11.2. Protocole expérimental du test des cométes Cette technique d’électrophorése de noyaux de cellules isolées en microgels d°agarose Sst applicable, en théorie & tout type de cellule eucaryote, Elle permet la détection des coupure: imple et double-brin ainsi que des sites alcali-labiles & pH > 13. Le protocole suivi (Figure 21) est adapté des travaux de Singh et al, 1988. La composition des différents ‘ampons et des solutions méres, ainsi que les références des Principaux produits chimiques et du matériel utilisé sont données en Annexe X. L'utilisation dun standard inteme nous a Semblé importante : il a consisté en une suspension du ‘type cellulaire considéré, exposée au Peroxyde dhydrogéne (250 4M, Ih & 4°C), aliquotée et analysée dans chaque test. Le déroulement du protocole se déroule sous lumigre inactinique pour éviter dinduire des dommages artefactuels a I’ ADN. —_ 11.2.A, Dépéts des gels sur les lames Les solutions d’agarose LMP (low melting Point) sont maintenues & 37°C a aide d'un bain-marie, Les gels sont ééposés sur les lames dans Mordre suivant: - ye couche (a déposer la veille) : 90 pL d’agarose normal (0,8% dans du PBS. (0,01 M)) sont étalés & T'aide d’un_céne de micropipette. Polymérisation & température ambiante. - 2™ couche: 75 ul d'un mélange 4 volume égal, d’une suspension cellulaire (obtenue selon les protocoles décrits précédemment) et agarose LMP (bas point de fusion) & 1 9% dans du PBS (0,01 M) sont déposés et Tecouverts d’une lamelle. Polymérisation @ 4°C pendant 10 minutes, La lamelle est retirge délicatement, ~ 3% couche: 75 uL d'un gel d’agarose LMP 0,5 % sont déposés, Fecouverts d’une lamelle et laissés & polymériser pendant 10 minutes 4 4° C. La lamelle est retirée délicatement. 521L.2.B. Lyse cellulaire 8 10 avec NaOH), 1% de N-laurylsarcosinate, auxquels sont ajoutés extemporanément 1% de Triton X100 et 10% de DMSO. Cette étape dure 2 h Pour les cellules obtenues & partir des tissus solides et le sang périphérique, et ne dépasse pas I h pour les hémocytes, ‘a destruction des membranes cellulaires et nucléaires, 11.2.C. Déroulement de ’ ADN Tees lames sont rincées dans le tampon d’électrophorése suite 4 'étape de lyse, puis déposées dans la cuve électrophorétique. Le déroulement de TADN a lieu dans le tampon a'electrophorése (0,3 M NaOH 0,01 M NaxEDTA, PH>13) durant 20 a 24 minutes selon le type cellulaire, Cette étape est réalisée en conditions alcalines. Le pH élevé du tampon permet la visualisation des coupures simple-brin et expression des sites alcali-labiles, des conditions neutres ne permettant que la détection des lésions double-brin, 11.2.D. Electrophorése Les conditions d’électrophorése sont les suivantes : 21 minutes, 300 mA, 20V (soit 'Vlom). Les molécules d’ADN, fragments libres ou molécules rattachées a la matrice nucléaire mais libres de migrer, chargées négativement du fait des groupements phosphates 53Ssemes, migrent alors vers anode, permettant d'obtenir les figures caractéristiques de comates, 11.2.E. Neutralisation Pagent intercalant utilisé. 11.2.F. Mise en attente des lames (déshydratation) Tes noyanx sont colorés pat 22 ul de solution &.20 g/mL de bromure d’éthidium, intercalation entre les bases de I'ADN. Une lamelle est déposée sur la lame qui est lue a l'aide d’un microscope ® epifluorescence, équipé d'un filtre dichroique DMS70 (filtre d'excitation : BP 510-550 nm; filtre barritre : BA $90 nm), relié par une caméra CDD monochrome a I'analyseur d’image Komet 3:1 (Kinetic Imaging Limited, Liverpool, UK), On réalise 3 réplicats par modalités ct de vingt-cing & cinquante cellules sur chaque lame sont analysées. Les lames sont codées, et lues aléatoirement sur la partie centrale du gel, 541L2.H. Paramétres mesurés, expression des résultats et analyse statistique Lanalyseur d’image Komet 3: 1 propose une Quarantaine de paramétres mesurés, Nous avons sélectionné : ~ Paire de la cellule (en um?), ~ Ts longueur dela queue (Tail Length) (en um), ~ Ta Proportion d’ADN présent dans fa queue (Tai! DNA ) (en %),, * _Terapport de la longueur totale dela cellule sur la largeur de la téte (L/H), +P Extent Tail Moment (ym) : produit du Pourcentage d’ADN dans la queue par sa longueur ~ Stenfin Olive Tail Moment (pixels/um) : produit de ta Proportion d’ADN dans la queue avec la distance séparant le centre de gravité de la téte de celui de la queue, Nous avons choisi d'exprimer le taux moyen de dommages a l’ADN par le Pourcenfage moyen d"ADN dans la queue, Les médianes, espaces interquartiles et les Percentiles ont été calculés sur les distributions des Parametres au sein des populations cellulaires étudiées. Des classes arbitraires de Pourcentage d’ADN dans la queue des cométes Pour teprésenter lee distributions celflaires selon ce paramiétre : 0-20 %, 20-40 %, 40-60 %, 60-80 % et >80%. Nous avons utilisé des tests ‘Ron-paramétriques pour l’analyse statistique séquence suivante ; ~ tum fest de Kruskal-Wallis (comparaison de moyennes sans condition de normalité des distributions), ~ _suivi dlun test de la médiane (comparaison des médianes) ~ st-de tests du 2° (comparaison des effectifs théoriques caloulés les efiectits ‘marginaux des tableaux de distributions avec les effectifs observés), 55Cellules incluses dans le gel Lyse cellulaire en Conditions alcalines Nucléoides inclus dans le gel Déroulement de rADN Electrophorése en conditions alcalines Neutralisation Marquage ay bromure d’éthidium Lecture des lames (Cométes / analyse d’image) Mesure des paramétres choisis Test statistique Informations — génotoxicite Figure 21: Principales étapes du protocole expérimental du test des cométesANNEXE I. : Tableau de pithése des principaux domaines d’applications du test des cométes et références d’études S’y rapportant dans la littérature —— DOMAINES D'APPLICATIONS REFERENCES, a Toxicologie génétique Mécanismes de réparation de I’ ADN Cycle cellulaire et Apoptose Radicaux libres Nutrition (régimes, compléments, additfs, antoxydants....) Epidémiologie (expositions professionnelles, strilté..) Recherche médicale et clinique (embryologie, pathologies : diabéte, Heroderma pigmentosum, cancérologie, essais thérapeutiques....) Ecotoxicologie Choucroun etal, 200) Sasaki etal, 2000 Anderson et.al, 1998 ‘Marzin, 1999 ‘Speit et Harmann, 1995 Fahrig etal, 199§ Bergavist etal, 1998 Bock et al, 1998 Wojewodzka etal, 1997 Mustonen eral, 1999 Roser etal, 2001 Godard etal, 2002 Stacey etal, 2003, Singh et a,'2003, Anderson etal, 2003 Gwetens etal, 200 Yen et Liao, 2002 Collins etal, 1996, 1997, 2004 Cadet eta, 1999 Gediket al, 1993 Grifits et at, 2002 Pool-Zobel etal, 1997 Chiu et at, 2000 Azevedo etal, 2003 Lebailly etal, 1998 Me Kelvey-Martin etal, 1997 Wojewodska etal, 1998 a et & Kassie etal, 2000 Kopjar et Garaj-Vrhovac, 2001 Garaj-Vrhovac et Kopjar 2003 Palus etal, 2003 Olive et al,.1996 Takahashi etal, 1999 Benhamou et Sarrasin, 2000 Martin etal, 1999, 2000 Berwick et Vineis, 2000 Colleu-Durel et al, 2004 Cotelle et Pérard, 1999 Mitchelmore et Chipman, 1998 a Lee et Steinert ; 2003 —_ EeeI ANNEXE IX. : Composition du tampon PBS (Phosphate buffered saline) sans Ca™ ni Mg™* Pour un lite de tampon i 0,01 M, dissoude successivement les sels suivants dans de eau ultrapure stérile : * Chlorure de sodium (NaCl) 8g * Chlorure de potassium (KCI) 200 mg £ Monohydrogénophosphate de sodium anhydre (NaHPO,) 1150 mg * Phosphate de potassium anhydre (KH,PO;) 200 mg Verifier que le pH du tampon avoisine 7,4, Conserver & température ambiante,20 302.236 1.06580.0509 1-04936.0500 sence 78245298 Prose, L9150 Sigma 0421 Siema 26128-30348 Bsoo27 pon 20821295 pte bords rodés 76 noe Ba i x22 05 633.933 Prolabo Polystat 1 95 642.286 pro eee labo “Glade Pre A194 Bioblock Scientite erase pat 200 Bocthingernge in Microscope a épiftuorescence PowerPac 209 siti Ceméra COD monochron ‘tea Bre | ~Analyseur dimage Ke Heel / rig, Kinetic Imaging Limited 1000 Pipeta),verene (sper 2.5 Nac] one “146, g) 100 mM NaeDTA, 37,28 10mM Tris 12 Ajuster le pH & 10 avec des sels de sovd 10 Alister 4 890 mL avec de eau ultrapure et sé Conserver a température ambiante | mois. Metre 30 minutes 2 °C avant Iéape de lyse. Extemporanément ajouter 1% de Triton X100 et 10% de DMSO. (soit 1 ml de Triton et 10 ml. de DMSO dans 89 ml. de la solution précédente,) i d'électrophorése (300 mM NaOH / 1 mM NaEDTA) Préparer des solutions-stocks S ION NaOH” 200g dans 500 mi Peau ultrapure E 200 mM_Na,EDTA 14,89 dans 250 mL d'eau ultrapure (pH 10) 4 température ambiante au maximum Po smpon temporanément mélanger 30 Conse peri du tampon 1X, extemporanémen a wu me 15 jours. Ges etS mide Sy Ajusterle volume il ite aves de ‘eau ultrapure. Bien homogénéiser, mL de S; 2 ‘Tampon de neutalisation i itre d'eau ultrapure et Tris (0,4 M) A pH 7,5. Pour cela, dissoudre 48,5 g de Tris dans 1 ltr tampon Tris (0,4 M) & pH 7, Préparer un il) " el'aide ctlorhydrique HC 36%. Conserver a température ambiante. ii it