MODUL 3 Teknik Kultivasi Bakteri

POKOK BAHASAN :
1. Pengenceran Suspensi Bakteri dari Sumber Isolat/Lingkungan
2. Teknik Kultivasi Bakteri (Solid and Liquid Medium)

TUJUAN PRAKTIKUM :
1. Memahami persiapan dan pelaksanaan pengenceran suspensi bakteri sebelum melakukan
kegiatan kultivasi bakteri;
2. Mengenal dan memahami teknik-teknik Kultivasi Bakteri (Solid and Liquid Medium).

TINJAUAN PUSTAKA :
1. TEKNIK PENGENCERAN SUSPENSI BAKTERI
Pengenceran suspensi bakteri dari sampel/ sumber isolat dari lingkungan dilakukan sebagai
upaya untuk mendapatkan kuantitas bakteri dalam jumlah yang dapat terhitung. Seperti yang
telah diketahui bahwa dalam sampel lingkungan komunitas bakteri berada dalam kuantitas yang
sangat melimpah.
Selain mendapatkan kuantitas yang dapat terhitung, pengenceran suspensi bakteri dari sampel/
sumber isolat dari alam juga diperlukan dalam rangka memudahkan dalam pengamatan koloni,
terutama dalam kegiatan bertahap pemurnian isolat (sub-kultur). Koloni yang tumbuh terpisah
dalam kuantitas yang dapat dihitung memudahkan peneliti untuk memilih koloni yang akan
dipisahkan (disub-kultur).
Pengenceran suspensi bakteri dari sampel/ sumber isolat dari lingkungan pada umumnya
dilakukan dengan teknik pengenceran berseri (series of dilution).

Praktikum Mikrobiologi Laut [M10B207] TA 2018-2019 Page 8

 Gambar : Teknik Pengerjaan Pengenceran Suspensi Bakteri

2. TEKNIK KULTIVASI BAKTERI

Kultivasi bakteri merupakan kegiatan untuk memindahkan bakteri dari sampel lingkungan ke
dalam medium kultur di laboratorium.
Ada 2 (dua) jenis medium kultivasi, yakni medium padat (solid medium) dan medium cair (liquid
medium). Kultivasi pada medium padat biasa dilakukan untuk bakteri-bakteri yang hidup pada
lingkungan yang kaya nutrient, sementara kultivasi pada medium cair biasa dilakukan untuk
sampel lingkungan yang tidak banyak mengandung nutrient.
Teknik kultivasi pada medium padat dapat dilakukan dengan 2 (dua) cara yaitu :
a. Metode Cawan Tebar (Spread Plate)
Suspensi bakteri hasil pengenceran dipaparkan di atas medium padat, kemudian diratakan
dengan menggunakan L-glass. Koloni bakteri akan tumbuh di atas permukaan medium
setelah cawan diinkubasi.

Gambar II-1. Kultivasi bakteri dengan Metode Cawan Tebar

Teknik kultivasi dengan metode cawan tebar hanya ditujukan untuk mengkultivasi bakteri
aerob.

Praktikum Mikrobiologi Laut [M10B207] TA 2018-2019 Page 9

 b. Metode Cawan Tuang (Pour Plate)
Metode cawan tuang dilakukan dengan memindahkan suspensi bakteri ke dalam cawan
petri, baru kemudian medium agar dituangkan setelahnya, lalu dihomogenkan. Setelah masa
inkubasi akan terlihat koloni bakteri tumbuh di atas permukaan dan juga di dalam agar.

Gambar II-2. Kultivasi bakteri dengan Metode Cawan Tuang

Teknik kultivasi dengan metode cawan tuang dapat dilakukan sekaligus untuk
mengkultivasi bakteri anaerob. Bakteri anaerob akan tumbuh di dalam agar.
Koloni yang tumbuh pada medium setelah proses inkubasi dapat dihitung untuk mengetahui
representasi jumlah koloni bakteri pada tiap-tiap seri pengenceran suspensi.

Gambar II-3. Perhitungan Koloni Bakteri dengan Total Plate Count (TPC)

Praktikum Mikrobiologi Laut [M10B207] TA 2018-2019 Page 10

 Teknik kultivasi bakteri dengan menggunakan medium cair (liquid medium) dilakukan
dengan memindahkan suspensi bakteri ke dalam medium kultur cair (broth). Pertumbuhan
bakteri dilihat dari Kurva Tumbuh Bakteri berupa kenaikan jumlah sel dalam skala waktu
pengamatan tertentu (Gambar II-4).
Pemgukuran kepadatan jumlah sel bakteri dilakukan dengan menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang (λ) 600 nm. Optical Density (OD) bakteri
merupakan representasi pertumbuhan jumlah sel bakteri pada perhitungan spektrofotometri

Gambar II-4. Kurva Pertumbuhan Bakteri

Pada kultur bakteri nilai OD600 dengan nilai sebesar 1.0 setara dengan kepadatan 8 x 108
sel/ml.

Praktikum Mikrobiologi Laut [M10B207] TA 2018-2019 Page 11

PROSEDUR PELAKSANAAN PRAKTIKUM :
1. TEKNIK PENGENCERAN SUSPENSI BAKTERI
Alat : Bahan :
 Mortar Keramik dan Penumbuk  Sumber Isolat (Akar Mangrove, Daun
 Tabung Reaksi Mangrove, Daging Kerang, dan Sedimen
 Rak Tabung Reaksi Laut)
 Pipet Volumetrik  NaCl Fisiologis/ Air Laut
 Vortex  Spiritus
 Busen  Kapas
 Autoclave  Kasa
 Tissue
 Plastik Tahan Panas
 Karet Gelang
 Kertas Label
Prosedur :
1. Masukkan NaCl Fisiologis/Air Laut ke dalam masing-masing tabung reaksi dengan
ketentuan sebagai berikut : satu tabung pertama diisi dengan 10 mL NaCl Fisiologis/Air
Laut dan enam tabung berikutnya masing-masing diisi dengan 9 mL NaCl Fisiologis/Air
Laut;
I II III IV V VI VII

10 mL @ 9 mL

2. Sterilisasi Seri Tabung pengenceran di atas beserta Mortar Keramik dan Penumbuknya
serta Pipet Volumetrik ke dalam Autoclave;
3. Gerus sumber isolat/ sampel lingkungan dengan bantuan NaCl Fisiologis/ Air laut steril
di atas Mortar Keramik steril,
4. Timbang 1 (satu) gram sampel (di atas alumunium foil), kemudian masukkan ke dalam
tabung I, vortex sebentar agar suspense homogen;

Praktikum Mikrobiologi Laut [M10B207] TA 2018-2019 Page 12

 5. Ambil sebanyak 1 mL suspensi dari tabung I dengan menggunakan Pipet Volumetrik
steril, kemudian masukkan ke dalam tabung II, vortex sebentar agar suspense homogen;
6. Lakukan langkah No. 5 untuk tabung III, IV, V, VI, dan VII.

@ 1 mL

I II III IV V VI VII

10 0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6

2. KULTIVASI BAKTERI (Solid and Liquid Medium)

Alat : Bahan :
 Cawan Petri Steril  Medium Nutrient Agar (NA) Steril
 Erlenmeyer steril  Medium Nutrient Broth (NB) Steril
 Jarum Ose  Seri Pengenceran 10 -6
 Pipet Volumetrik  Tissue
 L-Glass  Plastik Wrap
 Bunsen
 Vortex
 Inkubator
 Shaking Incubator
 Autoclave

Prosedur :
A. Spread Plate Method
1. Tuangkan Medium Nutrient Agar (NA) yang telah mencair (dipanaskan/ dicairkan terlebih
dahulu di atas Hot Plate) sebanyak 20 mL ke dalam Cawan Petri steril, ratakan;
2. Diamkan dan biarkan memadat di dekat bunsen;
3. Tuangkan sebanyak 200 µL suspense dari Tabung Pengenceran ke 6 ke atas Plate Agar
yang sudah padat, Ratakan dengan L-Glass di dekat Bunsen;

Praktikum Mikrobiologi Laut [M10B207] TA 2018-2019 Page 13

 4. Seal Cawan Petri dengan Plastik Wrap;
5. Inkubasi dengan posisi terbalik di dalam incubator (30 0C) selama 24 jam;
6. Amati dan Hitung Koloni yang tumbuh.

B. Pour Plate Method

1. Tuangkan sebanyak 500 µL suspensi dari Tabung Pengenceran ke 6 ke dalam cawan petri,
2. Ke dalam cawan petri kemudian ditambahkan sebanyak 15 mL medium NA yang masih
hangat (sekitar 30 0C),
3. Kemudian campuran diratakan dengan menggeser cawan petri di atas meja kerja dengan
membentuk angka 8,
4. Diamkan cawan petri hingga agar memadat sempurna,
5. Seal Cawan Petri dengan Plastik Wrap;
6. Inkubasi dengan posisi terbalik di dalam incubator (30 0C) selama 24 jam;
7. Amati dan Hitung Koloni yang tumbuh.

C. Kultur Cair (Liquid Medium)

1. Ambil sebanyak 1 mL suspense bakteri dari Tabung Pengenceran ke 6 dengan
menggunakan Pipet, tuangkan ke dalam 100 mL medium Nutrient Broth (Cair);
2. Goyangkan secara perlahan agar suspense bercampur;
3. Inkubasi pada incubator (30 0C) dengan shaking 150 rpm selama 24 jam;
4. Amati kekeruhan medium (sebagai indicator tumbuhnya bakteri) dan hitung densitasnya
dengan spektofotometri pada panjang gelombang 600 nm.

PARAMATER YANG DIAMATI :

1. Teknik Isolasi Bakteri : Spread Plate
Inkubasi
No Sumber Isolat Jumlah Koloni Terhitung (cfu)
Suhu (0C) Lama Waktu

Praktikum Mikrobiologi Laut [M10B207] TA 2018-2019 Page 14

 2. Teknik Isolasi Bakteri : Pour Plate
Inkubasi Jumlah Koloni
Jumlah Koloni Terhitung
No Sumber Isolat Suhu (0C) Lama Terhitung di atas
di dalam Agar (cfu)
Waktu Permukaan (cfu)

3. Kultur Cair (Liquid Medium)

No Sumber Isolat Inkubasi Absorbansi pada Densitas
Suhu Lama Waktu Agitasi (rpm) λ 600
(0C)

Praktikum Mikrobiologi Laut [M10B207] TA 2018-2019 Page 15