Mesure de ia concentration en protéine dans extrait meer protsine dans extrait ethoce snectrophotometriaue de Bradord (1976) Attention a mttade maure ume quanti de preine Par puts Gi epbirt an game talin de protina, La conamtoann Protéine dans Veiraitréalte lun cael qui fait iteoon olume et ba dilation de Vextraitintradis Préaration dela gamme etalon & partir dunn bovine Attention wily que Faun distil pour ls préparations diluion, > A parti d'une solution stock d albumine sérique bovine (BSA) Gralon de 0,1, 2, 3, 4, 5,€¢ 6 pg par puits dine ‘microplaque (1 bg = 10 ul de solution stock, 2 ng - 20 bl, ere.) Compléter 8 100 pl avec eau distillée Préparation de a diton de extrait enzymatique Irion X100 préen dans le tampon dextracton inte sie twat de Bradford. Une dilaton de Petrert dens ha diillle et indispensable (0.5-1,2 DO). Ineroiite un volume appropri ce cette dilution > Incroduire 280 pl du réaceifditué dans chacun des puts, 1a coloration bleue se développe pendant une minure Labsorption est lue 4 595 nm (570-610 nm) apeés 5 minutes Ta concentration en protéine dans extrait est calculée A partie dk la gamme éxaln en prenant en compre le volume de fea ie dilué et le facteur de dilucion, 5720 ul de réactif0,01 M DENB (0,53 mM final); +10 pl de Péchantillon ; 710 bi de substrac acétyltiochotine 0,1 M. AcSCh (2,63 mM final) extemporanémene Le-olume d échancillon incendie es fonction de Pespce ex des carac- {érstiques de extraction, Le volume total de 380 plot indispensable declan ne et lol de Beer-Lambert. Lineroduction du valenns dléclenche la eéaction enzymatique. La cinétique cot i pendant Guelaues minutes en fonction dela vitesse dela reaction qui dépend elle-méme du volume d'échantllon ineroduit, de espace eestée et des faantions dexcracion, Dans tous les cs, la vitese retenue da tn ia vitesse inicale, Lactvieéspécifique d'une ensymne on coujours caerme: PA fapPorE une quancité de proeéine. Lactivitd ACHE ve Tous les eéctfs doivene étre amenés a cemperacure ambiance avane megeation. Les puits sans extraic enzymatique (eampom, Die discillée; 4 i téaccif DIND ese prepare dans da tampon 0,1 M TRIS-HCI pHs. 08 0.02 M phosphate de sodium pH 8 et peut Gere conservé quelques jours a4 °C, 4a tempéracuce opcimale de mesure se siue enere 20 e825 °C Dosage des protéines totales —— aa —— 1 dosage des protéines selon fa méthode de Bradford (1976) ext basé Gr [x coloration bleue développée lors de la fixation du bleu de Coomassie sut les groupementscationiques des protcines Pour chat Pea a meses, 280 il de react de Bradford (acide phosphorique, iéthanol et blew de Coomassie) sone ajoutés 100 pl une dilute appropriée de l'échancillon 4 doser. Le réactif de Bradford est com. nercialement disponible sous forme concentrée et sa dilution dans de Ut distlle ese consillée excemporanément. Parallélemene et pour chaque série de mesure, une courbe d'étalonnage entte | et ng de