oe ikiéu huyét thanh) thude giéng Salmonella. Cae serotype nay duge chia theo hé théng cia Kaffmann - White dya trén cong thie khang nguyén O ikhéng nguyén somatic) va khéng nguyén tién mao H (flagella). Ngoai m@t sd serotype duge dat tén riéng nbu Enteritidis (S. enteritidis), Typhi (S. typhi), Paratyphi (8. paratyphi). Typhimurium (S. typhimurium). héu hat cae serotype khdc duge ky higu bing cong thtic khang nguyén. Salmoneila c6 thé duge phat hién (phan tich dinh tinh) bing mot quy trinh gém 4 bude 1a tang sinh, tang sinh chon loc, phan lap va khang dinh. Salmoneila thutng cé mat trong mau véi s6 lung nhé, bi ton thuong va cing hién dién chung vdi mt sé lugng Jén cde Joai vi khudn khée thude ho Enterobateriaceae cé tinh eanh tranh manh va te ché suv tang trudng cia Salmonella ~ Buée tng sinh: thy theo dac tinh thanh phan héa hoe cia mau cin chon quy trimh tang sinh phi hyp. Thong thugng tl 1é gita mau va mdi trudng tang sinh la 1:9, tuy nhién tily trudng hap cu thé ti lé nay cd thé thay ddi. ~ Buse tang sinh chon foc: cée méi trudng tang sinh chon ge thuting ding dé phat hi¢n Sa/monelia trong cdc mdu thuc phim la Rappaport. Vassiliadis (RV), Selenite Cystein Broth, Tetrathionate Mueler Kauffmann Broth (TT). Cae nghién evtu gin day cua AOAC cho thay méi trutng RV c6é thé thay thé cho ede mdi trugng khde dé phan tich nhiéu loai mau khdc nhau. Tuy vay, mdi trudng TT thubng duge ding dé phan tich cdc loai mau chia thit tuai séug, eae mAu ¢é mat 46 nhiém cao, ofc loai thite an gia sic... Hién nay nguéi ta khuyén khich vige st dung it nhat 2 loai méi trudng tang sinh chon loc dé tang cu’ng kha nang phét hién duge tat ca cdc serotype Sa/moneifa néu cé hién dién trong mau. ~ Suéc phan Ig: nham tach va nhan dang Salmonetia khdi cée quan thé vi sinh vat khac trong mau. Nhiéu loai méi trutng rin khée nhau duge sir dung dé phan lap Salmonelta, mdi mai truting gidp nhdn dang cée lodi thude gidng nay dya trén mét vai dac tinh. Hién nay, eae tiéu chudin vé sinh an toan thye phém khuyén khich viée sii dung it nhat hai loai mai truémg phan lap khée nhau dé tang cudng kha nang phat hign tat ca cde dong Salmonelia, dic bigt méi trugng XLD duge khuyén khich sit dung. ~ Bude khang dinh: nhim xde nhan lai cdc khudn lac dac trung cho Salmonella xuét bién trén mOi trudng phan lép. Buse nay dya trén viée su dung ede thi nghiém sinh héa va thi nghiém huyét thanh dac trung cho Salmonella. Cée thit nghiém duge khuyén khich si dung 1a thi nghiém KIA/TSI, indol, LDC (Lysine decarboxylase), ODC (ornithine decarboxylase}, urea, 1én men mannitol, sorbitol, cde thi nghiém huyét 124se thanh O va H da gia. Thong thutng cée phong phan tich vi sinh thye phéim khong cé kha nang xdc dinh dén loai phu hay serotype ma chi xde nhan dén Salmonella spp. Viée phn tich chinh xAc serotype nhiém vao thye phéim thudng duge thuc hién tai cde trung tém vé sinh phong dich hay cac phong thi nghiém chuyén dink danh vi sinh vat. 5.2. Méi trudng va héa chat ~ Nude peptone dém (Buffered Peptone Water, BPW) ~ Canh Rappaport-Vassiliadis Soya Pepton (RV) ~ Canh Malachite Green Magnesium Chloride (canh RV ei tién) ~ Tetrethionate Muller-Kauffmann (TT) ~ Thach Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) ~ Thach Hektoen Entric Agar (HE ) -Thach Bismuth Sulphite Agar (BS) ~ Thach Brilliant Green Phenol Hed Lactose Sucrose (BPLS) ~ Thach Triple Sugar Iron (TST) ~ Canh Urea - Canh Lysine Decarboxylase ~ Canh Ornithine Decarboxylase - Canh Mannitol (Phenol Red Broth Base) - Canh Sucrose (Phenol Red Broth Base) ~ Canh Sorbitol (Phenol Red Broth Base) ~Canh Tryptone ~ Thutc thif Kovac’s ~ Khang huyét thanh Salmonella da gia. 5.3. Quy trinh phan tich dinh tinh Salmonella trong thc phim 5.3.1, Tang sinh D6i véi cdc loai mau théng thugng tign hanh can 25g mau trong tui PE v6 trig, bd sung 225ml dung dich BPW va déng nhat mau bang Stomacher trong 15 hoac 80 giay. U 6 37 + 1°C trong 18 - 24 gid, Doi voi mot 86 loai thye phéim ¢6 chita cée ch&t 06 thé gay adc hole tte ché su tang trudng ciia Salmonella cfin thue hign quy trinh tang sinh dae biét nhu sau: — Doi vdi mau gia cdm tuoi sOng: dat gia cm vao trong mdt bao nhya lén, thém vao 1 lit méi trudng ting sinh BPW. Lic bang may Ide khodng 30 gidy dé méi trudng tham duge vao trong toan bé mau. 122- Dai vi sita khé: cho 25g mau vao trong tui PE v6 tring, bé sung 225ml moi truéng BPW, dé yén 60 phut 6 nhiét do phong. Sau dé lc cho én khi sita tan ho&n toan. ~ Déi véi cde gia vi hay cde loai thye phdm chia nhiéu gia vi: ding nbat mu 6 4@ pha long 1/100 trong BPW (thay vi 1/10 nhu binh thudng) trviée khi nudi tang sinh. Bién phap nay nh’m lam gidm néng dp cdc hop chat te ché sy tang trudng cita Salmonella trong bude tng sinh. — D6i vdi cde loai mau nhu casein, pho mdt, bo vA ede sdn phim tuong ty khée: thue hién déng nhat mau trong moi trugng ting sinh da duge lam dim 46n 40°C. — Déi vdi sin pham chita cocoa: déng nhat m4u trong méi trugng Skim Milk Broth duge lam am 6 40°C. ~ Déi vdi dita, cdc san phdm ctia dita va cdc mau c6 ham lugng chat béo cao: déng nhat mau voi BPW, sau dé thém vao 2 - 3 gigt Triton X-100 truée khi tang sinh. 5.3.2, Tang sinh chon loc Lac dé tron déu dich tang sinh, va chuyén 0,1ml sang 10m! méi trudng tang sinh Rappapport-Vassliadis Soya Pepton dé duge d dm dé do 42°C. U d 42 + 0,2°C trong 18 -24 gid. Khi cdn thiét c6 thé kéo dai thai gian d thém 24 gids Mot. sé méi trusng tang sinh chon lge khée nhu Selenite Cysteine Broth, Tetrathionate Muller- Kauffman ciing duoc dung. Mai loai méi truéng chi cé tée dung chon loc trén mét dac diém phdt trién cia Selmonella, mot s6 dong Salmoneila tang trudng duge trong méi tru’ng nay nhung lai khong ting truéng duge trong moi truting khdéc. Vi du Salmonella typhi khong tang truéng duge trong méi truéng Rappaport Vassiliadis va Tetrathionate Muller-Kaufmann, Salmonelta dublin khong tang trudng dude trong méi truing Rappaport Vassiliadis. Do vay, dé tang kha nang phat hign tat cd cdc dong Salmoneita hién dién trong m&u thue pham cén phai dimg it nhat hai loai mi tru’ng tang sinh chon loc khac uhau cho cimg mot mau. Ngoai ra, mdi moi trudng chon loc duge a 4 mot nhigt 46 nudi cdy khaéc nhau nhy méi trubng RV duge G a 42°C, méi truiing TT va SC duge & 6 37°C trong 22 - 24 gid. 5.3.3, Phan lap va nhan dign Dimg que cdy vong thye hién ky thuat cay phan lap khudn lac don Vi ging tit dich ting sinh chon loc lén dia méi trutng chon loc phan biét dac tring cho Saimonetta nhu XLD, HE, BS.. Cutng dé chon loc va 123mic do phan biét thé hign é hinh thai khudn lac ctia Salmonella trén tung méi trung cing kh4e nhau. Dé chon loc vA nhan dang duge tat cd cde dong Salmonella phai ding téi thiéu 2 mdi trubng chon loc phan biét khde nhau cho cong m6t mau. Cac biéu hién ctia Salmonella trén tong méi trugng khac nhau nh sau: ~ Moi trudging XLD: khudn lac cé mau héng trong suét, o6 hay khéng c6 tam den, Mot sé dong Salmonella cé thé cé tam den béng rat lan cé thé chiém gan hét khudn lac. (xX. dnh 23 va 24) ~ Méi trung HE: khudin lge Salmonella co mau thay déi tit xanh dvong dén mau xanh tye, cé hay khong cé tam den, Mét sd dong Saimonetia e6 tam den béng rét lén c6 thé chiém gan het khudn lac, (X doh 25), ~ Méi trudng BS: khuan lac Salmonella cé mau nau xam hay mau den, thinh thodng cé xudt hién anh kim tim. Méi trudng chung quanh khuan lac chuyén thanh mau ndu va sau dé chuyén thanh den néu kéo dai théi gian G. (x. anh 26) ~ Moi truong BPLS: 6 khudn lac Salmoneita mau héng nhat, trong: sudt. xung quanh khudn lac méi truéng chuyén mau dé. ~ M6i trudng SS : 1x, anh 27), Tat cd cae dia mdi tru’ng sau khi cay duge d 6 37°C trong 22 - 26 gid. Sau khi u, chon cée khudn lac c6 dae diém cla Salmonella but trén dé thue hién bude khang dinh bing cdc thi nghiém sinh hoa va thi nghiém khang nguyén 5.3.4, Khdng dinh Tu méi méi tru’ng chon loc phan biét chon va cay chuyén ft nhat 5 khudn lac nghi ng& sang mdi truéng khéng chon loc vi du nhu TSA. U 37°C trong 18 - 24 gid. Cae khudn lac xudt hin trén mdi tru’ng nay duge sti dung cho cae thi nghiém sinh héa va huyét thanh. Cée thir nghi¢m sinh hoa chinh edn thyc hién cho Salmonella 1a len men glucose, lactose, saccharose, HS, urea, indol, VP, ODC, LDC, stt dung mannitol, sorbitol (xem chung IV). Cac ching Salmonella cho cdc két qué thi nghiém sinh hdéa nhu sau: ~ Thi nghiém sinh H,S (TSI hay KIA): Salmonella chi len men duge dutng glucose trong céc méi trutmg trén vi thé phdn nghiéng cia mdi truiing cé mau dé, phan sdu cé mau vang. Ba sé che dong Salmonella déu ¢6 kha nang sinh HS nén c6 xudt hién ede vét mau den trong méi trutmg nay. C6 thé thay hién tugng sinh hoi qua hin tugng lam v6 thach méi iz 3trudng hoa méi trutng bi day lén trén tao ra mét khodng khéng bén dudi day dng nghiém. ~ Thi nghiém LDC (+): sau khi nudi cdy moi trudng chuyén thanh kiém, mau méi tru@ng duge chuyén thanh mau nhu ban dau (mau tim hay xanh), ~ Thi nghiém urea (-): Salmonella khong phan gidi urea nan khong Jam thay d@i pH méi truding; sau khi nudi cy mai trutng vin git’ nguyén mau vang cam. ~ Lén men mannitol, sorbitol (+): mdi trudng sau nudi edly bi acid héa va chuyén thanh mau vang. ~ Thit nghiém Indol va VP (-). Cac thi nghiém khang nguyén cdn duge thye hién song song vdi mau ching khong bing dung dich nude mudi sinh 1¥ dé loai try kha nang ngung két gid. Hai loai khang huyét thanh da gid cén ding la Salmonella Polyvalent O va Salmonella Polyvalent H. Phan img (+) khi chimg thi nghiém tao ngung két vdi khang huyét thanh nhung khong c6 hién tugng ngung két véi nude mudi sinh Ly. 5.3.5. B40 céo két qua Quy trinh kiém nghiém nay chi cho phép phan tich dinh tinh Salmonella, giip két lu@n c6 hay khong cé Salmonella hién dién trong 25g mau, khong cho phép phan biét dude cac dong Salmonelta hién dign trong mau. Dé khéing dinh duge tén ching Salmonelia phan lap duge cdn phai tién hanh thi nghiém ngung két voi cdc loai khang huyét thanh don gid khde uhau hay cin géi ching Selmonella phan lap duge dén cae phong thi nghiém chuyén dinh danh vi sinh vat. Can luu ¥ Sadmoneita 1A nhém chia cdc dong gay bénh nguy hiém. Do vay can tuan thi triet dé cae bién phap an toan khi lam viée vi cae ching Salmonella dimg lam déi ching (+) cing nhu khi thao tac trén cae ching phan lap dugc. Céc moi truding hay mu vat sau nudi cy edn phai hap khet tring edn than true khi ria, Quy trink phat hién Salmonelia trong thye phdm duge tom tat trén Hinh 5.6, 5.4. Quy trinh phan tich dinh tinh Salmonella trong mude Salmonella cé thé hién dién trong tat cd c&¢ loai mide (nude sinh oat. nude udng, nude dimg cho néng nghiép, nudéc séng hd, nude thai, nuée bién) véi mgt dé thip. Do vay dé phat hign Salmonella trong nuée 125edn phai qua bude loc thu gép t8 bao qua mang loc, lam gidu trong moi trugmg tang sinh, dé phuc hdi cdc té bao bi tén thuong. Quy trinh phat hién cing gém 4 budc tuong ty nhw trudng hep thue phdm véi mét sd luu ¥ 6 bude tang sinh nhu sau: Néu thé tich mdu nhé hon 10ml, cho mau vao trong 50ml mdi trugng BPW cé néng dé don. Néu mau cé thé tich [én hon 10m, cho mau vao méi truéng BPW cé néng a6 kép theo ti 1é 1:1. Trugng hop ding mang loc dé thu gép té bao, sau khi loc mau, cho mang loc vao 50ml méi trugng BPW. Tién hanh 6 6 36 + 0,2°C trong 16 - 20 gid, sau 46 tip tue bude tang sinh chon Igc, phan lap va khang dinh nbu tran, Déng nhat 25g mau trong 225ml méi truéng ting sinh (BPW), i 6 97°C, 18 - 24 gi t Cay 0,1ml dich ting sinh sang méi trudng tng sinh chon I9c (RV), & 6 42°C, 1B - 24gior 1 Phan lap khuan lac don trén it nhat 2 moi truéng chon loc phan bigt (XLD, HE, BS, SS..), 48 37°C, 24 gid ¥ Chon cae khudin lac dac trung cho Satmonetta, cy sang BHI hay TSA; 0 qua dém eases Thit nghiém sinh hoa cho két qua: - Trén KIA / TSk: déivang, cé/khong H2S, sinh hoi/khong; = Urea: (+3; Indot: ():VP: (3): LDC: (4): ODG: (+); Manitol: (+); Sorbitol : (+) a This nghiém ngung két khang huyét thanh: Poly: 0, Poly: H ¢ Két luan: Salmonella dutong tinh / am tinh trong 25g méu Hinh 5.6 Quy trinh phat hig Saimonelia trong thyc phém 1266. SHIGELLA 6.1. Dinh nghia va nguyén tac Shigella la true khudn gram 4m, hiéu khi ya ky kbi tay y, cho thir nghiém catalase (+) (trit Shigella dysenteriae), oxidase (-), len men glucose khéng sinh hei, hdu hét ede loai khong len men va tao acid tif lactose, dulcitol, khong sinh HsS, khdng c6 enzyme lysine decarboxylase Giong Shigella gdm 4 loai: (1) S. dysenteriae Khéng Ién men duge mannitol thude nhém kh4ng huyét thanh A, gém ¢6 10 kiéu huyét thanh {serotype (2) S. flexneri thude nhém khang huyét thanh B, gdm 6 kiéu huyét thanh va cé thé duge chia thanh nhiéu subserotype khdc nhau theo sy hién dién cua cdc khang nguyén khde nhau trong uhém nay: (3) S. boydii lén men mannitol sinh acid, thue nhém khang huyét thanh C. gém 15 kigu huyét thanh va (4) S, sonnei cé kha ning ién men mannitol, thuge uhém khéng huyét thanh D chi ed 1 kiéu huyét thanh. Shigelia la tac nhan gay nén béah shigellosis, 14 mot bénh nguy hiém lay lan rat nhanh trong cong déng tit ngudi sang ngubi, qua dung thue pham va nuée uéng. Nguén nhiém Shigella vao thuc pham chi yéu Ja tir nguyén ligu, tir nuée hay tit cong nhan ché bién. Cac loai thue phém thuting xuyén phan lip duge Shigella ta cdc mon xa léch, thit bam, thay sin Liu lugng gay ngé dée thyc phém do Shigella rat thap, c6 thé 6 mic 10 té bao/g san pham. Do vay Shigella duge kiém sodt rat nghiém ngat trong thy phdm, doi héi phuong php kiém nghiém phai rét nhay. cde quy trinh kiém soat phai chat cha. Shigella cb thé duge phat hién bing each cdy mot lugng mau xde dinh vac méi truong long khéng chon loc, sau dé duge chuyén vao moi trudng tang sinh chon loc. Djch khudn sau khi tang sinh chon loc duge cay phan lap tran it nhat 2 loai moi truéng thach dia véi mete d6 chon loc khée nhau. Khudn lac nghi ngi duce kiém tra bing thi nghiém sinh hoa va khang huyét thanh. 6.2. Méi truéng va hod chat - Canh Tryptose Soya ~ Méi trudng Tergitol — 7 Agar (T7A) - Canh Gram Negative (GN) ~ Thach MacConkey (MAG) ~ Thach Xylose Lysine Desoxycholate (KLD) ~ Lysine Decarboxylase Broth (LD) 127~ Thach Hektoen Enteric (HE) ~ Thach Deoxycholate Citrat Agar ~ Mannitol Phenol Red Broth (MPR) ~ Duleitol Phenol Red Broth (DPR) ~ Thude thit oxidase ~ Thuéc thi catalase - Thach Triple Sugar Iron (TSI) ~ Méi trugng the nghiém tinh di dong ~ Khang huyét thanh: bén loai khang huyét thanh da gid polyvalent A.B.C,D 6.3. Quy trinh phan tich 6.3.1, Tang sinh Lay 25g mau cho vao tii dap mAu, thém 225ml canh Tryptone Soya. Sau khi déng nhat mau, do pH va chinh vé pH 7 + 0,2. Buée chat miang tdi va U6 37°C trong 16 - 20 gid. Cé thé pha loang mau trong binh tam gidc, sau khi chinh pH t cdc binh nay trong diéu kién ky khi 6 nhiét dé va thoi gian nbu trén. 6.3.2, Tang sinh chon ige Chuyén 0,1ml dich tang sinh sang 10sal canh tang sinh GN, a & 37°C trong 16 - 20 git 6.3.3. Phan lap Dimg que cay vong cay dich tang sinh lén ede mdi tru@ng thach dia chon loc. Vi khucin Shigella rat mhay cam véi diéu kién mi trugng nudi edly, dé cé thé phat hién duge Shigella véi higu sudt cao nhat, nén. sit dung it mht hai loai moi truding phan lép khac nhau. MOt so méi truong phan lp cé tinh chon loc khée nhau cho Shigella lA T7A, XLD, HE va MAC. Sau khi cdy, d cde dia méi truding ¢ nhiét dé 37°C trong 24 - 48 git: Biéu hign eda Shigella trén ce moi trudnug phan lap nhu sau; ~ Mai truémg T7A: méi tru’ng ban dau dye nhu sia co mau xanh hoi vang ahe. Trén méi trugng nay khudn lac Shigella cé mau xanh nhat. ~ Trén méi truéng MAC: khuan lac Shigella c6 mau nau dé, trong sudt. - Trén méi truéing XLD : khudn lac Shigella co mau dé, trong suét. 128eR - Trén méi trudng Deoxycholate Citrate Agar, khudn lac Shigella cé mau dé nhat (méi trudng cé mau dé cam, hoi duc). ~Trén mdi trudng thach HE : khudn lac Shigella cé mau xanh nhat, trong sust. 6.3.4. Khéing dinh bang thit nghiém sink héa va huyét thanh Tit cde khudn lac nghi ng trén mai truéng phan lap, chon it nhat 5 khudn lac c4y lén mdi truting khdng chon loc (nhu TSA), & 6 37°C trong thdi gian 20 - 24 gio. Cac khudn lac xuat hién trén moi trudng nay duoc st dung dé tién hanh cde thé nghiém sinh hoa va khang huyét thanh. ~ Tht nghiém sang ic: truée tién cdc dong duge nghi ngé la Shigella duge cay vao méi trugng TSI, u g 37°C trong 24 gid. Shigella cho phan ing kiém trén mat nghiéng va acid ¢ phan s4u, khong sinh hai va khong tao HLS trong méi truing. Céc dong cé phén ving nhu trén duge thi nghiém dé khang dinh Shigella ~ Thif nghiém khéng dinh: ede thit nghiém sinh héa edn 1ign hanh 4é khang dinh Shigella va cdc dic trimg sinh héa cia nhém nay duge tom tAt mhu duéi day. Chi tiét quy trinh thue hién ede thi’ nghiém sinh héa nay duge trinh bay 6 chuong IV. Thi nghi¢m sinh hoa = Két quad Thi nghi¢m sink hoa Két qua: Simmon citrate - Salicine ~ Arginine decarboxylase - Xylose - Lisine decarboxylase - Cellobiose - Urease - Adonitol - Malonate - Duleitol MR + Inositol - vp - Cac vi sinh vat c6 cdc phan ting sinh héa dje tring nhu tren duge khang dinh la Shigella spp. Dé xc dinh loai Shigella nhiam vao trong mau, cdn thyc hign cae phan ting sinh héa dae trung cua ting loai nhuf sau: @-PKUONG DHAP PHAN TIC 128Dac tring sink hoa —_$. dysenteriae S. flexneri S. boydii_ S, sonnei Sinh khi tit glucose - - a “a B-galactose +” - + + Ornithin decarboxylase - - ay + Indol + » - Acid tir dulcitol ao - - Lactose - ” a ro Mannitol ~ + + + Raffinose - + ~ ” Saccharose - - - il Xylose = ~ + - ” Cte dong S dysenteriae 1 vi $. sonnei tun ihn cho phan ting duong tinh; * Sadysenteriae t vG S. flexneri 6 luén iuén che phan tng dm tink, S dysenteriae 2 thi duong tinh: Phan img duong tinh chi bidu hign 24 gids sau nudi edly; © S. dysenteriae va S. flexneri 6 06 1hé cho phan img duong tinh. 6.3.5. Khéng dinh bang thit nghiém khang huyét thanh ‘Thue hién thir nghigm khang huyét thanh bing huyét thanh da gid A. B, C, D tir cde dong duge nudi cély trén mdi trudng thach khéng chon loc. Tién hank céc déi ching (-) trén nuéc mudi sinh ly. Mit sé Shigella tao thanh khang nguyén bé mat (khang nguyén K) co thé lam che mat khang nguyén O va lam cho phan ding ngung két khong dién ra. Vi thé khi khéng c6 biéu hién ngung két, cin thuc hién viée dun sdi dich vi khudn trong khodng 30 phut dé loai bd khang nguyén bé mat. Sau a6 tién hanh lai thd nghiém ngung két. 6.4. Béo cdo két qua Ket qua duge bao c4o dudi dang phat hién hay khong phat hién Shigella trong 25g mau. Can uu ¥ Shigella la nhém chifa cée dang gay bénh nguy hiém, 06 thé gay cde triéu ching bénh ¢ mat do xam nhiém rat thap. Do vay can twain tha triét dé cde bién phdp an toan khi lam viée véi cée ching Salmonella ding lam 46i ching (+) cing nhu khi thao téc trén cic ching phan lap duoc. Cae méi cruéng hay mau vat sau nudi céy cdn phai hap khit trimg cain than truée khi ria. Quy trinh phat hién va dinh danh Shigeila trong thuc phim duge tom tat trén Hink 5.7. . 130 7“oy ‘dng nhét 25g mau trong 225m} TSB, chinh pH vé 7,2, 0 6 37°C.16 - 20h + Cay 0,1ml dich tang sinh sang 10m| mdi truding GN, & 6 37°C,16- 20h Phan lap khudn lac dan trén it nhat 2 mi trudng chon igc phan bigt (T7A, MAG, XLD, HE, DC ..), 08 37°C, 24 - 48 gid ¥ Chon cde khuin iac dic trung cho Shigella, cay sang BHI hay TSA; U qua dém 6 37°C ¥ This nghiém sinh héa cho két qua: = KIA hoae TSI: dd/vang /H,S (-)/gas (-) ~ Di déng trong thach mém: khang di dong ~ Oxydase (-) Y Thu nghiém sinh héa khang dinh. t Két luan: Shigella ducng tinh / Am tinh trong 25g mau t Thit nghiém sinh hoa chuyén biét va thyc hién ngung két huyét thanh dé phao loai Hinh & 7 Quy tinh phat hién va dinh danh Shige trong thue phim 7. VIBRIO 7.1. Dinh nghia va nguyén tac Vibrio 1a vi sinh vat gram 4m, hinh que bai ddu khong déu nhau tao thanh hinh dau phay, di dong, séng ky khi tury ¥, c6 phan img catalase va oxidase (4), len men glucose nhung khong sinh hoi, khong sinh H.S, nhay 131cdm véi Vibriostaticum 0/129. Trit V. cholerae hien dién ¢ ving nude ngot. tat cd cde loai Vibrio khac déu cdn mudi dé tang trudng va thudng xuyén duge phan lap duge tit cdc ving nuée ven bién. Gidng nay c6 4 loai la tic nhan gay bénh cho nguti-gom: V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus va V. alginolyticus duge phan biét dia tren cdc dic diém sau day: V. cholerae cd phan tng oxidase (+), tang tring duge trong mdi trumg canh trypton ¢ 42°C, arginine dehydrolase (-), lysine decarboxylase (+), lén men duge sucrose (saccharose), khit nitrate thanh nitrite, co thé tang truéng duge trong méi trudng chifa 0 - 3% NaCl, khong phat trién duge trong cde mdi trugng chita 6, 8, 10% mudi. V. parahaemolyticus ¢6 phan ung oxidase (+), phat trién duce trong canh trypton ¢ 24°C, phan ting ADH (-), LDC (4), 6 khé nang khi nitrate thanh nitrite nhumg khong Jén men sucrose, sy dung duge mot s& ngudn carbohydrate khac dé lén men nhung khong sinh hdi, khong tang truéng duge trong moi trutng khong cé mudi, ving truéng tét trong mai truéng oé6 dén 8% mudi nhung bi we ché trong mdi trusng chia 10% mudi. ¥. vulnificus khde véi hai loai néu trén 1a khong lén men sucrose, khong tang trudng duge trong méi trung khong c6 mudi, bi we ché trong mdi trugng ¢6 8 - 10% mudi. V. alginolyticus cé kha nang lén men dudng sucrose, khong tang trudng duge khi trong moi truéng khéng c6 mudi nhumg cé thé phat trién trong méi truéng chia dén 10% mudi Co thé phat hién cdc loai Vibrio dya trén nguyén tde sau day: Mt lugng mau xéc dinh duge tang sinh trong mdi tru’ng chon loc dae trung. Cay phan lap tif méi truéng tang sinh sang méi truong ph4n biét chon loc dac trung. Cac khudn lac nghi ngd trén méi truéng phan Jap duge Khang dinh bang ede thir nghigm sinh hoa va huyét thanh hoc. Méi truéng tang sinh chon loc cho Vibrio cholerae, V. alginotyticus va V. vulnificus la nude pepton kiém. Trong khi d6 méi truéng Colistine Polymicine Broth thuing duge ding dé tang sinh V. parahaemolyticus. Méi trusng thudng ding dé phan lap Vibrio 14 TCBS (Thiosulphate Citrate Bile Sucrose Agari. Cac vi sinh vat lén men duc sucrose trong méi truting nay sé cho khudn lac mau vang va lam acid héa méi truting ben dudi khudn Igc. Néu vi sinh vat khong lén men duge dudng sucrose sé cho khudn lac mau xanh. 132 3S7.2. Méi truing vA hod chat — Canh Pepton kiém Alkaline Peptone Water (APW) - Canh Colistine Polymicine Broth (Colistine) ~Thach Thiosulphate Citrate Bile salt Sucrose (TCBS Agar) — Canh Tryptone ~Thach Kligter Iron (KI) ~ Canh Hugh Leifson Glucose (HLG) ~ Canh Carbohydrate tim ~ Méi trudng thi nghiém Decarboxylase (Moeller) ~ Dung dich oxidase — Dung dich thu nghigm String (sodium desoxycholate 5%) ~ Khang huyét thanh polyvalent O dig cho V. cholerae — Khang huyét thanh O — Dung dich NaOH 1N ~ Dung dich HCl 1N - Dung dich dau phi v6 trang ~ Dung dich Bromocresol tim 7.3. Quy trinh phan tich 7.3.1. Tang sinh chon ioe Can 25g m4u vao trong bao PE v6 tring, thém 225 mi canh thang tang sinh chon loc {dimg nuée pepton kiém chita 1% mudi NaCl cho trugng hgp V. cholerae, V. vulnificus, V. alginolyticus; canh Colistine cho truéng hep V. parahaemolyticus). Déng nh&t mu bing m4y dap mau. U 37°C trong 6 - 8 gid. 7.3.2, Phan lap Dung que cdy vong ria vang trén bé mat mdi trudng tang sinh chon joc 1én bé mat dia thach TCBS dé phan l4p khudn lac don, U 37°C trong 18 - 22 gid. Hink dang khudn lac dae trung ciia cde loi Vibrio trén méi trudng nay la nhu sau: Khudn lac V. cholerae va V. alginolyticus lén, dugng kinh khodng 2 - 3mm, lang, c6 mau vang, hoi phang, tam duc va chung quanh khudn lac cé quang trang dye (x. dnh 28). Khudn lac V. parahaemolyticus va V, vulnificus lon, duéng kinh khoang 3 - 4mm, cé mau tif xanh dén xanh duong. Tiép theo, cdy chuyén sinh khoi tir céc khudn lac @4c trimg trén méi truéng phan lap sang modi truding khong chon loc hay thach méu, d qua dém 6 nhiét dé 37°C dé thu sinh khéi st dung cho cae thi! nghiém sinh héa. 1337.3.3. Thit nghiém sinh ha Cae thf nghiém sinh héa quan trong dé phat hién hay phan biét cdc loai Vibrio la: quan sat tinh di dong trén kinh hién vi, quan sat su di dong trén thach mém va ede thir nghiém khée. Cae dac diém sinh hoa cia V. cholerae la: ONPG (4), lactose (-, ADH (-j, LDC (4), TDA (-), Indol (+), manose (+), sucrose (+), oxidase (+), tinh a man NaCl 0% (+), 3% (4), 6% [-), B% (-), 10% (-]. Cae dae diém sinh héa cia V. parehaemolyticus la: ONPG (-), lactose {-), ADH (-), LDC (4), TDA (-), Indol (+), manose (+), sucrose (-), oxidase (4), tinh ua man NaCl 0% (-), 3% (4), 8% (+), 8% (+/+), 10% (-), 7.3.4. Tht nghiém khang huyét thanh Thit nghiém ngung két huyét thanh duge dimg dé xac dinh cae dong Vibrio 6 cde biéu hign khdng nguyen chuyén biét. Trueng hop V. cholerae c6 thé phan hiét duge ec dong V. cholerae O, va V. cholerae non- 0, tkhae O)} nbur sau: ~ Thtt nghiém voi khang huyét thanh da gid polyvalent O nhom 1: nhé mot gigt khang huyét thanh O da gid lén phién kinh sach va mot gigt nude mudi sinh ly lén mét vi tri khée cia phién kinh. Ding que céy vo trung chuyén vi khuén lén 2 gigt dung dich trén, phan tan déu vi khuéin vao trong giot dung dich. Két luan (+) khi cé hign tugng ngung két. ~ Mae dinh kiéu khang nguyén O,: dimg khang huyét thanh don gia Inaba va Ogawa. Khang huyét thanh Inaba (+) khi khang nguyén chi ngung két vi khang huyét thanh Inaba va khéng ngung két vdi cdc mhom khée hay dung dich mudi sinh ly, Khang huyét thanh Ogawa (+) khi khang nguyén chi ngung két vdi khang huyét thanh Ogawa va khong ngung két véi cac nhém khéc hay dung dich muéi sinh ly. Khang huyét thanh Hikojima (+) khi khang nguyén ngung két v6i khang huyét thanh Ogawa va Inaba nbung khéng ngumg két véi dung dich mudi sinh ly. Phan tmg khdng nguyén 1a (~) khi ching khong ngung két vdi cdc nhém khang huyét thanh néu trén va khong ngung két vdi dung dich muéi sinh. ly. Truéng hgp nay cé thé gap do sai 4m trong thao tac thir nghiém hode Ja do ching Vibrio nay trén thugc nhém non-O,. Phan tng ngung két la khong dae higu khi tat ca thit nghiém khang huyét thanh déu cho két qua (+3. Tring hop V. parahaemolyticus thyc hién ngung két véi hai loai huyét thanh 1a huyét thanh O va huyét thanh K. Tuy nhién trong mot s6 trugng hgp khang nguyén O bj khang nguyén K che lp, vi thé cin 134phai mi ly ching trade khi thye hign ngung két voi khang nguyén O bing cach dimg que cay chuyén sinh khéi cia ching trén moi trudng thach chon lge vao dung dich nuée mudi 3%, hap & 121°C trong 1 gid dé bidu 16 khang nguyén O ra bén ngoai. C4c kiéu khéng nguyén cia V. parahaemolyticus dive tém tt nhu sau: Nhém O Kiéu khang nguyén K Nhém O Kiéu khéng nguyén K 1 1, 25, 26, 23, 28, 41, 56, 58", 64 6 18, 46 2 3, 28 7 19 3 4". 5, 6, 7, 29, 30a, 81, 33,37, 8 20, 21, 22, 39, 62 43, 45, 48, 54, 57, 58", 59 9 23, 44 4 4%, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 34, 42, 10 19, 24, 62 49, 58, 55, 63 al 36, 40, 50, 51 5 15, 17, 30%, 47, 60, 61 * @6 cling kidu khang nguyén Kd cde nhém O khée nhaw 7.4. Bao cdo két qua Két qua duge bao cAo dudi dang phat hién hay khéng phat hién V. cholerae hay V. parahaemolyticus trong 25g mau. Can luu ¥ Vibrio 14 nhom chifa ede dong gay bénh nén cén tuén thi trigt dé cdc bién ph4p an ton khi lam viée v6i e&e ching Vibrio ding lam déi chtmg (+) cing nhu khi thao téc trén céc ching phan lap duge. C&c méi truémg hay mdu vat sau nudi cay cdn phaéi hap khtt tring cén than trudc khi rita. Quy trinh phat hign va dinh danh V. cholerae va V. parahaemolyticus dugc tom tat trén Hinh 5.8. 135136 Ddng ahat 25g mau trong 225m| APW hoae Colistine U canh khudn 6 37°C Phan lap lén TCBS Sau 16 - 24 gid Phan lap len TCAS. U & 37°C trong 24 gid Chon khudn lac dae trung: ~ V. cholerae: khudn lac vang, ¢ 2 - 3mm ~ V. parahaemolyticus: khuan lac xanh, ¢ 3 - 4mm. t Ria lan TSA chia 1% NaCl hay BHI, U qua dom 6 37°C This nghiém so bo: — KIA: dé / vang. Hy (-), gas (-} ~ Di dong trong thach mém: (+} ~ Oxidase: (+) ~ KOH thir Gram: (~) ———____-_-¥ Thi nghiém khang dinh ¥ Két lun V. parahaemolyticus / V. cholerae Hinh 6.8 Quy trish phat hign va dinh canh V. cholerae va V. parahaemolyticus8. LISTERIA MONOCYTOGENES 8.1. Dinh nghia va nguyén tie L. monocytogenes la vi khufin cé hinh gay ngén, manh. gram duong sau khi nuéi cay 20 gid, cho th’ nghiém catalase (+), oxidase (~), chuyén dong xoay tron thanh dgt trong tiéu bdn giot treo (khi nudi cdy & 20 -28°C), cé kha nang thiiy gidi esculin va lam tan huyét trén méi truéng thach mau. sinh acid tit rhamnose uhumg khdng xylose, c6 phan ing CAMP (+) vei Staphylococcus aureus va (-) véi Rhodococeus equi. L. monocytogenes 1A mot tac nhan gay bénh listeriosis rat nguy hiém (nhiém tring mau, say thai ¢ phu nif, viém mang ndo, gay ti vong thai nhi) c6 ti 16 tt vong rat cao (30 - 35% 4 ngudi ldn va 70% & tré em), Loai nay thuéng duge phét hign trong thife an gia suc, nue, nude thai, 1a toai dae biét nguy hiém trong cdc loai thyc pham da qua gia nhiét. Cac quy dinh vé an toan vé sinh thye phdm thudng khéng cho phép su hién dian cua L. monocytogenes trong 25g thyc pham 4a qua gia mhiét nhimg cho phép 100 CFU/g déi véi thyc phém phai gia nhiét truée khi sit dung. Quy trinh phat hién L. monocytogenes duge thuc hien bang qué trinh tang sinh 2 giai doan. Mau duge cén vao trong tii PE v6 tring, déng nhat vdi mdi trudng tang sinh so cap. Sau khi d 24 gio, dich nudi cdy duge chuyén yao mai trudng tang sinh thi célp va duge 6 tiép 24 gid, Hien nay quy trinh ¢: *n cho phép tang sinh mét giai doan nhung thdi gian tang sinh 1a 48 gid. Quy trinh tang sinh mét giai dogn duge sit dung khi cdc mau 6 mat dé vi sinh vat nhiém thap; quy trinh tang sinh hai giai doan duge su dung cho cdc mau cé mat 46 vi sinh vat nhiém cao. Sau buée ting sinh, canh khudn duge chuyén sang bude phan lap trén méi trugng chon ige dac trung. Cac khudn lac nghi ng duoc khang dinh bang ede dac tinh hinh thai, sinh ly va sinh hoa va mién dich bang cde thi nghiém dac tring. Trong phat hign L. monocytogenes can sti dung cdc ching vi sinh vat lam d6i ching nhu: L. monocytogenes, L. innocua, S. aureus dung huyét B yéu, R. equi. 8.2, Méi trudng va hod chat ~ Canh tang sinh so cap Listeria Enrichment Broth I (LBI) - Canh tang sinh thi cap Listeria Enrichment Broth II (LBID) duoc chuan bi thanh cde éng nghiém 10m! - Méi wrung Enrichment Broth (EB) cai bién tit moi truing LB, duge st dung trong quy trinh tang sinh mét giai doan ~ Mai truéng thach Oxford Agar ~Thach mau 137~ Méi truong thach mém BHI: BHI chifa 5g agar, phan phéi Sml vao trong céc éng nghigm ~ Rhamnose Phenol Red Broth (RPR}, Xylose Phenol Red Broth (XPR) ~ Thude thi catalase, oxidase 8.3. Quy trinh phan tich 83.1. Ting sinh PDéng nhat 25g mau trong 226ml mdi trugng tang sinh LBI bang Stomacher trong 30 giay. U 30°C trong 24 gid, Chuyén 0,1 ml LBI sang ong 10 mt LBII tigp tye U ¢ 30°C trong 24 giv. Quy trinh tang sinh mot gini doan duge thuc hign nhu sau: Can 25g méu, thém vao 225ml canh EB (da dugc lam 4m 6 45°C néu mau thir 1a cae san phém cia sta va 6 30°C d6i véi cae sadn phim khdc) va tién hanh déng nhét mdu trong 30 giay, U 4 30°C trong 48 gia. 8.3.2. Phin lip Dung tam béng v6 tring tham dich mau tu dng tang sinh, trai sang 1/2 dia méi truong Oxford Agar. Tir nhitng vét cy nay dimg que cay vong ria sang V/2 dia con lai. U 4 37°C trong 24 - 48 gid. Trén mdi trubng nay Khuan lac Listeria c6 mau x4m hay néu duge bao quanh béi vong den, khudn lac 1ém, nh, dudng kinh khodng 1mm (x. anh 29) 6.3.3. Khang dinh - Thi kha nang tan huyét: chon khudn lac dién hinh trén mdi truéng thach Oxford, ding que cay vong cAy chuyén sang méi trueng thach mau, U 6 37°C trong 24 - 48 gid. Trén méi truéng thach mau khudn lac L, monocytogenes duge bao quanh béi vong tan huyét hep do hién tugng dung huyét dang §. Truée khi tién hanh thi khang dinh, cay chuyén khudn lac nghi ngo L. monocytogenes sang mot méi trubng léng Khong chon loc, i ¢ 25°C trong 20 giz. ~ Thif nghiém catalase va oxidase (xem chudng IV): L. monocytogenes cé catalase (+) va oxidase (-). ~ Nhu6m gram: Listeria nhuém gram duong. ~ Kha nang di dong phuang phép giot treo: Listeria spp. chuyén dong xoay tron trong canh tring i ¢ 26°C. Thi tinh di dong trong éng nghiém: cay vi tring bing cach dém sau vao thach mém trong éng nghiém, & 25°C trong 40 gid hoac lau hon, kiém tra sy tang truéng cia vi khudn xung quanh duéng cély, Listeria spp. di dong tao hinh chiée di cach bé mat thach vai mm. 138, 2~ Kha ning bién duéng dudng: i e4c ong canh tring thir kha nang len men dung 6 37°C trong 7 ngay. Két qud (+) (mau vang) thueng quan sat duge trong vong 24 - 48 gid. L. monocytogenes len men dutng rhamnose nhung khéng cé khé nang lén men duong xylose. ~ Tht thi nghigém CAMP: trén dia thach dung dé thi CAMP, cay ‘S. aureus thank mét dudmg cdy mang, tuong ty cy R. equi dé tao thanh hai duong cy song song céch nhau 4 cm (Hink 5.9), L. monocytogenes Ching kiém tra S. aureus Hinh 5.9 $0 dé phan bé dudng cy céc ching trong th nghiém CAMP Cay ching nghi ngo Listeria 6 gita, gan nhmg khéng cham vao hai dutng cdy song song cia S. aureus va R. equi. C6 thé cy mot hode nhiéu dong vi khudn nghi ngs L. monocytogenes (chting thit nghiém) dé kiém tra trén cling mét dia. Cay chting di ching (+) L monocytogenes va ching L. innocua nhu huéng din trén Hink 5.9, U dia 4 37°C trong 20 - 36 gid. Phan ting (+) khi xudt hién vong cOng hudng tan huyét ngay tai ranh gidi cia ching thir nghiém vdi S. aureus hode gitta ching thir nghiém véi R. equi. Phan img CAMP (+) véi R. equi sé tao ving tan huyét rong (6 - 10 mm) va co hinh dang dau mii tén. Phan tng (+) vdi S. aureus thugng tao ving tan huyét hep (khoang 2mm) cé dang hinh tron. L. monocytogenes cho phan tng CAMP (+) v6i 8. aureus va (-) vai R. equi. Neue lai, L. innocua c6 phan ing CAMP (-) véi cd hai loai S. aureus va R. equi. 8.4, Bao cdo két qua. Béo cdo phat hign hose khong phat hién L, monocytogenes trong 25g mau. Quy trinh phat hién L. monocytogenes dude tom tdt trén Hinh 5.10. 139Déng nhat 25 g mau trong 225g LB I, U8 30°C. 24 gid ¥ Cy 0,1ml canh khudn sang 10m! méi truding LB il, 6 30°C, 24 git z Ria lén dia Oxtord Agar, & & 30°C, 48 gis ¥ Chon céc khuén la ic dac trung Listeria a Ria lén dia thach TSA, b qua dém t t ¥ ¥ ¥ t CAMP Thach Thach Soicanh | |Canh Canh véi maud 6 | |mém,a khudn APR.GS | |XPR, S$. aureus | |37°C 24 625°C , BHI da G 87°C, 48 us37C, va - 48 gid 24-48 825°C, gid 48 gis Ri. equi gid 20 gitt ie eee ee ee ‘S.aureus: Tan Di déng Chuyén Duong Am « mau hinh du dong tinh tinh éu tron xoay A. equi y than ‘ron ©) mém I Két ludn Listeria monacytogenes (+)/(-) trong 25g mu 140 Hinh §.10 Quy lrinh phat hign L. monocytogenes trong thyc phdm caCan luu ¥ L. monocytogenes la tae nhan gay bénh dic biét nguy hiém. Nguoi dang mang thai, ngui suy yéu hé mién dich... khong duge tryc tiép lam viéc voi vi khudn nay. Can than trong va tudn tha nghiém ngat ede quy dinh an toan khi thao tdc trén vi sinh vat gay bénh khi tién hanh phan tich thi nghiém Listeria. Néu e6 digu kién nén phan riéng khu vuc danh cho phan tich Listeria. Cac mai truéng hay dung cu sau khi nuéi cay phai duge hap kh trang truée khi rifa hay thai bé. 9. BACILLUS CEREUS 9.1, Dinh nghia va nguyén tée B. cereus la nhitng tryc khudin, gram duong, hiéu khi va ky khi tay y, di dong, tao néi bao tu, lén men glucose sinh hoi, phdn ding VP (+), cé kha nang sit dung nitrate. Loai nay tang truéng duge trong khoang nhiét do vir 5 ~ 50°C, t6i uu 6 35 - 40°C; pH dao dong tir 4,5 - 9,3, dé tao bao tif va bio ti nay mam rat dé dang. Trén mdi trudng chon lec loai nay tao khuéin lac réit to, moc lan, ria nha, Vi khudn nay hign dién trong dat, bui, cde loai thye pham (sifa, thit, rau qua, hén hgp gia vi, san ph4m khé ..). Vi khudn c6 thé ‘Wét ra hai logi déc t@ chinh 1a diarrhoeal toxin gay tiéu chay vA emetic toxin gay nén mua. Loai nay phan biét véi cac loai khac trong Bacillus nhom 1 nhu B. anthracis gay bénh than 4 ngusi, B. thuringiensis tao doc to két tinh gay bénh cho con tring, B. mycoides, B. megaterium dya vao céc diac tinh sinh héa duce trinh bay trong Bang 5.1. Bang §.1 CAC DAC TINH CLA BACILLUS NHOM I : Loai 1 Dac tinh B.cere | B, thuvin B. B. B. I -gicnsis mycoides | anthracis | megaterium. Gram + + + + | Catalase + + + + + ae +e -" = v- Khir nitrate + we + + = | Phan huy tyrosine + + + o + 1 Khang lysozyme + + + + = Phan ting vei long do trun + + + + — [ben men glucose + + + + = Phan ting VP + * + + - Sinh acid tit mannitol = = = = + Tan mau cmdu ein) + + + = = * ¥:90-100% ee chiing duong tinh; " +/ cde chiing IA Am tinh: 4 -- Hau hét céc ching 1a + 60-50% cée ching dusng tink; ¢ ~: 90-10% im tink, 141B. cereus duge phat hign va dinh lugng bing mdi trung thach chon loc Mannitol-Egg Yolk-Polymycin (MYP) hoae Cereus Selective Agar (MOSSEL), Polymycin Elgelb Mannitol Bromothymol Blue Agar (PEMBA). Khudn tac B. cereus cé hinh thai dac trung trén cdc méi trudng nay. Cac khudn lac nay cé thé duge tiép tue khang dinh dua trén céc tht nghiém sinh héa véi cdc dac diém nhv lén men glucose sinh acid trong diéu kién ky khi, khit nitrate thanh nitrite, thii nghiém VP (4), thiy phan L-tyrosine, tang truéng duge trong 0,001% lysozyme. Ngoai ra B. cereus cing duge dinh lugng bang phuong phap MPN. 9.2, Méi tru@ng va hoa chat — Nude pepton dgm Buffered Peptone Water (BPW) ~ Thach Mannitol-Egg Yolk-Polymycin (MYP) - Thach Polymycin Elgelb Mannitol Bromothymol Blue Agar (PEMBA) ~ MAi trutng thach Cereus Selective Agar (MOSSEL) - Nho long dé tring (Egg Yolk Emulsion), 50% - Canh Trypticase Sey Polymyein (TSP) - Canh Phenol Red Glucose ~ Thach Tyrosine - Canh Lysozyme — Méi trusng thit nghiém Voges-Proskauer - Cauh Nitrate Broth - Thach dinh dudng Nutrient Agar cho B. cereus ~'Thach méu Trypticase Soy Sheep ~ Mai trutng kiém tra sy di déng = Thuée thit nitrate (dung dich A, dung dich B) ~ Héa chat nhuém Gram 9.3. Quy trinh phan tich Cho 25g mau vao tdi PE, ba sung 225ml mdi trugng pepton dém (BPW) déng nhat dé co dé pha loang 10, déng nhat bing Stomacher trong 1 phwit. Mau tiép tuc duge pha lodng thanh day thap phan dé cé cac 6 pha loang thich hgp. 9.3.1, Dinh lugng B. cereus bang phuong phép dém khuan lac a. Phat hign bang mai truong chon lge Trai 0,1ml méi dé pha loang lén méi trutimg thach MYP, & 24 git & 30°C. Do B. cereus khong lén men mannitol, tao lecithinase va khang 142 Br %polymycin nén trén méi trugng nay khudn lac B. cereus o6 mau héng eosin, duge bao quanh bdi ving ¢6 tia chitng 16 lecithinase duce tao thanh. Truong hop su dung méi tru’ng MOSSE, khudn lac B. cereus to, mau héng, xung quanh cé vong sang. Chon tit 5 khudn lae (+) cy sang thach nghiéng dé chudn bj cho cdc phan tng khang dinh B. cereus, 4b. Cae thit nghifm khang dinh ~ Nhuom Gram: cdiy ria cde khudn lac chon tit mdi tring MYP hay MOSSEL sang dng thach dinh dung. U d 30°C trong 24 gid. Sau do tidn hanb nhugm Gram, quan sat duéi kink hién vi. Viée nhudm Gram 6 thé duge thye hién bang phuong phap Jensen hay phuong phap Hucker. Truéc tién, tao vet boi vi sinh vat trén phién kinh. Chon mét phién kinh sach, dong but ghi trén kinh vé 1 vong tron dudng kinh khodng 2em 3 mat dudi cia phién kink. Dat 6 vj tri tuong tng véi vong danh dau & mt trén cia phién kinh vai giot nuée cét thanh mét giot Idn. Ding que cy vong chuyén mét ft sinh khéi khudin lac yao giot nuéc trén phién kinh, Ahuay nhe bang dau que cay dé duge huyén phi déng nhét va boi déu trong khu vye cila vong tron, Trutng hgp ching nim trong dich nuéi cy thi dimg que ey vong chuyén vai vong dich t& bao lén ving vong tron 6 trung tam bé mat phién kinh. boi déu trong khu vyc cia vong tron. Dé yén cho vét boi khé. Ding tay gitt hai canh cia mt déu phién kinh, dua phién kinh (8 vi tri canh vét boi) qua lai vai ln trén ngon Ida dén edn hoge dén Bunsen dé od dinh vat béi trén kinh. Trénh dé vét béi tiép xue trye tiép v6i ngon Ita. Thue hién tuong ty dé tao mét vet béi chung hai ching vi sinh vat déi chimg trong cing mot phién kinh khée. Sit dung £. coli lam ching déi chimg cho Gram (-) va Staphylococcus aureus tam ching 4éi ching cho Gram (+) Theo phuong phap Jensen, nhé vai giot dung dich methyl violet lan vet béi, gif yén trong 20 giay. Dung binh xit nude, bom nue lén vét béi dé rl sach phdm nhuém. Nhé vai gigt dung dich KIM, lén vét boi, && yén 1 phut, Ding binh xit chifa edn 95%, bom cén lén vét boi, rita phém ahudm dén vita mat mau. Dé yén vai gidy sau dé ria lai bing nude. Nh bang dung dich safranin 30 gify. Rita sach bing nuée, Tham nuée du bang gidy loc. Theo phuong phap cia Hucker, bing thao tée tuong ty nhu ¢ phuong phap Jensen, nhum vét béi 1 phuit bang dung dich crystal violet, Rua bang nude, Nhugm bing dung dich KIM, trong 1 phot. Khit mau bang céch xit cén 95% cho dén khi sach mau. Rita Jai bang nue va nhudm bing dung dich safranin trong 2 phuit. Sau khi thyc hién xong quy trinh nhujm, quan sét mau nhudm cia t& bao bing vat kinh 100X nhang trong dau (xem chuong IV). Té bao nhuém Gram (+) c6 mau xanh tia (S. aureus), té bao nhudm Gram (~) cé mau dé héng (E. coli). B. cereus 1a tryc khufin ldn, Gram duong, thuong két hop vai nhau thanh dang chudi. Bao tif hinh bau due, khong 06 dang nang bao ti, 143Dimg que céy vong c&y chuyén mot long sinh khéi chang thit nghiém trong éng thach dinh duéng vao 0,5mi BPW v6 tring. Huyén phi hoa dich nay dé sr dung cho c&e phan tmg sinh héa. - Thu nghigm lén men glucose: cy vi khudn vao 3 ml canh Phenol Red Glucose Broth, & 4 35°C, 24 gid trong diéu kién ky khi. Lac dng nghiém that manh va quan sat su phat trién thong qua dé duc vA su chuyén mau méi trudng tt dé sang vang, chung té sy sinh acid tir glucose trong diéu kién ky khi. ~ Thd nghiém kha nang khii nitrate: efy vi khudn vao 5 ml méi trudng canh Nitrate Broth, a 6 35°C trong 24 gid. Kiém tra su hién dign cua nitrite bang cach bé sung vai giot dung dich A va dung dich B cia thuéc thi nitrate. Néu co mau cam xuat hién trong ving 10 phit thi ching t6 nitrate bj khu thanh nitrite. ~The nghiém VP: (xem chuong IV) — Thtr nghiém kha nang thiy phan tyrosine: céy vi khudn vao thach ughiéng Tyrosine, w & 35°C trong 48 gig. Sy xudt hign ca sinh khoi, kbutin lac la chi thi tyrosine bj phan hay ~ Thit nghiém véi canh Lysozyme Broth: cy vi khudn vao 2,5ml mdi tring Nutrient Broth chia 0,001% lysozyme. The hign twong tu vai mdi tring Nutrient Broth khéng chia lysozyme. U éng nghiém é 35°C trong 24 gid. Kiém tra sy tang trudng trong mai trudng chia lysozyme va méi truéng déi ching. U nhitng éng 4m tinh thém 24 gid trude khi két luan két qua thi nghiém. Dua vao Bang 5.1. d& khang djnh dang da chon la B. cereus hay khong. ¢. Cée thit nghi¢m phan bigt ete loai trong Bacillus nhém 1 Dé phan biet cdc loai khde nhau trong Bacillus nhém 1 can tiga hanh bé sung cde th nghiém sau: » Thi nghiém tinh di 4gng: ding que edy vong cdy dich 24 gi nudi cay théing vao gitfa mdi tru’ng kiém tra di déng cho B. cereus. U 6 30°C, ti 18 - 24 gid va kiém tra dudi énh dén kiéu moc doc theo dudng edy. Lo&i di déng moc khuéch tan vao méi trvting theo hudng xa duting cély. Loai khong di déng chi moc trong va doc theo duéng cély. Bd sung 0,2ml nude cat v6 tring vac bé mat méi trugng thach nghiéng Nutrient Agar. Cay huyén phi vi khudn vao. U thach nghiéng wit 6 - 8 git d 30°C. Nhé nuée vé trong lén phién kinh va dat sinh khdi vi khudn vao. Quan sdt ngay dudi kinh hién vi dé kiém tra sy di dong. Hau hét c4c ching B. cereus va B. thuringiensis la di dong, B. anthracis va hau hét cde ching B. mycoides khong di dong. 144 ee