(Ghoix de Nespéce bivindicatrice ae Le choix de lespce sentinelle sur laquelle les marqueurs biologiques seront mesurés est un compromis entre les exigences scientifiques, la finalicé du suivi et les ctitéres de faisabilié sur le certain. Une espéce bio-indicatrice doit avane cout étre disponible, sensible, plutde sessile pour fidelement refléter son environnement et facile & prélever. En milieu marin, la plupart des suivis concerne les bivalves et les pois- sons. La moule commune (Mytilus edulis et Mytilus gallopovincialis) a écé Vobjer de nombreuses études, essentiellement pour son coe d'échantillonnage faible. Les vertébrés benthiques, particulitrement la sole (Sofea solea), le flet (Platichrhys flesus) et la limande (Limanda limanda) en Aclantiquelmer du Nord et le rouget barbee (Mullus har 4atns) en Médicerrannée, ont été largement exploités parce qu'ils pré= sentene une plus grande sensibilité aux inhibiteurs malgeé un cofit de prélvement élevé, Lamplitude de la réponse des organismes a l'exposition aux inhibi- teurs est fonction de I'espéce animale et de la nature moléculaire de Vinhibiteur. Ces deux éléments induisent des éearts importants dans la sensibilité des différentes especes, Les données publiées dans ce domaine montrene une forte sensibilité des vertébrés puis des crusta- és et enfin une faible sensibilicé des mollusques en génécal Echantilonnag Quils concerent les possons, les crustacés ou les bivalves, les échan- tillonsdestinés la mesure de activité ACHE doivent éete vélisé sur des organismes vivants, immédiatemene apres leue peélevement dans le milieu, Dans le cas particulier des bivalves (huitre, moule), les ani- maux peuvent étre conservés vivants hors d'eau A 4 °C pendant 24 heures avanc dissection, Les échantllons sone prélevés sur le muscle chez les espaces des vertébrés et les crustacés ec Sut les branchies chez les bivalves. La masse totale de Méchantllon ne peut éete inférieure & 50 milligramenes Conservation des échantilons IL n'y a pas de systéme de conservation qui gatantisse lintégricé des activités aptés scockage. La dégradation enzymatique est fonction de espace (I’AChE de vereébrés qui présente des capacités cinétiques éle- ‘wées est plus rapidement dégradée que les cholinestérases de bivalve), de la température de stockage (plus elle est basse, plas V'enzyme est stable) et de la durée de stockage. Aujourd’hui, le condicionnement ‘optimal de conservation des échancillons est azote liquide (-196 °C)Lesmmarqueusbiciques es eft des palants:arehehalnestéase en réduisant au minimum la durée du stockage. Les échantillons de ‘vent dete eraités immeédiatemene apeés décongélation en maintenanc chaine du froid & 4 °C. Dans tous les cas, le stockage apris excract esc proscrie. eters Les détails opératoires sone connés en annexe. extraction des cholinestérases est la premigre éeape de la mesur Aptés prélévement, les tissus sonr broyés dans un tampon 0,02 phosphate de sodium, pH 7+ 0,1 % Triton X100 a 4 °C. Le Trt X100 est un tensioactif non ionique qui permet de solubiliser | formes membeanaites majortaites des cholinestérases. Laddicion « Triton X100 est foncitrement indispensable, elle garanti la solubi sacion de coutes les isoformes moléculsites d'ACHE. Le rapport de pension ese fonction de lespéce traitée mais on admec un rapport | (poidsivolume - girl) pour les mollusques, 1/5 pour les ceustacés 1/10 pout les tissus de poissons. Pour exemple, un gramme de bra chie de mole sera broyé dans 2 ml de tampon 0,02 M phosphate sodium, pH 7 + 0,1 9 Triton X100. Aprés centrifugation & 9000 pendant 20 min a4 °C, le surnageanc (action mictosomale $9) q contient les cholinestérases solubilisées est considéxé come la sou dacérylcholinestérase. Plusicurs méthodes de dosage de l'activité ACHE sont décrites mais méthode specteophoomécrique d'Ellman etal. (1961) est aujourd’ la plus pratiquée, Cette méthode mesure le produit de hydrolyse d' subserat synthétique - V'acétylthiocholine - suivanc la cinétique acétylcholinesté > chiocholine + acide acérique > formation du complexe TNB-thiocholi (coloration jaune lisible a 412 nm) Dans des conditions d'excés de substeat, !appacition de la thiocholi est proportionnelle a activité enzymatique. La fixation de I’ dithiobisnicrobenzoate (DTNB) sur les groupements thiols -SH- de thiocholine provoque l'apparicion d'une coloration jaune dont Iine« sicé est fonction de 'activité ACHE. ‘Transposée & l'utilisation de microplaques pour des puits de 400 jt ALLas marques bsogaves des efets des polls: facéblhoinstre Annexe technique : Procédure standard de mesure des activités acétylcholinestérasiques chez les organismes marins Etape 1 sur 4 Extraction des cholinestérases —— eS Poissons 1 g de tissu musculaire dorsal dans 10 mal de tampon 0,02 M pH 7 phosphate de sodium (PB) + 0,1 % Tricon X100 (ratio 1/10, poids/volume), Crustacés | g de tissu musculaire abdominal dans 5 ml de tampon 0,02 M pH 7 phosphate de sodium (PB) + 0,1 9% Triton X100 (ratio 1/5, poids/valume) Bivalves 1g de branchie dans 2 ml de tampon 0,02 M pH 7 phosphate de sodium (PB) + 0,1 $6 TriconX 100 (catio 1/2, poids/volume) > Broyage 15-20 secondes & l'aide d'un homogénéiseur de type Ulera Tureax® > Cencrifugation 9000 g pendant 20 minuces Les surnageants bruts sont ucilisés comme source d’acétylcholinest rase dans la mesure de lactivieé .Lesmarqueurs bilogiies des efets des potas: Taciteoinestrase Etape 2 sur 4 ‘Mesure de activité de racétyicholinestérase Méthode spectrophotomeétrique (Ellman et al, 1961). Dans un puies de plaque a microrieration (microplaque), introduire successivement > 10 pil de Vexteair «= auugmenterce volume si Vacrivite done nne alenr inférieure 40,1 A DOinn, > 340 pil de 0,02 M pH 7 phosphate + 0,1 % Triton X100 + ajuster le volume de tampon an volume extrait sernageant; «= des pourcentages ce Triton X100 supérieurs 0,1 96 final eset interfer avec le DTNB. > 20 pl de eéaceif DTNB 0,01 M =e riaaif DTNB est dssans dans 0,1 M pH 8 TRISIHICL on 0,02 M pH 8 tampon phasphate; ~ la movi finale du DIN est de 0,53 mM. Poids moléculaire du DINB = 396. Ajouter extemporanément a la lecture: > 10 pl de subseeatacétylchiocholine (AcSCh) 0,1 M = lesubstrat ACSCh ot disious dans Poa disillée la molarté finale de ! AcSCh est de 2,63 mM, Poids maléudaire de PASC = 289; welled ve que la repartition du substrat dans les pits soit simaltante Suivre la cinétique & 412 nm (405-420 nm) pendant au minimum 3 minutes, Choisir les valeurs donnan la plus force vitesse iniiale. AyExpression de I'acth spécifique de lacétylcholinestérase Lctivitéspécifique AChE est exprimée en unité de densieé oprique (1U = 0,001 A DOymn/mg de protéine ese calculée selon la formale: DO (412 nmin AAaa2 x Vol, x 1.000 [orosine]—~ 1.36% 10" x profondenr de puts x Vox [prone ‘Aaa = variation de DO/min 3.412 nm Val, = volume total 380 pl) 1,36 x 104 = coefficient d'extinction du TNB profondenr du pits = Vera Vol, = volume de léchansillon prone] = quancitecaleulée de protéines ineroiite lors de la mesure de Factivité ACHE brace, en mg/ml. Exemple: 20 pl d’un extrait de muscle de sole donnent une activité brute de 0,250 Do/mn + 0,022. La concentration en protéine dans V'extrait est de 12 mg/ml (22 pain. 20 pl de Vexeraiecontiennent: 20 x 12 « 240 pe 24 mg, Exprimée en Ulma/mg protéine: (1 U = 0,001 4 DO), activité spécifique est 0,250 , 0,022 9.022. 1 041 + 0, ymnlmg => = 1041 + 92U/mniem, oP = COEF «L041 = 0,092.8 DoMmmg => = 1041 = 9 8 Exprimée en nanomoles de substrat hydrolysées, sachant qu'une 1 A DO/ma/mg correspond a hydrolyse de 75 nanomoles acéeylchiocholine, Vactivieé spécifique est: 1,41 x75 = 0,092 «7 78,1 + 6,9 amoles/mn/mg. 2%