~ 116 - DETECCION, IDENTIFICACION Y CUANTIFICACION DE PROTOZOARIOS Y HELMINTOS INTRODUCCION La parasitologia es 1a ciencia que comprende aquellos seres vivos que de manera permanente o temporal viven a expensas de otros organismos. El término Pardsito es aplicado en este manual a los Protozoos, Platelmintos y Nematelmintos que se encuentran normalmente en tas heces. Debido a que éstos son excretados en las heces pueden ser trasmitidos al hombre a través del agua y suelo, causando ingestidn directa o indirecta por medio de un agente intermediario. En los sistemas de tratamiento de aguas residuales es aconsejable realizar un muestreo continuo, el cual nos permita estimar 1a eficiencia en cuanto a la renocién de pardsitos, y 1a evolucién del potencial de peligro para la salud. Para el investigador inexperto el problema mis grande est en la identifica- ci6n de huevos, quistes y pardsitos. La correcta diferenciacién de la larva thabditoide de Necator americanus y Strongyloides stercoralis de las especies de Rhabditis de vida libre y otras larvas de vida libre que est4n presentes en la naturaleza también es un problema. Existen varios métodos complicados y tediosos para rutina. Por tal motivo, el presente manual tiene por finalidad dar a conocer una metodologia y procedimien- tos practicos para la identificacién y cuantificacién de Protozoarios y Helmintos. DEFINICION Protozoarios E1 phylum protozoarios incluye mas de 30 especies que pueden atacar al hombre. De éstos, doce son patégenos verdaderos, diez son trasmitidos por insectos y el resto (Giardia lamblia y Entamoeba istolitica) pueden ser trasmitidos por moscas o por el agua. Son animales unicelulares, constituidos de una pequefia masa de protoplasma conteniendo uno 0 mis ndcleos. En su mayorfa son microscépicos. Se encuentran en47 todos los ambientes; unos de vida Libre, otros pardsitos y soprofitas. No se les reconoce células 0 tejidos diferenciados; algunos poseen estructura relativamente compleja. Ciertos ciliados toman sus alimentos a través del citostoma 0 boca, conti- nuando a un pequefio tubo o citofaringe, que termina en el interior de 1a masa citoplasmatica, asi miemo, poseen orificio anal o citopigeo. Otros protozoarios tienen una organizacién mas homogénea y la entrada de los alimentos la hacen por absorcién a través de cualquier punto de 1a membrana celular. En ambos casos, una vez ingerido el alimento,dentro de la célula se forma un vacuolo que contiene las particulas alimentarias, las cuales son transformadas en sustancias asimilables por los enzimas que contienen los jugos digestivos. Estas sustancias asimilables atraviesan la pared del vacuolo y son absorbidas por el protoplasma. De acuerdo a las caracterfsticas estructurales de locomocién, los protozoarios se pueden clasificar en: Amebas, flagelados no pigmentados y ciliados. De los protozoos la especie que tiene mayor significado sanitario es la Intanocba histolytica, conocida como 1a causante de 1a disenterfa anebiana, bajo con diciones favorables puede producir disenterfa 0 invadir otros Srganos como el higado y cerebro, causando serios daiios. Otro protozoario de gran interés en el aspecto de salud es Giardia lamblia, protozoario flagelado. Su distribucién es mundial y 1s infeccién es mAs frecuente en los nifios que en los adultos. Es la causante de 1a diarrea, clicos abdominales, frecuente eliminacién de heces Ifquidas y palidas, fatiga y pérdida de peso. Otro protozoario de menos importancia es: Balantidium coli. Helmi El grupo de los platelmintos se caracteriza por ser gusanos aplanados en tos sentido dorsoventral, cuyo grupo originario est4 constituido por los turbelarios. Los gusanos chupadores (trematodes) y los acintados (cestodes) viven exclusiva— mente de modo parasitario. La base estructural de su cuerpo es un parénquima muscu- lar que consta de tejido conectivo y que est& cruzado por fascfculos de fibras musculares, circulares, longitudinales, diagonales y dorsoventrales. En este-18 - par@nquima estan incluidos intestinos, sistema nervioso, sistema de excretas y Srga- nos sexuales. Son primariamente hermafroditas, s6lo en pocas especies hay separa~ cién de sexos (por ejemplo, Schistosoma). Los Srganos excretores consisten, por lo general, en dos pequefios canales principales que corren lateralmente 1levando en el extremo érganos terminales espe- ciales Llamados células flemigeras y que desembocan al exterior por uno o dos orifi- cios. El pardsito intestinal plano de mayor importancia es: el Diphyllobothrium latum, el Hymenolepis nana, el Taenia solium y el T. saginata. El hombre es el huésped intermediario de 1a forma larval de los gusanos intestinales planos. Los gusanos cilindricos o nematelmintos incluyen muchas espe~ cies parasites y también de vida libre. Los gusanos que son redondeados tienen por Jo general abertura bucal, intestino terminal y ano. La superficie de la mayorfa de los nemftodos est@ formada por una cuticula recta, lisa o finamente anillada. Las especies médicas de mayor importancia incluyen 1a clase nemétoda que son: Trichinella spiralis, Trichuris trichiura, Strongyloides stercolaris, Ancylostoma duodenalis, Necator americanus, Ascaris lumbricoides y Enterobius vermicularis. 3. METODO DE CONCENTRAGION Y LAVADO - CUALYTATIVO El examen para la identificacién de pardsitos y protozoos se realiza por el nétodo de concentracién por centrifugacién y Lavado, el que consta de dos procedi~ mientos, el de flotacién (sulfato de zinc) y el de sedimentacién (formol-ether). 3.1 Resumen del método EL método de concentracién y lavado consiste en tomar volfimenes adecuados de muestras de agua y centrifugarlas a 2,300 rpm durante dos minutos, decantando el sobrenadante. Este proceso de centrifugacién se realiza como minimo tres veces, hasta obtener un sobrenadante casi libre de materia en suspensién.- 9. El sedimento obtenido por este procedimiento de centrifugacién y lavado se divide en dos partes iguales, una se emplea para la técnica de flotacién y la otra para la de sedimentacién. La técnica de flotacién consiste en usar una solucién de gravedad especffica nds alta que la mayoria de los protozoos, quistes y huevos de helmintos, pero de gravedad especffica nds baja que los desechos fecales. En el procedimiento de 1a técnica de flotacién se toma exactamente la mitad del sedimento (20-30 m2, producto de 1a concentracién y lavados sucesivos), se adiciona sulfato de zinc hasta Llenar el tubo y se procede a centrifugar a 2,300 rpm durante dos minutos, Se extrae una gota de 1a superficie de la pelicula y se coloca en una 1émina portaobjeto, con una gota de solucién yodada de D'Antoni's, cubriendo con una lémina cubreobjeto e inmediatamente se observa al microscopic. Para 1a técnica de sedimentaci6n se toma los 20-30 mi del sedimento que queda y se transfiere a un tubo de centrifuga de 50 mt, se agrega 10 mt de formol al 10% y 5 mb de ether, procediendo a agitar vigorosanente por 20 segundos. Se centrifuga @ 2,000 rpm durante un minuto, luego se elimina el tapén de detritus con un aplica~ dor y se decanta todo el sobrenadante excepto el sedimento. Se mezcla el sedimento y una gota del mismo se transfiere con una pipeta Pasteur a una lamina portaobjeto, con una gota de solucién yodada de D'Antoni'’s, cubriendo con una lémina cubreobjeto e inmediatamente se observa al microscopio. 3.2 Aplicacién La técnica de flotacién es recomendada generalmente para Oocystis de coccidios, quistes de protozcarios, huevos de nematode y algunos huevos de gusanos planos acin- tados. No es satisfactoria para Tremotodes, Acantacéfalo y algunos huevos de gusa- nos planos acintados. La técnica de sedimentacién consiste en concentrar quistes de protozoarios, ‘Teematode, Acantacéfalo y algunos huevos de gusanos aplanados que no pueden ser ais— lados por el método de flotacién. Esta técnica de formalina ether es 1a mejor y més efectiva para detectar Schistosoma, gusanos con ganchos (Hook worm) y huevos de Ascaris.- 120- La deteccién e identificacién de Protozoarios y Helmintos es reconendable para evaluar los sistemas de tratamiento de aguas residuales, con un muestreo con- tinuo, el cual nos permita estinar la eficiencia en cuanto a su renocién y 1a evo- lucién del potencial de peligro para la salud. 3.3 Equipos, material y reactivos 3.3.1 Equipos y material Centrifuga Con capacidad para centrifugar voliimenes grandes tales como 12 y como minimo que dé 2,090 rpm. croscopio Este debe ser mono o binocular de acuerdo a las exigencias de cada laborato~ rios. Teniendo como minimo oculares de 10x y objetivos de 4x, 10x y 40x. Balanza Debe tener capacidad de 200-300 g. Frascos de muestreo De preferencia pl4sticos con gran capacidad y de boca ancha. Frascos de centrifuga De vidrio 0 plastico y con gran capacidad. Tubos de centrifuga De vidrio 0 pldstico, graduados y con capacidad de 50 mi. Pipetas De tamaio conveniente pata tomar el volumen requerido répidamente, permitiendo un error méximo de 2.5%.- 1a- Ldminas portaobjeto y cubreobjeto /Agas de inoculacién De platino o nfquel-cromo. 3.3.2 Reactivos Solucién de sulfato de zine Formula Zn80, . 7 H20 331 g Agua destilada ie Preparacién Disolver 331 g de sulfato de zinc en un litro de agua destilada. Se debe verificar la gravedad especffica y poner a 1,180. Se puede almacenar por perfodos largos en frascos blancos. Solucién yodada de D'Antoni's Formula Yoduro de potasio 1.0 8 cristales de yodo 15g Agua destilada 100 me Preparacion Disolver 1 g de yoduro de potasio y 1.5 g de cristales de yodo en 100 me de agua destilada. Colocar en frasco ambar y usarla después de cuatro dias de al- macenamiento. Es estable por periodos largos. Solucién de formalina Formula Formaldehido (40%) 10 me Agua destilada 90 me122 - Preparacién ‘A 90 m2 de agua destilada agregar 10 mt de Formaldehido 40%, Neutralizar agregando tetraborato de sodio hasta llevar a un pi 7.0 6 7.3. Bter etflico De grado analftico. 3.4 Muestreo Para la toma de muestras parasitolégicas se deben usar frascos de polietileno con capacidad de cuatro litros. No es necesario que estén estériles, pero deben ser lavadas con abundante agua y enjuagadas con agua destilada. Las muestras deben ser tomadas del mismo punto que las muestras bacteriol6gicas y siguiendo las mismas reco- nendaciones para el muestreo (ver pagina 11). Para las muestras de desecho crudo se toma un litro, para efluentes de lagunas primarias dos litros, y para efluentes de lagunas secundarias y terciarias cuatro litros. Las muestras se deben examinar en vivo y de preferencia no almacenarlas mas de dos dias después de su coleccién. Si las muestras no se pueden observar en el lapso de dos dias puede preservar- selas con formaldehido al 10%. 3.5 Procedimiento = LLegada 1a muestra al lsboratorio se procede a colocar en los frascos de centrifuga. = Centrifugar la muestra a 2,300 rpm durante dos minutos. = Decantar el sobrenadante. = Concentrar a un volumen de 250 mt. = A partir de este volunen se procede a lavar la muestras centrifugando y decan- tando el sobrenadante (evitando agitar el sedimento) y agregando agua de caiio hasta obtener el volumen anterior. - Este lavado se realiza como minimo tres veces hasta obtener un sobrenadante bastante claro. = B1 sedimento obtenido por este procedimiento de centrifugacién y lavado se divide en dos partes iguales, una se emplea para 1a técnica de flotacién y la otra para la de sedimentacién (ver Figura N° 16).- 123 - Técnica de flotacién Tomar 20-30 mi del sedimento (producto de 1a concentracién y lavados sucesi~ vos) y colocar en tubos de centrifuga de 50 mt, graduados. Adicionar sulfato de zinc hasta llenar el tubo de centrifuga. Centrifugar a 2,300 rpm durante dos minutos. ~ Tomar una gota de 1a superficie de la pelfcula con ayuda de una asa de Kolle y colocar en una 1&mina portaobjeto con una gota de solucién yodada de D'Antoni's. = Cubrir con una 14mina cubreobjeto. = Observar al microscopio (ver Figura N* 16). Técnica de sedimentacién = Tomar 20-30 mt restante del sedimento (producto de 1a concentracién y lavados sucesivos) y colocar en tubos de centrifuga de 50 mt, graduados. ~ Adicionar 10 m2 de formalina 10% y 5 mi deeter, tapar el tubo y proceder a agitar vigorosamente por 20 segundos. Centrifugar a 2,000 rpm durante un minuto. Eliminar el tapén de detritus que se forma en 1a superficie, con un aplicador. Decantar todo el sobrenadante excepto el sedimento. Mezclar el sedimento y transferir con una pipeta Pasteur a una 1émina porta~ objeto. = Cubrir con una 14mina cubreobjeto. - Observar al microscopio (ver Figura N° 16). 3.6 Resultado Este método se limita a expresar cualitativamente la presencia de Protozoarios y Helmintos.METODO CUALITATIVO DE PROTOZO0S Y HELMINTOS 2 Centrifugacidn ly concentracién a 250 m aaiaaiaasisiasion f~Gentrifugaciéa ' y lavados| eee eee (Contrifugacién y concentra edén entre 50-60 mz Tec, flotacién Tec. sedinentacién - Agrezar fatode zinc Agregar formol-ethy Centrifugaci6n, Centrifugacién, lecantacién y comal Toma de sobrenadante de sedinento Tdentificacién miccoscépica fentiFicaciGn Ir microscSpica Figura N° 16 DIAGRAMA PARA IDENTIFICACTON DE PROTOZ00S Y HELMINTOS= 125 - Quadro No. 29 DETERMINACION DE PARASITOS MBTODO CUALITATIVO HOJA NP DE PROYECTO ANALISTA "DE MUESTRA: PUNTO DE MUESTREO: FECHA DE MUESTREO: FECHA DE ANALIST VOLUMEN UTILIZADO: VOLUMEN FINAL: ‘PROTOZ00S /HELMINTOS Sed. lavado | Flot. lavado formol ether | sulf. de zinc Quistes de protozcos Helmintos huevos/iarvas= 126 - 3.7. Registro de datos Guadro N° 29 - Enel se registra los microorganiemos encontrados en cada muestra. ~ Técnica empleada y frecuencia de los organismos, desde el punto de vista cualitativo. 4 METODO DE CONCENTRAGION ¥ LAVADO, CUANTITATIVO La cuantificacién puede estar relacionada con el area o con el volumen de agua. La determinacién por area es cuando los organismos no se encuentran unifor- menente distribuidos. La determinacién por volumen es para 1a mayorfa de microorganismos y para den- sidades menores dé poblaciGn. El método de cuantificacién tiende a emplear mayor tiempo, pero se hace nece- sario cuando se quiere conocer el nfimero de quistes y huevos de Protozoos y Helmin- tos en aguas de recreacién, en procesos de tratamiento de aguas servidas, lodos y aguas destinadas a cultivo de peces. El volumen a analizar depende de la calidad del agua. EL resultado se expresa en niimero de organismos por volumen de agua. 4.1 Resumen del método EL método de concentracién y lavado cuantitativo es similar al método anterior, en que voldmenes adecuados de muestra son centrifugados a 2,300 rpm durante dos minutos, decantando el sobrenadante. Este proceso de centrifugacién se realiza cono nfnimo tres veces, hasta obtener un sobrenadante casi libre de materia en suspensién. El sedimento obtenido por este procedimiento de centrifugacién y lavado se divide en dos partes iguales, una se emplea para la técnica de flotacién y 1a otra para la sedimentacién. La técnica de flotacidn es 1a misma y se reporta cualitativamente. El sedimento resultante de 1a técnica de sedimentacién es el que se leva a cuantificar,- 127 = = Se toma 20-30 mi del sedimento y se transfiere a un tubo de centrifuga de 50 mt graduado, se agrega 10 mi de formol al 10% y 5 me de eter, procediendo a agitar vigorosamente por 20 segundos. ~ Se centrifuga a 2,000 rpm durante un minuto, luego con mucho cuidado se eli- mina el tap6n de detritus con un aplicado y se decanta todo el sobrenadante, excepto el sedimento. = Se mezcla el sedimento, 1levando a un volumen uniforme de 2-3 mt agregando forol al 10%, para preservarlo, = Se coloca un mililitro de este sedimento en una celda de Sedgwick-Rafter (S-R). Esta celda es de fAcil manipulacién y proporciona datos razonables cuando se utiliza con un microscopio calibrado y equipado con un micrémetro ocular de Whipple (ver Figura 17). La celda S-R mide 50 mm de longitud; 20 um de ancho y 1 mm de profundidad. El area total es de 1,000 mm? y el volumen es de 1,000 mm? 1 mt. El micr6metro ocular de Whipple es un disco de vidrio que contiene un reticulo grabado que divide el campo en cien partes o cuadraditos iguales (ver Figura N° 17). El valor en micras del area de cada uno de los cuadraditos varia segtn el ocular y objetivo utilizados. Este valor debe ser medido para cada objetivo del nicroscopio con un micrémetro de objetivo que es una lamina de vidrio que contiene en el centro una linea de 1 mm de longitud, dividida en 100 partes iguales (10 mi- cras). = Se coloca el micrémetro sobre la platina del microsropio y 1a cuadricula de Whipple en el ocular; se hace 1a superposicién de ambos y de esta manera se puede nedir el lado de uno de los cuadraditos = El Grea del cuadradito se obtiene multiplicando este valor por 100 y por lo tanto el nfimero de campos comprendidos en toda la cémara de Sedgwick-Rafter. ~ Para el recuento en bandas se tiene en cuenta lo siguiente: 2 La longitud de 1a cémara S-R tiene 50 mm; ésta representa la Jongitud de 1a banda « La profundidad de 1a cémara S-R es de 1 mm « El ancho del total del micrémetro de WhippleCAMARA DE SEDGWICK~ RAFTER MICROMETRO DE WHIPPLE ENFOQUE DE MICROMETRO DE OCULAR Y MICROMETRO DE OBJETIVO Figura ¥ CAMARA PARA RECUENTO Y ACCESORIOS- 129- - Al utilizar un ocular de 10X y un objetivo de 20X calibramos el microsco- pio y tenemos que el ancho total del micrémetro de Whipple es 0.5 mm (500 u). - El volumen de una banda es 25 mm? 6 1/40 (2.5 %) del volumen total de la camara de S-R. - Para muestras concentradas el total de organismos en una cémara de S-R se obtiene multiplicando el nimero de células contadas por el volumen final, por el factor de enumeracién, entre el nfimero de bandas contadas al azar por volumen ori- ginal de muestra por un mililitro. Generalmente se cuenta 2 6 4 bandas; esto depende de 1a densidad de organismos presentes. 4,2 Aplicacién El contaje por el método de Sedgwick-Rafter presenta la ventaja de ser el mds preciso; el cuidado que debe tenerse es en el proceso de concentrar 1a muestra y en los cdlculos para 1a obtencién de un buen factor de calibracién. La desventaja de este método es que al concentrar la muestra se concentra las partfculas en suspensién y si no se tiene el cuidado debido se dificulta el reconocimiento adecuado de los organismos. 4.3 Equipos, material y reactivos 4.3.1 Equipos y material Los misnos que para el andlisie cualitativo. Adeités: Gmara de Sedgwick-Rafter Micrémetro de Whipple Micrémetro de objetivo 4.3.2 Reactivos Los mismos que para el anélisis cualitativo. 4.4 Muestreo E1 muestreo es el mismo que el del método cualitativo.- 130 - 4.5 Procedimiento El procedimiento es el mismo que para el andlisis cualitativo, teniendo en cuenta el mismo volunen de miestra @ analizar (ver pagina 131), (ver Figura 18). La técnica de flotacién es la misma, reportando los datos cualitativos (ver pégina 132), Para la técnica de sedimentacién se procede igualmente que para el andlisis cualitativo y el sedimento final es Llevado a un volumen de 2-3 mt (ver pagina 132). ~ Homogenizar la muestra. ~ Un mililitro de este sedimento se coloca en la celda de Sedgwick-Rafter, colocando diagonalmente el cubreobjeto a través de la celda, la cual rotar suave mente; esta cubierta no debe flotar sobre la celda (ver Figura 17). ~ Se espera de 15 a 20 minutos de manera que los organisms permanezcan fijos. ~ Se procede a realizar el recuento con 1a ayuda de un microscopio debidamente calibrado y equipado con un micrémetro ocular de Whipple. ~ El recuento se realiza por bandas longitudinales seleccionadas al azar; se cuenta todo el frea de 1a banda y como minimo 2 a 4 bandas. ~ Se puede informar por sepatado el nfimero de cada género e especie. ~ La expresién de los resultados es N°/mi. Ejemplo Una muestra cuyo volumen inicial fue de 500 mi se concentra a 2.5 mt. AL calibrar el microscopio se obtuvo que el volumen de banda fue de 25 am?, El ndmero de bandas contadas al azar fue de 2. E1 total de organiemos contados por banda por género fue de 900, Reemplazando tendremos, 2 factor de enuneracién: eae = 40 25 om: 900 x 2.5 2x 500 xi * 4° = ndmero organismos/m= nGmero organismos/mi = 90= 131 - Muestra 2 Contrifugacion y ‘concentracion 2250 wh Centrifugaciéa y lavados * Gentrifugacisn y concentracién entre 30-60 mi Técnica de flotaciéa Técnica de sedimentacién Adicionar Sul- Adicionar fato de zine — | Formol-eter ——_+—_ centri fugacién Centrifugaci ‘Toma de Decantacién y sobrenadante Tona de sedinento sSUSSAMSHSESSEE‘psbisbeeaaboae a 7 Coane: Ident ificacién Iulerueseees Microsc6pica Canara Sedgwick Rafter Figura N° 18 METODO CUANTITATIVO DE PROTOZOOS Y HELMINTOS132 = 4.6 Resulrado La expresién de los resultados es N°/mt. Los cdleulos son los siguientes: La cfimara de Sedgvick-Rafter tiene una longitud de 50 sm, ancho 20 am, y 1mm de profundidad. £1 4rea total es de 1000 m® y el volumen es 1000 um? o sea La. : 1,000 mm? Factor de enuneracién = 7705 de banda encontTads ea ma? Para muestras concentrada: Sanat Total céiulas cont, x vol. final concentrado _, {#°t0* W* bandas coitadas al azai x vol. original oestva 5 ToL cién, Se debe tener en cuenta: - Volumen de 1a muestra. = Volumen final del concentrado. 4.7 Registro de datos Guadro #* 30 Se registra los organismos encontrados.en cada muestra; exclusive para la técnica de flotacién. Cuadro N? 31 ~ Se registra los organismos contados por banda. ~ Bl total de los organismos contados en todas las bandas. - Se calcula el niimero de organisnos/mt.- 133 - Cuadro N° 30 DETERMINACION DE PROTOZ00S/HELMTNTOS METODO CUALTTATIVO HOA N'_____DE PROYECTO EoeSES rset ANAL LGR PUNTO DE MUESTREO NDE MUESTRA FECHA DE MUESTREO FECHA DE ANALISIS| VOLUMEN UTILIZADO YOLEN FINAL _ aa 7 J Fearactos-Lavano (OBSERVACIONES PROTOZ00S /HELMINTOS (SULFATO DE ZINC) L —| [ C i { l i i I ! ] Lab-1082= 134 - Guadro N°31 DETERMINACION DE PROTOZOOS/HELMINTOS, CUANTITATIVO HOJA NO DE PROYECTO ANALISTA, = Para muestra concentrada 1000 nm? Factor de enuneracién = YGI-de bandas encontrado en 300 aumentos (an) “ Sotal organianos consados x vol. tinal coucentrade x factor de enumerne No. por sl = Ge"Sandas contadas al azar ¥Voly orig. de moestra x imi * © : Fecha de auestreo Punto de muestreo No. de muestra Volunen colectado Volunen analizado Volumen final concentrado Sedinentacién: Lavade (formol~ether) Protozcos/helmintos (Larvas) }-———————— | Total de bandas contadas al azar r aon 3 = Total contado | %-/8!3. - 135 - REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION et al. Methods for the examination of water and wastewater, 15 ed. New York, APHA, 1981 CANADA CENTRE FOR INLAND WATERS. Methods for microbiology analysis of water wastewater and sediments. Burlington, Ontario, 1976 LAKSHMINARAYANA, I.S.S. & ABDULAPPA, M.K. The effect of sewage stabilisa~ tion ponds on Helminths. 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