 0.8156 0.125 " -+0.903090 0.8156 0.125 = 0.903090 0.8156 0.125 = 0.903080 0.8156 0.125 0.8156 ve 3.2624 (Slog)? 13.049 La conversion en logaritmos es para aproximar los valores obtenidos a una curva con distribucién normal Dado que el producto sometido a examen podria interferir en el ensayo, la Sensibilidad del lisado se determina en presencia y en ausencia det Producto emetide @ examen. No debiera haber una diferencia significativa onite foc dos Tuores de Sensibilidad. Un criterio simple es aceptar que la eerelbiidey del lisado an presencia de! producto. no es menos de 0.5 veces yo més del doble de la sensibilidad del lisado. Para la aplicacion del método de gelificacion es necesario demostrar que cumple [08 requerimientos de una regresién lineal: * una pendiente significativa desviaciones no significativas de la regresién lineal Y si ademas es de punto final: “Ia intersecci6n con el eje de abcisas no diferente significativamente de cero EI método general de Analisis Estadisticos y Determinaciones Biolégicas, Proporciona informacion sobre los procedimientos a emplear en estos ensayena EES 5 Endotoxinas bacterianas ‘Microbiologia 161 448 Factores de interferencia Se debe proceder como en la sensibilidad del lisado: preparar diluciones de endotoxina estandar PBR. en muestras (sin endotoxina detectable) y a continuacién medir la fecuperacion de endotoxina, para poder establecer la ‘maxima dilucién valida (MDV), calculada en la expresion: MDV= Concentracién limite endotoxina/ Sensibilidad del lisado (ambos valores en EU de endotoxina / mi), Sila sensibilidad del lisado en presencia de la preparacién no difiere en mas de un factor de {a determinada en ausencia de la preparacién, se concluye que no existen {actoree de interferencia. Si la preparacion actita como inhibidor los factores de interferencia, deben ser eliminados por dilucién, filtracién neutralizacién, dialisis, o adicion de sustancia, Hay que realizar simultaneamente: + producto: cuatro réplicas (x4) * control positivo: dos réplicas (x2) + control negativo: dos réplicas (x2) 44.7 Desarrollo de la Validacién del Ensayo del LAL Las monografias, establecen requisitos relativos a endotoxiinas bacterianas en términos de concentracién limite de endotoxina. Un producto satisface las condiciones si no contiene mas de la concentracién limite de endotoxina, Sin embargo, el cumplimiento de ecto feauisito solo se puede demostrar, poniendo de manifiesto que la concentracion de endotoxina en el producto es menor que la concentracion limite de endotoxin Sea cual sea e! método que se siga, el reactivo 0 endotoxina que se-tilice debe cumplir: 8) Estandarizacién de la Endotoxina Estandar Control (CSE), con la Endotoxina Estandar de referencia (RSE). 7 El ensayo de LAL, mide la actividad de las endotoxinas en EUiml, cuando las Sa oeerinas control se presentan en ng/ml. La estandarizacién ayuda a convertir el peso de CSE en EU/mi. Este paso es especifico para cada combinacién de LALICSE ) Validacién en nuestro Laboratorio: analistas, lisado y materiales, Este paso debe ser desarrollado por cada analista, usando la combinacién: LAL endotoxina. Cada método debe ser validado antes, desarrollando el ensayo del LAL en el producto. Cualquiera que sea la técnica empleada, la validacién consiste en efectuar una curva estandar, ©) Caracterizacién de las muestras (inhibicién, potenciacién). Es esencial que este paso se desarrolle antes de efectuar los andlisis de rutina. La racemat’ on el ensayo de LAL, puede ser inhibido © potenciado por elementos de Ia muestra 0 por condiciones fisico-quimicas: pH, concentraciones idnicas, eto 4d) Analisis de rutina, Si el ensayo se efectia siguiendo los pasos indicados, los resultados seran reproducibles,162 Microbiologia Endotoxinas bacterianas 448 Guia de Validacién del ensayo en gel + Caracterizacién del gel * Validacién del lisado * Cleulo MDV y resolucién de interacciones * Verificacién de rutina sobre tres lotes * Ensayo 44.8.1 Consideraciones tedricas + Estandarizacion * Validacion de la sensibilidad del lisado © Céloulo Mov * Caracterizacién del producto: + Test preliminar de inhibicién (TPI) * Test de inhibicién / activacion. (TIA) 4.4.8.2 Ensayo del producto Se toman al menos tres unidades del lote, que Corresponden al principio, medio y final del lote, Mezclar y ensayar alicuotas por cuadruplicado. Deben controlarse tres lotes de producto (tambien la presencia de sustancias de interferencia) diluyentes, Solucion Control | Conc. endotoxina | Resultado | Expresion Producto | = | | 0.0100 I 0.0108 ! i 00100 ‘| 7.00862 "| 0.00968 | 85 i (0:0100 sees | eer 0.0087 rier] i [ 0,100 0.121 T 0.100 q one ozo | 13 i 0.100 0124 | i 7.00 0.863 | i 1.00 i 0.892 0.897 | 33 1.00 i 0.935 | 0.999 b = -0,27235 a= 2.8023 b) Inhibicion y potenciacién Al tratarse de un producto sélido se ha llevado a cabo una disolucién de 50 mg en 5 mi obteniendo asi una concentracién de 10 mg/ml. A partir de dicha concentracién, se calcula el PFC y la MDV: CLE = 0.015 (Eu/mg) * 10 (mg/ml) = 0.15 (EU/mi) a la insolubilidad del producto, se ha ensayado una dilucién 1/50, la cual permite una buena dispersion del producto asi como una buena recuperacion de la endotoxina anadida. PFC = 0.15 (Eu/ml) / 50 = 0.003 (EU/ml) Por lo tanto, la concentracién de endotoxina de 1a curva patrén que se utilizara en el ensayo debe estar comprendida entre 0.1 y 0.5 EU/ml. Se trabajara con 0.100 eu/mi. MDV = CLE / 2 = 0.15 (Eu/ml) / 0.001 (EU/ml) = 150 Los resultados obtenidos sobre tres lotes distintos y realizados en tres dias distintos son:168 Microbiologia Endotoxinas bacterianas ! Lote Endotoxina Endotoxina Diferencia % Media ; Producto muestra recuperada recuperacion EUimi Evi Euimi No detectada 0.138 0.138 roe) ' 1 _Nodetectada 7 0.129 O19 129 faa No detectada 0.133 0.38 a i No detectada O75 0135185 ' 5 No detectada 0.135 0.135 7 135 | 2 __0.006293 aee0124 9 0.124 2a coe 0.00167 0.125 0123 tas i 0.00125 erase 0.150 eae 05) 133 an No detectada — 0.132 0.432 2 | 3 Reet “oa ago ee detectada 0.129 O19 129 ; No detectada———O.16 : 0.135 iSoune : Conclusiones para la realizacion del ensayo en rutina: La concentracin inicial de trabajo es de 10 mg/m! La concentracién de endotoxina estandar a afiadir es de 0.100 EU/m! La MDV es de 150 La dilucién inicial del producto es 1/50 El % de recuperacién se encuentra entre el 50 — 150 % El coeficiente de correlacion Ir tes 0.999 Los dos Ullimos puntos son los que determinan la validacion del ensayo para los tres lotes del Producto Sélido que se esta validando, PreeBibliogratia Microbiologia BIBLIOGRAFIA * European Pharmacopoeia. 3° Edition Supplement. 2.6 Biological Test: 2.6.14. Bacle Endotoxins pag 79, 2001 + Real Farmacopea Espafiola, pag 63 2.6.14. Endotoxinas bacterianas, 1997 * British Pharmacopoeia Vol Il. Supplement A 342. Supplementary Chapter IC, 1999. * "Guideline on validation of the Limulus Amebocite Lysate as an end-product endoto test for human and animal parenteral drugs, biological products, and medical device FDA, 1987. bi ‘* Interim Guidance for Human and Veterinary Drug Products and Biologicals: * Kinetic L Techniques”. FDA, 1991.170 Micromunogia -zado de contaminacién microbiana 5. GRADO DE CONTAMINACION MICROBIANA $1 Recuperacién microbiana EI ensayo de grado de contaminacién en productos No estériles esta descrito en Farmacopea Europea y en USP 24, Se describen s Continuacién los parametros utiizados Para validar este ensayo, AEF! Catalana publicé una Monografia sobre este tema, En la presente monografia se amplian algunos aspectos de los descritos en la monogratia publicads 5.1.1 Exactitud y Precisién a exacttud es el porcentaje de recuperacién frente al valor del inéculo. a Precision expresa la variabilidad 0 mas-menos del método analitico para determinar e! Li age, % Contaminacion. Matematicamente se expresa como eouiioers oe variacién (CV%). Nos podemos encontrar una vez tenemos los resultados de exactitud y precision con que: Exactitud * [a recuperacion se halla dentro de los limites establecidos (70% del inéculo) para todos los microorganismos. Nuestro método es correcto. * Baja recuperacién para todos los microorganismos, Debemos cuestionar el Método y en '0 posible modificarlo para incrementar el nivel de recuperacion, Bala recuperacion para uno de los microorganismos y dentro de los limites para todos los demas. Si el tipo de microorganismo que tiene baja recuperacion representa un ambiente de fabricacién deberd implantarse un sistema de control rutinario de des, n ge dicho microorganismo y establecer un nivel de accién para minimicas ci riesgo. En algunos producios (por ejemplo antifingicos) si no dispone de un inactivador especifico pera e, bnincipio activo, la baja recuperacién puede ser alribuida a la propia nanesloes Gel Bteparado, en cuyo caso se puede repetir el ensayo contaminado, Por ejemplo la gilucion 1/100 de producto o una dilucién superior, siempre y cuando ne'se sobrepase el limite de aceptacion para el producto y comprobands ta recuperacién a estas concentraciones. * fla fecuperacion en uno o mas microorganismos: Nos indica que la muestra es faciimente contaminable, lo cual exige que se tomen medidas en los ambience de Produccién y utilaje a efectos de evitar las posibles contaminaciones, Se acepta una Preepegacien Por encima del limite superior siempre que se cumpla el parameto do Precision.Grado de contaminacién microbiana Microbiologia 171 Precision Un coeficiente de variacién superior al 15- 20% cuestiona nuestro sistema de trabajo. Se deben revisar todos los elementos que intervienen en el metodo de control (instrumental, Personal,...) a fin de detectar el origen de las desviaciones. Veamos algunos ejemplos: a) El caso mas sencillo desde el punto de vista experimental es cuando se valida la eficacia de los medios de cultivo en presencia y ausencia del producto a examinar. Ejempl Los microorganismos con los que se realiza este ensayo son los indicados en la Farmacopea S. aureus, P.aeruginosa, E.coli, etc..La prueba consiste en inocular una cantidad conocida de uno de los microorganismos a la muestra problema y a un diluyente (control positivo), Se efectia el ensayo sobre tres lotes de un producto o sobre tres réplicas. De cada réplica se toman 10 g, se diluyen en 90 mi de diluyente, se le afiade 1 mi de suspensién estandarizada de uno de los microorganismos y se efectua un recuento. En paralelo se hace un control positivo 0 de crecimiento inoculando 1 mi de la misma suspensién de microorganismo a 100 mi del, diluyente (prueba en ausencia del producto a examinar). Se hace tambien un control negativo para verificar la ausencia de crecimiento en los diluyentes utilizados, en este caso se trataria de ver que el diluyente es estéril Supongamos pues que vamos a hacer la validacién de la recuperacion microbiana én un producto: Lactosa. Hemos utilizado tres lotes de producto, 10 g de muestra por lote y por microorganismo, los hemos contaminado con’ unos inéculos y obtenemos los resultados siguientes: | Microorganismo ' Inéculo | Recup.Lote 1 | Recup, Lote2 | Recup. Lote | UFCiml_! _UFCIm | _UFCimI UFC/mL |S. aureus [285 | 190 | 201 i 2 |B. subtl | 493.5 sco | 532 510 [econ | 569 400 | 428 sio__ | C.albicans | 605 wo | 654 | Nota: En la columna inéculo se incluyen los resultados de control de crecimiento de la suspension del microorganismo correspondiente. Inéculo " Recup. Lote 1 ~ Recup. Lote 2 1 Recup: Lote 3) | Microorganismo | UFC/mt UFCim! | UFCiml_ | UFCimi | {C.perfringens 210, 150 210 {2101172 microviologia Grado de contaminacién microbiana Glewo de los tantos por ciento de recuperacién, la exactitud v la precision: *. Exactitud % Recuperacion = Microorganismos recuperados presencia producto aa Microorganismos recuperados ausencia producto © Precision: Donde: X: media de los tantos 5: derivacién estandar CV: coaficiente dé variacion Microorganismo ~“Yrecup. Yerecup. Yarecup. Exacta Precision Lote1 __Lote2 __Lote3 Por ciento de recuperacion de un microorganismo, =e (CVyiier, Sa 87.96 5.45 B. subtilis — 2.70 [E coli_ 8963 7.40 “C. albicans 10} 106.44 Cie 4.47 ~C.pertringens "71.42 100.00" 400.00 Cfe 18.53 El coeficiente de variacion es inferior a 20 % en todos los casos. Esterilidad material utlizado 1 Conforme J 5) También se puede efectuar la comparacién de la Fecuperacién entre el producto y un blanco (diluyente) mediante un test de t de Student Eiemplo: Se determina la recy peracion de S.aureus en un medio de agar en Presencia y ausencia de product '0 (ensayo por triplicado con tres réplicas), Producto |__Biyents 38 56 __media_ 41 t 51,14 | desv. estandard 3.3166 ! 3.62 ! variancia 10,999 i 3.117 |Grado de contaminacién microbiana Microbiologia 173 Test de F para comparar las variancias: Fexp = 13,1119/10,999 = 1,1919 F tablas (P=0,05 , vi= 8, v= 8)= 3.4381 F exp tabs existe diferencia significativa entre la recuperacién del producto y del diluyente. Se deberd valorar si esta diferencia es aceptable microbiolégicamente o si debe mejorarse el Procedimiento afiadiendo un neutralizante al producto. ©) Cuando se requiere afiadir un neutralizante y se deben comparar los tres casos: Producto sélo Producto con neutralizante Diluyente, Se puede recurrir a un andlisis de la variancia (ANOVA) para detéiminar si el efecto de! neutralizante es significativo sobre la recuperacién. EI ANOVA también se puede utilizar para los estudios de precision intermedia cuyo objetivo es determinar la variabilidad del método, efectuando una serie de andlisis sobre ‘a misma muestra, en el mismo laboratorio pero en condiciones operativas diferentes. Eiemplo: Se desea estudiar la influencia de dos medios de cultivo de distintas marcas comerciales en la recuperacion de un indculo y a dos tiempos distintos. En el ejemplo la situacién que se describe es que a partir de una suspension microbiana se realizan 6 diluciones a tiempo 1, 3 de ellas se ponen con el medio Ay las otras 3 con el medio B. Posteriormente a tiempo 2 se repite la misma Operacién. (La suspensién inicial microbiana es la misma que se ha podido mantener en nevera, etc..). : Los datos (CFU/ml) tabulados seran:174 Microgrolagia Grado de contaminacion microbiana Medio I Tiempo 1 I Tiempo 2 ’ 113 i 129 iN 140 | ‘16 120 124 j 142 ] 131 B i 144 | 140 146 ! 125 Es un caso de andlisis univariante de medidas repetidas. En primer lugar se aplica un test de homogeneidad de variancias (test de Cochran) Gao 8 maxis,’ + 5,%+...+8,? __ Grupos] 7 2 T 3 4 a 3 | 3 i 3 3." s_ 196.3333 42,9995 4.00007 56.9995 Es*= 300.3323 Grp 196.3333/300.3323= Gunias(P =0.05, 0.6537<0.7679 no significative por'lo que aceptamos la igualdad de variancias de los 4 grupos. ; 03. ‘Al ser las variancias homogéneas, podemos pasar al ANOVA Miramos en primer lugar la influencia de los medios en la recuperacién: ‘Source SS DF _MS F P Medios 660.083 1 | 660.083 22.736 0.008 Error [119.333 47) 29.833 7 hay diferencias significativas (P=0.009) omprobamos la influencia de los tiempos: ‘Source ss] OF | oS La tiempos, 154.083 | 1) 154.083, 1.280 No hay diferencia significativa entre los tiempos ‘Vemos ahora la influencia de la interaccién tiempo-medio: ‘Source SS, OF, MS. i P Tiempo medio | 70.083 1 70.083 0.582 0.488 Error 481,333 4 420.333 La interaccién tiempofmedio no es significativa, Como conclusion en este caso podemos decir que hay diferencias significativas en la recuperacion de microorganismos segiin se use uno u otro medio, en Cambio, los recuentos no viene ‘influenciados por el tiempo transcurrido entre los dos recuentos en los dos medios.Grado de contaminacién microbiana Microbiologia 175 5.2 Ensayo de deteccién de patégenos 5.2.1 Introduc n La finalidad de esta validacion es comprobar si las propiedades nutritivas y selectivas de los medios de cultivo utilizados para el ensayo de deteccién de patogenos quedan afectadas Por la presencia del producto a examinar. 5.2.2 Métodos a) Método de recuento en placa b) Método de filtracion a través de membrana 5.2.3 Numero de réplicas El ensayo se efectla sobre muestras de tres lotes diferentes de producto acabado o materia prima, 0 en su defecto, sobre tres muestras diferentes pertenecientes a un mismo lote. 5.2.4 Material EI propio de un laboratorio de micro! para la deteccion de patégenos. logia,’ ademas de los medios de cultivo necesarios 5.2.5 Microorganismos de ensayo * Staphylococcus aureus ATCC 6538 6 6538P. * Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027. + Escherichia coli ATCC 8739, * Salmonella typhimurium (no se recomienda ninguna cepa de referencia). Es posible utiizar una Gepa_no patégena para la especie humana, como por ejemplo Salmonella abony NCTC 6017. 5.2.6 Preparacién del inéculo 3 Se prepara una suspension estandarizada de cada uno de los microorganismos de ensayo y se efectiian las diluciones oportunas en agua de peptona tamponada, para obtener una concentracién final de 1000 UFC/ml de cada microorganismo. Se mezcian volumenes iguales de cada una de las suspensiones en‘un tubo estéril (tubo mezcla) y se reserva para inocular las muestras y el control positivo.776 Microbnngia Grado de contaminacién microbiana 3 5.2.7 Procedimiento 5.2.7.4 Para productos que no requieren filtracién Pretendan detectar: © Muestra A: se diluyen o disuelven 10 g 6 mi de producto €n 90 mi de Caldo dé” TsB, Fan J2 deteccion de Salmonelta sp. (ver esquema 1) 7 Muestra B: se diluye o disuelve 1g 6 mide producto en 100 mi de Caldo de TSB, para la deteccién de S.aureus, P.aeruginosa y E.coli (ver esquema 2 y 3). Awlo By los controles positives con 0.4 mi del tubo mocele Preparado anteriormente, es Gecit con 100 UFC aproximadamente de cada cepa. Se incctat las muestras A y su control Wo @ 35-37°C durante 18-24 horas y las muesiras By su. contro! Positivo durante 18-48 horas a la misma temperatura 5.2.7.2 Para productos que requieren filtracién la incubacion como se indica en el apartado §.2.7 1 * Muestra B: para la deteccién de S.aureus, P.aeruginosa y E.coli se fila la cantidad de producto diluido correspondiente a 1g 6 mi de producto a examirar y a Continuacion se procede como en el caso de la Muestra A. * Gontrol positive: se efectua el mismo procedimiento, pero fitrando una cantidad de diluyente apropiado sin el producto a examinar 5.2.7.3 Deteccién de Salmonella sp. Tras la incubacion se agita el frasco de Caldo de TSB correspondiente a a Muestra A y se transfiere 1 mi a un tubo conteniendo 10 mi de Caldo TBC (Ver esquema 1). Se incuban los tubos a 41-43 °C durante 18-24 horas. Se efectuan subcultivos sobre al menos dos de los siguientes medios: Agar VB, Agar XLD y Agar Desoxicolato-citrato. Se incuban las placas a 36-37 °C durante18-72 horas, Se repite el mismo procedimiento para el control positiveGrado de contaminacién microbiana Microbiologia 177 La aparicion de colonias con las siguientes caracteristicas indica la presencia de Salmonella 80: ' * Agar VB: colonias pequefias, transparentes, incoloras 0 de una coloracion entre rosa y blanco opaco, a veces rodeadas de una zona rosa o roja * Agar XLD: colonias bien desarrolladas, rojas, presentando 0 no un centro negro. Agar desoxicolato-citrato: colonias bien desarrolladas, incoloras. La presencia de Saimonella sp. puede ser confirmada efectuando subcultivos en superficie y en profundidad en Agar Tres Azucares-Hierto a partir de las colonias aisladas en los medios anteriores. Tras la incubacién, la aparicién de un crecimiento que vire la coloracion de rojo a amarillo en profundidad y no en superficie, acompafiado generalmente por la formacién de {gas en el agar con o sin produccién de sulfuro de hidrégeno, confirmaria el resultado. 5.2.7.4 Deteccién de E.coli Tras la incubacion agitar el frasco de Caldo de TSB correspondiente a la Muestra B y se transfiere 1 ml a un frasco con 100 ml de Caldo McConkey (Ver esquema 2). Se deja en incubacién a 43-45°C durante 18-24 horas y se efectuan subcultivos en placas de Agar McConkey los cuales se incuban a 35-37°C durante 18-72 horas. E1 mismo procedimiento se repite para el control positivo. El crecimiento de colonias rojas, generalmente no mucosas, de bacterias gramnegativas con morfologia cocobacilar, rodeadas a veces de precipitacién rojiza, indica la presencia de E.coli, que puede ser confirmada por pruebas bioquimicas apropiadas, como por ejemplo la produccién de indol 5.2.7.5 Deteccién de S.aureus Tras la incubaci6n se agita el frasco de Caldo de TSB correspondiente a la Muestra B y se efectuan subcultivos sobre placas de Agar Baird-Parker (Ver esquema 3). Estas placas se incuban a 36-37°C durante 18-72 horas. E| mismo procedimiento se repite para el control positive El crecimiento de colonias negras de cocos grampositivos rodeadas de una zona clara (halo \ansparente) similares a las obtenidas en el control positivo, indica la presencia de S.aureus, que puede ser confirmada con pruebas bioquimicas apropiadas, tales como la coagulasa y la desoxirribonucleasa. 5.2.7.6 Deteccion de P.aeruginosa Tras la incubacidn se agita el frasco de Caldo de TSB correspondiente a a Muesira B y se efectdan subcultivos sobre placas de Agar cetrimida (Ver esquema 3). Se incuban las placas a 35-37°C durante 18-72 horas. EI mismo procedimiento se repite para el control positive.178 Microbiologia Grado ce contaminacién microbiana # z gs e 8 & g g g a q 3 3 a 3 3 a 3 g a a : 8 < 5 y g a la luz UV, similares a tgs obtenidas en el contol Positivo, indican la presencia de P.aeruginosa, que puede ser confirmada'con Pruebas bioquimicas, tales como la oxidasa y 5.2.8 Valdez del ensayo El ensayo se considera valido y por tanto validado el método de deteccién de patégenos, si Se aislan en todos los casos los micioorganismos ensayados El ensayo no se considera valido cuando: * No se aislan los microorganismos inoculados en todos o en alguno de los lotes enszyados. * Nose asilan los microorganisms inoculados en el control posiivo. Cuando esto ocurra pademos proceder de la siguiente forma: microorganismo. * En el caso de que no obtengamos ningtn tipo de recuperacion de microorganismos, debem i En este caso, debemos filtracion y repetir el ensa, Grado de contaminacién microbiana Microbiologia 179 Esquema 1. Deteccion de Salmonella sp. A era de necorgnsnas (1coo uF o4ni oni 10 pro f ee 100m aldo toomicise 88 proouctos CONTROL PoSTIVO 35.37 18.4 ‘ Pletesn: eee Ager XLD ‘Ager VB Agar Cireto-desoxicaato 35.7 18.72 Sainonel 5p.100 Microun gia Grado de contaminacién microbiana Esquema 2. Deteccién de Escherichia coli a Mezcta de microorganismos (1000 UFC) 4m 4m f — A stonicako 100mic.188 a PRODUCTOS ‘CONTROL PosmTVO 38.37%, 1848 4m f 100i C McConkey 41-43 °C 18-24, | ©@ 0 iy 35.37°C 18:72h Escherichia covGrado de contaminacién microbiana Microbiologia 181 Esquema 3. Deteccidn de S.aureus y Ps.aeruginosa A Mezcla de microorgarismos (1000 UFCin) osm Odi fl ‘awoaxio fi ioe 100mi C188 a PRODUCTOS CONTROL POSIT 357°C, 18-48 | | ‘Ager Cetrimide ‘Agar Beird Parker 35-57 °C 18.72h 35-37°C 18-724 Pseudomonas aoruginasa Slaphylococcus aureus 5.3 Ensayo de determinacién cualitativa y cuantitativa de enterobacterias 5.3.1 Introduccién , ta validacién de este método consiste en demostrar que si el producto a ensayar est contaminado por enterobacterias, podemos determinar cualitativamente su presencia y Guantitativamente el nimero de UFC/g 6 ml presentes siempre dentro de los rangos establecidos en la Farmacopea Europea 3* Ed. Suplemento 2001, punto 2.6.13. - * 1000 UFC/g 6 mi * Entre 100-1000 UFC/g 6 mi + Entre 10-100 UFCig 6 mi © < 10 UFCig 6 mi162 Microbiologia Grado de contaminacién microbiana Para la determinacién Cualitativa, contaminaremos una muestra Perteneciente al producto ee a su deteccién Para la determinacién cuantitativa, Contaminaremos una alicuota de producto con un numero de UFC/g 6 mi de enterobacterias gue esté comprendido en uno de los rangos sryeriormente mencionados y que coincidira con el limite Permitido de enterobacterias‘ para Gicho producto. A continuacién desarrollaremos on ejemplo para una preparacién oral de ongen natural cuyo limite de enterobacterias sea como marcne 100 UFCig 6 mi. 5.3.2 Numero de réplicas " (<10 UFCig 6 mi), ya que es necesario saber eu Conteniendo a la hora de interpretar e! resultado obtenido. 5.3.3. Material El propio de un laboratorio de Microbiologia ademas de los Medios de Cultivo utilizados en ta deteccién de enterobacterias. 5.3.4 Microorganismos de ensayo * Staphylococcus aureus ATCC 65386 6538P. * Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027. * Escherichia coli ATCC 8739, * Salmonelia typhimurium (no se recomienda ninguna cepa de referencia). Es posible ullizar una cepa no patégena para la especie humana, coms Por ejemplo Salmonella abony NCTC 6017. S182 considera necesario puede introducirse ademas algin otro microorganismo que pueda Se onto in contaminante habitual de la preparacion o que pueda interery an la deteccién de enterobacterias. 5.3.5 Preparacién del inéculo Se mezcian volimenes iguales de cada una de las diluciones anteriores en un tubo estéril (tubo mezcia) y se reserva para inocular.Grado de contaminacién microbiana Microbiologia 183. 5.3.6 Procedimiento Para cada uno de los lotes de producto se prepara una muestra de 10 96 mi de producto y 90 mI de Caldo lactosado estéril. 5.3.6.1 Determinacién cualitativa Se inocula también un contro! posit producto a ensayar, Se incuban las muestras inoculadas a 35-37°C durante el tiempo suficiente Para asegurar la revivificacién de las bacterias pero insuficiente para permitir su ‘multiplicacion (generalmente Finalizada la preincubacién, se agitan los frascos y se trasvasan 10 ml de liquido (cantidad EeresPondiente a 1 g 6 mi de producto) a un frasco que contenga 100 mi de Caldo de Enriquecimiento de Mossel. Se incuban los tubos de Caldo & Mossel a 38-37°C durante 18- 48h, Se efectian subcultivos sobre placas de Agar VRBD para comprobar que el crecimiento Corresponde a enterobacterias. Estas placas se incuban a 35-37 °C durante 18-24 h, Un crecimiento de colonias bien desarrolladas de bacterias gramnegativas, generalmente ‘ojas 0 rojizas, revela un resultado positivo, 5.3.6.2 Determinacién cuantitativa Para un producto cuyo limite de enterobacterias sea < 100 UFC/g 6 mi, procederemos contaminando la muestra y un control positivo, con un numero de enterobacterias, ‘comprendido entre 10-100 UFCig 6 mi de producto: Se inoculan las muestras preparadas de cada lote (10 g 6 ml de Producto en 90 mi de Caldo lactosado ester!) con § mi del tubo mezcla, es decir on S00 UFC aproximadamente, de las UFCig 6 mi de producto. Se inocula también un control positive que contenga 100 mi de Caldo lactosado esteril, sin el producto a ensayar. Se’ incuba las muestras durante el tiempo suficiente para ase,184 Merobiologia Grado de contaminacién microbiana Krave. 3 tubos conteniendo aproximadamente unos 29, ml de Caldo de Enriquecimiento de Mossel, con fracciones de 1 ml, 0.1 mi y 0.01 wt de muestra preincubada, correspondientes 6 mi a 0-1 g 6 mi, 0.01 9 6 ml y 0.001 g 6 mi de Producto a examinar respectivamente. Se incuban los tubos de Caldo E.Mossel a 35.37°C durante 24-48 h, 5 Se glombran subcultivos sobre Agar VRBD do los totes que presenten turbidez, para SomProbar que el crecimiento corresponde a enterobacterias. Se icubani las placas a 35. 37°C durante 18-24 h, Un crecimiento de colonias bien desarrolladas de bacterias gramnegativas, generalmente ‘ojas o'rojizas, revela un resultado positivo, Confirmar que el producto contenia entre 10-100 UFCig 6 mi de enterobacterias, tl como indica la tabla 1, segun el punto 2.6.13 del Suplemento 2001 de la 3* Edicién de la Farmacopea Europea Tabla 1. Numero probable de bacterias por gramo de producto / Cantidad de producto sem Psion 0.1960.1mi 0.019 6 mi 0.001 gémi Producto ~ A * * 21000 * Z : Entre 100-1000 | 7 2 a Entre 10-100 5.3.7 Validez del ensayo 5.3.7.1 Determinacién cualitativa El ensayo de determinacion cualitativa de enterobacterias Se considera valido y por tanto validado el método si se obtiene un crecimiento Positivo de enter error en la aplicacién del procedimiento o un problema en | cultvo utlizados, por lo que se recomienda repetir el ensayo Si obtenemos un resultado negativo para las muestras Y positive para el control positivo, entonces puede que el producto presente alguna actividee antimicrobiana, que debera ser climinada mediante dilucion, neutralizacion o bien ftracion:Grado de contaminacién microbiana Microbiologia 185 5.3.7.2 Determinacién cuantitativa El ensayo de determinacién cuantitativa de enterobacterias se considera valido y por tanto validado el método si se obtiene el resultado correspondiente al inoculo que hayamos utlizado para el ensayo (ver tabla 1), tanto para las muestras como para el control positivo. Si obtenemos para las muestras un numero de UFC/g 6 mi de producto superior al que hemos inoculado, debemos tener en cuenta la contaminacion inicial pot enterobacterias de las muestras y repetir el ensayo haciendo las correcciones pertinentes en los calculos del indculo Esquema 1. Determinacion cualitativa de enterobacterias. a Mezco de nicrocrganisnos 0 UFC) atm 04 ni 10 9 produc q ate A ‘orica 0 ml Clactosado bectosad PROBLEMAS TROL ssa an, CONTROL POSTIVO | Omi f 1001 CEMasset SC, 1048h, | @ > 35.37 °C, 18.24,186 Microunogia Grado de contaminacién microbian Esquema 2. Determina ici6n cuantitativa de enterobacterias para un Producto cuyo limite se <100 UFCig 6 mi. ezla de microorosismos (100 UF Cin) Sm Sm 109 producto’ Ut) tt 100i ca Or Clactosedo bean) PROBLEMAS: ‘CONTROL POSITIVO 35-37" 2h. Tae ree nee Ae F O19 Ootg Mg canted fa de producto 35.37, 48h, -—t— @ So Ove 3537 °C, 18-2th,Eficacia de la conservaci6n antimicrobiana Microbiologia 187 6. EFICACIA DE LA CONSERVACION ANTIMICROBIANA El ensayo de eficacia de la conservacién antimicrobiana permite demostrar que un producto (especialidad farmacéutica, cosmético, etc.) tiene una actividad antimicrobiana determinada (debida a la adicion de sustancias antimicrobianas 0 debida a su composicién) que lo protege de los efectos adversos causados por una eventual contaminacion microbiolégica durante el almacenamiento o el uso. El ensayo consiste en inocular una cantidad de producto, si es posible en su envase original, con diferentes suspensiones de microorganismos por separado. A distintos intervalos de tiempo se realizan recuentos tomando alicuotas de 1g 0 1 mi de producto para detectar microorganismos supervivientes. En el momento de afrontar ta validacién de este método se debe tener en cuenta: a) Microorganismos Se siguen las directrices del apartado “Cepas de control”. b) Medios de cultivo Se siguen las directrices del apartado “Medios de cultivo”. Es necesario realizar ensayos de fertilidad y de esterilidad de los medios de cultivo. Si se utilizan medios de cultivo 0 diluyentes distintos de los recomendados por las Farmacopeas, se debera demostrar sus Propiedades nutritivas y la ausencia de toxicidad, realizando una validacién del diluyente o del medio de cultivo tal como se detalla en el apartado correspondiente: ¢) Método de recuento Antes de iniciar el ensayo de eficacia de la conservacion antimicrobiana se debe disponer de un método de recuento de microorganismos supervivientes validado. Con la validacion del método se demuestra que éste es capaz de recuperar los microorganismos supervivientes en niveles minimos de contaminacién (10-100 ufc Por gramo o mililitro de producto). La recuperacién de los microorganismos se puede demostrar al inicio del ensayo, Cuando Se inocula el producto se hace un recuento a las 0 horas y se, compara el resultado con un fecuento en paralelo de una solucién de peptona inoculada con los mismos microorganismos y en la misma proporcién. Por ejemplo: Recuento 0 horas 1) 20 ml producto + 0,2 mi de inéculo 1,0x106 ufe/ml Pseudomonas aeruginosa 2) 20 ml peptona + 0,2 mi de indculo 3,0x106 ufc/mi Pseudomonas: aeruginosa Queda demostrada la recuperacién para niveles altos de contaminacién. Sin embargo, en algunas ocasiones el recuento del producto a las 0 horas es inferior al recuento de la solucién de peptona lo que demuestra una actividad antimicrobiana del producto. Es necesario también tener la certeza de que el método es capaz de recuperar los microorganismos a niveles bajos de contaminacién lo cual debe incluirse en la validacién del método. La viabilidad de! indculo se puede demostrar si la solucion de peptona inoculada (control Positivo) se conserva a la misma temperatura que el producto inoculado y se realizan fecuentos a determinados intervalos de tiempo. Se considera que el indculo es viable si se obtienen recuentos del mismo nivel o superior que los obtenidos a las 0 horas.188 Microbiologia Eficacia de la conservacién antimicrobiana Debe tenerse en cuenta que en los ensayos de validacion se utllizan cepas de laboratorio ie ig.hnan sido expuestas anteriormente a agentes anlimicrobianos, Sin embargo, en muchas ocasiones los métodos analiticos intentan recuperar microorganismos que han estado expuestos a agentes antimicrobianos, y que pueden estar debilitedes & dafiados. £3 exposicion de los microorganismos al producto debe realizarse por lo menos én dos BreaaGs 0.05 (no significativo) Test de coincidencia o bien de paralelismo: p > 0.05 (no significative) 7.8.2 Repetibilidad (Precisién) (Mismo laboratorio en idénticas condiciones) Se determina a partir de un bianco de excipientes al que se le afiade la cantidad de antibidtico correspondiente al 100% teérico, Después de realizar la valoracién (9 réplicas) se obtienen unos resultados con los cuales se caloula: + lamedia + la desviacion estandar (variabilidad del método). ‘+ la desviacion estandar de la media * el coeficiente de variacion. * los limites de confianza de la mediaValoracién microbiolégica de antibiéticos Microbiologia 193 * los limites de confianza de la desviacion estandar * [a tolerancia, que expresa la variabilidad del método respecto al intervalo entre las especificaciones superior e inferior. Criterios de aceptacién (ver ejemplo): * Coeficiente de variacién: <5% para unos limites de 90-125% * Tolerancia < 30% 7.5.3 Exactitud Para determinar la exactitud se preparan tres alicuotas de un blanco con los excipientes, se afiaden a una de ellas la cantidad de antibidtico correspondiente al limite inferior de aceptacién (90% en el ejemplo desarrollado a continuacién), en la otra alicuota se afiade la cantidad correspondiente al 100% y en la tercera la cantidad correspondiente al limite superior de aceptacion ( 125% en el ejemplo). Se efectian tres valoraciones de cada una de las alicuotas y con los resultados obtenidos ‘se comprueba que se cumplan los parametros estadisticos que definen la exactitud: + Homogeneidad de variancias + Test t de Student * _Determinacién de! sesgo 0 error determinado Criterios de aceptacién (ver ejempl : + Homogeneidad de variancias: p > 0.05 (no significativo ) * Sesgo< 3% 7.5.4 Selectividad Se determina analizando por duplicado el blanco de excipientes. Si el resultado no es Cuantificable se demuestra la selectividad de! método. Si la respuesta es cuantificable, se debera tener en cuenta la misma en la obtencion de resultados. En estos casos se debe determinar cual es el producto que interfiere, y tratar de eliminarlo (por dilucién 0 por neutralizacién) o bien afadirlo a los patrones, de forma que tanto los patrones como los problemas tengan la misma concentracion de sustancia interferente. ” 7.8 Ensayo del producto En las valoraciones de rutina cuando la linealidad del sistema ha sido demostrada, usar un ensayo de tres puntos, Usar en cada ensayo el nimero de réplicas por dosis que asegureni la precision requerida Tomar al menos tres unidades del lote, que correspondan al principio, mitad' final del lote.194 Microbiologia ! 7.7 Periodicidad de la validacion Valor.s.10n microbiolégica de antibisticos Farmacopea Europea -no indica la petiodicidad de la validacion, solo se requiere la validacién al inicio de control de! método de valoracién. 7.8 Ejemplo Desarrollo de un caso antibisticos, Producto o cyando hay un cambio en la formulacién o en el D ‘ Practico de validacién de un método de valoracion microbiolbgico de Concentraciones del ensayo: —Disoivente para ia solucion patron: ~Solucién tampon: _ Microorganism: io y pH final: Temperatura y tiempo de incubacion Difusion en agar Cuadrado latino (3x3 Solucion estéril de neomicina cortisona Neomicina sulfato SCR (para uso en ensayos microbiolégicos) 2,2. 66 y 8 ugiml (r=1.41) ‘Agua purificada BH 8.0 (0.05 M) Bacillus subtilis ATCC 6633 Suspensién al 70 % e inocular al 2% Medio E (pH 7.9) 30-37°C y 18-24 horas Criterios de aceptacién del disefio Regresién linea _p<0.05 (significativa) ‘experimental: Paralelismo p>0.05 (no significativa) ! Curvatura p>0.05 (no significativa) Especificacion: 190-125 % _ Parametros de validacién: _Referencia bibliografica: El resultado de la valoracién sera la independientemente (réplicas). Linealidad / Rango Linealidad/rango Precision (repel Exactitud Selectividad Farmacopea Europea.3° Suplemento 2001 lidad) media de dos determinaciones realizadas Se desarrolla un ejemplo de andlisis de regresion del patron y problema y su test de coincidencia. En el ejemplo se pone de manifiesto una cierta desviacién de los criterios de aceptacion de! modelo. Rango de validacién: entre 2 y 8 ygim! Linealidad: regresién lineal entre ef logaritmo de la concentracién de antibi6tico (ug/ml) y el diametro de los halos (mm). Concentraciones: 2, 2.83, 4, 5.66 y 8 g/m.Valoracién microbiolégica de antibiéticos Microbiologia 195 X (abcisas) Y (ordenadas) ‘Concentracion Logaritmo Diémetro (mm) (ug/ml) ~~ Concent. Patron Problema $ eee 5.66 0.75 19.87 | 19.80 5.66 [0% F974 19.72 ~ 8 0.90 21.04 21.59 8 0.90 21.09 21.46 8 0.90 20.41 2 eee 8 0.90 20.88 21.03 8 0.90 t 20.42 tT 21.08 a ee 21.19 i 20.78196 Microbiologia Valoracién microbioldgica de antibisticos Recta Patrén: a) Anilisis de Regresion Ecuacién de la recta de regresion: Diametro (Y) = 14.8 + 6.74 log concentracién (x) Predictor Coeficiente” SiDev T eae Constante "14.8423, 0.1524 7.61 0,000 ‘Cone: | 6.7070 (0.2381 28.17 0.000 | : co S=0.2776 | R-Sq=96.6% | R-Sqlad) = 96.5% | b) Analisis de la Variancia Fuentes {gl sss P. —Regresién fein 61.146 | 61.146! 793.60 0.000 or teers 2.187 | 0.077 Falta de ajuste 3 {0.088 | 0.023 O27 OBaa 252.089 | 0.083 Total {297 63.303_| i T 22 21 Diémetro (mm) 7 16 2,00 283 4,005.66 Concentracién (meg/ml) 8,00 La concentracion se representa en escala logaritmicaValoracion microbiolégica de antibidticos Microbiologia 197 Residual Model Diagnostics Normal Plot of Hesiguals aa f ote anc Clete?) v Normal Score 1 Chart ot Residuals vp Resioual Residual Ay! vs (Observation Number Histogram ot Hesiguals Hesidual vs. Fits Ee : oe 24 a . . . : 55 Fooft ge il é re: ; Lo: a coe : \Sedadadadabet data 4 7 Normal Probability Plot 0.5 00 os Residual Average: v.v0vy0uu ‘Anderson-Varling Normaity test ‘SWev. 0.272749 A-Squarec:u.40y198 Microbiologia Valon..idn microbiolégica de antibisticos Recta Problema: a) Anélisis de Regresion Ecuacién de la regresion: Didmetro (Y) = 14.7 + 7.16 log. Concentracién (x) False teatens 55° ————— Senso ati Sah oe Sa es — ie Teens is ass sro lrsaressn | rswadyeonen | b) Anilisis de la Variancia Fuentes a MS] __F P Regresion 4 6.9636 69.636 698.42 0.000 Error i 38 3.258" 0.116 t Falta de ajuste [3 0.098 0.032 "0.26 0.855 Enon exp. 5 3.1607 0.126} i Total — 29 72.895 23 2 a 20 9 Diémetro (mm) 8 7 16 15 200° 283 © 400566 8,00 Concentracién (megimi) La concentracién se representa en escala logaritmicaII SSS Valoracién microbiolégica de antibiéticos Microbiologia 199 Residual Model Diagnostics Normal Plot of Residuals | Chart of Residuals 05 ’ saacane 3 0D 1 Bo ic Fam é i < a - : 7 me a a 6 70 B Ea Normal Score Observation Number Histogram of Residuals Residual vs. Fits 7 6 Bs Ba Eo r2 1 ° Iadadidac'2008 Residual Normal Probability Plot wo vw 95 = 20 8 50 £ 20 2 05 o1 ut ue ua ue uu uz ua Hesidual ‘Average: v.v0v0vwy ‘StDev. 0.335194 NU value: 0.018200 Microbiologia Valoracion microbiolégica de antibiéticos Test de coincidencia ne 203 std defnisa por dos parametros. pendiente (8 6 b) y punto de corte (x6 a) con el eje de ordenadas. El método estadistico que permite determinar si dos rectas coinciden se basa en definir una yagable ficticia Z (por ejemplo: O= esténdar de referencia; 1=problema) que represeria a ne Gos Tecias y estimar un nico modelo de regresion multiple que incluye el término interaccién (1=XZ), year X+y 248 | +e La hipotesis de coincidencia ( y=8=0 ) se veritica con una prueba de F que compara el ‘Subconjunto de estos dos coeficientes de regresion. En este caso, el numerador con dos grados de libertad, contiene ta suma de cuadrados SC(2,X2|X) explicada al introducir las variables X y XZ en el modelo que ya contenia la variable X. El denominador SCE(X:Z;XZ) es la suma de cuadrados residual de! modelo completo. Anilisis de Regresién conjunta Ecuacién de la recta de regresién: Diémetro (x) = 14.843 + 6.707 log.Concentracion (Y) -0.133 Linea + 0.451 Int Predictor] Coeficiente SiDev Ct Le Constanta | 14.843 [our [87.107 0000 Cone 6.707 0.267 [25.138 Linea’ 0.133 0.241 {0.550 int T0451 [enc 377 eee iat 106 a a S=0311 | RSq=96.0% | R-Saladj) = 95.8% Analisis de la Variancia Fuentes [OF 38 us -F[e Regresion | 3 131.072 "43.697 45151 0.006 Enor_ 86 5.419 0.097 i Total 59. 736.497 1 IValoracién microbiolégica de antibiticos Microbiologia 201 Fuente. | SS DF MS. F a 2 : « E bs ; 2 ba ° . . ae oRae Concentracion (megim) La concentracién se representa en escala logaritmica CONCLUSIONES EN EL ENSAYO DE LINEALIDAD Determinacion T |Resultados patron | Resultados Criterios aceptacion | | problema . Coeficiente de FRSq | 96.6% (0.966) | 95.5% (0.988) I RSq=r20.08 determinacién i . i i ‘Andlisis variancia-F, | P 0,000 | __ 0.060 | £0.05 (significative ) ‘Andlisis variancia- F, | P 0.844 | 0.855 P>0.05 (no significativo) Normaiidad de tos Ver-Normal | Ver-Normal Cumple Cumpie _ Homoscedasticidad de | Grafico residuales ” Grafico residuales los residuales I | vs-Fits vs.Fits Debe cumplir i Cumple cumple Test de comcidencia) P| O18 ]P>0.08 (no (conjunto) | \ | significativo) Por los resultados trabajo escogido, la relacién logaritmo d obtenidos Ia linealidad se considera valida, es decir, en el rango de le dosis respuesta es lineal.<02 Microbiologia V. on microbiolégica de antibisticos Precision Resultados de las nueve determinaciones: 103.391, 97.591, 98. 380, 100.743, 103.207, 100.671, 100.556, 96.514 y 100.455 %. Test de normalidad ( test Kolmogorov) Resultado | Resultados ' Resultado Probablida Orden % | ordenados | estandarizado dNormal (1) 0) 0) | 72 =X) | acumulada | i i Ze | | | ' ) | | | __n=9 1 i ! 103.391 96.514] -7.56450 0.058850 7 O1T444 0.052361 97.591" 97.591 | -1.10322 1 0.134967 7 98.380 98.38 0.76550 0.221986 | -100.743 100.455 0.12300 0.548046 0.44444 0.104501 i 2 0.22222 | 0.087255 Esme —10 4 108.207 100.556 "0.16635 0.566061! 5 —~o.ss6e6 0.010506. 6 8. & 9 -0.33333_1 0.111347 100.671 100.671" 0.21555 0.585332 7 0.66667 | 0.081335 100.556 100.743 "0.24647 0.597340 0.7776 0.180438 | D* 96.514 "103.207 | 1.30150____0.903457 0.88889 | 0.014568 100.455 "103.301 | 1.38034 0.916259 1 "1.00000 /-0.083741 a Valores D para diferentes niveles de significacion n I _0=0.10 0=0.05 o=0.07 9 0.387 0-430 0.513 Para D'=0.180438 le corresponde un valor de a <0.90, Hipétesis de normalidad confirmada. Normal Probability Plot Probability 8 95 975 85 995 100.5 101.5 1025 1035 Resultado ‘Average: 100.168, Kolmogorov-Smimov Normality Test SiDev. 2.53591 Der0.180 00.216 D:0.216 ny ‘Approximate P-Value >0.1Valoracion microbiolégica de antibidticos Microbiologia 203 Med Seq 00.2 Desviacion standard $=2.3353 expresa la variabilidad del a — Método ~ — Coeficiente de variacién 2.33% ___deber ser inferior al 5% 1€ 95% para la media 98.4- 102.0% limites de confianza de la (IC=x+t*sVn) Media IC = 100.2 £2,306" 2.33539 ee 7 - IC 95% paras 1.577-4.474 limites de confianza de la _ _ desviacion estandar Variabilidad de resultados 1.65% Desviacion standard de la media para n=2 El intervalo de confianza de la desviacién estandar es asimétrico, ya que la distribucion ‘muestral de la variancia sigue una distribucin de x? Variabilidad de los resultados: 23 5 = 1.65% (Desviacion standard de la media para n=2) a En la realizacion de Ia valoracion se efectuan dos replicas y el resultado es la media de las 2 Naloraciones. Por tanto, la variabilidad es la que corresponde a la distribucién muestral de las medias para n=2. [Detrectn mt dy nas da moo) ‘Dutrinein de os vests del mtd (ne) 6, 6x1.65 Tolerancia = © 199 = 6%1-65 199 _ 99 304 eranela TTT 125-90)"204 Microbiologia aracién microbiolégica de antibiéticos omer soe ‘ Upver See La tolerancia expresa la variabilidad del método respecto al interval entre las especificaciones superior e inferior, CONCLUSIONES EN LA PRECISION Determinacion T Resultados {Griterios aceptacion Coeficiente de 2.33% i <5% variacién | Tolerancia | 28.3% <20% a precision cumple con los parémetros establecidos, el ensayo es repetitive. Exactitud Resultados de cada una de las tres determinaciones a las distintas concentraciones, Entre Paréntesis se indica el porcentaje respecto al teérico o recuperacion, ‘Concentracion Uinferior J Teérico LU superior 90% | 100% | 125 % 88.68 _(98.53) 402.73 | 123.24 (98.59) 90.23 (100.25 102.56 126.2 (100.96) 91.46 (101.62) 103.49 129.39 (103.51) Variancia 2.397 0.245 6.054 * Homogeneidad de variancias (Test Cochran) c Shrax 6.054 ‘exp Fas? +82 2.397 + 0.245 + 6.054 = 0.696 Gene (0.696) es inferior a Gs.2.005 (0.8709) esto indica que las variancias son homogeneas,al Valoracién microbiologica de antibidticos Microbiologia 205 + Determinacion del sesgo o error determinado Recuperacion (x) Eis valor de referencia * Test tde Student _ (00-R Vir (00 -101.3) 9 ant texp= ay 1.90 Para P=0.05/2 y v=8 texas tiene un valor de 2.306: no hay diferencia entre la recuperacion media obtenida y el 100 % por lo que la exactitud es conforme CONCLUSIONES EN LA EXACTITUD Determinacién Resultados [criterios aceptacion vomogoneitad ge |? Vol Gin=0886 | p00 (oe signteawa) variancias | _Sesgo | e% 1.98 + inferior al 3% _ {de Student P Valor tos#2.10 50.05 (no significativo) "12 (exaclitud cumple con los parametros establecidos: concentraciones extremas de Problema se detectan como tales. El resultado del método en la valoracién microbiolégica del blanco por duplicado no es Guantificable ( 0%) lo que demuestra su selectividad: s6lo da respuesta Ia Presencia de antibiético y no hay ningun producto que interfiera. Conclusién final del ejemplo El ensayo se considera validado ya que cumple con todos los Parametros de validacion establecidos.206 Microbiotogia Bibliogratia BIBLIOGRAFIA European Pharmacopoeia. 3 Edition. - Biological Test: 2.7.2 Pag 73, Supplement 2001, British Pharmacopoeia, Vol I!” Micobiological Assay of Antibiotics", Supplementary | LA 365, 1999, JA: Bernabeu, M.A. Camacho, M.E. Gil ~Alegre, et al. « Microbiological bioassay of semorycin thiocyanate: optimisation. and validation”. Jourar or Pharmaceutical and Biomedical Analysis 21pag. 347-353, 1999. The fitness for purpose of analytical methods. A laboratory guide to method validation and related topics. EURACHEM, 1998 f Analytical method development and validation. M. Swartz & LS. Krull. Marcel Dekker Inc.,1997. Statistical method in biological assay. Third edition . D. Finney. Charles Griffin & Company Limited, 1997.VALIDACION DE METODOS EN BIOANALISIS1 INDICE: PARTE IV Validacion de métodos en Bioanalisis INTRODUCCION. 1 Definicién y generalidades 2 Procedimiento a seguir 1.3 Comentarios... 4 5 Criterios de aceptacion Ejemplo..... Curva de calibracion. 22.1 Definicién : 2.2.2 Procedimiento a seguir ................, 2.2.2.1 Preparacion de la curva de calibracién .. 2.2.2.2 Determinacion de la funcién respuesta 2.2.23 _Eliminacion de patrones de calibrado 2.2.3 Criterios de aceptacién : 2.2.4 Efecto de la dilucion 2.2.5 Comentarios 22.6 Ejemplo 2.3 Recuperacién. 2.3.1 Definicién .. 2.3.2 Procedimiento a seguir. 2.4 Exactitud y pres 24.1 Definicion é 24.2. Procedimiento a segui 24.3 Calculos — 24.4 Criterios de aceptabilidad 245 Ejemplo. 25 Limite de cuantificacién 25.1 Generalidades : 2.5.2 Procedimiento a seguir . 2.5.3 Criterios de aceptacion 2.5.4 Comentarios estneerrnerstnesssnnt 2.5.5 Ejemplo de verificacion del limite de cuantificacion.. 2.6 Estabilidad 2.6.1 Generalidades 26.2 Procedimiento a seguir . : : 2.6.2.1 Estabilidad durante el proceso de congelaciénidescongelacion. 2.6.2.2 Estabilidad durante el procesado de la muestra........... a 2.6.2.3 Estabilidad durante el almacenaje de las muestras congeladas hasta el momento de su analisis.... . 2.6.2.4 Estabilidad de las soluciones patré 26.2.5 Estabilidad de las muestras en el inyector automatico, . . 2.6.2.1 Estabilidad durante el proceso de congelacién/descongelacion . 2.6.2.2 Estabilidad durante el procesado de la muestramomento de su analisis......... 2.6.2.4 Estabilidad de las soluciones patro ree 2.6.2.5 Estabilidad de las muestras en el inyactor automation 2.6.3 Consideraciones especiales. 2.6.4 Recomendaciones enaje Ge las muestras congeladas hasta el VALIDACION DURANTE EL ESTUDIO. 3.1. Definicion y generalidades. 3.2 Concepto de serie analit 3.3. Estabilidad 3.4 Curva de calibracién..". 3.5 Limites de cuantificacién 3.6 Exactitud 3.7 _ Ejemplos... 3.7.1 Ejemplo 1: serie analitica aceptada, 3.7.2 Ejemplo 2: serie analitica rechazada...... 3.7.3 Ejemplo 3: serie analitica rango restringido.. 4, _REANALISIS DE MUESTRAS. 4.1 Razones de un reandlisis... es 4.2 Criterio de aceptacién de los resultados del reanalisisBioanalisis. 215 esta introduccién sigue sin existir todavia una bioanaliticos. La actual guia de la FDA “Bioanalit Se encuentra en fase de borrador desd que la validacién de un método en el c serie de caracteri Selectividad: Las separ: aro oe suelen ser dificiles debido a que son habituales los picos interferentes de naturaleza desconocida procedentes de ve ‘mattiz y los picos de posibles metabolitos, Magnitud, siendo habitual lones para aquellos valores de concentracién fuera del rango superior.ee R « ese = 23 pasande por los Pree g ony onipulei~ suestra. ~nlras cle 2 =! enelisis de materi: primas o de especialidades 2,4 cefing © exactitud, on bzaralins hac retzrencia 2 a wae femanthe co Suet chiimwe de racion obtenida en el Estudio de linealidad no sirve habitualmente para determinar el limite de cuantificacion, ya que las concentraciones de analito son demasiado elevadas. * Dado que en bioanatisis se suelen analizar lotes con un nimero elevado de muestras (son habituales las series analiticas.con mas de 100 muestras), la precision intra e interensayo son parémetros fundamentales. Ademas, deben intercalarse muestras de Control de calidad entre las muestras analiticas. Estas muestras control se utilizaran como criterio de aceptacién de la serie analitica En este capitulo se contemplan dos partes fundamentales de la validacién de un método de bicanalisis. La primera es la “validacién previa a un estudio", es decir, aquella que se lleva s cabo despues de la puesta a punto del método analitico y que determina si el método es o o adecuado para la realizacién de futuros estudios. La segunda es la “validacion durante ¢l @studio", fa cual incluye la evaluacion de la exaclitud y precision de los andlisis rulinarioe llevados a cabo en un estudio concreto. A su vez, también contempla el cumplimiento de los criterios de aceptacién de una serie de muestras analiticas en base los limites Breestablecidos. Esta misma estructuracién es la que propone el actual borrador de la guia de la FDA sobre validacién de métodos bioanaliticos para estudios en humanos. Cabe destacar que todos los apartados de validacién descritos estén basados en el andlisis de una Unica alicuota de una muestra biolégica. Esto significa que puede darse por correcto el valor de concentracién de un analito sin tener que llevar a cabo replicados de la misma muestra. Naturalmente, siempre y cuando el método haya superado los criterios de aceptabilidad preestablecidos y que los valores de precision y exactitud de las muestras de control de calidad obtenidos durante los analisis rutinarios sean adecuados. En aquellos casos en los que la muestra biolégica a analizar tenga problemas de estabilidad o conlleve una variabilidad intrinseca al tipo de matriz biolégica, se recomienda que para una mejor estimacion de la concentracién final del analito se leven a cabo analisis por duplicado 0 incluso por tiplicado. Resulta especialmente importante destacar y subrayar este aspecto ya Gue los métodos bioanaliticos se sitian en el contexto de estudios en animales y humanos que abarcan desde las fases tempranas del desarrollo de un nuevo farmaco hasta el analisis Ge principios activos que ya estan en el mercado, como por ejemplo estudios de bioequivalencia entre un posible genérico y el férmaco de referencia, andlisis de principios activos para terapias hospitalarias monitorizadas, etc. Por este motivo, mientras que un método analitico utilizado para un estudio de bioequivalencia debe estar previamente Validado cumpliendo, sin excepcién, todos los apariados de la validacién, en aquello: fstudios | iniciales del desarrollo de un nuevo farmaco (estudios farmacocinéticos/toxicocinéticos exploratorios en animales, perfiles metabélicos en distintas especies, estudios de metabolismo in vitro, etc) pueden hacerse concesiones a la precision Y exactitud, En estos casos, y a pesar de que a cualquier analista le gustaria poser unIntroduccién Bioandlisis 217 método que cumpliera plenamente con todos los requisitos de una validacién "estandar’, la informacién que aporta un resultado final de concentracién con valores de precision y exactitud superiores al 20% puede ser demasiado valiosa para ser desestimada, En la presente monografia se ha intentado reflejar la experiencia acumulada en la validacion de métodos bioanaliticos durante los Ultimos aftos, no solamente desde una perspectiva Puramente regulatoria sino también desde la experiencia del dia a dia de un laboratorio de Bioanalisis. También se han recogido las discusiones, reflexiones y conclusiones surgidas on la reciente conferencia de la American Association of Pharmaceutical Sciontist (APS) Sobre la validacién de métodos bioanaliticos celebrada, de nuevo, en Washington durante el mes de enero de 2000, Finalmente, y a pesar de las particularidades comentadas en esta introduccién, resulta evidente que el objetivo final de la validacién de un método de bioanalisis sigue siendo. la fatificacién de que el método puesto a punto para el analisis de uno o varios analitos es exaclo, preciso, selective, reproducible y que, por lo tanto, es valido para realizar su determinacion cuantitativa en la matriz biolégica correspondiente.218 Boandiisis Validacién previa al estudio 2. VALIDACION PREVIA AL ESTUDIO 21 Selectividad-esper idad 24.4 Definicién y generalidades stir eo? analitico depende de la calidad de la separacion iad intrinseca de la deteccion usada. Asi pues, sie usa un método de deteccion poco especifico como ia absorcién de luz ultravioleta (UV), estuoren nenle si se trabaja a bajas longitudes de onda, detora realizarse un considerable gsfuerzo en la separacién cromatografica, mientras Que si se utiliza un detector altamente Selectivo, como la espectrometria de tases oe tandem (MS/MS), el esfuerzo en la SeParacion cromatografica puede reducirse considerablomento jeto del anélisis (Shah et al, 1992). Aquellas Muestras blanco Grantee eten una interferencia significativa (> 20% te la respuesta del limite de Soantleacion) deberdn ser rechazadas. Si el mimeo ce Mmuestras rechazadas es mayor del 10% del total de muestras blanco estudiadas se aconseja analizar un nuevo lote de ‘uestras. Si en este lote debe descartarse de nuevo un numero de muestras superior ala | Validacién previa al estudio Bioandlisis 219 10% debera modificarse el método analitico para eliminar la aparicion de la interferencia. Se compararan cromatogramas representativos de dichos blancos con cromatogramas correspondientes al limite de cuantificacion para examinar las sefiales obtenidas en cada caso. Deberd de evaluarse también la presencia de picos de interferentes de un analito y/o metabolitos entre si y sobre el estndar interno, Para ello se recomienda estudiar separadamente muestras blanco a las que se les ha afiadido solamente el estdndar interno a la concentracion de trabajo y muestras patron de calibrado correspondientes al valor mas alto de concentracién de cada uno de los analitos sin el estandar interno, De este modo Podré observarse la posible aparici6n de picos interferentes de cada analito a los tiempos de elucion de tos demas compuestos. Para el caso del estandar interno, las respuestas instrumentales de las posibles interferencias debidas a los analitos, y/o a sus posibles impurezas, no debera ser mayor del 5% de la respuesta total del estandar. 24.3 Comentarios Los comentarios que se describen a continuacién hacen referencia a conceptos y situaciones que pueden resultar utiles para la validacion de un'método analitico, sin pretender en ningun caso establecer normas de obligado cumplimiento. Si él método analitico va a aplicarse en estudios clinicos en los que participaran individuos de diferentes paises, es recomendable evaluar muestras blanco procedentes de voluntarios de cada uno de ellos ya que las interferencias pueden variar en funcién de los habitos de vida de cada pais. En los estudios preclinicos con animales, los criterios aplicados en el estudio de la selectividad pueden ser menos rigurosos y algunos autores (Braggio et al, 1996) aceptan evaluar muestras procedentes de tres origenes distintos en lugar de seis debido a que los. animales se mantienen en condiciones estrictamente controladas y homogéneas (mismo crigen, edad, peso, dieta, etc.). De todos modos, siempre que la disponibilidad de la matriz Sea suficiente, es recomendable trabajar con seis blancos distintos sea cual fuere la especie estudiada, En otros casos puede darse la circunstancia de que el férmaco que quiere determinarse esté Presente como sustancia endégena. Entonces ser necesario conocer la variacién de los niveles basales de dicho térmaco en las diferentes situaciones de! animal ylo voluntario incluidos en el estudio: ayuno/comida, ciclos de suefo y vigilia, etc., debiéndose, en muchas ccasiones, elevar el limite de cuantificacién de modo que la influencia de los niveles basales en las concentraciones determinadas sea despreciable. Si las condiciones experimentales Ge administracion y toma de muestra estan suficientemente controladas puede conseguirse que los niveles basales sean muy constantes y queden absorbidos por la curva de calibracién (ordenada distinta de cero). Siempre que sea posible debera determinarse la selectividad del método analitico frente a los metabolites del férmaco. Esta recomendacion puede ser dificil de cumplit en las primeras ctapas del desarrollo de un nuevo principio activo ya que, en muchos casos, se aborda la yalidacion de un método bioanalitico para realizar su caracterizacion farmacocinética de forma previa o simultanea al inicio a los estudios de metabolismo. Sin embargo, con el avance de las técnicas del estudio del metabolismo jn vitro, la caracterizacién de los posibles metabolitos de un farmaco puede abordarse desde los primeros estadios del desarrollo, permitiendo completar el estudio de la selectividad frente a la mayor parte de ellos. Siempre que se identifica un nuevo metabolito debe evaluarse su posible inlerferencia en el andlisis del resto de analitos (compuesto inalterado, otros metabolitos, estandar interno, etc.).220 Bioandiisis Validacién previa al estudio 24.4 Criterios de aceptacién ‘Tal como se ha indicado anteriormente, tas Fespuestas de los picos interferentes en el tiempo de retencién de los analitos deberan de sor Menores del 20% de la respuesta del limite de cuantificacion. Las respuestas de los picos interferentes en el tiempo de retencién del estandar interno deberan ser < 5% de la respuesta no dicho estandar a la concentracién utilizada en el estudio. 24.5 Ejemplo por lo que deben estar el espectro de masas del ™etabolito activo aparece =276) cuya masa es la misma que '2 del férmaco, por lo que para evitar interferencias, los mee Compuestos deben estar modo de deteccién selectiva de iones (SIM), de mode que se pueda realizar la Cvantificacién. Se eligen los valores de m/z=276 para el tarmacs y el estandar interno y ‘m/z=292 para el metabolito activo, En primer lugar de analizan seis blancos de plasma de voluntario no tratado, mostrandose en la figura 3 el perfil cromatogréfico SIM de uno de ellos correspondiente a la masa monitorizada para él farmaco y al esténdar interno a mi2=276 (a la izquierda) y el perfil Sorae ondente a la masa monitorizada para el metabolite activo & miValidacion previa al estudio Bioandlisis 221 palm). farmaco (100 ngimi) y metabolito activo (1500 ng/ml) respectivamente, anadidos Sobre un extracto de plasma blanco. Las concentraciones ullizadae so el estandar interno y la correspondiente al punto mas alto de la curva a modo, como el metabolito presenta un pico de fragmentacion que coincid farmaco y del estndar interno, presentara una sefial de interfere, cromatografico del ion monitorizado para el farmaco y el estandar interno, Puede apreciarse que a las concentraciones del limite de cuantificacion no existen picos interferentes provenientes de la matriz. Figura 1, Cromatograma de jones totales donde se muestra.la buena separacion entre todos. los compuestos estudiados, Pmatan 20000 Estandar Farmaco 000 Metabotto intemo no activo 16000 12000: own | Metabotto he (ein)422 Bioanausis Validacin previa al estudio Figura 2. Espectros de masas Cl negativa de u remetabolito no activo (posible interferencia), estandar interno (isémero del farma 10) farmaco y metaboiito activo, respectivanonte Aonmesnce Arumasnce Amen fomdence 100 Metabo | 0 active 276 ler6 ast] Estancar Farmaco interno Metabolite aeivo 88 aeesgeg 388288388 00. Metaboto so se von, We me (rin)Validacién previa al estudio Bioandlisis 223 Figura 4. Perfiles cromatograficos a m/z=276 (farmaco y estandar interno) a la izquierda y miz=292 (metabolito activo) a la derecha, correspondientes a la adicion de estandar interno (100 ng/mi) sobre un extracto de plasma de voluntario no tratado poem 00 7000 Estandar ‘interno Figura $. Perfiles cromatograficos a m/z=276 (farmaco y estandar interno) a la izquierda y mi (metabolito activo) a ta derecha, correspondientes a la adicion de farmaco (100 ng/ml) sobre un extracto de plasma de voluntario no tratado Arama, pmo 10000 ‘2000 aoe Farmaco hoe 1600. 4 1100. 000. 1200. ‘soon 1000: 00 ‘3000 : 100. 2000 00 Motabolto Estandar oS interno 1224 Bioandiisis Validacién previa al estudio Tpektarmaco y estandar interno) a la izquierda y m/z=292 {rretabolio activo) a la derecha, correspondiamiee voy adicion de metabolite active (1800 ng/ml) Sobre un extracto de plasma de voluntario no trateac mse — ‘Activa somo | ‘Metabolito ~ cee a 22 (metabolto activo) a la derecha, comespondientos « ane muestra de patron de calibrado con 8.25 ngim| de farmaco (LC), 2 ngiml de matabolito actives (LC) y 100 ng/ml de estandar intemo untae Anmdnce + Aundance Parma F seasito Metaboito — Estindar 0 activo 00 ‘acto 0 20000 00 00 sme — j 2m 00 10000 zm 100 000 fan oe adele 00 300 00 aso aa 350 Tao lime (aio, Time (ou) ‘Sadicones amtsertaice "°°! Here de lemperatrs one meiodo We oman te oe ye ‘ebido a cambios en las ondiciones ambientales.EE aE Validacién previa al estudio Bioanalisis. 225 2.2 Curva de calibracién 221 Definicion ia curva de calibracion de un método analitico es la relacién existente entre la respuesta instrumental que produce un determinado analito y las concentraciones del mimo La curva Ge calibracién es la funcién respuesta mas simple que relaciona respusia instrumental con concentracién. Esta funcién se caracteriza por el rango y la linealidad Fl fango de un método analitico es el intervalo entre los limites de cuantificacion superior e inferior para los cuales se ha demostrado que el método analitico presenta un adecuado nivel de precision, exactitud y linealidad. La linealidad de un método analitico es la capacidad dentro de un fango definido de obtener resultados proporcionales, bien de forma directa o bion por medio de une transformacion matematica, a la concentracién de analito en la muestra, 2.2.2 Procedimiento a seguir 2.2.2.1 Preparacién de la curva de calibracion Se debe generar una curva de calibrado_para cada uno de los analitos @ cuantificar en la muestra, L2 curva de calibrado se construira con muestras patron preparadas en la misma matriz que las muestras a cuantificar, afiadiendo concentraciones. conosidee del/ios analito/s, y sometiéndolas al proceso de extraccion yandlisis. A lo largo de la validacién, se deberan evaluar un minimo de tres curvas de calibracién, empleando, a ser posible, matrices procedentes de fuentes distintac Para un determinado método analitico se debera emplear el mismo tipo de funcion fespuesta en la validacién y en el andlisis de muestras reales. 22.2.2 Determinacién de la funcién respuesta . Cowulta ll Tepresentar las respuestas de los patrones de calibrado en funcion de la detector fits onacet un andlisis visual, Este andlsis visual permite em algunos ceeoe detectar falta de linealidad. Si se detecta esta falta de linealidad, los datos pueden ser Sometidos a transformaciones matematicas con anterioridad al analisis de regresién. Se2 Rioanaisis Validacion previa al estiidio ¢! origen. la pendiente de la regresion, ay Sooner felativo porcentual (ER %) de cada 20 Ge los patrones que forman fa curva de Calibracién, es decir, la desviacién en Porcentaje de los valores calculados frente a los vsior tedricos. ‘+ Pérdida de sensibilidad * mala cromatografia * érdida de la muestra durante el proceso * datos aberrantes o anémalos cuya inclusion on la curva desvia claramente el resultado y e1ER % excede los limites fjados 2.2.3 Criterios de aceptacion EI ER % de cada uno de los patrones Presentes en las curvas de calibracion no debera ser Soot oy at £15 % de la concentracién nominal excepto para el limite de cuantificacién, el (ea Pedra ser como maximo del 20 %, Este ern, debera cumplirse para al menos 2/3 de ibs Patrones de calibracion de cada una de Ine curvas, incluyendo los limites superior inferior del rango,Validacién previa al estudio Bioandlisis 227 224 Efecto dela lucion El rango de la curva de calibracion debe abarcar el rango de las concentraciones esperadas en las muestras problema. No es recomendable extrapolar resultados por debajo del limite de cuantificacion, ni por encima del limite superior de la curva de calibracion. Las muestras problema deberan ser reanalizadas, previa dilucién con blanco de la matriz biolégica, Cuando su concentracién sea mayor que el limite superior de la curva de calibracién. Para Confirmar la validez de los resultados obtenidos en las muestras diluidas, se realizara un estudio del efecto de la dilucién en el que se comprobara la precision y exactitud del analisis de replicados de muestras patron sometidas al proceso de dilucién. La precision, expresada como CV (%) debera ser inferior al 15%, mientras que la exactitud, expresada como ER (%) debera estar comprendida entre + 15%. 2.2.5 Comentarios Aunque el rango y la linealidad de la curva de calibracién se establece en la mayoria de los casos tal y como se ha comentado en los apartados anteriores, existen algunos Procedimientos alternativos que resultan interesantes de comentar: Uno de ellos consiste en obtener el valor de “n” de la funcion y= a + bx". Para poder utilizar una regresién lineal “n" no deberia ser diferente de uno. Otro procedimiento consiste en llevar a cabo una regresién no lineal, ajustando los datos a un polinomio de segundo orden (y= a + bx + cx’) y comprobar Ia significacién del término cuadratico “c’. De forma similar al ¢aso anterior, para poder utilizar una regresién lineal “c’ no deberia ser distinto de cero. También se puede comprobar que la pendiente de la curva de calibracién es estadisticamente diferente de cero a la vez que la ordenada en el origen no lo es. Finalmente, cuando se dispone de replicados de los patrones de calibrado, se puede aplicar ‘un test de Ia falta de ajuste. Este test estadistico Proporciona informacién para evaluar ia Posibilidad de que en algunos casos un modelo no lineal resulte mas apropiado que uno lineal. Si el modelo de regresion escogido es rechazado, se eligiré uno nuevo mas complejo. Dado Que las concentraciones extremas del rango de linealidad pueden originar una falta de ajuste, su reduccion suele resolver el problema. :228 Bioanalisis, Validacién previa al estudio 2.2.6 Ejemplo Aluste de los patrones de calibracion a una regresién lineal sin Ponderar y ponderada por 1/c = a+ bx sin ponderar Concentrac‘én” ~ Relacion de areas ‘Concentracion experimental | ER% delpatron | Recta Recta Recta Recta ‘Reels i Recta | Recta Recta Redta ogi) |S fRaemnr a 2S 5 19.0919 0.0808 0.0788 54 a4 77 85 -37.8 545 3 (GSI C466 0189 4 gore | 84 gS SHS loreseh eee ol ae Sl neat SRemm 2a s[e a gta gaara 0.7228 0.5735 0.6805| 41.2 414, 29 73 36 [1.7787 1.7470 1.5758 | 1010 916 10 48 84 (3.4690 3.4974 3.3662 | 1919 5-47 55 41 7.0972 6.7143 7.2225 4079 1 05 17 20 8.8129 8.0780 8. 4982 01 20 04 ledia | 2.7 420 14.2 JER%|_ Parametro Recta Recla Real es Fie ~0040 0.0298 0.0507 0.0177 0.0164 0.0179 0.9999" 0.9993 0.9995, f 0.9999 0.9986 0.9991 ——L—_0.2999_0.9986 _0,9991_ = a + bx: ponderacién= te Concentracién)' Relacion de areas delpatrén | Recta Recta Recta Concentracion cxperinental ER% Recta | | Recta Recta Recta Recta (ng/ml) 1 2 3 [4 2 a joa 2 3 do [OA6I4 0.1616 o1599) 92 400 98 | a6 on 3% 20° |0.3478 03334 0.3739 | 198 203° 221 | 09 16 103 4 jorze osres amos! aay 37 BL | BP 38, 103 400 1.7787 1.7470 1.5758} 1009 1052 908 } 09 52 95 joo [24890 34974 33662, 1967 2104 924 | a6 fs 28 foo (20872 6.7143 7.2225! 4024 4036 4120 | os o@ 3 500__16.8129 8.0780 8.9939 | 4900 4868 5027 | 0129 or = 1 — Media 26 4.0 43 ! i JER%! | Parametro Recta Recta Recla 2 3 @ 0.0017 9 0.0135, b 0.0176 0.0165 0.0176 r 0.9999 0.9991 0.9992 e 0.9998 0.9982 _ 0.9984 ——1 0.2998 __0.9982 _0.9984_ Nota: EIER % mejora considerablemente con el empleo de la regresion ponderada or 4c,EE LL CTD Validacion previa al estudio Bioandlisis 229 23 Recuperacién 2.3.1 Definicién La recuperacién, también denominada recuperabilidad, se define como la eficacia en la extraccin del analito a partir de la matriz biolégica. 2.3.2 Procedimiento a seg Su calculo se basara en la comparacién entre la respuesta del analito ylo patrén intemo, extraido de una muestra biolégica y la respuesta de la misma cantidad de analito ylo patron interno sin extraer (recuperacion dei 100%). , "i En aquellos métodos en los que la matriz biolégica afecte la respuesta del analito, la recuperacion del 100% sera la respuesta de un blanco de la mattiz biologica extraida, a la que posteriormente se adicione el anaiito. b2 fecuperacién se determinara a tres concentraciones distintas (baja, media y alta) dentro del rango establecido. Es deseable que el método tenga una recuperacién alta, proxima al 100%, pero feuberaciones inferiores al 50% pueden aceptarse siempre que sean reproducibles De forma ideal las recuperaciones de analito y estandar interno deberian ser del mismo orden En los métodos bioanaliticos la recuperacién no es un parémetro relevante, esta ligado a la Sensibilidad y al limite de cuantificacién ,(a mayor recuperacién menor limite de Cuantificacion), pero en ningun caso es un parémetro equivalente a la exactitud 2.4 Exactitud y precision 2.4.1 Definicion ba exactitud es la capacidad del método analitico para proporcionar resultados lo mas cercanos posibles al valor te6rico (valor nominal)230 Bioandlisis Validacién previa al estudio concentracion, * @! nivel superior debe situarse entre el 75-90% del patrén de calibrado de mayor concentracién, Las soluciones del compuesto utiizadas pe breParar los replicados de cada concentracién pueden ser las mismas en | Nees £nsayOS. siempre que se demuestre Ig estabilidad en las Condiciones de almacenamiento. Estas Soluciones se prepararan a partir de une Pesada distinta a la que se utilice para la preparacen de la curva de calibrado. 24.3 Calculos Las concentraciones de los patrones wilzados para el céleulo de la exactitud y precision det método se determinan a partir de la curva de calibrado del ensayo, 53 cxactitud se expresa como ta diferencia Porcentual entre la concentracién media determinada y ta concentracion teéries felativo (ER) % = (concentracién media Geterminada - concentracién tedrica / concentra n teGrica) x 100}. Este calculo se realizara Para cada uno de los tres ensayos utiizando log replicados de cada nivel de concentracion La precision intraensayo del método se calcula erpartir del Coeficiente de variacién {CV (%) = (desviacion estandar / concentracién media eterminada) x 100] de los replicados para conla doternne concentracion en cada uno de los tee ensayos. La precisién interensayo se Getermina a partir del coeficiente de variation de los replicados de los tres ensayos para cada nivel de concentracion, 244 Criterios de aceptabilidad La exactitud intra e interensayo expresada como error relativo porcentual (ER %) debe estar baierendida entre 415% del valor de la concontracion tedrica para las concentraciones baja, media y alta, 2 ilecision intra e interensayo expresada como CV (%) debe ser <15% para las Concentraciones baja, media y alta 2.4.5 Ejemplo A continuacién s © muestra un ejemplo de determinacién de la exactitud Y precisién intra e interensayo:: Validacion previa al estudio Bioandlisis 231 PRECISION Y EXACTITUD INTRAENSAYO: ENSAYO n? 1 Curva calibrado Concentracién ““Relacion | Conceniracion ER a) Curva de del patron de ‘areas ' Determinada Calibrado —ealibrado A gimp 0.04 ugimi —oorsast | goa | gg 0.4 pg/ml 0.182676 0.40 | 02 0.8 pgm | 0.344784 075 57 2 ugiml o89e309 198 hg 6 git 2.736925 5.97 “05 1Oygiml =| 4.632231 10.14 1 ‘Muestras patron de control de calidad ‘Concentracion Relacion Concentracion ER Teorica areas Determinada (%) gi (g/m __ 9.00 4.086178 8.87 4.088942 8.92 4.054136 8.85 4.128685 9.01 4.096457 8.94 4 Media= 8.92 0.9 | CVe 0.71 { j 4.50 2.025861 4.42 2.075186 4.53 2.046993, 447 2.053232 4.48 2.102228 459 Media= 4.50 04 Cvs tat 0.09 0.038022 0.09 0.043910 0.10 0.043377 0.10 0.045187 0.10 0.041586 0.09 ; Media= 0.09 55, C= 6.36 a282. Bioanalisis oo Validacién previa al estudio PRECISION Y EXACTITUD INTRAENSAYO: ENSAYO n?2 Curva calibrade Ceneentracion”~ Relacion Coneantracion ERT Curva de del patron de ‘areas Determinada Calibrado conrad Nees een tie Le 004 ug/ml .021180 0.04 42 O.4ipgimt 0.193723 0.42 Sele 0.8 pgimt 0.358159 077 32 2 povral 0.955192 2.08 39 5 gin! 2.779352 6.06 1.0 10 pgimt 4.523789 9.87 13 —__-177T Muestras patrén de control de calidad Concentracion Relacion Concentracion ERM), teérica areas Determinada eg ——{ug/mi) —— 8.00 4142624 9.04 4.051295 8.84 4.087072 8.92 4.053174 8.84 4.077045 8.90 4.50 1.987028 4.33 2.086066 455 2.085231 4.55 2.035109 444 2.036274 444 4.46 09 9.09 0.042355 0.08 0.043070 0.09 0.044820 0.09 0.040811, 0.08 0.046066 0.09 Medi 0.09 “35 5.19 EtValidacion previa al estudio Bioandlisis 233 PRECISION Y EXACTITUD INTRAENSAYO: ENSAYO n° 3 Curva calibrado Concentracién “Relacion | Concentracion ER (%) Curva de del patron de areas Determinada Calibrado —ealibrado gi) 0.04 igimi 0.018293 0.04 0.4 ygimi 0.176094 0.39 0.8 ygimt 0.343261 0.75 ' 2 pgim! 0.937820 2.06 6 ugimt 2.742558 6.01 02 40 git 4.554989 9.98 0.2 Muestras patron de control de calidad. ‘Concentracién: Relacion ‘Concentracién ER (%) TTeorica areas, Determinada ——tegimy (le — 3.00 ‘ai7776 9.16 4.078038 ass 4147190 9.09 4.073861 8.93 4.147922 9.09 Media: 9.04 05 cv 4.12 450 2.074409 4.55 2.084141 457 2.072863 455 2.058524 451 2.060843 452 Media= 454 09 we os - 0.09 0.039743 0.09 0.045048 0.10 0.043333 0.10 0.038400 0.09 0.037181 0.08 0.0 24 8.67 tr234 Bioandlisis + Validacién previa al estudio RECISION Y EXACTITUD INTERENSAYO (n=15, 3 ensayos) Concentrac‘én Concentracién —_Teorica (ug/r _ determinada (ug/ml) 9.00 8.96 4.44 a - 0.5 450 4.50 1.53 ae 0.0 0.09 0.09 En el ejemplo mostrado en las tablas anteriores se cumplen todos los criterios de aceptabilidad descritos en el apartado 2.4.4 2.5 Limite de cuantificacion 2.5.1 Generalidades —, El limite de cuantificacién (LC) es la minima concentracién de un analito que podemos determinar con une precision y exactitud adecuadas. En un método bioanalitico se considera que el valor de precision debe ser inferior o igual al 20% (CV) y que la exactitud debe Siluarse entre el #20% (ER %). Ademas, deberd ser utilizado como el punto mas bajo del rango en la curva de calibraci6n. En los métodos bioanaliticos, a diferencia del andlisis de impurezas en materias primas y especialidades farmacéuticas, no suele emplearse el concepto de limite de deteccién. 2 2 Procedimiento a seguir : Se prepararén, como minimo, cinco muestras blanco de matriz biolégica a las que se afadiran ta concentracién de analito mas baja de la curva de calibracion y se analizaran Conjuntamente con ésta, comprobandose posteriormente si se cumplen ios criterios de aceptacién, 2.5.3. Criterios de aceptacion $2.precision y exactitud del limite de cuantificacion (LC) debe ser inferior al 20% (CV) y + 20% del valor nominal (ER %), respectivamente Los picos interferentes en los tiempos de retencién de cada analito a cuantificar no deben Poseer un area mayor del 20% del area correspondiente al limite de cuantificacion de cada uno de ellos.Validacion previa al estudio Bioandlisis 235 25.4 Comentarios EI método descrito anteriormente es el mas utilizado y recomendado, resultando Conveniente repetir el procedimiento en tres ensayos distintos, de manera que los criterios de aceptacion se cumplan en cada uno de ellos. Sin embargo, también pueden encontrarse en la bibliografia_ métodos mas complejos, como el método de los intervalos de confianza (Dadgar, 1995) y el método de la curva de calibracion (Chapuzet, 2000), 2.5.5 Ejemplo de verificacion del limite de cuantificacion Patrones de calibracién Precision y exactitud del limite de cuantifcacion Rel. Areas: UC aensayar Rel Areas Conc. Gale. ER(%) (ogi (worm "0.062 - 0.048 0.10 0.206 0.03 0.056 0.028 79 0.30 0.692 0.03 0.071 0.034 145, 1.00 2.323 "0.03 0.072 "''' 0.035 16.0 2.00 4.256 0.03 0.065 0.032 55 3.00 6.681 0.03 0.058 0.029 49 ‘Ecuacin Ge fa recta: Rel. Areas =-0 008623 + 2.231+Cone oa masts Ponderada por 1/Cone’ = aaa an 26 Estabilidad 2.6.1 Generalidades Los estudios de estabilidad incluidos en la validacién de métodos bioahaliticos se han enfocado tradicionalmente desde el punto de vista de la conservacion de muestras congeladas en el laboratorio y de la influencia de los ciclos de congelacién y descongelacion alos que se ven sometidas durante los andlisis. La rutina habitual de trabajo en un laboratorio de bioandlisis requiere una ampliacién de estas recomendaciones ya que existen muchos factores que pueden afectar a la estabilidad, pueden permanecer durante varias horas antes de ser analizadas. Puede consideraree que [a estabilidad de un analito en un fluido biologico es el resultado de sus condiciones vo Pant pain (@ -20°C, a T* ambiente, etc.), de sus propiedades fisico-quimicas, del tipo de Iatriz biolégica, del recipiente en el que se encuentra y de todas las manipulacionese las que pueda estar sometido durante la preparacién de una muestra.236. Bioanalisis Validacisn previa al estudio adecuadamente. Semimportante destacar que los estudios de estabilidad deben situarse de forma racional centro lo due puede considerarse la ‘practica rea" y Ia rutina del labersreiees el andlisis de Plas ean at Por ejemplo, no seré necesario establecer la estabilidad de an analito a un Plazo que exceda el tempo entre la extraccién de la muestra y su andi, 2.6.2 Procedimiento a seguir En este apartado van a describirse los estudios de establlidad que deben considerarse en un protocolo estndar de validacién: 26.2.1 Estal 'dad durante el proceso de congelaciénidescongelacion 2.6.22 Estabilidad durante el procesado de la muestra 2.6.2.3 Estabilidad durante et almacenaje de las muestras congeladas hasta el momento de su anilisis. 26.2.4 Estabilidad de las soluciones patron 2.6.2.5 Estabilidad de las muestras en el inyector automatico, Es aconsejable que en todos los estudios de estabilidad se utlicen soluciones patron recién coeearaas. ya sea en la matriz biolégica correspondiente y previamente chequeada Para Gescartar cualquier tipo de interferencia, o bien en el solvents determinado on ef cece de las foluciones patron de trabajo (soluciones acuosas, metandlicas, ete) Las muestras de control de calidad deben prepararse en la matric biolégica al menos a dos mratcartraciones diferentes, una concentracién baja (cercana al limite de cuantificacion del método) y otra alta (cercana a la concentracién del patron de callbrado de mayor moda yan). Resulta una practica habitual la utiizacién de una concentracion baja, na media y otra alta Se aconseja estudiar la estabilidad de las muestras durante tres ciclos de congelacion y descongelacién. Para ello, deben prepararse muestras de control de calidad y someterlas al proceso de congelacién a -20°C o bien a la temperatura a la que eslardn almacenadas ireEL —————— Ses Validacion previa al estudio Bloandilisis 237 Existe otro procedimiento basado en analizar Ja muestra de control de calidad Ginediatamente después de su preparacién para obtener un valor basal que s¢ illicens como referencia en lugar del valor teérico. El procedimiento mas frecuente es al siguiente Inmediatamente después de la preparacién de una muestra de contro! de calidad se analizan tres alicuotas para obtener el valor basal y se somete al resto de ls muestra a la RECUPERACION MEDIA + DE RELATIVA AL CONCENTRACION BASAL TERCER CICLO MEDIA+ DE acerca ie ee ieee - BASAL (%) Resultado 10 ‘esuilado2 Media #DE, Resultado a4 DEs edie Baja Resultado2 Media 1+DE, Resultado 11. Media 4 + DE, i yy Resultado 3 Resultado 12 medial Resultado 4 Resultado 13 Media Resultado S Media2+DEr Resultado 14. Media § + DEs Resultado 6 Resultado 15 Resultado 7 Resultado 16 Ata Resultado 8 Media3 DE; Resultado 17 a on Resultado 9 Resultado 18 media Cabe destacar que los controles de, calidad pueden estar dispuestos en alicuotas Gistribuidas en varios tubos o bien en un solo tubo con cantidad sufieiente ge muestra para Satiaer arias alicuotas. En el primer caso se someteran todos los tubos a los tres ciclos de congolacion/descongelacién, mientras que en el segundo caso es un unico tubs e que se somete a este proceso. +2, Estabilidad durante el procesado de la muestra {res alicuotas de cada una de las muestras de control de calidad deben mantenerse a Semperatura ambiente, o a la temperatura de trabajo, durante un periode de tiempo igual 0 26.2.3 Estabilidad durante e! almacenaje de las muestras congeladas hasta el momento de su analisis .Haitian SIs Validacion previa al estudio 2.6.2.4 Estabilidad de las soluciones patron fealizacion de pruebas de estabiidad innecesarce, Existen muchas recomendaciones que pueden tenerse en cuenta para optimizar ovis Pruebas, muchas de las cuales se Bape aon en la conferencia de la “American Association of Pharmaceutical Scientist, AAPS" celebrada en Washington durante el moe ge, enero de! 2000. Entre las recomendaciones mas relevantes se encuentran las siguientes: No Sse considera que sean necesarios estudios de estabilidad adicionates a los ya realizados on la validacién de un método analitico en los Siguientes casos:Validacién previa al estudio Bioandlisis 239 Cambios en el material de vidrio tipos de recipiente en el que se encuentren las muestras biolégicas. Cuando se usan diferentes sales de un mismo anticoagulante en la obtencién de muestras de plasma En casos de transferencia entre laboratorios, siempre y cuando no se produzca ningiin cambio metodolégico. Cuando se mejora de un método analitico previamente validado. Debe evaluarse de nuevo la estabilidad cuando: * Existe un cambio en la matriz biolégica (plasma, sangre, orina, etc.) 0 de especie animal, aunque e! método analitico sea el mismo. Aunque no resultan habituales los problemas de estabilidad debidos a cambios en el tipo de anticoagulante presente en una muestra plasmatica, resulta aconsejable comprobar que el nuevo anticoagulante_no produce ningun efecto sobre la estabilidad deVlos analito/s. Finalmente, cuando un mismo método analitico va a ser utilizado en varios estudios de forma rutinaria, pueden prepararse y congelarse lotes de tubos con patrones de calibrado en la matriz biolégica correspondiente (convenientemente etiquetados segin su concentracién, el volumen de la alicuota, la fecha de la preparacion, etc.). Este procedimiento resulta muy practico ya que estos patrones de calibrado unicamente tienen que descongelarse para ser utilizados de forma rutinaria durante los sucesivos dias de andlisis. Naturalmente, solo puede llevarse a cabo después haber realizado los estudios de estabilidad descritos en anteriormente, y de haber demostrado convenientemente la estabilidad durante el proceso de congelacidn/descongelacién y durante su tiempo de permanencia a -20°C 0 bien a otra temperatura de congelacion.240. Bioanaiisis Validacién durance el estudio 3. VALIDACION DURANTE EL ESTUDIO 3.1 Definicion y generalidades Después de llevar a cabo la “validacién previa al estudio" (también denominada pre-estudio) ampliamente descrita en los apartados anteriores, ios mismos pardon estudiados deben estado ee Comtfolades durante el andlisis rutinario de las muccting analiticas de un rats. Dada la complelidad de la mattiz, y frecuentemente ack Procedimiento de dal mraGnto de ta muestra previo al analiss instrumental, se requiore ce validacién continua gel método analitico mientras éste se aplica. Este control corresponde a la denominada Sadacién durante el estudio" y es el que debe asegurar Io cena de los resultados earenigos en la cuantificacién de analitos en matrices biologicas, La “validacién durante el csudio” se realiza mediante curvas de calibracién y muestras contra oc calidad analizadas Sorluntamente con las muestras problema, El criterio establecido de aceptacién o rechazo de los resultados analiticos obtenides se basa en la exact 32 Concepto de serie analitica o ensayo de lote de muestras Se define como tal el conjunto de muestras formado por al menos una curva de calibracién identica a la utiizada en ta validacién pre-estucio, muesttas de contol ae calidad y muestras Problema, procesadas conjuntamente. §, hlimero de muestras’ de control de calidad analizadas debe situarse entre un 5 % y un 20 % del nlimero total de muestras problema incluidas en una eerie, Normalmente, el minimo numero de muestras de control de calidad en cada serle analition debe ser 6 (2 de Concentracién alta, 2 de concentracién media, y 2 de concentracion baja) Con un mismo instrumento, y en un mismo dia, pueden analizarse mas de una serie analitica si el tiempo de analisis lo permite, 3.3. Estabilidad 2s muestras problema deben ser analizadas durante el perlodo conocido de estabilidad de los analitos en la matriz biologica, 3.4 Curva de calibracién Se deben analizar las muestras patron necesarias para poder establecer la curva de alibracion de la serie analitica, El minimo numero de patrones de calibrace Para definir ta Fee 8 “alibracion debe ser 5 (excluyendo la muestra cero y el blanco’ de I matriz biolégica) {La concentracién abtenida para los patrones de calibrado considerados, debe presentar una Gesviacién respecto al valor de la concentracién nominal dentro del # 15% (#20 % para el palr6n de concentracién mas baja). Si alguno de los patrones extremos (ella o bajo) de a Fame haste Te et stiterio de aceptacion, podra no ser considerado, restringiéndese. ala Validacién durante el estudio Bioandlisis 241 3.5 Limites de cuantificacion Quedan determinados por las concentraciones extremas de la curva de calibracién. No se deben realizar extrapolaciones fuera del rango establecido 3.6 Exactitud La exacttud se valida mediante el anélisis de muestras de control de calidad, como minimo @ 3 concentraciones diferentes, realizando 2 replicados a cada concentracion El ctiterio de aceptacién de una serie analitica, basado en la exactitud de las muestras de fontrol de calidad es el siguiente: la concentracion obtenida para como minima el 66 % de las muestras de control de calidad debe situarse dentro del intervalo limitado por un # 20 9c de desviacién respecto a la concentracién nominal. En un mismo nivel de concentracion. no mas del 50 % de las muestras de contro! de calidad pueden desviarse de los limites mencionados. Este criterio coincide con el abreviado con la nomenclatura “4/6/20%", En el informe del estudio deben figurar los parametros que definen las curvas de calibracién oblenidas, los resultados de las concentraciones recalculadas ("back calculated") de los Patrones y los resultados de las muestras de control de calidad. 3.7 Ejemplos 3.7.1. Ejemplo 1: serie analitica aceptada Muestra”Concentracién nominal Concentracion caloulada ~~ ER ——{ngim)) _ (ng) %) sTD1 o4 0.119 19.0% sTD2 05 0.46 8.0% STD3 2 1.98 1.0% sTD4 8 812 15% STDS 25 42.40 68.4% (1) sTD6 40 4150 + 3.8% QcH 35 34.20 | 2.3% cH 35 33.80 “3.4% acm 35 4.00 14.3% acm 35 4.23 20.9% * act 0.35 027 22.9% * act 0.36 0.40 14.3% St 4% ‘STD: patron de catiorado CH. QCM, ACL muest (3) no tenia en cuenta p "ERD20% ‘2s de control de caldsd de concen ara consti i curva do calibra Wracien alta, media y baa, respectivamente,242. Bloandiisis Validacién durante el estudio La serie anaitica es aceptada dado que 2 muestras de control de calidad (sefialadas con un asterisco) se desvian mas de un 20% de su valor nominal, pero en distinto nivel de Feeamfiacion. El patron STDS ha sido excluido de la recta de calibracion Por presentar un resultadg aberrante. 3.7.2. Ejemplo 2: serie analitica rechazada Muestra“Concentracion nominal Concentracion caleulada ER — ——Lrgim) agin) —%)_ stD1 04 0.091 91.0% STD2 05 0.47 6.0% STD3 2 2.10 5.0% sTD4 a 7.90 1.3% sTo5 25 26.20 4.8% sTb6 40 38.60 3.5% ack 35 34.20 2.9% cH 35 27.20 “22.3% * acm 38 4.00 14.3% acm 35 4.23 20.9% * ct 0.35 0.27 22.9%" act 0.35 0.40 14.3% SYD pavon eo catbrado PERO QC: mucsras do conto de caked de céncentraciin ata, media y baa, espectvamente NERSZO% £2 Serie anaitica no puede ser aceptada dado que 3 muestras de control de calidad (sefialadas con asterisco) se desvian mas de un 20% de su valor nominal 3.7.3 Ejemplo 3: serie analitica rango restringido ‘Muestra“Concentracién nominal Concentracion calculada ER — —Lngimt) (ngim!) ______(%) sTO4 O41 0.091 9.0% sTD2 05 0.47 6.0% sTD3 2 214 5.5% stD4 8 7.90 1.3% STDS 25 26.20 4.8% sTD6 40 24.27 46.8% (1) ach 35 34.22 2.2% ach hin 35 "36.20 3.4% acm 36 4.02 14.9% acm 35 3.60 2.9% 0.35 0.27 22.9% tas de conto de calidad de concent (1), no tengo en eventa para constr a cunea de caltracion "ERD20% (9060 alta, media y baja, respectvamenteEE:C" TTI Validacion durante el estudio Bioanalisis 243 En la tabla siguiente se muestra un ejemplo que pretende ilustrar las consecuencias dela exclusion del patrén de calibrado de concentracion mas alta (40 ng/ml) no haya sido considerada en la construccién de la curva de calibracién por presenter on resultado aberrante (tabla anterior). El rango queda restringido a 0.1 - 25.0, debiendose reanalizar todas las muestras que hayan presentado resultados de concentracion superiores a 25.0 ngiml. La serie analitica se acepta dado que las muestras de contol de calidad cumpien el criterio de aceptacion: eee: Concentracion ese Concentracion : (git) ne ‘no detectado +30% del valor original: queda a criterio del Director de! estudio (no se proporciona ningin resultado, se acepta el valor mas coherente con el perfil farmacocinético 0 toxicocinético, etc.) . ‘ » Si se ha podido realizar el reanalisis Por duplicado, el criterio puede ser el descrito en el Siguiente esquema: ORIGINAL + 2 REPETICIONES iferencia entre los Diferencia entre los luplicados >30% duplicados < 30% peti el rednalisis Media del duplicado Media del duplicado Error en uno de los si €s posible) oa S$ 415% > 218% dos resultados del iterio del Director de 1p Cuando se conoce de antemano el signo dé una posible diferencia entre dos parémetros debe adoptarse un test unilateral antes de proceder al analisis estadistico. En los casos dudosos, cuando no se pueda dar preferencia al test unilateral o al bilateral, hay que aplicar este ultimo, Ademas, cuando la diferencia entre los dos factores es significativa con una Prueba bilateral lo sera aun mas con una prueba unilateral. Asi pues, es aceptable la actitud conservadora de aquellos analistas que sistematicamente utiizan pruebas bilaterales ya que S\aplicaran pruebas unilaterales las diferencias encontradas serian aun mas significativas. 4.3 Errores tipo ly Il. Riesgos «yf Muchas de las técnicas estadisticas se basan en la inferencia en la poblacién de los valores de una muestra escogida aleatoriamente de esa poblacion. Para interpretar las inferencias csladisticas, el analista debe especificar los niveles de aceptacién de error y el riesgo estadistico que en ciertas situaciones pueden ser cuantificados. : El modo de aproximacion mas comin es determinar el error tipo I. El error tipo | se produce Cuando la hipétesis nula es cierta y se rechaza. La probabilidad de cometer este error se lama riesgo «.. La probabilidad complementaria 1-c se llama nivel de confianza, Definiendo un riesgo a, el analista fija los margenes admisibles de error especificando la probabilidad de concluir que la significacién existe cuando en realidad no existe. Una Practica muy comin es fijar un riesgo a de 0.06, sin embargo, este nivel no es estrictamente requerido en todas las situaciones. Este valor de riesgo a se ha extendido de forma importante debido a la disposicién de tablas para este nivel. Al especificar el error de tipo |, el analista también determina ur error asociado, denominado error tipo Il. El error tipo ll se produce cuando la hipétesis nula no es cierta y se acepta La probablidad de cometer este error se llama riesgo B. La probabilidad complementaria 1B se llama potencia. Realidad Ciera 1-0 Decision correcta B Error tipo I a | 1B | Deci 4.4 Potencia de una prueba La potencia es la probabilidad de rechazar correctamente la hipdtesis nula cuando debe ser rechazada y es la potencia la que establece la probabilidad de éxito en la busqueda de las diferencias si es ue realmente existen.264 Estagistca aplicada La potencia esta déterminada por 4 factores: * Error tipo 1. Lot errores tipo 1 y Il estén rwersamente relacionados, y a medida que el sorok tipo | Se acerca a cero, el ertor tipo Il aumema Por tanto, al disminuir el error Se reduce la potencia de la prueba estadistica Ja ue ucea! 22! efecto que tiene relevancia analitca es importante ya que puede existir si Efecto. La determinarta ono onificacién en una prueba estadistica y sin embargo Carecer de relevancia analitica. Cuando el efecto ce cl efecto puede ser muy pequerio y reduce la potencia se reduce. Si Se reduce a, aumenta 8 y se reduce la Potencia (1-8). Si se reduce el efecto (d), aumenta B y la potencia Se reduce (1-). Si-se aumenta n (tamafio de la muestra), las 4 Guivas se hacen mas estrechas (se reduce la Gesviacién estandar), se reduce By aumenta (1, 8). Ho : hipétesis nula Hy : hipétesis alternativa 4d: diferencia ©: Error tipo I ( falso positivo ) B : Error tipo I! (talso negativo) 4.5 Tamajio de la muestra qeuce, ha comentado que el numero de elementos incluidos en un estudio influye Grectamente sobre la potencia. Por ello, a'planificar my estudio estadistico es indispensable Gelerminar e1 numero de elementos para tener ua Potencia suficiente (habitualmente, se acepta que debe ser como minimo del 80%), Para el calculo del tamafio de una muestra hay que definir los siguientes elementos: + Especificar la hip6tesis precisando si es unio bilateral, * Establecer el error tipo 1. Suele aceptarse un riesgo «del 0.05, * Fistablecer el error tipo il. No existe un acuerdo Sobre el. valor mas apropiado. Normaimente se situa entre el 5 y el 20% + Definir la magnitud de la diferencia, efecto 0 asociacién, que se desea detectar, * _ Definir un valor para la variabilidad de la variable a estudio,Estadistica aplicada 265 De estos cinco elementos, sélo el ultimo debe ser conocido, ya que los otros cuatro son flados por el analista utiizando su propio criterio o a partir de una informacion previa, A continuacién se aplica la férmula correspondiente, que depende de la prueba estadistica que vaya a ser utilizada en el andlisis. Las formulas para el calculo del tamafio puedeh resultar algo complicadas, por lo que es tecomendable utilizar tablas 0 un software estadistico. ‘Acontinuacién, se expone el calculo del tamafio de la muestra en diferentes situaciones * Numero de elementos para la estimacion de una media donde ¢ =p Si la variancia de la poblacién es desconocida y se estima a partir de una muestra, la formula a utilizar es: n= tamafio de la muestra 2u2 = valor de z correspondiente al riesgo a fijado (bilateral). %= valor de z correspondiente al riesgo B fijado (unilateral), valor minimo de la diferencia o efecto que se desea detectar. Los valores de z son: Riesgo aop Bilateral unilateral Ejemplo 1: Se debe analizar un lote de comprimidos a partir de una muestra representativa Gel mismo (n=20 comprimidos triturados y mezclados). Calcular el numero de replicas necesario para hallar la riqueza cumpliendo las especificaciones. Datos: Contenido de principio activo por comprimido: 125 mg Desviacion estandar del método analitico: 2.0 mg Limite de aceptacion: 95-105% (1256.25 mg) Riesgos: 1 (potencia 0.90) Resolucién: (1.964 1.28) x 1o7= (2sx0.05y También es posible utilizar la siguiente ecuacion:266 Estadistica aplicada lo (1.96 41.28) x a variacién y e, la desviacién en porcentaje permitida 1.07 ' siendo CV, el coeficiente de Por la especifigacion, Pia esviacion estandar del método no se ha obtenido con una validacién formal sino a partir de una estimacién puntual se utiliza la eouacion corregida’ formal FOSX Zh = 0.96+1.28) — +. 0.51.96 : (125x0.05F * Numero de elementos Para la estimacion de una media prefijado un nivel de confianza (1-a). ap Eiemplo Se prepara un subestandar de analito para un método de HPLC y se desea que Su riqueza respecto al nominal no se aleje mas del 1% con un nivel de confianza del 95 % (00.08). Si el Coeficiente de variacion del método analitico es de 1.2%, ecual sera el minimo de réplicas necesario para cumplir con este requisito? Si la variancia de la Poblacién es desconocida y se estima a partir de una muestra , la formula a utilizar es:SSE ‘= Te Estadistica aplicada 267 Donde: I= tamafio de la muestra 22 = valor de 2 correspondiente al riesgo a fjado\bilateral) 2s valor de 2 correspondiente al riesgo f fjado (unilateral) valor minimo de la diferencia 0 efecto que se desea detectar. Eiemplo 3: ona diferencia minima de 10 minutos cuando se alcanza un 75 % de disoiice, idad de error | (a) que se esta dispuesto detec 1S e0 0.08 ¥ se desea tener una capacidad del 99 % (fa Gelectar la diferencia, si existe realmente, Dado que se desea evalier qué pauta es mas eficaz, se trata de una hipotesis bilateral Resolucion 102 +50] oF =2x( 9642.33) x54 05x19 Let Por tanto, son necesarios 11 comprimidos por formulacién, es decir, que en total eben incluirse en el estudio un minimo de 22 comprimidos 46 Identificacién de datos atipicos contrario hay que utilizar métodos estadisticos. La eleccién de! método estadistico para la identificacién de datos atipicos esta condicionado por el tamafo de la muestra. La probabilidad de obtener a valor atipico es tanto mas Pequefia cuanto menor sea el tamafio de la muestra, Para muestras superiores a 25 elementos podra considerarse un valor atipico si se Oe aoe, eta del dominio * 42, El intervalo (42s) engloba, en ka distribucién normal, el 95.46% de todos los valores Para muestras 0 grupos de muestras <25 puede emplearse el test de Dixon. Este test tiene como finalidad identificar si un valor del que se sospecha que es excepcional procede de268. Estadistica aplicada luna Poblacion distinta que los demas valores de la Muestra, Para el caso de una muestra, '0s valores individuales que componen la muestra se crdacne Ejemplo 4: 1) Paca la serie de valores 60. 61.2, 61.8, 62.2, 63.4 y 67.5 se sospecha que el 67.5 es un dato atipico. Para n=6 2) Pera la serie de valores 414.7, 398.8, 394.2, 393 4, 392.8, 392.7 se Sospecta que el 414.7 es un dato atipico, XM; =%41)_ 414.7-305.8 =6 pee Para w 414.7=392.7 0.859 > 0.560 ( 05) Se considera el valor 414.7 como un dato atipico Porque su nivel de significacion es <0.05,SES EESYV”lWTZ Estadistica aplicada 269 9.8 = 0.583 16.8 El valor en la tabla H para n=5.y k=3 es 0.563 (a=0.08). For tanto, se puede identifcar el valor 88.6 del grupo 2 como posible candidato de valor atipico por generar una diferencia significativa entre low rangos de los grupos (p<0.08), Siempre que se identifiquen y se eliminen valores atipicos en una muestra, ha de indicarse y justificarse en el informe del estudio. 4.7 Pasos basicos para verificar una hipétesis Se introduce de forma elemental la estrategia a desarrollar en la comprobacién de hipotesis. Los pasos basicos son los siguientes: a) Formular la hipétesis nula. La hipotesis debe ser planteada antes del inicio del estudio y hay que definir si es unilateral o bilateral. La prueba unilateral sélo se plantea cuando tiene interés el signo de la diferencia esperada. b) Definir un estadistico de prueba y su distribucién de probabilidad suponiendo que la hipétesis nula es cierta. La validez de la prueba de hipotesis depende en gran parte de ue este paso se implemente de forma adecuada, L ar la probabilidad maxima a de que la prueba rechace la hipétesis nula cuando Esta decision se basa en un compromiso entre el coste de la prueba yelde tuna condlusién incorrecta, 9) Determinar la potencia. Como Ia potencia esta felacionada con a, la vafiabilidad de la Poblaciép (0), el tamafo de la muestra (n) y el efecto, su ealeulo depende de definir pag’ valores. En muchas situaciones para aumentar la potencia, 1o pico que cabe hacer es aumentar el tamario muestral. mE ®) Llevar a/cabo la prueba. Por ejemplo, seleccionar aleatoriamente lof elementos de una Te getra: deteminar el valor de la variable en cada uno de ellos y realizen of analisis de los datos. | Uegar a una conclusion estadistica. Se debe expresar las conclusiones en términos de Techazo o de no rechazo de la hipotesis nula61 ES8iktiioics yuiicada 5. DISTRIBUCION DE PROBABILIDADES. DISTRIBUCIONES CONTINUAS: LEY NORMAL, TEST DE NORMALIDAD, t-STUDENT. CHI-CUADRADO Y F-SNEDECOR. DISTRIBUCIONES DISCRETAS: LEY BINOMIAL, LEY BINOMIAL NEGATIVA Y LEY POISSON Una distribucién de probabil ‘elaciona los valores de una variable con su probabilidad de currencia en la poblacién. La distribucién de probabilidad es un ente abstracto (modelo matematico) y, como todo modelo, esta. sometido a la afirmaciin de Box: Todos loc ‘modelos son falsos, algunos En este capitulo se presentan las distribuciones de Probabilidad mas relevantes desde un Punto de vista conceptual y que pueden resultar de. utilided en diferentes situaciones practicas Principalmente hay dos tipos de distribuciones de probabilidad: * Distrbucion continua. Las distribuciones de probabilidad continéa son utilizadas para modelar situaciones en las que la variable de estudio es une variable cuantitativa continua. (ley Normal, Student, Chi-cuadrado, F-Snedecor, etc.) * Distribucion discreta. Las distribuciones de probabilidad discreta son utilizadas para model situaciones en las que la variable de estudio es una variatie cualitativa binomial, (ley hipergeométrica, binomial, Poisson, etc.) 5.1 Ley normal ba ley Normal fue descubierta por Abraham de Moivre como limite de un modelo binomial fos errors cue potenciado por Laplace y especialmente por Gauss en sus estusion sobre ‘0s errores de medicién en astronomia. Este modelo es aplicable cunsdan * bos valores se distribuyen en torno a su valor medio, de forma que la mitad esta por encina de la media y la otra mitad por debajo (distribucién simetrica) + La mayoria de id valores se encuentran agrupados en torno a la media, la probabilidad de aparicién de un valor va disminuyendo a medida que se aleja de la media Fn estas condiciones se dice que una variable aleatoria Y se distribuye segin una ley Normal de parametros yy 6 (Y ~ N (, «)) cuando su model matematico viene dado por la ecuacién: Donde: e=2.718 3.141 11 = media de la poblacién desviacién estandar de la poblacionPuede llegar a invalidar el test El primer analisis a realizar para evaluar la normalidad de los valores de una muestra son los graficos de probabilidad normal. Estos gréficos se construyen a Partir de fa distribucion orma) acumulada que define una escala especial en el eje de ordenadas (y), Eeloe graficos Peru nPatar la distribucién acumulada de los valores de la muestra con la diicienc, Sgeada de una distribucién normal. La distribucion normal sigue una lines recto on diagonal, de tal forma que cualquier diferencia de los valores de la muestra ee manifiesta ‘como una desviacion de la linea recta. Si una distribucién es Formal, la linea que representa la distribucion real de los datos sigue de cerca la diagonal Como la interpretacion de cualquier grafico tiene un caracter subjetivo es necesario completar este analisis visual con test 40 de ple pe vo U29 pede pede is it aiidee ieee aren Rie Sara estadisticos especificos. oor BMI, Los test de normalidad tienen como hipétesis nula (He) que los valores de la muestra siguen una fe . distribucién normal frente a ta hipétesis alternativa (H,) de que no siguen una distribucion Formal. Todos los test calculan el RaeeRnhioaiaee nivel de significacion para las diferencias respecto a una distribucién normal pero: siguiendo dos enfoques sas 99.997 diferentes. Los test de Kolmogorov-Smirnov y de 90.65 Anderson Darling estén basados en la _comparacion de las om diferencias entre la distribucion acumulada de los valores de la 113 muestra y la distribucion acumulada que se obtendria en el 50 supuesto que —siguiera exactamente una ley Normal de ise media yy variancia o? Los test de Ryan-Joiner y de Shapiro-Wilk 228 estan basados en Ia correlacion de funciones de distribucion 013s acumulativa. En ambos casos, el supuesto de normalidad sélo se aplica a la poblacién y se espera #40 ut2e e304’ Ue haya pequefias desviaciones de ella en las muestras aleatorias272 Estedistica aplicada Ejemplo Se quiere estudiar, mediante la prueba de Kolmogorov-Smimov, ta normalidad e108 valores del contro! de dosificacion de una solucion (volumen nominal ae mi. Datos y resolucién: er Datos Probabilidad Volumen | Datos evince Probablidad eee mi ordenados x acumulada > e cum () N Dep 9) 9) 5 ) 8-8 ass orate ars ara 156 43.8 1.32553 0.092498 _2"~0. 14286 0.0803690 146 44.1 -0,96635 0.166934 3 0.21429 —o.oa7a516 188142" -0.84663_ 0.198601 4028571 ooast oe 154 44d -0.60718 0.271867 5 0.35714 0.082766 137 146 0.36773 0.388538 6 0.43867 ors 153 147 -0.24800 0.402068 7.50000 -~0-0878336 42 44.9 0.00855 0.496588 8 ~0'57143 00748405 14.1 15.3 0.47035 0.680947 9 0.64286 0.0380898 138 18.4 0.69007 0.722429 10 0.71429 —0.0081436 144 186 "0.82962 0.786596 11 785710 0108817 149 15:7 0.94925 0.828753 12 0.857140 0283800 147 18.8 1.06897 0.857459 13 0.92887 O0Tit12t 16.5 16.5 4.90708 0.971743 44 1 _0.0282571 n Se puede deducr do la tabla At Se acepta la hipétesis de normalidad de la distribucion porque el nivel de Significacién del valor Dmux = 0.098 para una muestra de 14 elementos es Superior a 0.1 (véase la tabla F). Normal Probability Plot Probability ne Me 186 168 VolumenEstadistica aplicada 273 Si sabemos que una variable se distribuye segun una ley Normal y conocemos su media y Su desviacién tipo, el célculo de probabilidades se realiza mediante un cambio de variable, De forma que si tenemos: x~N (u, 9) Se pasa a una variable z: X=H ar, La distribucion de esta nueva variable (2) se le denomina ley Normal estandarizada y tiene Be han eta ep ceswiaci6n tipo 1 (z ~ N (0, 1)). Al ser esta distribucién siempre la mists se han podido tabular las areas que dejan a la derecha cada uno de los valores de z (areas de cola). De esta forma, el calculo de probabilidades en cualquier distribucion Normal se reduce a un Proceso del tipo: * Caloular los valores de z que corresponden a los valores de x que definen el area a determinar. * Con la ayuda de las tablas, determinar el rea definida por los valores de 2, Esta area es 'a que corresponde a la probabilidad buscada. Ejemplo 7: Las especificaciones para el volumen de una solucion son 1040.5 mi, A partir de foceso de fabricacion se obtiene una iacion tipo de 0.17 ml. ‘Si-cada.unidad fuera de especificaciones cuesta 50 ptas, qué ahorro medio {coste de no calidad) se obtendra al fabricar un lote de 40000 unidadse cen el Proceso centrado en el valor nominal en lugar de seguir centrado en 9.8 mi?, Resolucion: Yeamos cuantas unidades defectuosas se fabricaran con el Proceso centrado en 9.8 mi, 105 =98 4 1 22 = 4.12 = area de cola = 0 0.17 2 238 = 1.76 2: =-1.76 = drea de cola = 0.0392 Proporcién de unidades defectuosas: 0.0392 Sin embargo, si el proceso esta centrado en 10 mi el Conjunto de unidades defectuosas sera: '274 Estadistica aplicada 2 = 2.94 => area de cola = 0.0017 Como et area de las colas @s la misma, la proporcién de unidades detectuosas es: 0.0017 x 2 = 0.0034 Por tanto, en un lote de 40000 unidades tendremos, en Promedio: Unidades defectuosas con el proceso centrado en 9.8 mi: 40000 x 0.0392=1568 Unidades defectuosas con el proceso centrado en 10 mi: 40000 0.0034 = 136 La diferencia de unidades defectuosas es: 1568 ~ 136 = 1432 El ahorro medio centrando correctamente el proceso sera de: 1432 x 50 = 71600 ptas por cada lote de 40000 unidades, Sila distribucion de ta poblacién es y ~ N (1, 6) , a distribucién de la media muestral tiene como parametros: siendo n el tamafio de la muestraEstadistica aplicada 275 Esto significa que los valores de las medias muestrales tienen una dispersion en torno a la media poblacional menor que los valores individuales (tanto menor cuanto mayor sea el tamafo de la muestra). Esta propiedad de la media muestral es muy utilizada en el control estadistico de procesos (SPC), ya que controlando las medias tenemos mayor probabilidad de detectar desviaciones que mediante observaciones individuales. 5.2 _Distribucién t-Student La ley Normal queda perfectamente definida por la media y la desviacién tipo de la Poblacion, pero en muchas situaciones practicas no se conoce la desviacién tipo de Poblacién y sélo se dispone de muestras pequefias (n<30), Bajo ciertas hipotesis, se puede sustituir 6 por una estimacién de s que, si se obtiene a partir de una muestra suficientemente grande, tomara un valor proximo a ¢. Puede definirse un nuevo estadistico t i siendo n el tamafio de la muestra. Gaistribucion de estadistico t se le conoce como distribucién de {-Student y representa la tistribucién de la media muestral cuando la desviacién tipo de la poblacion es desconocida La forma de la distribucion t depende del grado de incertidumbre de s*, que se mide por los grados de libertad (v=n-1) en los que se basa s?. Cuando el tamafio de la muestra es pequefio, la posibilidad de variacion de s* implica mayor Probabilidad de variaciones externas y cuando el tamafio de la muestra es infinite ne hay incertidumbre en la estimacion de s*y la distribucién t se convierte en Normal. La ley Normal nos da una aproximacién razonable de la distribucién t cuando n>30. 5.3. Distribucién Chi-cuadrado y2 La distribucién de Chi-cuadrado representa la distribucién de la variancia muestral yse Puede demostrar que : 2 @-)5 Se distribuye segun una ley de x? con n-1 grados de libertad o Ejemplo 8: ’ EI peso de un proceso de llenado de polvo es una variable N(200,7). Se introducen ciertas modificaciones en el proceso y una vez efectuadas, se extrac una muestra de 20 unidades cuyos pesos en mg resultan ser 203.0, 198.9, 191.5, 202.1, 202.6, 198.3, 201.3, 193.1, 201.4, 204.1, 203: 198.8, 209.8, 199.5, 195.5, 198.5, 198.8, 201.2, 197.1, 204.4,276 Estadistica aplicada, . Con una confianza del 95%, zse puede asegurar que las modificaciones han Teducido la variabilidad del proceso? Resolucion: Lavariancia de la muestra es s? = 17,14 a Variancia muestral se distribuye segin Por tanto: = (n=1) o Xe La probabilidad de obtener un valor menor 0 igual de 6.65 en una distribucion de XC con 19 grados de libertad es de 0.00414 (nivel de signiticacién < 0.05) . luego Si puede decirse con una confianza del 95% que las modificaciones han Feducido la variabilidad del proceso Este ejemplo también se puede resolver calculando el intervalo de confianza Seguin las formulas del apartado 3.3: s(Qv-1) 17.14x (20-1) inferior: OD 9.92 Limite nein Soa *m=1)_17.14xQ20-1 Limite superior: =). V.14x(@0~1) _ 36.55 Xow, 8910 reducido la variabilidad del proceso. 4 Distribucin F-SnedecorI Estadistica aplicada 277 En el caso particular en que s La distribucién del cociente de 2 variancias muestrales (87 1°33) de una misma poblacién Normal sigue una distribucion de F con n,-1 y nz-1 grados de libertad. 5.5 Ley binomial La distribucion binomial es aplicable en experimentos caracterizados. Por la siguiente situacion: * Se realizan n experimentos independientes * Cada experimento tiene sélo dos resultados posibles * En cada experimento la probabilidad de “éxito” (hay que definr el resultado de interés de tin Suceso determinado) es constante y es p, por tanto, la de “fracaso” es 1-p Si Se cumplen estas condiciones, el numero de éxitos que se obtienen al realizar n CirenaeMes eS una variable aleatoria que sigue una distribucién de probabilidad llamada binomial. La probabilidad que 1a variable tome un valor concreto x al realizar n experimentos, con una Probabilidad de éxito p, se representa de la forma b(x,0,), y es igual a: b(x,n, p) = es 3 Ejemplo P'- py * éCual es la probabilidad de aceptacién del ensayo de esterlidad de un lote con un Porcentaje de contaminacién del 0.1% si se ultiizan 20 unidades muestreadas de forma aleatoria? * En este enunciado se ha omitido 0 supuesto una informacion necesaria para su Fesoluci6n, ¢cual es? * GCual es la probabilidad de aceptacién del ensayo de esterilidad de un lote con un porcentaje dé contaminacién del 0.1 % si se utiizan 20 unidades de 10. tal muestreadas de forma aleatoria y s6lo se utilizan 5 ml por unidad? Resolucion: baxmp) Ger) P'-py x=0; n=20; p=0.001 5 (0, 20, 0.001) = 0.9802276 Estadistica apticada * Elvolumen de cada unidad empleado en el ensayo. nt * b(xn,p)=—" “d-py (x. p Hoa? tr x=0; n=20; p = 0.001x 100 0.0005 _— 200 (0, 20, 0.0005) = 0.99 lote en esta situacion. En este ejemplo is Probabilidad de equivocarse al aceptar tun Tote con un porcentaje de contaminacion del 0 1%¢ 5 superior a 0.98. 5.6 Ley binomial negativa El interés de esta distribucién radica en que es utlizada en situaciones en las que el tamafo de la muestra o el niimero de experimentos ne esta establecido por adetantado, sino que se determina a medida que avanza el experimento, 5.7 Ley Poisson Si en una distribucién binomial con parametros n YP se hace que n tienda a infnito (nes) y Pa-cero (p-+0), de manera que np=) permanezca constante, ee deduce que: Lim b(n. p)=e* © = ps.) con A= nxpEstadistica aplicada 279 Poisson para como maximo 1 unidad contaminada de 10536 unidades envasadas e incubadas. P(X S1,A) = ze * donde A=nxp n= 10536 x=1 0.05 = er" 4. Gl" (19536 p)) Resolviendo la ecuacién se obtiene p=0.00045, por tanto el resultado de la PQ es CONFORME. Probabilidad de aceptacién Zona de contormdad) Zona de alora Qo00s Q001 Qoo1s 0.00045 romocion de contaminacion280 Estadistica aplicada 6. COMPARACION DE MEDIAS. TEST t-STUDENT, COMPARACION DE DOS MEDIAS CoN MEDIDAS REPETIDAS. ANALISIS DE LA VARIANCIA, PRUEBAS DE HOMOGENEIDAD DE VARIANCIAS, Tradicionaimente, tas técnicas para la macnaracion de medias se dividen en dos grandes cotedtetun Se trate de comparar 2.0 mas de 2 medics En el primer caso, se utiliza como peat enC2, 08 Prueba un valor que sigue una distrbcios de t-Student si la hipdtesis nula de ipyaldad de medias es cierta, Para la comparacion de mas de 2 medias se aplica el método 6.1 Test t-Student Fi fest t-Student es una prueba estadistica que Permite comparar dos medias mediante la rel recreice WM? Variable independiente catagérica bivare nn una variable dependiente cuantitativa, factores no identificados, ina, Vez Fealizados los experimentos y recogides los datos es necesario verificar las Condiciones de aplicacion. Estas son: * Wgualdad de tas variancias poblacionales. Se comprueba mediante la prueba de F- Snedecor. La prueba es muy sensible a ia vulneracionae este supuesto. Se acepta que las variancias son homogéneas. Cuando las variancias son heterogéneas es necesario utilizar una correccién de la prueba nareca ene area Estadistica aplicada 281 Una vez verificados las condiciones de aplicacién, el Sesarrollo del test es: Calcular la variancia poblacional unica: @) Variancias homogéneas (a3 b) Variancias heterogéneas. (0) #03). Se calcula la vz ariancia de.las 2 muestras (x) ys) * Calcular el vaiort, el cual pertenecerd a una distribucion t de Student @) Variancias homogéneas ») Variancias heterogéneas * Comparar el valor de't con su distribucin de referencia Siltist a ~Diferencia no signifcativa (14=te) Si [tt ga —Diferencia significativa (aus) @) Grados de libertad para variancias homogéneas I= natng2 ») Grados de libertad para variancias heter de libertad corregido que se obtiene re rogéneas. Se utiliza un numero de grados dado por la siguiente férmula: dondeando al entero mas proximo el valor262 éstauistica aplicada * Toma de la decision. Para el ensayo se fabrica un lote piloto y se distribuyen las unidades en dos Temas 2s temperaturas de A y B (siondo BA). Tranecurie el periodo de tempo establecido se extraen 10 unidades y se realize wr analisis quimico del principio activo. Los resultados obtenidos son: ‘Temperatura 7 J.B ~ 988 96.6 100.6 96.1 101.0 98.2 100.1 97.3 100.0 97.2 98.6 95.6 98.8 97.6 101.8 96.9 100.3 93.8 98.6 96.4 Resolucién: Estadisticas N Media (i) —__Desviacién estandar (6) Test de normalidad ‘Anderson-Darling | Estadistico: A? Nivel de signiticacién [0.260 \Veamos ahora si se puede considerar que o? Hoo} =a} Ho} #0;Estadistica aplicada 283 205 => F, 1.205 =0,3929 Por lo tanto, Se puede trabajar con la hipétesis de igualdad de variancias ya que el nivel de significacién es no significativo, (0.05). Si se utiliza la tabla D3 el valor de Foos9 es 3.179, Se cumple las condiciones de normalidad y de igualdad de variancias. Estimador de la desviacién tipo poblacional (para ne: is): s+ 2 s= Realizamos el contraste de hipétesis: Hot My = My He By # My Estadistico de prueba: (69.86 - 96.57) his fty t als 10 10 Si se utiliza la tabla B, el valor toos.1e €S 2.104 25 => 1156.25 = .000 (significative <0.05) Se puede afirmar que la temperatura influye en la estabilidad quimica del Principio activo como se puede apreciar en el siguiente grafico: Boxplots of A and B (means aro indicated by solid circes) =264. Estadistica aplicada 61.1 Comparacién de dos medias con medidas repetidas Be ealza una prueba t para estudiar el cambio en la variable dependiente antes y después de que los elementos del estudio estén expuestos al factor de estuae El objetivo es medir ta respuesta en una misma muestra en Momentos diferentes. La hipetesis nula es que la diferencia de respuesta no se modifion ot efecto del factor del estudio, La hipétesis alternativa es que el factor modifica la respueste, Estadistico de contraste 1 = donde EE d = media de la variable diferencia d=y,-yp 41 = Varidncia de la variable diferencia (d) grados de libertad = n-4 n= tamafio de la muestra Si Itt ave ~»Diferencia no significativa Si It2t gua ~PDiferencia significativa Condiciones de aplicacién: Pera muestras pequefias, normalidad de fa variable diferencia en la poblacién, Si este supuesto no se cumple hay que realizar la prueba no Paramétrica de T de Wilcoxon con medidas repetidas. 6.2 Andlisis de la varianci (ANOVA) E} andlisis de fa variancia (ANOVA) es una técnica estadistica que permite comparar mas de jos medias mediante la relacion de una variable independiente categorica cen cna variable dependiente cuantitativa, En el ANOVA la hipétesis nula contrastada es Ia igualdad de las medias de las variables dependientes entre los grupos: Ho: we pe=. donde numero de grupos, El proceso para llevar a cabo el andlisis de la variancia se puede resumir en los siguientes pasos: 1) Definir el problema y el objetivo Eh bunto de partida para cualquier analisis estadistico es definir el problema y los objetivos analiticos en términos conceptuales. Un modelo conceptual no necesits ser complejo y detallado, sino una simple representacién de relaciones a estudiar. Si se propone una relacion de dependencia como objetivo del estudio, el analista debe especificar los conceptos dependiente e independiente.EOL Estadistica aplicada 285 2) Desarrollo del proyecto de andlisis Con el modelo conceptual establecido, el esfuerzo se dirige en definir los detalles especificos como: * _Definir as variables independientes y dependientes. * Métodos de medicion. * Tamafo de muestra * Técnica de muestreo 3) Obtencién de datos Realizar las pruebas o ensayos para obtener los datos. 4) Evaluacion de los Supuestos de aplicacion. Casi todas las técnicas estadisticas tienen requisites de aplicacion, Para el ANOVA estos requisitos son: * Las muestras cuyas medias se desea comparar, deben ser muestras aleatorias simples de sus correspondientes poblaciones. A menudo reculte dificil comprobar Sats POteS!s 81 no se tiene informacién del método seguido en Ia recogida de Las poblaciones de las cuales provienen cada una de las muestras son normales, Ponaue [este requisito es poco critico y ciertas desviaciones Fespecto a la [ormalidad no afectan a la validez del metodo excepto en algunos eases extremos, Es'importante comprobar estos supuestos para una correcta aplicacién del ANOVA. 5) Estimacién de la signiticacién de las diferencias entre medias. Si las condiciones de, aplicacién del ANOVA son satisfechas, se procede a calcular la significaci6n estadistica de las diferencias entre medias. Los calculos a realizar son: ©= ntimero de grupos, = numero de elementos en cada grupo. N= numero total de elementos. Yy = elementos i de! grupo j 5, = Media de los elementos de cada grupo r= media det total Fuente de ! Grados de Media cuadratica variacion | Suma de cuadrados libertad: (Mc) F Entre | Sc, | MC et Sea | grupos: ' e-1 MC... Residual SNe Slaw i N=c i Total Na raw |286. Estadistica aplicada Contraste de hipétesis con riesgo « SIF Diferencia no significativa SIF 2 F came. —» Diferencia significativa 8) Verificacion del modelo Los residuales deben ser independientes y estar Rormalmente distribuidos con media cero y variancia constante pero desconocida, Produccién. Para ello se toman muestras de 8 lotes con diferente contenido de princi activo y se remiten a las diferentes plantas para su andlisie, Los resultados obtenidos son: Resultados (%) rE Método A Método B Método C i 1022 7 99.7 7 96.4 2 i 101.8" | 99.5 | 96.1 3 98.1 99.4 95.9 4 98.1 | 99.2 95.7 5 | 98.4 | 98.8 | 95.5 6 | 96.7 98.4 94.7 7 | 95.5 \ 97.9 | 93.3 8 i 94.4 ! 97.3 92.8 Resolucion: Veriicacion de las condiciones de aplicacién (respect ala vari iable método) * Notmalidad de las variables. Con los resultados obtenidos se ha aplicado el test de normalidad ‘de Anderson-Darling. Los datos de las tree variables (métodos) Proceden de poblaciones normales (p-value >0.05)I EEE Estadistica aplicada 287 Test de normalidad Anderson-Darling | Método A] Método B [Método C Tamafio muestra 10 10 10 Estadistico A? 0.375 | 0.294 | 0.520 Nivel de significacion 1 0319 | 0512 | 0.126 * Homogeneidad de variancias. Se ha aplicado el test de Levene Test Statistic: 2.227 p-Value: 0.133 (no significativo) ‘Se cumplen las condiciones de aplicacion. Resultado estadistico Analysis of Variance Analysis of Variance for % Source OF SS MS F P Metodo 2 63.18 31.59 26.39 0.000 lote 7 53.71 7.67 6.41 0.002 Eror 1416.76 1.20 Total 23 133.65 Verificacion de las condiciones de! modelo Residuals Versus ie Fited Values Los residuales no siguen ninguna pauta. Comentarios Se puede concluir que existen diferencias significativas, entre los métodos de analisis (p=0.000) y entre 1a cantidad de principio activo contenida en los lotes utilizados en el estudio (p=0.002). Del estudio realizado se deduce que puede considerarse que las medias de los resultados obtenidos por cada método son diferentes.288. Estadistica aplicada 2 Prueba de homogeneidad de variancias permite veriticar la hipdtesis Ho: o; =a} : i Observadas en k grupos. i @ partir de las variancias 5? =»? Esta prueba es sensible tanto a la normalidad de los datos como a la igualdad de tamafios de los grupos muestrales, * Test de igualdad de variancias de varios grupos muestrales del mismo tamafio ») ¥ cuando las muestras son aleatorias e independiones y proceden de Poblaciones normales. GOs test mas empleados son el de Hartley y e! de Cochran. La Prueba de Cochran es algo mas sensible. ba prueba de homogeneidad de variancias propuesta por Cochran permite verificar dicha hipétesis mediante el estadistico El numero de grados de libertad es v=n-1 La hipétesis de iqualdad de variancias se rechaza (con riesgo &) cuando el estadistico G hallado es superior al correspondiente valor G(k.v,a) dado Por la tabla, aceptandose la hipotesis alternativa. : * Jest de igualdad de variancias de varios grupos muestrales de tamafios iguales o os, y cuando las muestras son aleatorias e independientes Y proceden de Poblaciones normales. En estas condiciones experimentales ol tect ie eleccién es la prueba de Bartlett. En esta prueba se calcula el estadistico de % y se acepta la hipétesis de igualdad de variancias cuando el nivel de signticecion os superior al riesgo aestablecido. con c= Donde: ve )v,=N-k venct tamafio muestral total = n,+nz+....+n s? = variancia muestral variancia de cada grupoEstadistica aplicada 269 Ejemplo 13: Se quiere estudiar si la variabilidad en la dosificacién de una misma solucién en tres lineas de llenado es estadisticamente igual para un valor de =0.05. Datos y resolucién: 9 0.85+11%0.71+13%0.92 _ 27.42 941113 33 vey tai x (2.3026x 33x 10g0.8309 ~2.7422)))= 0.193 La significacion de 0.193 en una distribucion de x? con dos grados de libertad es de 0.908. Si se utiliza la tabla C el valor de yn052 es de 5.99. Por tanto, se puede aceptar la hipdtesis nula de igualdad de variancias porque el nivel de significacion es muy superior a 0.05. : * Test de igualdad de variancias de varios grupos muestrales de tamafios iguales 0 distintos y cuando las muestras son aleatorias, independientes y sus valores son de una distribucién continua pero no necesariamente normal. Eltest de eleccién es la prueba de Levene.290 Estadistica aplicada 7. REGRESION. DESARROLLO DE UN ANALISIS DE REGRESION SIMPLE. PREDICCION. COMPARACION DE DOS RECTAS DE REGRESION En muchas situaciones puede resultar de gtan utildad explicar el comportamiento de una variable cuantitativa Variables x a veces tienen relacion entre si, el concepto estadistico independiente puede dar lugar @ equivoco, por lo que se prefiere denominarias variables explicativas, predictivas o regresoras. ' Cuando el numero de variables predictivas es uno se denomina regresién simple y sera objeto de estudio en la presente Monografia, El modelo que représenta Ia relacion estadistica entre la variable independiente y la Predictiva se denomina ecuacién de regresion simple y se formula como: yru+Bxte Ante un determinado conjunto de datos, debe evitarse caer en la tentacién de lanzarse inmediatamente a calcular la ecuacién correspondiente. Es necesario realizar primero un analisis exploratorio de los datos, analizar si podria ser util realizar algin tipo de transformacién matematica de los datos, asi como verificar el cumplimiento de las hipotesis en que se basa la interpretacién que posteriormente se realiza del modelo obtenido. 7.1 Desarrollo de un anilisis de regresion simple Etapa 1: Obtencién de los datos Después del disefio y analisis experimental, recoger en una tabla los pares de valores de las Variables. Es aconsejable tener al menos 30 pares (el nimero de pares de valores recogidos impone algunas limitaciones) de datos obtenidos de forma aleatoria para evitar la posible presencia de autocorrelacién entre los datos, Variable predicti x Xm YoEstadistica aplicada 291 Etapa 2: Andlisis exploratorio de los datos + Estudiar la relacion entre las dos variables, por ejemplo mediante un diagrama bivariante, El estadistico que mide el grado de asociacién lineal entre las dos variables es el coeficiente de correlacién: 6, -70,-7) El coeficiente de correlacién oscila entre -1 y +1. Un valor nulo indica ausencia de asociaci6n lineal entre las variables. * Detectar posibles observaciones anémalas. * Determinar los residuales estandarizados. Las observaciones correspondientes a valores de [>for 2 fequieren un estudio detallado, ya que son posibles anomalias. Etapa 3: Estimaci6n de los parametros de la ecuacin (Minimos cuadrados) ysatbxx Error estandar Prueba de significacion a oo tea, Fo eta292 Estadistica aplicada Etapa 4: Analisis de regresion Un valor significative de F(<0.05) indica que ta relacion de dependencia 8 significativa [poetciente de determinacién: es una medida de ajuste del modelo a los datos que expresa 'a Proporcién de Variacién total explicada por a recta de regresion Etapa 5: Verificacién del modelo * Los valores de ta variable predictiva no admiten errores. Esta condicion se asume para Poder aplicar el modelo * Distribucién normal de los residuales e-N(0,07) No se pueden aplicar de forma exacta los test de normalidad del tipo Kolmogorov o Anderson-Darling, ya que los residuales no son observaciones independientes de una ee eee tm. Peto de forma aproximada podemos hacer dicho tipo de text > grafico Probabilstico normal para detectar desviaciones de la hipdtesis de nerraliveeEstadistica aplicada 293 © Autocorrelacién de los residuales. Este supuesto se comprueba cuando los datos han sido recogidos de forma secuencial en el tiempo. Se utiliza el estadistico de Durbin-Watson (un test para estudiar la correlacion serial entre los términos de error adyacentes). El rango de este estadistico oscila de 0 a 4. Un valor en torno a 2 significa que los errores no estan correlacionados, menor de 2 que los errores estan positivamente correlacionados y mayor de 2 que estan negativamente correlacionados. 7.2 Prediccién ‘Se puede utilizar e! modelo de regresién lineal para realizar predicciones sélo si se cumplen las condiciones de aplicacién, al menos de forma razonablemente aproximada, en el Conjunto de datos que estemos analizando. Si el valor de x, esté dentro del rango de los valores de x utilizados para estimar los parametros de! modelo, la prediccién es una interpolacién. En caso contrario seria una extrapolacion y en consecuencia, su utilidad no es valida sino esta basada en conocimientos tecnicos del problema. © Interpolacion directa, Dado x, obtener y, ¥ Ely aaeXS ‘© Interpolacion inversa Dado y, obtener x,294. Estadistica aplicada Los resultados del trabajo experimental son: Concentracion Area (mAU ni ion (ngil rea (MAUS) 600) | 4405.6" 4387.9 4362.4 480 | 3533.4 3514.20 | 3498.68 384 2813.9") 2806.52 2803.8" 300 ; 21785" | ai7e.6" | bag ar 240 1764.19 | 4763.37 | “4742.40 150, 1095.3 | t086.3 | toa1.909 "Orden de inyeccion Resolucion Regression Analysis. The regression equation is mau == 11,0 + 7,33 2 Predictor Coef_ _—stDev TO oP Constant 10.997 8.095 -1.36 0.193 c2 7.33350 0.02081 352.39 0.000 13,23 R-Sq= 100.0% R-Sq(adj) = 100.0% Analysis of Variance Source DF ss Ms F P Regression 121727727 21727727 124181,85 0.000 Residual Error 16 2799 175 Lack of Fit 4 773 193 |, | 1.45 0.382 PureError 12 2026 169 Total 17 21730526 Durbin-Watson statistic = 2.25 No evidence of lack of fit (P > 0,1)S-—STSTS TE m "=a Estadistica aplicada 295 Residual Model Diagnostics Normal Plot of Resduas {Chart of Resale i” i eu in Histogram of Residuals J esas ae wee RR * En la ecuacién de regresién la ordenada en el origen (-11.0) es no significativa (p-value 0.193) : * El coeficiente de determinacion (1) es del 1.00, lo que indica que el 100% de la variacién de la variable dependiente (mAUs) se explica por la variable independiente (ng/) * Del analisis de la variantia se deduce que existe una ‘relacién liieal entre la variable dependiente (mAU) y Ia variable independiente (ng/pl). Puesto que F=124181.85 y la significacion de 0.000, se acepta la hipétesis de que, en efecto, existe una relacién de dependencia significativa ' * Se observa un ajuste de los valores al modelo de regresién lineal (F= significacion de 0.382) * Verificacion de los supuestos que deben concurrir para una correcta aplicacion del mismo: 15 y un nivel de 2) Normalidad de la distribucién de los residuales. Los residuales deben ajustarse a una ley normal y para comprobarlo se observa el grafico Normal Plot of Residuals. Se detecta un alineamiento de los residuales a la recta, >) Igualdad de tas variancias (homoscedasticidad). En el grafico Residuals vs. Fits, los residuales no adoptan ningun patron consistente., ©) Autocorrelacién de los residuales. El estadistico de Durbin-Watson da 2.25 y este valor es proximo a 2 y se puede determinar que los errores son independientes. El grafico | Chart of Residuals (residuales versus orden) puede aportar informacion visual sobre este criterio. Se puede concluir que el modelo cumple con los supuestos de aplicacién. Finalmente se puede deducir que e! método analitico cumple con el parametro de linealidad. 7.3. Comparacién de dos rectas de regresion Una recta esta definida por dos parémetros: pendiente (B) y punto de corte (a) con el eje de prdenadas, a comparacién de dos rectas conduce a formular las tres siguientes pruebas estadisticas:296. Estadistica aplicada Recta A: yeast Bix Recta B: y,=an+ x 8) éLas dos rectas tienen la misma pendiente (hipétesis de paralelismo)? Ho: Ba=Br, 5) eLas dos rectas tienen el mismo punto de corte? Hor a= ot5 ©) elas dos rectas coinciden? (ar y fr son los pardmetros de Ia recta con todos los elementos) Ho: Ba=Bu=Bry a= Cuando se rechazan las hipétesis nulas las rectas son diferentes. Existen basicamente dos procedimientos para comprobar estas hipétesis. El primero de ellos consiste en estimar de forma separada las dos rectas de regresion y comparar las estimaciones con pruebas de significacién EI Segundo procedimiento, mas general, es definir una variable ficticia Z (por ejemplo: Orrecta A y t=recta B) que represente a los dos grupos, y estimar un unico modelo de Fegresion miltiple que incluya el término interaccion (I=2X) YFery+ BrXtyZrdxZte Para comprobar las tres hipotesis: a) Hipétesis de paralelismo: b) Hipétesis de igual punto de corte: ©) Hipétesis de coincidencia: La pruebas que afectan a un coeficiente de regresion se verifican con las pruebas de F. Las dos primeras hipétesis (paralelismo e igual punto de corte), que se pueden comprobar directamente a partir de la significaci6n de los coeficientes r y yr que se obtiene al estimar el modelo completo, se verifican con los cocientes de F: SC(AZ|.X,2) 203 F OF in n-4 El valor SC(XZ|X,Z) del numerador es la suma de cuadrados explicada por el término interaccién XZ en un modelo que ya contiene las variables X y Z. El valor SCE del denominador es la suma de cuadrados residual del modelo completo.a Estadistica aplicada 297 SC(Z |X, XZ) <05F= 1 m0 = Soper T AD 7 Fm n-4 $012,421) Ejemplo 18: Comparacién de dos rectas Datos (Rete me L 4 jams Z | A(=0) 8 10 12 14 | 2 < 6 Bi=1) 8 10 12 14 Calculo: Hipétesis de paralelismo SCUXZ |X, 388.28 ~ 388.04 pe ee 1 = 0.332 =0: F SCE. EAD coy 0332 — F,,40.332 = 0.57 ( Rectas paralelas) n-4 14-4 Hipotesis de igual punto de corte SCZ|X,XZ) —388.28-341.37 64.97 > F, a 1164.97 = 0.00298 Estadistica aplicada (Rectas con distinto punto de corte) Hipétesis de coincidencia SCAZIX) 38828-196.17 2 : = 133.04 5 F,, 133.04 = 0,00 (Rectas no coincidentes) Resultado: El cdlculo estadistico concluye que las rectas son paralelas pero no tienen igual Punto de corte y, por lo tanto, no son coincidentes. 25 20 cal ~~" [Recta a} 10 . _ Recta 8| 6 7 8 9 1011 12 13 14 45 Origen de los valores empleados en el célculo (marcados en negrita) Regression Analysis (modelo completo) The regression equation is Y= 1.00 + 1.00 x + 7.92 2 - 0.064 xz Predictor coef, StDev T P Constant 2.0000, 0.7180 1.39 0.194 x 1.00000 0.08027 12.46 0.000 z 7.9165 0.9819 8.06 0.000 ros | ss5 [ons [ears fare Toe} Bes [see [sees [cots | eres | ieee | ars sy € ea a | ee ae ie ae tat ie oe | eee [wees | wee | are amet ase fe ube | sees | “aesze | eaeae | oreis | sevos | “is96s | seves | cones] voces creas | cease | cosets | coser | voaee | —T | aor og Or of I 0 OL 6 a Z 9 ¢ e € z a a za eige,ini J aey st Pea | ues | Suey | ecoe | ere | vere | sorz ] tore | s6oz | see | se6e | OOF eect | aaet I wer ey [mer | aeer | vere | woz | cuz | cere [core | sezz | core | ussz | cece | eae | reoy | Og gar [oer econ | er [eer | oz | vere | oare | ere | ocez | ore | soe | seve | zeze | soov | Ov sar pei | eri pwr | acer | soe | wee | see | voce [ive | vesz | osoz | eee [ sice | vay | OF erp wer | wer | aoe | vere | eee | core | ave | vise [ese [rice [ose | aoe | core | sev | 02 per} mee | ime | wre | ve | wee | owe | cme [eeve | ae [eee | eure | ooce | tory | sey | OF mle} toe | wee | vee | eee | cere | ee | oe | eeze | wece [ cave [ ecoe | cove | asee | sins Tei} owe | eroe | ee | oe | aee | eee | verve | cose | voce [ eeoe | ecpe | soy | esry | cies wae | eee | owe | oe | owe | vee | use | oe [ we | see [ese | ozy | urey | scr | v6ss ae Tt wie | pe | eave | vee | csr | cor | are | coer | vezy [| lacy | vesy | usry [ens | ua5s sor yer ees | ues | oes | coos | pees | ces | ivoe | veoe | cove [| sszo | earo [tesa | ree9 | cove vse | vase | vse | ase | oe | core | cise | swe | ve | wee [cis | ave [ue | esse | sero wren] eivar | tre: | caver | omer | corer | seve | reer | esee | ezeer | sezer | avees | vores | coos | ciser 6 @ Z 9 are [rr | ery | ese | sey | aay | sey | suv | osey | oss | zors | cove. [ cers | e009 | r € @ 7 aroese] vizise | erie | oeo0ee | rere | zewive | crsore | veoeee | Zersez | seeeee | oorore | cesvee | worsiz | corer | arr io oor | 0g oF oe | 02 | oF 6 a z 9 g ’ € z@ | TA ugionqusip | ap peveal ep sopei6 so} ep U!oUNy Ua ¢O'0 Bp B09 ep eave un efep enb se10JeA “sODepeUS @P 4 OP UO!INAUISIC “EC BIGEL”set [| set [user [cory | aaoe [tore | osse [voz | eee | ame | mace | ast ] wee] wav | ae] OOF v ; sez | soz | seve | oeoe | owe [ove | aove | oe | eae | aos | ia] Oo seat [ever | t00e | eeoe Sou | eso [via [tore [eee [ae [are [eee [ere | vere | vise | ewe] ee] eas] et oF ee [eee | eee [ome [ame [ome [aoe | eae | are | toe | ame] aor oar pas tae 06 Bee | oe | seer [cue | aie | ooee | asre [rose | eave | vase | aory | tery | meer | aes one TOE nov [sir [say | ay | sory | aay | wey | aaos | mars | owe |e] ess ease tas} oor oF ar | usr | wer | orev | woew [aes | ises | aars [cies | eons | amos | cere | am] aos] war fe wer | soos | sus [seis [oes [nes [uss [ee | ene | vase | wee | oor | vet} wee] en te Sis | eeee [soos [coos] sare | cows [ce | ee | enea ) vere | ora | ot] aes} aaa] weer] soe [wees [eve | weer | seee | wet | oer | are | one | core | meee] anne | tere} eset ar 9 ore | eee [tees | cues [ese | icon | sror | eaean | caro | zoo | awa | au | coe] oma mee te Aen | meet | seer | cose [sion [ores [sore carn | econ | aoesi | wees | ae | von} omar] went | P trese | sscez | tivex | worse | coos | ezewe-| swe | evi | ve | nem | mee | Ole avez | oor | sire | & res | teres | ares | coves [owes | race | osees | sives | aaees | venue | wares | aavee [ores | oom | oosar tr | S26 Cees | ose 20eo | Zep onze | oaebaes | conenze | sxe esue | Ter 2e00 vs6'oaes | vee aces | ose ases | ssoeacs | csz'v20s | ves tors | ove eesr | serzecr | 7 008 os | om Oe 4 oF 6 e Z 9 ¢ ’ € z A ’a 7a “oPnauisip el 8p pevEqH ep sopes6 S01 ep uoDUNy Ue 40'0 €P eI00 ap kelp Un uefep anb sei0IeA sooapeus ep 4 0p uoronquisia ‘pa eqes,zor [soz J owe [ osez [vse [ooze [ ecve [ eive | eee | wiv | eivy | sos | ses] ea] ceri O01 orez | wwe | eese [ooze | isez [woe [we | oose | ezey | zis | 106y | ears | ecco | sez | zezai | og wre | saz | ae [wee | swe [vee | veov | uoey | sry | sezr | ezvs | oops | ose | ise] soozr | OF were [ese | woe | uee | tore | oczy [coer | esr | usr | cas | ves | seve | voor | ewe | corer | oe sise | sore | seve | soov | czy [sus | cezs |" ons | ceos | soo | vara | osoz | eco | cose | ars | 0c oss | zerz | weee | corz | tox [eve [osee | voce | cise | sese | vera: | tezws | csper | soem | ecoie—] or wooo | ose [eace [use | eve [vee | coros | ooror | sooo] ears | viz ceszr [ ioeci-| veces | useze | 6 wuss | was | aes [oor | evo [ osu | wecus | svoz | ores | oszr | rover | veers | esr | rover | sivae 16 iseii | zozer | seezs | eeses | ieses [toon [overs [ veon | sist | ozsi | soze | covas | eee | osmiz | areez |Z szoor | soca | versr | coor [cern | ziver [eaves | ocoei | cover | seooe | eovoe | ezeiz | sorez | son | zosce | o eitvz | ovvve | cove | osave [corse | vise | weue | eroue | sovec | scvez | isvez | eave | oozee | case | aia ture | wor | ewosr | sever | over | csoey | zever | ocowr | sever | ves0s | aizis | seres | ones | wei time] > cover | seovei | eves | eevses | verses | zzezi | voweer | wivocr | sosies | ocezer | ousver | euovei | Seow | were | esour | E soeess | covess | sores | corses | corsss | sorese | sorees | coress | eotees | sores | cores | coress | eocess | cvaece | eucecs |e srceezéea| ezv'ezcor9 | 526 zvaze | eer zovezs | 096 1 ra0za | ¥61 ¢ess09 | ree Svezcd | G62 e86z65| sev sere6s | 206 Zcoos | y21 esrecs| Z¥@ 2990705] 00s Oszors | Zve szzecr| ves ticsor | ~T OOF 0s OF Of 02 OF 6 @ Zz 9 g ¥ & z # A a SIP e| Sp PeLEql| ap Soped6 So] Bp UOIOUN Ue 1.00'0 8p B/C 9p ealg UN UElep anb se10|eA “soDEpsUS EP 4p UOINQUISI sq EI4eL“PeedG | O08 | ~Z8800 | EeeDO | coord | WiTo | osero ] Geno | —ZeOrD | coDZD | GOED | —ceEEO asroo | seov0 | 6aa0°0 | oorro | aoero | arro | siaro | eoaro | arizo | erszo | eeoco | seoro | eleso | Por vos | eza00 | brit | torvo | ssero |~ozero | ezozo | aieo | ziazo | oor | ozeo | enivo | 20000 | 6 [ F200 | eorro |~eenro | zexro | eeoeo | szzzo | eoveo | ebleo | seico | sraeo | eaero | os0 | IMTO oF ‘2600 | eoevo | tei | ozozo | esezo [ easzo | ezazo | veie0 | eosro | arivo | vaero | seoso | oaszo | oF [ 85900 | sero | scare | aso | eevz0 | asco | ~azezo | saeco | zaaro | wero | 2100 | s6i80 Zooro | zero | sivo | ieizo | wseo | esizo | evo | vacco | seco | cecvo | sais0 | eeeso | ealeo taro |" hosko | tievo | eezzo | esazo | voezo | saieo | seseo | oscco | vosro | soeso | soo | ceoo eeiro | zosro | ve0eo | seve | ezezo | se0co | eoero | ezieo | perro | taro | eess0 | 1490 | veo dara | seuvo | seize | veezo | ~ézoco | eeeto | seseo | visto | aro | soso | seas0 | tore | uso Hero | seevo | sizo | oaazo [ tieeo | vasco | o1eeo | coero | coaro | trs0 | Zees0 | isrl0 | ig060 fesvo | sozeo | esuzo | vezeo | eeseo | uzoyo | wero | ooero | 1ecso | sesso) 1ves0 | aero | zeceo oasro | souzo | sreeo | vero | osrro | sur | Wiso | zieso | seig0 | eces0 | elez0 | cole0 | osle0 oe | Oe oT a OF 6 e Zz a s + € z : (Coanas oP OTH S]'e] a} 9] | 6] ©] A] ao} | S260 | veeeo | Goro | oreo | oz0s0-|~sees0 | eei90 | tuzz0 | gosr0 | zieo | 90060 | eo060 | seeco (s0'0=0) uesyo09 ep eqanud e} ap upioeoyiuBis ap ONIN “a eIGeLApéndice 329 Tabla F. Nivel de significacién del valor Drax de la prueba de Kolmogorov-Smimov ‘Tamafio muestra Nivel de significacion («) () 0.10 | 0.05 0.01 1 0.950 0.975 0.995 2 0.76 0.842 0.929. 3 0.636 0.708 0.829 4 0.565 0.624 0.734 5 0.509 0.563, 0.669, | 6 0.468 0.519 0617 | 7 0.436 0.483 0.576 8 0.410 0.454 0.542 9 0.387 0430 | o.sia 10 0.369 0.409 0489 | 44 0.352 0.391 0.468 12 oss. | 0.375 0.449 13 0.325 0.361 0.432 14 0.314 0.349 0.418, 45 0.304 ‘0.338 0.404 16 0.295, 0.327, 0.392 17 0.286 0.318 0.381 18 0.279 0.309 0.371 19 0.271 0.301 0.361 20 0.265 0.294 0.352 >20 1.22/Vn 136Vn || 1.63/Vn330. Apéndice Tabla G. Criterio de Dixon para identificar datos atipicos (un solo grupo) ivel de significacion k 0.05 0.01 3 0.941 0.988 i el valor sospechoso es el menor 4 0.765 0.889 5 0.642 0.780 6 Siel valor sospechoso es el mayor 0.560 0.608 7 0.507 0.637 8 0.554 0,683 9 0512 0.635, 10 0.477 0.597 " 0576 0.679 12 0546 * 0.642 13 athe Sil valor sospechoso es el mayor 0521 0.615 14 0546 O6at 15 0525 0.616 16 0507 0,595 7 0.490 0.877 1 ry =S3 =" shel valor sospechoso es elmenor «0475-61 a Mei 0.462 0.547 2 = =" siel valor sospechoso es el mayor ee 2 May 0.440 0.524 22 0.430 0.514 23 0.421 0.505 a 0.413 (0.497 25 0.406 0.489Apéndice 331 Tabla H. Valores maximos del coeficiente de Q para la identificacion de datos atipicos (varios grupos) tae Nimero de elementos de cada mussagreptaa conwer 2 3 4 5 6 7 8g 9 10 1|_- | 0% | a7 [oss | ose | os: | om Tow Ton 2 | ose | casa | oso | o7ee | a7a8 | or | area | acer | asa 3_|asis | over | asor | oses [oss | 0521 | ascr | one | anno 4 | oset_| ose | caro |"osas | ozs | oa10 | oes asco | oaer 5 0.581 0.451 0.398 0:369 0.351 ‘0.338 0.328 0.320 0.314 §_{ osee | vase | ose2 | 0316 | os00 | 0206 | 0200 | azo | ozer 7 0.451 0.342 0.300 0.278 0.263 0.253 0.245, 0239 | 0.234 8_| oor | 0308 | ozer | 0248 [0204 | ozs | oaie | oz | once S| case | oars | os | ozes [oar | 0209 | oor bom Tove 10 | sase | 02s | o2zo | 204 | oss | ows | ose | onte | onze Los valores correspondientes a una muestra (2 decimaies) estan dados para una 0.1 de rechazo indebido. Los demas valores Corresponden a una