(Ghoix de Nespéce bivindicatrice ae
Le choix de lespce sentinelle sur laquelle les marqueurs biologiques
seront mesurés est un compromis entre les exigences scientifiques, la
finalicé du suivi et les ctitéres de faisabilié sur le certain. Une espéce
bio-indicatrice doit avane cout étre disponible, sensible, plutde sessile
pour fidelement refléter son environnement et facile & prélever. En
milieu marin, la plupart des suivis concerne les bivalves et les pois-
sons. La moule commune (Mytilus edulis et Mytilus gallopovincialis) a
écé Vobjer de nombreuses études, essentiellement pour son coe
d'échantillonnage faible. Les vertébrés benthiques, particulitrement la
sole (Sofea solea), le flet (Platichrhys flesus) et la limande (Limanda
limanda) en Aclantiquelmer du Nord et le rouget barbee (Mullus har
4atns) en Médicerrannée, ont été largement exploités parce qu'ils pré=
sentene une plus grande sensibilité aux inhibiteurs malgeé un cofit de
prélvement élevé,
Lamplitude de la réponse des organismes a l'exposition aux inhibi-
teurs est fonction de I'espéce animale et de la nature moléculaire de
Vinhibiteur. Ces deux éléments induisent des éearts importants dans
la sensibilité des différentes especes, Les données publiées dans ce
domaine montrene une forte sensibilité des vertébrés puis des crusta-
és et enfin une faible sensibilicé des mollusques en génécal
Echantilonnag
Quils concerent les possons, les crustacés ou les bivalves, les échan-
tillonsdestinés la mesure de activité ACHE doivent éete vélisé sur
des organismes vivants, immédiatemene apres leue peélevement dans
le milieu, Dans le cas particulier des bivalves (huitre, moule), les ani-
maux peuvent étre conservés vivants hors d'eau A 4 °C pendant
24 heures avanc dissection, Les échantllons sone prélevés sur le muscle
chez les espaces des vertébrés et les crustacés ec Sut les branchies chez
les bivalves. La masse totale de Méchantllon ne peut éete inférieure &
50 milligramenes
Conservation des échantilons
IL n'y a pas de systéme de conservation qui gatantisse lintégricé des
activités aptés scockage. La dégradation enzymatique est fonction de
espace (I’AChE de vereébrés qui présente des capacités cinétiques éle-
‘wées est plus rapidement dégradée que les cholinestérases de bivalve),
de la température de stockage (plus elle est basse, plas V'enzyme est
stable) et de la durée de stockage. Aujourd’hui, le condicionnement
‘optimal de conservation des échancillons est azote liquide (-196 °C)Lesmmarqueusbiciques es eft des palants:arehehalnestéase
en réduisant au minimum la durée du stockage. Les échantillons de
‘vent dete eraités immeédiatemene apeés décongélation en maintenanc
chaine du froid & 4 °C. Dans tous les cas, le stockage apris excract
esc proscrie.
eters
Les détails opératoires sone connés en annexe.
extraction des cholinestérases est la premigre éeape de la mesur
Aptés prélévement, les tissus sonr broyés dans un tampon 0,02
phosphate de sodium, pH 7+ 0,1 % Triton X100 a 4 °C. Le Trt
X100 est un tensioactif non ionique qui permet de solubiliser |
formes membeanaites majortaites des cholinestérases. Laddicion «
Triton X100 est foncitrement indispensable, elle garanti la solubi
sacion de coutes les isoformes moléculsites d'ACHE. Le rapport de
pension ese fonction de lespéce traitée mais on admec un rapport |
(poidsivolume - girl) pour les mollusques, 1/5 pour les ceustacés
1/10 pout les tissus de poissons. Pour exemple, un gramme de bra
chie de mole sera broyé dans 2 ml de tampon 0,02 M phosphate
sodium, pH 7 + 0,1 9 Triton X100. Aprés centrifugation & 9000
pendant 20 min a4 °C, le surnageanc (action mictosomale $9) q
contient les cholinestérases solubilisées est considéxé come la sou
dacérylcholinestérase.
Plusicurs méthodes de dosage de l'activité ACHE sont décrites mais
méthode specteophoomécrique d'Ellman etal. (1961) est aujourd’
la plus pratiquée, Cette méthode mesure le produit de hydrolyse d'
subserat synthétique - V'acétylthiocholine - suivanc la cinétique
acétylcholinesté
> chiocholine + acide acérique
> formation du complexe TNB-thiocholi
(coloration jaune lisible a 412 nm)
Dans des conditions d'excés de substeat, !appacition de la thiocholi
est proportionnelle a activité enzymatique. La fixation de I’
dithiobisnicrobenzoate (DTNB) sur les groupements thiols -SH- de
thiocholine provoque l'apparicion d'une coloration jaune dont Iine«
sicé est fonction de 'activité ACHE.
‘Transposée & l'utilisation de microplaques pour des puits de 400 jt
ALLas marques bsogaves des efets des polls: facéblhoinstre
Annexe technique :
Procédure standard de mesure
des activités acétylcholinestérasiques
chez les organismes marins
Etape 1 sur 4
Extraction des cholinestérases
—— eS
Poissons
1 g de tissu musculaire dorsal dans 10 mal de tampon 0,02 M pH 7
phosphate de sodium (PB) + 0,1 % Tricon X100 (ratio 1/10,
poids/volume),
Crustacés
| g de tissu musculaire abdominal dans 5 ml de tampon 0,02 M
pH 7 phosphate de sodium (PB) + 0,1 9% Triton X100 (ratio 1/5,
poids/valume)
Bivalves
1g de branchie dans 2 ml de tampon 0,02 M pH 7 phosphate
de sodium (PB) + 0,1 $6 TriconX 100 (catio 1/2, poids/volume)
> Broyage 15-20 secondes & l'aide d'un homogénéiseur de type
Ulera Tureax®
> Cencrifugation 9000 g pendant 20 minuces
Les surnageants bruts sont ucilisés comme source d’acétylcholinest
rase dans la mesure de lactivieé
.Lesmarqueurs bilogiies des efets des potas: Taciteoinestrase
Etape 2 sur 4
‘Mesure de activité de racétyicholinestérase
Méthode spectrophotomeétrique (Ellman et al, 1961).
Dans un puies de plaque a microrieration (microplaque),
introduire successivement
> 10 pil de Vexteair
«= auugmenterce volume si Vacrivite done nne alenr inférieure
40,1 A DOinn,
> 340 pil de 0,02 M pH 7 phosphate + 0,1 % Triton X100
+ ajuster le volume de tampon an volume extrait sernageant;
«= des pourcentages ce Triton X100 supérieurs 0,1 96 final
eset interfer avec le DTNB.
> 20 pl de eéaceif DTNB 0,01 M
=e riaaif DTNB est dssans dans 0,1 M pH 8 TRISIHICL
on 0,02 M pH 8 tampon phasphate;
~ la movi finale du DIN est de 0,53 mM. Poids moléculaire
du DINB = 396.
Ajouter extemporanément a la lecture:
> 10 pl de subseeatacétylchiocholine (AcSCh) 0,1 M
= lesubstrat ACSCh ot disious dans Poa disillée
la molarté finale de ! AcSCh est de 2,63 mM, Poids maléudaire
de PASC = 289;
welled ve que la repartition du substrat dans les pits
soit simaltante
Suivre la cinétique & 412 nm (405-420 nm) pendant au minimum
3 minutes, Choisir les valeurs donnan la plus force vitesse iniiale.
AyExpression de I'acth
spécifique de lacétylcholinestérase
Lctivitéspécifique AChE est exprimée en unité de densieé oprique
(1U = 0,001 A DOymn/mg de protéine ese calculée selon la formale:
DO (412 nmin AAaa2 x Vol, x 1.000
[orosine]—~ 1.36% 10" x profondenr de puts x Vox [prone
‘Aaa = variation de DO/min 3.412 nm
Val, = volume total 380 pl)
1,36 x 104 = coefficient d'extinction du TNB
profondenr du pits = Vera
Vol, = volume de léchansillon
prone] = quancitecaleulée de protéines ineroiite lors de la mesure
de Factivité ACHE brace, en mg/ml.
Exemple:
20 pl d’un extrait de muscle de sole donnent une activité brute
de 0,250 Do/mn + 0,022.
La concentration en protéine dans V'extrait est de 12 mg/ml
(22 pain.
20 pl de Vexeraiecontiennent: 20 x 12 « 240 pe
24 mg,
Exprimée en Ulma/mg protéine: (1 U = 0,001 4 DO), activité
spécifique est
0,250 , 0,022
9.022. 1 041 + 0, ymnlmg => = 1041 + 92U/mniem,
oP = COEF «L041 = 0,092.8 DoMmmg => = 1041 = 9 8
Exprimée en nanomoles de substrat hydrolysées, sachant
qu'une 1 A DO/ma/mg correspond a hydrolyse de 75 nanomoles
acéeylchiocholine, Vactivieé spécifique est:
1,41 x75 = 0,092 «7
78,1 + 6,9 amoles/mn/mg.
2%