228 | Volumen 4, nomero 2, agosto 2011 Analisis electroforético de proteinas del veneno de Sothrops atrox “jergon” (Ofidia: Viperidae) de distintas zonas geograficas de la Amazonia Peruana Electrophoretic analysis of proteins in the venom of Bothrops atrox “lancehead” (Ofidia: Viperidae) from different geographical zones to the Peruvian Amazon Rommel Rojas". Roberson Ramirez’, Marianela Cobos‘ y Juan Castro’? ‘Centro de Investigaciones d= Recursos Natursles-CIRNA Universidad Nacional de la Amazonia Peruana-UNAP. Apartado postal 4969 Facultad de Clenclas Blolegless. Los venanos de serplentes son secreciones endogenas constitukdas en su mayor parte por proteins, que pueden causar diversos cuadros sintomatologioas, y en sigunos casos la muerte. Las semplentes fueron Feoolestadas en el campo por muestreos hempelologlcos utlizando la tecnica del revelamlento por encuentros casuales [1] y el veneno recoleciade por onenamiento manual. Usando la itonka de electoforesis alecontnua £ ge! de potaartamida [2] a7 5% y 12% oon dodeclsuate de sowia (PAGE-SDS) se anatzaron los perfles elzctroforetioos de S sepecimenes de Botivaps atrax “jemgon™ provenientes de 5 zonas geograficas d2 Is Amazonis Pemana, slendo evaluadas en condiclones reductoras utllzando veneno eentmtugado, asimismo se resiizd Ia cuantifcacion de las protelnss por el método espectrofotemetico uillizando el método de Bluret [5]. Los resultados muestran la presencia de protelnas en los rangos de 14 KD a 116 KD. obteniendose variaciones en la cantiad de bandas proteinas, 9.11.8.7.8 para las poblaciones de Moena Cafto, Isia Iquitos, Panguana, Genaro Herrera y Nina Rumi, mientras que la cuantMoacion muestra la existencls de una mayor cantidad de protelnas en el veneno de lz serplente provenente de lpia Iqutos (57.41 mgimi) y una menor cantidad en el espécimen de Genaro Hemera (32.13 mgim). Se concluye menclonando la existencla d= varlaciones en los perflies electrforeticas y cantidades de las protelnas presentes en él veneno de Bothrops atrox dela Amazonia Peruana. Deseriprores: venencs, proteinas, electroforesis, pallacmiamiga, cuantifcacién. ABSTRACT ‘The snake's venoms are endogenous secretions constituied for protelms and can produce different ‘gmptomatology and in some cates the, dead. Using the, elecoploreto technique In polyanrytamide discontinuous gel of 7.5% and 12% whit sodlum dodecylsulphate (FAGE-SDS) In reductions conditions carves on a protem ansiyss othe venom n Bothrops ator snake's Tom = deteren gessrapeles zones the Peruvian Amazon using centrfuge crude venom, addltionally the proteins were quantification for using an ‘spectrophotometer following the Bluret method. The resufis evidence the presents of dfferent bands In the protzins, In ranges of 14 KD to 116 KD, findhng 5, 11.5,7.8 bands of proteins for the populations of Moena ‘Cala, Isla Iquitos, Panguana, Genaro Herrera and Nina Rumi, while the quantiiostion show the presents to major quantity of protain in the snake from isia Iquitos (67.41 mg/ml) and a less quantity In the specie trom Gena Herers (32.13 mgiml). We conclude mentioning the existence of variations In the electrophoretic Profle and quantfication to proteins trom the venom of Bothrops afrox to the Peruvian Amazon. Keywords: venoms, profelns, efectraphoretic, polyacryfamide, quantificationTespansablee da un sinnomero de perdiaas de widas humanas; cuando no suceden casos tatales, los steciacos PUEGEN SUIT una Cestruccion de tejdos hasta la pércid total o parcial de algun miemore [5]. Dei genero Satrops, tenemos 3B. atrox, conocio3 comOnmante como jergon, y 6 13 serplente ‘wenenosa que mayor gocileries produce (cerca del 20%) en muesita selva. Otras especkes de Impotancia en salud publica son Bamrops pictus, Bomrops bamem, Bothrops Brazil [5). El veneno es progueiga por un organo especiaiizado ‘Vipendae, d2nominago ijanguia ce Duvemoy. ‘pect por peptides y proteings toxlcas. tales como miotoxinas, hewrolonnas y,faxinas coaguanies. que onganicos donde destacan las protemas y peptons, 'y Componentes Inorganiccs que ejercen tunciones. ibe apoyo de ia eetsbllisd estructural d= siqunas proinas como [as metaloproteasas, actuando jambién como catalizadores en algunas reacoiones 'y patologlcos, que pueden Inducir lesiones en al jajioo loesl, efecto sistemicos 0 muerte relacionadas con ia toxiciose del weneno [3]. La gran variacion Intra e interespectisa en la composicion quimica y las actividades biologioas de bs venenos €6 un fenomenc muy conocido [9] ¥ hace necesano establecer Ins Para cada una de igs especies de En este sentido; se ha visio necesaro analzar electroforeticaments y euantiicar Iss protemas det weneno a2 la seplente Bomops airox “jergon" oe Sterantes zonas de ta Amazonia Penana. EXPERIMENTAL Area de Estudio Se resizd en el Latorstods de Biotecnologia del Centro de investgasiones d= Recursos Natiraies a2 ig Amazonia (CIRNA) de Ia Unwersidiad Nacional a ig Amazonia Peruana: sitiaaa én él AHH. Nuevo ‘San Lorenzo. Psje. Los paulles S/N. Obtencién de musstras Las mugstras fueron recolectadas 3 través de visuales: (3) [1] en's zones geegraneas Se lr Amaroo Pemuana © Ia comunidad o& Genar Hemers, cuyas son: Istmud aur 4° 7H aS5008". la eooroeNsaae. coorsenadss geograricas 53°46.20"y alltud este: comunidad de Moena cafe geogratiess de: Lattud sur 3° 46° 22.53°y lattus Geste 73" 14° 27". comuntdad de Isla Iquios cuya ublezcion 2s: latiud sur, 3 4358.83" latitud oesie: 3* 45° 8", comunidad de Ninarumhl, cuya ubiescion geograics #6 c= lattus sur 3° 4004.76 Tatiud geste: 75" 25°40" y Is zona ge Panguana, cuyas coorenadas gesgraticas son: latihld sur: 3° $3° 30S y Iattud oeste: 73° 8° 42 peste Extracelon del vanano El veneno fue exirakio de 5 especimenss adultos Por presion manual de gidndulas venenosas en parafilm, ayuda de una mictopipets y simacenbado 3 -20°C. Tratanusnto del vanano El veneno obtenisa fue centrmugado 2 14000 mm Gurante 3 minutos, SI sobrenagante tue trasterigo 3 otro microtube de 1.5 mi. Perfll Electroforético con dadscllgulfato de sodio (PAGE-SD3} ‘Se prepard un gel disconthuo de Follacrilamkia con dodeciisulfsio de sodio (PAGE-SDS) de acuerdo al Método de [2] con un gel de apliamienta de 75% ¥ 12% 08 COMM, IUEQo S€ procedio a GllIr el vEnENd: 1:20 tratando en condiciones reductoras, seguidamente Tue colocado en los ponilos del gel y ce realize e1 comdo electrotoretion Gurante 2 moras 3 ev.278 | Volumen 8, numara 2, agosto 2014 Luego ae ia comiaa slectrotoretea 2! gel tue revelago Uizande azui de Coomaesie utizarico =! proteesio Propuesto por de [10] Cuantincacion a proteinas Se vO 3 6300 por 8! metoda de [3]. que consistio enel desarrolo Oe ia curva estandar con 20 mgmi Oe BSA, los CUSIES $= mezciaron En 5 1uDOS, 1 mi OF Feactivo con 100 wll de los estandares y al cabo de 15 minus se reaiizo ta eetura a S40 nm, en el espectrotstometro. Con los datos de concentracion y absorbancla obtenidos se hizo la curva estandar y ia ecuacion ge la recta comespondlente, utlizando #1 programa Microsot Excel, Para determhar i consentracion O& IS6 proteins del veneno, € Proceoio 3 realizar 13 olucion de 1-20, wega se tome 100yI de estas mezolandose con 1 mi de reactive de Bluret y al cabo de 15 minulos se reallzo Ia lectura en el especuofetometro (Figura 1). Con los datos obienidcs en dicha lectura se calculd la concentracion de proteinas presentes en Iz muestra, reemplazandolo en la ecuscion de ia curva estandar. RESULTADOS ¥ DISCUSION En bb presente figura se muestra bb curva estandar obtenida para Cuamtificar las protemas existente: en el veneno de ls sempientes en esmiio, se obnve un RA=9 0007, bo cual permitia utilizarlo en los ensayos. eamiaissanes Absartanca En Is figura 2 se puede observar los datos obtenidos Se Ia cuantiNcacion de protemas oe serplentes de oterentes zonas geogratiess, mostrandose uns mayor camtioso €n el especimen d@ isis iquitos (1348.2 mgimi. mientras que el Individuo Proveniente de Genaro Hemera (642.6 mgiml) presento la menor cantidsd oe proteinas, ins Inglwauos de Moena Cafo, Nina Rumi y Panguana, mostraron cantidades medias de proteinas. Canoantacién mati copie Zonas de muestreo Figura 2. Cusntificacion de protelnas de! weneno de Bothrops atrox de dlsrentes zonas geograficas. En la figura 3 s¢ muastrs el perfil electroforeticn de prowinas en el veneno de Bothmps srox Provenientes de olferentes zonas geograficas, mostrandose vanscinnes ena migracton de las bandas y las cantidades de i Pee-=- @e..2>°" Figura 3 Perf eleciroforetico de proteinas del weneno de Bothrops atrox. 1= Moena Cafo, 2 Isia iquitos. 3 Panguana, 4= Genaro Herrera, S= Nina Rumi, 6= marcador molecular (EZ-RUN protein Martér BP 3600-500, FISHER LAB) En trabajos similares [11] reaitzaron i cuantmescion de proteinas del veneno utlizando otros métodos de ‘swantifcacion, obleniende una concentracion en 7B mg de proteinas en el veneno de Bothrops atox proveniente de un serpentario y lloflizado. El matodo utilzads en @l presente trabajo, 2s OM para is cuantificacion d= proteinas en venenos de-serplentes, ya que su alta concentracion pemnlte confent un Tango mas conflabie lecturas, por oo lado, en muchos trabajos, son utlizados los matodos de Lowry y de absorbancia de 280 nm [12, 13] El numero de Dandss protekas, son vanaples en ‘todos Ins especimenss, Is serplent= provenlents de Mosna Cafo, presenta hasta 9 bandas proteicas, ia Oe tia Iquitos presenta 11 pandss, ge Is zona OF Panguana & bandas, de Genaro Hemera 7 bandas y de Nina Rumi 8 bandas. Estas. vanaciones pueden Oeberse 3 muchos factores tales camo e1 ests00 ‘nsiniogica, #1 estaaio etaro del rep, 3 almentacion ‘yet aisiamiento [14]. El factor que mas sfects is vanacion ntraespecmca de proteinas del veneno es el alsiamlento geografica [15]. progudtencose clertos niveles. de alopatria, por Ig Presencia 8 bamerss natursies como Ios rics amazenloos, asimisme el allmento presente en esas ‘zonas puede generar un veneno espectico par ciertas presas, sin ig amazonia periana presenta una alta diversidad de especies potencalmente utiles para la allmentacion de Jo cual pUESE Influir a generar un mayor grado de varlscion en los vaneros, siendo @sios generallsias para varias especies. asimismo [15] Mancionan que dentro del rol adaptative observado en Botops atx es conskierade coma un Gepredador generallsta cuya dieta Incye pequafios mamiaros y 38s, pero también sapos y isgariss. [17] Menciona que existe una amplla gama de varlasiones en los venenos de semplentes provenientes de ls presion evolutlva entre las potencies press qu dessrrollan mayor Inmuniiad, lo que producirs que las serpientes Gesarrolen nuevas funcionas proteicas que logren ser efectives con us presss, en ia amazonls peruana, también se asta llevando esta presion, lo Cusl puede Iniur en I cesamolin oe nuevas proteinas an los venenos. La omterente composicion dé Ios venenos pues ser explisada = en condiciones | o2 poblaciones tragmantadas debido 3 la dinamica ecologka y aisiamiento y la distancia entre podlasiones a2 ea0a ‘zona, asimismo ia warisclon o&| venena én el seno de una misma especie puede constitulr un mecanigmo bioiogieo que dota aa serpiente de gran ‘fewibldad para adaptare 3 amblentas camplantes y poder, a6l, garantizar su supervivencia. Por otro lado, la diversidad Intraespectica de los venenos, pUEGEN generar sintomatzicgiss variables de considercign y requiere de diferentes tratamientos, recongclendose su Importancia maica. Sin embargo, las Investigaciones S0Ore Ia ubioseion geograica de las toxinss d= Gomvops anor es estasa. CONCLUSIONES Ewisten vanaciones en Ia composicion proteica det veneno oe Ia Semplente Bothrops atrox de olterentes zonas o& la Amazonia Peruana, Tinalment se menclona que las herramlentas MoIBCuIares. coma I electroforesis con muy Utes para caractenzar los venenos de serpientes. AGRADECIMIENTOS Al proyecto “Herramientas. biotesnologioas para la abtenciin de lineas calulares de alta rendimienta de vitamina C de Myrclaria dubia (HEK) McVaugh “camu camut por el inanciamiento realzado. REFERENCIAS Snot 1OE-1a0 4 Caiveie: Toxicon (200) 92B4— 1281. .-Chippage, Vv. Willems, 4 wmbe. Tanieon 2319911 wes, ET) J: Guteres, &. Lomanie, @. Leon, A Giron, ML Flores, ¥. Angua, . Cavene Jounal of prooeomic ‘Faqa0ds) 165-402. Blorojas_22E8@hhotmaiLcom