VERONICA DINU EUGEN TRUTIA Profesor dr. Profesor dr. ELENA POPA-CRISTEA. AURORA POPESCU Profesor dr. Profesor dr. doc. BIOCHIMIE MEDICALA mic tratat SM EDITURA MEDICALA Bucuresti, 1998[Coperta de: ADRIAN CONSTANTINESCU. .»Toate drepturiteedivoriate epartin i exclusivitate Editurit Medicale, Publicatia este mared tnregistratd a Editurit Medicale, fiind protejait integral de legistatia interna si internagionalé, Orice valorificare a conginutulul tn afara limitelor acestor legi si a permisiuniieditorilor este inserzisi si pasibilé de pedeapsd. Acest lucru este valabil pentru orice reproducere — integralit sau partiali, indiferent de mijloace (multipliciri, traduceri, microfil- ‘dir, transerieri pe dischete etc). Tehnoredactare computeriatis TOP GAL SRL ISBN 973-39-0299.3,Prefata in domeniulsiingelor biologice progresele tehnologiel moderne au permis extinderea si aprofundarea studiilor referitoare ta diversi constiwenti celwlari sau subcelwar Totodatd, uilizarea metodelor moderne de investigayie siingificd in domeni au evidentiat $4 noi roturi sau mecanisme de actiune - mai mult sau mai pusin complexe ~ ale unor asemenea constituenti. Datorita acestor fapte, insusi obiecnul de studi al biochimiei ~ in general - sal biochimiei medicale - tn particular - si-au largtt sau g'au aprofundat continutul propriu. De asemenea, fn ceea ce priveste obiectul biockinitel medicale, investigatiite moderne de cercetare au relevat not si multiple implicatit - din ce In ce mai siranse - pe care le are aceasta disciplina cu diverse alte discipline medicale (genetica, fitologta, fisiopatologia, farmacologia, medicina internd etc.) Se injelege ca in asemenea conditit se impunea intocmirea unui now tratat pensru studinl biochimiei medicale care sd cuprinda tatr-un tot util atdt unele cunostinge clasice cat si noile achizitt ale cercetarilor moderne, precum si evidentierea relatillor existente intre procesele biochimice si funciile fiziologice - normale sau patologice - studiate de alte discipline, considerate strict - medicale, In mod deosebit aparea necesar sé fie elevate mecanismele moleculare care siau 1a baza declansdrié unor boli in vederea realizarli tuturor acesior deziderate s-a elaborat lucrarea de fata care ‘cuprinde: studiul proteinetor, studiul enzimelor, transferul de informatie, hormonil si mecanismele de reglare metabolica, energetica biochimica, marile metabolisme, echilibrul acido-bacic, matricea exiracelulara si nofiuni de biochimia nudritiet. Pe lingd caracterul didactic care face ca lucrarea sf poatd fi uilizatd de studengi pentru tnsusirea bnvdjamantulul de biochimie, adresabilitatea acestet biochimti medivale este mai larga, considerdnd-o folositoare atdt medicilor cat st biologitor; in special, celor care-si desfasoard activitatea profesionald in laboratoare clinice. In dorina realizarii unui text usor de urmdtrit si retinut, lucrarea este insogita de ‘material iustrativ bogat cuprinzand numeroase scheme, tabele si tablouri sinoptice. Referitor 1a bibliografia care a stat la baza elaborari ei trebuie subliniat faptui ca desi ea a fost vastd, sau mentionat aici publicatiile mai recente $i mai importante, prezentandu-se deci o bibliografie selectiva AutoriiCuprins Cap. 1 Froteinel Structurd generata. (Prof. De. Elena Popa-Cristea) 1 Aminoaciai 12 Pepiele U3, Protiele : 121" Sct prima prot. 182 Organizre spajalis moleclloy pote ‘Staci sedan poinln Strctrs tna spate Strctry cinemas proteins 133 Propratii genemle le prin. 134 Gasitctes protein 35 Proteioele pasate Serimaltunina Invanoplobulincis eto a eoaglie ibvnogcaa 135 Homoproteinc 137 eonectincte Cap. I, Enaimele. Prof. Dr E. Taga) TLL tntoducers, sees , M2 Seiderea de clire enrime a ncisiel de acti caualiel a enzimelon U3 Specifcisten enziaior UIT Specifietate de race. 1132 Shecifistate do saat 11333 Specticate sereochinic, UA Strvetiea enzinlon MA. Aspecte xenenie. | 142 Engine ov stracaesprossicd | 1143 Easiae or ervtusl heteroprte. ILS Sistem (complexe) mubienzinti, 16 lasenime - U7 Central setv gi ance TX Cinetica ensinatics. : 1LS.1 Expeitnarea viteei reactor easinatice. AUivitten enneion 82 Viteza inal a realoecozinatiee, F 1183 Indluengspit-uui gi emperatai asupra avi envinclor T1844 Influenjaconcentaietenzim. TESS Inflenjs concentrate substestuli, Beuaia Michaelis-Menten. M86 Determinares experimental Ryy Seuaificaiaseestel constant. Conta etait, Ke 18.7 Besujia Linewesver Bork, 5 1838 Inia acivisitensimeloe ic ioe. Gc 1B ry 2 cf FY as 0 6 a 5 2 3 if a “s 6 6 6 » n 2B RB % 1B 7 8 8 a is %0 °2 2119, Replaeabiosintat 9 activi easnete. i191 Anect pene 11923 Relarea ean eine {19.3 Replies sos atv catch. U19id Reglare alent a fncit hemoglobin 11953 Roplaes coven 3 ac enanelo 1110 Localizves lorecsald a crane ILI Enainete paeosis 1112 Chsifcsren denies eco. (Cap. HL. Vitamine 31 coenzime. Prof. De. doc. Aurora Pesce} Lt Generale ML2 Chyiicars visitor 113 Vitaninele hidrosolabe i voir ir coenatinaien. M131 Complesal B ‘Vaan B, amiss) i cocina tminpiatostat Vitamin By (ibellavint) x coenzele fav Vitamina PP (nacia) gi coensimelenicuinarsidice. Vitamina B,(piridonina) yi coonaimele derivate ‘Aci pantotenic gh ewenbima A, Blowing gi oll ei Coenimatc, ‘Vitamiat By (ctancobalanina) yi ela ef coeneimati, Aciul folic eoenziele dria 132 Viumina € acid ascorbic). MLA Vitanipels paso, TL Vieanina A reine. h42 Vismina Doss Lt Vining ka Viti (Cap, IV, Adal nucle (Pro De: Veronica Dino), 1N.1Intocere N22 Sct chink air aie V2.1 Brace sunave din store acallor able 1¥22 Nocteoise i eteotde din tors actor wii 1.23 Nucleotide naturale bes V2 Analg! stctra psor aot i miler 1V25 Sinatanscovaleolt»scgior uch 126 Camis Tato cine nestor al ‘enatraen 9 hates ABN Rivrales aetior aude 1a’quial devonrivonclet VS Strasura coves a ABW. : 1¥32 Confonnofia motel de ADRS pu ve saves {33 Omaizarce nara gee I poss suc 2% attr genous cuca 123 Bioinens ADN (epicaes)- ices Ja procacns Reflcwes Is Socio. Sines de ADN pe mani de ARK. V4 Atal ancl Tih Tipo de ARN, “ARN mesagoe (ARN) [ARN de tater AUC, AARN sinozomal (ARN). AARN nvcler dee! dns wanes Aaa ma de ABN Gio) Transeriote ls Euan Innit a wana 13 rec op psec’ ae niclior de AR, Exciviaintonor din tnseripce par Molten posta ulfinae IVa Bisiates ARN pe maid de ARRCap. V. Blosinteza protenclor(traduceren mesaju Vel Coda genetic. ¥2 Blosnters proteincor, : 2 Prelucetn postiadieee we malacuiorpotie Ye Rega oni price. ‘V5 Ltn ale molcslelor de ADN i separate seein, tai ‘VSI Reparte pin excne sna : V52 Repararea prin evenaree len 33 Mia Expr erotics mai. CClonatea genelon me 7 Choarea goosor in viva (Fetioiog ADN recogni ‘141. Seenaial= clon geneor sieves ADN recom 3712, Expamaen fens infonmai copies in ADN vec 72 Clonaresgencov in Vio (Reatia polimeraies Ts la) 73 Aplin le clontn gene iDetrminaesseevenetnusesicior te eipensdctd) fhe muse ante ‘eon de trostr Sot ‘enetie). (Pot. Dr. Veroica Dino), ¥. v, v, vi Cap. VI, Bnergetica blochlmied, @rof, Dt. E-trai) Tiago me V3 Sine trmotiunic.Fanli de aarp inno AA a tc VLE Cate de sitet ATP i vv, a Cap. VHL. Metabolism glucidelor, (Prot: Dr. Verouies Dia)... 204 Vila Chimis glucidelr : 204 VILL? Monorail el 5 235 ‘Stereoizomeria monveahardeior : _ 2s Structure eiclie ale monozaharidlor, : A 5 08 “Amsinozshren IS 403 Denosizanarn, u so Proprieie fiice 4 chimice ale inoneaaacdsin. ans YViLL2 Olipozsbarvee : 408 VIL Polzahartde HO | ‘ViL2 Digest aber glucdelor, I a2 | ViL211 Dette enzimatce In digest yi absori guido‘. us Vil3 Gaile de metabolizare a glocoze. = a6 VMAX Giicolia (Secventa Embden-Meyamnot Pana). us ‘Bilal cacrgeic a licliai : 2 VIL32 Decarboniiea ochlativa tpiuvaiauis |. > 29 ‘VU133 Cielul acvalor icssboxle (Cell Kesh) 333 Ciel Krvbs = cae wnibalict F 85 Bilan energetic al ane slacoii or TN SlsVid Ale efi de metsbotizar a slucom Vili Cale peniozofostatior ce pean ar EF Dette tn: cnt pte ae pon i ‘vita’? Cale aed a ere ms VILS Glaceneogens, ‘ViLSi1 Roplare alostaicd a gluconeogencze. i152 Rela: hontonl a acomsopom ius Metabalsnal licogenclu 'Vil61 Degradrenshicogena Reglare plicogenoize ‘Vu.62 Biosintesa plicogenalsi (Gicogenogenera). | KReglarea glicogenogencze ‘VIL63 Alert entimatice in metaboismal glicogenitul VIL Meaboismol galacozs. ILE Metabolism frac VIL9 Glicoprteiele ees. VIL9.1 Biosintea alicoproteincion ii92 Snes lg cpio ‘Vu.t0 Piosoalicani : Cap. VIN, Metaboisutlpidelor. of: Dr. lens Popa-Ceistesh coeeesees 394 VEIL Chim ipidelor. Se : cose $84 ‘WULLLT Asis eae EEN a VIULL2 Actaris (Glicridls so grisile nasi) aeeettr 387 VL. Retell (Geral fra) 3 339 ‘Ai Tosa 389 Fesfsicolinele Gein) 200 Fosftlistanolinl : fon Fosltiisennsle (en-tfiie. 402 Fontan Ga ois, i 402 Paamalogenle 404 Fostaudigterti DUS 04 VIL Sfngolipdete : : do ‘Slingomicinel. : SEEN Saas ‘Geosinglipiel. 2 LIT fos urns Comer se 2.0200) : ao VL Ue ein. aor rence ao * aoe a0 as Vtl2 Digest absorb lipideor : VIL Metabolism sciedor grag es NON an ‘VINL3-1 Degradarca oxida’ 4 avsilor gr Onidarea sctitor grag (Ciclal nat aps iui Lyne, a8 Bonus sar ft Sentara a1 a2 (Oridare chor grain pono VIU32 Catogenecs 5 \VUI3.3 Biasinezs cil gag ‘Biosineaa eidal pam Elonpatea aszlor gra. 5 Bosintzaaciilor gayi nestor == ‘VIS Metabolfemal lev, ‘INS Metaboliemal naciiglicsrtior ‘VINLS:1 Hidolia ta liceroio, ViIL3.2 Biowineza taciglicerolitor. LVIILS Metabolism! gliceolosolpidelor. VIILT Metabotismalsfingolipidelo VIIL8 Meabolismal colesterohu : ‘VISIT Digestia yi absorbpa colesicrluul VIN82 Biosinteza coleterails : VUIL83 Catablisna)eolesteroluii VIL Lipidele plasmatice VIO Analiza lipides plasmic, VIIL92 Chilomicroni ssVIL Lipopreseinele ev densiate mick (LDL, Bl poproteine). IIL Lipoproceinele co dentate mare (ADE, eclipopreceine). UILOG Acti grag ber (AGL, scat graginecsteniie) ‘Vi97 Dispel ‘VI.10 Ficosante. VILI0.1 Blosintexseicosinoizio ‘¥INL10.2 Catabelismal peostaglandielor 27 YVIILIO'3 Acne biologic ale eicosanizion (Cap. IX. Metabotismal protelnelor sal annuacizlor. Prof. De, BX fatroducer. DC Starea dame poicinelo. Banu anus BG Digest prtincior lint yaoi nici, iia rte endapee, 124 Fondul de aminoacla. Aminoacta esa IK Caan wine desist yi Sl nog. IXS.1 Aspect generale, 1X52 Dezaminarea oxidativi a aminonczlor ji anspor union C53 Diowntens ce DCS Rela fine csi ureogenoti i ich senior iearboniic. ESS Boi cauzate de defecte in metabolizares amoaiacul, 1.6 Catabolism aminoacilon wilzares eeeletclo de carbon, TX61 Aspect generale 1DC62 Alaina treonina,slicins, seria, estina (i ltina) ro Segre la ald pirvie. | C63 Aminin, poling, bstidins,glutamina aedulglotamic se degradeso8 In acid eeetogtae, [D644 Aspagina i aeidal sparc we dagradcn ia onatoseetat” | [DCG tzoleucing,valos yi mlionins ae degredouss la scsinl-COoA, 1RC.86 Leucinn i lizna e degradeazt lo acid ueoioactic va acetal. CoA, 1567 Trpuotsnul se degrades I aceliCoA alain [C68 Fenlaanion gi ror se degradeazd ta acid fumavic gt acid acetoacaic 169 Bali caunate de defect th uiljatesacheltal de eatbon a amioaeizlor i Blsiens anne tei TK Aspecte zener 1X72 Ca parcalare de biosnis, 1%.8 Fonmarea din aninoaczi a unor comps ce fant speeaizae. DX.61 Compusi rez prin deearbotiaressminesczion C82 Biosinteza gluational, DCR Sintraa ereatne. Relajia crating = creatifosat. Creatnia, DCB Coripuyi de wconjuene” a aminoseiaior Cap. X. Metabotismal hemoprotenelor. (Profs, -Tria) XL Aspecte chime. 2 Bionintea her YET Elapele bsinere, | X22 Keaharea biosinteas emul 23 Powe, X.3-Caiaboismul iin YLT Brae inal X52 uilabinomre, vinden Ho ei, anor, ee bile XC83 Euaple finale a X35 Hipebtimbineni Tryin Cap. XL. Metabolism nuctootdelor purnice prince (Prof: De Blebs Pops-Cristes. X11 Metabo wucteotidelor pier X11 Bosnian de novo «leila ncaa I Bionntena AMP si GM, site aucleelr es igi fost wera. Bisitezn desocibonecleldelo, Retlava biowntsae de novo purl XL Ineo toe pir X113 Cabell purglor [SUL Batelogia metbolsmttal piston ‘st m a 6 6 9 419 09 far 90 93 eu euX12 Metabolism nacleotielorpisiidinies urine tt a Fe Go. om ot Br an ae ees : : a ‘aise Soe IRs SaagAn 22 ee : e aE A ace oe rae aie ee x gies oe ‘XILS.1 Hor al parti Wee ee 4 BEIT Sica hi a va OS Seas iemaaare “ ee SESS Oe er & 28 Scar ets 28 Sg woe i : et ace SS58 Hormonii hipofizari glicoproteci a a HT @0 XUL11'9 Hormonit neu chipolizan & ul42 Epis team peal 250g} SI15 Ehdortne : as ROLL Ft ei 33 L141 Fula EO peru grow factor : 635 SUL43 Fonte For (Hwa pow aco : Soe 6 XUL143 Fumi POGE (lacket derived grow factor). «2002202. 2 686 XUL144 Familie TGF B (Transforming grow far aes a XULI45 Factont de eresereinsainclke (GF, emstomeding) EI 6a XiL146 NGF (Nee grow factor. eae rly XIL1427 Familia CSP {Colony stimalaing factor). BUI 9. RITES Eten (Etopenn ning no : 0 XU1149 Intedeakinele GE : eae XUL34.10Ineroronit ONE), eas XILI4.11 Oncogencle yi canola erent clare. es Cap. XITL Apa. Procesee hidrvetcetroitie sf elilbeulaeldostazi. (Prof. Dr. dos. Auror Popescu) XIIL Ineoduoer . 6a RIN Cojtel psi ape i on : 63 SHA Beibal spel fn organ, : 67 XMLS.1 Necesal line de ap SII aie KIL Pendens de apa : Soy os XiI13.3 Exoosul dt apt aon ST oa XM Brooceaite neo-chinie ae pet. CUE En ei ADEA Stn praca marie : ol ee SIL42 Lagstura de hidropen 9 asoiee molecule : Dg 10%A.4.3 Cio spect clara de vaporzare, UL Caaare de top, poncal de toi pont de ters SULaS Ape ordain hs rose inci 1 noes se rl oi a pc SUS Kev slaty pl. XLS. Spect de aca abs i ie ithe Headsets ‘Yli.61 Silene tanpon aida hiarbooat. 3.63 Satemal tampon a fos Ae} Seca ign a pri XiLe4 Sitemal mpen al bomogtobioet ILS Coopenrea pman-erit Cap, XIV. Matelea estracelulard (Prof. de. oe, Aurora Popesca} XIV1 Consttvenyi cic af matrce!extmeelulare, ‘NIV-71 Prec. YIV.L2 Glicoainingticani i pasieahicaal Giccraminogiat Pantie hislogioe ale proteaglicanior i licvaninc pliner: Biosuncon gi degeadare prteoglcanlr, IY. Rolal mathe! extacealare Ta eysul mocdopencze IV3 Modified consttuenlor natsoat exacetlre. XAV.S1 ModifeSri fa fone do Vast XIV.3 Colagenozee, XIV.53 Une mealies calaive dnd XIV'34 Macopolzanardozele ‘Cap. XV. Nofiuni de nuteite (Prof, Dr doe. Aurora Popes). VA Katou 53 Necesaral nuit ‘V2.1 Chel de energie ‘Mabotismal boa Ereccle wnnosenetie Chet egies den Se elvis a depo. sever Sega 5 Conipoaii envi jel abner XV Pencpie native V9 Ghucse 333 Lida 5353 Bronte V3.4 Viemiels KV353 Minerale KVMs Sobmanjele score hie V5 Fite smear wee Nes “i 4 Procipelle prose aineare ‘Vi Wels atsenare de ogi inal apts si produel acai ue. Came. Pestle xvid Pret nite de abe was Corealele. apie: XV.43 Ae prodise ainda ‘rodusele zalacoase Uae Condiment XVAE Allmenie bogs Ya ainosei excel XV Renaniare ner pap aatev nce npn prdas aii. 2xV'5 Couanboya nail pistarea S58,Cap. L PROTEINELE. STRUCTURA GENERALA Proteinele sunt constituenti chimici ai organismelor vii cu cel mai inalt grad de complexitate, de variate moleculark gi care prezinté specifictate de specie, de organ. Denumirea lor deriv’ de la cuviintul grevese .proteias" care inseamin de prim rang, cel dintti". Protencle_ sunt ubsanie masromolssulae de-pae-nalioenidich. La consria proteinelor participa woacizi fundamental, aceiasi la toate vieluitoarele, de la. i_simpli_bact 18 la om. Prin legare in lanfuri polipeptidice variate ca jungime si succesiune a uniii{ifor se poate objine un numar nesfirsit de combinagii, Cu toat multiplicitatea posibilitijilor de combinare a aminoacizilor in lanturi polipeptidice, 1a_un_anumit_organism nu se realizeazi decit anumite.seevente, acelea care sunt specificate de materialul genetic, de ADN parental, Proteinele sunt macromolecule informafionale, cu secvenfe_specifice ninoacizi, sunt expresia epigeneticd a genomului celular, Proteincle indeplinesc funcfii fundamentale, specifice organismelor vii (Tabelul 11): Tabet B. Exemple de proteine st funefil indeplinite de acestea Proving Fania ‘Colagenul Principala proteind a jesututilor conjunctive Histooa Proteins nuclear asociatl ea ADN Spectina rotsnd eritocitara cu rol in menfinerea forme eclulare “Armilaza Enzimd, paricipé la digesia amidonulut Pepsina Evin, parcips la digesia proteineior Glicogen sintaza nein, parc la sinteza glicogenlui Taciat dehidrogenaa TBnzim, catalizeae oxidarea lactatula la pirovat Aetna Proicind contactlé din magchi ‘Miorina Proveind contract dia magehi Tsui Tiormon pancreatic hipoglicemiant Hormonul de eregere Honnon tipotizar Serumalbumina Protein plasmatice, anspor jon, vitemie, honnont Hemoglobina “Transport oxigen i sstemol circulator “Transferina “Transports oni de Her a plasma Feritina Forma de depozitare a feral Giocroni “Transport electron Trunoglobatinele “Anlicorpl care fixeatl i imobilizearl agenil bactereni Tibsinogenal Proving plasmatied cu rol Sn coagularea singelal - Proteinele au un ro structural major, ele consttuie material din care sunt consiuite toate siructutile celulare, membrane, organite celulare ca si materialul interceluzr al Jesuturilor gi organelor, Proteinele exist intr-o varietate molecular’ foarte mare si cle asigurti diversitatea si specificitat 13+ Proteinele. exercitiactiuni cataitice, determindnd varietatea nesférsitt de: reactii biochimice si specificul transformarilor chimice dn organismele vii. ~ Proteinele contractile sunt instrumentele :u ajutorul c&rora organismele vii Indepinese activtatea contact i locomotoare. amine, oxigen, dioxid de carbon. - Proteinele’ au sarcina de a apira organismul impotriva unot corpi_strtini, ‘macromolecule, virusuri, bacterii, Reactiile imunologice sunt mediate de o clast de proteine specializate - imunogiobulinele, L1. AMINOACIZIL Unitajile constituente ale proteinelor sunt aminoacizii, care prin legatura peptidic& ‘inure gruparea aminict a unei molecule si gruparea carboxil a altei molecule dau nastere TLROSTMGHECHE peatiee, Esa 20 arniomclapretcnogent specicay pin coal genetic, prezenti in toate organismele vii, de la cele mai simple pnd la om (Tabelul 1.2). Altituri'de acesti 20 aminoacizi fundamentali, in proteine se mai intdlnesc alti cdtiva, care rezultd, de fapt, prin modific’si chimice ale acestora dup’ tncorporare in lanfurile ppolipeptidice (do ex. hidroxiprolina, hidonilizina et). Totodati, se mai intlnesc si unit aminoacid cu ate func, ca omitina,cirulina (Tabeld 1.3). ‘Aminoacizii natural au formula general: B—GH— coos NH, ei sunt c-aminoacizi. Face excepfie unul din cei 20 de aminoacizi,prolina, care, are 0. functie aminic& secundard,_ Diversitatea aminoscizifor naturali este datt de natura tui R care poate fi 0 catend hhidrocarbonaté alifaticd sau aromatic, un heterocicla sau R poate s& cuprindd o functie adijionala. + Aminoactzit alifatict-(Pard gruptti functionale th R). Gicocolal sa glicina: GH, — COOH NH, Alanna: oH, — cH — coo th Valina: cH, — CH— cH — COOH ba, he Leucina: oH, — CH CH, — cH— cooH oh Teoleucina: CH, — tt — Ge — Gt SO0H CH, NH, 4a(S] aa uy , "aN HO 12] aumomaaustounien poy] tupnon ooo —H}— 1b "ho — "ho 1. a) oot stoxtmearounse- PPY| 1000 — HO — "HO — HO — *HO| SN “HO als mPR.CORHEE» PEN ree 009 ~ ¥ — Hb — HN, vil aw ousdsdaguen py eer 1000 ~ 4b — "Ho or 69 onaswouie poy] cement) soon 000 — 1} s e € t t eo co imag. | paierseo ors nos pone norma. poamonas paso cr mean rodoupjoad soyzprouae ingap 16 agIMPANS,‘UN HSI arcane suoxdaxdon-f-ommme-p pry) PUI) 000 — Hb — | *HN "HN HO. fe| om ee ee "HN HO! | me onion env pov _ 1000 — th ab] ji te 0 ay omioxioudopur<-ounne-n proy| jendy | OS aa at fi HN \ a a 1000 = th — 10 ££ ) 7 HoO9 —y ) og ‘paxoq9-o-wIpHONE pioy | ‘puroad] L_ gs v £ 1 (oaomurwes) Z1 peaa w=$ sn wy WS!) ay emu sounutpend-g-ounun-D poy sumary| Wooo — #}—tHo — "Ho — tH} HN “HN xlé] wa ayouesounnepar9 pv] eon] 000 — 1b — "ho "Ho — "Ho — "Hb HN a] a umn opauet-coen roy onmno| 009 — Hb — "to — 0 — oon 2 (4 "4 a aa ouenifoune poy] sama pry Hoos ~ #3. — "Ho — "Ho — 200H aN nQ2i] wv auponsopaun-goumen poy] guy 009 — Hb — "Ho — oon or a aw ee 11000 ~ Hb —"wo — 9008 aN wt consensnowsommn ny] _eemonen| __Hooo—Hb "Ho —"Ho—s—‘ho v £ c T (zonwgnuo>) Z7 2901stozuaqoune-t poy HO —"H'O — NH orange pay-cuue-n poy euuDsOWOR, HOOD — CHNJHO — HO — “HO — OH ouungonst-oute-n poy ustSowoH, Hoo9 — CHNIHO —"Ho —"Ho — SH ommuDyesomUEp-g'2 PY wuntig, HOO — FHNIHO — CHO) — NTH mepatesoupuive-g-oumuse-» poy sei | HOO ~ FHNIHO —"CHO) — HN — 09 ~ NH 1 apauurct orugsaqouNeg py HOO ~ "Ho — "HO ~ 09 —"HO— NH Loreoponiomay, vk poy vaya 1 Hooo — "Ho —*Ho —"Ho — NTH amordoudoaue-d pray wumety = HoO9 — "Ho ~"Ho— NTH 1 automa mn aagumuog preanaonas pmo Ermey, mofouayoudon yovouuyAminoacizii aromatici (fir geuptiri functionale in R). reotmnee on net coon 1 Ni, Aminoacizii heterociclici. Histidina cuprinde heterociclul pentagonal cu doi atomi de sat, imidazol Oo ott ; Triptofanul cuprinde nuclewl heterociclic al indotutui oo I a cH, — G— COOH O art ql Inde ‘Triptotan Prolina cuprinde o grupare aminicd secundard, situatd intz-un cicl derivat din pirol: O ou N 8 q gin peti Aminoacisii cu grupari hidrosilice. Serina si treonina curpind in R functii alcool: Gre pri coon Oy — PH — GH ~ COOH OK NH, OH NH Serina Treonina Tirozina posed o funcjie-adijional’ fenol: w<_) CH. GH — CoH NH, 19Aminoacisit cu sulf (ioaminoacizit). Cisteina cuprinde functia tiol (R= —~ SH) gi melonna tunic oter R= = 8 — BY Gi, gr — COOH chy 8 — oh, — OF, — GH — COOH du tn, th Catia ti Aminoacizi dicarboxilici. Acidul aspastic si acidul glutamic sunt acizi monoaminodicar- boxilici, iar asparagina gi glutamina sunt amidele lor: HoOC — cH, — GH COOH #000 — 04, — oF GH — COOH NH NH cial panic cial game HyNloo — oH, — GH = COOH H4Noc — oH, — cH,— G8 — COOH NH Ny sparging tain Aminoacisit diaminici, Lizina are ca funcfie adionatd o grupare aminic& primar’: HN — CH,— CH, — OH, — GH, — GH — COOH Ny ye Ne Arginina cuprinde o grupare guanidi derivati din guaniding, H.N— Ni I NH HN — G1 — CH, Oh GH, = CH— COOH NH NH. Arnis Proprietaitefizice ale aminoacisilor. Toft aminoacizii sunt substante solide, cu puncte de topire rdicate, mai mari de 200” si se descompun inainte de ase topi. Aminoacizi se dizolv’, intr-o miisurd mai mare sau mai mic, in api, dar sunt grew solubili in ‘solventii nepolari cc eter, clorofarm, benzen, Sunt usor slubili h solu dilate de acii si baze. Ieomeria opticé a aminoacisilor. Toti aminoaciai, cu excepfia glicocolula, posed un centru chiralic (un carbon asimetrc) care este Cyt R- oe —ccon NH,Tzoleucina si teonina au un carbon asimetrc aditional, stomul Cy. Formulele de configurajie ale enantiomerilor unui aminoacid oarecare, reprezentate in sistemul D-L. in care substanja de refering este aldehida glicerict dexirogita sunt: Goo ook Hm GaN HN G—H R R D— aminoacid L— aminoacid fin structura proteinelor nu se intlnesc dectt L-aminoacizi. Aminoacizii din se-ia D ‘apar numai ocazional, in special la unele microorganisme si totdeauna au roluri specifice. Propristile acidobazice ale aninoacizilor. Aminoaciziicuprind 0 grupare — NH, bazict $i una — COOH acid’ gi intre aceste dou funcyii poate avea loc transferul de protoné: oot coo" RacnS ee RH , wis in pr wf) Daioritt interacjiunilor electronice posibile intre cele dou funcfii invecinate, cchilibrul reacliei este deplasat aproape in totaitate spre dreapta, practic aminoacizii (monoaminomonocarboxilici), in cristale ca si in solufie, exist numai sub form’ de ‘aunfioni (ioni bipolar). Structura bipolar a aminoacizilor este susfinut& de numeroase fapte. Prin_miisuritori de distanje interatomice s-a gisit ct in gruparea carboxil, distanjele C-O sunt egale (1,26 A), ele corespund ionului carboxilat, unde are Toc conjugarea mp: De asemenea, moleculele aminoacizilor, neutre in ansamblu, au momente de dipol foarte mari, cuprind sarcini electrice mari si de semn contrar in regiuni diferite ale moleculei, {oni bipolar ai aminoaciaiior rimdn tn continuare ainfoij, ei au aft caracter acid, cf si ccaracter bazic, Functia acid actual a unui aminoacid (moncaminomonocazboxilici este ‘gruparea aminicd protonattt, — NH,*, acidul conjugat al gruptirii aminice, — NH: = NA! === NH, eH acid asa 2Funcjia bazict @ unui aminoacid este ionul carboxitat — COO™, baa conjugatt a ‘grupirit carboxil baat sad Unii aminoacizi ca: lizina, acidul glutamic, acidul aspartic, cuprind fn radicalul de Ia Cy gruptri acide sau bazice adijionale, Pentru inceput in examinarea comportanii aminoacizilor ca acizi c ‘monoaminomono- carboxilici (aminoaciz Pentru caracterizarea aciditi i zicityi aminoaczilr se folosesc exponentii de aciditatc, pK, (OK, = — log K,), Funcfia carboxil este caracterizat prin pKq-coont iar functia aminicd Drintr-an pKa.nt,*, La unit aminoaciz se adaugl oa tia masime pK, corespunzztoare funcict acide adifionale, ‘in Tabelul I se dau valorile pK ale celor 20 de aminoacizi natural Din examinarea datelor din Tabelul 14 se remarci, in primul rand, faptul c& functia — COOH este un acid mai putemic (pK » 2) tecit grupwea similar a acizilor carboxilici oarecari (pK pentru acidul acetic este 4.75). Aciditatea grupait — NH, este edusa (pK = 9-10), dar intrece towusi bazicitatea — COO™. Din aceasti cauz’, in apa puri, gruparea — NH,° doneaz% mai mulfi protoni dect accept ionul — COO Solujiile apoase ale aminoacizilor sunt slab acide, Tabel 1. ‘Valorile pK sl pl ste amineactztior ‘Amincacid PKa-coon Kano PK pl es) 1. Glicocal 7234 9.60 2 Alsnin 235 9.68 3. Valing 232 982 4 Leveing 236 9.60 5. leleucing 236 9.68 6. Fenilalaning 133 913 7. Prolin 199) 1080 8. Taipiotan 238 938 9: Sern 221 ous 10. Tyeonina 23 1043 11, Troan 230 91 10.97 12) Cisteing wn 10,78 833, 13. Metionina 228 921 14. Asparaging 202 i 15, Gluuaming 207 ais 16. Acié aspartic 208 gig2 3.86 17. Acid glatamic 21g 967 45, 18, Histiding i 317 6.00 19. Lind 218 895, 10.33 20. Arginind 217 90s | 1248 2le aid i az pe cre fe cuprinde pote reactions cu x i cu acizi, acceptind protoni. incircarea electricd a unui aminoacid dopinde de pHT-ul solufiei. Dac un aminoacid se afld ints-o solufie puternic acid (PHT = 0-1) grapirile acceptoare de protoni sunt protonate in totalitate, La titrarea acestuia cu ‘© baz tare (HO}) protonii sunt eliberafi in ordines descrescdtoare a acidilafiifunctiilor acide. Au loc reacfile: B A -i H — COOH > pi co0" NAY Ni, Jn. 11 este preven cura de ive aie, a newaii fneilor — COOH s NH sls de NOOH. ak it Layfh-cne? ref oer cooy : : / se | tL 7 é arr Moc ty: 969 7 | 7 bette : | 238 1 $88 | | | I { v0} [tsi -oHeH- coo? 7o FF 30 Eohivelenfi HO™ Fig, 11. — Curba de trare a alaninel, Din ecuafia Henderson-Hasselhalch: (Bazi) PHL DK, + og EE 2Brezultt cl la un pH egal cu pKa.coon (2.35) exist egalitaten HN — CH(CH,) — COOH - HN — SH(CH,) — COO~ iar la pH = pKa-nn,* ©.69) egalitatea: H,N — CH(CH,) — COO- = H,N— CH(CH,) — COO™ La un pH egal cu semisuma valorilor pK, sarcina neti a aminoacidului este practic nul, in solufie existind numai ionii bipolari. Acst pH este denumit izoelectric (pl). In Tabelul 14, coloana 5, sunt date valorile pl ale aminoacizilor proteinogeni. Pentry aminoacizii neutri, punctele izoelectrice sunt situate la valori de aproximativ 6, pH pain inferior pH-ului fiziologic, La pH = pI solubilitatea aminoacizilor este minim Comportarea aminoacisilor cu grupari acide si bazice adifionale. Un numir de 5 uminoacizi din cei 20 cuprind in radicalul R de ta C, grupaii acide sau bazice: acidul aspartic, acidul glutamic, lizina, arginina 3i histidina, Funcjia fenol din tirozind gi cea tioalcool din cisteint sunt acizi foarte slabi care ta pH-ul fiziologic se ionizeaza intr-o -mvisuri neglijabili, La acesti aminoacizi se.adaugd o 2onstanta pK suplimentard (Tabelul 14), Fen acid aspanic i eluamic acidatea aco fun este mai mic deci a grupului carboxilic de la C,, are 0 tirie comparahilti cu a acizilor monocarboxilici alifatici (pK = 3,86 la acid aspartic gi 4.25 la acid glutamic), nu se mai simte influenja grupirii aminice'vecine. ‘Formele acidului aspartic, in raport cu pH-ul soluiiei tn care se afl, pot fi deduse, ca si in cazul aminoacizilor neutri, prin protonare maximal’ si apoi adiugare teptatti de za: {uncfile acide vor eeda protoni in ordinea descrescitoare a tiriei lor: = om va a fe Be ae Beane te Bln ote Blane oe bee (Fy (0) oO (2) psu izoelectric al acestor aminoaci este dat de semisuma valorlo pK ale functor ‘care genereaz’ ionul fra sarcing neti. Pentru acidul aspartic si acidul glutamic, punciele lor izoelectrice sunt situate Ia valori net acide (2,97 gi, respectiv 3.2), Lizina este un aminoacid bazic cu o funoje aminict in R, Formeie lizinei in raport cu variagiile de pH ale medivlui sunt: Hy — NH Gre Na qo Gren (Ha (ps ra (hae re (Pde won EA coo CEL Gein, CER Gok ee ine ce Re (2) (+ (9) ie) pH-ul izoelectric al lizinei este situat la valorarea 10. 24Arginina are un caracter bazie net prin gruparea guanidini NH NH q +H NH-C—NH, == R W NHC —NH, {on guanidiniam Jonul guanidinium, datorits conjugal x — p poate fi scris: Histidina prezinth caracter bazic prin nucleul heterociclic al imidazolului: ve U Bazicitatea acestei grapiri este mai redust (PK = 6,00) si pl este situat la valori apropiate de pH-ul fiziologic (7,58) Din cele expuse mai inainte Teaulta ci ionizarea aminoacizilor, sarcina electric’ pe care 0 poarti fiecare dintre ef, depinde de pH-ul solu’ in care’ sunt cuprini, Dact finem seama ci in organismele vii aminoacizsi sunt cuprinsi in lanturile polipeptidice ale Brojeinelor este important de examinat comport cd acizi sau baze a restuior Aminoacide -NH — CH(R) — CO -, sarvina electrica pe care 0 poarti aceste resturi Ia PH-ul fiziologic. Resturile aspartil si glutami au in aceste condifé o sarcin& netd (-) pe cAnd resturile lizil, arginil si histidil au sarcina (+): er pe is weed Ve oe ae oe ied —NH—CH—CO—; —NH—CH—CO—; —HN—CH—CO—: —HN— cH—Co— Restul histidil este redat prin dow structuri tautomere: NA 2 i é 8 eon poe ( = | . : : 28Clasificarea aminoacicitor dupa natura radical’ de la Cy In proteine, aminoacizit sunt angaja( in legis pepiidicsprih wruparca amsinica si cea carboxil 8 I NH — CH—co— seit aminoaciaic Cvea ce diferentiaza resturite celor 20 de aminoscizi este natura radicalului de la Cy Natura interacjiunilor ce ye pot stabili inure resiurile aminoacidice depinde de incarcarea electric 1 acestor restur, de caracterul lor polar sau hidrofob, TTinindasse seama de aceste insusiri ale resturilor R de ta C, aminogetsis sunt impanfii in patra grupe aminoacizi cu R bidrofob, nepolar: izoleucina, protina, feniialanina, wiptofanut, metioninay b, aminoacizi cw R polar, dar Riri sarcin& electect: serina, teeonina, tro asparazina, glutaming si glicocolul (R= HW); i cu R inclcat (-) (a pHl-ul Tiziolegic): acidul aspartic, vinoaocizi cu R inedreat (+) (Ia pH-ul Giziologie):lizina, arginn cisteina, cidul glutaani , histidina, Reac(iile chimice rilor. Aminoacizii prezintt diverse reactii chimice Ia care participa atat funchitle amino si carboxil comune tuturor aminonciziler, cit $1 sgruparile prezente tn radicalii de la Cy. Reavtii ale gruparii COOH. Aminoacizii formeazst derivai normali ai acestei functii ester. amnide, anhidride, nitrii. Prin decarboxilare, aminoactzii formeaz’ amine. mull dint ele substanje cu propria fiziologice gi lanmacologice remarcabile (amine biogene): R—CH— COOH ——> R— CH.— NH, + CO, Nay Unele amine, produsi ai reactiei de decarboxilare a aminoacizilor, sunt aritagi mai jos: N Ty CH, — CH, — Ny HOOC — (CH,), — NH, \ H tana scd-yaminobatne (in sina) Gn kid glotanie) Gis OH — NH, HN — (CH), — NH Gre eth NH, OH SH ctanolamin cadaverina iste (Gin seri) (din Hens) Gin eising) Reactii ale grupeirtt -NH,, Prin aceasti funcjie aminoacizii dau numerouse react + condensate cu compusi carbonilici RA 7 ean? O° / Hon, SN pach Nee He COOH COOH \ buza Sch (alii, esting) HR)agent R— cHo nd, ee a cH NCH), IS i CH— NH, set cH NH— co ~ - = on / o-c N\ ° ob I 5 GH — Ne se R—GH—NH—C—OH coo ‘00H ~ oxidare: + HO R—CH—COOH ——» R—CH— COOH ———» A G—COOH I = 2 1 = NHS 1 NH. NH oO ceteacd (a or0asis) ~ inlocuirea gruparit — NH, cu — OF: + HOH a —cH— coor "> a — cH —coon | “WA, 1 NH, oH sehideox-scid Reactii ate funciitor prezente tn radicalul de la Cy Pentru functia tioaleao! din cisteind sunt caracteristice reactiile: + oxidare bland’ sé reversibild la disulfur GH, — SH GH,—S —S — CH, -2H | | 2 GH—NH, === CH—NH, CH—NH, 1 +2H | | COOH coo coo sist~ formare de stirwi cu metale grele, marcapti RSH. AgNO, ———» A— Sag + HNO, + oxidare energic’ la acid cistei: CH.SH CH, — S0,H 1 oxidare | GaN eet, coon C30H acid citeie Serina, treonina si ts rezulttin iroxi formeazA esteri, cu acidul fosforic, zina prin func genera pt 9 Post GH Ne Gx —0~ Poy, coon bun, ss its coon by —q—coor ection wm, sid rosinfostorc Gruparea — NH, de la C, al lizinei confer acestui aminoacid sau restului tizil, posibilitiyi multiple de a interacjiona cu alfi compusi. Condensarea cu funcfii carbonit este una dintre proprietijile cele mai importante ale acestui rest aminoacidic. De asemenea, prin oxidarea gruptirii C, — NH; din ling se obfine alizina: ovidare HIN CH ~ (CH) — GH — COOH —e 0 = HO — (CH)),— GH — COOH NHS NH, lina ina Gruparea carbonil nou format poate participa mai departe Ia alte reactii, 281.2 PEPTIDELE Peptidele sunt combinafii de tip amidic rezultate prin condensarea a dow’ sau mai ‘multe molecule de aminoaciz: i i i i H.N— CH — COOH + H.N— CH — COOH —» H.N— CH —CO—NH—CH— CCH —H,0 inept Peptidele pot rezulta din dou’, trei,n motecule de aminoacizi, Ceea ce raimane dint-un ‘aminoacid dupa angajarea sa in legdtura peptidicd poartt denumirea de rest (reziduu) aminoacidic. Peptidele cuprinzfind mai pufine resturi aminoacide sunt denumite oligopeptide, iar acelea cu un numr mai mare de resturi aminoacidice sunt polipeptide: i f i wo biccot Bion Eicon polipeptié Capetele molecule’ unui peptid sunt diferite, unul are grupare aminict liber, capt: N- terminal, iar cellalt are grupsrea carboxil neangajat, este capatul C-terminal. Resttrile de aminoacizi de la capetele moleculei sunt denumite resturi N-terminale si, respectiv, C-terminale, Inceputul unui peptid este capital N-terminal Denumirile peptidelor se construiesc socotindu-le derivati acitati ai restalui aminoacidie C-terminal, Se citese succesiv radical aminoacizitor incepiind cu capatal N- terminal pan la restul C-terminal, De exempla, tetrapeptidul: Geom, gion pe H.N — CH — CO— NH — CH, ~ CO —.NH— cH ~ GO — NH — GH — COOH Se citeste valil-glicil-seril-alanin, De asemenea, pentru redarea structuri unui peptid, ‘mai mic sau mai mare, se folosese prescurtirile de tei litere sau de o singurt liter& pentra aminoacizi. in acest sistem, tetrapeptidul de mai sus este redat: Val-Gly-Ser-Ala sau VCSA. Cu ajutorul acestor prescurtiti int-un spajiu restrins pot fi redate structurile unor polipeptide foarte tar Daloriti posibilitigii de legare a acelorasi aminoacizi in seevente diferite, peptidele pot prezenta fenomenul de izomerie de structur, de pozitie, Doi aminoacizi diferiti pot da nastere 1a dow dipeptide izomere dap’ cum unul sau altul ocupa pozifia N- sau C- terminal’. De exemplu, dipeptidele izomere leucil-metionin& sau_metionil-leucing. Posibilitjile de izomerie cresc foarte repede oda cu creslerea numfrului de aminoazizi. ‘Trei aminoacizi distincji A, B, C pot da nastere la 6 tripeptide izomere (peptidul cuprinde ciite un rest din fiecare aminoacid). Din patru aminoacizi 24 tetrapeptide, din cinci 120. Un cicosapeptid (cu 20 resturi) in care fiecare din cei 20 de aminoacizi este cuprins o singur datS poate exista sub forma a 2x 10" izomer. Posibilitatea legirii aminoacizilor fn secvenfe nesfirsit de numeroase sti la baza multiplicitiii gi varietijii molecutare a proteinelor. 29in organismete vi se ininese numeroase peptde (oligopeptide sau peptide mai mari) cu fanchi particulare, Unele din aceste peptide ax legtiuri peptidice atipice, cuprinzind resturi aminoacidice modificate, au structuricieice, cuprind D-aminowcizi (Tabelul 15), Tabet 15. Oligopeptide cu tune biologics Benumrea] Stacia Fura fenaion | y--u—ye ay gon edox Bradikinina | Arg—Pro— Pro Gly — Phe —Ser— Pro — Pha — Arg se MAgent ipor Jnictensina | Asp—Arg-—Vat—Tyr—to—His-— Pro —Pho tens, cegon 28 acca seororon aoe seen Hermon [rsi— An | Pro —cl— Hs — Pro— ami ean [Owtoaina | Sys — Tyre Gin— Aan — ya Prom Leo Gy anda | Rormon ° { nourhipotzar s— 8 [Vasopresina [Oys— Tyr Pho Gin—Aan— Gye =P Lou) = Sy aries [Roman neuchpotar —— a) Res Gly N-terminal este angajt in ogra poptdia prin groproa y.COOH b) Resta Gi N-arminl fmeazs amie ntond vest Pro © trminlformearé ani, :} Resturie 'oys si ys formeaza punteosulica; ras Gly C-terminal formeaza ami 1.3 PROTEINELE Protcinele au o sirueturi polipeptidict. Graniga dintre polipeptidele propriu-zise si sprotcine este arbittara. La un anumit grad de complexitate a lanjurtor polipeptidice apar nivele superioare de organizare gi calitii noi neintinite Ia polipeptidele mai mici. Proteincle, altiuri de acizii nucleici, sunt macromolecule ce exist intro varietate foarte mare. Fiecare tip de celul,fiecare individ, fiecare specie posedti un set distinct de proteins, Se esimeazi cd numarul de tipui de proteinedin intreaga lume vie este de 10"°— 10"? si potentalul de diversitate nu este epuizat. Chiar proveinele care indeplinese functii similare la specii diferite sunt entitiyi distincte, cu mase si propriety diferite. Chimia proteinelor este deosebit de complex, ea presupune, mai inti, infelegerea principiilor generale de constructie 2 moleculelor proteice, a modului in care dintr-un ‘numa Fimita de unit structurale se pot forma infinit de multe proteine gi a factorilor care intervin in realizarea organizArii lor spatiale. In al doilea rind, studiu! proteinelor 30necesith abordarea Fectirui tip de protein in parte, siabilirea pentru flecare specie rmoleculari‘a consti chimice, a arhitecturi sta functct (saw functir) pe care fe exer Structura polipeplidicd este apti st asigure proteinelor cele dow’ caractere, diversitate molecular’, pe de o parte, si specificitate de forma, pe de alti parte, Un polipeptid: bok Ro \,\7 NO NS NZ WY i | ‘cuprinde o catendi principal cu o structuri monotond in care se repet grupul de atomi - NH — CH — CO —. Varie‘atea lanjurilor este asiguratd de radicalii R fegafi la C,. Cu ajutorul celor 20 radicali diferii se pot objine combinalii multiple, deosebite prin umarul si secven{a resturilor aminoacide, Lanqurile polipeptidice, unidimensional> si flexibile, se convertesc spontan in edificii cu trei dimensiuni, cu forme caracteristice ‘peniru 0 anumita seevent de aminoacizi ‘Organizarea spatialt a fanjurilor polipeptidice are loc prin interaeyiuni necovalente — legituri de hidrogen, atracfipotare si ionice, interacliuni hidrofobe — la care participa ait grupisile “> C = 0 gi > Ni din eatena polipeptidicd, cit si diversele grupirt ccuprinse in catenele laterale ale lantului. ‘Complexitatea proteinelor a Aleut necesar% introducerea mai multor trepte de organizare structural. denumite structura primar’, sect Jterfiarli. si stmoturd uaternart, Structura primar precizeaz’ mundral i secventa resturilor aminoacidice ‘moleculf, ea redi (otalitatca legiturilor covalente din molecut’ si mai este denumi ‘sinictued Covalent) Strsctura primari corespunde formlcior structurale wanale ale anui compus organic. La moleculele simple astfel de formule definesc in acclasi timp 51 relafille spatiale dintre alomi, La proteine cu Janjuri lungi gi un num foarte mare de atomi sunt posibile numeroase conformatii (aranjamente spatiale rezultate prin rotatia liberi a atomilor sau grupuritor de a:omi in jurul legtturlor simple) si este necesara ierarhizarea nivelelor de organizare spatial’. Siructurile secundare rezullate din inferacfunile grupelor > C=O si > NH din gruptsile peptidice, sunt siructuri ondonate, periodice, ctementul structural case le gencreah previntd el insusi regulartate, Sructura terjiar’ a unui lant potipeptidic Jnalobeazd nivelul de organizare secundar la care se adaugd modal de pliere, impachetare a lantului polipeptidic determinat de interactiunile posibile intre radicalii R de la C,, interactiuni ce depind atat de natura acestor radicali cat gi de relatiile de vecindtate dintre ei. Descrierea organiz’rii spafiale a unui lant polipeptidic prin structura secundac’ gi tertiara este arbitra, cele dow’ nivele structurale se intrepatrund, impreuna ele definese conformatia specific’ a Jangului. Proteinele alcituite din mai multe lanfuri polipeptidice (proteine oligomere) cuprind ‘un nivel cuatermar de organizare, Stuctura cuaternari a unei proteine oljgomere descrie modul in care lanuile polipeptidice individuale, se asociazd, se asambleaza penitu a realiza siructura proteinei date, structura sa funcfional®. 3113.1 STRUCTURA PRIMARA A PROTEINELOR Prima proteint a clei structurl primard a fost stebiliti este insulina (Sanger, 1953), protein mic cu 51 resturi aminoacidice (Fig. 1.2). Dupat aceasta a urmat ribonucleaza Fig. 1.3) cu 124 amincacizi. Numarul proteinelor a ciror structuri primara este cunoscuts depiseste astizi ceva zeci de mii ‘Cunoasterea structurilor primare are 0 importanga deosebitd pentru infelegerca rolurilor proteinelor, ea a deschis orizonturi noi in toate stinfele biologice: ‘a. Prin studii de seevenfalizare s-a stabilit definity cf o_proteind dail are o structurt uni, nu este 0 colecjie de specii moleculare diferite (cum este cazul polimerilor de sintezi); b. Structurile._primare ale proteinelor constituie baza injlegerii la nivel molecular a_ activitatii lor biotogice; °c. Prin compararea structurilor primare a proteinelor care indeplinese functii omoloage ta organisme diferite se poate stabli gradul de varitate structural compatibil’ cu, 0 ‘anumitd funcfie gi aoeste comparatit permit urmarrea itorie? evotutive a proteinei. Dou sau mai multe proteine omoloage pot varia la nivelul structurilor lor primare, Adesea aceste deosebiri rezulti prin inlocuirea unui aminoacid dintro grup cu un cltul aparjinind aceleiasi grupe (de ex. Val cu Leu sau Ang cu Lys). Astfel de substitu sunt denumite conservative. inlocuirea unui aminoacid dintr-o anume pozijie cu altul aparjinind altei grupe (substitujie nonconservativali poate altera intr-o mare: misurl functia proteinei; 4, Secvenga aminoacizilor into protei ADN si expresia acestui mesaj: ¢. Studiile de seevenfalizare au dus la descoperirea unor specii de proteine anormale (proteine mutante) ca expresie a unor modificiri la nivelul genomuluis aceste proteine normale se pot manifesta sub forma unor boli (boli moleculare). £, Sccvenfializarea unui num’r din ce in ce mai mare de proteine a scos in eviden|& fenomenul de polimortism molecular. © protein eu o anumitt Functie, 1a 0 aceiagi specie, poate exista sub forme moleculare diferite. este vetiga intre mesajul genetic inscris in $ s* : : e Fig. L2 — Structura primaréa insulinet 32NOOK con 6) nqPooveee: 2888—,” & Fig. L3 — Structue primara a ribonucleazei 13.2. ORGANIZAREA SPATIALA A MOLECULELOR PROTEICE Fiecare proteing, fiecare lan polipeptidic are o structura tridimensional specificd care este reprodust cu fidelitate de milioane si milioane de ori in cursul viefii organismului si de-a lungul gencrajilor, Forma specifici a unei molecule proteice este determinati de structura sa primar, unicl pentru fiecare tip de proteina, Aranjamentul spatial unic pe ‘care un lan} polipeptidic 11 adoptt intr-o solutie este impus de constringeri termodina- mice, este rezultanta tuturor interactiunilor necovalente care se pot stabili in cuprnsul moteculei astfel ca nivelul siu energetic si fie minim. Aceste interactiuni necovalence de energie joasa (1-7 kcal/mol sau 4-29 kJ/mol), au energii de activare mici, se stabilese cu viteze foarte mari gi nu necesita intervengia mor catalizatori. Ble devin eficiente numai prin insumarea efectelor unui numir foarte mare de legituri ‘Legtturile necovalente care se manifesta in canal moteculelor protece, ca sila alte citegorii de biomolecule, sunt legdturle de hidrogen, legiturile polare si interafiunile hidrofobe, 33Legitura de hidrogen se manifest ca 0 valent auxiliary’ a hidrozenutui cmd acesta este legat covalent la un atom puternic electronegatir (O sau N): 8 b+ — x———— Y donor de hidrogen acceptor de hidrogon Atomul de hidrogen, polarizat pozitiv este atras de atomul electronegativ al altei molecule, Astfel, egitura de hidrogen se manifest, tn principal, cao fort electrostatic’. Punjile de hidrogen se stabilesc dupat direct privilgiate. Direcfia cea mai favorabita, cea care duce fa interacfiunea cea mai pulemiicd, corespunde colinearitiiicelor tei atomis X,H gi ¥. Totus, cdnd aceasti dispozitie nu se poate realiza sunt posibile si aranjamente nelineare ale atomilor. fn afara de api, unde fiecare moleculd este angajat’ simultan in patru legituri de hiidrogen, la dout participa ca donor gi la dowd ca acceptor de hidrogen, asociafile intermoleculare prin punfi de hidrogen se intalnese la multi alfi compusi, in stare pur sau in solufii apoase. Legiturile de hidrogen intse- sau intermoleculare intalnite la proteine si alte biomolecule sunt: e —O-H=O-H : O-H~-0«0 1 | »~ ~ Zz DH Inieracjiunile electrostatice, polare, se stabilesc inte grupai cu sarcini electrice opuse. Aceste interactiuni pot fi: ~ asociatiiinire perechi de ioni, legituri saline (de ex. inire un rest Arg gi unul Glu); ~ inferactiunea dinire o grupare cu sarcin’ + sau cu 0 grupare polar Rr sarcin - interactiuni intre grupdiri polare fs sacing. Proteinele cuprind-un numir mare de aminoacizi cu R polar, fri sarcini, si interaetiunile dinire acestia sunt un factor important pentru stabilizarea structurilor de ordin superior ale proteinelor. Totodati, in interiorul moleculei proteice, unde accesul apei este interzis, se realizeaz’ un mediu dielectric, care ‘avorizea7i interactiunite polare. Interacjiunile hidrofobe sunt acele forfe care fac ca moleculele sau grupirile nepotare i se asocieze in agregarte gi si reducd la minimum contactul lor cu apa. Acest fenomen este datorat, in primul rind,, factorilor entropici; entropia apei scade cind © moleculd nepolara vine in contact cu apa si, respectiv, entropia apei creste dact aceasta molecula este exclust din api. 34Interactiunite hidrofobe sunt factorii cei mai importanti care determina conformayi unei molecule proteice prin insumarea unui foarte mate numir de contacte nepelare. Dintre cei 20 aminoacizi proteinogeni, sapte posed R cu caracter hidrofob. unite disulfurice — $ — $ — care se pot stabi intre dowd resturi Cys, desi sunt Jegituri covalente, an un rot determinant pentru. conformafia proteinei. Realizarea unci unfi — $ — $ — necesitt aducerea a doul resturi Cys in poziii potrivte care se realizeaz’ prin forte necovalente. Fiecare specie proteici este un unicat in ceea ce priveste structura primaa si conformafia, Din studiul conformatiflor unui numer de protcine se pot formula prine pile aenerale care guverneaza organizarea spatial a tuturor moleculelor proteice. Cele dou, elemente structurale ale unei proteine, axul catenei polipeptidice gi cele 20 de tipuri de radicali legati la C, care se pot gisithtr-o muititudine de relait reciproce contribuie Ia realizarea structurii secundare si terfiare a proteinelor: R, a, | ia t —NH—CH—CO—NH—CH—Co—NH—cH—co~ Structura secundaré a proteinelor Pauling si colab.incepdnd din aml 1930 au inireprins stu sistematice, prin cristalograie, curve X, de misurarea distanfelor interatomice, a unghiurilor 6 legtturi din aminoaci, din peptide. Sa stabilt chin gruparea peptic’ are loc 0 conjugare mp legitura —NH — CO — capi un caracter paral de Iegitur dubld,rotgia bert in jurul acesteilegsturi find asfet ‘mpiedicalh. Atomii C, vor sdopta poz figide faft de planul leghturii duble, In pepridele naturale se intllneste numa configurafia trans, mai stabil decat aceea cis (Fig. 14), Fig. L4— Configuraja trans a unei legaturi pepticice 35Lanjul peptidic tsi plstreazai Mexibilitatea prin rotagia liberd in jurul legaturilor: R, oF, 1 Wo —cH—NH— gi —c—cH— (© altt insuyire a gruparit peptidice este capacitaea grupei > NH de a forma o lepnturt de hidrogen cu un grup > C=O apartirdind altei grupari peptidice: SS NoH- ono DS NSHe One Conjugarea — p a grupairit peptidice accentueaza aceast insusire {Un lant potipeptidc, in solute, ar putea atopiao iafnitae de conformatit prin rota in jurul legiturior — CHR) NE si — CHR) — CO— , Uncle din aceste conformaii vor fi mai stabile dacd permit realiarea de puni de hidrogen intr gruparile peptide. Plecdnd de ka principiul c&aranjamental cel mai stabil este acela in care se realizeazi cel mai mare numér de pungi de hidrogen, Pauling si Corey (1951) au postulat dou structur secundare pentu lnjrile poipeptiicec-elicea si structura BO structura elicoidal’, distinct de cea descrist de Pauling, este intitnita la colagen, proteina major a matricei extracelulare, care are 0 compodifie aminoacidicx particular. Siructura de elice alfa, Lanjul polipeptiic se rtsuceste (la nivelul legiturilor simple) pentru ca grupirile 0 = C <7 si SNH sit devind adiacente stereochimic pentru a forma punti de hidrogen. Se objine astfel o structuri repetitivi elicoidala ia care toate unitate se aflt in raporturi spafiale identice cu unitatile vecine, O grupare “> NH formeazt punte de hideogen cu gruparea > CO aparyindnd colui de-al patrulea rest aminoacidic din seevenfa Lineara. in acest fel, toate grupele > CO si > NH sunt unite prin pungi de hidrogen (Fig. 1.5). ‘Stercochimia gruptcii peptidice, unghiurile de leg’turi, distanfele interatomice, colinearitatea puntlor de hidrogen, apartenenga aminoaczilor la aceeasi serie optic (seria L) determina o anumit’ geomettie a alice - cu fiecare rest aminoacidie se avansea pe vericalt, eu 147 A; ~ pasul elicei, distanga intze doulk puncte echivalente pe verticala este de 5.21 A si cuprinde 3.6 resturi aminoacidice; ~ diqunetrlelice, diametnul supraeje cilindrice in care se alld atomii C,, este de 10.1 A: ~ sensul rsuciriilangului polipepiidic este de la stinga la dreapta (clice dreapt2);Fig. LS — Structura secundar de «-elice a unui lant polipeptidie (dupa Linus Pauling) - radicalii R ai tuturor aminoacizilor sunt orientati spre exteriorul elicei, configuratia atomilor C,, este aceeasi pentru tofi aminoaci = toate grupirite “> NH si >>C =O formeazA punti de hidrogen, Un lan} polipeptidic sub forma de o-etice are forma unui bastonas cu diametrul de 10,1 A. Pentru 300 resturi aminoacidice lungimea acestui bastonag este de 450 A. 37Structura c-eligoialt a lanjurilor polipeptidice pestulatt de Pauling si Corey a fost gisita, in proporfie mai mare sau mai mic, ka diverse proteine (Tabelul 1.6) Tabelul 16 Confinutul In elico-alfa al unor proteine (evaluat prin motoda dispersiei activitatt optice) Proteina % elce alfa Miogiobind 70 Insulin 98 Ovatbuming ai Serumalbumina (poving) 46 Popsina at Ribonuctoaz’i 16 Chimotripsina 16 LLungimea si repartizarea segmentelor de c-elice in cuprinsul molecule este diferité de lao protein la alta, in funcyie de distributia factorilarstabilizatori si destabilizatori at elicei in structura primari, Resturile prolil, prin geometria lor particulard, impiedici risucirea elicoidalA a lanqurilor polipeptidice. La nivetul unui rest Pro, Janjul se indoaie cu un unghi de 130°, Resturile glicil, ipsite de catena lateral, confert lanturilor polipeptidice flexibititate siadesea la nivelul resturilor Gly structora secundara o este intrerupt,Lanful schimbdndu- si uyor ditectia, Resturite de valind, izoleucin’, weonin’, prin radicalii voluminosi de la C, determina © stinjenire steric dact aceste R ajung adiacente in etice, Serina, prin capacitatea de a forma punti de hidrogen prin gruparea alcooticl destabilizeaz clicea. Resturile de cisteina cind formexza pungi disulfurice leagi covatent, rigid, porfuni ale lanqului polipeptidie gi in vecindtatea acestor regiuni rtsucirea elicoidalé nu mai poate aves lo. Structura socundard ose intGineste in diverse proporfi att fa proteine fibrilare ct si la proteine globulare. O proteint fibrilari cu siructui secundari o in proporsic de aproape 100% este keralina, proteindi abundent’ tn pr, piele, unghii, Este alestuits din lanuri polipeptidice lungi, cu structura de ccelice, asociate efile dout si superincolicite, Prin asocierea acesior dimeri se realizeazi fibrile si fibre rezistente. in aceste fibrile, anuparile R pot intecacjiona prin valenfe secundare in cele mai bune condiiuni In plus, structura superelicoidala este stabilizatd si prin punt disulfurice intercatenare, keratins ‘avnd un confinut ridicat in cist Miogtobina si hetroglobina au un procent mare (70°%) de structurd secundart ot, fn aceste eazuri, segmentele de ovelice sunt scurte, ele sunt intrerupte de porfiuni 38rneclicoidale, La nivelul acestora din urmé, lanjul polipeptidic tsi schimba directia sub diverse unghiuri, permifand realizarea unei structuri compact. ‘Un alt motiv structural fntnit la proteine cu un procent mare de structurd securdarit ‘ozconstt in asocierea paraleli a unui numer de segmente de G-elice, Acest motiv structural pulindu-se repeta de mai multe ori in cuprinsul moleculei proteice. Structura BO alts structurti secundaria lanfurilor polipeptidice in care se realisear potenfiatal maxim de legare prin punji de hidrogen a gruphrilor —>C=O $i SNH este structura B sau structura in foaie plisat. In acest caz puntile de hidrogen sant intercatenare, lanfutile polipeptidice se agea7a fn foi. Cea mai stabil interactiune se ‘obfine dact lanfurile evolueaz’ unul de ta capitul N-terminal spre cel C-terminal si celalt in sens invers (structura cu tanturi antiparalele, Fig. 1.6). — riers i, A oe" sygtye aeed = sage ggty é getty — thy yey $ bytes _ 4 ° : ° ber iy Fig. 1. — Structura secundara cu lanturipolipeptidice antiparalele 39Datoritd rigiditati legaturié peptidice gi coplanarit§ii grupalui | | — CH — NH — CO — CH — se realizeazi structuri asemiindtoare unei foi plisate. Radicalii R sunt orienta, alternativ, de 0 parte gi de ata Structura secundara in foaie plisat8 este intlnitd i proporte de aproape 100 % in proteina din matase,fibroina. Lanfurile polipeptidice antiparalele sunt intinse si asociate prin legituri de hidrogen, dand nastere unet foi plisate, Aceste foi se ageazd in straturi, inte straturi se stabilesc mumeroase legituri intre grupatile R, care proemineazt de 0 Parte si de alta afiectei foi, Datoritt une structs primare speciale, cu multe resturi Gly si Ala alternante, distanjele dintre foi sunt mici (3,5 A gi 5.7 A alternativ). Aceasta structurd confera fibroinci rezistenfl la intindere gi flexbiltae Structurite B sunt motive structurale intiite frecveat in proteine globulare. Cel mai simplu element de structurd B consti dintr-un lan} polipeptidic indoit asupra lui insusi Gare realizeaza doud segmente antiparalele, denumit B-turn ow oR ° ONS 9 PN ON i ° # ° i I N. ©. 1 oO RH wv De asemenea, mai multe catene polipeptidice, de regulA 6 dar si mai multe, pot adopta siructurdi B cu foi plisate, Domeniite structurale ale imunoglobulinelor si ale proteinelor din aceeagi superfamilie cuprind un motiv structural majoritar B. jelor Structura terfiard a prot Acest nivel de organizare inglobeazdstructura secundar gi defineste raporuriledintre segmentele de o-clice gi structura be a de f impacto a lanqului polipeptidic. Factorii determinanfi ai, structurié terjiare ai_unei (eraciunile necovalente intre_ rails Rd eC, Be caesi efi egnicu scr eer sau Bich Sunl.cupringi in segmente neorganizate. La nivelul de organizare terjiar molecula proteic’ dobaindeste forma sa specific’. 40Jntre' diversi radicali ai aminoaci necovalente: uni de hidrogen intre radicalii cu (RRIpNETACHOTTE} (ain resturi sevil, reomil), [Fenotice| (din resturi tirozil) famidicd (din resturi glutaminil gi asparaginil): jor se pot stabili_ urmatoa wele tipuri de legtturi = Jeghur ionice [STR] tne paca ow savlndnegoivl. Gin reste ii, agin, Wf infetactiuni polare inire ruicalii polar fairl sarcinis | | NH NH | | cH — cH, — coo~ HyN— (GH), — CH | | co co | | asparil tal ~ inieractiuni_hidrofobe_intre resturile aminoacizilor nepolari ca valin’, leucind, izoleucin’, fenilatanina, alanint Ni He Na | \ | chon, cH oH I i co nef I I alana valt Resturite cisteinil din multe proteine formeaza\ legituridisulfurice care Feaga covalent rogiuni mai depirtate ale lanjurilor potipeptidice. Poviiile acestor legituri depind si de {otalitatea factorilor care asiguri conformatia nativi a profeinei. Ribonucleaza (104 resturi aminoacidice) cuprinde patru pungi disulfurice intre resturile CyS-CySyu. C¥Sie-C¥Sos, CySerCySi $1 CySorCySqq. Din multitudinea de combinafii posible, intre cele 8 resturi cisteinl, in profeina nativa se realizeazd una singurt (Fig), 41Un lant polipeptidic adopts, in misura in care th permite structura sa primar’, configurajii de o-elice si de structurd B si prin pliere, impachetarea fangului cau si satisfack si afinitile radicalilor R, Rezultanta tuturor acestor interactiuni determin’ conformatia moleculei proteice. Aceasti conformatie este de fapt un compromis — nu se pot realiza toate legiturile de hidrogen posible, nu toate porfiunile nepolare ajung s& fie inconjurate de un mediu pur hidrofob, nu orice grupare (—) ajunge la vecinatatea tuneia (+), dar este compromisul cel mai favorabil din gunct de vedere energetic, cel mai stabil, Factorul ultim care determina conformafia unei proteine este structura sa primar’, Informayia geneticd tradusa in secvenfe de aminoacizi, prin jocul forfelorfizico-chimice, se transforma spontan in edificiétridimensionale spec fice. Prima protein’ a cre sructur tridimensional a fost stabil in cele mai mici detalii, precizindu-se pozijia in spajiu a tuturor atomilor component este mioglobina (Kendrew gi cola, 1957). figTabinajeste o potent abundent i muschi, in. special la. mamifeele cufund’ioare (balen’, cagalof) avind rolul de rezervor tisular de oxigen. Este 0 proteind Cuprinzind aproximativ 150 aminoacizi (mioglobina din rugchiul de casalot 153) sio grupare neproteich denumitt hem, In Fig. 17. se ara schematic conformafia moieculei de mioglobint. Fig. L7 — Stuctura teriaré a mioglobinel 42Fig. 8 — Structura tonjiara a lanquul B al hemoglabinel Jn mioglobind 75% din lanjul polpeptidic formeazs o-elice, Coprinde 8 segmente elicoidale (Genumite A, B, ... H) cuprinzand intre 7 (segmentul D) si 24 resturh aminoacidice (sezmentuLH). Regiunile elicoidale sunt separate de segmente neclicoidale, Ja nivelul cirora Jangul polipeptidic isi schimba direcgia, In patru puncte de terminare a elicelor se afl’ ‘pinlita? In celelalte regiuni intreruperca risucirii_elicoidale este determinati de alji factori, Prin aceste schimbiri ale directiei lanqului_polipeptidic, molecula devine extrem de compacts (45 x 35 x 25 A), (erin ‘numai fminoacizi cu R nepola} cu excepiia a dout restuiT Ristidil angajale in lewarea ‘gtupicii hem, Resturile teonil gi tirozil au gruparile hidroxilice orientate superficial, pe ind porfiunile nepolare ale acestor aminoacizi sunt ingropate in interior. Suprafaja externa moleculei cuprinde toate resturile polare si cu sarcin’ electric, presirate printre radicali nepolari. Conformatia lanturilor polipeptidice din hemoglobin’ este asemainitoare cu cea a mioglobinei (Perutz, 1959) (Fig.8) 43In prezent, sunt cunoscute structurile terjiare ale multcr proteine, Proteinele solubile, citoplasmatice sau acelea prezente in plasm’ sau in lich dele interstijale sunt proteine ‘elobulare care au etalate pe suprafafai gruptirle polare si pe acelea care pooart sarcini elecirice, Radicalii nepotari sunt orientafi in interiorul moleculei. Forma sferica sau elipsoidali a moleculei depinde de raportul dintre numvirul resturilor aminoacidice cu R incireat si numérul resturilor cu R hiidrofob. O valoare mai mare a raportului (0,9-1,4) favorizew24 adoptarea unei forme mai alungite. © prciein’ cu un raport numair R inchtcal/numir K hidrofob mic (0,3-0,6) adopt o form’ sfervidala, resturile nepolare, hidrofobe se acomodeaz’ mai usor in centrul unei structuri globulare decat al uneia cilindrice, La proteinele membranare inglobate tn stratul dublu lipidic, repartizarea resturilor aminoacidice polare gi nepolare este inversd. Partea exterioara a molecule, in contact cu lipidele membranare, cuprinde radicalii hidrofobi. La unele proteine, in interior molecule’ se defimiteaza canale ciptusite cu resturi aminoacidice polare si inciircate electric (canale ionice). Organizarea pe domenii a proteinetor. in anit din uni a fost descris un alt nivel intermediar de organizare structural a proteinelor, organizare domeniall sau suprastruc- tur secundart. Acest nivel de organizare este innit mai ales la proteinele mai mari. Un domeniu al unei proteine multidomeniale corespunde unei porfiuni continue tn structura primard a lantului polipeptidic care este impachetat intro entitate functional $i are o organizare proprie secundsra si terjiara. Domenie sunt separate tntre ele prin porgiunt de lan} mai putin organizat, flexibil, ceea ce asigurd posibilitatea deplasirii unui domeniy in raport cu altul (dinamica domeniilor), Retail dintre demenii sunt deosebit de variate, zoncle de contact, de interactiune pot fi mai reduse scu mai intinse, De asemenea, dimensiunile domeniilor structurale variaza intre limite largi, de ta cAteva zeci de resturi aminoacidice, la sute (cel mult 400), Organizarea domeniala a proteinelor se intiineste la multe proteine si domeniile structurale s-au dovedit a fi unitii fundamentale ale evolujei si diversifictrii proteinetor. (ea unor proteine analoage (exercith funcfi similare) sau/si omoloage (deriva dintr-un acelagi strimos) s-a g&sitcX aceste proteine cuprind unul sax mai multe domenii structurale aproape identice, Acest fapt denoti c8 odati ct prin procesul de evolutie s-a sinventat proteings apt si indeplinease& optim 0 anumiti funefie, patternul structural al acesteia a fost conservat si repetat ori de cite ori a fost necesar, Diversificarea si ‘complexificarea proteinelor s-a ftcut prin combing ale scestor motive structurale. Jn natura exist numeroase enzime, diverse ca origire gi activitate catalitic’, care utilizeazd ca substrat un nucleotid (ca NAD, FAD, AMP). Toate aceste enzime cuprind un domeniu structural de aproximativ 70 resturi aminoacitice cu o regiune specific de legare a nucleotidului, 44Proteinele care regieazi transcrierea ADN si exprimarca informaei genetice au capacittea dea se lega de ADN dublu elicoidal, In structura acestor proteine a fost recunoscutit existenta cAtorva motive structurale (femoar cu leucing, deget cu zinc, motiv oP) care prin forma si . Celetatte specii de hemoglobin’ cuprind in locul lanfurilor B, lanjuri. 8. € + Hb A, = @ B; Fiecare protomer este tegat de clte 0 grupare fem si activitatea de transport a oxigenului se manifest: numai la nivelul tetramerului Lanjul 0: cuprinde 141 resturi aminoacidice, iar cel B, 146 resturi, Structurile tefiane ale avestor lanjuri sunt similare cu ale mioglobinei, ca care are similitudini gi de compozitie aminoacidict In Fig, 19 este ariath structura cuaternara a hemoglobinei, Un lant c@ este asociat de cele dow lanjuri B prin zone de contact diferite a, B, si ct, Bs Contactete intre protomeriidentici «gio: sunt foarté reduse, Contactul eB este cel m intins in spatiu, sunt implicate 34 resturi aminoacidice si aduce in contact 110 atomi, Forfa principal de legare sunt interactiunile hidrofobe. Al doilea contact, oj B, mai restrins aduce in vecingtate 80 atomi aparjindnd fa 19 resturi aminoacidice. Datoriti acestui contact mai slab, Hemoglobina se disociaz’ in condifiuni favorable, mai inti dimeri $i apoi sunt eliberafi protomeri: 02 By S22 Of E204 28, 46Fig. 9 — Structura custernara ‘a hemoglobinel. Regiunte accidale sunt reprezentate prin cline 1.3.3, PROPRIETATI GENERALE ALE PROTEINELOR Solubititatea, Proteinele fibrilare sunt insoluble in apa, pe cand cele globulare prezinta ‘grade diferite de solubilitate, Aceasti insugire este datoratd repartizirii pe suprafafa ‘moleculelor de resturi aminoacidice cu sarini electrice gi a acelora care cuprind grup poare, Solubilitatea in api a proteinelor este puternic influenfatti de pH-ul mediului prin modificarea inctrciri electrice a proteinei, De asemenea, diverse stiruri ale metalelor ugoare — NaCl, MgCl,, Na,SO,, (NH,),S0, -, influenfeazi considerabil sotubilitatea proteinelor. La concentrafii mici ele au un efect favorabil. De exemplu, proteinele din clasa globulinelor sunt greu solubile in ap pura, ele se dizolv’ usor numai in-soluji saline diluate, La concentrafii foarte mari, strurile amintte scad solubilitatea proteinelor pnd ta precipitarea lor din solutit (salifiere). Albumainele si globulinele se deosebese dupe usuringa cu care sunt precipitate de cate sulfatul de amoniu. Globulinele precipiti cand solupile care le cuprind sunt aproximativ semisaturate in (NH,),SO,, pe cind albuminele ‘precipita Ja concentrajii mai mari de 75% saturajie, Precipitarea fracfionati a proteinelor din solujie prin adugarea treptati de (NH,),SO, este 0 metod cu largi utilizari pentru separarea proteinelor din medii biologice complexe. Proprietajile electrochimice. Proteinele sunt amfoliji macromoleculari, cuprind un ‘numair mai mare sau mai mic de gruptiri acide gi bazice, Contribusia cea mai important o.au resturile glutamil, asp arginl si histidil, Resturile aminoacidice C-terminal si N-terminal au 0 contribujie redust, cu atat mai redust cu et lanjul polipeptidic este ‘mai lung. La pH-ul fiziologic toate acesie funefii acide sau bazice sunt ionizate complet (restul histidil este ionizat aproximativ 50%), proteina apare ca un poliamfolit 47.Proprietile electrochimice ale proteinelor sunt concretizate prin pH-ul izoelectric (pl), H-ul solugiei in care proteina apare cu o sarcini electricd nul, numarul grupisilor (+) este egal cu acela al grupirilor (—) ‘Valoarea pla nei proteine depinde de compozitia sa amincacidicd, de predominenga res- turilor acide, a acelora bazice. © proteind cu pl > 7 cuprinds un exces de lizin si/sau anginina, © proteinit cu pl <7 cuprinde 0 proporie mare de aminoacizi dicarboxilici (Tabelul 18) La pH-ul izoelectric solubilitatea, mobilitatea proteinei in cdmpuri electrice este ima, La pH-uri depaiate de pl o proteind ate o incitedturd neta (+) sau (—~) y iy , 7 we we / \ coon N coor WN co0- protan a protein ia protein a me neal rel Sub formt de anioni sau cationi, proteinele migreazal in cmpuri electrice, proprietate care st la baza metodelor electroforetice de separare a proteinelor din amestecuri, Tabeiul 18. pH-utile izoetectrice (pl) ale unor proteine Proteina pl ‘Saimin 72.10 Histon’ 10,80 Serumalbumina 490 Miozina 5,20 Fibrinogen 5,50 ps Tireoglobulina 458 Uzozim 11,00 Mioglobina 699 Hemogiabina 707 Citocrom & 920 Insuling 5,35 Papsina = 1,00 Denaturarea proteinelor. Conformatiile native ale proteinelor globulare, rezultate prin impachetarea specifick a lanjurilor polipeptidice si asocierea subunitatilor in proteinele oligomere sunt extrem de fragile, ele sunt usor perturbate sub acfiunea unei multitudini de agenti care afecteaza interacfiunile: necovaiente din cuprinsul moleculei. Modificarea conformafiei native a uni proteine poartt denumirea de denaturare si agenfii care 0 provoact sunt agenti denaturanfi, Structurite de ondin superior ale unei proteine — secundara, terfiard, cuaternars — sunt asigurate de legituri necovalente de energie joast si agengit denaturangi pun in joc forte de intensitate mict care nu afecteaz’ legiturile 48covalente, In cursul denaturirii unei proteine nu sunt rupte legiturile peptidice, nu se libereazi aminoaciz, Denaturarea proteinelor este provocatt de agengi foarte dieriti: = temperatura de 50-60? denatureaz cele mai multe proteine globulare; pujine prot 4e ex. ribonucleaza, suport pentru scurt timp temperaturi de 100° fii a se denatua; = radiapile cu frecveng’ mare, ultravolete, X.Y: - pHL-urile extreme, acide saw bavice denatureaz’ majortateu proteinelor; + ureea si guanidina, tn concentrayii mari denatareaz, reversibil, majoritaea proteinelor soluble; ~ agentiitensioactivi (surfactani), ~ solventii organici. Actiunea denaturanti a ureei si guanidinei, compusi cu o capacitate foarte mare de a contracta legituri de hidrogen, demonstreazd rolul acestor interacfiuni ta slabilizarea conformafiei unei proteine. Actiunea acestor agenti este usor reversibilty dupa ‘ndepirtarea ureei sau a guanidine, legiturile de hidrogen se reconstituie in cuprinsul moleculei.proteice in acelasi numir si in accleasi pozifii ca in proteina natva, Denaturaréa proteinelor sub actiunea agentilor tensioactivi saw a solvengilor organi demonstreazat rolul interactiunilor hidrofobe in realizarea conformatiei native a anei proteine, Acizii si bazele modifica inetrcareaelectricd a unor gupir, schimba raporturile de vecinatate inte sarcinile + gi - de pe suprafaja molecule 13.4, CLASIFICAREA PROTEINELOR Sistematizarea proteinelor, compusi de 0 varietate molecular si functional’ extraordinar de mare, este deosebit de grea, orice incercare este arbitrar’ bazdindu-se pe lunele trisituri ale proteinelor gi ignordindu-le pe altel. prima impatire foarte generald a proteinelor este ace solubile gi in genere proteine intracelulare si protcine| fibrilare) insotul proteine extracelulare, cu roluri de susfinere. Un all criteriu de clasficare a proteinelor este prezenfa say absenga in molecul’ a nei grupati chimice distincte.de lanjul potipeptidic, den: mitajerupaire prosieticzy Pe aceasta bazi, proteinele sunt clasificate in{proieine” mpl alcatuite num inoactal gi ‘oiijugale,(heteroproteine),alc’tuite dinir-o protein’ (apaprok 6 grupare prosteticd. Dupti natura grupiri prostetice se deoschesc urmitoarele clase de protein in proteinefalobula .yor , de regul (POH) legat {)[Fosfoproteine} grupatea prostetic’ este constituita din/restul fost esteric la grupairi hidroxilice ale resturiloriseil,ireonil sau tirozil) Unele proteine cuprind permanent_resturi_fosioril “(de ex. caxsina}, pe cind alicle oscileaza intre forme fosforilate gi defosforilate (proteine interconvertibile). Schimbarea_ gradului de fosforilare a unei proteine, face parte dintr-un mecanism general de reglare a funcfillor proteinelor (vezi capitolele enzime, hormoni). 492 NGticaproieine| proteine ce cuprind fc de Inn{ul polipeptidic. (Proteinele din- membrana_plast aie cele ca care. captuse diverse caviti sunt bosate in restur glcidice, Un numtrredus de glucie este prezent ina in mai toate proteinele. Seipaprareinere sum asociagii inte proteine (apolipoproteine) si una sau mai muke amps elie apt. ‘Asovierle predominant necovalente sunt totusi suficfent de ttt, structurale de sing, sttitoaze. in ne (cilemnicroni, ¢ — si B— lipoprotein) uiteteiee buglichu dé \Gzomoproteineté sunt proteine cotorate din cauza grupaei prosteticepe.care o cuprin Subclasa icioproveinslag, proteine a ciror grupare prosttict este Mem! cuprinde 2! emoglobina. si mioglobing, protee_runsportue de.oxigen, citron proteine) * cli. Capi dept ge prose sce et eB) (cibolavina). Flavoproicinele funcfioneaza ca transporter deshidrogen. © aceeasi proteint! poate cuprinde mai multe tipuri de gruplri prostetice, insumind caracterele mai multor clase de proteine conjugate, fosfo- si glicoproteine, glico- si metaloproteine ete. Un alt mod de a sistematiza studiul proteinctor este acela dup funetile pe care te indeplinese, proteine enzimatice, proteine contractile, protcine hormonale, proteine de transport etc., sau dupi origine in groteine plasmatice, proteine eritrocitare, proteine hepatice etc. fn toate capitolele urmittoare ale acestei ctf, proteinele apar ca figuri centrale prin vvavietaten for structuralti gi multitadinea de funcfii pe care le indeplinesc, catalizatori, hormoni, anticompi, proteine structurale, contractile et. Metabolismul proteinelor, sintezi si degradate. este tratat in Cap. V unde se prezint& mecanismele moleculare de legare a aminoacizilor fn suecesiuni dictate de informayia 50genelici cuprinst in ADN i in Cap. IX care cuprinde caile de biosintezt ji de catabolizare a aminoacizilor. fn subcapitolul urmitor sunt prezentate cfteva grupe de proteine, care evidenyiazt relafile structurt-fanctie, 13.5, PROTEINELE PLASMATICE, Plasma cuprinde o canitate mare de proteine (-~7,5 ght 5 deo mare diversitate (Tabelal 1.9). Prima fractionare a proteinelor serice s-a Ricut prin salifiere (salting-out) cu sulat de amoniu sia dus la objinerea fractiunii globulinelor care precipita la concentra saline mai joase (in jurul valorilor de semisaturafie) si a albuminetor (precipita ta saturarea solujiei in sare). Folosindu-se metode cu putere de rezolutie din ce in ce mai mare, bazate pe diversele insusiri ale proteinelor, s-a putut individualiza in plasma un rumtir foarte mare de proteine ( > 300). Metoda curent pentru. separarea proteineior plasmatice (sau scrice) utilizcti in laboratoarele de biochimie medicala este electroforeza, Se ulilizeazd suporturi solide (hirtie, yel de agaroza, get de acetat de celuloza) gi pH-ul de Iucru este 8,6. La acest pH toate componentele proteice sunt incircate negativ gi migreaza spre anod. Pe electrofo- rogram’, dupiicolorare, proteinele apar ca benzi colorate, Prin masurarea densitijit optice a clectroforegramei, fiecare band dun maxim de absorbjie (Fig. 1.10). Prin electroforeza serului, in condigiile aminiite mai sus, se objin cinei fracfiuni: serumalbumina, c,- 04-, 8 - si y-globuline F10-—Eleceoforegrama saul urn (oH 86). Se separ crc acum: aburina, a, ‘az, Br si glabuineSerumalbumina are mobilitatea electroforetic& cea mai mare. Serumalbumina constituie © fractiune omogen’, pe cind fracfiunile globulinice, cuprinde fiecare mai multe componente individuale (Tabelul 1.9). Tabolut 19 Protoine plasmatice (tabel selectiv) Proteina Canemgial co pl The Freaiburina 20-40 B44 47 wah ‘Albumin 13500-4000 458 care Fraciunea o,: -Antiprotesza 78-200 55 4 az {antivipsina) 4,-Glicoproteing 50-150 ” ar Sz {orosamuccia) Apolipoprotein A 170-325 200 : -Fetoproteina 0,003 68 : : Fraojunea og: Haptoglobina 30-215 85 4a az eMacroglebulina 125-410 800 54 52 ‘Ceruloplasmina 20-50 160 44 4gz Frachunea 6 ‘Transterina 200-350 7 87 2 Apolipoproteina B 60-155, 000 : - Gy 10-40 208 7 : Fibrinogen 200-400 340 55 282 ics 70-150 180 : : Be-Microglobutina 0,1.0.2 118 : Fracjuneay: go 525-1650 160 paz IgA 40-300 170 : ez ght 25.310 800 : 82 Protelna reactiva © Og 120 62 Serumalowmina. Este cea mat abundenti protein’ plasmatica (3.5 — 5,5. g/dl) reprezentind jumatate din proteinemia totaki. O cantiate aproximativ egal eu cea din plasm se aff in spatiile extracelulare, Serumalbumina are masa molecular’ de 69 kD si este alcituitt dintr-un lant ppolipeptidic cu 585 resturi aminoacidice, Este o proteinai multidomenialt, Forma generat ‘4 moleculei este elipsoidald, Are pl ~ 5, la pH = 7.4, poart& un numair mare de sarcini negative, Este sintotizatt in ficat (12g) iin plasma, are un timp de injure de 15-19 zie,Prin concentrajia sa mofeculard mare, serumalbumina este componentul care rispunde de 75-80% din presiunea osmoticd @ plasmei, avand rolul de a menjine apa in compartimentul intravascular Serumalbumina are proprietaten de a lega, mai mult sau mai pafin specific, diversi componenfi plasmatici, indeplinind funetia de transportor al acestora, Serumalbumina leagd compusi hidrofobi, insotubili in api, ca bilirubina, acizi grasi liberi, vitamine liposotubite. Serumalbumina este transportor plasmatic pentru unit hormoni steroizi, penta hormoni tiroidieni, Serumalbumina leagi cationi, Ca, Cu™. De asemenca, serumalbumina este un yehicul pentru multe medicamente: aspiring, sulfonamide, penicilina etc, Imunogtobulinele. Inunoglobulinele (anticorpit) sunt proteine cu roluri de apirare {mpottiva microorganisinelor —bacteri, virusori, parazigi — care invadeaz’ organism. Sunt proieine solubile, se af majoritar in plasma si reprezint& elementele de recunoas- tere ale sistemului imun umoral. Imunoglobulinele sunt sintetizate ca un rispuns specific {a patrunderea in organism a unui microorganism sau a unui compus macromolecular (proteind, polizaharid) strdin (nonself). Agentii sirkini capabili sti dectangeze sinteza de anticorpi sunt denumigi antigene (imunogeni). Un anticorp se combind cu antigenul specific formand un complex antigen-anticorp (complex imun) care blocheazA antigenul si totodatd inifiacd procese care distrug agentul patogen, fagocitoza, activarea complemen- ‘ului (eispuns imun), Antigenele, microorganisme sau macromolecule, cuprind pe suprafata lor un mozaic de grupiri chimice, fiecare dintre acestea putdnd declansa sinteza unui anticorp specific. © grupare chimica sau un ansamblu de gruptiri care poate declanga sinteza unui anticorp se numeste determinant antigenic. La o proteind, un determinant antigenic este reclizat de céteva resturi aminoacidice. Mioglobina, 0 proteins cu aproximativ 150 resturi aminoacidice posed cinci determinanti antigenici. Numeirul determinantilor antigenici pe 0 celuli bacteriand este foarie mare, Organismul uman este capabil si recunoasca orice fel de determinant antigenic si si sintetizeze anticompi specific. Se estimeaz’ ci un adult sintetizeazd in jur de un de specii moleculare de imunogiobutine, Imunoglobulinele sunt sintetizate de plasmocite, celule care provin prin diferent.erea si proliferarea limfocitelor. Fiecare celuli si clona celulara respectiva sintetizeaza\ un singur tip de imunoglobuline, capabile si recunoasct un singur determinant antigenic. O celula bacteriand sau 0 ‘macromoleculd proteic& cuprinzind numerosi deferminanti antigenici stimuleaza diverse celule limfoide B ceea ce duce la sinteza unei populatiiheterogene de imunoglobuline, lion 33_anticompi policlonali. Prin tehnici de laborator se pot obtine clone cel fiecare molecule identice de imunoglobuline (anticorpi monoclonal Exist mai multe clase de imunoglobuline (Ig) cu fimofii si distribugitdiferite: Tg, IgD, IgE, IgG, IgM. Clasa IgG cuprinde mai multe subtipuri: (eG, ... leG.). Imunoglobulinele M (IgM) se gAsesc in principal in plasma, in concentrafii mici, sunt simtetizate ca rispuns la primul contact al organismului cu antigenul. Sunt deosebit de cficiente in activarea celulelor fagocitante gi in activarea complementului. Imunoglobalinele G (1gG) consttuie fracjiunea majori a imunoglobulinelor plasmatice (70-80%). Se gisesc, de asemenea, sin lichidele interstate, Sunt sintetizate in cantitate ‘mare Ia al doilea contact cu antigennl. Activeazti complemental si celulele fagocitare. Pot traversa placenta Imunoglobulinele A (IgA) se gisesc in concentrafii mici in plasma si in secrepiile ‘macoase din intestin, ptiman, lactimi, saliva, colostra, IgA constituie prima Tinie de apirare impottiva invaziilor cu agenti patogeni, Nu activeazti complementul. Imunoglobulinele E (gE) sunt recunoscute ca fiind responsabile de unele manifestari ale rispunsurilor alergice. Se afli fixate pe leucocite bazofile plasmatice si pe mastocitele din perefii vaselor gi dupa interactia cu antigenele celulare activate mediazd rispunsurile alergice (secre de histamin’, uncori serotonin). Imunoglobulinele D ([gD) sunt prezente in plasma in cele mai se cunoaste exact ce funcie specific’ au, are care si product ici concentrafit; nu Structura imunoglobulinelor, Diversitatea moleculsri a Tg (aproximativ 10° specti moleculare) se realizeazi in cadrul unci scheme structurale unice (Fig. 1.11), Sunt tetrameri cu formula molecular H,L,. Lanjurile H (de la heavy, grew) cuprind aproximativ 440 resturi aminoacidice (446 pentru tanguite H din IgG) si au mase de 53- 75 kD. Langurile L (de la light, usor) cuprind aproximativ 220 resturi aminoacidice (214 la IgG) gi au mase de 23 kD, Lanjurile H sunt diferite de ta 0 clas® ta alta, lanquri ka IgG, p la IgM, oF la IgA. ¢ la LQB si 6 a TgD. Langurile L, la toate clasele sunt fie langari ‘fie k. Unele imunogiobuline apar sub forma de oligcmeri ai structurii de bazs, dimeri (ig) sau pentameri (1M) (Fig.1.12). Structura generali a unei molecule de imunoglobulind este ardtat% schematic in Fig.L.11, Molecula are forma literei Y. Lanfurile L si H se asociaza incepand cu capetele lor N-terminale si formeazi brafele literei Y. Cele dow jumitiji C-terminale ale lanfurilor H_alettuiese coada moleculei. Imunogiobulinele cuprind componente oligozaharidice legate N-glicozidic. inire lanjuri gi interlany exist numeroase pinfi disulfurice,Fig, 112 - Structura pentamerica @ imunoglobulinelor M (IgM) Funcfile inunoglobulinelor. Functia principal’ a unei imunoglobuline saw antiorp (Ac) este aceea de a recunoaste si de a se combina cu antigenul sau determinantul antigenic (Ag), formand complexul Ag-Ac: Ags Ac we AgsAc © molecult tetramerics de Ig este bivalent’, cuprinde dow situsuri de legare, cu aceeasi specificitae, alcdtwite din capetele N-terminale ale lanjurilor H si L. Inferacfiunile dintre Ac si Ag sunt necovalente, interacfiuni hidrofobe, polare, pungi de hidrogen si se bazeaz pe complementaritatea chimic& si stericd dintre determinantul antigenic si situsul de legare al Ig. Acest gen de interactiune are un grad foarte inalt de specifiitale, afinityile antigenetor pentru anticorpii specfici sunt foarte mari (k pentru ‘complexele Ag-Ac au valori de 10*-10"° M) factorii determinangi ai acestor interactiuni sunt vitezele de difuziune, fiecare inialnire dintre Ag si Ac este eficace. Fixarea Ag la Ac si forimarea complexelor Ag-Ac este urmatti de evenimente care vor duce la omoriirea microorganismului invadator, Is distrugerea antigenului, Aceste funcfi 35cefectoare sunt comune pentru 0 clas’ de imunoglobuline. Complexele Ag:Ac formate de citre IgM gi IgG sunt apte sa interactioneze cu receplori de pe macrofage si neutrofile, inijiind chemotactism, fagocitoza, eliberare de mediator citotoxicitate, De asemenea, complexele Ag:Ac inijiaz’ evenimente care activeaz sistemul complementului, culminaind cu formarea unui complex litic (sau MAC, membrane attack complex) care formeazat pori in membrana celulei int si determina liza celulei. Aceste funcfii efectoare sunt localizate in segmentele N-terminale ale lanfuritor H. Organizarea multidomeniald a imunoglobulinelor, Cercetarea imunoglobulinelor cu metode din ce in ce mai perfectionate a dus la stabilitea de-analogii structurale fntre diversele porfiuni ale lanjuritor L. si H, Segmente cu lungimi de aproximativ 110 resturi aminoacidice, dout in languri L si 4 tn tanjuri H, prezintt analogii la nivelul stracturilor ‘primare si al organizarii lor secundare si terfiare, alcatuind domenii structurale. Un astfel de domeniu este alcituit din dow’ foi plisate cu languri antiparalele cu structurd B. intre foi, radicalii nepolari determina interactiuni hidrofob: putemice si o punte disulfuric’, realizeazi o legatur’ covalent interstrat, impachetareaspecifict a unui astfel de domeniu bistrat cu foi antiparalele, este intlnith si ta alte proteine (immunoglobulin fold) eceptorut celulelor 7, complexele majore de histocompatibilitate (MHC clasa I si clasa TD, coea ce pledeaztt pentru originea lor genetic& comund Fig.1.13). © moleculd de Ig este alcituiti din 12 astfel de domenii, Un domeniu dintr-un fang este asociat cu un domeniu din alt lan, astel incdt intreaga motecul& apare ca fiind alcttuiti din sase module globulare (Fig.1.14) Stulile de seevengializae ale lanjurior L si H din popalafit omogene, individuale de Ig av aritat ca segmentele 1-108 pentru lanfurile L gi 1-125 pentru lanfurile H diferé de Ja o moleculd la alta, sunt domenii variabile V, si Vy. Colelalte segmente au structuri primare aproape identice pentru fiecare clas de Ig, sunt regiuni constante C, si Cy. Regiunea constant a lanturilor L corespunde unui singur domeniu C,, Regiunea C, cuprinde trei domenii constante Cy, Cys, Cys (la IgG {In structura cuatemart a unei Ig, domeniile V, si V, formeazi situsurile de legate a antigenului, ceea ce permite, in raport cu structura yrimard a V, si V,, realizarea de centre de legare cu specificitii diferite, Variabilitaea acestor domenii nu este inst aceeasi pe toati lungimea lanfului, Lanurile L cuprind trei zone si lanfurile H patru zone cu un grad de variabilitate mai mare, zone hipervariabile. Resturile aminoacidice corespunzitoare acestor zone cipusesc niga nepolard unde este fixat determinantul antigenic, Regiunea Cy, cuprinde situsurte efectoare care mediaza funciile comune intregii clase ‘de imunoglobuline, Funcfia de activare complementului este domeniul Cy. receptorii pentru macrofage si neutrofile sunt localizati pe Cys. Organizarea structural a imunoglobulinelor arati modul in care pe o schemd structural comund sunt constituite milioane de molecle, diferte prin situsurile de legare a antigenelor. 56i D ad Oi TR GAGS Fig. L13 — ProtsneInrude stucural sl gonatio cu Imunoglobnee 1. Gomplex major de histocompatbitte casa | (MHC 1) E Gomplos majr de Hstcompattets ease (MHC I) 5 Receptor ceuleor 4p ancora in membrane calor) Fig. 14 — Stustura mulidomenial ‘nel imunogebuine Factor’ ai coagularit (fivrinogenal). Coagularea sngelui reprezintd un mecanisrs de aptirare pentru a impiedica hemoragiile, Este 0 component a hemostazei care mai implick gi alte fenomene: vasoconstricjic, activarea si aderarea trombocitelor Ia locul Jeziunii vasculare. Formarea chiagutui (trombus) are loc prin transformarea fibrinogenalui, protein plasmatict solubili, in fibrint, insolubila, care formeaz o rejea in care sunt inglobate trombocite si hematii, Coagularea este un proces care se autoregleazst, tienjindndu-se un echilibru foarte fin inte hemoragie si tromboz,La coagulare participa foarte multi componenji plasmatici saw tisulari, Uni’ dintre acesti factor! ai coagutirii sunt desemnati cu cifre romane, de ta Ela XIII (factoral VI nu exist), Acestifactori exist Tnr-o Form’ activ’ si una inactivt (II gi I,). Unii factor (XI, XI, IX, VIL, X, 1) in forma lor inactivat sunt zimogeni (proenzime) iar in cea activi sunt enzime proteolitice de inaltd specificitate, Ionii Ca indispensabili coagulirii sunt Iactorul IV. Factorii V si VII nu sunt enzime, ei participh ca fuctori auxiliari (cofactori) ‘in procesul de activare a unor componenti ai coagultri. Factorut T este fibrinogenul si factovul L, fibrina. Factorul XIII, este o encima cu actvitate transamidazic’. Factorul I], trombomodulind sau factorul tisular este produs de endoteliul vascular (Tabelul I.10), Tabelu 10 Factoril coagulérit Factor] Oenamie wzuala | FONGTIE 1 Fibrinogen Froteind plasmatioa soUbia, 4 Fibrin Fotmeaza agregate fare. 7 Provombina ‘Aativaté de un complex format dns X,, Vy, Ca hy Trembina ‘Transforms orinogent in fina, aeiveaza: Xi, Vi, Vil i Factor isular, | Factor aux la aativarea factorior XV. ‘romborroduina w oF Vv Proaccelenna | Asivat de wombing, vy Cofactor fa activareaa Ii de cdtre X,. vi Proconverina | Acllvat de li, + Ga™ vil Impreund cu Ill activeazé X la X. Vil] Factor ‘Raval de Ty, anthemofiie vit, Cofactor al actverd X de cate IX, ™ Factor Christmas | Actvat de Xi, gi Ga my Activeaza X la X, (impreund cu Vill, gi Ca), x Factor ‘Aavat pe cuprafata plachetelor de cAtre complexul Ca SwattPrower | + Vil, + 1X, (calea inrinseca) sau de catre Vil, asistat de factorul tsular(calea extinsacd x Activeaza protrombina x ‘atv do Xl, Xi, Activeara, impround ou Cat, 1X la a XIT__| Factor Hageman | Activat do kallveind Xi, Se leaga de poretole vasului lezat, Xi | Factor stabilize | Activat do trombing tor al fibre! xill, Stabitzeazé florina prin lagaturi tncrucigate 58Protrombina, factorii VIL, IX si X sunt proteine care cuprind in segmentele N- terminale resturi de acid -carboxiglutamic (Gla), Aceste resturi aminoncidice se formeazst Inur-un proces post-traducjional la care partcips ca intermediar, vitamina coo- ~ooc coo" | NZ cH, cH t 1 1CH, vik cH, 1 1 HN CH~co— —HN—CH—co— rest Giu rest Gla Proteinele cu resturi Gla au 0 mare capacitate de a Tega ionii Ca™, Initierea procesului de congulare este urmati de activarea tn cascada factorilor de coagulare, semnatul inifial fiind puternic amplificat, Exista dout cai de inijiere a acestei cascade, calea intrinsecd (aparent cu participare de factori exclusiv sanguini) si calea extrinsect, la care participa si factori de origine tisular’, Ambele cai conduc la activarea protrombinei in trombina, aceasta din wrmd transforma fibrinogenul in fibrin’. Agregatele de trombina sub actiunea factorului XIII, (activat de trombind) sunt legate incruciset $i devin insolubile (Fig.1.15). Cales intrinsecd Calea extrinseca Xe Vis 2 Factor a" vile a xa x Xe x lle ca?” Protrombing (tl) Trombihd fl) Mills Fibrinogen Fibrin Fibrin (solubita) {insolubila) Fig. 15 — Etapa finala a coaguléri sangelul 59{in cele ce wrmeggat sunt descrise unele aspecte biochirvice, moleculare, ale coaguli Fibrinogenul are un rol central tn coagulare. Este o proteina plasmatica cu masa ‘molecular’ de 340 KD. Concentrajia sa plasmatica este de 200-400 mg/dl (2-3% din proteinemia totalg). Este un hexamer alcatuit din tei tipuri de lanfuri: Aa (610 aminoacizi), BB (461 aminoacizi) si-y (411 aminoacis). Formula si molecular este (Aa BB 9). Molecula este alangiti (460 A), prezentind tei zone slobulare, dow’ periferice si una central (Fig,.16). Lanfurile BB si y cuprind oligozaharide legate N-glicozidic. Fibrinogenul cuprinde multe (17) purfi disulfurice. Segmentele N-terminale A si B din langurile Aa: si BB, fibrinopeptide, cuprind multe resturi Glu si Asp, segmental B mai cuprinde si resturi de tirozin& sulfatat 1 NH GH—on-€- 0-207 co ! Aceastt compozitie amino: ick confer fibrinopeptidelor sarcini (—), ‘Trimerul Ao. BB 7 se formeaza prin asocierea paraleli a celor tre lanjusi gi doi trimer se asociazt prin capetele lor N-terminale, fibrinopeptidele ap2irind ca proeminente ale ‘nodului central. Nodulul central are o sarcind nett negativa (-8) ca $i nodulii periferii. Repulsiile electrostatice intre moleculele de fibrinogen previn agregarea lor si proteina ‘este menginuta in solu Inigierea coagulirii determina activarea in cascada a factorilor coagultitit care culmi ‘neazai cu activarea protrombinei la trombind, Protrombina (Eactorul 1) este sintetizata in ficat. Cuprinde un lant polipeptidic cu $82 aminoacizi in segmentul N-terminal cuprinde resturi Gla, formate int-un proces dependent de prezenya vitaminei K. Fibrinogen Tombing KR Fibrinopeptice A ai B ae 2504 Fibring Fig. 16 — Schema structural a fbrinogenul ga forine ‘A S18: frinopeptidele A si B: a3: siusutle de interactune dire molecule de firins‘Sub actiunea factorului X,, 0 proteazi, sunt scindate cAteva legituri peptidice si protrombina este transformat% in trombind. In aceast transformare se pierde segmental N-terminal care cuprinde resturile Gla, Trombina este aleatuiti din dows tani polipeptidice, A(49 aminoaca’) $i B(259 aminoacizi), reunite print-o punte disulfurich. ‘Trombina are activitate proteoltict, sub actiunea ei asupra fibrinogenului sunt ‘ndepirtate Gibrinopeptidele A si B, fibrina rezultaté avand formula molecular’ (0. BY. Prin ‘ndeprtareafibrinopeptidclor, nodulal central capa sarcint +5, Totodat sunt demascare centre de legare pentru regiuni ale nodulilor periferici, Moleculele de fibrin’ se asociazt Jongitudinal gi lateral formand fibre cu o periodicitate de 230 A, jumdtate din lungimea unei molecule de fibrin. FigJ.16) ‘Agregatele de fibrin& formate numai prin interactiuni necovalente sunt fragile (chiag rmoale). Asupra acestora acfioneaz’ factoral XIII, factor stabilizator al fibrinei, encima cu actvitate transamidazicd, leaga incrucisatrestur lizil si ghutaminil: NH Ne | 1 xi, GA (OHM + HCOOH) GH NA, 60 60. 1 1 \ \ * * a Go go ‘Aceste legtitur interlanjuri fac ca polimerii de fibring st devind insolubili si rezstrt jin rejeana de fibrin’ se incorporeact trombocite gi hematii diind nagtere chiagulul. Coagularea este un proces rapid care trebuie si réimdn& localizat ta locul teziunii vasculare si chiagul urmeazi st fie distrus, dizolvat cat mai rapid (fibrinoliza). Pe lingé diluarea in torentul circulator a factorilor activi ai coagulirii, captarea selectiva si catabolizarea lor hepatic’, plasma cuprinde componenfi care intervin prompt pentru a ‘topa procesul. Actiunea trombinei este ‘intrerupti: prin intermediul unei proteine plasmatice (prezenti in fracfiunea electroforetick 0), denumit& antitrombina, care se combina stoichiometric cu ombina si fi anuleazs actvitatea proteolitick. De asemenca, ,-macroglobulina are 0 aefiune similar’. Un alt mecanism de intrerupere a cascadei coagulrii cuprinde protcina plasmaticd, Proteina C, care intervine prin inhibarea factorilor IX, si X,- Proteina C este activatt de trombin’ in asociagie cu o glicoprotein din endoteliul vascular, trombomodulina aFibrinoliza. Plasina cuprinds si componentii necesari dezagregisii si dizolvirii chiagului, Acestia rimdn inactivi pana cind se impure intrarea lor in actiune, Etapa final a fibrinolize’ este catalizatt de plasmin’, enzima proteolitics, care transform fibrina in fragmente solubile. Plasina provine dintr-un precursor plasmatic inactiv, plasminogen, care este incorporat in refeaua de fibrind, El este activat de 0 proteazs eliberatt de endotetiul vascular, factorul tisular activator al plasminogenului, 1.3.6, HEMOPROTEINELE, Acest grup de proteine conjugate cuprinde mioglobina si hemoglobina, transportori de oxigen, citocromii, transportori de electroni, membri ai lanfului respirator mitocondrial si ai accluia situat in reticulul endoplasmic hepatic, diverse oxidaze si peroxidaze. Gruparea prosteticd a acestor proteine este hemul, Varietatea hemoproteinelor rezulti prin unele diferenge in structura hemului sau pentru aceiasi grupare hem pot rezulta ‘entittji distincte in raport cu natura apoproteinei si a wodului de asociere cu hemul, Hemoglobina (Hb) si mioglobina (Mb) cuprind aceeasi grupare hem, alcatuitt din protoporfirina si Fe". Porfirinele sunt compusi cu o structura macrociclie&, tetrapirolic’, {in procesul de biosintezd a hemului apar ca intermediari naturali uroporfirina, coproporfi rina si protoporfirina, Fiecare din aceste porfirine deriva dints-un precursor porfirinogenic. Nucleele fundamentale macrociclice ale porfirinogenilor si ale porfirinelor sist: porfinogenul si porfina. oe ; [= =< | Le < |] Lar Lal LI | | Portinogen Portina Porfirinogenii si porfrinele poart in pozifile 1-8 umatorii substituenyi uroporfirinogenul si uroporfirina: 1,3,5,8 -grupari_ = — CH, — COOH 2.4.6.7 — CH, — CH, — COOH coproporfirinogenul gi coproporfirina 1,8,5,8 -grupai = CH, 2.4,6,7, — CH, — cH, — cooprotoporfirinogenul si protoporfirina: 4,3,6,8 -gruparl = —CH,(M) 24 . — CH= CH, (vin, V) 67 — CH, — CH, — COOH (P) Formula protoporfirinei este: Porfirinele cuprind © stucturt macrocielick foarte stabil cu caracter aromatic. Delocalizarea electronilor determin’ agezarea tuturor atomilortntr-un singur plan, Atom de hidrogen din macrocicha sunt eliberaji ca protoni, sarcinile — sunt delocalizatc. Protoporfirina (spre deosebire de uroporfirin’ si de coproporfirind) are proprietatea de 1 Tega cootdinativ un ion de Fe" formind hemul, Fonul de fer are capacitatea dea coordina 6 liganzi (are cifre de coordinatie 6), Asocierea Fe™ la protoporfiring se face prin cei patru aiomi de azot ai porfirinei gi alfi doi liganzi extemni, de regul’ furnizait de supa din protein’: Mioglobina este 0 hemoproteint care funcjioneazi ca transportor tisular de O;, prin legarea reversibild a dioxigenului Mb +O, = Mb,Partea proteied, globina, este alettuiti dintr-un singur kanj polipeptidie (cu 153 resturi_aminoscidice) impachetat intr-o globuki compact. Cuprinde © grupare hem fixati intr-un buzunar, ciptusit cu resturi aminoncidice hidrofobe. Legarea hemului la slobing este diferits dupa starea sa oxigenati sau deoxigenati, tn forma deoxigena- 1, ligandul extem X este reprezentat de_un rest His din langul polipeptidic His proximal) si pozitia Y de coordinare a Fe este vacastit, In forma oxigenati, pozijia Y este ooupati de dioxigen, care la randul lui contracteazi o a doua legaturi ccoordinativa slaba cu un alt rest His (His distal): Ms proxind/, | M3 sto. Acest gen de asociere dintre hem si protein’ face posibili oxigenarea reversibila a mioglobinei, fri modificarea valenei ferulu. Hemoglobina este o proteind tetrameric’, forma principal din singele adultului are formula moleculara 0,8,. Fiecare lan a sfB este asocint cu cite o grupare hem, Locurile de legare a hemului Sunt situate I nivelul contactelor cc /. Asocierea dintre hem si fiecare lang protomeric se face in. mod similar cu asocierea hemlui la mioglobind. Resturile His proximal sunt 87 csi 93 B iar restrle His distal sunt 58 csi 3 Oxigenarea reversibilii a hemoglobinei este descrist printr-un sir de react oO O, o Oy Hb si HOO, =E Ho(O), =E Hb(O,), = Hb(O.). Oxigenarea maximal a hemoglobinei corespunde fixisi a patru molecule de dioxigen, Cinetica oxigentirii hemoglobinei este diferitt de cea a mioglobinei, structura ‘cuatemari permite functionarea unor mecanisme foarte eliciente de reghare (vezi Cap.ID, ‘Totodat, hemogiobina, pe ing transport de oxigen are si funcyia de wansportor de protoni si de dioxid de carbon. Citocromii sunt hemoproteine care transport electroni, prin schimbares reversibill a valenjei feruluiz cite Se cit Fe* eFig. L17 — Hemul citocromulul & Citoctomii mitocondriali (a, a), b, ¢, c) acfioneat secvential, electronié tree de Ia ‘un component la altul, in final find acceptagi de dioxigen: 4c Fe +0, —__. 4a Fe + 20% 20% + AH 21.0 Citocromul c, cel mai bine studiat, cuprinde un lant polipeptidic cu 104 resturi aminoacidice si 0 grupare hem, Asocierea dintre hem si proteina este diferitt de cea {nnd Ia hemoglobind sau mioglobin’. Ligandul X este reprezentat de. un rest His (48) si pozitia Y este permanent ocupatti cu un rest Met (80). Gruparile vinil sunt legate covalent la resturile Cys (Fig. 1.17). 1.3.7, FIBRONECTINELE Fibronectinele alcttuiesc o familie de proteine extracelulare adezive. Ele au roluri :majore in interacjiunile dinue celule gi membrane bazale saw dintre diversi componengi ‘ai matricei extracelulare gi celule. Aceste procese sunt cruciale pentru determinarea caracterului migrator sau stafionar a] celulelor. Fibronectinele au roluri importante in embriogence’, in menginerea integriitii fesuturilor, in hemostaz, determina migrarea celulelor canceroase. Fibronectinele sunt proteine dimerice, protomerii A si B au mase de aproximativ 250 KD si ‘prezint& o inaltt omologie structural. in dimer capetele C-terminale ale lanjurilor A si B ‘sunt reunite prin dou punti disulfurice (Fig.1.18). Dimerul este 0 molecult alurgita (600 A/25 A). Protomerii A si B sunt organizaji in mai multe domenii structurale, fiecare domeniu fiind caracterizat prin capacitatea sa distinct de a se lega la alli componenti.\ BMC 7 s / Fig.148 » Stuctura multidomenlala a floronectinel plasmatice entra fibronectina au fost descrise mai multe izoforme (12), specificare genetic. dinire acestea este fibronectina din plasma, Aceasta este sintelizald in ficat, jesut in care mu se mai exprimit nici o alt gend a fibronectinei. Alte izoforme ale fibronec- tinei sunt sintetizate de diverse ale tipuri celulare. Cea produst de fibroblasti este prinue cca mai malt studiatd si mai bine cunoscutl fibroncctind, Fibronectinele dup’ sinter’ intracelulard sunt secretate in matricea extracclulars locala unde funchiones: 2, Toate esuturile cuprind fibronectin, Fibronectinele au capacitatea de a stabililegtturi cw alle profeine, astfel se realizenaat © ofea de interactiuni care conecteaz’ proteine extacelukue (colagen, faminin’, vitronectina) 5% mucopolizaharide (proteoglicani) cu receptor! membrana Gintezrine) gi cu proteine intracclulare care aletuiese citoscheketul (actin, ecactinin’, vinculin’), © molecuki de fibronectin’ posed’ mai multe domenii structarale prin intermediul efrora inieractioneazi cu componenfii enumerati mai sus. Aw fost identificate domeniile de Jegare la colagen, heparin, fibrin?, actin ca gi domeniul de interactiune eu 0 celuki Inferactiunea dine fibronectin (Gbroncctina plasmic si celule are loc prin intermedi unui domenia de aproximatiy 75 KD sitwat in jumaiatea C-terminal a lanjuitor A gt B Situsul de legare specific cuprinde secvenja Arg —- Gly -—- Asp — Ser (RGDS), Peptide mici de sintez care cuprind acest segment sunt apte 8 adere pe supafaa celulctor. Receplorul celular pentru fibronecting, care recimaagte seevenja RGDS, a fost identifica in toate tipurile de celule. Acost receptor face parte dini-0 familie de Feceptori care recumose si imteracfioneaz’ cu diverse. proteine adezive, familia. integrinelor Integrina specifics pentru fibronectin este o glicoproteind, un heterodimer ot. Tntegrina din plachete (slicoproteina Tl, — Il) este distinct de cea a altor celule Integrina plachetclor, pe Ling’ fibronectin, inteFactioneuz8 si cu fibrinogen, fibrin’, cu factorul von Willebrand Fibronectina plasmaticl’ are un rol deosebit in fortarea cheagului, prin legare de fibring, fibronectina este incorporati in cheag. Prin multifuncjionalitatea sa fibvonectina ‘sigur ancorarea cheagului la celule si pe matricea structural a pereilor vaselor.Cap. I, ENZIMELE 1.1. INTRODUCERE Numérul reacfiilor cunoscute care au loc in organismele vii este de ordinul miilor; cu rire excepfil, aceste reaefii sunt catatiza {in anul 1877 cttalizaiorilor rectitor din_orga “ti s-a atribuit numele de sencime in drojdie); aveastt denumire, alituri de aceea de xt Utilizeaza gi in prezent, Denumirea mai vecke a fost aceca de ,fermenti* (legatt si en de procesole fermentative): pentru enzime individuale s-au utilizat demumiri specifice, ca cde exemphu, .diastaza” (in prezent - amilaza). Locul de, acfiune al celor mai multe enzime este in interiorul celulelor; unecte yalizatori", se aiclioneaz’ inst gi in awa acestora (de exemplu, © serie de enzime din plasma sangaind intre care si cele care asiguri coagularea). Toate enzimele specifice unui tip de cclule ‘sunt sinietizate chiar de acele celule; enzimele care actioneaz’ th at sintetizate doar de anumite tipusi de cetule (hepatice, renale etc.) Enzimele au toate insusirile catalizatorilor utilizati in reacille chimice din tumea nevie, Ele sunt insti superioare acestor catafizatori ia mai multe privinte: 8) Asigurh reucjitlor chimice pe care le catalizeaz’ viteze cu cdteva ondine de prime in plus ) Reacfiile pe celulelor sunt 21 au toc in condi blinde: temperaturk sub 59°C. presiune atmosferied, pH in jurul lui 7: exist, evident, si unele excepfii. Comparativ ccatalizatorii chimict acfioncazdi Ia temperaturi ridicate, presiuni mari gi valori extreme de pit: ©) Au speciticitate fosne mare ceea ce asigur ca in reactille pe care le catabizeacd sh nu se formeze produsi secundar. ‘Multe enzime au Tosusiri neint@nite ka catalizatori chimiei, Foarte importante sunt: 4) Capacitatea de regive a producerii lor in celule si/sau de reglare a activitaii ) Posibilitatea catalizicii unor reactii endergonice prin cuplarea acestora ot react 4 capitolul .Energetica biochimica"). Isioria enzimologiei se intinde pe doul sute de ani, Matile descoperirirealizate pana a mijlocul secolului nosiru au fost rodul gandirii si experientelor individuale ale unor chimigii organivieni, fiziologi, microbiologi, captivati de acest domeniu: Gay-Lussac, Licbig, Berzelius, Kahne, Emil Fischer, Pasteur si alfii, Tolusi, ca gi in multe alte domenii ale biochimiei, abia in ultima jumétate a secolului nostra, prin cercetiti efectuate de grupuri ultraspecializate si cu mijloace telnice din ce in ce mai perfectionate, are le atalizea exergonive (v 6s-a putut ajunge la 0 infelegere profundy a naturii si functionarit enzimetor. Cunostingele de enzimologie sunt extrem de utile in prezent pentru interpretarea multor fenomene din biologia celulard, genetic si alte stinge biologice. Ingineria genetical se bazeazsi aproape exclusiv pe actiunite specifice ale unor enzime. Din punct de vedere medical, enzimologia contribuie astiei in misura hotiratoare la cunoasterea cauztlor a numeroase boli, diagnosticul si urmarirea evolutiei acestora, elaborarea pe baze stinfifice a medicamentelor si multe altel, 1.2. SCADEREA DE CATRE ENZIME A ENERGIEI DE ACTIVARE A REACTILOR. CAPACITATEA CATALITICA A ENZIMELOR Toate reacfite chimice sunt insogite de variagii ale energiei. in reacjile care au loc tn Jumea nevie, variatile de energie se urmtirese in rod curent prin varistia caitdurii (entalpiei); dup cum ele elibereazt sau absorb cildura sunt ,exoterme” respectiv vendoterme. Dac reacfiile an loc in condifii de temperaturi si presiune constanta, pparametrul termodinamic urmirit este altul, respectiv variafia energici libere, notati AG. {n cazul reacfilor care au loc in organismele vii superioare, la care cei doi parametri sunt constangi, se urmireste, de asemenea, variatia energiei interne, Dac AG in cursul este negativa (ceea ce corespunde eliberiirii de energie), reactia este ,exergoni- cit invers, reactia este ,endergonica". in cazul reactiilor exergonice, care constituie obiecul discufiei ce urmezdt, energia ‘medie a moleculelor reactangilor este mai mare decat energia medie a produsilor de reacfie, Deoarece produsii de reactie sunt mai stabi decd reactant, s-ar putea crede cit reactiile in care se elibereazi energie sunt si spontane, Totusi, cu foarte rare exceptii, desfigurarea acestor reacfii este condiionatt de fumicarea unei anumite canitagi de energie; abia dupa ce au fost ,amorsate” ele devin eliberatoare de energie. De exemplu, oxidarea glucozei cu O, este o reacfie in care se elibereaz’ energie; totusi glucoza rezisti contactului permanent cu acest element luni de zile, chiar si ani, dactt reactia nu este declangatt prin furnizarea unei cantitagi de energie Energia funizatt reactiet are rolul de a mari numirul de ciocniri intre reactant, inclusiv a celor eficace: este vorba de ciocniri din care rezult& .complexe de tranzitie™ stiti prin intermedi! clirora au Joc transformarile substratelor in produsi de reactie, ‘Aceastl energie este cunoscuti sub numele de energie de activare™ gi este definitt ca energia necesari pentru ca toate moleculele dintr-un mot de reactant st ating’ starea de tranzitie". Ea se exprima, evident, in Ki/mol sau Keal/ml si este specifica fiecdrei react 8in taborator sau industie, energia de activare necesar’ reacfiilor este furmizatt sub forma de chlduri. Imposibilitatea ca reactile chimice din organismele vii 8 fie influengate de cildurt este compensati de citre enzime, care, asemandtor tuturor caaizatorilor, scad energia de activare, Cu edt un catalizator scade mai mult energin de wtivare a reacfiei pe care 0 catalizeaz’t cu tit el este mai eficace adict asigur’ 0 vitezt mai mare acelei reacti Enzimete scad foarte mult energia de activare in raport cu catalizatorii chimici, Reactia de descompunere a apei oxigenate poate servi ca exemplu in acest sens: 2H,0, ——> 2H,0+0, in absenta catalizatorilor energia de activare are valoarea de 18 Keal/mol; ea este de 11.7 Keal/mol in prezenja catalizatorului de platina coloidala si de numai 2 Kealfmot in prezenja catalazei, enzima cu specificitate absolut pentru aceastreactie (Fig. 1.1). Aga se explicd capacitatea catalitich deosebit de mare a catalazeit o singurti molecul din aceasti enzim’s descompune 5 x 10* molecule de ap’ oxigenati intr-un minut, in conditii optime, Existd gi enzime care asigura viteze de reactie de ordinul 10" - 1¢'* in raport cu reactiile corespunaatoare necatalizate, Scaiderea de citre catalizatori a energie’ de activare este consecinga cursului diferit pe care acestia Ml imprima reactiei. Se stie cf orice reactie catalizati decurge 3i in absenja catalizatorului’ dar cu vitez’ foarte mict. in acest caz substratul (S) se transforma direct in produs de reactie (P). ‘S 8 4 E % | Wares. ariatia energiei S fila libere th reactie~ § S . NS = == Sherea tinalé Destosurares regeiies ——~ Fig. ll. Energia de activare pentru descompunerea apel oxigenate: 2a) f8r& catalizator; b) In prezenta Pt colcidale; c) In prezenta catalzal, 0id este prezent catalizatoru, in cazul reactilor Jin Tumea vie enzima (E), inte aceasta gi substrat se formeazat un complex ES din care apoi rezulta P si se reface E: E+S == ES——» E+P {In conformitate cu cele afimate mai tnainle, energia de activare pentru transformarea Jui $ din ES in P este mult mai mica decat la transformarea directa a lui $ in P. Jn Fig. TLL, este reprezentat si faptot c& intro recctie exergonicd declansat® prin fumizarea energici de activare, se elibereaz’ o cantiate de energie care este suma cnergii de activare + varajia energie tibere specific (diferenfa inte energia medie a reaclantilor sia produsitor Desigar cli in organismele vii, akituri de, reacfile exergonice, au loc numeroase reactii endergonice, Ele sunt posible prin fapinl ch existh enaime specializate, care, pe lang seiderea energie de activare, sigur’ i ransenal energiei tibere necesire de ka rect exeryonie. Destagurare acesor reef este prezentat in capitol ,.Energetica biochimicd 11.3. SPECIFICITATEA ED 'ZIMELOR Inalta specificitate este una dintre caracteristicile fundamentale ale enzimelor Consecinge ale acestei specifictagi deosebite sunt att evitarea formarii de produsi secundari in reaefi, ct si, pe un plan mai general, existenja insigi a editor metabolice (Gn sensul ca succesiunea reactiitor, de exemplu intrun compartiment celular, este impusi de enzimcie existente). Modalitiile de manifestare ale specificitit sunt diverse. Se pot considera totusi tei variante de baz: specificitatea de reacjie, specitictaten de substrat si specicificitatea stereochimi 13.1 SPECIFICITATE DE REACTIE Specificitatea de reactie consti in aceca ef flecare enzimi catalizeazA numai un singur tip particular de reactie (excepliile sunt foarte rare. Tipul particular se ineadreazt {in unul din cele yase tipuri fundamentate de reactit care su loc in lumea vie: oxidoreduce- fe, hidroliza, formare (scindare) de legtturi covatente, izomerizare, formare de legituri covalenie utilizind energia eliberath prin scindarea unor legituri macroergice. Se va vedeu mai departe in acest capitol cd in sistemul actual de clasficare sunt sase clase de ‘enzime, corespunzMor celor sase tipuri fundamentale de reac Ca exemplu de tipuri particulars de reacfi pot fi considerate: ~ hidroliza proteinelor in prezenta proteazctor: ~ fosforlir ale unor compu diversi cu acid fosforie provenit din ATP, is kinazelor: prezenta 70« schimburi de gruplri amino contra gruptti carbonil intre aminoacizi gi cotoseizi, catalizate de transaminaze. © consecin a spocificitii de subset exe cea cl un anumit compe cae peu f transforma fn mai mull produsi de reacfie, nocestl entra ficare transformare o envinatt specifics se ‘exemplifict prin reacfle pe care le suferi bs organism glucazo-6-fosftal (G-6-P): glucozo-6-fostatizomeraza glucozo-¢-fostat — fructozo-6-ostal fostoglucomutaza glucozo-¢-fostat = giucoz0-1-fostat glucozo-6-fostatdehidrogenaza ne glucozo-6-fostat acid-6-fostogluconic glucoze-6-fostataza S——m — glucoza + acid fo- toric gkicoz0-6-fostat + Ho 113.2 SPECIFICITATE DE SUBSTRAT aria mai rest Aceasta consti in mali larg de actiune a fiecitei encinre cu ‘0 anumiti specificitate de reacgie, Ea poate fi + absolut, dacd enzima catalizeaz wn anumit tip de reacfie Ta un singur substrat; = de grup, dact enzima catatizeazti acelasi tip de reactic la douk sau Ia un nanir restrins de substrate; = specificitate larg, dact enzima catalizearat acelasi tip de reactie Ja un namie foarte mare de substrate. Dou’ dintre enzimele cn specificitate absolut sunt anhidraza earbonick gi ure anhidraza carbonic’, 60,4 1,0 E4P Jn prevent, exist numeroase. doveri experimentale, decte sau indirecle, privitoare ta formarea complextlui BS, intr-un numiy redus de cazuri enzima este legati de substrat prin Jeatturi putemice (covalente); asfel de complexe ES siabile au fost izolate gi analizate prin difratia razelor X alte metoe. Complexele in care legtturie dine E. gi S sunt slabe Sau studiat pe ei indirecte: saturn enzima cu substrata s-au objinut modifica in spectrul de absorb, soluhiltate, stabilitate termi etc, Mai now, formuea complexclor BS este sudia\ 8prin metoda marenjului chim ea const in tratarea enzimeor ola cu compusichimic. care reactioncaz’ fn mod specific eu anumite grup (apart unr resturiamsnoacide) lt care se atageuzk prin Lewin putemice (care un se seindez% la hidvoliza enzimel). Dact erzima mascatd nu mai fixeaz $ inseamn’ c& aminoacid {a cares att compusul cin implica in formarea complexului BS, Acest aminoacid poate fi ecunescut dact se hid enaita, in hidrolizat sping si compexul aminoacid ~ compusalchimic. (© observasie important in legiturs cu formarea complexului encimi substrat este 4 Ta anumite enzime indepartarea prin proteoliz a unor portuni din-macromolecutele lor nu afecteazd (sau afecteaz in mict meisuri) activitaten. Aceste dave experimeniale corelate cu ncvea cde regu, substraleste foarte mic‘n rt port cu enzima, au permis formulares conclurei && numai o zond restzinsi din enzim? pa ‘ici la Fxares si transformarea chimich a Ini S; aveastt ond se numeste central ectiv™ 4 enzime. Tot din studi experimental a reat 8 o enim dispane de un Singur cent activ, In centrele active ale enzimelor s-au evidenfiat grupiiri chimice de tip carboxil, arnino, hidroxil i tio: acestea apaitin unor resturi de aminoacizi cu caracter avid sau bazic (glutamic, aspartic, serina, sfozina,cisteina etc), dar si hetrocici, im special al histidine’. Gruparite sy resturte heterocielice apartin de regal unor aminoaciza indeparte( in secvenga (struct primari) a protenel- encima, De exemplu in centr ati al chimotnpsi- pei s-a iantificat sruparea OFT a serine in posijia 195, grupavea carboil a acidulak aspartic 1n pociia 102 si nucleul imidazotic al histidine! in pozija 57. Grapirile acestea sunt karte propia in spay ca usmnare a conformal) spociice a chimotripsinet (Fig. 11.3). Sunt ined polemici in Lega cw ventral activ al envimelor rezultate din generali- zaea unor cavasi paticulare; unit consider’ ch acesta este aledtut dintr-un ,centru de Jegare" si separat.dinty-un «centru cataitic". Alf susfin cB este mai corect considere ef n centeul activ umele grupari sunt implicate in tegarea substratuui, altele uusiguta cataliza propriu-zisd, cle fiind intescalate. In cazut onzimetor heteroprowice. cofactoriéreprezentati de grup prostetice fac parte din central activ: coenzimete ston metalict au povitionare care fe asiguri conluerarea cu central activ. 1H (A) — WH, (8) 1 1 Ser 195 dgr cooH (8) Fig, 1.3. Structura tertiard a chimotripsinel: se evidentiaza resturle Ser-195 si His-57 ‘care Impreuna cu Asp-102 (dispus in apropiere) se atla In cerirul activ 9In Jegituri cu organizarea spatial a centrului activ al enzimelor ¢raportaté. la structura substratulai) s-au elaborat dou’ modele: = Modelul clasic (Emil Fischer) consideri c& potrivirea substratului cu centrul activ al enzimei este analoagi cu potrivirea ,lacit-cheie“. Acest model presupune o rigiditate a structurii enzimei in zona centrului activ ig. 1.4), ~ Modeiul Koshland, numit ,centul activ indus", presupune o flexibilitate a zonei in care aceasta se afl, fn enzima libera central activ este .preformat ceea ce inseamnd cl el are © configuratic spafialt sor diferti de cea necesa! fixtriisubstratului, Substratul induce 0 ‘modificare conformational a zonei centrului activ realizindu-se configuratia optim’ fix 4n Fig, ILS. se red’ una inte reprezentivile simplificate ale modelului Koshland. ‘In cazul unor enzime, formarea complexulii ES in varianta Koshland a fost demonstrat experimental Pe de alti pate, din punet de vedere termadinamic agezarea cea mai potrivith 4 substratulu in raportcu enzima reduce la minimum gradele de liberate in ceea ce priveste ‘ranstatia si rotaia substratului, element ce favorizeaz aingerea uscart a stiri de tranzitie; aceasta este interpretarea datt sciderii energiei de activare in reactile cataizate. de enzime, Specifcitatea stereochimict si mai ales inhibiia competiiva a enzimelor pot fi explicate cu usuringl pe taza modelutui Koshland, Desigur cf fiecare enzima prezint o siructura specifich a centrului activ (cu stirile »preformatt* gi ,indust'). Aceasta nu exclude existenja unor analogit in structurile cenirelor active, cel putin pentru enzime cu funcfie apropiatt. Astfel 0 serie de enzime protcolitice au in centrul activ un rest de serin’; mai mult, in vecinitatea restului de serind variafia resturilor aminoacide este foarte redust (Fig. 11.6). enzima substrat enzima- substrat Aeon Pts Motel cont enzima substrat enzima- substrat Trpsind +Gin-Asp - Gly (Se- Gly - Gly - Pro ~ Chimotripsina :-Mot-Gly - Asp (SB) Gly - Gly - Pro - Trombing Giu- Gly - Asp -[Ser]- Gly - Gly - Pro - Fig, 1.6, Secvenja aminoacizlor In zona centrului activ ‘al unor enzime protealtice asta spropiata 80Fig. IL7. Mecanismet propus pentru scindarea hidroitica catalizaté da chimotrpsina a logaturlor poptidice (detail in tox} Existenja acestor omologii pledeazA pentru faptul ci, cel putin in lini mari, scindarile proteotitice sunt asemanatoare ca mecanism:; situagia este de asteptat s% se ‘intdlneasc& gi pentru alte tipuri de reactii catalizate. ltd constatare reznlta% din studial centrulti activ al multor enzime este c& acesta se aflt in .cavititi" sau ,sanfuri* (crevase); polaritatea redusa sau chiar lipsa polaritii din aceste zone favorizeazit fixarea substratelor. CCunoasterea grupirilor functionale gi a altor detalii structurale ale central activ al tunor enzime a oferit si posibilitatea formulirii unor mecanisme de reactie. in cazul chimotripsinei Fig. 1.7), se presupune ci in lipsa substratului imidazolul restului His-57 interactioneazi prin legtturi de H eu unul dintre atomii de oxigen ai gruparii COOH st& Asp-102 si cu H al grupanii OH a Ser-193. Cand substratul este fixat in eavitatea in care se afld central acti (gi a cirui povifionare este realizath prin diverse interaefi) bidrogenul de la gruparea OH a serinei este transferat ca proton pe azotul restului imidazol; el formeazi acum o legiturd de hidrogen cu azotul gruptsii peptidice a substratului in timp ce O~ a restului de serind atack weleofil atomul de C al grupaci Peptidice a substratului. Prin aceste rearaniri se induc: scindarea heterotic’ a leghturi peptidice: intr-o fax intermediar’, gruparea carbonil a aceste legtturi (cu restul proteic de care este atagatt) se leagt covalent cu serina in timp ce gruparea NHL (de asemenea cu restul si proteic de care este atasata) formeazi legttura de hidrogen cu atomit de ‘azot ai imidazotului. In final, restul proteic de la gruperea OH a serinei este deplasat de pi, restul proteic de la imidazol se desprinde gic; chimiotripsin fg ea stuctura iii ‘Un mecanism detaliats-a formulat pentru reactia eatalzath de lizozim, Centrut activ al fizozimului se prezinti sub forma unei ,despictturi* (gan)) cuprinzdind mai multe rupiri de legare si catalitice (Fig. 1.8). Numarul restuilor de NAM si NAG cuprinse {in central activ este sase. La legare participa resturile de Tep-63, Tep-62, Asp-102, Ala- 107, Arg-114; grupirile carboxil din resturile Glu-3$ si Asp-52 participa la cataliza Esenfial in mecanismul propus este faptul c& in timp ce restul Glu-35 este intt-0 zon’ hidvofoba a tizozimului,e1 nefind ionizat fa pH-ul optim de acfune (pH=5), restut Asp- 52 este intr-o zon’ hidrofi& si deci este ionizat. Din cele cinci legituri glicozidice (1-4) aflate tn centrul activ singura care se scindeazi este cea cuprinsA inte resturile Glu-35 gi Agp-52. Gruparea COOH a Glu-35 cedeaa protonul oxigenului care formeazi legttura glicozidict (1-8) simultan cu scindarea heterolticd a legiturit oxigen - C, a NAM. Restul NAG formeazt astfet gruparea OHf la C, in timp ce C, a restului NAM devine carbocation (Find stabilizat de interactia cu gruparca COO a restului Asp-52). Urmzezi atacul nucleofil a (OH)~ din apt cu formarea grupttii hidroxil la C, a restului NAM; simultan ionul H* din apit formeaza cu geuparea COO a Giu-35 gruparea carboxil neionizath (Fig, 11.9). Reacfiile catalizate de enzimele heteroproteice sunt si mai complexe deoarece apoenzima si cofactorul partcipx simultan la formarea complexului ES si ta cataliz Fig. IL8. Roprezentarea intitivés = contrull activ al lzozimulul (comentariy fn tex}. 22Fig. 1L9, Mecanismul scindatihidoltice a legatulor (1-4) glicozidiee in hoteropolizaharide, catalzati de lizozim. IL8. CINETICA ENZIMATICA, Cinetica ey studiaz’ viteza reactitlor catalizate de enzime in functie de variajia raportului concentratilor enzimei si substratulu ((EJ, (8) sia influenfelor unor factori fizico-chimici cum sunt: temperatura, pH-ul, inhibitor ete Conceptia unanim admist in enzimologic ca formarea din substrat a produsului reactie implica obfigatoriu existenfa complexului enzimma-substrat (ES) redatt prin ecu: E+S == ES——> E4P 2 fost statuatd in primut rnd in Tegiturt cu cinetica reactiilor catalizate de enzime; de aceea, in interpretarea ficciruia dintre aspectele cuprinse in acest subcapitol punctal de plecare il reprezinta chiar aceast ecuae 11.8.1, EXPRIMAREA VITEZE! REACJILOR ENZIMATICE. ACTIVITATEA ENZIMELOR Utitizarea curenta in cinetica enzimatic’ 4 acestor termeni face necesard definires lor. Viteza de reactie se exprim’ prin cantitatea de substrat (ransformatz in produs de seactic (exprimatl in miligrame, mai rar in grame) intro unitate de timp (secunds, min),Pentru enzimele purificate, cérora li se cunoaste masa molecular’ se poate stabili numarul de molecule de substrat transformate de ciire 0 moleculd de enzim® intro secundi, valoare ce reprezintt ,activitatea moleculwit a enzimei. Aceasti miirime, sinonima cu eficienfa cataliticd, este importants pentru c& permite ait comparatii intre diversele enzime cat si a enzimelor in raport cu catalzatorii chimici. Pe de ait parte, pentru enzimele a cisor activitate moleculars este stabilii, pe baza mrdsurtil ccantititii de substrat transformat, de exemplu de cite un omogenat tisulir, se ponte alcula concentratia enzimei (numdrul de molecule) din acel omogenat. In practica biochimict curentt, inclusiv in cadral getermingritor enzimatice in scop de diagnostic (in special in ser), interescaz’ mai putin activitatea absolut’, fiind ins’ importante variatite de activitate; in acest caz este suficient $8 existe o anmumita unitate anbitrari do activitae care st serveasct drept refering. Se ulizeazii urm&toarele uni: unitatea internafionaki, Ul; 0 unitate internationals reprezintX cantitatea de enzim’ ‘cate sigur’ conversia unui pmol de substrat/min in condifii standardizate de pH, temperaturd, prezenta cofactoritor (care sunt stablifi panteu fiecare enzim). ~ Katalul (Kat); un Kat reprezintt acea cantitate de enzim’ care asigurdt transfor. ‘marea unui mol de subsiral/sec (cu. multipla kilokat si submoltipli mkat si pat), Pentru unele enzime se utilizeazt si alte unitati, Astfel pentru oxidoreductazele cu coenzime NAD* (NADH + 1°) sau (NADPH +H’) actvitatea se exprima prin cresterea sau sc&derea extincfiei la 340 nm formele reduse ale enzimelor absorbind aceasth radiagie, i: timp ce formele oxidate nu 0 absorb; 0 anitale enzimatich pentra aceste hidrogenaze-dehidrogenaze reprezinta cresterea sau sciterea cu 0,001 a extincjiei Ia 340 him intr-un minut (cova de 1 cm) Pentru fosfatazele din ser se utilizeazX unitatea Bolansky care reprezint cantitatea de enzima ce formeaza, prin hidroliza esterilor fosforiei, un mg de fosfat anorganic (in conditi standardizate de pH, temperaturl). 118.2. VITEZA INITIALA A REACTIILOR ENZIMATICE ‘Dacé unui substrat aflat in solujie i se adaagi o cantitate de enzima care catalizeaza\ transformarea acelui substrat se corstali ¢& formarea in timp a produsului P are Toc dup’ 0 curb ca cea din Fig. 11.10, Fa are © porjiune rectilints (cu panta constant), apot_ se ‘inclind si in final se aplatizeazit. Esie nevesar ca in mtsuritorile de cinetic’ s% se ia valoarea notati ve, mumiti viteza initial si care reprezint’ viteza reacfiei ‘Pe porjinea rectlinie. Datorita concentra- og z Fiat tied mari a substratuloi corespunzaitoare J i acestei porfiuni, ES se transform numai in E +P (nu gi in E + S). in practic’ se din valoarea \, a fiecirei probe). Proporfionalitatea inte viteza v, si [E] are importante aplicait practice: de exempta, este posibil si se estimeze concentrajia relativa aunei enzime In omogenate ce ukare irk a fi necesar sX se efectueze o purificare prealubill a acesteia, Pe de 0 pate, Ve = KE), iar pe de alt pane v, = (PYt (unde [P] = concentrayia produsului timpul de destigurare al reactei); deci: KfE)=IPM sou (E]= [PPK -t Dach timpul penira studierea reacfei este merou acelasi (deci constant) $i produsul K-te constant (notat K;): in aceste condifi, concentragia in enzim’ este direct proportio all cu cantitatea de produs format (El = [P]K.- “Asemenea miisuritori de concentrafii relative a enzimelor se efectueazi sistemtic in laboratoarete de analize medicale (mai ales asupra singelui) deoarece variaiile sunt corelate cu diferite stiri patotogice, (vezi subcapitolul ,Enzimele in diagnosticul clinic“). 87118.5. INI TA CONCENTRATIET SUBSTRATULUL ECUATIA MICHAELIS-MENT ait miajoritaié encimelor cotulare este constantd tn timp: fe excepyie cavimete numite .inductibile” (veri Reglarea activitti enzimielor”) precum si enzimete Dlasimatice nefunctionale a edvor concentrate crese sab seade in anummite stiri patologice (vei -Relafia enzime - patologie'), fa schimb, eoncentrajia substratelor celor mai multe ‘vie variaaa destul de mult dupa starea metabolicd 4 jesotalui si numerosi ali ctor pena vitezei de veacje de concentraja substratului constiuie aspect cel mai important al einetici envimatice, fv aoestcaz,reprezemtarea grafic a lui v, tn unc de 18] (El, temperatura si pH-ul find constrante} conduce la o cura cu aspect de !iperbott Fig, 1114), Existd gi excepfi enzime pentra care tn toc de hiperbola se obfine > curt sigmoidal (sez! wEnzimele aosterice) Din ana 21y, crete proportional cu cresterea ($] numai pentru vatori imici ale acestein: apo cresteres se face tot mai lent pentru ca dincolo de puncta! #3. cori de mutta eteste (8), viteza reacted mime constant; valoarca constant a vtevel este si valoarea maxim, notath V,,. Explicagia aturei curbei procum sto ecuagie in care v, se exprim’ in funcjie de (S}, $i constant Ky, se daloresA fui Michaelis si Menten In deducerea ecusiei se pleact de o kn completars tn cle mengionate anterior in tegitrd eu aceasté ecuate general se Precizeazi cd tnsformarea ES ——» E + P este de regula irvetsibild dis dow men tive: pe de o parte, este etapa mai lent, pe de all parte. P devine, in eadnal et Imotabolice spevitie,substat penis reactia miloare si devi se consul rapid Lexlott ‘oun reac enzimatce tn care eformarea lui ES din E si Pw poate ft negiisy Saturatie Fig. 1.14, Veriatia vitezel reactei endimatica in functe de concent subetratutl 0 Ky i]Deoareee vitezs inte-0 unitate de timp, reactied eataizatd enzimatic se exprima prin cantitatea de P fornat ar [P] este proportionala cu [ES], se poate serie =k, IES) @ Cantitatea de ES disponibilé pentrs trnsformarea tn E si P este inst dependents, pe «ie 0 pare, de vitera cu eare se formeaz iar. pe dealt parte, de viteza de disaciers in i S; aceste viteze sunt redate prin: dle formare a ui ES = K, IE) £5} a unde (E] reprezint& conceniraia enzimei libere (disponibita i momentul dat pentru fos Ds - viteza de disociere a tui ES vite ks ESI @) face parte dint-o cale metabolica (ES) rlumane practic constant’ (“steady suai [S} gi [P]. Conxigia mafematic’ pentru aceasta 'S sti fic egal cu suma vitezelor de transformare in E si Daca reactia staie™, stare sie ca viteza de formare at Iu P i refacere a lui B + S, devi Ky “TEL 1S} + (K+) IES) ° sa Kk TS 1 Ce Raportul constantelor este fot @ constant’, notatt Ky. deci ky BLS ” ei care poate fi serisa gi sub) Form eg SI ea Deci pentru calcula! pe baza ecustici (7) a i Ky, care are @ deosebitt importan’ in enzimologie, este necesat misurarea direct a lui {E} si [ESI. Aceste determin’ sunt deseori dificile; de aceen se urmareste objinerea unci ccuatii in care Ky st fie coretat cu parametri mai usor msurnbii, In acest seop (E} se exprim prin (= led -(ES) @ unde [Ey] este concentragia total. a enzimei in medi. Substituind pee [E} din (9) in (8) se obgine: ses) - AE TESD 81 10, % care prin rezolvare conduce la: ge - EU a rl 89Substituind aceasta valoare a lui ES in (2), se objine: vpu KES) (12) Ko) Cum s-a aritat, cind concentrafia substratului este mare (caz frecvent in vivo), viteza reactici este V,,, ceea ce presupune particjparea in totais a enzimei la react, deci: Vu * KE] (3) ‘Substituind in (12), se objine: vee van 8 (14) Ke iS) Aceasta este ecuatia Michaclis-Menten sau ecuatia de vitezi a reactiilor enzimatice cu un singur substat, Ea red deci varigia Ini vin fumetie de varitia lui (S): in ecuatie ‘mai apar constanta Ky si Vay, (Care exprima indirect concentrafia enzimei).. ‘Concordanja ecuafei cu aura curbei din Fig, 1114 este exceptional; pentra verificare se dau dows situa: a, Ciind S are concentrafia foarte mic (corespunzitor portiunii O - A pe curbii), valoarea lui la nusnitor poate fi neglijata gi ecuajia (14) devine: Vou (81 ~K 18] ro) adic’ v, este direct proportional cu {S}; , Cand § are concentrajia foarte mare in raport cu Ky (corespunzitor punctului B pe curb’), valoarea acesteia din urma poate fi neglijati, deci: Vu £8] i} (16) adic& v, atinge valoarea maxima, 118.6, DETERMINAREA EXPERIMENTALA A K, SEMNIFICATIA ACESTEI CONSTANTE, CONSTANTA CATALITICA, K., Fiecare enzimfi se caracterizeaza printt-0 valoare particulard a Kye aceastt valoare se determin’ in principi astfel: se prepart o setie de 6-10 probe (intr-o solutie tampon potrivitt) introducdindu-se in toate acceagi cantitate de enzim’ dar realizindu-se un gradient crescitor al substratului. Reactia, declansati in momentul amestectsii enzimei cu substratu, este sath sit se desfagoare un anumit timp (secunde, minute, dup caz) poi este intrecuptt prin adaosul unui inhibitor potrivil, Se misoara tn fiecare probsi cantitatea de produs format; cu aceste date se calculeazA valorile v, care se reprezint grafic in funcjie de [S] crescator, Se objine cura hiperbolicd caracteristica (Fig, 1.14). Porfiunea dreapti paralelt cu abscisa (corespunzatoare saturarii E cu S) se prelungeste and la intersectia cu ordonata; intersect reprezint V,,,. Se ia valoatea Vyay/2, se duce © dreaptt paralelai cu abscisa pind ta intersectia cu curva si de aici se duce o dreapta paraleli cu ordonata pana la intersectia cn abscisa, care este chiar Ky. 90‘Dacit fn ecuafia Michaelis-Menten se substituie ¥, cu Vay/2 se objine succesiv Vows _ Yeo SI 2 Kut lS} S]= Kus tS} Ky= IS] (17) Se trage concluzia: Ky reprezinés acea concentratie a substratului pentru care viteza reacqiei este jumaitate din V,,,5 in consecinf& valorile lui Kye se dau in moliftitr. Semnificajia lui Ky reiese duck se apeleazt 1a formula (6): Ky = (Ke + KOK: considertind K, << K, se obfine Ky = KK si deci .Ky rod capacitatea de disociere a lui ES in E + S"; fn alfitermeni, ea red tiria legaturiiintre E si S in complexul ES, Valorile Iui Ky, pentru diverse enzinie sunt cuprinse intre 10" - 10° molifitru Se conehide: + valorile mici ale Ky, corespand unei legtturi slabe inte E i - valorile mari ale Ky corespund unei legitari puternice intre E si. ‘in cinetica ensimaticn se utilize gio all constant, nota K, care se define ste prin rapertul: Voss 1) “El Ea red numarul de transforméti substrat ~» produs pe care fiecare centru acti Ie catalizeavc\ inte-0 unitate de timp (turnover). Cunoscind valosile si semnificajile lui Ky, si Kay Se poate calcula K/Ky care red& eficienga cataliticd a enzimei (Tabelul 1.2), Tabotul 12 Valotile Ku. Kou $i Kye/Ku le cAtorva enzime In raport cu substratele Enzima Substratih Kell) Kale) Kala Rooticoinesterazs [Acelicolna Jesxt0® | ant" Texto" ‘Anhicraza carbonica | CO, taxi 10x10" eax? ‘Antickaz8 carbonic’ — | HCO; zexto® | 4oxto 1,5x107 Catalaza HO, 25x10? 10x10" 4oxt0? Chimotipsina Estoruetiic al | 44x10" 54x10 texto" Neacet-glcnel Fumaraza Fumarat soxio* | 8x10" 1,6xto* Ureaza Ure asx? | 1,oxt0" 4ox108 9118.7, ECUATIA LINEWEAVER-BURK, fatematie, ecuajia Michaelis-Menten poate fi transformatti in moduri variate. © variant, datorati iui Lineweaver si Burk, este forma reviproca: ariahilele Giind (S) si v,, ecuaia este de forma general y amfic 1, in funcfic de 1fS} se objine o dreapti (Fig. U.15). intersectia drepted cu fordonata corespunde vilorii 1Myq ia panta dreptet fe Kyou BACK Se prelungeste dreapta pling Ia interseetia cu abscisa, se objine valoarea -tiKy Doin punctul de vedere al determintsii experimentale a 1oi Ky $i Vga Feprezentarea tui 1, fn funetie de 1/1$} este avaniajoas’, numairul de probe necesare pentru obfinerea dr (i deci a tui V,,. $i Ky) fiind mult mai mic in compatafe cu nurndnul de probe necesare objinerié hiperboted. Pe de alt& parte, ecoafia lui Lineweaver gi Burk este extrem de utilt in studit de inkibigic a activitgii enzimetor prin compust chimici. Fig. 1.15. Roprezentarea grafic& vatial Lineweaver- Burk, NZIMELOR 1.88, INHIBITIA ACTIVITATH B Activitatea multor enzime este inbibatt de compusi chimici diversi; in sistemele vii asemenea compusi pot fide origine endogentt (de exemplu diferi metaboliti) sau de ‘origine exogen’ (cum sunt agengii toxici sau uncle medicameite). Inhibifia enzimetor poate fi reversibild ireversibilt, aceasta din unm numindu-se si inactivare, In ambele cazuri inhibiforul se Teag’ de enz m8, dar in timp ce in inhibitia ireversibila legatura enzima-inhibitor este putemica (covalent), in inhibigia reversibila legttura este ska 92Un exempt de inhibitie ireversibili este oferit de acjiunea iodacetamidei asugra cenzimelor care an in centrul activ 0 grupare - SH; are loc reactia: Enz—CH,~SH+—CH,—CONH, ——» Enz—CH, SCH, —CONH, + HI — CH, ~ CONH, este complet inactiv (nu poate fixa Complexul Enz — CH = substratul) ‘Tot grupliriie SH din centrete active pot fi blocate si cu acidul paraclormercuribenzoic {n timp ce grupaile hidroxil din centrele active (cum este cazul tripsinei) sunt blocate de inhibiforul di-izopropilftuorofostat. Se cunose doa variante majore de inhibitie reversibit 4) Inhibigia competitive, produst de inhibitori care se Ieag’ tot ta nivelul centrului activ al enzimei, dar prin legdturi slabe, fn cazul prezengei simultane in mediu (sat in Celule) a substratuiui si inhibitorului, intre acestia are loc o competifie penima fixarea pe encima. La 0 capacitate egal de legare fa nivelul centrului activ a substratulu: si inhibitorului, enzima va fixa acesti competitor’ in raport cu concentrapile lor. Inhibitorit ‘competitivi sunt compusi cu structur8 apropiatt de cea a substratulu. Evenimentete care au foe pot fi reprezentate simplifi \ eI {In acest tip de inhibitie, partea din enzima aflatd sub forma complexului EI poate fi ‘ecuperatt dact fn mediu apare un exces de substrat (datortt reversibilithé E +1 + BD). recizarea ci: un nuit compas este inhibitor compeaitiv pentru o enim’ dat se face tn ‘mod simpla; se traseazi dreapta I/v, in functie de 1/fS} pentru prezenta in media a tui E si S i apoi acocasi dreapt pentru prezenja in media 2 E, S gi. bn ulm cav se remarcto pant crescutf a dreptei, intersecia cu ordonata nefiind modiicatt. Valorile intersecfei prelungitit Areptei cu abscisa gi panta dreptei sunt modificae cu coeficiental 1 + {IVK,, mde Ky are semmificajie asemanditoare Ini K,, da pentru eacfia tui E cu T (Fig. 1.16). ele?) “| Fig. 1.16, Reprezentarea graticd a ecuatei Lineweaver-Burk In cazulinhibiisl competitive. Ist 83Prinze numeroasele inhibit competitive cunoscute sint si urmtoarele: Succinat dehidrogenaza, enzima ce catalizeazt transfornarea acidului succinic in acid fumaric, este inhibatt de acizit dicarboxilici malonic, malic si chiar oxalic. cook cooH coc I I | coon on, CH Hon | i i | cooH cH, coon ot i cooH coctt acid succinic acid materi acid aie acid oxalic Un numair de medicamente targ ulizate f5i datorexzt efectele faptului c& sunt inhibitori competitivi, De exemplu, sulfanilamida, cea mai simpla sulfamida, este asemnitoare structural cu. acidul paraaminobenzoic pe care il poate inlocui in cursul sintezei acidului folic de catre bacteri (vezi vitamine si ccenzime); cum acidul folic este indispensabil bacteriitor, acestea mor (la om nu se intimpll acest Iucru deoarece el ia din hhran’tacidul folic) nn <_-coor w-€_ soon Aacid para-aminobenzoic Sulfarilamida in chimicterapia cancerului se utilizeaz analogi structurali ai bazelor purinice. si pirimidinice; ei inhiba sinteza de acizi nucleici impiedicand diviziunea celulara care este ‘malt mai rapid a tumor. b) Inhibitia necompetitiva; in acest caz inhibitorul, a clrui structur poate si difere destul de mult de structura substratului, se leag’ prin legaturi slabe in alt loc decAt central activ al enzimei, Afinitatea pentru substrat a enzimei pare a nu fi modificatt, Exist inst posibilitatea ca o parte din ES cit si EI si formeze complex ESI; transformarea lui $ din acest complex in P este sc¥uti in raport cu transformarea lui S din ES, deci atat v, clit si Via Sunt mai mic. Inhibifia necompetitiva depinde numai de concentraia inhibitorului (Gi de afinitatea enzimei pentru el) deoarece subsiratul in exces mu il poate deplasa pe acesta, E+P t yey E ES| ——» E14? (putin el acd se studiaza cinetica unei asemenea react, reprezentarea 1/v, in functie de 1/{S] | conduce le 0 dreapti a c&rei prelungire intersecteazt abscisa in acelasi punct cu dreapta | obfinuti fara inhibitor (deci Valoarea Ky, nu este modificara); in schimb, sunt modificate | intersecfia cu ordonata si pania (Fig. 11.17). 94Fig. 1.47. Renrezentarea gra- fied a ocuaiet Lineweaver- Eurk fn cazul inhilal necompettive Excmple sunt unele enzime care conjin grupari SH libere in alte pozitii decdt centrul activ. Aceste grupiri pot fixa prin legituri slabe ioni ai unor metale grele cum sunt Ag” si Hg’ care diminut sau chiar anuleaz’ capacitatea enzimelor de a transforroa substratcle in produsi. Aga se explict efectul oteivitor al multor metale grete. IL9 REGLAREA BIOSINTEZEI §1 ACTIVITATH ENZIMELOR 119.1. ASPECTE GENERALE insusici cum sunt capacitatea catalitick deosebitA, specificitatea, inhibarea prin diversi compusi etc, se stidiazd in detaliu urmarind comportarea enzimelor extrase, purificate 5 dizolvace in mediu apos; tn aceste condifi, atunci cfind se studiaza acjiunea unui anmumit factor, de exemphu a unui inhibitor, ceil parametrit cum sunt temperatura, pHt-ul, concentra cxzime si substratlu,prezenjin limitsle necesare a cofatorilor t., se mergin ia valorile dorite (de regula cele optime). Si poniru enzimele care gi desfisoarl actvitatea in organismele vii, o parte dine factor mentionaji se menfn la valori constant sau vafiaxS th limite restrdnss. Apar tousi relaiv frecvent si sini deosebite; nue acestea varaile mari in timp ale concentrlii substratului (de exemplu a glucidelor, ipidelor si proeincor tn tracul digestiv) si acurnalerea pe limite a produgor final a cllor metaboice sunt cele mai frecvente. Se mengine in astel de situa in celole, organe sau organismal intreg o concentragie stafionarX si 0 activitae constant a tuturor enzimelor? Réspunsul Ja aceastlintrebare a venit mai inti din studivl unor provese metabovice la organismete simple (hacterif) la care s-au remarcat, functie de condifile create in ‘mediu, cresleri gi sctderi in limite foarte mari ale cantitiyii unor enzime, sau, in alte cazuri, variafii Insemnate ale activitagii cnzimelor. Aceste variafii cantitative saw 98calitative, vonsituie de fapt modality de regtare care sunt alributal biocataizatorlor Prin intermedi reatilorcatalizate de astfet de enzime (lar $1 prin prezenga sau absent cofactorilo, a inhibitertor ete.) hacterite ist mengin hemcosttzia fn raport et: mediat exiem, Pe bara cunostingelor actual, se poate afirma ch gi in organismele supericare toate procesele care aso baz molecular sunt reglale prin enzime; fa ceste organise datorita specialiari celulelor gi organelor, pe de part, sia funcfci integrate, pe de alt parte, reglajul canitativ say calitatv al enzimelor ta un anumit nivel poate avea cow Ja nivelal organisrnaluiinireg, fo afara condor mengionate (exces sau lips de substrat, exces de prose) se mengioneaza aici e8 aefianea horonilor se xealizea final prin intermediul unor envime de reglaj specializate (veri captolul .Hormoni") Jn cele ce urmeact se prezinskreglarea cantitiii ensimelor-(pe scurt) si cele dow ‘ariante majore de reghre a ativitiiienzimelor: reglarcaalosteried si wezlarea covalent 1.92 REGLAREA CANTITATH ENZIMELOR Cantitatea oricarei proteine din organism, deci gi a exzimelor, rezulel din dinami proceselor de biosinteza si degradare, Viteza de schinb (tumoverul proteinelor) exprimat prin timpul de injumatatire, Ty, este foarte variats (vezi .Metabolismul proteinelor si al aminoacizilor”). Se slie cd proteinele se sintetizeaz’i die uminoacizis pe de alti parte, produsii de degradare ai proteinelor sunt, de asemenea, arrinoacizii, Se poate scrie rela: Aminoaci == Proteine (enzime) K unde K, este o constant yeneralé a procesului de sintez iar K, este 0 constant a procesului de degradare Dependent de valorile celor dou constante generale se disting situaile: K.>K, K,=K, — concentrajie stajionars eral concentrajie crescutt a enzime: K.< Ky concentric sclizut’ a enzimet Majoritatea enzimelor au K, = Ky ele se numese enzime constitutive. Ericimele la care K,> K, se mumese inductibile, cele la care K, < K, se namese represibile. Se face pre- izavea cl inducia sau represia sintezei enzimelor nu au carscier permanent sic kao aceeasi envi india sintezei allemeazt cu epresiaacestea in furctie de necestiile de manent. Inductia sintezei se resirdnge de regul lao singur encima dintr-o cale metabolic& (de ex. inducfia prin subst a 5-aminolevulinatsintetazei, ALAS, in calea biosintezei hemului). Existd situapii de inductie simultand a mai multor enzime: de exemplu, inductia enzimetor hepatice iustrata prin aceea ca la o diet bogat in proteine, in decurs de 1-2 zile sunt sintetizate cantitati mari de enzime din ciile metabolice de degradare ale aminoacizilor si din gluconeogenez’. Schimband dieta in una bogati in glucide, sinteza enzimelor mengionite este represald $i ste indus sinteza enzimelor din calea glicolitich ete. 96Represia sintezei enzimetor se face de reguli prin intermediul sor compusi cu molecukt mich, numigi corepresori; ei actioneazt sub forma de complexe cu pro cine specializate numite aporepresori, Mecanismele inductiet si represiei sintezei enzimelor, bine cunoseute in prezent, Au pot fi infelese decal in contextual mai larg al mecanismului biosintezei proteinelor Soordonat de avizi nuckeci, Aceste aspecte. sunt trate in capitoiul ,Biosinteza proteinelor™. 1L9.3. REGLAREA ALOSTERICA A ACTIVITATI ENZIMELOR {n subcapitolulreferitor la cinetica reactor catalizate de enzime s-a menfionat c& pentru ‘ele dint acestea curba variatici Iai v, tn funcfie de [$} are un aspect sigmoidal (Fig, 1118) Viteza micl a reactiei a inceput urmata de cresterea marcat la concentrafii mai mari ale substratului, sunt rezultatul unor mecanisme particulare de acfiune a enzimelor ce catalizeaza aceste react. Hotirdtoare pentru elucidarea acestor mecanisme au fost cercetiile efectuate de 3, Monod, .P. Changeux si F. Jacob, in anit 60, asupra reglirii activitit unor enzime bbacteriene, S-a constalat de exemply c& in biosinteza L-izcleucinet din L-treonind (care censt din cinci react catalizate de tot alitea enzime), L-izoleucina in exces inhibit itreaga cale ‘metabolic. Nu sunt inst inhale tate enzimete ci doar prima dintre ele, Ltrconin-dchidrazza, a calalizenza transformarea L-treonine! in c-cetobutirat + amoniac (Fig. 1.19), v% ay, = i(S) penta: 1 onda setae o Set pemotep: 2 ena alent ments posse: 5 enaind astro Poga o — I cH GH L-treonin. a cotobutirat ag no-G-n sehidatars thie —+ —+—> > H-C-cHe H-G-NHe cago cooH ' . ceed ene L- izoleuciné Fig. 11.19. Inhibarea activitiii Letreonin-dehidratazei de cttre Lrizoleucina aflatt in exces, a4 Bir ofe coe > oe z id Ele pHs oEty pte. 5 (*) fd) | Fig. 1.20, Modularea activiaiit enzimelor alosterice: (a) inhib int-o cale metabolica linear’; (0) inhibi tn cale metabalicé cu ramiicafi (6) sctivare prin substrat; (¢) feed-forward stimula Studiind si alte chi de biosiniexs, Monod si colaboratorii au fost in misurd st gencralizeze ch produsul final, acumulat peste necesitiile de moment, devine inhibitor al enzimei care catatizeaza prima sau una din primele rescfi ale sirului celor implicate {in biosinteza sa Fig. 1.20.2), in cazul cAilor metabolice cu ramificatit, produsii finali sunt inhibitori ai enzimetor care catalizeazi reactiile de la nivelul ramificafilor; deseori, fiecare dintre produsii finali inhib gi activitatea primei enzime (Fig, 11.20.b). Monod sicolaboratorii au denumit acest tip de inhibijie,inhibigie prin produs final, inhibifie feedback sau retroinhibifi; enzimele inhibate s-au denumit enzime alosterice ir inhibitor, inhibitor alosterici sau modulatori (efectori) negativi. Au fost identificate si enzime alosterice a ctor activitate creste tn prezenta unor compugi care au fost numifi activatori alosterici sau modulatori pozitivi, Asemenea modulatori pot fi substraul (care activeaz prima enzimt) (Fig. 11.20.c), unul dinire intermediari care activeaz3 o enzim’ aflat’ in continuarea cdi metabolice (Ieed-forward stimulare) (Fig. 1.20.0), diferi utilizeazt i activator sau hibito. 98, alji compusi, AtSturi de denumirile deja enumerate se iceea de efectori alosterici tn legatur’ cu totalitatea compusilor cu rolPentru cele mai multe enzime alosterice exist allt modulatori pozitivi cat si negetiv Modulatorit intensificd sau scad activitatea enzimelor ca urmare a fixteii lor pe acestea. Locurile de fixare sunt distincte pentru modulatorii pozitivi gi cei negativ si altele dectt centrul activ. De aici denumirile de enzime alosterice, inhibitori alostrici (allo = alt loc). Exist in prezent mai multe argumente, bazate pe cercetiri experimentale, privind locurile distincte de fixare pe enzime a activatorilor si inhibitorilor de acest tip. Astfl, ‘s-au realizat ,desensibilizir™ ale unor enzime alosterice prin actiuni fizice sau chimice: pHL-uri extreme, enzime proteotitice, ureea, temperaturi scizute sau erescute, unele rodiafi: s-au reatizat astfel de modele experimentale incat s& fie afectate numa Tocurle de legare ale modulatorilor nu si centrul activ. in alte experienge s~a putut proteja centrul activ de acjiunea unor agenti denaturafi prin intermediul modalatorilor. Si alte insuyiri ale enzimetor alosterice, a reactilor catalizate de ele, precum si a conditilor in care se desfigoaré aceste reacfii au importan(& pentru cunoaslerea fie a mecanismului de acfiune, fie a rolului de reglatori a calor metabolice. Intre acestea se citeaz”: = din punct de vedere structural, aproape toate enzimele alosterice sunt oligomer, de reguld cu numer par de monomeri: doi (mai rat), patru, sase ete. + reacfile catalizate de aceste enzime au AG" negativ, sunt deci exergonice gi ‘reversible; ele impriima sensul unic al cailor metabolice din care fac pare; situarea chiar | inceputul cdi metabolice a acestor reacfiiasiguri nu numai un control al intensitiii ci, dar si imposibititatea parcurgerii ei in sens invers, ceea ce se traduce prio ‘cconomicitate maxim’; = compusii chimici cu rol reglator a enzimelor alosterice (efectorii) sunt prezenti permanent (rareori doar intermitent) fa locul de acjiune al acestor enzime; variazt Joar concentrafa lor, ‘Mecanismele (modele) propuse pentru explicarea, cu respectarea datelor experimentale aritate, a aefiuni enzimelor alosterice au fost numeroase, Dintre acestea s-au impus dows ‘modelul concertat (simettic) imaginat de Monod, Wyman si Changeux (modelul MWC) si modelul seevenfial propas de Koshland, Nemethy gi Filmer (modelul KNF). Cele dow’i modele au citeva efemente comune: 4, fiecare monomer al oligomerului are centrul su activ; ’b, monomerii ,coopereazai” in fixarea substratului si deci in desftigurarea proces catalitic, Prin cooperare se injelege ci la fixarea substratului monomeri se influenfexza. De exemplu un monomer care a fixat substratul mareste capacitatea de fixare a acestuia de etre ceilalti monomeri (Cooperare poritiva); fixarea substratului de citre un monomer poate avea ca efect diminuares capacitigi de fixare a lui de citre ceilalji monomeri (cooperate negativa). Cooperate acestea se fac numa prin intermediul centrelor active ale monomerilor (deci centre de acelasi tip); ele sunt de tip homotrop. Dac avem inst ‘in vedere cele aritate antetior $i anume cX enzimele alosterice sunt controlate §: de modulatori (care se leagt in alte pozitii decat substratnl) interactia se face si Ia nivelul locusurilor pe care se leagt modulatorii; astfel de interacyii se numesc de tip heterocop; cele mai multe enzime alosterice sunt de tip mixt, homotrop-heterorop; c. interactiunile intre monomeri in oligomer, ait in cazul efectului homotrop cAt si a celui heterotrop, nu implick modificiri profunde (formare sau rupere de legtturi covalente) ci doar modificiri conformagionale, De aceea reglarea alosteric’ se face cu consum minim de energie. 99)Siarea R =€S9 Fig. 11.21. Fltarea substratull gltranztiaT > {in cazul unei enzime alosterice formata din do! monomer substrat Modelal simetric postuleazat suplimentar: - Oligomerul trebuie si indeplinease’ permanent conditia de simetrie, respectiv centrele active ale monomerilor si fie echivalente In interacfia cu celfalti monomeri: de fapt,oligomerul poate exista numai in dow’ stiri: conformajia T (ensionat’, constrains’) in cate enzima are afinitate mici fap de substrat si confarmagia R (relaxald) cu afinitate ‘mare pentru substrat, Starea T are centrul activ preformat, starea R tl are definitivat. Cele dou’ stir se afla in echilibru, constanta de echilibru fiind L (constant afosterica). Termenii T si_R se seferd ta flexibilitatea oligomerulai, respectiv felul si numarut interacfiunilor fnire monomeri. In lipsa substratului siarea predominantA este starea TT. Daca se consider numai interactiunea de tip homotrop, fixarea substratului la starea T se face cu atit mai grew cu cat concentraia iui este ma mica (Fig. 1.18, portiunea O- A pe curba 1). nto enzima alosteric’ format numai din doi monomeri fixarea substratulai la unul dintre acestia determing tranzifia T > R; in virtutea postulatulii simetriei, dar si al principiului cooperirii, al doilea monomer dobindeste automat conformajia R si el va fixa mult mai ugor substratul (Fig. 1.21, porfiunea A-B, pe curba din Fig. 1.18), porfiunea B-C pe aceeasi curbi, corespunce saturiri enzimei cu substrat. Lao enzima alosterica format din patru sau mai mulii monomeri efectul cooperativ este mult mai pronunfat deoarece fixarea substratului fa un singur monomer determinz\ tranzitia T > R ta intreg otigomerut La enzimele homotrop-heterotrope, efectul madulatorilor se suprapune peste cel al substratului. Cei poritivi (activatorii) stabilizeazi conformatia R, deci favorizeaz% deplasarea echilibrului T R spre dreapta: cei negativi (inhibitorii) stabilizeazst conformatia T (Fig, 11.22; curbele 2 si 3 pe Fig. 11.18) i A 3- &S Stares StereaR Fig. 1.22. Stabilizaree stiri T a enzimelor alosterice de cdtre inhibitor gia stiri R de cétre activator. 100Diferenta esengiald inire modelul seevengia si modetul simetric consti in acer ci primul abandoneazt\ prineipiul simteri Teclam’ si in acest eae tmnzitia T > R dar nu este exclust interacfia strii Ra acestue u stirile.T ale celorlai monomeri. Cooperatvitaten se resiringe de asi dal ta influenfa monomerilor Ti R vecini, Legarea substratului de cfixe primul monomer se face si in acest coz cu dificuliale datorith stieii T a tutwror monomerilor enzisnei Motifiedndu-si conformayia prin legarea substatului, acest monomer va irduce ‘modificarea corespunztoare doar Ia monomerul vecin care va fixa substratul cu mai ‘mull usuring®. Chiar dactt numfeul enzimelor cu cooperativitate negativt este foarte mic (dinire acestea se citeaza trozil-ARN, sintetaza), modelul scovengial s-a dovedit a fi mult mai potrivit decdt cel simetric in exeul acestora. Ukerior elaboriri color doui modete, Figen a demonstrat cd le sunt eazuri parttealare ale unei scheme mult mai complexe: dependent de paniculartajite structuilor terticnd $i Legarea substratulni de chtre un_ monomer cuaternar, unele enzime alosterice acjionesz\ dupit modelul simetric, altele dupi cel seever il, altele dup modelul generatizat (cel propus de Eigen). b aspect cinetic, Hill a stabilit 0 ecuajie cu valahilitate mat penta enzimele si pentru cvle slosterice: log = ny“ oglS} ~ fogk tunde vg, Vu si Sau semnificafile cunoscute, K este constant specified pentru interactiunea enzimf-ligand; ny este coeficientul Hill, 0 constant empiriea care reflects it numetrul locusurilor de fixare a liganzilor cat si intensitatea interactiunié acestora, Repreventind grafic log v./Vea. -v, in funcjie de log (S] (Fig, 11.23) se objine dreapia 1 (pomind din origine) pentru enzime tipsite de cooperativitate, dreapta 2 (interscctie le pozitiva si 3 (intersectie ordonatl) pentru cele cw abseisa) pentru cele cu cooperativita cooperitivitate negativa, Punta dreptelor 2 gi 3 re ul de cooperativitate, vo x 8 SS sy Ss Fig. 1.28, Dreptele obtinute ia oprezentarea grafich a ecuatici Fill pentru enzime lipsite de ‘cooperativitate (1), eu cooperativitate poziiva (2) $i cooperativitate nagatve (2) |{n ultimit 15-20 ani s-au evidenjiat ta unete enzime alosterice structuri si mecanisme de actiune mult mai complexe, Un exemplu este aspartat-transcarbamilaza, enzimai cu rol de reglare in calea de biosintez’ a nucleotidelor pitimidinice (vezi si capitolul Metabolismul nucleotidelor purinice si pirimidinice"). Enzima are 12 subunitati dintre care sase sunt ,catlitice” si ase sunt ,reglatori. in starea T, subunitaile cataitice sunt grupate in doi trimeri iar subunitijile regtatorit sunt grupate in trei dimeri, intreg ‘ansamblul avand o anumit& simetrie si o maxim! compactizare. Tranzitia T > R const fn trecerea spre un aranjament cu o alt simetrie, in care ansamblul subunitiitor este mult mai deschis, Cele dou substrate se leg numnai 1a unitiile catalitice: legarea si transformarea se realizeaz’ printr-un mecanism coopertiv sofisticat si deosebit de ficient, Produsul final al chi metabolice, acidulcitidinsriosforic (CTP) se teagh numai Ja subunititile reglatorii producdnd o inhibifie feed-back, 119.4, REGLAREA ALOSTERICA A FUNCTIEI HEMOGLOBINEL Reglarcs alosteric’ nu se restringe numai Ia enzime, Functia hemoglobinei este reglat tof printr-un ascmenea mecanist, Hemoblobina (Hb) si mioglobina (Mb) sunt hemoproteine care in organism indeplinesc func{iivitale: prima transport O, de ta plimani la celetalte jesuturi si CO, in sens invers, ccoa de a doua depoziteat si disperseazi oxigenul in muschi, Structurile componentelor proteice ale Mb si Hb sunt prezentate in alte capitole (“Proteine, ,Metabolismu hemoproteinelor"). Cunoasterea acestora este necesari pentru injelegerea regltsii alosterice a functiei Hb. Din punet de vedere funcfional, comun pentru Mb si Hb este fixarea O, la nivelul hhemului: mai precis, O, se dispune intre Fe (leginda-se coordinativ la acesta) si histidina distall (cu aceasta interactioneazat electrostatic). Din faptul inst efi Mb nu are structur cuateraas si deci fixeaz’ o singuri molecull de O,, in timp ce Hb are structurdt letramotricd si fixeazd patra molecule de ,, rezulti ciferenje importante intre ele. Acestea se reflect in aspectul hiperbolic al curbei de oxigenare @ Mb faja de cel sigmoidal in cazul oxigentrii Hb in condifiile fiziologice (Fig. 11.24). Valorile presiunié de semisaturare calculate din curbele specifice sunt, de asemenea, net diferite: 1 mm Hg pentru Mb si 26 mm Hg peniru Hb (presiunea de semisaturare, notat& Psy. reprezint presiunea parfiaki a O, la care Mb si Hb se oxigeneazat fn proportie de 50%). Bfectul cooperativ. responsabil de curba sigmoidal a Hb (si de Ps: ridicats) este complex. de tip homotrop-heterotrop. Pentru simplificare, se prezint’ mai inti aspectul homotrop al efectului. El poate fi studiat pe Hb izolati din eritrocite, adus’ in solufie apoasi din care Q este apoi ‘ndepfrtat; Hb complet lipsiti de O, se numeste deoxigerata. Dacit in aceasta solutie. se introduce , a cirui presiune creste treptat de ta 0 la 100 mm Hg si se determin’ pe 102100: - O, (%) 8 Hb 40: 20- ——————» Saturare cu 20 40 60 60 100 120 ————> Po, (mm Hg) Fig. 1.24, Curbele do oxigenare ale mioglobinei (Mb) si ‘homagiobinel (Ht). parcurs c&ttl Hb a fixat O,, se obfine o curbs sigmoidald apropiata de cea din Fig 11.19. (diferenta fat% de aceasta {ine de influenja in condiile fiziologice a factorilor care dotermind caracterul homotrop-heterotrop al efectului). Interpretarea, bazat’ si pe alte ‘maisurltori experimentale directe, este ct Hb deoxigenati este in starea T, cu afinitate foarte redusd pentru O,, Structural, aceasta stare se caracterizeaz’ printr-un numfir maxim de interacfiuni att intracatenare cat gi intercatenare; intereseaczt mai ales un numir de opt legituti ionice stabilite intre grupari carboxil si amino (Fig. 11.25). oS NHE ——____#2_ a coo Bs coo A Bg WH; = ; Asp 44, coo a ee By Fig. 1.26, Legaturiionice intro subunitaile Hb in starea T; acestea se scindeaza cand Hb se oxigeneaz’Importanja deosebiti are si faptul c& in starea T Fe din fiecare subunitate este situat in afara planului protoporfirinei IX (la o distangli de 0,6 A) ca urmare a legarii Iui de histidina proximata (Fig. 11.26.) Neinsemnata ta inceput, acceptarea O, de citre Hb se face simfit pe miisurt ce se forjeazs prin cresterea presiunii, Fixarea O, la 0 prima subunitate (Sau, dup’ Perutz, deodatt Ia cele dout subunititi a), este corelati cu modilictsi structurale. retativ fnsemnate nu numai fa nivelol acesteia Cacestora) ci, fa concordang’ cu model simettie (considerat potrivit pentru Hib), fa nivelul tuturor subunitfitor. Semualut este dat de revenirea in planut protoporfirines IX a Fe* ca urmare a legtturii ce se stabileste intre acesta si O, care se plaseazt intre planul hemului si histidira distal. Cum legatura Fe cu histidina proximal nu se scindeaz’ in urma fixarii O; (Fe inece doar din starea pentacoordinaté fn stares hexacoordinat’), sunt antrenate prin acest rest aminoacidic ‘modifica in structurile secundara si terfiard ale fiecirei subanitifi Se scindeazi tofodat si cele opt legtturi ionice fiind angajate modificdri semnificative in structura cuaternar S-a stabilit de afl, in urma unor analize prin difracfia razelor X, ci un dimer of se roteste in raport cu celtlalt, considerat fix, cu 15°. Aceste modificiri (influenfate. si factorit de care se face deocamdatt abstractie) constituic de fapt truncitia T — R a Hb. Afinitatca mare pentru O, a stiri R se traduce print-o rapid fixare a acestuia de ctitre subunitijile 2, 3 si 4 (sau 3 gi 4). Doar in apropierea presiunii de 100 mm Hy, capacitatea de fixare diminu’ ca umare a saturii Planul hemului + His proximala [7 rp CH,- v=—\ HN. p> ty (ON Fe? cn. fr His distals Fig. 1126, Poziia Fe™ fas do pianul Remmll n He L nebxigenaia gi oxigenata 108oo His 2 x, Lis 62 Can) t-G-0-R-0- 2, 3- bisfosfogliceratul (DPG) ata o g ae - Fig. 1.27, Stuctura 2,0-0°G ¢intercalarea acestula jn cavitatea convalé a Ho neoxigenate © varia atit de mare a presiunii parfiaie a O, pentru ca acesta st se fixeze pe Hb aw constitu. in vivo, un dezavantaj. In pkimani insi presiunea parfials a Os nu variact inte 0 si 100 mm Hg ca in conditile experimentale descrise ci ea este constant la nivel valorii maxime, Accasta fnseamnii c& doar ultima portiune a curbei din Fig, 11.24 este vlabila entra conde Fiziolozice, coea ce si explict oxigenarea extrem de usoara a Hb. Pe de alti parte, cedarea O, la nivelul fesuturilor este favorizath si chiar determinati de condiiite Fixtri redate in Fig. 1.24. Evident, disocierea O, de Hb se face dunt ceeasi curb dar parcurst in sens invers; presiunea partial a O, care este in fesuturi de cea 30 mm Hg, favorizeara procesul cedirii sale de citre Hb dar il si intrerupe in ‘momentul cind Hb este inet oxigenati in proportic de 50-60%. Deci, Hb va prelua in plimdini doar restul de 40-50% O, ccea ce favorizeazt suplimentar oxigenarea, Condiile desctise ale oxigen si eoxigentn Mb asigurd si alte avantaje funetionale: a) in musehi, O, cedat de Hb este deosebit de ugor preluat de Mb (a se compara curbele de oxigenare din Fig. 1124); ) tot cu suring! este cedat O, i timpul sarcinii, de la Hb» mamei (HbA,) la Hb Cembrionului (HHE = ct.) si Mb fitului (HDF = cL) ale caror curbe de oxigenare sunt, de nsemenea, sigmoidale, dar deplasate ia stinga in raport cu cea a HbA,BBcctul homotrop avut in vedere pant acum pentru fixarca O, pe Hb (dar si pentru diso- cicre) este complctat de acjunile compusilor 2,3-bisfosfoglcerat si CO, precum si ale ionilor Hs de aceea, pe ansamblu,efectal cooperatv este in acest ea de tip homotrop-heterotrop. 2.3-bisfosfogliceratul (2.3-DPG), sintetizat in cursul glicolizei si prezent fn eritrocite ‘ntr-o concentrafic egal cu aceéa a Hb, intervine astfel: in starea T se intercaleaztt in chiar cavitatea centralti a Hb ca urmare a atraciilor ele-trostatice intre gruparile sale jonizate negativ si gruptiri ionizate pozitiv (amino) ale Tangurilor de tip & si, mai ales, de tip B Fig. 11.27). Prin aceasta starea T a Hb este supliraentar consolidata, dificultatea fixirii O, cresciind (curba sigmoidala se deplaseaza la dreapta). Dupa ce ins Hb a fixat ©, la o subunitate (sau 1a dow’3) modificarea conformajional’ a tuturor subunitilor, responsabilii de tranzitin T > R, face incompatibild rimanerea 2,3-DPG in cavitatea central (care se micsoreazt). Curba de oxigenare a Hb ligsiti de 2.3-DPG este nu numai ‘deplasati spre stinga dar igi pierde in bund misurd aspectul sigmoidal tinzdind spre cel hiperbolic. Prin aceasta, 2.3-DPG favorizeaza cedarea O. la fesutur Christian Bohr (fattl celebrului fizician Niels Bohr) a ficut, in anul 1904, observagia cat Hb cedeazii mai usor O, dact pH-ul este mai sctizut decat cel fiziologic si presiunea partiali a CO, este mare: i literatura de specialitate acestz constatiri sunt eunoscute sub rnumele de fect Bohr”, Explicajia dati efectului Bohr, despre care se stie tn prevent ec este mult mai ‘complicat, se restringe aici la aspectele esengiale. Astfel, in vivo, concentratii mari ale CO, si ionilor de hidrogen sunt ta nivelul fesuturilor unde rezultA prin procesele ‘eatabolice: ionii de hidrogen mai rezulti: a) Ia formarea intre Hb (dar si alte proteine din plasmt) a carbamatilor sub forma ctirora cea. 15% din CO, este transportat In pkimdnt tn vederea elimintri; grupirile amino care reacjioneazii cu CO, sunt ale unot aminoacisi N-terminali din lanjurile Hb si celorlatte proteine: Fl-NH,+C0, === A-NH-COOm +H fon carbamat b) Ja transformarea marei majoritagi a CO, (ce. 859%) th ionul bicarbonat, compus solubil, care este transportat de asemenea ta pkimni anhidraza carbonica CO+HO qe HCO, H,c0, <== H+ HOO Valoarea mai micti decit 7,4 « pH-ului (Cit este valoarea nonmalii tn singe) si presiunea partials mare a CO, favorizeaza cedarea O,, curba de oxigenae fiind deplasath spre dreapla (Fig. 11.28). ‘in plamani echlibrele reacpilor de ka punctele a gi b sunt deplasate spre stingn datrith climinasii CO, prin respiraje. Concentrafaionilor H' descreste, pH-ul depigeste usor valoarea {de 74: curba de oxigenare se deplaseaza la stinga find faverizatdfixarea O, pe hemoglobin. 1060 20 40 60 80 100 120 —_———> Po, (mm Hg) Fig. 1128, Deplasarea curbei de oxigenare a Hb in funetio de valoarea pHi. 119.5. REGLAREA COVALENTA A ACTIVITATI ENZIMELOR in prezent se cunosc multe enzime cu rol reglator a ciror conversie forma inactiva - forma activ are loc prin modificisichimice care implicd formarea sau ruperea nor legéturi covalente Caza cel mai frecvent este al enzimelor care se activeaz prin fosforlare (sau defosforilare). Fosforlarea se face de citre ATP care transfer, de regu, un singur rest de acid fosforie; esta estetific’ grupit hidroxil ale unor resturi de seri, mai rar trozint sau teonin, care nu fac parte din central activ. Reacfile de fosfrilae sunt catalizate de kinaze specifice, care, la rindul Jor, potexista in forme fosforlate numitefosfokinaze si defosforilate numite defosfokinaze. Find putemic exergonice, reaciile de. fosforiare sunt ireversibile. Transformarea inversi, form defosforilat - forma fosfriat se face hidrolitc in prezenta unor fosftaze specifice; si aceste react sunt ireversibile Fig. 1129), Enzimele interconvertibile prin fosforilare-defosforilare apar mumai in celulele ‘organismelor superioare, Dupa caz, unele enzime interconvenibile pe aceasti cale sunt active in forma fosforilati (glicogenfosforilaza) sau defosforilat® (glicogensintetaza). Activarea unor enzime prin fosforiare (defosforitae) este, de multe ori etapa lim’ iro cascadi de evenimente declansath odatt cu fixarea de elite celule a. uor hormoni saw ali ‘compu chimici cu rol reglator. Aceste: mecanisme sunt tralate in capitol (Gre + NH + ATP (GP + ADP +P, 107ATP ADP Kinazé End- Ser- OH Gnd- Ser-0-PO,H, _— Fosfataza HPO, H,0 Fig. 1.29, Reglarea activitai enzimelor prin fostrilare-detostoriar. Forma activa a enzimei este transformati in forma inact vi prin ,adenililare” (atasarea printr-o legiturk covalent a unui rest de AMP). Ca si foxforilarea, adenililarea se face cu ATP dar fa un rest de tirozints reactia este ireversibila: Revenirea lx forma activi se face si in acest cuz prin hidrotizt (Fig, 1.30) Glutaminsintctaza este o encima cirel activitate este reglata att alosterie edt si covalent, Reglarea covalent’ este cea aritald, Reglarea alosterict prezintl douk aspecte: este multipli in sensul ci exist now’ compusi cu rol de modulatori negativi Gntee care stidina,triptofanul, carhamilfosfatul) si citiva modulator pozitivi; pe de alti parte, este cumulativa in sensul ck: modulatorii pot actiona simultan (in totalitate saw numai uni) si atunei efectul lor se insumeazs ‘Tot activasi de tip covatleni sunt si transformer proenzimelor de pul pepsinogenulu. Lripsinogenului, chimotripsinogenului, procarboxidazei etc. in enzimele pepsin’. tripsind. chinotripsin atbonipeptdat, Pome inatve amogeni sunt exe rods Toul ATP PP, OH i ED: Tyr OH E@-Tyr-0-P-0-CH, A oO AMP H,0 Fig, 1.90. Raglarea activi glutamin-sintetazei prin edoninilare-deadeninilas, 108de sintez (mucous gastricd pentsu pepsinogen, pancrensul pentru toate celelelte); activitrile se produc fa locul de acfiune (stoma, intestinul subjire), Aveste uctivisi au loc ata sub actiunea unor tactori local cit st autocatalitic, dupa schema enerali Factor local (pH, enzim’, autecataltic) Zmogen Enzimé activa ‘Transformtvile acestea sunt unidirecfionale, nu exist posibilitatea refacerii ‘“imogenului din enzimele active. Modalititile particulare de activare a acestor enzime se. 1pot urmeiri fn capitotul ,Metabotismul proteinelor gi al aminoacizilor”, 1.10 LOCALIZARBA INTRACELULARA A ENZIMELOR Pe mfisuri ce cunostinte organismelor superioare 8-1 interioral acestora (“celute sunt cw una diametral opust. Scpararea prin uliricentrifugare a organitelor celulare urmatt de identficarea prin \ehnici histochimice si iochimice a enzimetor in fiecane dintre aceste organite a const tit metodologia care a permis elaborarea unui adevéirat tablou al distribulici intracelulave a enzimelor, Céteva elemente ale acestui tablou se prezint in continuare, Este 0 regukl general cl orice celuld specializati dispune numai de acele enzime care calalizeaz’ efeetiv reacti in celula dat, Unele enzime (sau seturi de enzime) se afl in ‘oate tipurile de celule specializate, Este cazull enzimelor implicate in edi metabolice fundamentale cam sunt: biosinteza proteinelor siacizilor nucleici,glicotiza, ciclul acizilor ‘ricarboxilici etc. Fic functionarea acestor ci, care asiguri multiplicarea si dezvoltarea, nici un tip de celule nu poate exist, Tot cx regulls general, 0 aceasi enim’ apare in forme usor diferite de la un tip de celule fa altul, Diferenfole acesten apar att la nivelul structurii primare si conformagict (enzime homoloage) cat sila nivelut structurii cuaternare (izoenzimele); activitatea lor iferenpiatd, akturi de concentrafia variabili sunt in raport direct cu necesitigile diferite :tipurilor de cetue, Pe de alti parte ficcare tip de celuli specializata dispune de seturi de enzime care catalizeaza reacfile din caile metabolice particalare: enzimele implicate in biosint2za hormonilor tioidieni se aff numai in tiroidS, cele care participa la biosinteza ureei se M18 numai in ficat, ereatinkinaza se alli aproape in fotaliate in musehi etc. Un alt aspect priveste locul in care se afl diverse enzime intr-o celuli dati: et coincide, evident, cu locul de desfasurare a ciii metabolice sau a unei secvente a chi ‘metaotice din care face parte reactia pe care o catalizeaz. Astfel, glicoliza se desfigoar& rhumai fn citoplasma, deci toate enzimele acestei chi sunt in citoplasm; biosinteza ureci ‘Gn hepatocite) se destigoari partial in mitocondrit paxfial in citoplasma, deci uncle cenzime ale acestei chi sunt citoplasmatice, altele sunt mitocondriale, Enzimele implicate in biosinteza ARN-wilor sunt locatizate in mucleul celular care este sediul sintezei. $i enumerafea ar putea continua. privind structura celulelor specializate din fesuturile amplificat, imaginea distribujiei haotice a enzimelor in ‘cu enzime") datind din s fost inlocuita 109Unele enzime au localizare dubkt:aspartat aminotransferaza (ASAT = GOT) ct si izocitratdehidrogenaza (ICDH) se afl att in citoplasmt ct si in mitocondri, ICDH citoplasmatict are coenzima NADP*, cea din mitocondri are NAD", ICDH mitocondrialti catalizeazd o reactie a ciclului acizilor tricarboxilicis ICDH citoplasmatict, in relate cu cea mifocondrialS, asigura transferul echivalengilor de reducere prin membrana acestui organit (vezi .Metabolismaul energetic”). “Malte enzime sunt legate de membrana celutart sau sunt chiar incluse fn aceasta membran ‘cu localizare spre exterior sau spre citoplasm’, in cazul mitocondriilor, enzimele pot fi legate ‘de membrana exter, de membrana intern, multe se allt in matrix (Tabelul 1.3). Tabelul 3 Locolizarea unor enzime in mitocondrille celulolor hopatice Monoaminoaxidaza (MAO) Mombrana externa Acl-CoA sintetaza Fostolipaza A, Nucleoziddltostatkinaza ‘Spafil inve membrane ‘Adenia Kinaza ‘Membrane intern NADH dehidrogenara Gitoorom (6, ¢,€, 8, 8) Succinat dehicrogenaza Citrat sintotaza Matrix lzoclvatdehicrogenaza (ICDH) Fumaraza Glutamatdehidrogenaza Enzimele de oxidare ale acizitor grasi IL.11, ENZIMELE $I PATOLOGIA jn plasma se afl un numtir foarte mare de enzime Dependent de existenga sau inexistenja la acest nivel a substratelor corespunzitoare (in ali termeni dupa cum enzimele catalizeazX sau mu reactii fn plasma). ele se imyent in: a) Enzime plasmatice funcfionale cum sunt: lipoproteinlipaca, pseudocotinesteraza, lecitin-cotesterol aciliransferaza (LCAT), cele implicate in coagulare si fibrinoliza si altele, In aectiuni grave ale ficatului, acesta este incapabil s& sintetizeze normal proteine, inclusiv enzime, astfe} activitiile lor scad in raport cu valorile normale. 'b). Enzime plasmatice nefunetionale: teoretic, oricare enzimai celulara trebuie st fie prezenta si in plasma; numairul celor identificate este int-adevair foarte mare. Prezenja Jor in plasma se explic& prin destrucgia celular normals dar si prin permeabilizarea membranelor in cursul eforturilorfizice, scderea resurseler pentru producerea de energie si altele, La persoanele siinitoase nivelul acestor enzine este aproape constant, el reprezentind o stare stationard intre rata eliberarii din celule si inactivare. La cele mai multe dintre enzime acest nivel constant este foarte sclzat; ele au fost evidengiate prin metode extrem de sensibile, posibile de efectuat cu aparctur costisitoare, Cteva zeci de rt)enzime pot fi inst dozate in plasm cu suficientt precizie utlizand metode retativ sirple. Dintre acestea s-an selectionat un numar si mai restcins pentru dozare in scop de diagnostic; sunt enzime a vor concentrafe (activitate)creste foarte mult in cursuil destrucilor masive ale celulelor producitoare si proporjional cu grivitatea leziunilor la nivelul fesuturlor din 2are aceste enzime fac pare: inim’, ficat, mugchi scheletici stele. Un element important pentru ca enzimele plastnatice si alba valoare diagnostic’, dar side unite a eficaciii tratamentu- Ini, este timpul in care setivitatea for devine semnificat crescuti, respectiv scizutt, ‘Se exemplific& cu enzimele serice care se dozeazit in legitura cu infarctul de miocard siafectiunite hepatice. In primul caz se dozeara creatinkinaza (CK), glumatic-oxaloacetic- transaminaza (GOT) si lactatdehidrogenaza (LDH). La toate exist o crestere proportio- nal intre marimen zonei infarctate gi cresterea activittii serice. Dozarea creatinkinazei este tots! mai util pentru diagnostic deourece chiar dupa 4-6 ore se remarci 0 crestere a activitji ei iar maximul este atins dupa 18 ore (la GOT si LDH peste 24 ore). Situafia ste diametral opus in ce priveste durata de revenire a activititii acestor enzime serice In valorile bazale (normale), de aceea evolutia bolit se urméreste cel mai bine prin LOH. Pentru diagnosticul afecfiunilor hepatice se practical, alituri de alte investigagii paraclinice, dozarea activitijii a peste rece enzime plasmatice nefuncfionale. Unele reflect integritatea celular, altele sunt in legituri cu diverse procese metabolice, atele redau capacitatea de sintez a proteinelor gi acizilor nucleici si in sfagit capacitatea de excrefie. Bste recomandati dozarea intr-o anumitdiordine (nivelele 1, IL, HI gi IV’ prima insfanga, nivelul 1, se recomandi dozarea GPT (glumatic-piruvie-transaminsza), GIDH, (glutamatdchidrogenaza) gi }GT (7-glutamiltranspeptidaza), Deosebit de util pentru diagnostic ar fi si existe pentru fiecare fesut o enim extrem de specified in ser. Un caz este fosfataza acid a c&rei cresfere a activityii este in legiturt cu carcinomul de prostati, Pentru investigarea hepaticd ar fi utili: dozarca ‘activi sorbitoldchidrogenazei (SDH) sia omitin-carbaunil-tansferazei (OCT) careins nu se practica curent din cauza unor dificultafi tehnice. Difioultigi mari in investigarea par prin intermediul activityii enzimetor serice apar. in primul rind, din faptul c& cele mai multe enzime plasmatice nefunctionale a ‘clror activitale se poate determina, au provenien{a multipkt: LDH si GOT provin din inima, muschi gi ficat, CK din inima gi mugehii scheletici etc. © alti dificultate este legatii de inactivarea rapid’ in.ser a unora dintre enzime. Chiar si in cazurile complicate, prin diverse strategii, medicul si laboratorul de biochimie pot objine totusi rezultate foarte bune, Se menfioneazai determinarea simukan’t ‘A mai maltor enizime serice sicalculul unor raporturi (de exemplu, raportul De Rittis‘ntre GOTIGPT, care scade sub 1.3 in afectiuni hepatice), dozarca activitiii enzimelor pe {esuturi (recottate prin biopsie), mai rar practicata. De mare valoare sunt determintrite activitijilor izoenzimelor utilizind in acest scop procedee de separare (pe colcan’, clectroforetice) sau inhibarea cu anticorpi specifici a unora dintre izoenzimele unei enzime date. Astfel predominanfa in ser a formelor LDH, gi LDH, este un indiciu foarte ‘bun pentru infarct de miocard, in timp ce predominanfa formei LDH indick afecju hepatice. {n cazul CK, cresterea in ser nu numai a activitatii totale ci si a activi izoenzimei de tip MB este indiciu sigur de infarct de miocard (forma MB fiind de provenient aproape strict: miocaric’. Activitatea multor enzime plasmatice nefunctionale se determing in relagie cu bolile de metabolism (glucidic, lipidie si proteic). Cele mai importante dintre acestea sunt prezentate in capitolele respective. utIL 12, CLASIFICAREA $I DENUMIREA ENZIMELOR Primelor enzime descoperite fi s-au atribuit diverse denamiri: in cele rvai multe eazzuri rhumele enzimei s-a format din numele substratului prin adiiugarea sufixului -a7a; urea pentru enzima ce catalizeazat hidroliza urcei ta CO, si NH, arginazi pentru enzima care catalizeas hidroliza arginine’ ta omitina gi utes ec. Aor enzime ti s-ww atribuit denumiei particulare fra leptturl cu reactia catalizatt: pepsin’, tipsing, chimoteipsin’ Cand numgirul enzimetor cunoseute-a devenit foarte mare gi rmulat date despre structuri, coenzime, mecanism de acfiune ete.,s-a impus at introducerea ned clasificari rajionale cat si a unor denumiri bazate pe criterié chimice care si evite confuziile Acestea au fost elaborate, in anul 1961, de 0 comisie de enzimotogie a Uniunii Intemational: de Biochimie si Biologie Molecularti IUBMB) find in vigoare gi fm prezent ‘in sistemul de clasificare adoptat fiecare enzim’ este incadratd intr-o subclasti si, eventual sub-subelasi care aparfine unei clase, Clisele, subclasele, sub-subclasete. si cenzimete individuale se noteaza prin cifre despite de puncte, Sunt gase clase de enzime avand in ordine numercle si catalizdind reactiile: 1, Oxidoreductaze, catalizeazit reaclit de oxido-reducere; 2, Transferaze, catalizeazs transteruri de grupe ce conjin carbon, azot sau Fosfor; Hidroluze, catalizeaz’ scindtri de log’turi covalente cu participarea apeis 3 4, Liaze, catalizewX ruperi ale legtturilor C-C, C-S si CN; 5 Taomeran, catalizeact toate tipurite de izomerizzi, inclusiv racemizais 6. Ligaze, catalizear’ formarea de legituri intre carbon gi O, SN, cuplate cu hidroliza leghturilor macroergive. Subclasele si sub-subclasele sunt stabilite dup tipal geuptrii saw legiturii care se ‘modificd in cursul reactiei, dupa natura coenzimei si ate particularittyi. Sistemul acesta de Clasificare este deschis, orice enzim’ now descoperita putdnd fi intsodus intr-o clas, subclast $i sub-subelast, Comisia a hota cX se pot utitiza dow modalitayi de demumire pentru enzime: 4) Numele recomandat": se plstreazt (sau se atribuie) denumiri cw sufixul -a7z (slucozidazt, zahara7a, ureaza) sau se dX denumirea dup’ actiunea specific (actatdehi drogenazA, adenilatciclazi); pentru unele enzime se uiilizeazi denumirile. specifice (tripsina, pepsi b) Numele .sistematic™: acesta este coretat cu numele clase, subeclasei si sub-subelasei: cl cuprinde denumirea substratului (substratelor), tips! reacyied catalizate, coenzima, eventual alte caracteristic. Astfel fiecare enzim are un cod specific. Utilizarea numetui sislematic este obligatorie doar in situajile care reclam evitarea oricdrei ambiguity iparituri, congrese ele.). Curent se utlizeaz’i denumirle recomandate 112Clasificarea si denumirile sistematice ale enzimelor sunt redate in Tabelul TL.4. Tabelul Fragmente din tabloul vast al clasiicarii enzimelor ‘gia denumirii sistematice a acestora 1. Oxidoreductaze 1.4, Care actioneaza asupra gruparil CH — OH 4.1.4. Cu coenzima NAD" sau NADP* 4.4.1.1. Alcool: NAD"-oxidoredtotez 1.1.1.27, Lactat: NAD-oxidoreductaz’ ° 1.2. Care actioneaz asupra gruparl 1.2.1. Cu coanzima NAD" si NADP* 1.2.1.12. D-gliceraidehid-3-fosfat: NAD-oxidoreductaza 1.2.3, CuO, ea acceptor 1.2.3.2, Kenting: oxigen-oxidoteductaza 1.3. Care acjioneaz asupra legaturil CH — CH 1.3.2, Cu citoorom ca acceptor 41.4. Care acjionoazi asupra legaturl CH — NH 2 Transteraze 2.1, Care transfera fragmente de un carbon 2.1.1. Moti transtoraze 2.1.1.1, S-adenozlimetioning: L-homocistein S-metitransteraza 8.1. Care scindaaz& legatur esterice 3.1.1. Carboxiestemhidrolaze 3.1.1.8, Gileorol-oster hidrolaza 4. Liaze 4.1. are © 8. Izomeraze 5.1. Racamazo ¢ epimeraze 6. Ligaze 6.1, Care asiguri formarea logiturlor C—O 113Cap. HL VITAMINE $I COENZIME, TiL.1. GENERALITATI Vitamincle sunt o categorie de substan strict necesare animalelor superioare si care nu pot fi sintetizate in organismal lor. De aceea, vitamirele trebuie si fie procurate de aia alimentard. fn organismele superioare vitaminele nu reprezint& materiale structurale, de felul principiilor imediate (proteine, glucide, lipide) si nu au valoare energetic’ dar implinese roluri funcjionale importante, Intr-adevar, majoritatea vitaminelor - sau derivati ai lor imediayi - sunt constitenti coenzimatici, participind la multiple si variate reac motabolice, Pentru acest motiv, in capitolul de fag se vor descrie si ilustra asemenea interventi Degi pentru implinirea tuturor roluritor functionale ale vitaminelor organismul omului ‘are nevoie de cantitiji foarte mici (citeva miligrame sau chiar micrograme pe zi), ratia alimentard trebuie si le procure regulat. Altfel, ajung si se declanseze anumite stiri patologice specifice, numite avitaminoze, Este de remarcat c& exist si vitamine distincte din punct de vedere chimic - dar fnrudite structural - care implinese aceleasi funcyii si a ctor caren(% determin’ aceeasi avitaminozil. Acestea se numesc vitamere. Spre exemplu, diverse vitamine E (tocoferoli) sunt earacterizaie, una in raport cu alta, drept vitamere; astfel inedt in loc de vitaminele E se poate spune gi vitamerele E. in studiul vitaminelor se intdineste uncori si terme: de antivitamind (Sau antivita- mine). Antivitamineie sunt substanje cu acfiune antagonista vitaminelor si care produc efectele avitaminozelor respective. in principiu, fiecare vitamin’ poate avea una sau mai molte antivitamine. 11.2, CLASIFICAREA VITAMINELOR, Vitaminele au structuri chimice foarte variate. D:n aceasta cauzl, ele nu s-au Clasificat conform structurii ci s-a fixat drept criteriu de clasificare 0 insusire fizicd si anume, solubilitatea, Din punct de vedere al solubilitgi, vitaminele s-au grupat in dow’ categorii: vitamnine hidrosolubite (cele cu moiecule polare, soluble in api) si vitamine liposolubile (cele cu molecule apolare, solubile in grisimi), Prima categorie cuprinde vitaminele din ‘complexul B (vitamina By, vitamina B,, vitamina B,, vitamina PP, vitamina B,,, acidul folic, biotina, acidul pantotenic) si vitamina C. A dota categorie, cea a vitaminelor tiposolubile, cuprinde: vitamina A, vitamina D, vitamina E si vitamina K, 14ML3. VITAMINELE HIDROSOLUBILE $1 ROLURILE LOR COENZIMATICE HI, 3.1, COMPLEXUL B »Complexul B* este un grup de cel pujin 8 vitamine hidrosolubite (mengionate clasificare) si care se gsese impreundi in naturd, fiind int-o stranst inter-reki funcjionaki, ‘Toate vitaminele din complexul B sunt cofsctori tn diverse reactii enzimatice; in special, ele joact rol de coenzime in cele mai importante react metabotice. Acest ol este ilustrat - pentru fiecare vitamin’ - in cele ce urmeaz’ Vitamina B, (tiamina) si coenzima tiaminpirofosfat. Vitamina B,, sau tiamina, cuprinde in motecula sa dow nucle heterociclice (pirimidinic si tiazolic). Ambele nuclee sunt substitute in anumite pozitii si sunt unite cH, + cH, ra 5 # 2,4 Re: te 8 ne Sy, S87 cH-cHpon Fig. ll, - Viana B, (iamina) in organism - la nivelul ficatului, rinichiului si inimii — molecula vitaminei B, este combinati cu resturi de acid fosforic si proteine specifice (in prezenta ionilor Mn") pentru a da nastere lu coenzime si enzime active, partcipante la metabolismul slucidels. Inr-adevar, in celulele diverselor organe si esuluri tamina se afl sub forma de ester pirofostori, tiaminpirofostat (TPP). EI reaulit din reacfa tiaminei cw ATP: Tiamina + ATP. —> ‘TPP + AMP Accasti reactie este c ~ in creer si ficat izati de enzima tiamiin difosfotransferaza, aflatt - in special ¥ ay ot, 2 @ new NH, A, Chir Ho-P-o-P Fig. 2. - Tiarrinpirofostatul (TPP) Tiaminpirofosfatal este coenzimd in reactii enzimatice de transfer ale unei unitifi de aldchida activa. Asemenea transferuri au loc in reacfii de decarboxitare oxidativa a o- ceto-acizilor (piruvat, o-cetoglutarat) si in reactii de transcetolare. Ambele tipuri de reac{ii sunt intlnte in metabolismal glucidic, In aceste reacfii de transfer rolul propriuis al coenzimei TPP este de a servi la eliberarea din anumite molecule a unititior 1saldchidice care urmeazi si fie transferate pe alte molecu. Se ilustreazit aici interventia tiaminpirofosfatului in decarboxilarea acidutui piruvic si formarea de acetaldehidx( in vitro). Datorit’i pozitiei sale in ciclul tiazotic din tiaminpirofosfat C,’ este reactiv; in urma ionizirit H legat de el devine H’ iar C,’ carbanion. Acest carbanion exercit’ un atac rnucleofil asupra C, din molecula acidului piruvic, Ca urmare, rezulti un compus de adijie al acidului piruvic fa tiaminpirofosfat si care se decarboxilear’, formandu-se hidroxiotil — tiaminpirofosfat. Ulterior, acesta elibereazt molecula de acetaldehidti (rezultatt din hidroxietilul format prin decarboxitarea acidului piruvie) gi regenereaz ae woos on 5 ca wea zl i piruvle fin vito) {In organism, accasth reactie - cheie de decarboxilare < acidolui piruvic este catalizati ‘de un complex maltienzimatic, al pinuvat dehidrogenaze., in care - pe lang’ tiaminpizo- fosfat ~ participa ined patru cocnzime: acidul lipoic, icetil-CoA, NAD* si FAD. Lit studint metabolismului glucidic se prezint{ mecanismul intregii reactii complexe, ilustrindu-se in totalitate transferul acetaldehidei rezultte din decarboxilarea acidul piravic. Decarboxilarea oxidativa a d-cetoglutaratului, precum si a derivatilor 0 - cetocarboxi- lici proveni{i din aminoacizi cu catend ramificata, se realizewzat prinu-un mecanism absolut similar celui de decarboxilare a acidului pinavie; deci tot cu participarea ‘tiaminpirofosfatutui. ‘Tindnd seama de rolul cocnzimei tiaminpirofosfat in matabolismul glucidic, se injelege 8 in carenfa vitaminei B, este stanjenit - sau chiar fatrerupt ~ acest proces atat de important din punct de vedere energetic, Acidul piravic (piruvatul) ajunge astfel st se acumulere - ca atare ~ in organism, ceea ce atrage o serie de manifestari patologice resimfite, in special, Ja nivetul sistemului nerves. Este de remarcat c& in deficienja de tiamind, pe Magi acidal piravie ajung sii se acumuleze in organism si alfe substanje (-cetoacizi saa pentoze) care in mod normal particip Ia reactii de decarboxilare sau transcetolare prin interventia coenzimei tiaminpirofosfat. Concentrarea acestor substanje in cantityi mai mari decdt cele normale antrencazi - de asemenea - diverse tulburiri metabolice. 116Vitamina B, (riboflavin) si coenzimele flavinice Vitaming B, se mai numeste riboflavind, datoritt structurii sale de flavind (pigment galben) cu radical ribitil, provenit din tibitol (potialcoolul corespunziitor ribozei). Acest radical este substtuit in pozitia 9 a heterocicluiui izoaloxazinic din molecuta riboflavinei, Jn pozifiile 6 gi 7 ale aceluiag heteroviclu sunt substituiti radicali metil: oH On On CH,-CH-CH CH-CH.-OH t He, et y He! we 3 Fig, t.4. - Vkamina B, (ibofiavina) in organism riboflavina formeazi cu ATP-ul doud flavinnucleatide numite: flavinme- nonucleotid (FMN) si flavinadenindinucleotid (FAD). Structusile lor chimice sunt | urméoarele: It OH OH OH (CH,~CH- CH CH CH,-O-PO,H, “ox we i Fig. 11.5. Flavinmononucteotidul (FMIN) f NH, o1-———— | GH-on A ie gy-o# Nw 2 gion a 8 CH; O-P-0-P-o-CH, He i D> oH OW I Fig. 1.6, - Flavinadenincinucleotdul (FAD) 47Ambeleflayinnucleotide (FMN si FAD) sunt coenzime care fie parte din sistem enzimatice implicate in diverse procese de oxidoreduoere din organism. Datortl structurii coenzimelor respective, aceste enzime se mai numesc flavoenzine sau flazproteine, In stuctura lor se remarci. 0 legituri.siransi, dar necovalenti, intre coenzim’ si partea proteict, De ‘semenca, majoriatea flavoproteinelor congin mete (Mo, Fe) cu rol de cofactor afonali. De aveea, enzimele corespunztioare sunt cunoscuts si sub numele de metaloflavoproteine. in ceaclte de oxidoreducere catalzate de flavoproteinee active, participantele dirccte la procesele redox sunt tocmai coenzimele constituente, FMN sau FAD. Intr-adevar, Ciclul lor ioaloxazinie poate suferi reduceri reversible pria fixarea femporari la atom de azot din poziile 1 si 10 a doi atomi de hidrogen preluai de la substratele (SH,) ca care intr in reacte gi care se oxideaz8 (S,.). R i row z ie ae’ a Fiat au FAD FANE sou FADH Fig. l.7. - Reducerea nuciaulul izcaloxazinic in flavin-nucleotide ‘in acest mod FIN sau BAD tree din formele lor oxidate in forriele reduse, FMNH, sau FADH,. Ca in orice reactie de oxidoreductic (dehidrogenare - fhidrogenare) si in reactia anterioaré participt dout sisteme redox: SHS,, si FMNFMNH,. Dupa cum se stic, fiecare sistem redox se caracterizeaz’ prinir-un potenfial elecitic standard, Valorile ‘acestor potengiale pentru sistemele FMN/FMNH, si FAD/FADH, servese la precizarea Jocului for de interventie in siral transportorilor de hidrogen si electros in studiul_metabolismelor se vor intalni numeroas: reactii de oxidoreducere (dehidrogenare - hidrogenare) catalizate de enzime care admit drept coenzime FMN sau FAD, Printre aceste oxidoreductaze foarte eficiente sun:: 0 — aminoacid oxidaza participant fa procesul de dezaminare a aminoacizilor, aldehid dehidrogenaza care catalizeazi degradarea aldehidelor, xantin oxidaza implicatt in degradarea purinelor, suecinat dehidrogenaza din ciclul acidulvi citric, flavoproteina transporioare de electroni participants Ia oxidarea acizilor grasi, dihidrolipoil dehidrogenaza implicatd fn decarboxilarea oxidativ’ a piruvatului gi 0. — cetoglutacatului, Se infelege, in aceste ccondifi, c&t de important este in organism rolul metabolis al coenzimelor flavinice. $i implicit, al vitaminei B, constituente, Vitamina PP (niacina) si coenzimele nicotinamidice Vitamina PP este vitamina antipelagroast (“pellagra preventiv factor"). Numele de niacing corespunde constitutiei sale chimice. Intr-adevar, din punct de vedere chimic, antipelagroasi o are si amida acidului nicotinic, nicotinamida sau niacinamida (Fig. 11.8). Prin ‘urmare, ambele substanfe (niacina si nicotinamida) sunt vitamerele vitaminei PP. 118Fig. 11.8. - Niacina si niacinamida ono" Acid nicotine Nicotinamide (niaeina} (rvacinarmids) Principalut rol metabolic al vitaminei PP reiese din faptul c’ ea intr’ in structura a doua toenzime nicotinamidice care pasticiph kx procese de oxidoreducere. Aveste coensime ‘sunt: nicotinamidadenin dinucleotid (NAD) si nicotinamidadenin dinacleotidfostat (NADP): WH, Su 2 Ne & Ge O-P-o-P footw, on oH On on Fig. IL9, - Niotinarridaderin dnuclaotid (NAD") NH, 2o ” LK Sua, WN’ e 9 Oo ¢ Zt CHro-k-0-8-0-CH, ° +0H HO = OHO iy —%, ‘OH OPOM, Fig, 40. - Nicotinamidaderin dinuctecttostat (NADP) Ca si coonzimele flavinice, coenzimele nicotinamidice fac parte din constitujia unor enzime implicate in reactii redox de hidrogenare-dehidrogenare. Aceast’ capacitate a ‘nucleotidelor pridinice so datoreazit insisi nucleului piridinic pe care-l conjin si la nivelut clruia are loc fixarea hidrogenului de la substat (Fig. 1.11). $i in cazul coenzimelor nicotinamidice sistemele lor redox participante la reacfile de hidrogenare - dehidrogenare, NAD" /NADE(+H" si NADP*/NADPH+H", se caracterizeaz jin potenjiale electrice standard, cu valori bine determinate, care servese la precizarea Jocului ocupat de cle in Langu respirator. Spre deasebire de coenzimele flavinice, la conezimele nicotinamidice legiiurile Jor cu componentele proteice din enzimele respective sunt foarte slabe, De aceea, aceste 119Fig. ll, - Reducsrea nuciouli’ pridinic in coenzimela nicotinamidice coenzime pot trece usor pe mai multe proteine enzimatice (apocnzime). Este de remarcat ci unele enzime devin active numa cind functioneaz cu coonzima NAD", altele numai cu coenzima NADP", iar altele admit drept coenzima stil NAD* cat si NADP. In gonere, dehidrogenarete care admit drept coenzim’s NAD" catalizeazi reactii de oxidoreducere din calabolismul oxidativ; spre exemplu, uncle reacfii din cictul acidulai citic, Pe de alti parte, dehidrogenazele i reductazele pordente de NADP" particip’ la reacfile din calea pentozofostatilor si ta cele care au loc in procesul de biosinteztt a acizilor grasi. Prin urmare, ca si coenzimele avinice, coenzimele nicotinamidice ~ mpreun’ cu vitamina PP constituent - sunt compagi cu rol melsbolic important. Vitomina B, (piridoxina) si coenzimele derivate Numele de piridoxing corespunde constitutiei chimice a vitaminei By deoarece ea este vn alcool eu nucleu piridinic, Acest nuclen este substtuit in patru pozifi astfel: in 2 cu ‘mol, in 3 cu hidroxil, iar in 4 gi 5 cu cite un grup hidroximetil (Pig, [11 12.). Piridoxina ~ aflati in produse vegetale sau animale - este insofité de douk vitamere Innudite structural: piridoxatul si piridoxamina, respectiv aldehida si amina (in pozitia 4) corespunzind piridoxine:: GHroH Ho cHeNH, HO AR clon HO. cHyon HO cH;on Py Kio He ON Ho ON ne ON Phidoxins Phos! Pridoxamins Fig. i142. - Structure chimice ale olor tei eenpus priinicl 8 actvitate de vitamina B, In citoptasms aceste wei vitamere devin substrate fai de enzime piridosal kinazt care eaalizeael reaofit de osforilare cu A'TP-l pena ficar. Ca urmave, ele Wee fn fosforici corespunziitori (la grupul de alcool primar din pozijia 5). Dintre acesti idoxalfosfal i pirdoxaminfosttal sunt coenzime participant la diverse each alice: n special la tansainaea, doctrborilaeasvanssulurarea - animacion Tn procesul wansaminri, pirdoxalfostaul gpuridoxaminfostatl intrvin pentru transformarea ~ dupi caz = ‘atl aminoacid in ceoacid 9 invers 120Ho CHAN, Ho cHr0-PO, HO yun Ww HC Hye Fig, W.12, - Piidoxalfostatl I pitidoxamintostatul Aminotranstoracs (transaminazd) Rew CH COOH + R~C-COOH am OOH + R= CH-COOH Ne. ° NH, Fig. lIL14. - Reactia generala de transaminare Mecanismut (de ping-pong} reacfiei de transaminare poate fi urmait usor dac’ se iau fn considerajie notafile: E — CHO = aminotransferaza cu coenzim’ piridoxalfosfat E — CH.NA, = aminotransferaza cu coencima pitidoxaminfostat si dact se fine seama de intervengia saccesivt a celor dowk coenzime in reac reversibile: aeptcate + once 2422 mycnnec-e me oon doow “act seni ; ee pencryne LH nye coon + e-chg-me zoow 3 bach Soy Regc00n + echp-at 2M yen cO0H mn 3 ee : re-cn-coontt ne cncoon +£-cH0 suis Fig. 1.48. - Mecaniemul tansaminéri 121le de decarboxilare a aminoacizilor, piridocalfosfatul joach rol de coenzima tot prin formare de baze Schiff intermediare. Coenzima piridoxalfosfat participa sé In procesul de trans-sulfurare; spre exempla, ta reagia metioninei (Sub formi de S-adenozil metiorina) cu serina’ din care rezxiti cisteina (veri metabolismal acestor aminoacizi, In sfaixgit, piridoxalfosfarul participa’ la mecanismmul de acfiune at fosforilazei implicat& in scindarea glicogenului (vezi ,glicogenoliza"). Acidul pantotenic si coenzima A Acidul pantotenic poartl acest nume (in greceste, pan = fot, peste tot) pentru ct este foarte mult rispindit in fesuturile vegetale si animale. Din punet de vedere structural, acidul pantotenic este produsul condensirii acidului 2.4 - dihidroxi - 3,3° - dimetil- butisic (numit si acid pantoic) cu B - alanina: cH, HO~CHly-G~ CH= CO~ N= CHiy CHHy~ COOH cH, OH ‘Asld pantoie Belin : Fig. 1.48, - Acidul pantotenic ‘in majoritatea organelor acidul pantotenic este fosforilat pe scama ATP-ului, sub actiunea unei kinaze specifice. Produsul rezultat este antrenat ulterior intr-o serie de alte patru reacfii enzimatice, succesive, conduednd fa formarea coenzimei A: we Hh ee ee ek in ottro-f-0-B-o-cnpe~ot-co-mi-ch-cn-do Gres ov on oon i POH, Fig. 1.47, - Coerizima A Cocnzima A particip’ a numeroase procese binchimice fundamentale, atit de biosintezi (spre exempln, biosinteza acizilor gragi, a colesterolului), cat gi de degradare (Gn special 1a degradarea oxidativa a catenelor hidroarbonate din diversi cataboliti). Posibilitatea coenzimei A de a participa In reactii numeroase si variate se datoreazi faptului c& gruparea — SH din molecula sa poate forma legituri tiolesterice, macroergice. Spre exemplu, activarea acizilor grasi (premergitoare degradirii oxidative sau biosintezei lor) are loc conform reactiei: COOH + CoA—SH4 ATP——- R— CO ~ SCOA + AMP +PP, 122Se observa ci in reacie 6-4 prescurtat structura coenzimei A libere sub forma Coa = SH pentru a se pune in evidenf’ grupul reactiv, respectiy - SH. Acesta este modul obignuit de a se nots forma liberi a coenzimei A. De asemenea, din reacfie se observ’ cc legitura macroergica, C — S (aflatt in tiolesterul acidului gras) s-a format prin desfacerea unei legaturi macroergice din ATP (scindat in AMP gi PP). ‘Un compus macroergic important in constitujia cliruia intel coenzima A este acetil — CoA, CH, — CO ~ SCoA, intdinit mult in studiul metabotismelor; mai ales, in cadrul metabotismului gluciic gi lipidic. Bi 18 si rolul ei coenzimati Biotina este vitaminf pentru om si animalele superioare iar pentru drojdii, ciupersi si bavterii este factor de erestere In constitutia moleculei de bioting intr’ ciclul hidrogenat al imidazolului condenset cu ciclut hidrogenat al tiofenului. La acesta din rma, in pozifia cx fapt de atommul de sul, se afl atagat (prin substituire) radicalul acitalui valerianic: ° aN HH WH el HG. cH Fig, 1.18 - Blotina a gH (oH), coon OF Jn orgmisn biotna ‘mplinsste rlur importante, paicipind In mod constant la metabo lipidelor-formarea gi degrdxca oxide’ 2 aciilr gra - precum gla metabolism gixcidelor ‘arboxiaea acid pinwvie pouty formarea acl oxalaced(prezent in cil aciduli citi). De asemenea, biti itrvne gin ale ea importante care novesitl lixarea dioxidului de carbon ‘pe uni metabo. in toate aceste reach biotin funcfionew cu rol de coonzima. In calitatea sa de coenzimti a carboxilazelor, biotina ia parte la reactii de carboulare care aparqin unor efi metabolice bine precizate: Tabelut tJ Enzime care funetioneazs cu evenzima biotin Bazina Rolul metabolic Piravat earbonliaza ‘rima reacie pe calea care conduce la wansformarea precursorlor- rez din unit cu 3 atom de carboa= In glocazd(ghuconengene2) Procurd oxalacetat pent cilul acdulu civic “Acel- CoA ~ carboxilaza Procuri unitii cu do! atomi de carbon - de acca 3 sintoza aczilor grasi penta formare de malonil - Cod. "Transform propioaatl fa succinat care intr apoi fn cll cid ie B = Mel -erotonil - CoA - earboxilaza | Intervine in eatabolismal leucine’ gi al unor compost isoprenoidci 123,Se ilustreaat aici rotal coenzimatic al biotinel in carboxilarca acidului piruvic, Reactia general este CH,—CO—COOH+ co, ——» Hoos — cH, — CO — COOH acid plruvic dd oxalacetio Trebuie subliniatfaptul ct le reacte dioxidl de carbon perticip numai sub forminctivat, ‘adic unit cu biotina. In aceasti etapa reacfici iau parte: HCO, ATP, Mg” si acetl - CoA (cu rol de efector alostric), Utero, grupul carbosil activat este tansferat la acid piruvic a & OH CH = MH COOH COOH dy — cy — i I £0 + co—sco +8 go “cH, — cH — ne 1 1 NCH, — CH — NH boo OH She oon Caroxibion- Acid Acid Biotn rain faiuvie oxatacetle —— snaimd e ® BH Ch — ih, AN oH = ah, s porncox sare —» S| 0 +a0eF; “CH, —CH — NH” NOH, ~ CH — No coo- Carboribiotnas Fig. I.10.- Mecanismulearboxtark acu pnw ‘Vitamina B,, (cianocobalamina) si rolul et coenzimatic. Vitamina B,, Implineste rol de vitamin’ antiperniciosst pentru om gi este factor de crestere pentu microorganisme. Poartd indicele 12 fin} eonsiderata al 12-lea produs izolat din complexul B. Numele de .cianocobalaming* este datorat consttatiet sale chimice deoarece congine in moleculé © grupare cian sian ion de cobalt (Fig. IL20). Exist si alle substante cw acjiune de vitamin B,, (vitamere) care. au siructuri asemnainlonre cianocobalaminei. Ble se deosebese de aceasta prin faptul et in focal grupisii —~ CN cuprind.o alti grupare funefionala electronegativa (nitro, hidsoxil), radicalul metil sau chiar un rest de deoxiadenezina In ficat, la omul stindtos, se gisese obignuit iei compusi cobalaminici: metil- hidroxi- si deoxiadenczil - cobslamina. Acesti compusi - sau vitanina B,, ca aire - iaw parte, cu Fol de costizime, in procese metabolice esenjiale din organism. In special, ele sunt coenzime penta uncle transmetilize gi anumite izomeraze: (mutaze). 124st (cri cont, be _1OHG}e— CON Fig, 1.20. - Vitamina B., (clancabalamina) Ryvarlaza dand diverse vhainere ale Viaminel 8, R= CN'n clancobalamina, Fi ~ OH In hieoxleobalartina, doosladeroz! in 8 — deoxiadenazicabslamina gi A = OH, im metlcobalamin’, ‘Se exemplifict aici, n primul rand, participarea metitcobalaminei, in calitate de coenzim’ unei transferaze, la reacpia de transformare « homocisteinei in metionin’ in al doilea rind, se pune in evidengi mecanismul de interventie al mutazelor si se ilustreazt participirea deoxiadenozilcobaluminei - cu not de coenzima - in reactia de transformare a L —— metil — smalonil — CoA in suecinil — Cos, qe i i ee fie oe fe HE Nig Mo- Hg flat 6 HEM Nie boon boos ‘Homocistein ~ rata Fig. 11.21. - Rolut coenzimatic al metloobalaminei 1251) Metilarea homocistcinet pentru transformarea acesteia in metioninft are loc in citoplasm’ wilizindu-se N, — metiltetrabidrofolatu! (Me—H,—folat) ca donor de meti. Enzima catalizanti este homocistein — metiltransferaze care admite drep! coenzim’ specific metilcobatarina. “ht aceasti reacjic meilcobalamina igi insugesle temporar un grup metil de la donorul Mo—H,—Polat set transferi homocisteinei, generindu-se astfel_metionina. Sernificatia etabolict a acestei reacii este dubli: se economiseste metionina iar tctrahidrofolatul ‘devine disponibil pentru a putea partic‘pa la sinteza de purine, pirimidine si acizi nucleici. 2) Taomierjzarea catalizaté de mutaze are loc conform reacfiei: t map Fig, 1.22. - Mecanismul intervential mutazelor ‘in cazul L — metil — malonil — CoA izomerizarea ia succinil CoA decurge conform reachei: ots Hq coon ¥G¢-cooH HCH G-s00a G-SCoA ° Deoxiadeno- ° 2ilcobalamina L-Metilmatonil- CoA Succinil - CoA Mutazd Fig. 1,23, - Rolul coenzimatic al ‘deoxiadenozileobalamine’ find catalizati de enzima L — metilmalonil — CoA mutaza care funcfioneaztt cu coenzima sa specific’, deoxiadenozilcobalamina. Este de remaxcat cf deficienja de vitamin’ B,, se poate resimi pana la nivelul acestor reacii, Astiel, in primul caz, homocisteina rimane nemetiata si ajunge s& se elimine prin turing (homocistinurie) iar in al doilea caz, pentru acclag motiv, acidal L — metil — malonic se climind tot prin urina (acidurie metilmalonicd, Exist si patru (ulburisi metabolice ereditare caracterizate prin incapacitatea organismului de a folosi vitamina B,. cu rol de coenzima in reacfi de felul celor ilustrate rai inainte, in douil din aceste maladii ereditare este afectat& numai formarea (sinteza) deoxiadenozilcobalaminei iar in celelalte dow’ s-a pus in evidenfd incapacitatea de constitute fie a deoxiadenozilcobalaminei, fie a metitcobalaminei, Acidul folic si coenzimete derivate Numele de acid folic este generic: el corespunde mai multor vitamere ale sale. Ca gi alte vitamine din complexul B, acidul folic este vitamin’ pentru organismele superioare gi factor de crestere pentru microorganisme. Denumirea id folic” se datoreaz® faptului Ca prima substangé descoperiti din acest grup de vitamine a fost izolatt din frunze (in lafineste fol) de spanac gi s-a dovedit c& are caracter acid. In structura molecular a acizilor folici se afl condensate tret sunstanfe: un derivat tcisubstituit al hterociclului numit preridind, acidul p — amninobenzoie si acidul glutamic: 126on , 00H € A Wik -c0-mi-b b ” (et) ia bh nw SNOW L coo 2-aming = hironh ‘2d p amino benzale ald glare 6: met! peviding Fig. 1.24, - Acidut folie (ptorcilmanoglutarnat) Numele de ,pleroilmonoglutamat" esie in legiturt cu structura chimic’ a acidului folic, deoarece compusul rezultat din condensarea 2— anino — 4 —hidroxi — 6 netil — pleridinei cu acidul p —- aminobenzoic se numeste acid pteroie si acesta este condensat -Ia rindal siu - cu un singur rest de acid glutamic. Se cunose inst alfi doi acizi eroilpentaglutamatul (cu cinci resturi de acid ghutsmic)aflat in ficatul anima‘elor $i pleroilheptaglutamatul (su gapte resturi de acid glutamic) extras din plante. fa acesti acizi folic resturle de acid glutamic sunt condensate intre ele tntr-un mod special (neobignuid). Intradevar, fa flecare condensare a parte gruparea carboxil din poziia Y ‘unui rest si gruparea amino a altui rest (urmatorul) de acid glutamic. Cel mai important rol pe care-1 implineste in organism acidul folie este acela de transportor al unor entititi cuprinz’nd céte un atom de carbon si care sunt folosite in multiple biosinteze. insi, pentru a putea indeplini aceasta funcfie, acidul folic este — prealabil — hidrogenat in compusal H, — folat, sub acjiunea folat — reductazelor care ulilizeazi ca donor de. hidrogen NADPH+H". Reducerea are loc 1a nivelul dubietor loghtur 5.6 $i7-8 din muclel pteidinic al acidului folic propriv-zis (pteroilmonoghutamat): ony ot Be ; by (6H) AN N coor Fig. 1.25. - Acidultetrahidrofolc (FH, sau THFA) in calitatea sa de coenaim’ in procese enzimatice de transfer, acidul tettahidrofoti participt la trecerea grupirilor cu un carbon: metil (—CH,), metilen ( >CHL), fermil (CHO), formimino (—CH = NH), de la un metabolit Ia altul. Spre exemplu, transferul ‘grupului cu un carbon de pe serind pe homovistein’ cu formare de metionina are loc conform reactilor din fig. 11.26. 1274 how t NS CHpNH wees GHANA, + on-wa, cop or 7 A gm | W ” i aoe Fig Grcins NIN 10- motion -FH4 N5,N10. metilon- FH4+NADH +H toms N5~ metil- FH 4* NAD* NS, -matil- FHg+ homocistein’ —= FH 4+ metionin Fig.1126, - Partiiparea acidutul terahidofoie, cu rol eoenzimatie la formarea metioninel Dupa cum s-a aritat Ia vitamina B,, ultima reactie din Fig. 11.26 are Joc cu participarea coenzimatic& a cobataminet, pentru transferul grapului — CH, (Fig. 11.20). N,N" — metilen HP, participant la reacfie are rol coenzimatic si in cedarea unui grup metif deoxiuridilatului pentru a-l transforma in deoxitimiditat: XM Ser i ae re Te ins) TE oF & OW ” (2-Dazoxiuriditat i a neuen Cee 2Deaoxitimidiiat ames ‘ais “a Fig. 1127, - Rotul coonzimatie al aciduultetrahidrofol la formarea deoxtimicilatuluh Reachia aceasta prezintt un interes deosebit caici deoxitimidilatal, astfet format, este precursor implicat in sinteza ADN-ului. ‘Formiminogiutomatl, un catabolit al histidine, taser grupul sta imino ta Hy — folat si rerult N’ — formimino — H, — folatul IL, 3.2. VITAMINA C (ACIDUL ASCORBIC) Vitamina C poartd gi mumele de acid ascorbic (a - fri, scorbic = ridacina cuvantalt scorbut) deoarece este 0 substang’ acid (acid organic) sé vindec’ boala numitt scorbut ‘Structura molcculei de acid ascorbic este inruditd cucea a hexozelor. De fapt, el poate fi considerat drept 7 - lactona unui acid hexuronic, numit acid L - gulonic, in molecula mai sunt cuprinse si patra grupari - OH: dou alcoolics (la C; $i C9) si dou enolice (la Cy si C). Atomul de carbon Cs are contiguratie sting. 128Prin indepairtarea atomilor de hidrogen din cele dowk grupari enolice se objine acidul dehidroascorbic, Ambele forme (acid ascorbic, acid dehidroascorbic) devin intercorver- tibile prin hidrogenare - dehidrogenare si sunt fiiologic active. Strcturile lar chimice sunt ‘rezentate in Fig, 10.28, ail CHg-OH Acid L- ascorbic Acid L- dehidroascorbie Fig. 1.28. - Acicul L-ascorbio 1 acidul L-dahicroascorbic Ca atare sau sub form oxidat, vitamina C particips Ja reacjii multiple pe care le suferd in organism diverse categorii de compusi importangi din punct de vedere biochimic: aminoacizi, nucleotide, hormoni, vitamine, coenzime, ioni metalic. ‘Majoritatea reactilor care au loc cu participarea acidului ascorbic (forma redusa) sunt hhidroniliri in care este implicat gi oxigen molecular: FH + Ac. ascorbic +0, > R— OH + Ac. dehidroascorble + H,0 ‘Se cunose insi si hidroxiltiri care se fac pe seama acidului dehidroascorbic, in aceste cazuri, ‘dtl cu hidroxilarea alteisubstanje are loc si reducerea forme oxidate a acidului ascorbic. ‘Ale ori, reatile a care paticipt acidal ascorbic (forma redust) constau numal in reducer Jn abelui TZ. se mengineazi cdteva reacii metabolice in care intervine acidul ascorbic (forma ‘edusi sau oxidat), precizindy.se totoldat gi tipul de reatie corespunzltor Tabolui 2 ccare participa acidul ascorbic Freacfia metabolica Tiaul de veacyie shined 172 0, —>0 Reaucere Cttocrom afc) Fe > Citrocrom ajo) Fe Reducers Methemogiobina »Hemoglobina —-Reducere Cupertopecen sola Aci tole —> ci tovahistotole ducer | * Prolina —>hidroxiprtina “Unis —hiceoniana =) Hiontaro | Triptoten —>5 -hidroxtiotofan __Oxidare cu participarea acidului dehidroascorbic * React importante In biosinteza colagenulul 129Pe Ling reactile menyionate fw tabelul precedeat,acidul ascorbic intervine si in diverse alle reac de oxidoreducere in care Funct oneazat cuplat cu glutationil sau coencimele nicotinamidice si Mavinice, Un rol important i ate acidal ascorbic in Toc 0's ROOH, Uhterior, radicalul liber fenoxi format din tocaferol reacjioneaza cur un alt peroxit liber: Toc 0's ROO’ ~——> ROOH « produs de osidare fara radical ber Acest produs fii radical liber are structura din Big, 11136. cH, cH, meres Bye OOO nolgs La HP \ Fig. l.36, - Predusul de oxidare al e-tovoterolutl ch, cH-ch, cH, Dupa conjugarea sa cu. acidul glucuronic, produsul,¢ oxidare al tocoferolului este ‘excreta prin bila -intestin, Actiunea antioxidanta a tovoferolifor este apreciabiltsieficient la concentra ridicate ale oxigenului. Datoritt acestui fapt, tocoferolii au tendinfa si se concentreze in acele siructurilipidice care ~ in genere ~ sunt expuse la prcsiuni ridicate de oxigen; spre -xomplu, in membrana eritrocitard sin membranele arborelui respirator. Un alt fapt demn de semnalat in legtturt cu acjiunea saioxidantt a tocoferolului este conlucrarea sa cu seleniul in acelas scop. Iny-adevar, in calitate de component af sistemului glutaion peroxidazei- seleniu dependent, seleniul participa sie Ia prevenirea sctiunii distructive a peroxizlor, altturi de vitamin E. Pe de altd parte, asa cum s-a specificat Ia vitamina A, tocoferolul poate fi intovirsit fn activitatea sa antioxidants de B - caroten, cu acfiune sinergic& de acelas tip. 1144, VITAMINA K Vitamina K poartt acest indicator deoarece este necesard congulitii (Koagulation’s Vitamin). Pentru acest motiv i se mai spune si vitamina antihemoragica. Intr-adevir, carenfa vitaminei K determin’ predispozii la hemoragié datorate prelungirié timpului de coagulare a singelui. 136oH, cA, ci (on-cHed-cH),-H é Menaiona (amine) Menachinona wtamina Ks 6, 7,5009) ne OF Ra ot, cH we ee ctort=d-cHl-(CH,-Ch,- br-chJ-H 5 one OK F ilochinona (vitemina K,) Sa Menadiol-altostatu de sodiy Fig. .97, - Structure vitarinelor K naturale si de sintez& Ca gicelelate vitamine liposolubile,vitamina K are mai multe vitamere cu stuctur chimice asemfindtowe (Fig, 37). In primal rind, exist dow’ vitamine K naturale importante: vitamina ,, izolati din vegetale gi vitaminea K,, izolat din tesuturt animale s| bacteri intestnale (care i capacitatea de a 0 sinetiza). De asemenea, cole, constituent al membranelor lipidice din luacitul Koch, are gi el activitate de vitamin K. Aldturi de acestea, exist mai multi produsi de sintezifolosf in erapeutic’ si care au constitu chimice asemndvoae ia activity de vitamin K cel putin egale cu cele ale produsilor natu. fn aceast categorie intr menadliona si unit derivagi functional ai sii (Fig.37). ‘n consttusia lor molecular, viamiele K naturale cuprind nucleul p ~ naftochinonei substituit in pozijia 2 cu un adical metil iar th povitia 3 cu un radical poltizoprenoidic Produgii de sintezit nu conjin in molecalele for ralicali polizzoprenoidici Vitamina K din alimtentele ingerate este absorbitt la nivelul jejunului gi acest proces depinde de absorbjia normald a lipidelor. Intradevar, cea mai frecventi deficienta de vilamindi K se datorcavai malabsorbjiei grisimilor care - ta rlindul ei - este asoviatt cu disfunoyia panereaticg, obstruct biliare, atrofierea muconsei intestinale sau altor diverse cauze de steatoree, Dupi absorbyie, sub acfiunea bile, vitaminele K naturale ~ impreuntt ca lipid - tree pe eale limfaticd in singe care fe duce la ficat, Vitaminele K de sintezt tree direct in torentul sangvin (find hidrosolubile), Ficatul este principalul organ de epozitare temporart a vitaminelor K naturale. Vitaminele K de sintez4i nu se acumaleaz’ {in ficat; excesul lor se climin& prin urinal, sub forma de glucurono-conjugali ‘Cea mai important funcfie a vitaminet K in organism este impticarea ei in procesal coagultsii, Dupa cum se sti, la formarea fibrine’ participa protrombina iar Ia biosinteza prorombinei intervine vitamina K. Cercetiri relativ recente av demonstrat ei aceasta vitamin’ nu este implicati numai in biosinteza protrombinei (factorul 11) dar gi in cea a tor Factori de congulare (VE, IX, X), Tofi acesti factori ai conguliri sunt biosintetinayi 137altor factori de coagutare (VIL, IX, X). Tofi acesti factori ai coagularii sunt biosintetiza {in ficat, sub forma unor precursor’ inactivi care devin aiologic - activi prin interventia vitaminei K. De fapt, ulterior procesului de traducere a mesajului ARNm in secventa ‘aminoacizilor din proteinele specifice - care constituie factorii de coagulare - intervine vitamina K, Ea ajutt Ia modificarea resturilor de acid glutamic in resturi de acid »y ~ ccarboxighutamie. Modificarea constt intr-o carboxilare ce se face pe seama dioxidutui de carbon, in microsomit ficatului, sub aegiunea catalitica a carboxilazei - in prezenta oxigenului - cu vitamina K (forma hidrochinonic8) drept cofactor al enzimei ee "Ge. ~00R,g00" H, ( H bs, bu Fig. Ill. 88. - Carboxllaraa restu- Vitamina K rlor de acid glutamic la resturi ~ go cH y~ —€-CH=N— —— deacidy-carboxiglutamic, pentry ° a constituirea factorilor de coagu- Jara, prin Interventia vitaminal K Resturile de acid + - carboxiglotamic (protrombina conjine 10 asemenea resturi) pot chela ionul calciu: i Che Fig. I.39, - Chelerea ionuti ce calciu Bee ‘dp catra acu y.carboighutaric Acest proces de fixare a calciului este esenfial pent rolul biologic al factorilor de coagulare ‘S-a constatat ct pe Hing factorii de coagulare exists alle proteine care congin resturi de acid - carboxiglutamic, formate tot prin infervengia vitaminei K, Aceste proteine au fost identificate in diverse organe: plimani, splin’, rinichi, placenta, oase (osteocalcin), 138Cap.IV. ACIZIE NUCLEICI IV.1, INTRODUCERE, Acizii nucleici sunt, din punct de vedere chimic, produsi de policondensare a unor uni- tii denumite nucleotide. Se cunose dow clase de acizi nucleici: acizi dezoxiribonucleici (ADN) si wizi ribonucleici (ARN). Atat ADN cAt si ARN sant macromolecule informagionale care permit stocarea, transmiterea si exprimarea informafiei genetice. Molecula de ADN reprints bara chimich a ered, ea conginind informaya geneticd cu sivce la biosnteza proteinelor, Conjmutul informational al ADN, inscrs in secvenfa nuclootcclor ce consiuie macromolecula, permite speciicaea structurifiectireproteine, determin deci, prin prorene. Descoperiri relativ recente completeazi substanfial imaginea oferith de dogma centrala, tindndu-se seama de capacitatea de autorepticare a unor tipuri de ARN ca gi de cea de transcriere a informatiei din ARN in ADN. 139IV.2. STRUCTURA CHIMICA A ACIZILOR NUCLEICI Hidroliza acid a acizitor nucleici d& nastere la baze arotate, pentoze yi acid fosforic, Pentoza din struciura acizitor ribonucleici s-a dovedit a fi D-riboza, in timp ce aceea din structura ADN este D-dezoxiriboza. in structura acizilor nucleici pentozele se gisese sub forms ciclict, B-foranozicd | no d—on oe i pees Ae en ee Lion he D-riboza, 0-2-cezoxiriboza i 1V.2.1, BAZELE AZOTATE DIN STRUCTURA ACIZILOR NUCLEICT. Bavele arotate care intr in structura acizilor ntcleici deriva din dou’ structusi heterociclice: purina si pirimidina Bazele purinice din structura acizilor nucleicé sunt adenina (6-amino-purina) gi guanina (@-amino-6-hidroxipuri: Ca baze pisimidinice s-au identificat 3 baze majore: i = aracilul (2,4-dihidroxi-pirimidina); + timina (24-dihidroxi-S-metit-pirimidina), = citozina (2-hidroxi-4-amino-plsimidina) i Bazele purinice si pirimidinice prezinté fenomenul de tautomeric, Se consider structuri tautomere dou’ structuri care diferti una de cealalt prin pozitia unui atom de hidrogen si a unei duble legatur. Bazele azorae prezinta tatomere lactim-lactam datorit OH ° t | grupel —C en, a Ay --4-h ho 7 Y Dezoxicitidina Dezoxiguanozina Fig. V.7 - Baze complementare unite prin logaturi de hidrogen| \ este exclusd intrucat s-ar depasi spatiul oferit de dublul helix (diametrul constant, de 2 rim, de-a lungul axului), iar imperecherea a dows baze pirimidinice ar face imposibilt stabilirea legiturilor de hidrogen, bazele azotate fiind situate prea departe una de all Bazele pereche sunt adenina-timina i guanina-citozina, intrucit numai acestea pot stabi humtrul maxim de fegaturi de hidrogen, asigurénd ast conformagia cu energia liber cea mai micd, deci cea mai stabil’, molecule’ de ADN. Adenina se leagt de timina | prin douai legaturi de hidrogen, iar guanina de citozina prin trei legaturi (Fig. 1V.7), | Cele doua catene polinucleotidice nu sunt identice ci complementare, in sensul cf, i adeninei dintr-o catend fi va corespunde intotdeauna tmina de pe cealaltt catent, iar | guaninei - citozina, Succesiunea bazelor azotate dinti-o catendt dicteazt succesiunea | bbazelor azotate din cea de-a doua caten’: 0 cater’ este replica celeilalte. Insigi dispozifia siructurilor hidrofobe, respectiv hidrofile, in mediul convenabil tor, confer structurii ADN, maximum de stabilitate necesera; tiria legdturilor care asigur’i conformagia moleculelor de ADN trebuie si fie suficient de mare pentru a-i menfine integritatea permijand totodalA flexibilitatea conformayionala a acesteia. Modelul Watson-Crick este reprezentat in Figura IV.8. chest cate our vc PCE pana ie Fig. 1V.8 - Structura dublu Fig. 1.8 - Autoreplicarea AON ul helicoldala. a ADN. 156Informajia genetic’ cu priviee la biosinteza de proteine rezid’ in insigi secventa bazelor azotate din catenele de ADN. Multiplele posibiliti de variajie a acesteia explicit maltitudinea de proteine ce pot fi sintetizate conform ,,instrucjiunilor* cuprinse in ADN. Modelal Watson-Crick ofert elementele pentru explicarea capscititii ADN de a stoca si transmite informafia inserist in seevenja bazelor azotate. Fiecare dintre aceste catene va servi ca matrita (lemplate) pentru sinteza unei catene noi, complementasi cu catena parental, rezullind astiel dow molecule fiice identice cu ADN parental (Figura IV.9). Conformajia dublu helicoidalt descrisi de Watson-Crick corespunde formei predominante de ADN fn celula - forma B, Exist dovada cil, departe de a fi-0 molecult static’, molecuta de ADN adopta $i alte conformafi, Conformajia de tip A corespunde tot unei duble helice drepte dar este mult mai compacti; pasul helicei este de 2,8 nm iar numarul de haze per tur este de 11. Ca si in cexzul ADN-B gi in ADN-A predomin’ conformerii anti Conformatia de tip Z (2 de la zig zag) corespunde la o helice sting’ aviind 12 perechi de baze per tur, pasul helicei fiind de 4,56 nm, Ea Totcerupe .monotonis" helicei drepte atunci cénd inidineste structuri speciale (anumite succesiuni de secvenfe altemative de purine gi pitimidine) fiind prezenti att in condifi fiziologice cat si in condigii speciale (la concentrafii mari de cationi). Intr-o succesiune GC dezoxinucleotidul guanine adopt ‘Super- uci! vasuciri egative pozitive a ABN GIRAZA == cw’ ADP ) Fig, 1V.10 - Contor- Fig. 'V.11 - Molecule de ADN superspiralate mmajja Za ADN 187conformafia syn iar cel al citozinei pe cea anti, ceca ce face ca lanjul s8 evolueze in zig- 22g intre cele dow conformal (Fig. 1V.10). Minoritard fai de dubla helice Watson-Crick si avand o stabilitate mai mica decat ea, prezenfa acestei conformatit are, probabil, o semnificayie biologicd; se sugereazd ci ar reprezenta un semnal de recunastere sau ar juca un rol important in variabilitatea geneti- Gia organismelor (aceste regiuni sunt, in general, predispuse la mutafii). Se admite ci in timpul proceselor de replicare saw transcriere a ADN, procese implicaind .deschiderea” moleculei, energia eliberatt ar fi utlizat% pentru stabilizarea sinicturilor Z, natural instabile, Daca este aga, rezultt el in cursul acestor procese au loc remanieri ale conformagiei ADN, variabilt in cursul existengei cetutei. Desi prezenta acestei conformnaii in vivo nu este ferm dovediti, exists argumente (in vitro) ca structura Z modifict interactiunile ADN-proteine, prin excelent importante jn replicare, wanscriere repararea leziunilor ADN, Se specalcazs ideea de Timbaj conforma- sional receptat ca mest) W . ORGANIZAREA MATERTALULUI GENETIC LA PROCARIOTE $1 EUCARIOTE La procariote, o moleculti unica de ADN, de mari dimensiuni (canjinfind 4.000.000 perechi de baze) si in general circulara (format prin legarea covalent a capetelor 5°, 3), aletiuigste un cremozom. Lungimes conturutui de ADN eromozomial este de 14 mm, deci cu mult mai mare deetit dimensiunile unei celule de Escherichia coli. Evident, molecula ADN va trebui st adopte in celulii o forma cit mai compact, care s-0 fact compatibilt cu spayiul oferit de etre aceasta. ADN circular formeaz intr superhelixuri prin suprarisuciri, superspiralizasi (supertwisting, supercoiling). Suprarisucirile spre dreapia (sensul dublei helice), determinate de sciderea numérului de perechi de baze per tur helice (fata de 10,5 in ADN-B), sunt considerate pozitive (positive supercoling ). Suprarasucirile spre stinga, determinate de cresterea numvirului de perechi de baze per tur helice, sunt considerate negative (negative supercoiling) tot prin convengie. Struetura superhelicoidala negativa este proprie celulelar vii, ea relaxiind dubla lice, Suprurisucirea este 0 proprietate universal’ a ADN dublu helicoidal; suprarisuciri par nu numai atunci cand un ADN circular se risuceste in jurul propriei axe dar gi in cazul ADN liniat-deci gi ta eucariote, Formele superhelicoidate sunt in raport ct forma helicodala, ea si una foja de cealaltt, topoizomeri, Enzime specifice, demumite topoizomeraze, catalizeazz aceste modificari ‘opologice, interconvertind izomerii topologici ((opologia-ramurA a matematici, studiazat deformirile geometriet unor structuri). © topoizomerazi, prezenti in procariote, este ADN giraza care are abilifatea de a produce sau desfinga suprarasuciti negative. Dow’ dine subunitiile acestei enzime- tetramer (dod perechi de subunitati A gi B), acelea care introduc superhelixuri negative, au si activitale ATP-awiet, spre deosebire de subunitale specializate in desfinjarea acestora, 158Pe lingli ADN reprezentind materialul eromozomial, ce cuprinde setul complet de gene pentru specificarca tuturor caracierelor celui, bacterie congin si mici cantitayi de ADN circular, exteacromozomial, care se g8seste in citoplasmia. Aceste molecule de ADN se numese plasmide gi congin o cantitate redust de informatie genetict, Pe tanga alte geve, ele contin si gene care specific’ anumife proicine ce le confer’ rezistenta ta antibio Plasmidele pot migra de fa 0 celuld cu rezistenjt Ja un antibiotic 1a alt celuli, eu sensibiltate la antibioticul respectiv, Piednd-o si pe aceasta rezistenti, Rezistenga la antibiotice. wansferabili nu numai in cadrul aceleiagi specti bacteriene ci side la 0 specie Ia alfa, pune probleme sertoase antibioterapici Plasmidele s-au dovedit a fi instrumente ideale de manipulare a genetor, Manifesténd ‘desea autonome fat de ADN cromozomial, plasmidele se autoreplica extrem de ragid, Posibilitatea incorporzrii unui fragment de ADN striin intr-un plasmid, prin tehnicile ingineriei genctice, gi reintroducerea plasmidului modificat tntr-un organism gaida permite objineren unor mv cant din gena stina sau din profeina specificaté de aceasta. fn cazul eucariotelor, cea mai mare cantitale de ADN se stiseste in nucTew care, sore osebire de procariote. este detimitat de citoplasma print-o membran’. in perioadele de repaos ale celulei, deci in afara perioadelor de diviziune, matericlul genetic se giseste sub forma de cromatina, un material amorf, dispersat in nuctew, care confine ADN, proteine bazice denumite histone si proteine nehistonice denumite hertone in timpal mitozei si putin inainte de aceasta, cromatina se condenseaza si se subdivide {in cromozomi care sunt complexe ADN-proteine. Numaral acestora depinde de specie; astfel,celulele somatice umane contin 46 de cromozomi grupati in 23 de perechi, vulpea ‘34, puiul de gina 78 lc, Fiecare eromozom confine 0 singuri molecula de ADN linear lungimea sa variind de la un cromozom ta altul Portiunile ADN care conjin_informafia geneticx cu privire ta sinteza unel proteine au fost denuimite, inifial, gene. S-a aritat ulterior ch proteinele formate din mai multe subunit polipeptidice sunt codificate de un grup de gene, ficedtei gene corespuny i un lanj polipeptidic. Relafia dintre materialul genetic (ADN) yi expresia i fi {proteinele) este corect exprimati prin conceptul o gen - un kang palipepkidics tot gene sunt si fragmentele de ADN care nu se =xprime final in proteine, ci in acizi ribonuelsict de transfer si ribozomiali, Gena reprezints deci trigmentul cromozomial care confine informayia cu privire la sinteza unui singur lant potipeptidie sau a unei molecule de ARN, Ficcare cromozom confine un set unic de gene. Totalitatea genelor cuprinse in ‘eromozomii nei celule constituie genomut acesteia, (Genomul haploid wan const din S x 10° perechi de baze). jn general, genele eucsviotelor se intilnesc o singurd dati in genom. Unele gene sunt prezente, ins, in copii multiple, de exemplu genefe care corespund tuturor tipusilor de ARN, gencle care codifii histonele, genele care coditic cheratina la plist gi cormute et Moleculele de ADN cucariot prezinta, spre deosebire de ADN procariot, si anumite segmente, relativ mici, noninformationale, care se pot repeta de mificane sau numai de mii de ori (ADN satelit). Aceste secvenfe repetitive, cuprinzind zeci sau sute de perechi de baze, sunt suspectate a indeplini roluri th reglare, in arhitectura moleculei de ADN, dar dovezile in acest sens sunt inci neconvingioare.‘Surpriza cea mare privind organizatea genomului cucaric aofert-o descoperinea discontin titi genelor, O gen’ conjinand informayia privind stmctura unui lan{_polipeptidie- este Intrerupti de secvenfe care nu sunt iraluse via ARN, care nu se vor exprima in structura Polipepiidului dat. Secvenjele de ADN tductbile, dinr-o snumit& gen’ structural, s-a0 ‘denumit exoni (expressed regions), iar celal introni (intervening sequences). Cercetirie din tltimii ani au dus ta concluzia ci discontinnitatea. genclor, departe de a fi 0 exceptie, reprezintt o tisiturs comund a genomului onzanismelor superioare (excepfie ar face genele care codifica histone si interferonu. Afirmatia nor geneticieni dupa care genomul eucariot este organizat pe linia relat si extravaganfei nu pare, deocamdatl, extravagant’, Celulele cucariote confin, pe ling ADN nuclear, si ADN- localizat in mitocondr dliferi¢ att prin struetura, cft si prin uncle proprietii, de cel nuclear. ADN mitocondrial se prezinta ca un duplex circular. cu masii moleculari relativ micd si 0 capacitate de renaturare surprinzattoare, Prezenja ADN mitocondrial conferi acesteia 0 oarezare autonomie genética, o parte dintre proteinete mitocondriale, mai ales cele implicate in biogeneza sa, sinetizindu-se pe tipar de ADN. propriu. Prinire aceste proteine semnakim: NADH-ubichinono oxidoreductaza (inhibat’ de rotenon’). apocitocromul b, subunitafi ale citocrom oxidazei, diferite proteine structurale. “Majoritatea proteinelor mitocondriale sunt insd specificate de gene nucteare, sintetizate {in citoplasma si apoi importate, gratic recunoasterii lor de ciire receptorii speciatizati de pe suprafata mitovondriei, Este sueprinzttor fuptul cX setul de gene ale ADN mitocondtial (care specific’ proteine mitoconctiale) nu este identic la diferite orginisme, proteine omoloage fiind codificate la unele de c&tre ADN mitocondrial, iar la aitele de etre ADN nuclear. kdeea unui transfer de gene intre nucteu si mitocondrie pare plauzibilA finand seama de faptal cL ADN nuclear poate tncorpora ADN exogen pitruns in celui, Se pune firese intrebarea: de ce alte organite celulare last pe seama ADN nuclear {ntreaga responsabilitate a biogenezei lor iat mitocondria cointereseazi att ADN nuclear catsi ADN propriu? Indiscutabil, prezenta ADN mitocondrial nu poate fi un capriciu sau un accidental evotu(iei, menfinerea unui sistem genetic separat constituind o substanfiali investifie, impust probabil de o necesitats inct neinfeleas’, IV.34. ARHITECTURA GENOMULUI EUCARIOT Camtitatea de ADN in celulele cucariotelor este semnificatiy mai mare decat ta procariote. Lungimea conturului de ADN dintr-o singur celuli umand este de ~2 m Pentru cao molecult de ADN sit, {n spatiul nuclear, sirimt, materialul genetic se organizeazl corespunzaior, un fol important revenind histonelor, proteine bazice, cu masi molecular mic’, asociate ADN. Se cunose 5 clase de histone si ariume H,, Hs, Hay Has He Histonele Hay si Hay au un confinut foarte bogat in lizind, in timp ce H, $i Hi, sunt foarte bogate tn arginint, Intrucit la pH fiziologie radicalii celor doi aminoagizi sunt protonafi, histonele stabilesc legituri saline cv anionti fosfat din molecula ADN, ‘ceea ce permite formarea de complexe ADN-histone 160Cantitatea mare de histone, existenga strict a 5 tipuri de histone in toate celuicle cucariote ca si constania structurii lor pe scara evolufiei au reactualizat problema importanfei acestora in organizarea cromozomilor: unde se afk aceste proteine in cromozom, cum sunt dispuse si ce rol au de indeplinit? Este asocierea histonelor cu ADN ‘ispunzitonre de condensarea materialului genetic, fécdind posibild incadrarea in spafiul nuclear cu diametrul de 1/10 nm a unor moiecule care, extinse, ar misura 2 m? Cercetiile ultimelor decade, utilizind un intreg arsenal de tehnici de performang’ (microscopic electronic, diffacyia neutronicd efe.), au dus 1a coneluzii ce par si dezlege ,misterul™ histonelor. Studile de difractie a razelor X (efectuate de Wilkins si Buzzati) au dus la constaterea surprinaRtoare cd, cromatina (cromozomii interfazici) prezint§ stracturi repetabile la intervale de ~10.nm, 28 va Nuclaozom .miez" a Nucleozom solitar '6) Nucleozomi reunit prin ADN ber Fig. v.12 161in studiile de microscopie electronick eromatina ase aspectul unor micgele pe-af8. Miargelele” reprezints o suitti de particule sferice cu diametm de ~10 nm, iar .ata, porfiuni de ADN liber. Unitatea repetitivi de 10 nm, evidentiati prin studiile de microscopie electronici, a fost denumitt nucleozon (Fig. 1V.12a). Ficeare unitate repetitiva-nucleozom-cuprinde un octamer histonic constituit din 2H. 2Hay. 2Hs, 2H. ce formeaz un fel de cilindru turit cu dimensiunile 11 x 11 x 5.5 nm, Dubla helice a ADN infisoari de aproximativ doua ori fiecare micz hisionic al nucteozomutui. ADN asociat octamerului este constituit din ~140 perechi de baze: (nucleozom ,micz"). intre doi nucleozomi ,tniez" adiacenfi se gtiseste ADN liber, 20-60 perechi de baze, la care este legati histona H, (Figura 1V.12.b). Studiile de diffactie neutronict an demonstrat ct ADN’ impacheteazti octamerul histonic si nu invers, cum se credea, astfel incdt poinucleozomii pot fi mai degraba asimilafi cu 0 af8 infigurata pe merge. In cromatina eucariotelor polinucleozomii formeaz’ un superhelix, dispuntindu-se dupi ‘un solenoid cu un pas de 10 nm, cu diametnl de 30 nm gio distant intre spire de 10-nm (Figura 1V.13), Fiecare tur de spirt are 6-10 nucleozomi. Sokenoizi at fi, ei insigi, orgnnizagi in fibre cu configuratit helicoidale de ordin superior. Se pare ci insisi cromatina activa, subiect al repliciri gi transcrierii, este asociat cu histonele, Cromatina activa ar confine, pe lang histone, si proteine nehistonice care modifica, intr-o oarecare measur’, structura nucleozomului ce .se deschide", permigind Citirea mesajului genetic. Structura condensati trece intro stare mai destinsi, care permite replicarea si transerierea. Indiscutabil, imaginea pe care 0 avem despre cromatin’, si mai ales despre moditi- cil pe care aceasta le poate suferi, este incompleti si perfectibilt, 1V.3.5, BIOSINTEZA ADN (REPLICAREA) Biosinteza ADN trebuie si decurgi astfelincdt si permits conservarea si transmiterea informasiei genetice de ta o generatie ia alta, in cursul diviziunii celulare, fiecare celul’ genereaza doud celule fiice cu acelasi patrimoniu genetic, conjinand, deci, aceeasi cantitae si calitate de ADN. Modalitatea specified de biosintezt_a ADN este replicarea, respéctiv desfacerea elreey LNB EDV OO DIO1 YS i" Ore a eg FOLODIODIOVO1 OD ~€ HO-WNIZOULL~VNIZNB | | £OVO9OI-O1 8O1@rO2@ YWIZNA -VNIZOULL-OH gGIRAZA. 3 HELICAZA a a OSA eats SS 5) puna De REAIC 2 gy BICRRA. cizA) 3 Pes ARN panes DFRASRENT OHAZA | sareza un nou [ARN peer commen swreza uunney FRAGMENT OKAZAKI TADN pounaeraza SS ARN enmes 1 COMPLETAREA GOLLRILOR CADN pounenaza 1) . St ut —RoNoeay me Fig. 'V.19 - Etapele biosintezel ADN xcwupenca ARN oes! 169Parngaom Petrova iloenzie} Fig. 1V.20 - Model sugerdnd replicarea simultand a eelor doua catene Despre mecanismul separirii celor dout molecule de ADN circular, rezultate prin i replicare, nu se sie aproape nimie. i Relativ recent, postulat un model de repicare a ADN care fine seama de faptul ci i asta se desfigoarh in vivo cu viteze egale pentru ambele catene (Fig. 1V.20), care {hi audmite ct Hf 1. replizomul este ancorat la membrana nuclear, dec: rel ti ADN fl ,trancitenca"; i} 2. formarea unei bucle (loop) de clire catena matriti eu direcjia 5-93" permite catenel lagging” si fie sinteizaté simultan si in aceeasi diretie cu catena Jeadin Hi cea a bifurcascs de replicare. 3. sifteza celor doul calene este concomitentt, fiecare Jintre ele devenind subsirat pentru subunitai difesite ale ADN potimerazei II care este un dimer asimettic, Subunitgile cu activita polimerazice ale holoenzimei ar diferi prin aceca cf i subuntatea responsabil de sinteza calenei Jeans se asociat form cu o subunitate care reste procesivitatea (abilitatea de a adtuga nucleotide continu, fri si se disocieze de catena in eresiere - veri mai departe), Penira catens lagging” esenfiaii este viteza reacfci de polimerizare si nu procesivitatea <\elrel esenf este replicaren simultant a eclor douk eatene in si directa bifurcayici de replicare pare un mode! valid. De remarcat un avantaj important al acestei modality: de replicare: proximitatea sitasurilor de terminare si incepere a dou fragmente Okuzaki ce se succed permite sransferul concertat rapid al dispozitivului de replicare de ka un primer fa. alt Fideitatea procesului de replicare ta procariote. Repliarea ADN, wflizand un aparat enzimatic extrom de claborat, eusesfe si asigure. prin inalta sa fideltate, menfinerea capitalului genetical speci iv fix, iar molecula de 170Crearea unei catene noi, perfect:complementari cn catena matrifa, se realizeaz’ att prin respectarea principiului complementaritiii bazelor ct si prin activitatea de autocontrol a ADN polimerazei IL. Aceasta, pe Tanga activitate polimerazict, prezint $i 0 importants activitate de corectare a unor erori, rezultat al atributelor enumerate ‘anterior. De subliniat c% ADN-polimeraza III stabileste o legaturd fosfat diesterich tatre capatul 3°-OHT al catenei in crestere si nucleotidul urmitor, numai dactt Ia capitul 3°-OH se giseste un nucleotid corect imperecheat cu catena mati’. Enzima are calitatea de a descoperi o eventual eroare de imperechere matrti-dezoxiribonucleot dl impropriu Gncorporat Ia capital 3'-OH al catenei in cresiere) side a selecta pe cel adecvat, O asemenea situajie poate st decurg’ din aparifia tranzitorie a unor fo:me tautomere rare ale bazelor azotate (Frecvenga este de 10% ~ 10°), Astfel, citozina in forma imino, si nu amino, se imperecheazti cu adenina si nu, firesc, cu guanina, ‘Aceasti imperechere gresiti este numai temporari, citozina revine Ja forma amino, uuzual’, care nu se ponte imperechea cu adenina; situafia este sesizati de ADN polimeraz, care mu -mai continu elongarea catenei avand In capital 3°-OH_un rucleotid neimperecheat. Prin activitate exonucleazic’ 3°95", enzima exclude citozina, reludnd clongarea catenei. in ipoteza unor erori repetate, ea isi continu’ activitatea exonucleazicd pint cind glseste capitul 3°—OH adecvat (Imperecheat cu. matrfa. Aceasth activitate de supercontrol a ADN polimerazei II elimint eroti ce s-ar fi camis {act singurul mecanism de control ar fi fost respectarea principiului complementar:ii bazelor, Intradeviir, dacti ADN polimeraza TIT n-ar fi fost Inzestrat{ cu activitate de ccorector, perechea adenin’i-citozin’ s-ar fi menfinut in ADN nou sintetizat, genernd 0 mutajic. Incapacitatea ADN polimerazei IN de a initia catene polinucleotidice, respectiv necesitatea unui primer, nu este un handicap al enzimei ci o necesitate impust de exigenfele procesului de replicare; ADN potimeraza HI poate s& exclud’ un nuclestid impostor numai dac acesta se afl la capatul 3° al unui lanj polinucleotidic tn crestere, ‘ceea ce ar permite 0 initiere defectuoast. Solufia pare a fi intradevar o inijiere mai aproximativa, prin sinteza unui ARN primer, sub actiunea unei ARN polimeraze lipsiti de activitate de corector, si excluderea ulterioart a acestuia, care va fi inlocuit cu fragmentul de ADN corespunziitor. Insigi alegerea unui sens unic al repliciirii, gi anume cel cu directia S'-3", contribuie 4 asigurarea acuratejii procesului, permizind ADN polimerazei si-si exercite actiunea de autoconttol gi corectare & erorilor. Dac’ tang sintetizat ar avea disecia 3°95" si ta capttul S’ ar apare 0 greseali de imperechere, excluderea dezoxiribonucletidalui impropriu ar face imposibilt continuarea replicirii in condifile date, de unde necesitatea stint lui, chiar cu prejul compromiterié fidelititii, aproape absolute, a procesului, Ca rezultat al functiei de corector a ADN polimerazei si al imperativului complemen- tert bazelor,frecvenfa eroilar in procesul de replicare a ADN este de una Ta 10° ~ 10" perechi de nucleotide, Totus, frecvenga erorior in ADN al Escherichiei coli este de numa una la 10° perechi de nucleotide, grajie unui sistem enzimatic ce acjioneazst post-eplicativ (vezi mai departe). Pe langi activitatea de corector, ADN polimeraza Il] este 0 enzimf cu 0 capacitate cataliticd excepfionalds ea reuseste s& adauge in cursul elongiisii aproximativ 60 000 de nucleotide pe minut. Viteza extrem de mare de polimerizare o face demna de rolul pe care si-lasumai in sinteza ADN.‘Un numir mic de molecule de ADN polimeraz’ HI prezente intr-o celul& bacterian’ (aproximativ 10 molecule) reugeste si asigure o vitezK adecvatl sintezei discontinui. a catenei .Jagging”, ceea ce presupune si reciclarea lor rapid’ intre captitul unui fragment Okazaki si capatul 3° al primerului anter Oa treia calitate a ADN polimerazei II, care o distinge, este procesivitatea, respectiv abilitatea de a adiiyea nucleotide la catena in curs de sintezi Fir% si .coboare* de pe. matrigi, ADN polimeraza II catalizeaza formarea a mii de legtturi fosfat diesterice MX SH se disocieze de matriff, ceea ce 0 consacr’ ca enzimi cu procesivitate remarcabil, calitale extrem de important pentru sinteza catenei leading, Viteza foarte mare a reacfiei catalizate decurge, in spef%, din atributul de procesivitate al enzimei, Acuratefea, procesivitatea si eficiena catalitick proprii ADN polimerazei TIT sunt calitati pe care le reclama rotul stu in replicare. {n contrast, ADN polimeraza I are procesivitate redust si capacitate catalitict mict, {n acord cu atributile sale in replicare: excluderea primerilor gi umplerea golurilor rimase Replicarea la eucariote {in linii_mari, replicarea ta cucariote se desfisoari dupa modelul deseris, cu panicularitaii derivand din organizarea genomului cucariot. Ca sila procariote, s-au identificat mai multe tipuri de ADN polimeraze si anume: a, B. 7, 6. ADN polimeraza 0. este implicatt in replicarea ADN nuclear, Ea este format din patru subunitii, avind propritati si structurisimilare in toate celulele eucariote, Cum Procesivitatea acestei enzime este relativ mict si una dintte subunitafi manifesta acfiune Drimazic’, se suspecteazi cit ea este responsabilt de sinieza catenei lagging. ADN polimeraza 8 este un dimer asociat cu o protsinti ~ antigenul nuclear din celuiele proliferante; aceasti protein’, prezenti in canttyi mari in nucleul acestor celule, stimuleaztt ADN polimeraza 6, crescdndu-i proceswitatea, Se consideri ci ADN polimeraza 8 raspunde de sinteza catenei leading", Ea maniféstd acfiune 3°" exonucleazics ADN polimeraza Beste implicati mumai in repararea ADN, nw si tn repticarea acestuia; manifestt acfiune 5-3" exonucleazic’, ADN polimeraza y este implicatl in replicarea ADN mitocondil Polimerazele nu manifesti, in general, acjiune 3°-sS° exonucleazic’, cea ce sugereazi existenfa unor mecanisme de asigurare a fidelitiiidiferite fafa de cele ale procariotelor; se admite existenfa unor exonucleaze ca envitafi in sine, Existenta ADN ligazetor i izolarea fragmentelor Okazaki pledeaza pentru discontinu- tatea replictrit (ca gi in cazul procariotelor) Datorith marimii moleculei ADN eucariot,cAt si deplasiriirelaiv lente a bifurcafiei de replicare (aproximativ 3000 baze/minut, fath de 16 COO la procariote), rezullat al organizairii supericare a genomului, pe o molecul& de ADN exist mai multe origini de replicare, separate prin 3.10* ~ 3.10° perechi de baze. in aceste origini multiple de replicare se organizeazi bifurcatit de replicare (aproximativ 100 pe fiecare cromozom) ce se deplaseaza bidirectional pe cromozomul eueariot in curs de replicare. 172Fig. V.21 - Fazole ciculutcolular —<—FF Mitoza Fidelitatea replicini este ta eucariote de ordinul 10°, rezullat, probabil, al insist nanurit cromozomului eucariot sal scfm unor exanuclezze 3°95" care secondeazi ADN polimeraza, Biosinteza ADN are loc la mamifere in faza S, de sintezA, a ciclului celular, faz’ separata de faza mitoticd prin perioadele de gol sintetic, G, si Gy (Fig, 1V.21), in earsul acestei faze, ADN nuclear este replicat in intregime si o singura dati per ciclu celular. Respectarea acestui imperativ este posibili gratie unor procese de metilare care marcheazi covalent molecula ce a trecut prin experiena replicirii, Marcarea const intr-o metilare, in general a citozinei, la S-meti-ctozing, efectuatt de, ADN metlaze care folosese ca donator de grupare metil SAM (S-adenozil metionina)s Gradul de metilare a citozinei este extrem de variabil, de la 3-5% pentru regnul ‘animal, la 33 % pentru cel vegetal (virusurite animale se sustrag, in general, metifiri. 1La eucariote secventa recunoscut de citre metilaze este: os. 6c. metiarea decurgind pe ambele catene, in eucariotele superioare un numa restrins de celule se divid activ; cele mai multe sunt refinute, dup mitoz, in faza G,, de nondiviziune (resting phase). Decizia inti din faza G, in faza G, gi apoi in faza S, wnat de mitozd, este tual de proteine cu activitate kinazic (variable cu specia) activate prin interacfimea cu diverse ciline ~ proteine a caror concentrajie creste sau scade dramatic fn cursul ciclului celular. Celutele tumorale stiu si evite faza G, a ciclului celular. Ritmul sintezei de histone este cel al sintezei ADN, gratie copiilor multiple ale genelor ce specific’ histonele (40 de seturi, fiecare continand genele corespunzitoare celor $ tipuri de histone). In faza S cantitatea de ADN si histone se dubleaz’, Durata fazei $ variazi cu specia; Ia mamifere este de aproximativ 8 ore. acl ar exista o singura bifurcatie de replicare care se deplaseazi cu o vitezi de 50 nucleotide/secunda pe un cromozom continand aproximativ 150 milioane de nucleotide, ar fi necesare aproximativ 800 de ore — de unde necesitatea foncfiontirt sincrone a'peste 100 de bifurcagii de replicare per cromozor, Diferite regiuni ale fiec’rui cromozom sunt replicate in momente diferite ale fazei S, «dar invariabil in aceeasi secventl. Controlul replicirii si diviziunit celulare ridict probleme numeroase, la care s-a rispuns, cel mult, partial 13 {Sinteza de ADN pe matriti de ARN Fluxul de informayie genetic in lumea vie are, in general, sensul ADN -> ARN -9 Proteine, tultimii ani, s-a idenificat in virusurile oncogene. continind-ca material genetic ARN o enzimet a cirgi existenja era greu de previizut $i care a completat conceptul exprimat prin ‘dlogma cena“ a geneticii moleculare. Aceasta enzimt, revers transctiptaza, este 0 ADN polimerazi ARN - dependenti, Ea are abilitaea ca, o dati plituns& in celula gad, si Sintetizeze un hibrid ADN-ARN, mai exact si construigsea o cateni de ADN pe matrifi de ARN. ARN viral este degradat enzimatic iar cafena ADN rimasi se autoreplica dnd nastere 4a un duplex ADN ce conjine informatia prezenti in ARN viru (Fig, IV.22}. Virus | Ccolit gazes WOO sow eee Fig. 1.22 - Ropicarea ADN pe ma: ‘tia de ARN sub acfunea ADN Polmerazel - ARN dependant (rovers transeriptaza) [sorte apn Ambele procese sunt catalizate de cite revers transcriptaza in virtutea a dou activitagi enzimatice aditionale de care dispune: 1) activitate ribonucleszic’, ce-i permite si hidrolizere ARN din hibridul ARN/ADN, (de unde si desemnarea sa ca ribonucleazi H); 1742) activitate ADN polimerazica ADN - dependent, Primerul folosit de revers transcriptaz4 in activitatea sa polimerazica este, surprinzi- tor, un ARN, inglobat in particula viral (pretuat in cursul unei infecfii anterioare). ADN rezultat prin revers transcriore se inser in genomul gazda putindu-se exprima {n proteine, tntr-o anamiti conjunctura. Cum numeroase virusuri ARN sunt oncogene si genomul viral este mostenit, se considera cA fiecare subiect uman este purtiforul unei oncogene neexprimate, ca rezultat al pitrunderii in organism a unor astfel de virusuri ARN (retrovirusuri), intr-un moment al evolujici. Dact apare 0 conditie care. sii le favorizeze exprimarea, deci dactt vor fi transcrise si traduse, celuia se malignizeaz4 prin acfiunea unor proteine ce realizeazi transformarea neoptazica (adesea kinaze), Revers transcriptaza comite greseli, neaviind activitate 3°—»5" exonucleazict acest fapt ar constitui una dint explicafile varietitii mari de tulpini virale producttoare de boal’. ‘Un retrovirus, prin excelent versatl,virusul imunodeficienfei umane (HIV) este rispunzitor de sindromul imunodeficientei dobandite (SIDA), Acest virus are un design comparabil cu al celorlalte retrovirusuri, conjinfind obligatoriu genele pol, env si gag. Acestea specificd revers transcriptaza si 0 enzimé, de integrare in genomul gazda (pol) cAt si proteine necesare asamblirii particulei vale (gag, env) in cursul multipficirii, Integrarea in genomul gazdt presupune, pe Tangti 0 integrazt, seevenfe nucleotidice specifice la ambele capete (Long Terminal Repeats). Virusul imunodeficienjei dobiindite dispune de multe alte gene care, prin splicing’ alternativ, produe un num impresionant de proteine benefice Iu Versatiitatea acestui virus deriv’, in spef’, din tipsa de acuratefe a revers transccip tazei, avand ca rezultat un numat mare de mutafii, deci de variante HIV, si o eficient redust a tratamentelor. Descoperirea revers transcriptazei, pe Hing semnificajia ei teoretict, are si o important latur’ practict rezultatt din faptul ct, desi prefes% propriul ARN (viral), enzima poate utiliza ca matt orice ARN pe care construieste un ADN complementar (ADN). Apare asifel posibilitatea obyinerii unor gene sintetice (ADN), prin utilizarea tnor ARN mesageri,relatiy usor de izolat, gene care, prin tehnicile ingineriei genetice, pot produce mari cantititi din proteina codificatt, IV.4, ACIZII RIBONUCLEICI IV. 4.1. TIPURI DE ARN Sunt produsi_macromoleculari_care_iau_nasiere_prin_condensarea_ribonucleotidelor. Ribonucleotidele ce alcituiesc molecula de ARN stabilese logdtun fosfat diescrice inte gupaea OH din povitia 3° a unui nucleord si gruparea OM din_pozifia.5” a nucleotidalui succesiv (Fig. 1V-23) Din punct de vedere al compozitiei in baze, ARN confine, ca si ADN, guanina, citozina si adenina, dar, spre deosebire de acesta, cea de-a patra bazi nu este timina. ci Uuracilul, Pe Hang’ aceste baze, ARN contine si baze asa-zise ,minore“, rezultate prin metitir, tolfri ale bazelor .majore™, Componenta glucidicd din structura ARN este riboza si nu dezoxiriboza. 175Fig, 1V.23 - Structura covalent. a ARN 5 UsecGuUCGUACUUAAAUAUGcAAD > * TMi t 0 TT >) GCCUCAAGCAUCGCUUUCAACCUUA y ¢ Fig. 1V.24 - Structura ARN mo- nocatenar confinénd porfun! cu baze complementare asociate, prin legaturi de hicragen por fiuni cu baze necomplemertare ea ‘Conjinutul in adenin’ este diferit de cel in uracil gi nibi cel de guanina nu este egal cu cel de citozind. O_ siructuri_dublu. catenari_complementar’este_exclust_penim. ARN, Molecule de ARN sunt monccene, def pe arumie porfiun, scolo unde 0 permite complementaritaiea bazelor se organizeacd in_structuri_dublu_helicoidale Portiunile de baze necomplementare sunt expulzate ca bucle in_afara zonelor de dublu helix dind molecule: aspectul de (Fig. IV.24 Cantitatea de_ ARN, spre ieoechhed a de ADN, tu Ing cel chiro, cal ales cele, funcie.de invensiatea procesull de si proteingfor la momentul dat, ‘Dupi rolul ce le revine in procesul de biosintez% a preteinelor ARN pot fi ~ ARN mesager (ARN,,) + ARN de transfer sau’solubil (ARN) ~ ARN ribozomal (ARN,) ~ ARN nuclear scurt (de’mici dimensiune) 176ARN mesager (ARN,) ‘Tindnd seama de faptul ci molecula de ADN se. giseste in nucleu, th timp ce biosinteza proteinelor se desfasoari in citoplasma, Jacob si Monod av postulatexistenja unui intermediar care duce" _mesajul_genetic_din_nucleu_in_citoplasms, Acest infermediar s-a dovedit a fi o molecull de ARN, denumiti ulterior ARN mesazer. Moleculele de ARN,, sunt molecule monocatenare liniare, de Jungime variabilA, ARN, esfe_sintetizat_in_nucleu ADN. O- gen’ structural. este transerisiy in sensu! complementariliir bazelor (A corespunde la U, iar G ta ©), objinandu-se 9 moleculd de ARN, a c&rei compozitie in baze reflect compocifia in bbaze a genei transcrise, 'ARN,. nuclear iese fn citoplasmal (la eucariote dupa .preluerareat” sa si formarea unui ARN,, matur), unde va servi ca matri§ (template) pentru si unui_polipeptid cu sccveng specific de aminoacizi. Fiecare aminoacid este Chive 0 scevente de trei nucleotide, denumifi codon, Captiul 5° al ARN, confine o seevenf care nu este tradust fn proteine, denumits secventa ,Jeader" (la procarite, ,inchude seeventa Shine Dalgarno"), captitul 3° Conjne gi elo regiune netradust, cunoscuth ca secvengt .(ailer” ‘La procariote, 0 moleculi de ARN, poate si conjind informatia pentru sinteza unui singur polipeptid (ARN,, monogenic sau monocistronic) sau a mai multor polipeptide implicate in aceeasi cale metabolic’ (ARN,, poligenic sau poliistronic), Cistronii sunt separaji prin ,tegiuni intercistronice” Sau ,spaliatoni™ ‘La procariote, intte gena transcrisd, ARN, si proteina specificatt de gend existh 0 relatie de colinearitate, succesiunes wipletelor nucleotidice inu-o gent corespunzind exact celei a aminoacizilor in protcina codificatt ‘La eucariote, ARN, rezultal al transcrieri este monogenic si, cel mai adesea, cw mult mai lung decat ARN, ctoplasmatic. $i In eucariote, ca si ta procariote, la capetele 5° si ‘se gisese regiun’ netraductibile. Genele care codifict proteine, sunt, in general, intrerupte_de_seovente de ADN necodificatoare, inlsoni (intervening. sequences). Secvenlele codificatoare, separate” prin introni, poartt numele de exoni_ expressed regions). Dogma colinearitifii gent-protein’, valabilt la procariote, este inedleatt In eucariote, la care continuitatea informayict genetice este desfiinjatt. Gena nu mai este ‘eorespondentul structural al ARN, subiect al traduceri,fiind cu mult mai lungt deca ar Fi necesar pentru codificarea unui anumit polipeptid. ARN,, rezaltti prin transcrire, tespectiv ARN, ranscripte primare sav ARN, precursori, stmt supusi unor prelueriri diverse avand ca rezullat objinerea unor ARN,, de dimensiuni diferite, Tunetie de stafiul de prelucrare la care se giseste fiecare exemplar, reunifi sub numele de ARN nuclear hieterogen; un ARN, produs final al procesului de prelucrare este un ARN, mai Preluctarea ARN. nuclear generazii unul sau, uneori, mai multi ARN, malut, care ‘vor servi ca_mlrije pentru sinieza unui san__mai_mulior polipeptide cu szovente “Timpal de supravicjuire a ARN, in celuld este varisbil. ARN,, bacterian are o vial foarte scurti,(2=3 minute); dupa ce serveste Ia sinteza citorva zeci-d. exemplare- din proleina pe canto specifich, este degradat-de-nucleaze, ‘La eucariote, ARN. are 0 via{% de ordinul orelor; aceasta diferent’ este uyor de ‘nfeles find seama de fluctuajiile mari de mediu la care o bacterie se obstineaz si se adapteze continu, 7i ARN de transfer (ARN) Moleculele de ARN, sunt molecule mici (70-90 nucleotide), monocatenare, tn care procentul de baze complementare este deosebit de mare fas de celelalte specii de ARN. Raportul A+G/U+C din ARN, este apropiat de 1 ARN, nuclear, nu si cel mitocondtial, prezinti 0 conformagie tn foaie de wifoi", vind 4 zone de perechi complementares13.necomplementa, expulzate cu bucle Fig. IV 25). Brat aminoacid +e 9000-00005 pee Brat anticodon Fig. 1V.25 - Structura tridimensional a ARN, La capltul 5° terminal, cei mai multi ARN, au restul acid guanilic, iar la capitul 3°, tot au secvenfa nucleotidici’ CCA. La caplitul buclei in‘erioare se gisesle asa-numita ortiune anticodon, care variazi cu natura ARN, $i alte secvenfe nucleotidice sunt importante in procesele de recunoastere; de exemplu, in brajul DHU existt o seevent’ nucleotidiet care recunoasig. si se leagt la aminoacil-ARN,sintetaza, enzim’ care. -Incarcé ARN. cu_un aminoacid specific, sctivat, in brajul T¥C, o anumit’ seovent& nucleotidic8 asigurd legarea ta ribozom a complexului aninoacil - ARN, 178Toate tipurile de ARN, au_un procent neobignuit de mare de baze minore: Peeudounan (0) Ditirourlns (OU) ieotimiane 7) : : ie ; | | DO ‘0 OG | s-noundes aati nase i {in procesul de, ARN, are de indeplinit dow’ funesii: uh 1, ‘Transporalgminoacizlor activa in fazasolubil a bozomi, sub forma de complexe a smninoacil - ARN, Fiecinuia dine cei 20 de. aminoacizi care init in siuctura proteine oF i corespunde cel pujin un ARN, specific. Exist, cel putin 20 de tipuri de ARN, In gereral, exist mai mulfi ARN, specifici pentru un aminoacid - ARN, izoacoeptori - fapt expicabil prin caractenal degenerat al codului genetic (un aminoacid poate fi specificat de mat mult codoni). Logarea aminoacidului se face la reziduul adenilic din secyenga CCA si consi in stabilirea unei legituri macroergice intre OH din 3° al adeninei si restul acil al aminoacidului (vezi sinteza proteinelor). 2, Adaptarea aminoacidului transportat in dreptul codonului de pe ARN, cares specfict, Aces toate a aminrat Se pool Po aoa ertaran oot Porfaen anticodon din ARN, este complementara succesiunii de nucleotide din ARN,, ce cocifict ‘aminoacidul transport de ARN, respectiv si ca atare cele dowi regiuni pot stabi legitri de hidrogen (Fig. 1V.26). ARN, este relativ stabil la procariotz si mai putin stabil Ia eucariots, Fig, 1V.28 - Recunoag- torga codon - anticodonARN ribozomal (ARN, Moleculele de ARN, sunt macromolecule flexibile s. deformabile, care contin zone. dublu catenare intieruple de zone monocalenare Exirem de Reterogen ea forma si mlrime, ARN, se impart, in funcjie de constanta de sedimentare (S), care depinde de marimea si forma peticule, in; ARN, 23 $. 16 $ 5i 5.S la procariote sf ARN, 28.8, 18S, 5.88 si 5 la eucatiote, ARN, Feprezint’ tipul de ARN cel_mal abundent (aproximativ 75% din toa. de ARN celulas) si cel mai stabil metaboli, "ARN, se agreed cu proicine JIVERE- lipid, consttind particule ribonucleoproteice denumite-riboromi (lescoperii de George Palade). Dupd valoaren constantet de sedimentare, acestia pot fi 70 $ la bacterii si 80.S la eucario Ribozomii pot disocia reversibil im douk subunitagi: 30S si 30S pentru procariote i 60 S, respectiv 40_S_ pentnu cucaiate. La procariote, subunitatea mare, 50 $, conjine ARN,23 S, ARN, 5 S si 34 tipuri de proisine ~ numeroate (L;-=) (gh aparteneni a subunintea- mare. Tags) Subunitatea mick, 30 $, CONDE ARN, 16 $9121 tipur de proteine ~ numerotate 6 So) dupa apartene ia subunitatea mic& ~ small) (Fig IV.27}. Proteinele ribozomale ‘au roluri bine stabilite, nu in intregime descifrate, decurgand fie din capacitatea catalitica (peptiil transferaze, GTP-aze), fie din abiltatea de a ,construi™ athitecturi stereospe- cifice, esentiale in recunoasterea_si_lesarea_diverselot tipuri_de_ARN_ implicate biosintea_proteinelor (ARN,,, aminoacil-ARN). 70s aos Vi was ¥ 3 ARN, 5SS ARN, 16S ARN-5S ARN, 18S ARN; 28. 21 polipeptide ARN, 58S ~33 polipeptide 34 polipeptice ARN, 28.8 46 polpepttte Fig. 1V.27 - Ribozomil Ia procarlote si eucariote 180Ribozomii_constituie sediul biosintezei proteinelor, Aceste unitifi mecano-chimice permit conlucrarea ARN,,, ARN, si in vedurea desfiguririi procesului de sintzz A proteinelor. Pe suprafata fiectrui ribozom exists dou situsuri si anume: situsul aminoacid, care Jeagdl ARN, purtitor al unui aminoacid, si situsul peptid, care leaga ARN, purtitor al ‘uni ang Subunitatea mic a ribozomulai (30 $ sau 40 $) leas’ ARN,, inr-un loc speciic astfel inet ribozomul si se afle cu locusul peptid in faja codonulut care specifick arninoacidal inifiator ico locusul aminoacid in fafa codonuiui ce specific aminoacidl 2, Logarea subunitifi mari de complexul ARN,, - subunitate mic8 determin Formarea ribozomului functional. ARN,, si ribozomii se pot deplasa unul in raport cu cellat, ribozomal glistind pe ARN,.. Aceasti deplasare reciproct permite trecerea tripletelor de pe ARN,, care specific’ aminoacizi succesivi in lanful polipeptidic, prin fay locusulut ‘aminoacid, indicdnd acestuia complexul aminoacil-ARN, ce trebuie legat. Aminoacizii vor fi incorporafi in molecula proteici in curs de edificare. Dupa sinteza unei molecule proteice, ribozomii disociaz, permijind reluarea sintezei unei noi molecule proteice. Cercetiri recente sugereaz participarea_catalitica a ARN, in sinteza_ lepiturii peptidice. ARN nuclear de mici dimensiuni © a patra categorie de ARN intilnita la eucariote, despre care nu se stiu inc multe Tucruri certe, este reprezentatd de ARN de mici dimensiuni - scurt (small nuclear RNA). ‘Acest tip de ARN este constituit din aproximativ 100 de nucleotide si confine un procent mare de uridind, Exist sub forma mai mallor specit moleculare notate U,, U, etc. Se gtiseste cu precitdere in nucleu, asociat cu proteine, generdnd ribonucleoproteine desemnate dupa tipol de ARN ,scurt": snRNPU;, siRNPU; etc. (Small nuclear ribomucteo- proteins = snurps). snRNP(U;, Us, Us, Us $i Us) intervin in excizia intronilor din ARN,, transcript primar, saRNPU; sunt implicate in’ prelucrarea ARN, transcript primar iar snRNPU, pare responsabitti de formarea capatului 5° al ARN, precursor pentru histone. 1V.42. BIOSINTEZA ARN PE MATRITA DE ADN ‘Transcrierea Modalitatea major’, specifict, de sintezi a tuturor speciflor de ARN, att la procariote cit gia eucariote, este transcrierea, respectiv sinteza ARN pe matrji' de ADN, In vivo, transcrierea este asimeiric’ In sensul c8, intr-o anomit® regiune a genomiui, se copiazi 0 singuri catend a ADN desemnatit drept catend matrjt (template) sau necodificatoare, cealaltt caten a ADN, purtitoare a informagiei cu. privire la sinteza ‘unui lan{ polipeptidic, in spef’, este catena codificatoare. Succesiunea bazelor in ARN hou sintetizat (ARN transcript primar) este aceeagi cu succesiunea bazelor azotate din catena codificatoare (cu excepfia inlocuirii timinei cu uracilul). Relatia catend template - catend codificatoare se schimbi funcfie de gena transcrist, sensul sintezei ARN riminind obligatoriu 5°93" (Fig. 1V.28). 181 | |t $ 5 _—s rl i Jot tt ey Fig. 1V.28, Tranecrierea asimetrcd» ADN, Biosinteza ARN, spre deosebire de replicare, proces cere angajeaza simultan intregal cromozom, vizeaz’ numai anumite porfiuni de ADN, acdea care codifica proteinele de care celula are nevoie ta un moment dat gi implicit ARN, si ARN, necesari, Biosinteza ARN, moment crucial in transferul de informatie de la ADN la proteine, presupune, in esen{f, prezenfa ADN dublu helicoidal, a color patru ribonucleozid- ‘vifostati (ATP, GTP, CTP, UTP) sia ARN polimerazei ADN-dependenta. Enzima constcuiegle 0 ‘catenti de ARN, complementari. cu catona ADN maltifi peniru 0 unumith gen’, avind polaritate 5°43". Ca si ADN polimeraza, ARN polimeraza contine zine gi necesita prezenfa in mediw a ionilor de magneziu saw mangan (Mn), ‘Transerierea a procariote Spre deosebire de eucariote, care folosese ARN polimeraze diferite in functie de tipul de ARN sintetizal. Ia procariote exist o singura ARN polimerazi pentru toate tipurile de ARN. Ea este constituita din patra subunitais doud de tip cz, ana de tip B si una de tip B (BB). La aceastit yenzini-miez”, important& in procesul de elongare, se ciaz’, “tranzitoriu, subunitalea sigina 6, importanid in inifierea transeriedi, erul_ ago constituic holoenzima, fn absenja subunit o ARN polimeraza se Ieagl nespeciic la ADN. Din punet de vedere chimic, reactia global cata reprezentats Wi de ARN potimerazat poate fi (ARN), © NTP —+ (ARN), + PP Ca si in cazul acfiunii ADN potimeruzei, reactia de formare a legtturii fosfat diesterice const in atacul nucteofi al grupirii 3° hidroxi libere din poliribonucleotidul in crestere asupet grupirii a-fostat din ribonucleozid wifosfatul urmator impus de matt. Reacia devine termodinamic favorabil& prin aofiunea pirofostalazei (PP—2P,), Spre deosebire de ADN polimeraza II ARN polimerazele sunt apte sh inifieze sinteza atenelor politibonucleotidice, fapt corelat, cu lipsa calif de corector, toleratt de Insti functia ARN, Sinteza ARN, atit la procariote c&t gi In eucariote, decurge dupa un model simiar mplicnd ca etape: |. inigierea transcrieri, I, elongarea catenei poliribonucteotidice TI terminarea transerier In procesul transcrierii esenfiali este recunoasterea pe molecula de ADN a unor somnale de inijiere si de terminare a transcrieii care si indice inceputul si sfarsitul fragmentelor de ADN ce vor fi transcrise (unitiji de trnscriere), Aceast sarcina, de extrema important, s-o asumai ARN polimerazele. 1821, Inifierea transerie Situsul ‘de initiere a transeriesii este semnalat de clire 0 seevent specifict de nucleotide din molecula ADN, responsabili de acuratefea provesului, care poart& wamele de promotor (P) si care este Fecunoscut de ARN polimerazi — holoenzima (0B8'6). Subunit c diferite crienteaza holoenzima che promovori diferi asigurind spe-iticitatea. Secventa nucleotidelor in tegiunea promotor, conservatii in evolufi, a fost stabil ppeniru un numgir mare de gene bacteriene, fupt care a permis desemnarea unor secvenfe consens, ca medic a structuri difergilor promotori. afi de punctul de. start al transcrierii, notat cu +1, care va dicta capttul S* al transcriptului primar ARN, promotorii sunt situati in \amonte" si notaji cu mirus (ecvenfele in aval fap de +1 sunt notate cu plus, ot prin convenfie. “Tofi promotor bacirieni au dou seevenfe consens situate pe catena codificatoare caseia- 10 @ribnow): STATAAT ¥ gi caseta ~ 35; S'TTGACA 3, Se admits ca variabilitatea secyenfelor promotor este corelati cu eticienta cu care ARN polimeraza se lengi la acestea, respectiv cu amploarea exprimarit gene Momentele initieri pot ft sumarizate astfel: 1, subunitatea 6 a holoenzimei recumoaste promotorul specific, in regiunea ~ 35, sise lagi la acest prinir-o legiturk Inxs: are loc formarea asi-zisului .complex inchis" de iniiere: 2. Holoenzima alunecs* de-a lungul ADN si in jurul pozifiei ~ 10, bogatt an acid Limidilic si adenilic, deschide C“topeste") dublul helix pe 0 porjiune de aproximativ 10 perochi de baze in virtea activtai sale de hefcaza are koe formarea .complexului deschis" dk initiere: TATAAAT i | aaa | a, AON Ge coral rege iranscrprarh (polimereze! Fig. 1V.29 - ARN polimeraza se afl cu situsul catalic in croptul ‘semnalulu' de injere a transcrieri 3. ARN polimeraza, prezent’ cu situsul activ in dreptul semnalului de inijiere a weanscrierii (Fig. 1V.29), catalizeaz’i formarea primei legituri fosfat diesterice intre hucleotidul +1, aproape invariabil nul purinic, si nucteotidal +2, Enzima, care confine pe subunitatea fun situs d legare-@ nucleotidului now introdus si alful de legare a moleculei de ARN in curs de editicare, se deplascaza in pozitia +3 pe template st continua sinteza. Subunitatea 6, care se disociazXt din complexul ARN polimerazzi ~ADN— ARN dup formarea primelor lepituri fost diesterice, se asociazti unei alte molecule de [ARN polimerazli— miez — si ncepe o now’ rund’ de transeriere (Fig. 1V.30). 183 | | | 1ARN polimeraza se leaga ta ARN Polimeraza DN $ migreazX spre promotor Paimeraza formeazi ie tun complex inchs Se formeazi complex deschis ED “| icp sca NO Sutunlutes o este Indepsras Fig. 1V.90 « Momente fn intiersa transeriert 184Bare POQDY YOCDOK Anvtpo head [CIBER IS) Fores Sad pucne | deheatneraencect ae Adisacrerea factorutui orp CIP 6--0-62 ~ UTP AWC-6-G-C | Vopr pcenengct aoa sy eet pa eeeeine og + AUCGECUUACG + O+O Fig. 1V.31 - lustrarea procesuli de transctiere cu sublinierea rolului ARN polimerazoi sia tactorlor « sip 11. Elongarea lantului polinucleotidi La capil 3° terminal al ARN in crestere se adanga ribonucleotidele dictate de matrigt, ‘Toate evenimentele transcrient decurg in bucla de transcriere care cuprinde 12-17 perechi de baze ADN-ARN. Pe misuri ce molecula de ARN transcript primar se sintetizeaz’, are loc disocierea sa din duplexul hibrid cu catena template, permiandu-se refacerea ADN dupex, sista, ca si destisucitea, de fopoizomenze, part integra a complexului de ranscriene, Viteza de elongare nu este constant, ea depinzand de seevenjele de ADN ,«iite™ de ARN polimeraza. UL. Terminarea transcrierii Exist cel pufin dou’ modalitifi de terminare a transcrieriis rho (p) dependent $i sho independent, rho fiind un factor proteic reglator (Fig. 1V.31). 185‘Terminarea p independent este impust de faptul ct wanscricrea unor secvenje de ADN specifice devine neconvenabila, din punct de vedere teraodinamic, complenului De exemplu; o secventt bogaté in perech. guanina-citozind este parcurst inieat bucla de transeriere se formeazé gren si duplexul hibrid ADN-ARN se denaturescé greu, Dificultifi maxime creeaz’ secvenide patindromice bogate in acid guanilic $i citidilic care proced o serie de A" conseculive si care dau prin transcriere Ssimucturi in ae de. pi" texrminate cu nuimeroase nucleotide uridilice (Fis. V2). Stabilitatea ,acului de par (erminator bogat i GC 9iimperecherea mai sumar’ a coz sale Poli-U cu cafena ADN matsji sunt favorabile temminisi wanscricti, Terminarea p dependenti este impusi de recunosgierea de cite acesia a unor seevenye de pe ADN template ce semnalizeaza stéasitul procesului de transcriere, Rho depisteazd, astiel, ARN pofimeraza opritS temperar la situsul terminator (Felatiy greu_de parcurs) si, folosindu-se de activitaile sale calalitice de helicaz’ ARN-ADN Gesface, duplexul hibrid) si ATP-aza, ca gi de afinitatea mare penis ARN’ monocatenst, clibereaz’ transcript primar ARN. Meecanismele intime ale procesuloi de transerere nu sunt cunoscute ci, cel mult aproximate, Transcriptele ARN, rezultate dupit prelucrarea postirarscriere a transcriptelor primare, sunt fic produsi finali ai eapresiei unor gene (ARN,, ARN), fie molecule purtitoare informajiei privind sinteza unor proteine (ARN,). caten’ —_dlirectia de transeriere oleate recEe S6GGCT| rrrrrrrr —— caong —Tesaace|_____leaeecea| aanaaaa AE atria ATT Ty ee ——— ttn 22 yuuuy A ff e ¢ © G transcript ARN cea g ¢é 44 O Fig. 1V.52 - Structurd in “ac de pt" favorabllé termina transorieri riptul primar ARN, procariot este mai lung deca insist gens de tanseris, ARN polimeraza transcric nu” numai gena corespunziitoare unui anumit i doult secvente suplimentare care 0 flancheazi. ARN, transcript primar va ‘avea, ca urmare, Ia captitul 5° 0 secvenfi denumitt leader” iar fa capitul 3° 0 secven{a trailer” care nu se expriml in proteinds 4 ena Sa a secvenfa leader " secventa trailer transcript primar ARNm 186‘Transcrierea 1a eucariote In cazul cucariotelor, procesul decurge similar transcrieri la procariote, comportind ‘si un grad de complesitate net superior Spre deosebire de procariote, cucatiotele folosesc ARN polimer de tipul de ARN sintetizat, ~ ARN polimeraza I, localjzatt tn nucleoli, sintetizeaz’i ARN, 458; ~ ARN polimeraza li, localizatt in nucleoplasma, sintetizeazt, cu precidere, ARN, ~ ARN polimeriza Ill, cu acecasi focalizare ca si ARN polimeraza M,sintetizeazai ARN, St ARN, 5S. Alat ARN polimersza I cit gi ARN polimeraza IU sintetizeaza si ARN nuclear de mici dimensiuni, ARN polimerazt mitocondrialt, Jocalizatt in matrixal mitocondrial, sintetizeack toate tipurile de ARN mitocondrial Fiecare dint cele pat tipuri de ARN polimentze uilizeazt promotor: diferij ae ci, in timp ce ARN polimeraza I utilizeaz’ promotori identici, ARN polimeraza 1 utlizenzit 0 diversitate de promotor, avand ca secvenfe-consers: casetn TATA, asemandtoare secvenfei Pribnow, centrati in jurul pozitiei-32, in amorte de panctal de star. al tansorerii; esie considerati responsabiti de acuratelea init transcrieri, reprezentind ,semrail unde" (hncepe transcrierea), recunoscut de poimerazz, auselele CAAT $i GC, situate de asemenes in amonte fat de +1, sunt considercte responsabile de frecvenga transerieri, reprezentind ,sernnalul cdind Gncepe transcrierea). a si in cazul secvenjei TATA, interacfiunea cu protcine speeifice (Factor: de initiere a transcrieii) este necesari in realizarea acestei functi. Pozitia si orizntarea color dowd cascte TATA athibute importante, disianta fix fad de ponctul start si orientatea 5°—»3" find obligatorie, Fiind situate pe acelasi cromozom ca si gena de reglat, aceste seovente se consider elemente acfionind in cis", spre deosebire de proteinele cu care interactioncaitl considerate a actiona in trans", © a treia clasi de secvenge de 10-20 perechi de baze erese sau scad viteza de inifiere a transcrierii (etapa limitanta de vitezA), motiv penta care au fost desemnate enhancer’, respectiv silencer”, Spre deosebire de secvenfele descrise mai sus, care Rispand de expresia bazali a unor gene, aceste secvenfe indeplinese rolal de reglatori ai expresiei genelor (expresia regiabila). Ele sunt functionale fie in amonte, fie in aval afi de punctul de stan si la distanfe uneori chiar foarte mari fap de promotori (obligatoriu inst in cis), Orientarea relativa fay de gena a clei transeriere 0 coniroleazi poate fi att 9 cit si 3°35" (Fig, 1V.33). ve Uiferite, in funcyie Expresie reglabila Expresie bazala ————_ re “4 Elemente de] | Enhancer ao a caseta cazota gona ‘iepuns Ly] al Ley | dasemnate)|"| silencer CAAT TATA steuctiralé = = —= — | Fig, 1V.83 - Elemente Implicato in ranscriero ta euceriote 187 {Functia acestor elemente de control se realizeaz ca urmare a interactiunii cu factori proteici, respectiv factori de transcriere, avind ca efect modificii conformafionale in ‘molecula de ADN, modificdsi ce pot fi iavorabile sau defuvorabile transrieri. Seovenjele enhancer sunt asociate cu gene care se exprima selectiv in diverse tesuturi, «deci relajia lor cu diferenferea celulard este de admis ‘Tot din clasa secven{clor interesate in expresia gencler fae parte si anumite element care mediaza rispunsul la diferite semnale - motiv penu cafe sunt numite elements de rispuns” (responsive elements) foarte asemanatoare cu enhancer Sunt identiicate .clemente de rispuns" la hormonii glucocorticoii,tiroidieni si alti compusi cu caracter pulemic hidrofob, care pot raversa 2u usurin(l membrana celulard, legindu-se, ulterior, Ia receptori spevfici intracelulari. Complextlhormot-receptor traverseaz’l membrana nuclear si schimb proteina rece tor eu un factor de transcriere avand un domeniu de recunoastere a elementului de rispuns hormonal specific. Toate genele care dispun de un efement de rispuns hormonal, in speld isi vor activa transerierea (vezi slimularea transctierii_genclor ce specifich enzimele-chele ale sluconeogenezei prin glucocorticoizi - hormoni hiperglicemianti. Factori de transcricre specific, interacjionand cu welemente de rispuns" la stresuri termice, chimice ot activeazd transcrierea unui grup de gene aviind ca produsi proteine ce atenucazai stresul: proteine de soc termic, proteine care cheleazt metalele ercle (ca de exemplu metalotioneina, protein] cu conjinul maxe ir grupiri tio!) proteine care se ‘opun stres-ului oxidativ al speciifor reactive de oxigen (superoxid dismutaza) ete © subliniere necesara ta sfirsitul ,odisees* transcrien: toate elementele bazaie saa reglatorii an o caracteristicd comund: interacjiunea cu proteine specifice. ‘Acfiunea ARN polimerazetor T si IT prezint& simitudini dar si diferente majore fat de aetimnea ARN polimeraze I, diferenfe doar consemnate, rt pltrunderea taint lo. i transerieri Transcrierea ADN este suprimatt de edtre unii compusi exogeni, fie prin moditicarea structurii ADN asife} inet acesta sti nu mai poalt servi ca malrifl in sintoza ARN, fie prin inhibarea ARN polimerazelor procariote sau eucariote. Antibioticul actinomicina D, ca si colorantul aeridint, prin portiunea lor plana, se insinueaza intre perechile de baze G=C; aceastt intercalare are ca reaultat distorsiunen moteculei de ADN, care nu mai poate Servi ca matrifti pentru ARN polimeraze. Dependenja unui proces celular de sinteza ARN se ,diagnosticheazat" in vitro prin inhibijia acestuia de catre actinomicina. Rifampicina, un antibiotic extrem de activ in trataea tuberculoze’, se leag’ a subunitaten Ba ARN polimerazei-holoenzim’ din. procariote, prevenind inifierea lwanscrierii, Ea nu inhibat ARN polimerazcle eucatiotelor. Un inlubitor de temut al ARN polimerazetor din celulele animale este produsul unei frumoase ciuperci, Amanita phalloides. Acest produs, amanitina, inhib, cu prectdere, la concentrafii mici, ARN polimeraza TL 1V.4.3, PRELUCRARI CO- $1 POSTTRANSCRIERE ALE MOLECULELOR DE ARN Procesul se referdl ln modificdrile pe care le suferi diferitele tipuri de ARN inainte de implicarea lor in hiosinteza proteinelor. Aceste modificiri decurg atat in nucleu cat si citoplasma si presupunz climinarea din moleculti a unor fragmente polinucleotidice: adiiugarea nor fragmente polinucleotidice; ~ modificari covalente ale bazelor azotate, 188Modificarea majort pe caré 0 suferi transcriptele primare la eucariote consti n scurtarea acestora, Cercetitile ultimilor ani au arttat cit moteculele de ARN (ARN,,, ARN, ARN,, ARN nuclear ,scurt"), rezultate prin transcrierea unor gene structurale, pot si ajunga la Iocul de sintezt a proteinelor cu mult mai scurte deci portiunea din’ genom ce corespunde proteinei respective sau ARN, ARN,. Constatarea a avut ca punct de plecare observatia ca fragmentul de_ADN corespunzitor ARN, ce confine informafia privitoare la sirteza ovalbumnine’ este itrerupt de secvenfe de ADN ce nu se regisesc in ARN, citoplasmatic. Reaulté ef seevengele de baze care cotific8 ovalbumina sunt plasate disconfinau in genom, Secvenjele nucleotidice din cuprinsul genei corespunzitoare ovalbuminei care na se reglisese in molecula de ARN, citoplasmatic s-au denumit ,introni’, iar secverfele nucleotidice transcriptibile si traductibile, delimitate de introni,’s-au denumit ,exoni". Lungimea totala a genei de ovalbumin corespunde la 7700 perechi de baze, in simp ce aceea a ARN, citoplasmatic, la numai 1872. Dintre acestea 1158 perechi de haze codified cei 386 aminoacizi ai proteinei, iar 64 de nucleotide de ta capital 5 si 650 de 4a capital 3° al ARN,, nu sunt traduse. [= Gena ovalbuminel 7700 perechi haze —> i 1872 nucleotide Fig. 1V.94 » Transcrierea genel de ovalbumin, cu obtinerea ‘ranscriptulu primar, urmata de excizia Intronlior, ARN, matur rozultat va servi ce matrié pent sinteza ovalbuminel Constatarea ci ARN,, nuclear este mai lung decat avelasi ARN, ajuns in citoplasm’ a dus {a concluzia ek ARN polimeraza realizeaz’ 0 copie primar idenficl cu inreaga gem, apoi itronii sunt excizaj si exonii se leagt formand ARN, matur,traducibil (Fig. 1V.34). Deparic dea fi un fenomen izolat, discontinuitatea genelor s-a dovedit afi un fenomen evasi-general, Cel mai adesea, secvenfele intron an dimensiuni cu mult mai mari decat cele exon (de peste 100 de oti), ceea ce ar constiui o explicafie paral a faptulu. c& ‘numai $~10% din genoml eucariot reprezinii secvenge codificatoare pentru proteine si ARN, acd seevenjele de nucleotide dintr-un ADN codificdnd o protein nu sunt adiacente, ci secvenfele codificatoare sunt intrerupte de secvente necodificatoare, este eviden: c& Ja eucariote nu se mai poate vorbi de colinearitatea gen’-proteing, ci numai de 0 colinearitate exon-fragment din proteina specificati (corespunzand, probabil, unui domeniu funcional al proteinei), 189 iExcizia intronilor din ARN precursor, biologic inictiv, tipurile de ARN in nucleu, sub acfiunea unor enzime specializate, care irebuie sh Fecunoasci secvenjele de baze la joncfiunea intromexon, st corectti a substratelor gi si efectueze actul catalitic. he In general, intronii au la capatul 5” secvenja GU iar Ia cel 3° seevenfa AG incadrate aadesea fn secvente consens mai lungi. Existi 0 categorie de introni in care, in amonte fajA de capaitul 3° al intromalui (50 nucleotide), este prevent 0 secventi consens, unui situs de ramificare, conjindnd invariabil adenozina: in drojdii, Giferith de cea a vertebratelor, este: 5*-TACTAAC- i Mutat in vecinatatea unei jonejiuni intron-exon, cu precadere in dinucleotidul de la capetele intronvlui, interfer excizia intronilor putnd yenera un ARN inactiv, q lun intron rezidual. Tn uncle -thalasemii sinteza seieuti a lanqurilor B-giobind 's-ar | datora unui defect de excludere a intronilor, av Exeizia intronitor din transcriptete primare “nd crept consecinga incapacitalea ARN nuclear de a .iesi in citoplasma pentru a fi citit. : Excizia intronilor din ARN,. sursti de enzima calli aparjingind exclusiv proteinelor. 1. ARN precursor Exon stang <<, 5' —eveueu-aS AGGGAGG Tatron vu. S\_cucucdoH Gy acccacc—A’ 190 ind procesul de exci Cech gi Zang au evidentiat o modalitate cu totul surprinzatoare de excizie a intronilor ddint-un ARN ribozomal al unui protozoar ciliat — Tetahymena termophila. Tncubarea in vitro a ARN, precursor (transcript primar) cu nucleozd trifosfayi gi extract nuclear, ca a dus la concluzia ct adaosul de extract ‘nuclear era inutil. Se contura ideea intervenjiei autocctalitice a ARN, in procesul de excizie-coasere, idee grea de acceptat, care extindea la acizii ribonucleict un atribut ‘Adaos ‘guanozind 4 AGGGAGG/ A Intron tinker — cucvewu-— Exonireunith i Fig. IV.95.a - Exclzia autocatalitics a intronlior din ARN, la Tetrahymena termophila se realizeazi pentru toate asigure juxtapanerea secven{a consens, conlindndboxe {—& “2 ° F Thou Et ‘OH \ 7 zi 9-0 x0 -[ ; 1 -OH- E. O7=R-O EQ 0- [i T-on+ fr OGR-O | se ee Fig. 95.b - Mecanismut ransesteriicar Tn reactia do oxcizio Lucrindu-se in medi in care contaminarea cu proteina era exclusti (ARN, obfinut prin tehnicile ingineriei genetice si nu prin extractie din nucleu), concluzia indubitabiki a fost aceea ch ARN catalizeazi excizia intronilor si coaserea propriilor exoni, . 1V.35a si b). Acestui tip de ARN,, izolat din Tetrahymena termophila, i s-a dat nhumele de ribozim pentru a consfingiactivtatea sa catalitic. Spre deosebire de enzimele clasice, aceastii enzima avind activitate autocatalitict nu se regiseste neschimbatt ‘dupiactul catalitic. in Kimurirea mecanismului de actiune a ribozimului decisiva a fost constatarea ci la unul dintre capetele intronului excizat se giseste un rest de guanozind care nu exista in ADN. GTP sau guanozina ng erau folosite in scopuri energetice, ci ca agent nuckofil apt sik desfact legtitura fosfat diesterici de 1a unul dintre capetele intzonului, Legarea guanozinei la un loe specific din portiunea intron 0 orienteaz astfel incit 0 amupare -OH a acestcia s% pont ataca legitura fosfat diesterict de la joncfiunea exon- capsitul 5° al_inironului. La capil 5° al exonului exist o secventt de 6 nuclectide pirimidinice CUCUCU care se imperecheaza cu 0 porfiune din intron GGGAGG. Agezai Converabil steric, guanozina alaci joncfiunea exon-intron a capatul 5". Aceastd reachie de iransestvificare are ca rezultal legarea guanozinei (G) la adenind (A) gi eliberarea capita 3° al exonului I. Uracilul (U), devenit caprital 3'-OH liber al exonului 1, efectueaza 0 a doua iransesteificare cu uracilul de la capatul 5° al exonului I, realizandu-se, odati cu excludsrea inironalui, conserea ceior doi exoni (proces de ,splicing") (Fig, 1V.35). De remarcat ch activitatea catalitich a’ ARN, este condifionattt de integritatca conformariet sale, intructt, fntocmai ca o enzima, ‘el trebuie si asigure juxtapunerea 191Corectti a substratclor. Excizia intronilor si coaserea exonilor sunt accelerate, grafic efectului autocatalitic al ribozimului, printr-un factor te ordinul a zece bilioane. Un argument in plus pentru calitatea de catalizator a ARN, este saturabilitatea reactiei ARN, (Gntron) cu GTP sau guaozina (Ky, = 30 M) si inhibitia acestei prin 3°—dezoxi-guanozind, Intronii din categoria descrist, avand capacitate autocatalitict. (Self-splicing) i utilizand GTP (sau guanozina) aditional, ca agent nuclecfil, apartin grupului T de introni. Exon 1 —>|<————— intron. —-—_—»|«— Exon2 ———_ Pad PGpUp__pCpUpRpApYp ApA | pGp + ProARN m t | 1 1, ” R= Purina x | Y= Pirimidina intron oN donefiune | 8) (25) pCpUpReApYp — ApG|-ong-+5'[ = Intron excizat Fig. tvExcizia intronitor din ARN, Excizia intronilor din ARN, cucariol se desfigoar’ similar exciziei intronilor din ARN, presupunind, de asemenea, succesiunen a dowd reactii de trnsesterificare (Fig. 1V.36). Deosebirile fi de excizia inkonilor din ARN, constau in fapul cX agental nucleofil care opereazat prima reactie de transesterificare nu mai este GTP (saw guanovina) liber, ci un ‘nucleotid in cadral intronului, iar excizi intronilor nu este autocaalitid(grupul LI de inten), intr-o prima etapa, gruparea 2'-hidroxi a unei unitigi de adenozin’ atact nucleofil Jegitura fosfat diestericd ce neste exonut 1 (5°) cu intronul, eliberand exonul. Legiitura hous 2°.5’fosfatdiesterict stabilitt dt structurii rezultate forma unui fasou. in cea de-a doua etapi, gruparea Jegatura fosfatdiesteried dint intson si exonul IT (3°). Intronul este eliminat, urménd 4 se degrada, iar cei doi exoni se reunese, Indepairtarca intronilor este catalizat’, in cazul intronilor din grupul II, de un complex "ibonucleoproteic constitit din ARN nuctear scurt (small nuclear RNA = sn RNA), protein: gi ARN, Subiect al prelucri, care poart numele de ,splicozom (spicecsome), prin analogie cu ribozomul. Se consider’ ci dimensiunea mare a splicozom-ului impiedict ARN,, Precursor si prirtseascd nucleulinainte de prelucrarea sa complet la ARN, matt ARN scurt, nucle’ (60300 nucleotide), bogat in uracil, particip sub forma a cinei speci ferite: U;, Us, U,, U/L, desemndnd si tipal de ribonucleoproteine rezullate prin asociere cu protcne: snRNPU,, snNPU;,... (Small nuclear ribonucleoprotein - colocvialcitte snurp). Recunoasterea joncfiunii intron-exon ca gia situsului de ramificare este asigurata de cite snRNPU, Se admite cit snRNPU, recuncaste din ansamblul de transcripte ARN prezente in nucieu numai pe cele confindnd introni. snRNPU; se imperecheazi cu cei doi exoni ce Aancheazat intronul, ceea ce permite discriminarea intre secvenjele GU si AG la limita intron-exon gi alte secvente de acest fel. RNPU; se leag’ la secvenja conscns, 4in intron fiind implicatd in seleetia punctetor de ramificare (Fig. IV.37). Interactia intre ARN, precursor (premesager) si celelaltetipuri de snRNPU nu este clrificatt Asocierea ARN, transcript primar cu snRNPU, presupunfind © multitudine de interacfiuni (proteina-protein, ARN-proteini, ARN-ARN) si o riguroasi intrare in seen’ a componenjilor, asigurd inalta fidelitate a procesului de excizie-coasere a intronilor, realizat cataltic de componenta ARN a snRNPU. ‘Trecerea prin y{urcile caudine” ale splicozomului face din ARN pi pe deplin matur, apt si ajungtt in citosol pentru a fi citit si tradus. -mesager un ARN,, 193tronilor din ARN, ‘Unele molecule de ARN, eucariot conjin in vecinftatea regiunii anticodon succesiuni de nucleotide (20-40) ce corespund unor introni, Spre deosebire de intronii din grupul I si II, acest introni se exclud prin particigarea ‘nor protein-enzime organizate ints-un sistem multienzimatic avind printre multiplele sale activitaji si pe cele de endonucleazat si ligaz (Fig. IV.38), Din demonstrarea capacitiii cataitice a ARN rezulté o idee fundamental din punct de vedere teoretic: dualitatea funcjional& a moleculei de ARN care, pe Hingi calitatea de a fi 0 molecult informaionatt, 0 are si pe aceea de ai functiona drept cataizator, Dupt aprecierea lui Cech, diviziunea muncii in celulii nu pare sii fie chiar atft de strict Problema discontinuitiit genelor la eucatiote este 0 tema fascinant& de biologie, care pune 0 serie de intrebairi al caror rspuns, cel pujin deocamdata, este departe de a fi isfictior. In co moment al evolufiei, cum si in ce scop au aplirut intronii? Procariotele actuate sunt identice ca genom cu cele din care an provenit eucariotele? Dac nu, este posibil ca si procariotele si fi dispus de gene discontinue gi ea variagia posibilitiilor de excizie a intronilor si fi servit evolufici, imbogatind ,repertoriul™ de proteine al acestora. Cu timpul, este probabil ca procariotete s& fi ,renunfat* la ADN necodificator, astel incit si-gi miireasca viteza de crestere prin sciderea cantitii de ADN ce trebuia replicata in fiecare generafic. Este prezenja intronilor avantajoast eucariotelor sau pur si simplu s-au pAstrat prin Jipsa unui aparat de excludere a intronilor? S-ar parea ci prezenga lor este avantajcast Se contureazi ipoteza interventiei intronilor in procesul de diferenfiere celular’. Mai ‘mult, tansportul ARN din nucteu in citoplasma pare sti depinda de prezenya intronilor. Intr-adevar, unii ARN obfiaugi prin transcrierea ADN complementari unor ARN matur (sub acfiunea revers transcriptazei) nu parisesc nucleul; probabil, unii introni codified porfiuni dintr-o enzim, maturaza, implicatl fn insusi transportul ARN. Cervetiri recente au demonstrat o mare flexibilitate a ,aparatului de excizie-sudurit a diverselor regiuni din ARN,, {a eucariote intrucit, dintr-un singur transcript primar pot rezulta numerosi ARN,, matuti gi deci proteine diferite (splicing altenativ). Chiar dact dintr-un singur transcript primar se objin proteine diferite, caracterul monocistronio al ARN,, eucariot se pistreazd, intrucat un singur tip de ARN, matur si un singur polipeptid rezulti intr-un anumit tip de celula, la-un moment dat, prin proces diferite. Un exemplu de splicing altemativ il ofert transcriptul primar-pentru tropomiozin — ‘protein a aparatului contractile prezint& diferenfe structurale in diverse fesuturi. O.genti Unie genereaza un transcript primar unic 7n tate fesuturle care congin tropomiazing. Prin tratarea diferenjiati a exonilor — in unele fesuturiacestia sunt trai ca introni — se obyin tipuri diferite de ARN, matur si deci ropomiazine diferite functie de yesut Fig. 1V.39). Exonii exprimagi in toate jesuturile sunt desemnagi ca fiind consttutivi. 195 iTranscriere I ‘Transcript e-xonucioats . primar ons ARN, | Execizia Intronutut Fig. IV.38 - Prelucratl posttranserier® als ARN, 196sm aa (Wy) sm te tone ne an STR xe Sytnas 5 ag mse aise we_ ps pease SUT ge UT ee Tt LV) tn ass Mugers stint EE ZAG Pew wa ‘sm wpe ES aS on Fig. 1V.39 - Organizerea genei «-tropomiozinel la gobolan; altarnativele de transeriere determina spocifictatoa collars Modificdri posttranseriere adijionale Pe king excluierea insonilor prezenfi in ARN eucariot (gin foarte pufine procaviole —~ mai ales din clasa bucterilorarhaice), numeroase pretucrriadijionle,diferind cu tipul de ARN, desivarsesc trecerea de la ARN transcript primar la ARN matur, functional, succesiunca Jor temporata fiind stabilits cu aproximatic, Modificiri aditionale ale ARN mesager eucariot Spre deosebire de ARN, procariot care este tradus in timp ce este sintetizat, deci se haste matur, la eucariote ARN,, devine functional numai dup modificarea capetetor $° gi 3°. Capaitul 5” al ARN,, este modificat covalent fnts-un proces considerat a fi cetran- scriptional, intruc&t se realizeazd chiar inainte ca deplasarea ARN polimerazei I din situsul de inifiere a transcrierii st fi avut loc. Modificarea const in adugarea unui rest de 7-metil guanocind legat prin legtturt S'S" trifosfat de transcript primar (Fig. 1V.40), La unele specii modificarea ta capttul 5° include si metilarea gruplirii 2° hidroxi din ‘ucleotidul ultim, uneori si penultim, din fostul transcript prima. ~Marcarea* capatului 5° al ARN,, este necesart intrucdt = protejeazt molecula de actiunea 5’~3* exonucleazelor; 197t Bazi Bazi 0. 0~CH, “o-P20 Fig. 1V.40 - Marcarea capatuul 5 al ARN,, = favorizeazA uis..erea, fiind recunoscutt de citre ribozom ca semnal de inifiere « sintezei proteinelor; = reprezintd un semnal de recunoastere pentru enzimele care-1 vor folosi ca substrat in cursul pretucritilor wlterioare, Capital 3° al ARN, este adesea modificat covalent prin poliadenitare — formarea ,covii" poli A (200-300 nucleotide). Poliadenitarea se produce in aval fata de 0 ,seeventt de semnatizare™ a clivirii si poliadenitirit si este rezultatul actiunii concertate a dout enzime: o endonucleazat care taie molecula de ARN,, tn vecinitrea ,secvenjei de semmalizare: si 0 poli-A-polimeraza care, ffst si necesite un template, catalizeaza polimerizarea restwilor adenilat, Semnificafia potiadenitarit la capital 3° al ARN, este obscurl; finfind seama ci in cursul existentei sale in citoplasm coada poli A a ARN,, sufera o scurtare progresi- Va, ca urmare a acfiunit unor 3°95 exonucleaze, se poate dmite c& scopul cozii este aceta de protectie a regiunilor codificatoare. $i tofusi, ARN, pentru histone gi interferon, cel putin, nu sunt potiadenitag In vitro. prezenja cozii poli A s-a dovedit extrem de util. Ea serveste ca ifiator in sinteza ADN pe matrigi de ARN, deci la obfinere: ADN, (“C* pentru complementar), utilizat {in tehnicile de clonare ca si ta izotarea si purificarea ARNw, din totalul de ARN celular din care el reprezintt 0 mict parte, Prelucrarea ARN,, eucariot se incheie cu excizia intronilor (vezi amterio). Modificati aditionale ale ARN de transfer i ‘La procariote, ca gi la eucariote, transcriptul primar confine mai mulfi ARN, precursori i (multimeric). ARN, precursori monomerici, avand extensii 5'si 3° relativ scurte, se objin prin actiunea unui mare numer de ribonucleaze (Fig. 1V.8) ' Jn objinerea capatului 5° al ARN, matur este implica 0 ribonucleaed eu activitate endonucleazici si anume Ribonucleaza P (RNA-aza P), constituit’ dintr-o subunitate de aproximativ 14 KD. 198 ARN de citeva sute de nucleotide si 0 protein’ cu caracer bazic, cu mas’ molecularin vitro, in prezenja unor concentrafii mari de struri, proteina s-a dovedit anu fi hnecesar’ actului cavalitic. Activitatea enzimei in vivo impune prezenfa ambelor subunit, actut eatalitic find insh realizat, aga eum a demonstrat $, Altman, de caire subunitatea ARN, care poate fi considera un ribozim. Prezenga proteinei bazice reduce. 4a concentrafi fiziologice de siruri, repulsia dintre dou molecule inctrcate negativ: dint ribozim - un ARN polianionic ~ si substratul siu ~ ARN, Actianea RNA-avei P se soldeazi cu formarea unor ARN, precursori cu capete 5 mature, De remarcat obligativitatea prezenjei Mg™ sau Mn® pentru activitatea enzimei La cucariote s-a demonstrat activitate de tip ribonucteaz P in nuclew sé mitocordri Spre deosebite de alte enzime ARN, RNA-aza P este o enzim ce se contormeszi scceptici clasice a enzimei, sub aspectul recuperirii sale in urma actului catalitc. Descoperirea ribozimilor ~ enzime in care componenia ARN define activitatea cataltich ~ 1 propulsat aceast& moleculd, diniotdenuna informafionala, pe un teren fina nu demult rezervat proteinelor, a desfiinjat dihotomia genotip-fenotip sia consoiidat ppunctul de vedere al fui L. Johnson privind soaria adevarurilor: orice adevar incepe ca etezie gi se termini ea dogma Se speculeaza cd ARN ar fi molecula primordial’, urmati de ADN si proteine, ccatalizatorul otiginar, si c8 insigi ribozomii, constituifi dintr-un procent foarte mar: de ARN, (aproximatiy 50%), ar juca in celuk’ si un rol catalitic. Argumentul pare afi ~servit™ de cite Noller si colaboratorii care au demonstrat ci ARN, necontaminat de proteine, este apt s8 catalizeze sinteza leghturii peptidice. Objinerea capitului 3° matur al ARN, din anscriptele primare multimerice, presupune © activitale exonucleazic& soldatd, in cazul procariotelor, cu revelarea capitului CCA (toate genele pentru ARN, codifich seevenfa CCA terminus), in cazul eucariotelor, secvenja CCA este adiugatti ulterior de citre o nucleotidt-transferazi aviind ca substrate ATP si CTP, © modificare covalenta pe care © suferi atit ARN, procariot At si cel eucariot consti in modificarea unor baze sau a ozei. Aceste modificiri enzimatic-catalizate constau in alchitit, iotti, hidrogentri, si decurg, in speta. in regiuni de ARN, in care thu exist haze complementare (vezi IV 4.1). Modificari aditionale ale ARN ribozomal clivarea unor ARN, securge similar la procariote gi eucariote si presupun transcripte primare de mari dimensiuni la transripte de dimensiuni mai mici: 30S peat cucariote $i 45S pentru procariote. Acestea vor genera molecule de ARN,, matur: 235, 165, 58 ARN, pentru procariote si 288, 18S si 58S ARN, pentru cucariote, dupti indepattarea tragmentelor spariatoare si, In cazul procariotelor, a ARN, objinut arin transericrea unor gene ARN, intruse (Fig. 1V.41). De menfionat ct ARN, 45S reaulti prin transcrierea, operat’ in nucleol, de etre ARN polimeraza 1, a sute de gene ARN, separate, ARN, 58 rezulti dintr-o molecult precursoare dif, objinult prin transcricrea unci gene, 5S, de cline ARN polimeraza IL Objinerea ARN, matur impli, att la procariote cAt gi la eucariote, modificarea prin metilare a unor baze 199precursor 30S Fig. 1V.41 - Modificiri post transcriere ale molacuielo: 168 ARNE 2s 58 de ARN, (43) ‘metilare + | ‘idrotssenaimatics ws 28 ARNE idroiiza | ensimaticd ARNT 16S ae ARNT 235 5s ANT precursor 45 8 ws 5as 2s iarotzs oar ‘nsimatios ‘moti ARNT ARN? ARN was 538 oes Modificdei adifionale ile ARN nuclear de mici imensiuni Sintetizat de cltre ARN polimeraza II, acest tip de ARN transcript primar va primi 1a capttul stu 5° un rest de 7-metil-guanozin’ (ca si ARN,.) in cursul unui proces contranscriptional Dupti ce ARN scurt* ajunge in citosol, o metitazat local il hipermetileazat dind un capit 5° ce confine 2,2,7 trimetil guanozing’ (m3G); mettarea se realizeaz% numai dup asocierea ARN nuclear ,scurt™ cu proteine specifice sintetizate tn citosol. Ribonucleoproteinele rezultate sunt importate de nucieu, desi proteina nu are semnalele caracteristice proteinelor de import. ‘S-a demonstrat c& introducerea m3G este necesari transportului in muctew, mediat receptorial, ca si learea prealabilt la proteine, 200Din necesitatea ca particula s’ aiba ambele semnale pentru a fi imporfath s-ar putea deduce c¥ numai particulele corect asamblate au acces in nucleu, unde au de indeplinit funchi specifice, IV44, BIOSINTEZA ARN PE MATRITA DE ARN Unele virusuri contin ca material cromozomial ARN. Replicarca acestui ARN in celula gazdi are loc sub acjiunea unei replicaze, 0 ARN polimerazti ARN-dependent’, analoag’, ca mecanism dt actiune, ARN polimerazei ADN-dependent, Replicazele se sintetizeaz’ in organismul gazdi ca raspuns la infectia viral. Ele ‘manifest o specificitate surprinzatoare, folosind ca matriji exclusiy ARN omolog (al virusului cu care a fost infectatt celula). in felul acesta, in celula gazdi are loc replicarea ARN viral, nu sia ARN al celulei gaz, ARN sintetizat pe matriti de ARN ‘omolog nu este complementar, ci identic cu acesta. Dupii infectic so sintetizeaz® pe matrifa ARN (4) o replicd complementara (~), lund nastere o dubli elice constititd AMP 40 = PO- I I CH OH q $ Chg A OH 9 deans a \ OH OH OH 0-co-cH 1 He Aminoacl-ARN, 07Reacfia globald de activare a aminoacidului poate fi scristt aminoacid + ARN,+ ATP. ———> aminoacli~ ARN, + AMP + 2P Pentru activarea fiectsui aminoacid se consuma dout legaturi macroergice. Atit reactia 1 cit si reactia 2 sunt catalizate de ligaze-aminoacil ARN, sintetaze, care ‘manifest 0 extrema specificitate atdt pentru aminoacid cat si pentru ARN, evitindu-se astfel eroarea legirii Ia un anumit ARN, a altui aminoacid decat cel al c&rui codon este complementar cu porjiunea anticodon a ARN, dat. Pe Iéng locul de legare a ARN, gi ATP, enzima este izestra cu ineX dow’ locusuri, unul pentru legarea aminoacidului, avind o dimensiune adecvatt acestuia si altul, hidrolitic. Dac& un aminoacid ce diferx ‘minimal de aminoacidul consacrat se leaga la locusul de legare a aminoacidului activat, ‘enzima recunoaste aminoacidul ,impostor" si-1 exclude prin hidroliza, De exemplu, dact fn Toe de izoleucina se teagt valina, care diferi doar orintr-o grupare meiilenict de prima, enzima corecteaza imediat aceast eroare, expulzdind vatina din locusul hidrolitic, care are dimensiuni potrivite pentru complexul AMP~valing, nu insti gi pentru AMP-izoleucind, Prin hidrotiza complexului valil~AMP, valina este climinati si enzima Jeagat corect izoleucina, Fidelitatea procesului de traducere-respectiv adaptarea corecti a aminoacidului pe matricea de ARN,, si stabilirea seevenfei de aminoacizi caracteristick proteinei de sinttizat este, in mare masut, asigurat de capacitatea de autocontiol a ARN, sintetazelor. IL, Inifierea tangului potipeptidic Citirea de citre ribozom a ARN, 8° face in directia 5’-3" a acestuia, proteina cedificéndu-se de la capdtul amino-terminal spre cel carboxi-terminal. Inigierea presupune ca primi etapa legarea subunitiqii 30 S a ribozomului la ARN. Legarea este mediati de unul dintre cei trei factori de inifiere si anume de factorul de inifiere 3 (FIB), care are si rolul de a preveni reasocerea prematuri a celor dou subunitifi ibozomale. Etapa necesita prezenta GTP. Legarea corect% a ribozomului in dreptul codonului de inijicre, ce specific’ aminoacidul N-terminal, este esenfiati pentru Citirea corecti a mesajului genetic. La procariote, aminoacidul N-terminal este invaria i, N-formil-metionina, Acestui aminoacid fi corespunde pe molecula de ARN,, codonul AUG (uneori si GUG), cel care specifica si metionina neformilaté din cuprinsul lanjului Polipeptidic. Subunitatea ribozomatt 30 S va trebui si discearnd intre AUG corespun- znd N-formil-metioninci, deci aminoacidului initiator, si AUG corespunziind celorialte reziduuri de metionina. Ghidarea corectti a ribozomulti ta capiitul 5° al ARN. in 208reptul codonului de initere, este osibilt datoritt prezenjei la captt- tul S* al ARN, a unet seevenge polinucleotidice (secvenla Shine Dalgamo), adiacent& codonului de inijiere, perfect complementari. cu 0 swvoesiume de nucleotide de la capital 3'-OH al ARN, 16 S, conginut in subu nitatea 30, Semnatul de iniere a traducerii la procatiote este, deci, re Drezentat de codonul AUG precedat de seevena nucleotidic’ descrist, Afinitatea ribozomului pentru sem- nalul de inijiere ar modula viteza leaducerii, aga cum afinitatea ARN polimerazei pentru promotor modu- leaza viteza transcrierii, Asa cum sa mentionat anterior, a procariote, mali ARN, sunt policistronici, codificind dou’ sav mai multe polipeptide. Pe un asifel de ARN, existi multiple semnale 4e inijiere egale numeric cu mum’ ul de lanjuri potipeptidice coditi- ‘cate, Ribozomul, alunecdind peste semnalul de tesrinare 4 sintezeé pri- ‘muti polipeptid (codonul non sens), inifiazd, informat find de un now semnal de i ‘orului lan} polipeptidic. A doua etaptt a procesului de inijiere const in legarea la com: plexul ARN, — subunitate 30 $ a Neformil-metionil~ARNS" sia GTP. La aceasta legare colaboreazat factor de inifete 1 si 2 FI + FI2) N-formi-metionil-ARN/" —rezultt prin formilarea metionil-ARN/™, Fig. V.1 - Cole tel repre fn formarea complexului de inipere,format din ARN" si metionind, sub acfiunea une ransfornaze avand oa donator de grupare form Nformitetabicrfolatu (N'-CHO-FH) rmationina + ARN" ATP —+ metioni-AFNS"+ AMP + PP ‘mation ~ ARN" NI®= CHO = FH, —» formibmetiont ~ ARN" + FH, De subliniat faptul cX exist douai specti diferite de ARN, purtatoare ale metioninei: ARN, si ARN,™, fiecare apt st lege metionina generind metionil~ARN}"™ respectiv metionil~ARN,* Dintre acestea numai metionil~ARN,™" este suscepibilt la formilare generfind aminoacidul inifiator care se va lega la codonul de inigiere, si nu Ia oricare codon AUG de pe ARN, in dreptul locusului peptid de pe rbozom care-1 accept (Fig. V.1). in cea de-a weia etapa a inijierii, subunitatea ribozomal mare, 50 S, se leagh la complexul anterior format, cu eliherarea simultands a factorilor de inifiere si hidrotiza GTP. Se formeazi, astel, ribozomul functional desemnat drept complex de inifiere Formil-metionil-ARN,"*, legat pe principiul complementaritiit bazelor la codonul de initiere, ocupa locusul peptid de pe ribozom (ocupat al fel numai de lanqul poipeptidic in crestere). Locusu! aminoacid al ribozomulu este deocamd:ta liber (Fig, V.t). Ill, Elongarea tangului potipeptidic Procesul consti in adiugarea succesivti de aminoacizi pind la formarea proteinei de sintetizat. ‘Adaiugarea fiectrui aminoacid parcurge mai multe etape, ce se vor exemplifica pentru aminoacidul 2 din catena polipeptidica, 1, Recunoasterea de citre ARN, purtitor al aminoacdului doi a celui de-al doilea codon de pe ARN,. Fixarea corectti a aminoacil~ARN, pe locusul aminoacid de pe ribozom este asiguratd atit de interactiunea codon-anticodon cat si de interacjiunile ce se stabilese ‘nire 0 anumith porfiune a ARN, si locusul aminoacid (A). Aceasta etapa fa clongirii necesit’ prezenfa unui factor de elongare (Tu) legat ta GTP, ea efector alosteric (Fig. V.2). b, Formarea legiturii peptidice prin transferul restului formil-metionil pe gruparea amino a aminoncil~ARN, din focusu’ aminoacid. Reactia este de fapt o reactie de acilare 4 grupei amino din aminoacidul doi, catalizata de © pepiidil transferaza, factorul de clongare G, inclust in subunitatea St! S, Locusul peptid este, tn acest moment, acupat de ARN, iar locusul aminoacid este ocupat, nefiresc, de un ARN, purtitor al ipeptidului format (Fig. V.2.) Energia necesari formarii legaturii peptidice este fumizats de energia eliberath ta desfacerea legturii aminoacid inijiatorARN, corespunziNor, ¢. Glisarea ribozomului de-a lungul ARN,, pe o distarfi de un codon spre capaitul 3° al ARN,, Simaltan are loc hidroliza ARN, (fost purtitor al aminoacidului 1) cu eliberarea sa in citosol. in acest moment, locusul peptid, ajuns in dreptul codonului 2, este ocupat de ARN, purtttor al dipeptidulai, iar locusul aminoacid, ajuns in fata codonului 3, este gata st accepte ARN, purtitor al aminvacidului 3 (Fig. V.2). Aceast& 210‘Compex 4 Une mai he iD om Fig. V.2- Etapa 1 a elongarl alunecare a ribozomului pe ARN, cu toate evenimentele ce insofesc, poart’ numele de wanslocare. Etapa de translocare este catalizaté de o translocaz’ si presupune hidroliza unei molecule de GTP, Ca si in etapa anterioart procesul este condijiorat de existena unor factori de elongare, Procesul de elongare este un proces repetitiv, care se deruleazt absolut analog la formarea urmatoarelor legituri peptic. 21Ponae Ponta A eter aret pevinoact PoxtaP Fig. V. 2a - Etapa 2 a elongail. 212Ponva rset Fig. V.2b - Etapa 3 a elongiiri, 213IV, Terminarea sintezei langului polipeptidic Procesul de elongare se opreste cind ribozomul intalnege unl dintre codonii non sens care semnalizeazs ‘erminarea lantului polipeptidic. Pe unit ARN, exist doi codoni non sens succesivi sau separaji prin 5 codoni, probabil pentru a reduce riscul citirii in continuare a mesajului genetic in azul unei mutaji care schimb tun codon non sens cu unul sens. La acesti codoni, ajunsi in faa ocusului aminoacid, nu se mai Poate Iega.nici un ARN, intrucdt nici 0 secvenfa anticodon nu corespuinde acestora. In acest moment intervin diversi factori de cliberare care efectucazt leghturii polipeptid-ARN,, cu cliberareapolipeptidului,” sub acfiunea peptidil transferazei stransformati" de factorii de eliberare (FE) in hidrolaza; ~ eliberarea ARN, purtor al li- ‘mului aminoacid, din locusul pep ~ disocierea’ ribozomului in subunitifile respective, apte st fnceapt sinteza unui nou tant polipeptdi = dogradarea ARN,, care a servit ca matritt pentru bi sinteza unei proteine, atunet cénd simteza, acesteia nu mai este necesara (Fig. V3.) Biosinteza proteinelor esto, asa cum s-a aritat, un proces de Dieters component mare complexitate care presu- pune si un, consum energetic substangial. Intradevar, la fore ‘marea unei legtturi péplidice se consumi patra legaturi macro- ergice, dout in etapa de activare / reas ogi Deipeat a aminoacizilor (ca ATP) si doud in etapa de elongare (ca GTP), Cele 29 kcal investite in formarea unei legituri peptidice care elibereazii la hidroliz’ numai 5 keal, asigurti ireversibilitatea Procssului si, desigur, delta sa. Fig. V9 - Terminare lanl protec. (UIA y 214Biosinteza proteincior decurge cu o vitezh impresionanti (un lanf polipeptidic de 100 de aminoncizi este edificat de cétre un ribozom de Escherichia colin numai 5 secunde), Pentra adecva fondul de proteine necesitijlor extrem de vavicbile, impuse de Muctuagile de ‘mediu, procariotele cupkeat procesul de transcrere cu cel de traducere; pe miisurl ce ARN polimeriza ADN—dependentt sintetizeazti ARN,, ribozomii efectueaz’\ traducerea acest. Biosinteza proteinelor ta eucariote decurge printr-un mecanism similar cu cel propriu procariotelor; aparatul de sintez’ a proteinelor din Escherichia coli poate s& utlizeze ARN, objinut de ta organismete superioare gist sintetizeze proteine perfect functionale Exist si unele particularitti in destiguraea biosintezei protenelor la eucariot, cum ar fi = aminoacidul initiator nu este N-formil metionina, ci metionina: = pe molecula de ARN, exist un singur semnal de inifiere a traducerii, reprezental, aga cum sa mai arat, “de 7-meiil guanozini legatt prinu-o lepituri wifosfat de 0 stecesiune de nucleotide metilate, urate de codonul AUG (Fig. IV.40), Sinteza proteinclor 4 eucariote incep: cu citiea codonului AUG situst in proximitatea capatului 5° terminal, ‘marca. Nici unl dintreceilalti codon AUG din ARN,, nu vor servi drept codoni de intiere, datoritt exigenfelor de legare ale ribozomului. Ribozomul cucariot mai are un airibut el nu sare” peste codonitterminatori (ca cel procariot), Ca urmae, pe un ARN, eucarioh. hu se poate sintetiza, tntr-o-circumstant’ data, decat un singur lan polipeptidic, chiar find transcript! primar conine informatia cu privre la sinteza mai multor Lani polipeptiice. = viteza procesului de traducere este mai mare in cazul eucariotelor. Citirea ARN, d¢ cite ribozom cu 0 vitezit de 40 codonifsec ar fi total insuficientt pentru eucaviot> éare trebuie st sintetizeze un intreg arsenal de proteine, dintre care unele cu masa mole2utari foarte mare, Pentru ctesterea eficien(ei traducerii, mai mulji ribozomi se angajeazi simultan in citirea ARNys fiecare dintre ei incepdnd citirea de la capatul 5° terminal. Evident, inur-un anumit moment, un ribozom va fi purtitorul unui lant polipeptidie mai lung sau mai scurt, functie de momentul in care a inceput citirea. Ribozomii cei mai propiati de capitul 5” al ARN, spre deosebire de cei care au ajuns aproape de capital 3° terminal, vor purta un lan polipeptidic mult mai scurt, avand inet de .descifat* © mare porfiune de ARN,.. Asocieren mai multor ribozomi, ce tradue sincron aceeasi molecu de ARN,, consttuie un politibozom sau polizom (Fig, V.4,) Se pare c& si procariotele recurg fa formarea polizomilor. Fig, V.4 = Hustrarea schematics a unui polibozom, 215V.3, PRELUCRARI POSTTRADUCERE ALE MOLECULELOR PROTEICE Objinerea unei proteine native, Funcfionale, presupune, cel mai adesea, modificarea lanqului polipeptidic rezultat prin traducere. Prelucrarile pestiraducere constau fn; indepirtarea enzimatica de la capatul N-terminal a restului formil din formil- rietionin’ (la procariote) sau a metioninei (Ia eucariote), ceea ce explicd faptul cd na toate proteinele incep cu acesti aminoacizi; modificarea unor aminoacizi in scopul obfineri celor care nu dispun de cuvinte cod. Hidroxiprotina, hidroxilizina din colagen se objin prin hidroxilarea enzimaticd a protinei, respectiv lizinel. Cisina se formeaza prin oxidarea reriduurlor de cisteind, y-carboxilarea rediduurilor de acid glutamic din unele proteine, indeasebi a celor implicate in coagulare, genereaz8 yrearboxi-glutumat, excelent chelator al calcului, Reacfia este dependent de vitamina K. ~ iodurarea reziduurilor de tirozina ale tireoglobulinei; + atagarea la lanjul polipeptidic a unor grupari funcfionale, de exemplu fosfat, pentra Formarea fosfoproteinelor (fosforilarea reziduurilor de serini a unor enzime reglatoare sau a reziduurilor de serind, treonind, tirozin’ din cazeins), glicozil, pentru formarea slicoproteinelor, biotina, pentru acetil-CoA carboxiligaza etc. ~ clivarea unor oligopeptide in cazul unor proteine sintetizate ca precursori, De exemplu, insulina sintetizatt ca preprohormon este converttl la hormon numai dup indepsirtarea succesiv’ a unor fragmente polipeptidice (vezi insulina) + ADP-ribozilarea (mono- saw poli- ADP-tibozilarea) proteinelor, intlnii la eucariotele superioare, joac’ un rol cenial in procesele de reparare, diferengiere celular, carcinogenezt. Mono ADP-ribozilarea reprezinta 0 modalitate de acfiane a unor toxine bacteriene printre care toxina difterict a holerei etc. care igi aleg, inspirat,finta printre proteinele implicate in transductin unor semnale celu Sursa de ADP riboza este NAD* = S-farnezilarea O prelucrare posttraducere, recent relevath, este S-famezilarea proteinelor. Provesul se adreseazai, in special, polipeptidelor sau proteinelor avand la capsitul carboxi-terminal : cisteina-(aminoacid alifatic),-aminoscid C-terminal si consti in S-famezilarea restului cisteinil catalizatt de 0 S-famezil transferaza (fig. V.5). Protein aa (N terminal, ~ fares ‘i « ) + Famezit pp 5 esiiienetorazs| Mg, Zi” Proteind —aa (N terminal } i na (C terminal ) + PP cys—aa~. oe ‘latch S~farnezil Fig. VS - S - famezilarea proteinelcr 216ctcoes | teats acetil CoA 1 | 2 mevntn == \ os izopentenit pirofosfat (C,) ( CH,= C~CH,~CH,-O®o®) | ‘goranil pirefostat (C.) | 2@o® farnezil pirofostat (C,,) YY’ YYYY “ x colesterol farnezilarea protoinelor Fig. V.6 - Provenienga metabolic’ a fernezi pirofosfatulu gi utiizarea sa. Donatorul radicalului famezil este famezil pirofosfatul, intermediar in biosintéza colesterolului (Fig. V.6). Freovent, famezilarea este acompaniati de metilestrificarea grupiriicarboxi-terminale. Sunt susceptibile In S-famnezilare polipeptide si proteine din clasa proteinelor G, GMP, fosfodiesterazele diverselor jesuturi (vezi hormoni) si alte numeroase proteine corelate cc procesele de transductie a unor semnale extracelulare sau implicate in diviziunea celula Hidrofobia radicalului farnezil ii justific& prezenga in proteinele ancorate la membrene iar depistarea lor in citosol sugereaz c& proteinele famezilate servese ca mesageri secunzi ai unor semnale extracelulare, mediate de proteinele G. 27© intreaga clast de proteine farmezilate este repreze wath de oncoproteine: inhibitor ai famnezif transferazelor sunt considerati ca fiind prom fitori in prevenirea maligniztrii celutare. S-a demonstrat ci mevalonatul, intermediar fn sinteza famezil pirofosfatulu, este necesar replicdsii ADN fn celulele animale, Inhibitor’ si sintezei de mevalonat, cum ar fi mevinolinul (utlizat si in tratamentul hipercolesterolzmiei), inhib cresterea blocaind celulele in faza G,, Reversarea procesului prin adaos de mevalonat, si nu de colesterol, ‘demonstreazii ci intermediarul fasnezil pirofosfat, si nu colesterolul, este responsabil de cresterea celutara, Constatarea nu este incompatibild cv oresterea sintezei de colesterol ‘in celula canceroasa ~ acilarea proteinclor cu radicaliacil ai acizitor gragi(miristolare, palmitoilare) este, de asemenea, 0 modificare posttraducere cu profunde implica fiziotogice. rice proteina, cu o sccvenft anume de aminoacizi, ti dobiindeste, ulterior, conformajia nativa, care ti asigur realizarea functional proteinetor Nurmeroase antibiotice si toxine bacteiene se eompottt ea inhibitor ai procesului de biosinteza a proteinclor. Inhibarea sintezei proteinelor se poate realiza in orice moment al transferulai de informatie ADN-ARN,-protein (Tabel V. Tabet V2 Inhibitor at sintazet proteinetor Compusl | Proceou! Toca de actane Titomicina Foplcare | Inpiedios fle separarea catonelar complomontare de ADN. ‘Acid nalicxle Replicare | Inhiba ADN giraza Bitampicina ‘Tranecviere | Leagé ARN polimeraza, Actinomicina D ‘Transeriere| Se leagii form la ADN, Streptomicina ‘Traducere | interord cu legarea formi-metionil-ARN la looul de intiore, ‘Cloramtenicolul ‘Traduosre | Inhiba peptidi-transteraza Tetraciclina ‘Tradvesre | Inhiba lagarea aminoacil-ARN, la tibozom Entromicina Traducere | Intiba vanstocarea prin lagare la subuntatea 50 S, Puromioina ‘Traducere | Blocheaza elongarea, substituindu-se unui amino- acilARN, in situsul A (este analog structural al extre- rita 3° al tozi-ARt) Traducere | Erori In crea codull genetic Traducere | inkiba translocaza Neomicina, Kanamicina Toxina diterioa Desi actiunea compusilor menjionaji se manifesta, cu prectdere, in organismele procariote, unele sunt Ia fel de active si in cele eucariote(puromicina, actinomicina D, ‘amanitina). 218V4, REGLAREA BIOSINTEZEI PROTEINELOR Mecanismele care regleazit viteza sintezei de proteine au fost studiate in special in azul procariotelor. Activitatea acestora depinde foarte mult de mediul in care triesc, de fluctuatiile in concentratia substanfelor nutritive pe care le utilizeazsi, Procariotele at abilitatea de a-si adecva echipamentul enzimatic la natura surselor de azot sau carbon ce Ii se oferts ele dispun de dowi tipuri de enzime: a, enzime inductibite; b. enzime represibile. a. Enzimele inductibile sunt acelea a ciror concentratie depinde de prezenfa. sau bsenja din mediu a unui compus denamit inductor. In general, enzimele inductibile sunt implicate in cai catabolice. In mod normal, cantitatea de enzime inductibile in celule este foarte micd dar ea poate creste spectaculos atunci cind spare necesitatea utilizar substratului enzimei respective, substrat care se comport ca inductor. Un astfel de exemplu este P-galactozidaza, enzim’ care catalizeaz’ hidroliza lactczei si care este prezentt intr-un numdir minim de exemplare in condifile in care bacteria are la dispozitie alte surse de carbon, de preferin(& glucoza, dar care, in conditiile in care lactoza devine sursa exclusiva de carbon, deci de energie, este sintetizatl in mit de exemplare, Organizati pe principiul maximei economii, bacteria investeste atninoacizi si energie pentru sinteza enzimei numai atunci cdnd aceasta devine imperios necesara. ‘Transferarea bacteriei pe un mediu confindind glucoz’i determina sistarea sintezei B-salactozidazei. Lactoza se comport ca inductor al sintezei enimei ce 0 catabolizeaz. Uiilizarea lactozet presupune participarea a inci dou enzime si anume: 0 permezz, care facititeaza transportul B-galactozidului in interiorul celulei si 0 transacetilaza, a rei functie mu a fost inca precizatS, Lactoza induce sinteza na numai a galactozidazei ci si a celorlalte dou enzime, Inductia prin lactozi este deci coordonat, referindu-se Ja toate enzimele implicate in utitizarea sa, b, Enzimele represibile sunt acelea a ciror concentratie depinde de prezenfa sau absen{a din media a unui compus denumit corepresor. in general, enzimele represibile sunt implicate in ci anabolice, © bacterie care creste pe un mediu confindind surse de azot si carbon este apt si realizeze sinteza tuturor celor 20 de aminoacizi. Daca in mediu se adaug’t unul ~ oricare = dintre scesti aminoacizi, bacteria incetea7A SX product enzimele implicate in biosinteza aminoacidului respectiv, Aminoacidul adugat produce represia sintezei tuturor ‘enzimelor implicate in biosinteza sa. Represia prin produsul final al unei cai anabolice este deci 0 represie coordonat. Explicarea in termeni molecutari a proceselor de inducfie si represie enzimatick se datoreaz lucririlor lui Jacob si Monod. in 1961, acestia elaboreazd modelul privind reglarea biosintezei proteinelor la procariote, reglare ce se efectueaz%i la nivelul trans- crierii, deci a sintezei ARN,,. ‘Modell Jacob-Monod de reglare a biosintezei proteinelor poartti numele de tecria operonului si s-a_bazat, in principiu, pe studiul regltrii metabolismului lactozei in Escherichia coli, Ei au postulat cd genele structurale ce contin informatia cu privire la biosinteza B-galactozidazei, permeazei si transacetilazei (desemnate z.y.x) sunt adiacente fn genom sic viteza sintezei celor tei enzime este guvemnati de un fragment de ADN 219 i idlenumit gen’ reglatoare. Pe aceasti gen’ reglatowre se edifict un ARN, ce contine informajia pentru sinteza unei proteine.denumit’ represor. Acest represor, © protein’ losteica, se leag la un fragment de ADN, desemnat drept operator, cae este adiacent Ja genele structurale a eiror transcriere o controleaz si impreund cu ease formeaz un ‘operon (operonul lac). Genele structurale ale operonului pot fi transcrise afta timp ct operatorul este liber. Legarea represorului Ia operaior blocheazt accesul ARN olimerazei ia locusul promotor avind ca rezultat suprimarea transcrierii genelor stnycturale interesate in metabolizarea lactozei. Ce se intamplt in prezenta lactozei care, aga cum am vitzut, se comport ca inductor, eclansind sinteza celor trei enzime ce 0 eatubolizeaztt) Jacob si Monod admit c& inductoral se leagt specific ta represorul atagat la operator si, inducdnd o tranzijie alosteri’, il convertestc Ino conformatie cu afnitate redust pentru operator; ca urmare, are loc desprinderea acestuia de pe operator. in acea:ti situajie, ARN polimeraza se Jeagt nestanjenit la Jocusu! promotor, inifiindtranscriecea genelor structurale, respectiv sinteza unui ARN, poliistronic pe care se vor edifica cele trei enzime ce eatabolizeaza Jactoza (Fig. V.7). Inductorul realizeaz’ derepresia operonului si permite declansarea proceselor de transcriere si traducere subsecvente. Molezulele de represor libere pot lega si ele molecule de inductor, ceea ce le convertexte fa fone inapte sa se lege Ia operator. Abilitatea represorului de-a se Lega reversibil si cxclusiv la operator sau inductor este responsabiltalft de represia sistemului B-galacozidazt ct 3i de derepresi (india) sa, © intrebare pare inevitabilt: ce se intimpla dact bacteria (E.coli) dispune simultan de slucoza si lactozt!? Se va comporta lactoza ca inductor, impiedicand acjiunea represorului si deci permitand transcrierea genelor lacs lterioara lr traducere? Strategie bacterie este alta; ea cresie pe seama glucozei si numai atunci cind concentrafia acesteia tinge valori minime incepe si utlizeze lactoza, Metsbolizazea simultand a glucozei, combustibil preferat al E.coli, si a factozei sunt excluse; bacteria nu consum’ energie pentru sinteza enzimelor operonului lac atita timp c&t dspune de glucoza (represie prin catabolit). Cum ,simte™ bacteria prezenfa glacozei in mediu si cum se comuta activitatea ci pe utilizarea lactozei cfind concentayia glucozei scade? Rspunsul s-a conturat ca lurmare a urmitoarelor constatit ~ adenozin monofostatul ciclic (AMP), format din ATP sub acjiunea adenilatciclazei si hidrolizat de fosfodiesteraza, reprezint4 semnalul de foame al bacteriei (*hunger signal"), de lipst a glucozei, AMP, se leag’ la o protein receptoare specific’ (proteina receptoare a AMP, = P.R.AMP.), formand complexul AMP-PRAMP,, apt si se lege pe tut locus specific din regiunea promotor. Prezenta complexului in acest locus favorizeaz aceesul si legarea ARN polimerazei Ia promotor (locusul promotor se suprapune partial peste locusul operator) ~ in lipsa glucozei sau la concentrait mici ale acesteia, concentajia AMPe este mares formarea comploxelor cu proteina receptoare si legurea acestein In promotor permite intrarea ARN-polimerazei ia Jocusul promotor. Dact lacoza este prezentd in mediu, operatorul este liber si ARN polimeraza efectueaz’ transcrierea genelor lac. (B- galactozidaza, permeaza, trinsaceilaza) si deci utlizarea lactozei (Fig. V. 8). Atunei cand concentrajia glucozei este mare, concent-aia AMPe este tedusd si, prin absenja complexului AMP P.R.AMP., ARN polimeraza nu se leag’ Ia promotor $i enele Inc nu sunt transcrise fie c& “exist Inctoes, fie cl nu, deci indiferent dacd ‘operatorul este ocupat de represor. 220a Gens reglalpare Gone siroctursle 3 Dey z aon le) : 1 setpery Hil, | | REAR APDADADDAAL 4A polio Mozen'| ‘Ribozomt | Probe’ | 20h eo) \ tlndiclor {-Galectoidess Prmeass Pleinéh Frofeine tl Cotihcale Complex indclor~ represen tach) Fig. V.7 - ustrarea mecanismulul de regiare a biosintozel proteinelor prin induct, Silaare Promotor Qocrator flere £ — — Co el 2 Proven ae at ARN polimerete ol on i ea Frofeind( a te) © (aah. AMP. polimersza BS ier Fig. V.8- Reglarea operonuut lac la E.G Int-un mei continénd giuceza (@) sau lactozt (b 221Complexul AMP.-P.R.AMP., spre deosebire de represor, exerciti' un efect pozitiv in exprimarea operonului lac. Aceast#t dubl&i modalitate de reglare intAinit& Ia numeroase bacterii si vizsind diversi operoni, confer’ acestora 0 mare flexibilitale metabolic’, ermitindu-le si-si ezolve problemele de adaptare la mediul nutrifional ce li se ofert lun moment dat, Teoria operonuiti ofer 0 explicatie i fenomenului de represie prin produs final a biosintezei enzimclor, Genele implicate in biosinteza histidinei-de exemplu-inceteaza si se mai exprime in situatia in care sinteza histidinei in celula depageste utilizarea sa. si ca urmare, aminoacidul se acumuleazi in mediu. in absenja histidinei, represorul, sintetizat de cttre gena reglatoare a operonului His, este inapt si se lege la operator. La concentrafi mari de histidin’ inst, aceasta se leaga la represor si induce 0 tranzijie conformafionalé ce favorizeazsi Jegarea sa Ia operator. Histidina se comport ca un Corepresor reusind si sisteze transcrierea genelor ce codific’ enzimele implicate in Propria sa sintez’. Are loc astfel represia coordonati prin produs final Fig. V.9), Indepartareahistidinei din mediu, respectivuilizarea se, produce derepresia transereri si deci aparitia enzimelor ce o sintetizeazt in termeni general, modelul Jacob-Monod admite existenta unei gene reglatoare care controleaza exprimarea anumitor gene structurale prin intermediul uni proteine, a ciel sintezi 0 specific’, denumiti represor. Activarea represoruluisuprim’ sinteza de ARN,,. deci de proteine, in timp ce inactivarea sa permite transcrierea genelor structurale controlate si sinteza proteinelor respective, Spent fbbbrale i BE Nig ! Liding | Represor, Frodus(goresresor) Mattie — Complex represar-corepresor ie en gr ar 2 s Gena strictureld nv este Hranscrisd Fig. V.8, «lustrarea mecanismului de reglare a biosintezei protelnelor prin represio, 222In cazul enzimelor inductibile, fepresorul este activ in mod normal si genele structurale sunt represate, Cand in mediu apare inductorul, represomul este inactivat de cttre acesta, ceea ce duce la derepresia genelor, deci Ia sinteza enzimei respective. Jn cazul enzimelor represibile, represorul este inactiv in mod normal si_genele structurale se exprim’ ductind fa sinteza unui anumit component celular. Cand in medi se acumuleaz’i produsul final al cli anabolice respective, care se comport. drept corepresor, represorul este activat prin formarea complexului represor-corepresor, producindu-se represia genelor structurale gi sistarea sintezei enzimelor implicate in sinteza metabolitului celular terminal. Tpoteza Jacob-Monod si-n dovedit validitatea in cazul a nenumdirate sisteme enzimatice. Ea a permis interpretarea aciunii unor compusi endo- sau exogeni (medicamente, hormoni) prin mecanisme de inductie si represie enzimatict, contribuind fotodatt ta descifrarea unor mecanisme patogene. Pe Fingtt tipul de reglare descris, bacterile dispun gi de alte mecanisme de control al biosintezei proteinelor, care fe asiguri supraviejuirea. La eucariote, reglarea sintezei proteinelor se realizeaza at la nivelul transcrierit cat si la nivelut traducerii. Mecanismele reglirii fa eucariote sunt putin cumoscute. Reglarea la nivelul transcrieri se realizeaza prin acfiunea nor hormoni, Se stie, de exemplu, ci sinteza unor enzime implicate in gluconeogenezit, cum ar fi piruvat carboxiligaza, fosfoenolpiruvat carboxikinaza, fructozo-1,6-bisfosfataza, este indusa de cortizol. Estrogenii, androgen, vitamina D igi exerciti acjiunea asupra fesuturilor fit radiograic Fig. V.18 - Identficerea unei clone conjintnd segmentul de ADN dori. 240Secvante i. Stnantite deamincacs) MM Gly = Law = Pr — Np ~ Glu ~ Aap ~ Mat ~ Tip ~ Pho = Ya! ~Arg ~ COO™ ‘Codoniponbil (6") GGA LUA CCA'UGG GAA GAC AUG UE WC cK AGA (3) Sage se 600 cue cca! ade coc — Regtine de deganerae mining —! frovesinsice uae oX4 anf Aue uae wf au Fig. V.19 - Detectarea genel une proteine cu seoventa de aminoacizi cunoscuta Biblioreci ADN, Pentru genoamele de mari dimensiuni, utiizarea unei biblioteci genomice comport’ probleme, identificarea nei gene anume find o operafiune dificil, Este motivul pentru care, cel putin in situajia in care scopul clonfrii este acela de a obfine o anume protein’ ceuvariot, se recurge la o bibliotect ADN.. Pentru constituirea ei, ARN,, matur se sepéra de cetelalte tipari de ARN celular, mult mai abundente, prin cromatografie de afinitate pe oligodT imobilizat pe coloan’. Hibrideazti cu oligodT exclusiv ARN, care sunt purtatorii unei cozi poliA; modificarea temperaturi gi concentratie saline permite eluarea ARN, Toate moleculele de ARN,, dintr-o celul& vor servi ca template pentru sinteza tunor ADN, monocatenari, sub actiunea unor reverstranscriptaze virale (Fig. V.20). ADN, dublu catenari, formati pe monocatenele ADN sub aciunea unei ADN polimeraze modificate, se inseri tn vectori de clonare care-i vor introduce in celulele gaz, cconstituindu-se 0 bibliotect| ADN, De remarcat ci, pentru un organism dat bibliotecile genomice au acelagi continat, indiferent de fesutul uttizat ca sursi de ADN, in timp ce conginutul unei biblioteci ADN, exprima functiile specializate ale ficcdirui tip de colulf, reflectate in expresia diferitd a tunor gene particutare in diferite fesutu Reprezentind toate genele exprimate la un moment dat intr-un fesut dat, numairal de clone cuprinse ints-o bibliotect ADN, complet este relativ mic in comparatie cu numsnul de clone dintr-o bibliotecd genomict si deci depistarea unei clone particulare va fi uusurati, © bibliotectt ADN,, reprezentind molecule de ARN, foarte abundente sau mai pujin abundente, este deci mai .tentanti decdt o biblioteci genomicd. Ea prezints avantajul posibititiii une gene eucariote de a se exprima in gazde procariote intrucdt lipsa intronilor nu pune gazdei problema existenei unvi aparat de excizie, ADN, pot, la randul lor, si serveasc’ ca sonde pentru a ,pescui intr-o banc’ genomic anumite gene. maARN + oigenucleotd sinteve fGioatea primer si otrrtrrtr| Gonsiuirea catensj comelementare Ge ADN os onto ever Fansoriaze ARNm - ADN hibris y TrttttTt| ARN este degradat inmedi scale 3 TI-TTTTT| AON polimeraza 3 TITTITTT Fig. V.20 - Gonstruirea nei bibloteci ADN, foloseste ARN, sintetzat prin revers transcriere, ‘V.7.1.2, Exprimarea fenotipicd a informatiei cuprinsé in ADN recombinat Plasmidele hibride, ca i bacteriofagit hibrii, reprezint& ny numai o surst abundent’ de ADN heterolog, dar si 0 modalitate de a objine in eelula gazd’i mari cantitiyi de protcine specificate de genele inserate, Clonarea operonu.ui triptofan din E. coli, de exemplu, a permis sinteza celor cinci enzime ce-i corespund, reprezentfind 40% din proteinele celulare. 242,Utilizarea unci garde procariofe pentru clonarea unei gene eucariote, avand ca scop final objinerea proteinei corespunctoare, poate fi inst un esec dact nu se fine seama de diferenjele notabile inire transcrierea, traducerea gi controlul celor dou’ procese 1a ccucariote fat de procariote, ‘Vectorii care permit transerierea fragmentelor ADN inserate in bacterii poart&i numele de veetori de expresie gi sunt confectionasi in vederea acestui Scop. Prin tehnicile ingineriei genetice s-au objinut mari cantitiyi de insulin’ uman’ (humulina), somatostatin’, hormoni de crestere, fa un grad de puritate pe care tehnicile de izolare nu-l puteau atinge. Tot prin sintezi bacteriand s-au obfinut, fapt remarcabil, interferoni si vaccinuri {21% incovenientele celor clasice, Objinerea activaronstui plasminogenului, utiliza! in teatamentul infarctului de miocard, sia antitripsinei (inhibitor al elastazei), utilizati in tratarea enfizemului pulmonar, se numfri printre succesele tehnotogiei ADN recombinant, ‘Tehnica clontsii genclor a rezolvat probleme de terapie medicali stringente (ratamentul diabetului insulino-dependent, a nanismului hipofizar ete.), a permis ‘modificarea geneticX a unor plante superioare (transfer de yene avind ca rezultatcresterea ficienfei fotosintezei si a rezistenfei ta diferite conditii de mediu), a produs bacterii specializate in degradarea unor poluangiefé. Amplificarea genelor, prin clonare in ‘bacterii,a permis succese remarcabile in genetict (secventializarea genelor, determinarea structurii cromozomilor In eucariote, mecanisme de control in exprimarea genelor). Se ‘anticipeazt utilizarea rezultatelor clonztii genelor in corectarca unor defecte metabalice ‘nndscute, prin transformarea genetic a unor celule somatice. Este de sperat c&i manipularea genetica a microorganismelor va fi practicatt exclasiv ‘n serviciul existenfei in spiritul celei mai inalte si inalterabile bicetici. Incapacitatea bacteriei gazdi de a recunoaste elementele de control al sintezei de ARN si proteine, adgugati la inexistenja aparatului de excizie-coasere a intronilor, ca gia celui de prelucrare posttranscriere, proprit eucariotelor, poate fi depisitt prin utilizarea unor ‘vectori de clonare apji si foloseasch garde eucariote (drojdii, celule animale in cuituri sau in vivo). Prine vectorii de acest tip, cei mai utilizaji sunt vectorii setrovirali modifica. ‘Simplificdind, procesul de clonare a unor vectori retrovirali in celulele animale parcurge cetapele: 1) sub acfiunea revers imnscriptazei, ARN retroviral genereazai un ADN dublu catenar, confinand informatia ARN: 2) 0 gent straind, cea dorith, se insert in ADN, objinfindu-se 0 moleculi de ADN recombinat, Acesta este incapabil si se replice gi st se transcre, intrucSt introducerea gonei pasagere presupune ablajia anterioara a genelor responsabile de aceste: procese (pentru ai_,face loc" gene strtne); 3) ADN recombinat este introdus in celule in cultur, in prezenja, obligatorie, & unui virus helper" ce permite transcrierea sa; ARN viral recombinat rezultat se asamblewzi in particule: virale; 243244 Ganon rue en] [o | PSeeet see ew cae El ma cere oe yn | onsite FON recombrat sta invodusin oauie opt ARN veal fecontinat’ produse ‘rprezenin overs vanscrpts Sinegaze Perteteg ross ‘nieiooed o ould Soman reer inigratineomozamal ae Fig. V.21 - Clonarea tn celule animale @ unor vector retrovirall4) genomul retroviral, purtitor al genet strline, este introdus in celule {int unde este reconvertit la ADN recombinat care se integreazii in genomul gazd’i, unde se poate exprima (Fig. V.21). Eficacitatea transferului genet trebuie si fie verificatt ati la nivelul sintezei ARN, ct sila cel al sintezei proteinei normale, Terapia genica ‘Terapia genicti — un deziderat care prinde contur — urmireste inlocuirea unei gene defeeincase, exprimattint-un produs final defectuos, cu 0 genti normal (irapie de substi). ‘Un numa important de lucri stiinfifice recente se refers la utilizarea adenoviruswrior ecombinate in tratamentul fibrozei chistce (mucoviscidoza). Tentativa a devenit posibila prin separarea si seevenfializarea genei responsabile de producerea acestei maladii, autosomal recesivi, afectind 1/2500 caucarieni, si care se adreseaz, in principal, sistemului digestiv Gin spefi pancreasului exocrin) i respirator (seereyie brongict excesiva cu consecinga infectiilor repetate, Este stabilit c& anomalia biologic’ fundamental care st la originea mucoviscidozei este disfuncfia unui canal ionic pentru cloruri, prezent in membrana celulelor epiteliale, isfuncjie datorati, in majoritatea cazurilor, deletiei unor seziduari de fenilalaning. Introducerea in epiteliul respirator a genei normale, folosind ca vector un adenovirus recombinat caracterizat printr-un tropism particular pentru epiteliuletilor respirator, a condus la rezultate incurajatoare, Pe Ling’ vectorii virai, s-a incercat utitizarea lipazomilor, ca si a unor compusi fiziologici avind afinitate crescuti pentru membrana unor celule tint (imunoglobuline, iransferina etc.) Tebnici recente de terapie gonici ocolese incovenientele introduse de vector retrovirali, recurgind In microinjeejia de ADN (gen) fn nucleul unei celute, Microinjectia de ADN int-un ovul de soarece fecundat, care se introduce ftr-o femett, permite exprimarea gevici striine in goriceii now nascusi (animale transgerice). Prin aceasti (ehnicd, sa reusitintroducerea genei specificind hormonul de erestere Unan in ADN cromozomial al soarecelui, sub controll unui promotor inductibil. $orrecii provenifi din embrioni injectaji capt dimensiunit fabuloase dact in hrana acestora se include inductorul genei pentru hormonul de crestere, ‘Animalele transgenice permit evaluarea funcjici celulare a genelor si a produgilor specificati de ele in cursul diferentiri, in diverse jesutur Se sperfi, in limitele unui optimism moderat, in tratarea bolilor genetice umare, in ‘misura in care defectul genetic este limitat la 0 singur genii, mecanismele biologize ce produc boala sunt injelese si gena normali este clonati, $-a experimental terapia genic cexclusiv pe boli genetice de mare gravitate, cum ar fio forma de imunodeficienss sever determinatii de deficitul enei specificdnd adenozindezaminaza, Introducerea gerei in celulele maduvei osoase pare st aibal rezultatul scontat, 5intr-un viitor, nu tocmai apropiat, pare posibili si abordarea terapiei cancenului, seontandu-se, inclusiv, pe clonarea genei ce specifica factorul de necroz’ tumoral (TNF), De subliniat cin timp ce terapia genic somatica (introducerea materialului genetic in celulele diploide ale organelor bolnave) este permis, terapia genict germinal este interzisa prin lege sau prin consensul comunititii stinfifice intemajionate. V.7.2. CLONAREA GENELOR IN VITRO (Reactia polimerazic& in lan}) © alta modalitate de amplificare a unui fragment specific de ADN, de data aceasta ‘© amplificare in vitro, utilizeaza o reactie enzimatica — accea de polimerizare in lang a dezoxiribonucleotidelor (polymerase chain reaction = PCR), Tehinica PCR, datorata tui Kary Mullis (1984), necesita: 1) molecule sau fragmente de ADN (provenind esengial din lizate celutare); 2) oligonucleotide primeri (amorse), formate din 20-30 de dezoxiribonucleotide care hibrideaza perfect cu extremittile 3° ale fragmentului de amplificat (in situatia in care seevenfa acestuia se eunoasle) sau cu secvenfe ce-t flancheazt acestea se pot objine fie prin addugarea unor fragmente sintetice la capetele fragmentului de analizat, fie prin inserfia fragmentului de amplificat, de secven{% necunoscut, intr-un vector de clonare de secvengii cunoscutt: 3) 0 ADN polimerazti catalizind elongarea celor doi primeri. Utilizarea unei enzime termostabile Taq polimeraza ~ izolata din Thermus aquaticus ~ organism apt si rinses activ la 75-85°C, simplificd metoda ce presupune variaii de temperaturs. Enzima s-a dovedit a aven o foarte bunt procesivitate ~ calitate remarcabill pentru 0 enzima care eadifict un potinucleotid; 4) cei patru dezoxiribonucleorid tifostaf. ‘Tehnica in sine reprezint un eicta repetabil, constind in + separarca celor douti catene de ADN prin denaturare termict, + cuplarea primerilor, adtiugafi in exces, cu secvenfele complementare (annealing); + polimerizarea, respectiy elongarea primerilor in directia 5-3". Operatiile se repett pang la obsinerea unei canttatisuficiente de produs. In general, Ciclul se reia de 25-30 de ori, secvenga de interes fiind dubkua la fiecare ciclu, derulat pe parcursul citorva minute (Fig, V.22). Dup’ cAteva ciciusi, produsul major este un fragment de ADN cu o lungime egala cu suma lungimilor celor doi primeri plus segimentul ADN de interes. Auributele evidente ale acestei tehnici sunt: selectivitatea, sensibiltatea, rapiditatea. Fragmente de ADN virtual pure, din genoame complexe, pot fi objinute pe parcursul cAtorva ore, in contrast cu Siptimanile ,pretinse™ de clonarea tradifiondl. Supremagia metodei rezultt si din canttatea de material necesar — o singuri molecul& de ADN si nu milioane, necesare clontirii standard"; mai mult tehnica nu presupune un ADN purificat. In plus, pentru amplificarea unui fragment specific de ADN nu este obligatoriu si se cunoasea secvenja nucleotidicd a segmentu.ui inti de ADN. 246fragment de clonat s Dp a e Po a P2 3 ; eS Lo (ParAseAeRGSS)- mG ——SOACGTATEGTGTCCGATTGCCA— 5° elelul 4 cletul 2 Fig. V.22 - Clonaroa genelor prin tehnica PCR (P,P, = primer’) Specificitatea se asigur’, in spefi, prin alegerea unor primeri (care flancheazit iy fragmentul de ADN ,4intt") suficient de lungi, astfel incat secvenga lor s& fie, virtual, | tunica in-genom. intrucat interacyiunea prin Iegituri de hidrogen a primerilor cu | fragmentul fint& este dependenti de temperaturi si concentratia salina, amplificarea i specifict este condifionatii de stabilirea riguroasti a condifiilor de lueru. a | 247i i | q Ubilizarea unei polimeraze termostabile permite alegerea unor temperaturi de cuplare primer-ADN suficient de mari (92-96°C) pentru a exclude interactiuni primer-template de joast specificitate Recent, s-a imaginat o strategie de Iucru care limieaz amplificarea strict ta fragmentul ,jintt*. Alituri de primerit ,consacrati", se uilizeszai un primer intern. Dupt prima rundi de amplificare, desfigurat in prezenfa celor trei primeri, se ajusteaz temperatura astfel ineit sti fie favorizat cuplarea primar intern — secveng tint (Gelectivitate infilibite). Tehnica PCR se practic& in aparate automate, cu controlul strict al timpului gi temperaturii, permigtnd amplificarea unui ADN, care nu trebuie si fie nici purificat nici ~proaspit", provenind chiar dintr-o singura piciturk de singe, sperm, saliva sau un Singur fir de pir. Aplicayiile practice ale tehnicii de clonare in vitro sunt numeroase si usor de imaginat: stabilirea diagnosticului prenatal intr-o larg arie de boli genetice, detectarea polimorfis- mmului alelic, detectarea infectiilor virale inainte de aparitia simptomelor sau a unui "ispuns imun manifest, wierea suspectilor si idenificarea celui vinovat in medicina legal. V7.3, APLICATIL ALE CLONARII GENELOR (Determinarea secvenjei nucleotidelor in oligonucleotide) Clonarea genetor prin metodele descrise anterior-Tehnologia ADN recombinant $i Tehnica PCR — permite obfinerea, in cantitiyi suficiente, « unor polinucleotide a ciror seovengi trebuie determinata. Metoda chimica Stabilitt de Maxam si Gilbert, metoda, simpli si riguroas’, are ca_principin fragmentarea ADN gi separarea electroforetici a fragmentelor rezultate, functie de ‘drimea lor gi independent de natura bazelor, urmata de icentificarea avestora. Simplificand, etapele s-ar succeda astfel: 1) se marcheaz’ unul dintre capetele ADN clonat cu ™P. 2) se separa cele douti catene si se izoleazdt populatia omogend, constitu din acceasi monocatentt, 3) se utilizeazi patru probe de ADN monocatenar marcet la capatul 5° (de exempt) si fiecare se supune unui agent chimic care distrage selectiv una dintre cele patru baze. S& admitem ci oligonucteotidul marcat la capital 5” este: -G'CICGTCAA-si cin proba I este degrada timina, in a 2-acitozina, in a 3-a guanina si in utima adenina, Prin distrugerea in proba 1 a timinei, oligonucleotidul este scindat in fragmente de diferite dimensiuni, care vor avea sau nu capitol 5° marcat. Prin tndepZirtarea, fo: la intimplare, a citozinei, guaninei, adeninei din probele 2,3,4, se obfin seturi de fragmente de dimensiunt diferite (mono, di, ti, tetra-nucteotide), 4) se separi electroforetic fragmentele obfinute in fiecars dintre cele patru probe, pe gel de poliacrilamida. Este necesar ca puterea de rezolutie a geluritor si permit separarea, neambigu’, a ‘unor fragmente diferind print-un singur nucleotid. Impunerea acestui unic criteriu, al 248lungimii fragmentelor, se realizeaz prin alegerea condiiilor de separare: gelul congne uree (-8M), iar electroforeza se realizeaza la ~$5°C, pentru a elimina orice asociere prin legituri de hidrogen a bazelor. 3) se identifict autoradiografic, exclusiv, fragmentele dinspre capatul 5°, care a fost ‘marcat gi se indic naman! de nucleotide corespanzitorfieeteuia prin comparare cu un etalon, ‘Admitind (Fig. V.23) c8 in proba 1, tn care s-a excizat timina, s-au obfinut di- si pentanucleotide macate (G'C si G'CTCG), este evident ct timina reprezintt mucleotidu: 3, respectiv 6 din oligonuclectidul anaizat, Similar, dain proba 2, din care s-a exclus citozina, se objin mono, tri, hexanucleotide marcate (G*- capatul 5°, G°CT, G°CTCGT) rezulta ck nucleotidele 2, 4 si 7 din oligonucleotidul de analizat sunt reprezentate de citozin’. Raiondind similar pentru pattemul obfinat in cazul probelor 2 si 4, rezulti c& oligovu- leotidul analizat este mononucleotidul GCTOGTCAA. Se poate conchide ca secvenfa nucleotidelor din orice ADN poate f stabilit direct pe gelul autoradiografia, citindu-l de jos in sus. Oligonycleotid GCICGTCAA oe analiza: : : baud excrratd i {al 1G [A dr gore gyrore 7 iy. Gl. Kagments revlo- Berog _ Gtereor oh "_ GCTe6TCA Stat ee 7 Sart \genanucleatid celonucteoric | orrrcare Aeptractet Vavanvcten \entanvel eee | vant or. |minvcteotie 6 - | diracleohi, | | \nanenueeatg, 2 Bas Probae Prope Oe. Probe? frobae Proba 7 Taha Fig, V.23 - Determinarea secvengel nucleotidelor dupa tehnica Maxam gi Gilbert 249De mengionat cf, in fapt, degradarea chimic’ afectezz’i ambele baze purinice (atat A, cat gi G) ca si ambele baze pirimidinice (att C, cat si T) t masurd diferiti, functie de condi, Problema se rezolva cu acutatefe, folosind probe caplate; G gi G+A, C i CAT. Modificind condiqiite de tucru, de exemplu in cadrul cuplului G/G+A, intr-0 proba se distruge, prin excelent, G, in timp ce in cea de-a dous se distrug gi se eliberewzt (prin ruperea legiturilor fostat diesterice), la viteze comparabile, att G, cit si A. Reziduurile | A se pot identifica comparind pe electroforez’ pozijiile G cu cele G+A; similar pentru cuplul C/C+T Fig, V.24), Tntrucdt nucleotidul 5° terminal nu poate fi identificat (se distruge) si o verificare a secvenfei catenei ADN jn studiu este necesart, se recurge la secvenfializarea paralelti a catenei complementare, dup marcarea acesteia cu ™P, ‘Metoda encimatica O modalitate altemnativa de determinare a secvengei ADN clonat este metoda Sanger. Spre deosebire de metoda Maxam si Gilbert, care este o metoda chimica, aceast§ tehnic este o metodaenzimatic’: ca igi propune si determine secyenfa catenet complementare cu cea de anatizat, avdnd ca principiu intreruperca controtati a sintezei acesteia prin incorporarea nor analogi structurali ai dezoxiribonucteozid trifostailor ‘rope stricturii ADN, i Sinteza in vitro a catenei ADN complementart presupune prezenta: 1) monocatenei ADN de secvenializat, utiizats ca matsiti (Lemplate) si care provine, in general, dintr-un fragment de restrict. 2) unui primer complementar ea o mick por- fiume de la capritul 3° al catenci de replicat, care se marcheazii cu P. Acesta se objine cu usuringt {innd seama de faptul cf fragmentele de restriotie sunt flancate de seevenfe cunoscute. 3) ADN polimerazei 1 din care sa exelus regiunea cu activitate 5’-3" exonucleazicd, rezul- tnd .fragmentul Klenos 4) celor patru 2° dezoxinucleozid tifosfajs dATP, CTP, AGTP, ATP, dintre care cel pofin unul este ‘marcat (ca alternativa la marvarca primeruli). 5) mici cantititi din cei patru 2’-3” didezoxinu- leozid trifosfati: ddA TP, ddCTP, ddGTP, da TP, ca analogi structurali ai 2° dezoximucleozid twifos- falilor, Este ugor de imaginat ci absenja grupei OH din dNTP face imposibili continuarea sin- tezei ADN in momentul in care nul dintze acegiia cAstigi in competiia cu dNTP dictat de mattis Sinteza ADN poste fi deci intrerupti, prematur si ‘ntimplitor, la oricare dintre reziduurile nucleotide. Fig. V.24 - Autoradiogratle de control 250Experimental se realizeuz in patra probe distinete care difert inte ele, exclusiv. prin natura daNTP utiliza, Fiecare proba va confine fragmente de ADN de dimensiuni diferite vind Ia capa! 3° acel dNTP, apirut prin hazard, oFi de cate ori ADN polimeraza a incorporat in locul unui NTP. ‘Cele patru seturi de fragmente objinute in fiecare dintre cele patrs probe se supan, 600, + 64,0 . prin intermediul unei lungi seecesiuni de reach dintre care unele de oxidare: GyH,.0, ——> 1, ——» 1; ——» 1 > —> —> 800, 4 64,0 unde fy, Ip ty sunt intermedia Starea final a sistemului este aceeasiindiferent c& CO) si €7,0}-au objinat prin prima sau a doua transformare (dac& condifiile in care se afl doi produgi sunt identice), in timp ce prima transformare nu are nici-o importanfa pentru organismele vii, cea de a doua este esenjial’ aga cum va reiesi in continuare din acest capitol gi din capitolul de ‘metabolism slucidic, Fapiul ins c& in ambele cazuri se objineactias.canttate de ence este.o dovad’ a tirii legilor termodinamicii in lumea vic. Legile termodinamicii sunt relajiile, formulate adescori matematic, intre functiile de stare, La baza tuturor acestorlegi siau dows principii, adeviruri incontestable reiesite din nenumarate obsrvatii ale fenomenelor naturale, precum si din experiente Principiut 1 este principiul conservirit energiei: formulat la modul foarte general el precizeact cl [p,.Stise.RIDess NeskialOal Wunivssuluinse.consssadi". El prevede posibilitatea transformarii unei forme de energie in altele, fiind formulat si astfel: _Chetgia bapoaialiceall nici disimist..ca.ealesulocisdodsisanstommliindintiand£ouy jo.alla, sau. peate.tmceade.Jaun,sistomedaaltal™. Principiul Tl, numit si principiul evolutici, siabileste sensul in care au loc transfor- imaiile Insogie de schimhiii de energie, FI statuenza cA .enlropia univers crs" pozslivt Kentasl! ~ QC psmit Keisial Pentru a respecta in intregime condifile in care se desfigoard reactile in organismele vii, in locul valorii AG" care corespunde pH-ului imprimat de reactivi si produgi se utlizeaztt valoarea corectata pentru pH = 7 notati AG”. Pentru un numa foarte mare de reacfii care au loc tn lumea vie aceste corecjii sunt cunoscute (se dau in tabete) Valorite AG” peniru diverse tipuri de reactit sunt date in Tabelul VILL. Se impune injelegerea corectt semnificagilor Ini AG™ si AG: AG" indict sensulide, rare a reactiel in condiit standard (inglysly pH-ul = 7) i este ¢ constant, in timp ce ag ate Maral enero WSS NOSE Ti conde EETIEE card" Toe Tile In organismul viu (concentrayii diferite de 1M a reactangilor i produsilor de reactie, HH diferit de 7, eventual T diferit de 298°K), Ideal ar fi ca pentru fiecare reacgie s8 se poatit calcula AG care reda starea energetic’ reall in sistemul biologic: acest lucru este posibil {n ultima vreme pentru reacji care au Toc in ast numitele .sisleme acelulare™. Pentru celelalte este utilizat% valoarea AG, care, in majoritatea cxzurilor, red suficient de corect tendinga de evoluje a sistemului * ca rare excep, pl-ul fn esate’ precum si al umosilor din organism unan este fn jurul valor de 7, 264VL4.2. VARIATIA ENERGIEI LIBERE IN REACTHLE DE OXIDO-REDUCERE, POTENTIALUL REDOX §I LEGATURA LUI CU ENERGIA LIBERA Datele din Tabelul VII evidentiaz’ ck AG*” in reactile de oxidare a glucozei si a aciailor gragi la CO, si H,0 au valori negative foarte mari, Aceste valori au fost objinate pe glucozt acid palmitic care s-au oxidat in bomba calorimetrict, Dar, aga cum 5-2 aritat mai inainte, aceleasi valori ale AG" totale se obfin si prin oxidarea treptatt Ia CO, si H,0 a celor doi compusi in vivo. In faptul c& aceste valori negative ale AG™ sunt Foarte ridicate rezid& explicajia c& oxidarea glucidelor si a lipidelor in organismele vii ‘este responsabili de producerea celei mai mari pari a energiei Tobet 1 Valorie AG pentru etera rae care au len ngs vit Til reat Rea 2 Serine Tal pie 0, 1660, 5 TO “28 Oxi Gites 60, > 660, iLO = 686 tas ‘aban 5 > Glete € Prctonk “Ss ites Aierhp Abeer, 3 Hees Gheourdch + HO => Chases +P 3 Tess Ghuseob 5 Ohaneer a times fide Ast foneres HO ott a Aad Mung SM. Chuunin «1.0 we Contos Gisitts Gina Gholghena 9 3 jin cazul reacfiilor de oxido-teducere AG” se poate calcula din relajia care Teag’ aceasti mirime de varafia potenfialului redox standard corectat pentru pH = 7, notatl AE, unde n_este_nu ie ia) cohiyalt ‘Valoiiea ‘lui E; se objine misurind pe E, (Fig. V1.2) care este potentialul redox standard al sistemuui de oxido-reducere la pH = 0 st adugind -0,421 voli cat reprezints ppotenfialul redox al unui electrod de hidrogen th care [H') = 107 ionifitru fas de electrodul normal de hidrogen, Fig. Vi2. ~ Determinarea potentlull redox standard (E)yal unui sistem de oxido- reducers, Electrodul normal de hidrogen const dintr-o { —— — plac de plating platinats Ee é Extundata fnr-o souutie de | @ ‘ eT Hs ail ‘acid tara_de_conceniratie Tub cu solufiey atm. Readtia de oxido- Fe Ket paar cre ate oe te le? Bi 20, Potongas ‘elon al ‘acest sloctod = IM in care. se sufla un 1 z Y ‘curent de H, la presiune de | solildld Je | w# Se orncawongs Soon Ce/y/; Llechropul Sane Sormet entdale as Buisurere ROTC) ‘opie reduse sunt de 1M. de tleragen‘Valorie E; pentny o serie de reactit redox importante in biocimie se dau tn Tabelul VI. Tabell VI2 YVolorile Ef ale unor sisteme redox (determinate a tmperaturs tutte 25 » 30°C Reactia de eecirod wi! 2H + 26 eH, = 021 @ -cologlutarat + CO, + 2H" + 22° «2 aocirat = 0380 NAD" + 2H" +20 » NADH +H = 0320 NADP" + 2H" + 2e ® NADPH +H = 0324 Piruvat + 24° + 2e' © Lactat = 018s (Oxaloacetat + 2H" + 26" = malat 20,166 Fumarat + 211° + 26» succinat = 0,031 2 eit Gay 20 #2 EH Cay $0254 2eit ajay 22 2 cit a #0385 12.0, * 2H +26 eH +0816 {In afara posibititititor ce le oferi pentru calculul lui AG", valorile potengialelor redox standard sunt utile gi in stabitirea sensului de curgere a electonilor in sisteme conginannd ‘mai multe cupluri de oxidoreducere (vezi ,Lanjul respirator); ca gi in cazul lui AG", valoarea informajionali a lui E; este limitat% ta condipile standard. Potenfialul redox al ‘unui sistem care nu se afl in condi standard se calculew cu ajutoral reli: wer, AT p LO Be ESs oe Tred] unde R, Tn si F sunt constantele inidinite si anterior, [Ox] gi {Red} reprezentind concentrafile formei oxidate, respectiv reduse. VLS. CUPLAREA REACTIILOR ENDERGONICE CU CELE EXERGONICE; INTERMEDIARUL ENERGETIC COMUN Organismele vii utlizeaz’ in permaneng’ mari canttiyi de energie att pentru singeza commusilorcy simcturi compleas (proteine. acizi nucleic. pide, zahaide.gt.), cit si peniru susjinerea unor Rggcssk,cum Sun coniracin musculyg, excttalis. transport activ sialele, Toate aceste procese sunt susjinute degaglils exergonics) Eiberarea de ence prin aceste react se Face chiar fa locul desfiguriri: proveselor Consumatoare si numai {n limitele necesarutui, Este evident cd transieral energie’ ibere rezultata din reacile exrgonice clilre acesle procese, toate avand o bazii molecular’, trebuie sti se realizeze cu 266. ene a sibil numaY pe cal aus, ‘slina desflourar, cles care csc MARRS. Sunt cunoscute dow. ‘variante de cuplay a) £3 i ‘Acest cuplaj nu este strict specific lumii vii el fiind intalnit gi in chimia ‘organicd sali cea anorganicd. Un exemplu din aceste domenii este cuplarea reacligi de hidroliz3 a anhidridei acetice cu: sinteza acetatului.d¢,clil din acidacchic, 31 alcool ctiics H,— 6-0 >e 2 HO ——» 204, — C00: EGO ce ara teats on 0 enduagews, CH, — COOH + C,H,— OH ——» CH, — CO00,H,: cHy—0-0 So + om 04 —+ cH C006 H+ C1 — COOH: 171 ee 47 Kear on, -Co0 ‘n acest caz, shimbubide casos bak se realizea8 prin jnkenediul aciduluiassic a chr Somme. eine sigur desisuraiea. cele. dss dau. Tn organismele vii opereaz numeroase reaciii cuplate in acest mod, Ele sunt, de regult, teaelinsuscesivs inacadtul dcedsiasinctiamstabolics, Un exemplu il oferd dout reacjii succesive care foe parte din calea.de, desradure. a. glicogenuli ip. muse ‘lucozo-1-fostat ———m glucozo-6-fosfat si glucoz0-S-fosfat. ——m fructozo-6cfostat: glucoz0-1-tostat Fosiogucorntacs §— ag = 4,74 oatmol lucoze-.ostt Giucorotostatzomeraze yg 40,40 keane! fructozo-6-fostat Pe angamblu: AG = -1,74 + 0,40 = -1,94 kcal/mol Existentaaccstor.cunlaleacoashitbiaunadin.caplicabilsedsstisusisiicn mars, iSMens (Ua duoniacls yi ANdlndtilelA ile iia tslanpchbsdn aden OOGN SUNT Gzomerizarea glucozo-6-fosfat » fructozo-6-fosfat) 267>) cuplarea seaciei endermonice Jaaseactia exerzonic, rin .intennediag energetic comun (Fig. V1.3); jgteimedianal comus este reprezentat de fapt de doi. compushslinixe Gare Uhul este yegneraslizal si al dojdes. enemizat 1). ei. doi compusi sunt intercon yertibili prin sasuemaRBaM de energic. her, Meccnismul.acestut Cuplaj care asigura ransferul energiei_libere. de la reactile, exergonige ale calor degradative ale slucidelo, lipidelor si proteinelor cdr cele mai diverse reacti consumatoare de energie, este prezentat in continuare VI6. LEGATURILE MACROERGICE. SISTEMUL ATP/ADP, PRINCIPALUL INTERMEDIAR ENERGETIC COMUN (COMPUS MACROERGIC) Stitile F si ale interediarului energetic comun mu au nici o fegttur cu strile excita - neexcitati ale atomilor si moleculelor, stisi convertibile prin absorbje-emisie de cuante de ‘energie. I" reprezinta un compas care are ,egituri macroergice* in timp ce T este produsul reacfici de hidrolizt a lui; dup caz, el nu are sau mai are ino legaturk macroergica, Deoaréce sistemul format. din ATP. (acidul adenozinuifosteric), corespunzitor lui J si ADR.Lmai,desraba, ADP. +P.) corespunziitor Jui J, constituie intermediarul energetic comun al majoritatii cuplajclor, se prezint& mecanismul funcfionarii acestuia. ATP-ul ca sialfi compus care au IsgSiurimacroeraie sunt denumificurent .compusi smacroergicis desi corect este st fie denumii .gompusi.suieedtur.macrocagice”. In cafeng ATP, care ccuprinde rei resturi.dle, cid. fosforice sunt oud Jeetturi macroergige, motate ss > ff te ) Cele dows lagaturl macrosrgice din ATPFig. Via - Cuplarea reactilor ende‘gonice ‘ou ele exergonice prin intermediar corrun Soindarea, hidvolitigl a ATP,(redat in forma ionizat’ aga cum se afl el in solufie sau {n mediul biologic), poate avea Toc in dow modur: la ADP + P,.respectiv la AMP. + PP. °° 9 gk 8 -o-bao- Bonk o- Adnainas 42 aaa bob b ° a) u . ot rO= PH O- Ademanas"O-P ~0— PHO” ‘ 1 o oo AG? =-7.3 Kealimol fn ficcare dintse, cele. dow. scindigi se rupe 0 legdtur .macrocrict ja.AG” este de -7.3 kcal/mol; aceastt valoare s-a Iuat in bioenergetic’ drept referind in sensul ci legit macroergice sunt considerate acelea care, prin, scindars hidolificd lihearsaz” cel Rujipatiiaenersig fm % ook } aunt) Teoretc, lexitura macrocraies mast ADP. sa. nul scinds hidroitis..s ibe ET eek maui puoioans et ne iol in schimb. Iegiitura macroergicd! din gcidul,pitafosforic este scindat hidrotitic xtc) d.zapid,,jn celule existind ghzima punfastatzz: energin care se elibereazi este chiar ceva mii mare decat -7,3 keal/mol. ° I ~O—P—OH+H,O ——» 2H,PO,; AG" = -B kcal/mol | 1 oH OH 269)Pe =~ PlRoFosTAT Cea de a, ein tepid P-O.din ATP, nu,este.macroergicd, Pe de alt parte, in celule, ‘nici nu existt enztine. care sil asigure aceasti \G” pentru accasti scindare a fost ‘otust miisurals qfectuindu-se fn vitro, hidroliza AMP +H,O ———m Adenozind +H,PO,; Ag” (4 kealinol Exist mai multe explicait in legtturt cu valgarea negatv’ idicatl a, AG" tn corsa bidrolizei, lesaturilor.R=0 din, ATP. si, din pitofostats, ~ in primul rind, gepulsia electrostatics, ATP, la pH7, are patru si ¢ sc.xesping sai putemnic deciit cele (rei din ADP, respectiv cele dows din acidul fosfories silyaia ose asem i 4 Min al doiea rind, at in ATP. cd, $n pirofosta legttrile cu caracter, macroessi unten annie (nse ous res ete) San abiltaigs W2TzTor care rezultS prin hidrolizi este mull superioard celei_a anhidridelor, acizit existing mggomere,, 7} in al ieilea aspect este Jepat de rol ionilor delMg"Vincetule, SLE. sunt complexati cu acest oni: att ATP. cit $i 2 9 6 °° wo ot i ott “O—P-0-F-0-F—0—Admmind “0-0 FP Adon ! ooo o o “age ue o gare Wi MigaoP- Ho=P — om toy On Mg MgHPO, Deoarece Mg este de, cca i. eed ATB (= 38.10%), reugjig de hidrol ra PsP, Tn cele mai multe dintre eazurile in ATE Luleand caste, 6s See deo si.P,»Scindorea ATP, la AMP. +, PB, urmata de scindarea rapid a acestuia din urindT& DP, ‘este intGlniti mai rar, ea este ins avantajoast din punct de vedere energetic (AG”. = -15,3 keal/mol); aceasta scindare a ATP se realizeazt cfind reactia endergonick cuplath i mul de 73 REAYMIOL Cele Gould variante se exemplified prin" Feacilé 270LA ucozei constind ii fosforlarea ei In glucozo-6-osfats intruedt reac ia SCRE TS heal, sie Saficienalemndarer ATPIPADE'S Pp: cH, — OH CH, ~O— POM, 0; \ hevokinars oH sap = » + ADP on OH on oH 2. Activarea acizilor grag). constind in trecerea tor in derivafi acil-CoA, necesit& mai malt de 7.3 keal/mot (pentru formarea legtturii macroergice C-S); ATP se scindeaz in acest caz la AMP + PP,, pirofosfarul scindindu-se rapid la ° Yotraza zo R—COOH+ ATP 4 CoA- SH ———» R-G~ SCoA+ AMP + PP, piofostatara PP4H,O —> 2P, nsumpl. de ATP ip, organism este permanent; da ante see (gnc SSE Gcliyitaien sistem nervos central); de aceea cl trebuie sit se resintetizeze rot fimrul, aspect ce vir fi prezenta in continue. Se fc acum doar precizirile: in timp ce ADP.+.P,., refonncaztt ATP. Cin condigile care vor fi precizate), din AMP. st osibilt.@ resiqtezA, directs ip muschi, se poate realiza o sintezt indire aigi_a enzimel gdenilatkinazte ‘adonilakinaz’ AMP + ATP awe BADP Din ADP se sintslizazapai ALP prin cuplare cup VL7. ALTI COMPUSI MACROERGICL POTENTIALUL DE TRANSFER ~ A GRUPARI FOSFAT Celelalte nucleotide trifosforilate, cu ribozt sau dezoxiriboztt, servese in anumite situafii drept compusi macroergici. Aste} iit A. este utilizat, in gagmil "peabolismului glucidic, Ja sinteza UDP-slucazel care paticips la ‘biosiniza * eatin aces, ea ne le fostorti, axe fo a doi inp: hioliza ATP ls ADP-+ , gl reagia Pew glo an 1 1slicoxenulu, ranslonmacca.galasiozei jn, elucozd sLalteles CTP activeazt unii compuyi iipidici in timp ce fa sinteza proteinelor paricips alle ATP cat si GTB, In procesele de biosintezt ale acizilor nucleici nucletiele wifosforilate (ATP, GTP, UTP si CTP pentru ARN si ATP, GTP, UTP. CTP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP pentru ADN) sunt, simultan, unitijii monomerice si furnizori de energie. Dact la scindarea hidrolitich a legiturilor macroergice din celelalte nucteotide trifosforitate se elibereaza aceeasi energie ca la scindarsa ATP, exist in organismele vii alfi compusi cu leghturi macroergice a ckror AG" in receyile de hidrotizateste-m mare decat -7,3 kcal/mol; majoritatea acestora sunt tot compugi fosforilati (Tabelul VI Tabelul VL3 lati saw de alté natura) sh ‘sunt masroerglet AG" tn reactile de hidroliz8 ale unot compusl macroorgic (foster ale unar compusi fostorilat! ear Compusad ao Realimoh Bimat ‘Adidul fosfocnalpiravie “618 ‘Carbamifostatal 514 Ail 1 3-bisfosfoglicesic = 493 Creatinfosfatal Ba Adit - CoA 23d ATP + ADP +P, -305 Glecoua- foetal ~209 Frvctoz0-6-fosfatul -159) Gilucozo-6-fosfatl “138 Glierol-3-fsfatul -92 Din dispuneren pe baza AG" a ATP intr-o pozitie de mijloc in raport cu ceilali compusi fosforilati reiese si mai bine rolul stu de intermediar energetic (moneda de schimb"), Orice compus macroergic fosforitat (dar gi nefosforilat) cu AG" negativ mai mare de 7.3 kcal/mol ponte transfera teoretic restul de acid fosforic ADP-ului pentru a se forma ATP; acesta din urmd este, la rdndul stu, capabil si uansfere restul de acid fosforic pe compusi cu AG" negativ mai mic decat 7.3 kcal/mol. Se realizeaza astfel 6 seari de trunsfer a restului de acid fosforic mumita ,potengial de transfer a grupaiii fosfat" (sau potential de fosforilare) care are 0 mare important in bionergeticd. Pentrw ca aceste transferuri si se product in realitate, este obligatorie existenja enzimelor specifice. Lipsa enzimelor specifice face imposible transferwile fosfatului inire compusii situai deasupra ATP in Tabelul VI3, sau intre acil-CoA si ATP: din acelagi motiv mu este posibili nici transferarea fosfatului de la compusii de deasupra ATP chtre cei | FP (FMN) Peis Complex Conptex 7 cqo-+|en'h8c|—p one—p| enn ae” |—ro, Foe ou Complex PADI 9 Fey (PAO J (evccinaty *|pee Fig, Vi11 - Functlonarea cuplaté 2 complexelor lantului respirator si fosforilri oxidative Subunitajile complexutui 1 sunt FPy, (numiti si NADH dehidrogenaza) si chteva proteine cu fier si sulf notate FeS,, FeS, FeS, si FeS,, aceasti ordine corespunzind ‘deseresterii valor negative a lui E,"; corespunzitor, curgerea echivalengilor de reducere {n intetiorul acestui complex este: NADH « FeAFuN) Yeore reo oa Fos, > Fes, —> Fes, —> Fes, Fes, . , am x . ne naor-/ SS FPirHiNe) 2 ar \ coatSe observa ct hidrogenul este disproporfionat la preluea sa de ciitre complex, in ‘continuare find transferati electronii;transferul se asigura prin oxidiri-reduceri ale ionilor de fier gi de sulf ai subunititilor, in final, protonii gi electronii refac atomii de hidrogen si acestia reduc coenzima Q. Complexul I este inhibat de rotenont (un insecticid ce origine vegetalt), amital (compus din clasa barbituricelor) si periciding (un antibioti:), substanfe care blocheazzi transferul de electroni Ia acest nivel. Complexul Il, numit si succinat-CoQ reducteaz’, realizeaza transferul echivatenfilor de reducere de la succinat la CoQ conform schemei: Suocinat FP, (FAD) CoaH, Fumarat xX FP, (FADH,) Coa Subunitatea principal a complexului II este succinatdehidrogenaza cu coenzima FAD, ‘care, fiind dispust Ia miarginea dinspre matrix a. membrane catalizeazii dehidrogenarca succinatului la fumarat in ciclul acizi acelasi timp, introduce hidrogenii tn tanful respirator, Alituri de aceast& subunitate, in ‘complex se mai aflt cel pun tri proteine cu fier gi sulf; evident, exist si fn interioral complexului If un transfer din aproape in aproape a electronilor. Variajia de potengial Ia transferul electronilor de ta succinat la CoQ este de 0,07 V corespunziind unei valori a AG" = -3,2 kcal/mol; deci Ia nivelul acestui complex nu se clibereaza suficient& energie pentm ca prin cuplare cu fosforilarea oxidativ’s si se sintetizeze ATP. ‘Complexul Ila lantului respirator are gi flavoproteine specializate pentru introducerea hidrogenilor de pe alte substraturi: acil-CoA, glicerol-3-fosfat, colina, sarcozina. In cazul acil-CoA, aceastt lavoproteint a fost identificats ea a fost numiti ,electron transporting favoprotein' (ETF) Complexul IH, nuit CoQ-citocrom ¢ reductszt, asigur transferul echivalengilor de reducete, tot sub forma de electroni, de la CoQ la citocrom 4 c: Co-citocrom ¢ i reductazé i CoGH, + 20itc (Fe) ————se Go + 2Ci.e (Fe) « 2H ‘Variaga de potengil la acest transfer este de 0.18 V, cei fi corspunde AG™ = 7.75 kcal/mol, i c0ea ve asigurd ca prin cupkarea cu fosforilaea oxidativ si se sintetizeze un mol de ATP. Citocromii care participa la structura acestui complex sint notafi by, by si cg este prezenti si cet putin 0 proteina cu Fe gi sulf. | Complexul IT este inhibat specific de antibioticul antimicint A,‘Complexul IV, numit citocromoxidszi, calalizeazt adifia a patra electroni furnizai de Cite (Fe), Ja oxigenul molecular cu formarea a 20*; acesta, combindndu-se cu protonit formeazi apa: CCitocromoxidaze 0,4 40+ aH 2H,0 ADP +P, ATP Structura. si mécanismul de actimié al acestui complex nu sunt inc pe deplin ‘cunoscute, Au fost identificate cel putin gapte subunitafi proteice a clror compozitie in aminoacizi este diferitf. Unele dintre acestea congin si ioni de cupru, Pe baza unor determin indirecte, se admite ci in complexe electronii receplionayi de la Cit.e de czire Cita, tree de la acesta pe protcina cu cupru side aici pe Cita, care ii transfert apoi pe oxigen Caderea de potential la trecerea clectronilor mediatA de complexul IV este de 0.5¢ V cireia ti corespunde 0 valoare AG® = -24,8 kcal/mol, deci energie suficienti pertra sinteza a wei moli de ATP; nu se sintefizeazd inst decat un singur mol Citocromoxidaza este puternic inhibati de ional CN~, de oxidul de carbon gi compasit NAD'+SATP 44,0 FADH, + /2.0,+2ADP+2P, ——® FAD +2 ATP+3H,0 Variajin potenjialulué redox standard pe tot lanl respirator este AE‘, = 1,14 V penta reoxidarea NADH +H, valoare rezultat§ din insumarea cliderilor de potengil ka nivelul calor trei complexe. Aplicind formula AG" = ~ nF-AE, se objine AG” = ~ 52,6 keal/mol. inrucat se sintetizeazt uei moli de ATP pentru care se consum’t 37,3 = 21,9 kcal/mol, randamental ulliziti energie’ libere pentru sinteza de ATP este: 21,9% 100/52.6 = 42%. Intravea echivalenyilor de reducere tn Janful respirator prin complexul I este numit’ ,rammara lunga a acestuia; ea asiguri deci formarea a tei moti de ATPatom gram de oxigen redus. La intrarea echivatentilor de reducere prin complexul TI se asiguri formarea a numai oi mioli de ATP/atom gram de oxigen redus, Este .ramura scurtt* a Langulai respirctor, Raportul intre numirul de moli de ATP produsi si oxigenul (in atomi gram) consumat este numit ,cat de fosforitare*. El se simbolizeaait P/O gi este deci 3/1 pentru ramura lung’ si 2/1 pentru ramura scurti.VL8.3, TEORI PRIVIND MECANISMUL CUPLARIE LANT RESPIRATOR - FOSFORILARE OXIDATIVA, Una dintre problemele fundamentale ale bioenergeticii 0 constituie mecanismul prin ccare energia eliberat in angul respirator este cuplati cu formarea de ATP prin fosforilarea oxidativa. Cele irei teorii formulate tn timp au ca element comun existenga intermediart ‘4 unei .stdri energetizate". Aspectele esenfiale ale celor wei teorii sunt prezentate in continuare, 4) Teoria chimica, numith sia intermediarilor comuni (Slater, 1953): prin analogie cu fosforitarea oxidativa la nivel de substrat, se admite c’ variafia energiei libere in cursul ‘recerii electronilor de Ia un intermediar redus (AHL) al lanzului respirator la urmatoral ‘oxidat (B) serveste Ia cuplarea lui A cu un compus C pentru a forma legtitura macroergica 'A-C. Inreacji de schimb secvenfiale,legiura macroergica este trecutt in compusal C-P: de aici in ATP. in timpul acestor reactii AH, este oxidat Ia A, B este redus la BH, si C este refficut putindu-se inifia 0 nowt secvenga: AH, + B40 === A ~0+8H, A~C+P, SE CHPHA C~P+ADP = ATP +6 Celor trei cuplaje ale lanjului respirator cu fosforilarea oxidativ’t ar trebui si te corespundit trei intermediari A~C; nici un asemenea compus nu a fost identficat. Abandonatt din acest motiv, teoria cuplajului chimic a fost reluat’ (Griffith, 1977) considertindu-se ci acidul tipoic, care s-a constatat cf este implicat in complexul ATP- azic, ar putea indeplini rotul tui C dar nu s-a objinut nici un fel de date experimentale care si sprijine aceast’ supoziie. ) Teoria conformayionala: in forma inigiakt (Boyer, 1964), considera cXt energia cliberati in cursul transportului electronilor este cosservati prin modificarea conformagionala la o stare energizatt a unuia sau mai multor transportori de electroni. Unerior, s-a postulat modificarea conformational a complexelor enizimatice la care se realizeazii cuplajul. in sprijinul acestei teorii se aduc rezultae objinute prin microscopia electronick care evidenjiazi ci la trecerea mitocondrilor din starea de repaos ‘metabolic la starea activa (consum de O, si sintez’ de ATP), membrana interna se pliaz’, volumul matriceal reducandu-se foarte mult. Viteza tedusti a modificirilor conformationale in raport cu rapiditatea cuplajalui transport de electroni-sintezai de ATP este un serios impediment de impunerea acestei teori ©) Teoria chemiosmoticl (Mitchell, 1961) postuleazt ch starea intermediar& energetizati care determing sinteza de ATP din ADP si P, este reprezentati de gradientul de protoni care se stabilegte intre fafa interioari gi cea exterioar a membranei interne mitocondriale in timpal transportului de electron. fn alfi termeni, transportul direcionat al electronilor in fungul membrane: determina un transport directionat (vectorial) al protonilor din interionul mitocondrilor spre exteior (Fig. VLI2). Gradientul protonilor ejectali in spajil intermembranar are dou componente: una de pH, (ApH) 284AP +I ap. SS waTRIK Ft ott ‘BEGUPLANTT \ | | Ty TF oe Fig, Vi.12 - O llustrare schomatizatd a teoriel chemiosmotice ‘sivuna electricd sau potengial de membran’i (AY). Suma lor este numiti fork proton mottice, notatt Ap: Ye RT apeay- 2,200 BT a pH Numeroase date experimeniale vin in sprijinul acestei teorii, Astfel existenja unui poten transmembranar, care constituie cheia spotezei chemiosmotice, are justificare prin faptal c& spafiul intermembranar al mitocondriilor este mult mai acid in cursul Functionasit celor dou’ procese. Prin studii de microscopic electronic& si alte tehrici, 5-a confirmat si faptul, de asemenea obligatoriu pentru valabilitatea teoriei, cd! membrana inte mitocondriald este sirtbtiuts de lao fafi la cealalth de complexele 1, I si IV ale lnnjului respirator (Fig. V9). Teoria prevede in continuare ci protonii_ din spatiul imtermembranar revin in mitocondrie strit prin , nductor” pentru pro‘oni {restul membranei Gind impermeabili pentru acesta). Acest flux de protoni este cel care determina. 1a nivelul subunitayil F,, sinteza de ATP din ADP si P.. Tn experienfe model s-a putut demonstra cA un flux artificial de protoni, tn absenfa lanjului respirator, powte determina cuplarrea ADP cu P, ceca ce constituie ined un ‘argument serios in favoarea teoriet chemiosmotice. ‘Unul dintre postulatcle feorieé chemiosmotice prevede 8 apa rezultatt in reactia de formare a ATP din ADP si P, se ionizeaza spontan, ionii H’ fiind dirijaji spre interiarul rmitocondrei (ei urmind sh creeze gradientul protonic) in timp ce ionis OH™ sunt dirijai spre spagial infermembranar: ADP: P, ATP + Hyer + OH sir Obligatoriu dupa Mitchell, acest postulat a constituit obiectul principal al unor ‘nvergunate critici la adresa teoriei chemiosmotice; totusi, prin argumentele experimentale deja menjionate ca gi prin altele aduse relativ recent, aceasta leorie s-a impus net in raport cu teoria chimich si cu cea conformational’ 285VI84. SISTEME DE TRANSPORT A ECHIVALENTILOR DE REDUCERE Reactii de dehidrogenare catalizate de enzime cu coenzima NAD* au loc atit in citoplasma cat si in mitocondriile celulelor, NADH + H* care se produce in astfel de ‘eaciii la nivelul mitocondriilor se reoxideaz prin preluarea direct a echivalengilor de reducere de etre lanqul respirator (mecanismul descris). Mai complicata este reoxidarea NADH + H" care se produce in citoplasma, Exceptind anumite cazuri, de exemplu ‘eoxidarea NADH +H" prods in cursul oxidini gliceraldchid-3-fosfat > acid-3-fosfogliceric {in reachia acid piruvie ——» acid lactic (vezi ,Glicolizat* in condi: anaerobe) si NADH + HP produs in citoplasmi se reoxideazi prin introducerea echivalentilor de reducere in lanjul respirator. Cum inst membrana mitocondrial& au este permeabilti pentru coenzimele nicotinamidice, procesul are loc pe cai indirecte numite navete (shuttle). Naveta .glicerolfosfat™ (Fig. VI.13.A) opereazi astfel: NADH + H* format in diverse reaciii de reducere din citoplasm’ se asociazd cu apsenzima specifich formind slicerol-fostatdehidrogenaza, enzima ce catalizeaxi reactia de hidrogenare a dihidroxi- acetofosfatului (DHAP. intermediar slicottic) 1a glicerolfosfat; intrucit_ membrana exten’ mitocondriali. este permeabilii pentru. glicerolfosfat, acesia pitrunde cu uusuring& in spajiul intermembranar. Pe suprafaja extema 2 membrane: interne mitocondriale este localizatt glicerolfosfatdehidrogenaza mitocondrialt care reoxideazt licerol-fosfatul ta dihidroxiacetonfosfat, cei doi atomi de hidrogen find preluaji de coenzima acestei enzime, care este de tip FP (FAD); de aici echivalentii de reducere tree {in Ianjal respirator. Dihidroxiacetonfosfotl revine in citoplasmd si suita de react se reia. Actiunea navetei glicerol-fosfat este resirinsi Ja intwoducerea echivaleniilor de reducere de pe NADH +H’ citoplasmatic in lanjul respirator. Ea este deci unidirecfio- hala si are ca scopuri menjinerea concentrajici necesare de NAD* in citoptasma gi fumizarea de echivalengi de reducere lanjului respirator. Printr-un mecanism mai complicat opereaz naveta ,malat-aspartat™ (Fig. VILI3.B); 4a wransferul in sensul citoplasmti --—+ mitocondrie sau mitocondrie -—-—> citoplasm’ (naveta este deci bidirecfionala) « echivalengilor de reducere concur’ malatdehidroge- nazele (MDH) si glumatic-oxalocetic-transminazele (GOT) citoplasmatice si mitocondriale precum si transportori specializaji pentru transferul prin membrana intern mitocondria- Wi a malotului, glutamatului, aspartatului si q-cetoglutaratului (notaji pe figurt, tn ordine 1, 2, 3 si 4). Prin aciunea acestei navete se asiguri atft reoxidaren NADH + H* citoplasmatic, eft si, pe plan mai general, reglarea cuplutilor NADH ~ NAD* extra gi intramitocondriale. Alte navete sunt capabite st realizeze schimb de echivalengi de reducere cu participarea sia coenzimelor de tip NADP. Una dintre ele ee responsabila de formarea ‘in citoplasm’ a unor mari cantitiyi de NADPH + H* nevesar pentru biosinteze, in special de lipide. 286NAOH +H * olitgya: (Shs A CLTOPLASMA NADH Oraloaceler | a ASD <@ Mglat —a-— Malat Wat i \ her | MoH MITOCONDRIE WARY NADH Oxaloacetas } AS) OU Qh ef) ox- Ceraglifa(éh ~~ @ & J «cepa gliléfar Fig. V3 - A, Naveta uniditectionala .glicerolfostat"; B. Transferul bidirectional .mlat-aspartat”VL8.5. AFECTIUNI DATORATE UNOR DEFECTE EREDITARE LA NIVELUL, ENZIMELOR LANTULUI RESPIRATOR $I FOSFORILARI OXIDATIVE ‘In complexele lanjului respirator si fosforilarii oxidative au fost identificate c&teva zeci de proteine, Cele mai multe dintre ele sunt sintetizate in citosol si transportate in pentru un numér dintre aceste proteine s-a slabilit c& sunt codificate de ADN mitocondrial. Se stie ch ADN mitocondrial are 0 rat a mutajilor d2 aproximativ zece ori mai mare decdt aceea a ADN nuclear, De aceea, mai ales in fesuturile care consuma ccanttayi mari de ATP, cum sunt ficatul, rinichii, muschii scheletici, muschiul cardiac, Sau semnalat ,miopatii mitecondriale™ de care sunt resporsabile proteinele cu defecte 1 clior sintezt a fost controlati de ADN mitocondrial. Se cunoaste si 0 neuropatic opticd ereditart caracterizat& prin pierderea bilateral a vederii centrale ca rezultat al degrada retinei, V18.6. CONTROLUL RESPIRATOR S-aafirmat chiar la inceputul acestui capitol c& organismele vii produc energie gi deci sintetizeazd ATP in raport cu necesitajile de consum din fiecare moment. Pentru a rispunde prompt la aceste necesita, fosforilarea oxidativa cuplat& cu langul respirator, principalele procese prin care se produce ATP, sunt riguros controlate, Cum inst cele dot procese constituie etapa final’ a degradirié glucidelor, lipidelor si proteinelor (Fig, VI.S), teoretic .controlul respizator" se poate exercita atit prin compusi si factori implicaji direct in lanjul respirator si fosforilarea oxidativa (coenzime reduse, O,, ATP, ADP, P,, complexe enzimatice et.), edt si prin intermediari ‘i degradaritor celor trei clase de compusi. $1 constatit ch, dintre acestis, rotul principal il are ADP-ul; astel, un omogenat tisular consum cantitatea cea mai mare de oxigen cand se adaug ADP, Deoarece ADP-ul se cupleaz’ cu P, pentru a forma ATP, controtul respirator se mai numeste si .control prin acceptor de fosfat" Raportul tre intensitatea respirajei celulare tn prezenfa ADP fa de lipsa acestuia se numeste ,ata controtului prin acceptor de fosfat; din studi efectuate pe mitocondrii izolate a rezultat ct aceasta poate varia in limitele unui ordin de mime si chiar mai mult. Sunt mai multe fapte care justticd rolut principal al AD? in controlul respirator: a) Factorul de cuplare 1 din ATP sintaza, prezent in cantiati timitate ta membrana inter mitocondriats, rfimane ,blocat* in forma energizatt in lipsa ADP; >) Intensitatea fuxului protonic prin componenta F, a ATP sintazei este, de asemenes, dterminata de nivelul ADP; ©) ADP este modulator alosteric pentru mai multe enzims cu rol reglator care c zea diversele etape ale degradarit glucidetor,lipfdelor si proteinetor. 288VI8.7, DECUPLANTT AI FOSFORILARII OXIDATIVE DE LANTUL RESPIRATOR Se numese decuptanti compusii chimici care blocheaza uilizarea pemiru fosforilarea ADP a energiet eliberate in angul respirator, Primal decuplant cunoscut a fost 2,4-dinitrofenolul, Prezent intro concentrayie de numa 10 yM, ef determina 0 diminuare a raportului P/O cu 0%: la concentrafit ‘mari raportul devine zero, Alte substanfe decuplatnte sunt unele hidruzone, izotiociana Wo, : | on Son a fno-Knanes | H | rmetoxifenihidrazond (FCCP) in celule exist iri indoialt decuplanji naturali ai fosforiliirii oxidative de lanjul respiraior, Ei asigur, inte altel, stabilirea unui raport optim intre processle consumatoare de ATP si produceren de cilduri necesarti menginesii constante a temperaturi. De exemptu hormonal T,(tiroxina), in concentratit peste limitele normale, are un Energia care nu se utilizeaz in alte scopuri se disipeaz’ sub forma de siexistenja unei protene, termogenina (sau leptina) cu rol asemfntr. ‘in sesuturile adipoase brune, a ciror culoare este datoratd unui confinut ridicat de rmitocondrii (deci de citocromi), lanjul respirator funcjioneaz decuplat de fosforitarea oxidativa, Asemenea fesuturi au animalele care hiberneazis de asemenea, fa fit gi la ow niiscut se at un fesut brun rispandit fn jurul vaselor mari si in regiunea omoplailor. Teoria chemiosmotic’ oferti 0 explicajie pentru aciunea decuplanjilor. Astfet 24- dinitrofenolul este un acid slab, care este solubil in membrana in stare protonat si solubil in apa sub form’ de anion (2,4-dinitrofenolat). El este deci un transportor de, proton’ prin membrana, determinnd prin aceasta abolirea gradientului protonic si provocand decuplarea (Fig, VIL12). V8.8, ALTE LANTURI RESPIRATORII In celule exist si alte variante de lanturi respiratorii, care nu sunt ins cuplate cu fosforitarea oxidaivd. Rolul lor este resins la reducerea O, in vederea incorporti in ‘anurnifi compugi chimici. Cele mai frecvente cazuri le reprezints procesele de hidroxilr, Astfel, reacfile de hidroxilae catalizate de monooxigenaze decurg dup schema general: H+ 0,+XH, ——» ROH +H,04X unde R-H este substrtul care se hidroxileaz’ hhidrogen, de cele mai multe ori NADPH. far XH, coenzima redusti donatoare de 239)fn sistemul de hidroxilare localizat in reticulul endoplasmic al celulelor hepatice gi suprarenale, rol esenfial are Cit Pro ale cirui insusiri sunt asemfinitoare cu ale itocromoxidazei din mitocondrii. El cuprinde si 0 flavaproteing (AD) la nivelul tereia hidrogenul este disproporjionat in H* si e~ Simplifcat, acfiunea acestui sistem de hideoxilare este redath in Fig, VILI4. fn ficat, acest sistem asigur’ hidroxilaea unor compusi de origine exogentt (de exemplu medicamente) dar ia unor compusi endogeni (unii hormoni), care, devenind solubili, se efimini usor din organism. in medulara suprarenalei, acelasi sistem participa ta sinteza noradrenaline’ $i adrenaline, in timp ce in corticosuprarenall se introduc gruptri hidroxil pe nucleut de perhidrociclopentanofenantren in cursul sintezei din colesterol a hormonilor glueo si mineralcortcoizi. eHt Pysor (fe?!) RH ara WABPHIMT pan. . yo 2° Aasa thet) RH Asa the enn} Le 2 WADE” “rp on Rego tte? Y- RH g, Paco (02) fla Fig. Vi14 - Lantu respirator cu rol de hidroxizare H,0, 40, 0;+H,0, 2°» 0,4 H0- + HO Reactivitatea lor este, in anumite situa, Benefick pentru organism, Un caz este celal fagocitrit microorganismelor, patticulelor strlne gi fragmentelor de membranl de czire neutrofile si macrofage. Pentru omoriea bacteriilor, aceste celule actioneaz printr-un ‘mecanism oxigeno-dependent si prin unul oxigeno-independent. Mecanismul oxigeno-dependent include sistemul mieloperoxidazat gi un altal care ‘genereazi radicali ai oxigenului. in linii mari, acest mecanism opereaz’ astfe): dupa ce s-a produs fagocitoza, NADPH oxidaza, localizatt in membrana leucocitelor, transforma O, din vecindtagiin O; ; procesul este att de rapid inc i s-a atribuit denumirea de ,explov! respiratorie” (respiratory burst). Mai departe, 0; este transformat in #1,0, prin reacia de ‘mai sus, care, in condifiile catalizsirii de c&tre superoxiddismutazal, este foarte rapida. Tn prezen{a mieloperoxidazei, 0 enzima fizozomali, HO, gi CI” genereazat acid hipocloros (HOCD care omoard bacterile, Mecanismul oxigeno-independent de distrugere « bacterilor funcfioneaza pe principiut hidrotizei prin enzimete lizozomale cuplat cu varia rsemnate de pH. in cantititile produse in mod curent, efectele distructive ale speciilor reactive ale oxigenului sunt nesemnificative deoarece organismul dispune de sisteme de apie deosebit de eficace, Bact, ins’, limitele producerii normale a or sunt deprisite, interacfin cu acizii nucteici, proteinele, lipidele si alfi compusi se prostice, efectele fiind multiple: rmutatii, inactivitatea multor enzime, modificarea ciclului celular si altele, Nu este surprinattor, de aceea, cn rol major in producerea sau in complicajile unor procese. cum sunt finbitrinisea, inflamatiile, ischemiile, diabetul, malignizarea, il au speciile reactive ale O,, Dout nie inferactiunile acestor spect cu diversi compas se dau in continusre: 1) Reactia HO- cu bazele azotate din acizii nucleici: 21‘ (et - a 0, ——> pt ——> H2,———» CH. —__+H,0 { [Superoxal] (| Giutation dismutazd f [peroxidazai 2G-SH G-s%s-G Fig, VIL1S - Sistemul enzimatic de aparare Impotiva specilor reactive als oxiganului Radicalul format sufera, la rindul lui, o serie de reactii cu desftigurare imprevizibitt Severitatea afecttrii ADN este mare dacil se produc asemenea leziuni pe ambele lanjuri ale moleculei decarece sistemele reparstorii nu mai pot reconstitui macromolecula infil 2) Peroxidarea lipidelor la nivelul acizilor grasi polinesaturafi; este initiat de mai ‘mulfi radicali intre care $i'O; sau HO. Se produe in serie: atacul radicalic cu extragerea H' rearanjaree molecular’: conbinarea racial porox cu $ YONEDA te NYA S oo" 00H Sistemele de atrare ale organismul impotsivaacestor eizete sant de dv spar a) enzimatic, prin care compusii agresivi. sunt transformaji tn compusi inactivi enzimele superoxiddisimutazi,catalaza si slutationperoxidaz’, case catalizeaz% reactiile de mai. jos, sunt, la un loc, sistemul cel mai important de apirare (Fig. VIS): Superonie D> H,0, 4 0, demutaza catalan 2H.0, —"S 2h,0+0, 205+ 2H" 1,0, + 26-8 2H,0 + 6-8-8-6 peroxigaz’ 292Actiunea glutationperoxidazei este cuplat cu aceea a glutationreductazei, cu coenzim’ NADPH + H’, care reface glutationul redus: Gutation GeNADPHy HY “TOR. pg sH « NADP Foauctaze b) neenzimatic, prin care sunt impiedicate procesele oxidative; o serie de vitamine, respectiv, C, E si A, prin caracterul lor reducttor, detoxifick celulele de intermediari reactivi ai oxigenului. Accasta ar putea fi o explicaje Ia constatatile ficute in timp ci prezenfa vitaminelor respective in cantitiyi marin hrand este corelat& cu un rise mai redus de prosiucere a unor tipuri de cancer si eu o freeven{i mai seazutt a altor afectiuni.Cap. VIL METABOLISMUL GLUCIDELOR, VIL.1. CHIMIA GLUCIDELOR Glucidele sau zaharurile sunt compusi polihidroxicarbonitici si derivagi ai acestora. Numele de hidrayi de carbon, care se mai foloseste ine’, sugereaztt cit formulele empirice ale acestora conjin C, H, O in raport de 1/2/1, Desi ‘multe zaharuri se conformeaz formulei empirice (CH,O),, denumisea s-a dovedit improprie pentru un humir mare de compusi din aceasta clas care confin alt raport al atomilor de C. H, © sau congin én plus azot, suff fosfor Glucidele se impart in oze si azide, dup comportarea la tidroliza m ile, sau ple, conjin 0. singur’_unitate polihidroxicarhonilics. (sunt deci ‘up awa srupirii_carbonil. din molecula, se impart i jar dup numirul atomilor de casbon se impart Grom, at-8) Geo 5 eno 10 oom Cole mai importante si abundente sunt hexozele (el pentozele (riho7!) Ozidele se impart, dup numsirul de unititi monozahauidice ta eare daw nagtere prin hidroliz’, in oligozide si poli Oligozidele sau oligozaharidele sunt constitute dintr-un nama retativ mic de unitati monozaharidice (ntre dou si zece) legate covalent, Dintre oligozaharidele care se isesc in jesuturile animale si vegetale, ca atare, cele mai frecvente sunt: zaharoza lactoza, maltoza, Ot constituite din mai multe subunitiji monozaharidice nu se gisesc libere; ele formeazit Ianurile lat fene polipeptidice din stryctura glicoproteinelor Polizaharidele congin un numtr mare de unitiji monozahuridice (de ordinul sutelor hidroliz8, Polizaharidele cele mai rispandite 2a, iar in regnul animt, glicogenul 028, fructor’, galactozi) si de, rale ale unor sau miilor), pe care le pot elibera pr fal sunt amidonul si ¢ wl vex 294VI.1.1. MONOZAHARIDELE Stereoizomeria monozaharidelor Compusii care au aceengi fornmuld structural dar diferti prin configuratia spajiala sunt stereoizomeri. Stereoizomerii aptrufi'ea urmare a prezengei in molecu a-unui jom de carbon asimetric (C" - carbon ale clrei covalente sunt satisficute cu petru substituenfidiferji) sunt stereoizomeri optic activi. Numatul de stereoizomer posibili ai unui compus contindntd » carbon asimetrici este egal cu 2°. Toate monohazaridele feu exceplia celotriozei, respectiv dihidroxiacetona) confin in molecult atomi de carton ntr-o molecukl face ca aceasta. SX poatt tasimetrici, find optic active, Prezenia unui C’ exista in dou’ configurafiidiferite, nesuperpozabile, comportandy-se una fai de alta ca obi ctul gi imaginea sa in oglind’, ca mina dreaptt fafa de cea sting’, Moteculzle Jor sunt deci je (chiros = mf) avaind ca centru chiralic, de asim uunul sau mai mulfi alomi de carbon asimetrici. Cea mai simplt aldozt aldottioza (sliceraldehida), avand un singur se prezint sub forma a doi stereoizomeri optic activi care se deosebesc intre ci exclusiv prin sensul in care rotese planul luminii polarizate (au aceleasi proprietati fizice si chimice). Acesti doi stereoizomeri optic activi poartt numele de enantiomeri si se 2isese unul fa de cetilalt ca obiectul fafa de imaginea sa in oglinds. Prin convengie, cei doi stereoizomeri ai gliceraldehidei au fost desemnati D gi L. Configuragia absolutt a celor patru substituienti ai carbonului asimetric, sabiliti prin studti de difractie a razelor X, este redata prin formulele de perspectiva si plane: ‘bon asimettic, Ho: cHO 1 H— ¢ —OH Ho—o — cH,OK D - gliceraldehica L- aliceraldohida 298Aldotetrazcle, conginind doud centre de chiraitate (Goi atomi de carbon asimetrici se prezinti sub forma a 2" (patru) stereoizoment optic activi care formeazit dou perechi de enantiomeri (I si 1: oxo oro gro Ho Ho g-on HOG =H 4 G-08 Ho-e=H wobiow Hong —H | Hogan HGH buon bu,on dx,on bron _Aldopentozele contin treiatomide carbon asimetrci si deci se prezintl sub forma a 2° (opt) stereoizomen optic activi grupayi in patra perechi de enantiomer. Similar, exist 16 aldohexoze stereoizomere grupate in opt perechi de enan ‘omer ‘Aga cum s-a mai aritat, s rik 21 prin. configuratia tuturor omilor_de_carhonasimetricisunt_enantiomeri, in timp ce aceia care difert prin configurijia a unu, maximum ay_- TScarboni asimetrici (@in totalul den C°), sunt diastereoizomeri, Diastereoizomerit care difes’ prin configuragia unui singur atom de carbon asimetic Se numese epimer. Schimbarea configura’ unui C” se numeste epimerizare. Enantiomerii se deosebése inire ei exclusiv prin sensul d2 rotajc s planului turninit polarizate, unghiul de rotajie fiind acelagi, Amestecul echimolecular al celor doi “HO ae 1g0H - Giiceraldebids out Gio ba ‘oh Gig0H Srz0H a — 2 “ Ho eno 0 Ho gon cH now nol on nok o OH neon neon “non Ergon S1g0H Shzon SrigoH ZN. Lr. £2. ZS gio io oho Sooo do. gloho who soon neon Hoe ov wb fo Hob bow won Ho on Mm HoeH nhon eon 'nGoH OH Hoge Nog Hog thon dow Gon. kon "Gow WeaH HOH HOH Srgon “dhigon“ctzoH de ion agoH ‘ehigo“ChizoH oiahed p-Aiees p-Gliecst D-Minest D-Gufsd 0-bbesO-Galcocé D-Taoct Fig, Vil. 1 - Seria D a aldozelor 296‘20H ee cH20H Dinidroxcetond ! grleon bso nH D-Ervuloes eon inéow ogi oe eon mo incon ‘ncn 1z0H 08 Ergon dig0H peices braces p-Sorbect sagas Fig. Vil. 2 - Seria D a cetozelor enantiomeri, dextrogir si levogir, constituie un racemic. Sinteza organicti dX nastere fa racemici, optic inactivi, in timp ce natura sinteizeac% numai unul saw altul inte enantiomeri, grajie stereospecificitiii enzimelor implicate in sintezt. Diasterecizomerii se deosebese intre ei prin proprietitile chimice gi fizice, precum si prin valoarea unghiului sau sensul de rotajie a planului fuminii polarizate Din motive de semaine, compas opi set! sau tpt in dod sr ste D si L, dupi inrudires configurajionali cu un compus de refering care este fliceraldehia (ye! si aminoaczi, Se consider ct monocafardele avind configu ‘tomului de carbon asimetric.cel mai deptirtat de_gruparea. carbonil identical. cu.ceas ‘carbonului_asimeiric din .D-gliceraldehid% apartin seriei sterice D, tar cele avind onfigurajia aceluiasi atom de carbon Tentics cu cea a a in L-gliceraldehida ‘aparjin serieisterice L. in Fig, VILLI si Fig. VIL2 sunt redate structurile stereoizomeritor aldozelor gi cetozelor apartinand serilor D. a[Na fofi steeoizomerii posibili se gisese in natur’, Cele mai rispandite si importante din punct de vedere biologic sunt aldozele D-ribozd, D-slucozi, D-galactozt si D- manozi si gelozele D-ribuloza si D-fnuciozd (numele cetozclor se formeszi in general inserdind sufixul ul" in numele aldozei corespunziitoare). in natur’i se gisesc si zaharari ‘paryinand seriei L, cole mai importante si rispancite find bora. De Subliniat ch apartenenga Ta seria D sau L nu exprima sensul de rotagie a planului lamin polarizate de citre zahittul respectiv, ci se refer la configurajin absoluts a atomului de C” cel mai departat de gruparea carbonil, Bin acest motiv este necesar ca, pe King’ convenfia de simbolizare D sau L, si se noteze si sensul ce rotate prin + sau ~. Un compas apartinand seriei D poate fi levogir D (-) sau dextmsir D (4). Evident, fiecare ‘oz apanindnd serici D isi aff enantiomerul in seria L. Ozcle continand acefasi numir de atomi de carbon si aparfinind aceleiasi seni sterice (D sau L) se gisese fntre ele in relajie de diastereoizomeri. Monozaharidele naturale gparjin in general seriei D. Gscoza naturateste D(H, glucoza gi are ui Ugh de rotayie de & 52.79 in timp ce fnuctoza natural este D_{—), fructoza avind un unghi de rotajie dec. Structurite ciclice ale monozaharidelor {In moleculele monozaharidelor exist grapiri funcfionsle care, in pozitii sterice convenabile, pot si interacjioneze, Astfel, gruparea carbon) poate fi ata fi de catre grupirile -OH (prin electronit neparticipanté ai oxigenului) din pozipile 4,5 saa 6,cu formarea unui compus.deaditie intramolecular denumit semiacetal saw semicetal intern; reamtintim eh produsal de aditie a unui alcool Ia un compus carbonilic se numeste semiacetal in cazul aldehidelor si semicetal in cazul cetonetor: L aparuet fa fostul carbon carbonic, poart numele de hidroxit semigcetalic saw glicozidic gi se deasebeste ca reactivitae de eelelalic. Reacfile de formare a semiacetalilor pentru aldoze si Getoze pot fi schematizate: Ho chow chow oe? 7 i ret on Z — 6-0 — iH toy g i (GHom, =e CHOM, «0; CHOW, | SE 1 —= i Me : G Nn === (CHOH), oO gon ol gic ab i Gon oH.04 Gaon ye 298Semiacetalii iniemi se formeazi! cu participarea unei grupari_ -OH situate intr-o posilic, relativ’ fapi de carbonil care. sit permits formarea unui ciclu de cingi sau sase atomi (gi nu mai mic sau mai mare), intrucéit acestea sunt favorizate din punct de.vedere, snengetic prin {in cazul ciclurlor de cinci atomi unghiurile pentagonului sunt foarte apropiate de cle pe cate le fac carbonul si oxigenul hibridizayi sp* (108° fay de 199228"). In acl ciclurilor de suse, alomii au sunt coplanari, generfind conformeri, baig sau scaun, in care unghiurile sunt de 103%) ‘Structurile ciclice s@ formeaza in cazul aldohexozelor prin participarea carbonilor 1 si 4 sau 1 si 5, iar in cazul cetohexozelor cu participarea carbonilor 2 si $ sau 2 si6. Structurile monozaharidelor conginand gicluri de cinci-atami se numese furanozice (prin ‘analogie cu heterociciul furan) tn timp ce acelea congindnd cicluti de sage. alomi se rnumese piranazice (prin analogie cu heterociclul piran). gro GuoH HOH ch,oH 1 1 i HOH cHOH geo cou | | ° 1 1 HOH HOH | HOH HoH | i —i fet 1 ° [J eo oe ron CHOH { 1 HOH HoH HOH aia i i 1 | cHOH cHoH HoH cH,08 furan dohexord st. furanozié&—cotohoxora at. franozb &H,0H fo i con i HOH i CHOH 0 | HOH 1 | choH cH, pian st. rane st pitanozica 299)Strueturile_piranoz mai_stabile.in_soluyie. decit cele fi intainese, mai ales, in combinatii ale ozelor. Ca urmare a reactici.de ciclizare prin semiacetalizare, fos ul carbon carbonilic devine carbon asimetric puting ie dau’ configuratiisteice diferte. Apar doi st ‘meri supranumerari numigit@nomes® in care atomul de carbon care Ieag gruparea -OW SeiMIACETATIES poate avea dowd contiguragii diferite (anomer a gi B). Anomerii_o se Figureaz’ in formutele ciclice de proiectic cu gruparea -OH_ sémizcctalict de_aveiasi parte a catenei de carbon ca gi oxigenul di spre deosebire de anomerii Bi. _ Cele dou’ forme anomere pot trece una in cealalté prin intermediul formei aciclice care, in solufie apoas’, este prezent in canttifi minine, Formele piranorice si furanozice (ot si) ale glucozei (a) si fructozei (b) sunt rep-ezentate in Fig. VIL 3. De mentionat ci cei doi anomeri difera intre ei prin proprictitile chimice si fizice ca si prin valoarea unghiului de rotate. Toate consideratiile de mai sus cu privire Ia structura ozelor indreptiiesc de mai degrabi. ca polihidroxisemiacetali, respectiy polihitroxisemiceta polihidroxialdehide sau polihidroxicetone Formulele ciclice de proiecfie uilizate, cu tot avantajul claitiii si simptitagi, nu fin seiima de relapile sterice dintre atomii sau grupele de atomi din moleculi. Haworth ulilizeaza’ structuri cictice care jin seama de distanjele interatomice obfinute pe dingramele de difrucjie a razelor X. in reprezentarea Haworth, ciclurile furanozice gi piranozice sunt imagine ca poligoane regulate perpendiculare pe planul hartei. Laturile poligonului apropiate de privitor se reprezinil adesea prin lint ingrosate. in. general, formulele Haworth se seviu astfl incdt oxigenul si fie situa in spatele planului hati Substituengii care se glsesc in formulele de proiectie in dreapta se figureaz’ formulele Haworth sub planul ciclului iar cele din stinga deasupra planului. Pentru a deduce formula Haworth a unei oze = de exemplu a D-glucozei din formula sa de proiectic se opereaza irei modificari ale focurilor pe care le defin tn motecult cei tei substituenfi de Ia carbonul 5, Se inchide, cick ire supra, si aquparea aldehidict de la C, objindndu-se- formu peure Sse “ra conform conventiei Haworth: care se _ we a vo bow onlea , 300a whan H-e-0H We brow S ucopnoes a °. H=c-0H we HoH -tuctotranoes 2 truetoiranocé Fig. Vil. - Structutle cictce ale glucozel (a) si fructozei (b) no-c-H W=G-0H H=c-oH HoH » oe cHon 301Structurile Haworth pentru anomerii @ gi B ai ghicopitanozei, gactopiranozet si i {ructofuranozei se reprezinidasifel: HoH HoH i Ho K—o. on | ou on ; HO on Ho on on e—D-—glucopiranaza B-D-gucopiranoea oH.oH cHOH Ho D— o. Ho }— 0. on on oF oH on ou a-D-galactopranoza P-D-galactopranoza HoHe 7 OX chon HoH 7° on Ho 9) ‘ Ho 7} A on 4 cHoH \ . on ou e-Defructoturanoza f-D-netoturanoza emai ele prezinf& ciclurile ca fiind plane, Aceasta este oO relativ ‘corect_ pentru. ciclul furanozic desi studiile de difractie a razelor X efectuate pe fructofuranoz& au demonstrat ct patru din cei cine! atomi ai ciclului sunt in acelast plan, in timp ce al cincleaiese din plan cu 0.05 ni, clue pranozie pot adopta, cas ciclo- hexanul, conformafii fini tensiune corespun- Zind conformerilor baie sau scaun, Studie cu raze X au demonsirat ci ciclurile de sase, Fig. Vil. 4 - Conformatia ecaun onan un fom de oxigen, segs exclusi in ‘a unel piranoze cconformiatie scaun (Fiz. Vil). ( pi r i.Aminozabaruri inlocuirea in molecula uneioze.a unei grupiiri bidroxil.cu o grupare.amino <2 nastere la aminozaharur, Cele mai importante aminozaharur samt glucoramina, galag\gzan ompugl care se gisese in structura gigaueyeeiele” Gaara or eri mai departe).. Tn proteoglicani se gusese cu preciidere sub form N- ssa N- sulfatat’: e-avezein eo-plencie oo Iron Wicu o molecult de acid piruvic next Prin condensarea unei molecule de manozani acidul neuraminic: ve-e Acilarea acidului neuraminic dt naslere la N-acilderivaji denumiji acizi sialic), Dact restul acil este un rest acetil rezult® acidul N-acetil neuraminic (NANA), constituent principal al glicoprotcinelor: ‘COOH GHoH, cH,OH 4 oH 4 ‘acid neuraminic ‘acid N-aceti-neuraminic (NANA) Dezoxizaharuri Inlocuirea unei grup hidroxil din molecula unei oze au un atm de | nastere ta dezoxizaharuri. Un dezoxizahar important este 2-dezoxiriboza slucidic din structuraacizilor dezoxiribonuclici (vezi acizl nucleic Un alt dezoxizafar important, provenit din galactoa, st anume 6-dezoxi-P-L-galactoza idrogen di ‘component sau B-L-fucoza, este prezent, alituri de acidul sialic, in structura glicoproteinelor: cHo HO — ¢ —H H— C—OH Q 4 = G—oK ae He Ho —¢—H Ho on cH, oH Letueoza peL-tucoza 308PROPRIETATILE FIZICE $1 CHIMICE ALE MONOZAHARIDELOR Monovaharidele sunt substanfe solide, eristalizate, solubi rul fe grupiiri -OH din molecula. Zena: sruplrilor funcfionale > C = O si - OH in moleculit ozelor le confer’ o reactivitale chimica deossbitd, exprimatd in multitudinea de reactii pe care le prezin’. In solujig, diverscle forme ciclice coexist cu forma.aviclica, chiar dacd aceasta Jin um nu depageste Jn prezenta unui reactant specific gruparii > C = O echilirl sc.dcplaseara spre forma aciclicd pe miisur’ ce aceasta se consumd in reactic astfel incat ‘ntreaga cantitate de 072 va reactiona ca un_compus carbonic. in prezenfa unor reactcnti samteristicL grup -OH glicozidic oza_va-reacjiona sub forms ci Proprietitile chimice ale ozelor, avand interes pentru determinarea Tor cantitative si calitaiva in diverse medii biologice, nu vor fi prezentate. Vom menjiona aici exclusiv pe acelea semnificative pentru transformdirile lor metabolice, Se vor alege formele ciclice sau aviclice, funcjie de participarea efectiva la reacjie a uneia sau alteia dint cle. 1. Reducerea monozaharidelor da nastere la patialeoolii corespunztori, In organism, ‘eacgia este catalizath de ciizime NADH sav NADPH dependente. D-glucoza se redace Ja Deglucitol (D-sorbitol far fructoza dk nagiere Ta doi polioli diastereoizomeri: D- sorbitol si D-manitot: in solventi_polari. grajie ge pou wate ef Eww ET ee ee ee ee wef nfo nedeet open fn diabetut zaharat se formes mari cantitii de Sorbitol, prin excelent in retin’, ceea cce-contribuie fa instalarea retinopatici diabetice, 2, Oxidarea ozelor poate decurge fic la gruparea carbonil, fie Ta gruparea alco! primar, cfind se obtin acizi uronici Onidarea glucozei, sub form’ de ester glicor-6-fasforic la acid 6-tosfo-gluconic este 0 rece caalzatd enzimatic cu care debuteaz o cale de metabolizare a glucozetavand ca Scop cbjinerea de pentaze (vezi suntul pentorelor). Ca acceptor de hidkogen funcfioneazai NADP. ind se objin acizi aldonici, qr 00H H—G—oH H=¢—on Ho—¢—H Ho —G-k i #0, NADP* = g-0H eee 4 = ¢—0H (NADPH i H goon H=¢-0H CH, OPO.H, CH,OPO.M, acid-6-fosfo-gluconie 305-B Oxidarea energict a grupisii alcool primar duce la acic glucuronic si reprezintt 0 reacfie important utlizata in procesele de detoxifiere sau fy sinteza unor proteogticani ce confin in structura lor acid glucuronic (vezi calea acizilar uronic’). 3, Condensarea cu compusi conjin‘ind grupairi amino di nastere la compusi.de.sip baz iff, Interactiunea ghucozei cu grupirle amino ale unor Froteine este responsabil’i de formarea in organism a proteinelor glicozilate. Gradul de glicozilare a unor proteine, cum ‘ar fi hemoglobina, constituie un test de apreciere a camtititai de glucozit din singe Se consider’ cfi in hemoglobind grupzirile amino ale vatinei terminale de pe Tanuile B sunt glicozilate conform reacfilor: Ho OH, Nw A Ho tH, H«N—cH—co— NZ ' cA 4—0-0H | 1 + HN —CH-co = ——» HO—C-H valina N— terminal H —O—OH H—¢—0H ‘CH,OH He cH, NZ a I Gh HH — cH — cO— c-0 | HO-oG—H ranspoziio i ———- Hc 8H ‘Amadori 1 49-08 CH,OH Alterarea, prin glicozilare, a unor proteine in diabetul zaharat este incriminatt nefropatia, neuropatia, retinopatia diabetica. 4, Esterificarea_ozelor cu acid fosforic reprezint’ 0 etapi important’ tn insist ‘menginerea ozelor in celult ca si in metabolizarea lor ulterioart. Printre esterii fosforici ai ozelor menjionam glucozo-6-fosfatul, fructoz0-G-fosfatul, fructozo-1,.6-bisfastatul (se utilizeaz’ prefixul bis", pentru desemnarea diesteritor fosforici). 306act eterificarea se face cu. gruparea -OH a altel aze se obfin oligo- (vezi mai departe). Legarea unei componente neglucidice, desemnati ci termenul general de aglicon, dace la oxigen-, azot-, sull- glicozide. De exemple plicozide in care componenta monozaharidic’ este D-ribo- sau D-dezoxiriboturanoza kar agliconul este o baz azotatt le cH,OPO.H, = H0,PocH, “ °N cH.o# on oH, HO oH 4 a * OH on e-giucoz0-6-fostat cefructoro-6ostat °. H.0,POoK, cH.OPOH, on}, H on on i cetructoz0-1,6-bisfosfat 5. Fonmarea glicozidelor, Gruparea -OH semiacetalick poate forma oxigen-cteri cu alti are confin 0 grupare.-OH, (de ex. cu _aleooli). Compusii formafi se numesc slicozide: glicozidele glucozei sunt glucozide, ale galactozei-galactozide etc. Glicozicele se pot prezenta fie sub forma anomenuh ‘metil -glucopiranozidului sunt fie a celui B. Cele dova forme anomere ale CHK cH,OH OX OCH, ° ‘OH OH i HO HO OCH, i oH oH meti-§-D-glucopiranozid metil-e-D-glucoplranazid si polizaharidele nucleozidele sunt, asa cum s-a aritat, N= 307 (Importante din punct de vedere medical sunt gligozidele cutdiovonice care aw ca Ligon compusi steruidici. Administrate in insuficienfa cardiac, glicozidcle cardiotonie sa i frecvenfa gi cteseinlensiatea bailorinimit. Aglcomi liber (genine) nu nual ed nu sunt inzestrafi cu valoare terapeuticA dar reprezinth chiar otra i VIL1.2. OLIGOZAHARIDELE { Oligozaharidele sunt compusi glucidici rezultayi prin condensérea a dou sau-n i ‘multor monozaharide (maxisnumm 10). Legitura sabi inte monovaharide este de natu | alicozidica ‘Cele mai importante gi abundente oligozaharide sunt dizaharidele Dizaharidele rezulta, formal, prin condensasea a dou’ molecule de monozaharid. care se re 66 poate, face: iciparealambilor hidrox (nereduchioars): 1 participaceahideoxiluui spmigceialie al une O22 a vn Jroxil alcoolig. 2 ie 078, rezultand Gzalaride monocarbonilice-(reduchoare). He c i \ \ ‘ HOH HoH u { \ | cHoH 0 HoH zshare | i siearbonilc ion cron He we i { cH,0H onon yn ——“ i Ho HG i \ | ! cHOH o HOF | | i cho HOH =O zaharié | | | monoearbonitc it cHOH Lo | \ 1 He He H \ \ i cH,oH oH04 308a rand Dintre dizahdridele dicarbotilice cel mai important este zaharoza (sueroz). foarte rispindit in rognul vegetal si anume in westia de zahtir gi in_sfock’, a vvaloare nutitivi deosebitt este consttuit dint-o moleculd de -glucopiranozi si 'una de B-fructofurs fiind un o-glucopiranorido--fractofuranozid (egiturt diglicoriict: CH.OH °. oH HO | OH | | zaharoza ° HOH, 7 0 HO GH,OH oH . Prin hidtolizd enzimatict, sub actiunealzaharazei denumitt silinvertazdl) zaharoza, zahiir dextrogit ({a) #= + 66,5"), formeaz’i un amestec echimolecular de fructoz’ levosirtiy¢ (lol? = - 92°) sitglucozd dextrouirs ((a]% = + $2,5°) care va roti planul luminit polarizate spre stinga, Acest proces de hidroliz’ a zaharozei poartd, din acest motiv, $i rnumele de invertige a-zahicubi. “Zaharoza nu presiftd propretiile ozelor conferite de gruparea semiacetaicd, vistual carbon (caracter reductor, formare de osazone, anomerie). intructt ambeie grupar sunt agai ‘inte dizaaidele monocarbonice cele mai importante sunt maltoza. ce ‘Maltoza_rezulti formal prin eliminarea_apei intre_hidroxilul semi molecule de_o-D-glucopiranoi.si hidroxilul din_pozitia-4a_altei mol slucopiranozi, find 0 c-glucopiranozido-4-ghucopiranoza (legiturs monoglicozi HOH HoH ° ° OH OH , Ho 2 oO: oH oH Matoza 309fi ~it~ i Maltoza ia nastere prin hidroliza enzim: midonului si glicogenu Celtis este dizaharidul format din dou molecule de B-zlucopiranozal legate 14 fiind 0 Bg 4 CH.OH CH.OH ' ° ° t on ° oH i} Ho on a on on | Colobioza il Celobiaza ia nastere prin hidrotiza cetuloze i Lactoza.rezulti formal prin oF,OH He °. ° oH Lactoza a $e gisese in laptele meuniere care osintetizeae din gluco, Sub actiunes galaciovidaze) este hidrolizatS la zahanurle. component H Dizaltaridele de tip monocarbonilic prezinti, desigur, propritgile ozelor date de {gruparea carbonil (caracier reducitor, formare de osazone). inrucdt dispan de un hidcoxil talic liber, virwul earhonit, prezintd, de asemenes, si fenomenul de anomeric. VIL13. POLIZAHARIDELE Polizaharidele sau glicanii_ sunt compusi glucidici care prin hidroliza chimica sau snzimatiek formeaza monozahaide sau derivafi si acestora (glucozam acizi uronici, acid N-acet ieuraminic). 310Se disting: — homoglicani ~ produsi de poticondensare a unui singur tip de_unita ~ heteroplicani ~ produsi de policondensare a mai multortipuri de units Dintre homoglicani, polimerii de_glucozd (glicani) sunt cei mai rAspa reprezentati de celulozs, glicogen, ‘Se cunose si polimeri ai manor arabinozei (arabinani), galactozei (galactozani) ete. Dinire heterugticani, mucopolizafiridele, componente ale poteoglicanilor (constiiite, {in general, din molecule de acid hexuronic gi hexozaming) si potiozidele bacteriene sunt cele mai rispéindite, Glicanii_ indeplinese roluri_structurale (celuloza idele_prezente in_peretele cetoplasmie al bacteriilor si in capsul, mucopolizaharidele. din jesuiul conjunctiv) sau de depozitare a rezervelor enerzetice (amidonul, glicozenu!), jn acest capitol se vor face referiri la structura amidonului si a glicogenutui Mucopotizaharidele vor fi descrise in capitotul ,Proteoglicani" Amidonul este homoglicanul cel mai rispindit in lumea vegetal’ unde reprezinta -rezerva slucidic’ principali El este constituit din dow component; ~ amiloza, in care resturile glucozil se leag prin legituri a- (1.4) «elucoriice: iii, fined _(manan cH,OH chon cHOH CH.OH ° x on on oH oH ©. o- °. oH on on oF - amuilopectina, in care resturile glacozil se leag’i nu numa prin legtturi o-(-4)- glucozidice, ci si prin lepituri_d-(1.6)-slucozidice conferind molecule’ 0 structurt ramificat aL eaa4- Amiloza formeazt (Fig. VIL 5). t Masa molecular a amilopectine) este de ordinul_zecilor sau sutclor de mijioune. Nu tructuri helicoidale, pasul helicei cuprinziind 4 - 5 resturi glucozi te solubila in ap, formdnd solugi coloidale sau micetare care da cu jodul o coloraie nasi, | Prezenta_ rumificatillor in amilopectin duce la 0 moleculi de_tip_ globular, foarte | condensala. (Fig, VIL6.) I Glicogenul este echivalentul animal al amidonului_vegetsl, reprezentnd form ‘ depioziiare a excesului de hidrati de carbon. Rezerve semnificative de glicogen se gisese | fn. muschi yi in feat, Cantitti mici de glicogen se gisesc in pate fesururile, melas Ta \ reier, Din punct de vedere al structurit glicogenul este asemindtor amilopect | om ca glico 2 de legtturi 1.6 - i} organizare face ea nico sip : Glicogcml_are_o asi molecular de ordinal aint. inapl fomencl iy VIL.2. DIGESTIA $1 ABSORBTIA GLUCIDELOR \ Glucidele ne parvin din ali sub forma de polizaharide (amidon, glicogen, i pense Couias) deabie Caafos males. tod) # mowoaluti (ect, il fructoza, galactoz’, penloze) intr-un rapoxt procentual ec variazd cu vista, Tntruca ‘Singura forma absorbabili este cea de monozaharid, este necesar ca polizaharidele si dizaharidele si fie mai inti hidrolizate la monozaharidele componente in cursul procesului de digestie, Digestia amidonului, zahfirul cet mai bogat in diet Fig. Vil. 5 - Stuctura helicaidslé a amiozel 312Fig. Vil. 6 - Svuctura amilopectine! Fig. Vil. 7 « Structura glicogenuiui 313.legituri 1,4 - stucozidice, Cum legiturile 1,6 ea gi cele 14 din vecinttatea ramificaiilor ny pot fi desticute de catre amilaz’, produsii de digestie « amidonului, sub actiunen [amilaze vor fi maltoza si fragmente oligozahwriice de dinensinni variable - dexiring limit, Dextrinele limita sunt hidrolizate ulterior, sub acjiunea unei hidrolaze, amilo-1, 6-glucozidaza, la maltozt Celuloza nu poate fi digeraté in tractul digestiv al omuli,astfel inedt ea este lips de orice valoare nutritive, Digestia dizaharidelor. provenite direct din alimentajie sau prin hidroliza enzimatick ‘2 amidonului, se realizeazd in intestinal subjite sub acfiunea dizaharidazelor, enzime ce manifests specificitate pentru natura dizaharidului i a legituri, glucozidice, Astel tualioza este hidrolizas de malaza CEASA), actoza de acta (F-galactozidaz, vaharoza de zaharazt (crplucondacl sau P-tructozidael), Toate acesie enzitne sunt concentrate ia nivelul jejuni si sunt sintetzate de efize enterocite, Ele actioneaz’ ka nivelul marginit in perie a enterocitului ($i nu tm fumenul intestinal), in vecindtatea sistemului de transport al monozaharidclor rezultate, De remarcat c& membrana plasmaticd a celuletorepiteliate intestinae (suprafataapicala) are structura microvilar’, ceea ce mireste substantial suprafaya activa in procesul de digestic si absorbjie a zatharutilor. Absorbjia monozataridelor,respectiv a glacozei, fructozi 8 unor pentoze, se realizeaz prin sistemul port hepatic gi i posibile: transportul activ (energodependent), contra gradientului de eo difuzia facil ‘Teansportul actiy este propriu ozelor cu structurk piranozieh avind la.C. aceeayi_ configuratie ca a glucozei si la C, un_grup_metil substituit sau_nesubstituil, respectiv ueozel si galacinzci, Se presupune ci transport plucozei in celyla intestinal se face eu participarea unui © (sistemul simport gluco weoa elt si Na. Legarea Ni naten transportorului pentru monozaharid, Oda‘ patrus i celula epitelinl intestinal prin membrana apicakt (absorbtiva), 1a concentraii mici de sodiu, acest este eliberat si odata cu el si glucoza, Glucoza iese din celuld prin difuzie facilita, modiata de un transportor prezent in membrana bazali, iar Na* este expulzat contra gradientului de concentrate. prin intervenjia ATP-azci Na‘, K* dependente (Fig, VIL8). Activitatea acestei enzime, situati in membrana baal, permite menginerea gradientului de concentric a Na” si deci reinctrcarea transportorului cu glucozt. Pentru acest mecanism i, galactozei, manozei ca gi iplicX dow’ mecanisme irate, $i de transport al glucozei pledeara faptul et ransportul.acesteia este iniba prin Saban» cgnoscut inhibitor al pompei de sadn Consideratf anterior a fi transportatt prin difurie fact, soar pairea ef i fructoza recurge la un carrier, diferit insi de cel al glucozei, Unele constatati experimentale contrazic mecanismele dz absorblie propuse care nu par, in forma actual, incontestabile, 34nh Lumen intestnat Erittvintestna! Capiare — - proteins | | -———— Pratsing anige | adind Gena anspor ‘gucors facie SN h Ai glucoze’ ATP-aza Fig. Vil. 8 Transportul glucozei prin muceasa intestinala ‘YIL2.1, DEFICITE ENZIMATICE IN DIGESTIA $1 ABSORBTIA GLUCIDELOR Exist anumite anomali in digesta dizahatidslor, determinate de deficitul enzimatic {al _dizaharidazctor, care duc ta intolerani Ia dizaharide, Defigitul de Inctazi duce la intolerangi la lactozi, cel d wzh Ia intolerant’ In zahapo2’. Semnele clinice ale intoleranfel lo dizaharide sunt comune gi se exprima prin/lureri_abdominale? Aiagee, croniciflatulenfa Acumularea in intestin a dizaharidelor. compusi osmotic activ, ereste resiunea_osmatics si favorizeazi intrarea apei din spafiile intrstiiale in lumenul intestinal ducind la pierderi digestive de api. Prosesele fermentative declansate de flora imiorobiand_genereazt produsi_care iri mucoasa_intestinala. (de ex. acid tactics in cextremis, aceasta devine permeabil& la dizaharide, care se vor elimina prin uring ‘De menfionat ch deficienta de lactaza poate fi mogtenita,situajie in Care Se manifesta imediat dupa nastere, sau se poate datora sciiderii in timp a activitayii enzimatice. Deficitul de dizaharidaze poate fi seoundar unor boli cajentrte eolitespprue, Se cunoaste si un deficit de vehalnz. evidengiat srict dup’ ingestin de ciuperci tinere (unica surg de tcaloet, 315 ivee I. 3. CAILE DE METABOLIZARE A GLUCOZEI Glucoza indeplineste in organism roluri metabolice multiple care 0 fac indispensabill. Pe lang’ faptul ci reprezina un combust elent pentru fesuturi (quasi-exctusiv pentru jesuturile glucodependente), glucoza mai este neces’ furniz’iii_unor compusi.. fapji cum ar fiz sau_exogenis SE alicerol si acetil-CoA utilizat Prin parcurgerea glicolizei se objin, de asemenea, elemental de grasi (acetil-CoA) si glicerolul. Pentoze si NADPH se obfin in cursul desfiiguririi cfili 6-fosfo-eluco uronici in asa-zisa cale a gucuronatului. Sinteza de aminoacizi se realizeaz’ prin fumizarea de citre slucozi a scheletului hidrocarbonat al stora (G-cetoacizii rezultafi in ciclul Kreps). ‘Angajarea glucozci in una sau alta dintre cle metabolice posibile va fi decis’ de starea metabolic’ a fesutului respectiv. In faza anabolic’, caracterizati prin abundengai de substrate energogene, rezultat al absorbtiei postprandiale, glucoza va fi transformatt in piruvat gi apoi oxidata terminal in ciclul Krebs, in vederea asigurarii resurselor energetice ale organismului. Utilizarea glucozei drep! combustibil energogen este ,permisi* in fazii anabolicd oricarui {esut, allt celor glucodependente, eft s\ celor glucoindependente (insulinodependente), Cu precidere in ficat, dar gi in alte jesuturi, variind cu specia, glicoliza se poate desfiigura exclusiv in vederea objinerii elementelor de constructic a trigliceridelor care vor fi depozitate in jesutul adipos. Transformarea glucozsi in tracilgliceroli, fosfolipide, si colesterol are loc atunci cfind posibilitijile ficatului de a stoca glucoza sub forma de slicogen au fost depisite (2-3 ore postprandial) fn faza catabolich - in perionde interprandiale sau in cursul unei hiperactivitii fizice saw intelectale- glucoza nu mai reprezint§ combustbilul principal decit pentru fesuturile lucadependente, care o objin prin plicogenoli2a si gluconeogenerK hepatica. Sursi de energie pentru celelalte fesuturi devin rezervele de lipide eonsiuite in faz8 anabolic si, in extremis, proteincle, Metabolizarea glucozei prin oricare dintre ciile enumerate este precedali, cu obligativitate, de_-fosforl necesari Kimfnerii ei in celuli. Hntr-adevar, 316sruparea fosfat, puternie ionizath Ia pH-fiziologic, confer motecutei de glucozo-6-fosfat rare ncti.negativa si sanse minime de a siribate membrana celular’ Fosforilarea glucozei, in prezenta‘ATP_ca donator de. gruparefosfat, este 0 reactie ireversibila catalizata de’ exo aio oro 4 —e—oH 4 = G—o8 Ho~ oH Ho-o—H | Mg" i H—O—OH + ATP ——____, H—c—OH 4 ADP | hexokinaze 1 Taio H—c—oH 1 ch,OH (CH_OPO.H, ‘Hexokinazeld diverselor jesuturi sunt enzime alosterive ce se prezint sub forma wai rmultor speci moleculare, majoritatea avin Ky mie pentru glucozi (prin excelent, moment dat impun inhibarea unela dinire efile de metabolizare a glucozei, ucumuiarea temporari de glucozo-6-fosfat in celuli va opri fosforilarea ghicozei pana ce aceasta vit fi consumati, evitindu-se sechestrarea inuitt a fosfatului in celul’. Hexokinazele sunt inhibate si de acizii grasi. Sciderea captirii glucozei in conditille unei concentra intrigelutare mari dé acizt grasi poate fi explicath prin prisma acestei constatiri. In ficat, are toc, de asemenea, fosforilarea glucozei sub acfiunea unei hexokinaze, desemnatd drept ‘hexokiniza D)sau glucdkinaza, izoenzima majort din ficat. Spre deosebire de ate hexokinaze, care pot utiliza deept substrat sae WEXGZe, Blucokiraza ulizeaza exclusiv glucoza, Deosebirea fundamental fat de acestea o constituie ‘ns diferenga valorior Ky, pentru glucozt. In timp ce hexokinazcle alior fesuturi ati un Kye mic (-0,1 mM) dect afintate mare peniru glucoz’, glucokinaza are un Ky, mare (-10 mM), Valorie mict ale Ky, permit hexokinazelor sh lucteze Ia Via, $8 asigure nevesarul de glucoz’ pentru fesuturi chiar la concentrafii mici ale acest senfial pentru fesuturle glucodependente, Glucokinaza hepatich este activa: num: condlile unui aport masiy de glucoza (valori peste § mM ale glicemiel) care depaind nevoile de moment ale organismulul. fa fi depusd, dupa conversia la glucozo-C-fostat, ca glicogen. La concentraii mari de glucoz (de x. postprandial) o hexokinazi hepsticd ‘oarecare ar fi incapabil’ si asigure fosforilarea glucozei in ritmul impus de necesititile restabilirii glicemiei, intrucat ca este saturat’ chiar la concentrajii fiziologice de glucoza. Cum viteza de fosforitare « glucozei sub actiunen glucokinazei creste pe misuri ce concentrajia inracelularé a acestein ereste, glucokinaza poate fi considerata enzim Potrivita fa local potriv Prezenja glucokinazei in ficat asigurd acestuia un rol central an reglarea capri slucozei $ menfinerea glicemic, Find o enim’ inductibil, transcrieren gene sale este 317‘ectivatt de insulin’, unui aport glucidic substanjial ti corespund, evident, canta maxi de enzima in fica si posibilitatea restabilirii prompre a glicetiei. Desi preluarea slucozei de ciire celulele parenchimului hepatic nu este insuling-dependentt, scdderea activitty slucokinazei tn diabet justifies, alwuri de perturbarea depunerii si.utilizail glucozet (ve reglarea glicogenosintezci si glicolize),instalarea hiperglicemie.. De mentionat c& glucokinaza, spre deosebire de alte hexckinaze, nu este inhibatt de sglucozo-6-fosfat; activitalea ci este controtati inside esterii_fosforici ai fructoz irictox: sfatul, cel dintdi comportindu-se-ca-inhibitor iar cel a activator al stu, Actiunea acesior efector alosterici este mediats de 0 “dispusi™ 2 se lege la glucokinaza sisi o inhite: la concentratii mari de fructozo-6-fosfat acesta se leag’ la protein’ induedind 0 modificare conformational favorabila legirii sale In glucokinazi in timp ce legarea fruetozo-I-fosfatului are efect invers, enzima rlimandnd activa, Stimularea ghucokinazei prin fructozo-1-fosfat, provenit din aportul de zaharoz’, sugereazst dependenta activititit enzimei de starea nutrition 3.0 explic lui aterogen al VIL3.1, GLICOLIZA (SECVENTA EMBDEN - MEYSRHOF - PARNAS) Funcfia major’ a glucozei in organism este aceea de a servi drept sursti de energie Imetabolic’. Eliberarea energici incomorate in molecula de glucoz’ se realizexzt tie Parfial, prin degradarea sa In piruvat, fie total, prin oxidare la 00, Oxidarea glucozei pani la piravat presupune parcurgerea slicolizei - cale metaboticx clucidat’ de catre Embden, Meyerhot si Pamas, Pirwatulrezulat in glicolizh este oxidat in continuare pina fa CO; prin antrenarea si in ciclul Krebs, in condigile in care fesutuile dispun de oxigen sau este redus la lactat, tn conde fn care aportul de oxigen este sett. Desfigurarea glicolize, proces putemic exersonic (AG = -47 kcal/mol se ealizes23 -scopul_procurtrii_ATP. In condijiile unei disponibiliiti_crescute_de_glucoz’i (postprandial) toate jesuturile, inclusiv cele insulino-dependente (lesutuladipos, ‘muschiul), vor utiliza glucoza in vederea obtineri resurselor 2nergetice, 1 ficat si alte tesurur. picoliza reprezint si modalitavea metaboticd de wansfonmre a_glucozei, oferiti in camtithti mari postprandial, in lipitle de_tezerva, respectiv irigliceride, forms ideala de depozitare a energici la care se va face apel in condifile fn cave concentrajia glucozei tn stnge este redusi, Glicoliza furnizeazd atc componenta plicerol a igliceridelor cit si elemental de construcjie a acizilor_grasicare. este. AceliI-CoA Yvezi metabotismal lipidelor). De mengionat ck fi slicerol_ erolfostat) gi in vederea obji acetilCoA i in scopul sintezei colesterolului. Acesti sf de naturd lipidica. vor fi exportali fesuturilor exirahepatice, cu prectdere jesutului adipos, sub form’ de lipoproteine, Seevenia glicolitied| se desfigoari in_citosal. si presupune urmiitoarele transformatri atic catalizate: 318,rsia slucozo-6-fosfatuui la fructozo-G-fosfa. Izomerizarea o-glucopiranoz0-6- Tui la Befructofuranozo-6clostar” se Telizeazi sub 6. izomerazs?. Enzima realizeazd izomerizarea celor douil oe inir-0 reaclie rover necesit& prezenta ionilor de Me™ sau H,0,P OCH, ol H,0,pocH, 7 ° OH on see k on > ea on 4 CH,OH on oH 2. Rosforilarea fructozo-6-fosfatului ¢ Fostorilarea B-iusiofuranoz se realizeaz4 into re inazi\(6-FF-1K), 6-Fosfofrucio za este 0. encima a irei activitate este controlatii de numerosi efectori metabolii, pozitivi sau negativi. fofructo-I-ki i cnergetice acelulei, ATP ior alosteric. Concentratiile mari de ATP intracelular inhibi ifert de iocul activ ce Teer ATE 'Rorma anomeric preferati de enzime gliclizel (casi de oele ale suntului pentozelor) este form P. aga cum atestl studi recente de cieticd enzimatics si RMN. 319|} ATP. Citratul, intermedia ‘De mengionat c2i AMP (ca si ADP) se comporti ca efector pozitiv, suprimand inhibigia, prin ATP, a Constatarea ci in muschi fluxul glicotitic poate varia de peste 100 de ori in timp ce concentrajia ATP varia cu mai pujin de 10% in tneverea de a starea de repaos Ja activitate intensi poate (i explicatt prin considerarea activity adenilat Kinazei (miokinswa). Aceastt cenzim®, prominent in muehi (dar sii ica gi alte fesutur), converteste ADP rezaltat in cursul contracfei musculare in ATP si AMP: 2ADP » ATP + AMP. nucit concentratia ATP este de aproximativ 10 ori mai mare decit cea a ADP side aproximativ 50 de ori mai mare deeat 4 AMP este usor de infeles ci somnaiul metabolic reprezentat dé variagii minore in concentrafia ATP este amplificat, find perceput 1a nivelul activitatii miokinazei in concentrajia ADP, dar mai ales in concentrafia AMP care se mosific’t major : ((AMP] = [ADPF' « K,./IATPD: astfel, 0 crestere procentual minora in concentrayia ATP, incapabili si inhibe substanfial activitatea G-fructozo-1-kinazei, antreneazt 0 setidere procentual major. a concentratiei AMP, suficientt pentrs a deprima semnificativ activitatea enzimei de asemenea, de fosfoenolpiruvat si 13 ai glicolizei. catular permite un eon | can de gluco anienat tn 0 Uninhibitor putemical enzimei s-a dovedit a f.giratul, care accentueaz’ i al ciclului Krebs, format din aceti-CoA provenit tn faza | recte din glucozi, se acumuleazi Ia cencentragii mari de ATTP (vezi reglarea ciclului Krebs) si iese in citosol unde inhibi encima cheie a glicolizei. Efectal \ Pasteur respectv inhibigia glcolizel prin respirajie ~ ar putea avea accasth explictic fn fesuturile cave fac sintezt de acizi grasi din gluco, cixatul iit in citosol serveste ca donator de gruptr acetil si totodati ca activator alosteric al enzimei cheie a procesului de nealipogenez’, Acumularea de citrat in citosol reprezint sermnalul celular al satisfacerit nevoilor energetice ale fesuturilor ca si al vecesarului de intermediari biosintetici al acestora, Inhibit prin ctrat a 6-fosfofructo-L-kinazei are gio att raiane in suture care utlizeazt de preferingdaciait grasi ca sursi enengetic& (mugchiul schelet> si cardiac) ca si in yesuturile ‘slucoindependente in perioadle catabolic. in faz catabolic’ portal glucagon insufina mare, ccare-i este propriu,activenzt lpoliza in fesutul adipas avand ca rzulta aflux de acai grasi spre {esuturi, Degradarea acestora prin B-oxidare duce la aceti-CoA mitosolic care este introdus in ciclul Krebs, vin oxaloacetat, sub form’ de citrt. Cind cencentrajia de citsat deptigeste posibilitile de uilizare in ciclul Krebs, citratul acumulatiese in citosol si, desigur, inhib 6- FFALK, coea ce se soldeaai cu acumulare de glucoz-Gfosfal, inhibitor alosteric a hexokinazelor extrahepatice, Reckicerea capacititi de pretuare a glucozei din circulatie, subsecventi ulilizrii aeizilor grasi, reprezinel una dintre modalitaile prin care fesuturile slucoindependente eruja glucoza sangving care, in condift de austertate glucidica, tebuie si uisfact, exclusiv, novestijile fesuturilor glucodependente, | anabolick din picuy 320© particularitate important a ‘produsul acfiunii sale, fructozo-1, Aceastt stimulare prin produs final (feed: back inhibigie) prezintd un interes major intrucd timp un inhibitor al fructozo-1, 6-bisfostatazei, encima 23-bisfosfoglicerat + 3fosfoglicerat, face posibila, desfasurrea ‘glicolizei si implicit menginerea unei concentrafii optime de 2, 3-bisfosfoglicerat chiar in conditile in care necesitiile de ATP ale eritrocitului sunt reduse,i foglicerat sub aefiunea unei ogliceral mutaza - in prezenfa obligatorie a Mg™: goon coon 1 HoH == He 1 i one® cH,0H 6. Transformarea 2-fosfogliceratului in piruyat, ‘nur-o prima etapa, reactia implicd sub actiunea unei sia 2-fosfogliceratului la 2-fosfoenolpis (eholaze] enzima ‘care necesit’ prezenfa Mg™ si este, ca atare, susceptibila la inhibitia prin fluon goon coon I Hoe = c-0~@ | “HO I CH.OH ch, Recoltarea singelui in vedorea determintvii glocozei se face pe 0 fluorur’, tocmai pentru 4 inhiba uiilizarea glucozei de cae eritocite 2-Fosfoenolpiruvatul este un compas macroeraic: legatura.gnolfosfat lib hidrolizi -14 keal/mol. in prezenja piruvat Kinazei'gruparea fosforil este transferati pe ADP cu formarea unei molecule de_ATP. in aceast’ etapa ¢ formeazi © nous molecult de ATP prin fosforitare 1a nivelol substraului: 00H cook 1 « 5 cno@® + ave —S ceo + ate i Mg?(Min®) | ch on, Bir se prezint sub forma a dows Hzbeiiaime? We tip L, propri de tip M, proprie muschiului, loenzimele de tip L sunt enzime alosterice, tetram susceplbile Ia actiunea a numerosiefectori metabolic: etapa catalizata de piruvat kinaza reprezintd, din acest motiv, un punct de control important al cit glicolitice. Printre efectorii_enzimei hepatice ‘se numirh fructozo-1, 6-bisfosfatul care functionenzd ca activalo®@Activarea unei elape dintr-o secvenid de react prnir-un metabolit, substrat al unei elape anterioare poartti numele de feed-forward stimulare. Expri activitatea enzimei Timitanta de vtec, fractozo-1, 6-hisfosfatul ,previne™ enzinia, Sitmtt in aval, asupra cantitiii de_fosfoenolpinivat_clieia_va_uebui si fact fg, ajustindsei_conespunzatoractivitatea— Adlai de t ‘hack simulae, feed forwamd stimularea reprezintz o modalitate de realizare a unor interacfiuni-metabolice complex: avand ca scop desfisurarea umonioasi a proceselor vitae (vezi reglaren gluconeogenezei. 326Pirayat_kinaza (ca 3i fosfofnicto-I-kinaza) este inl de ‘Alanina - aminoacid pluoformator- est si ea un inhibitor puri afin CoA. catecolamine, via. pt promovath de_giveagon si ; De remaeat ct insu activa in forma defosfo, promovati de: insuli funcyioneaztt in timp ce ‘conditii de relativa anaerobioz’ (in muschiul in, contractie, hi care_mu dispon_de-echipamentul enzimatie, necesar metaboliziri_erabe. a piruvatalu Gelina, Jesuturile embrionare sau neoplazice, hematiile, fibrele_musculare_alhe). Reducerea se face pe seama NADH rezultat fosfatului, fapt care asiguri reoxidatea NADH si deci posibititatea desfigurisi slicolizei, respectiv furnizarea de ATP, in absenja 03: cooH coo | ’ LOH | C-O + NADH + HY. HOH + NAD" I | on, on, Lactatul este .simis" pe cala sanguin’ ficatului ili unde se reoxideazi, in prezen{a LDH. la pinuval care va servi ca substral pentru glucaneageneza. Glocoza rezultati din lactatul muscular poate f furnizatt muschiului, care o va utiliza, formind din now tactat (vezi cictut Cor), Abilitalea glicolizei de a functiona in conditii de anaetobiozt consacra drept ale tunica de supraviojuire (sintezi de ATP) pentru uncle yesuturi inu-o astiel de conjuncturi. Mai mult, prezenja enzimelor glicolizei in concentrajii mari ii pernite acestei Cit si product ATP mult mai rapid decat o face degradarea aerobt, chiar dack producerea de ATP este mai eficienti in prezen{a oxigenului. De menjiona ci funcjionarea glicolizei este limita’ de acumularea aeidului lactic. perceput de FE-1-K ccare-si deprimi activitatea fa pH mai mic de 7. in conditi de aerobiout, piruvatul este convestit la acetil CO din gruparea —~ CL © avand ce SCoA rezultat labilizarea hid snului din pocifia H—CH,— Co ~ Scoa CH, — COOH + HOH ’ ——> — HO—C—COOH woo — ¢° = const | ‘cH,coow cH, — cooH aa? 333 4o-334 Lipsitreductaz~ ‘wansacetlaza Pirvat Dikidrotipalt enidrogenaza dehidrogenaza (Ey) (E3) Fig, Vil. 13 - Organizarea complexului piruvat dehidrogenaza acetl COA |COA-SH) NADH/NADT #f P1908 Oe «abe aepennt) \ en \ ig \ Piruvat dehidrogenaza Piruvatdehidrogenaza activa @ inaciva oo / naval dehidrogenaz- / [see | e. ca2* Fig. Vil - Controlul radical covalente gi alosterice a activitaii complexulul pruvat ‘dehidrogenaza(Giiza Sintazaleste o enzim’ alosterica inhibatt de ATP, NADH, citrt, acizigrasi eu Jang lung, ca si de succinil—CoA, intermediar al ciclului Krebs. Sciderea afinitagii citrat sintazei pentru acetil-CoA la concentratii maci de ATP.permite_ciclului Krebs. stesi, adaptee ritmul la necesitile energetice ale tesuturilor, De remarcat ca in ficat gi alle Jesuluri care fac neolipogenezs, formarea citratului reprerintd o rispintie metabolich extrem de important in care se hotirite soarta activ. Avesta se poate angaja nu numai in etapele ulterioare ale ciclulut Kreds ares ‘ci $i in biosinteza de novo a acizilor grasi..care are loc in citosol. Intrucdt acetil-CcA format n-miosol din piravas nu poate waversa membrana misoslic, sata adopts de celuki consti in exportul iv sub formii.de.citsat. prin intermediul unui transportor specializat, urmatt de clivarea ta acetil-CoA si oxaloscetat recta citrat laze citrat acetii-CoA + oxaloacetat arp ADP +P; lesirea citratului din_smitosol, in vederea angajarii sale in neolipogenez3, are toe ‘exclusiy in condi in care evolufa sain ciclul Krebs este blocatl prin cantititile mari de ATP si NADH, rezultae prin metabolizarea glucozei, care sunt inhibitor ai enzinet itante_de vitezs (vezi mai jos). Ts 2. into etapa ulterioar’, citratul este izomerizat In izocitrat prin intermedi} geidd.ut jtig sub actiuneafaconilaZeid oh, — COOH CH — COOH Ho— CH — COOH | —H,0 1 +H,0 HO-—C—COOH ===" C—GOOH === — CH—COOH i | —H,0 i CH, ~ COOH CH, — COOH CH, — COOH Echilibrul care se stabileste intre cele trei forme depinde de viteza de oxidare svidulutizocc sob actinea zac deidrogenaze) Trecereascidulul cic fn ci izocitric ¢ste inhibati.de.acidul fuor 3. Sub actiunea [izosicrat aH iz decarboxilare, formdnd a-cela suferi o oxidare insoftt de Ho— CH— COOH ° 1 NADY NADH +H" i oA COOH” \ t on ‘CH, — COOK oe CH, — COOH |A fost demonstrat existenga a doullizoenzime ale izocitrat dehidrogenazei: una NAD. prezenth exclusiv intramitosolic, si cealalti NADP dependent, avaind o dubli Sea ictal sali Ens NAD) dependent exe penn alostercd eee eS SBE cath ce sapere cea este forma implica in desfigurarea ciclului Krebs, cale catabolic& aviind ca scop sinteza de ATP, Activerea 335enzimei prin ADP anireneaz4 faptul cl, ori de cite. eri corcentr enzima igi miseste semnificatiy activitatea, Simultan, activitaea fnueegulul ciclu reste, etapa.calalizata.de. izocitrat dehidrogenaz’ find etapa limitantd.de_vitezt, Enzima este inhibat alosteric si de_chire NADH...——_ Izocitrat_dehidrogenaza NADP dependent} este, dimpotiva, inhibati de ADP si stimulats d2 ATP. Cum enzima este activa in condifii ce favorizeazat sintezcle (ATP erescul), $a conchis ef enzima este implica, alaturi defendima malic} Uehidiogena- wlE—guntaTaT pentozclor, in furnizarea NADPH necesar sintezelor reductive ce se desfigoar% eséngial in citosol. 4, Decarboxilarea oxidativi a q-cetoglutaratului la_succinat are loc similar cu decarboxilarea piruvatului, Ea necesiti prezenia sistemvalui multienzimaic(@-cetoghitara dehidrogenazl jeare utilizeaza drept cofactori TPP, acid Lipoic, ¢ NAD, FAD. Energia eliberati la oxidare este incorporaté sub form: jol esterice in unei leg goon cH, co, + NADY + GoasH SS cH, + NADH 4 HY co~ Scoa Succinil~CoA, in prezenta GDP si fosfatului anorganic, formeazi GTP si succinat. Se formeazi o legituri fosfat macroergict realizatl prin fosforiiare Ia nivelul substratulu, . Reactin este cataizata de usc! tokindza fsuccinit CoA sintetaza). cH, — COOH CH, — COOH + GDP + POH, === | + GoASH + GTP cH, — CO ~ SCoA CH, — COOH COOH — CH, — CH, — CO ~ SCoA + CH, CO—CH,— COOH —_» COOH — CH, — CH, — COOH + CH, — CO — CH, — CO ~ SCoA Reacfia permite metabotizarea ulterioari a acefoacetatului sub format de acetoacet CoA. Reachia este catalizata de succinil CoA - acetoacetattisforuza (vezi celogeneza, 336idrogena ena ese, ca silpiruvat dehidrogenaza) inhibatt de produsii senvzimatic IADHT, De asemenca, enzima este seusibilt Ia ergelicd tu ivaul de. Ca Oxidarea ula taf prin acfiunea Si avand drept eoenzimif FAB!) ina TENTRORE- FAD 'FADH, propriaei formere 6. Hidratarea fumaratului duce la L-malat si este catalizatt de fumarazai;erzimtt cu stereospecificiafe marca, fumaraza nu foloseste drept subsirat maleatul goo Hooc — oH il + HO yon H—COOH os cooH 7. Oxidanga malotului ta oxaloacetat se realizeaza sub acjiunea jalaidehidroge cooH coon { Nat NADH HT gto gue oe ae oe coon coo Derularea ciclului Krebs duce deci in oxidarea aeetil = Coa si regenerarea oxaloaceta wulai (Fig. VII.15). Prin oxidarea seetil~CoA se forme i sedicitog) G_NADH + 3H" + ADH ce sor fi oxida in lanl rspiaor. Nestea ‘eoxilitpernanene a eor a niveal lanl resprtor permite cil Krebs sh se ett estou exclusiv in condi de_aerobiard (spre deosebire de_licoliz). Oxalac I-CoA pe care 0 introduce in ciclu Krebs se poate formu Reacfia global de desfsu 2} OP0-S00A -ONAD' FAD GOP + 20.47, —P 200,+ NADH + FADH, «GTP +24 CoASH Ciclo! Krebs constiie 0 cals final de degradare, comun glucidetor. li prowinelor= 4b , Cty CO-S-CoA ° ‘cath CoA, ii Cirat sistaza < ¢-coo" GoaSH : $ og 8 F voosneonstieap | hon lve ge 000 og aD pom cat i Gi- WF SSiconenara a5 ATP NAOH ti t 0* 6-600" g conch Scoot | ! | Fig, Vil. 18 - Ciolu acizlor tricarboxilicl (cidul Krebs) Acizit gras int in ciclul Krebs prin componenta acetil~Co8, produs al oxi. Aminoacizit_glucoformatori (glutamat, aspartat, arginin, histidin’, v glicocol, tmeonind, cisteinl, trowind, fen i proprii dnd nastee la intermediay ai cilufui Krebs. Aminonczitcetofonnator (leucn, {enilalanind) genereaz’ gcetl~Co (vezi metabolismal aminoaczilor). arcat_c& acidii' Bagi, ca si aminoacizii_cetoformatori, pot furniza exclusiv componenta cei=CoA.] Spre deosebire de acestis, unii aminoacid, dar mai ales _slucidele, pot forma -nu_numai.componenia aceli-CoA (prin piruvat) care se consuma, : i $i componenta oxaloacetat care permite amorsarea ciclului Krebs, Reactia de formare a oxaloacetatnlui condifioneaz evident, utilizarea grisimitor, Fomarea oxaloacetatului are loc esential prin carboxilarea piruvalului sub acjiunea biruval Cavboxiigive!, jenzima localizati care necesitt biotina drept grupare prostetcts i t iH | CHCOCOCH +0, ATP —> COOH — CH, —CO— COOH + ADP +P, | 338,Piruval carbowiligazajeste o encima alosterich a ciel activitate depinde de prezenia aeatil=ChA = efector pozitiv al enzimei; in absenia_acestuia enzima este complet inactivl, Cresterea convenes acetil-CoA va induce erestensa_activitiii_piravat carboxiligazei, favorizind asifel ciclul de oxidare, prin cuplare cu oxaloacetatul, Diminuarea concentrafiei de acetil-CoA favorizeazi activitatea piruvat dehidrogenazei, enzima ce catalizewz formarea acetil~CoA. (Piruvat carkoxiligaza este, aga cum se va arita, prima enzimt a gluconeozenezs Origntarea piruvatutui spre gluconeogenezt sau spre ciclul Krebs va fi decisa, Jin ultima instan(, de disponibilitaite energetice ale fesuturilor. CICLUL KREBS - CALE AMFIBOLICA Pe Langit faptul eX reprezintd o cale de degradare comund pentru glucide, tipide si proteine, ciclul Krebs poate furniza intermediarii sii diverselor procese metabolice. Asifel, oxaloacetatul si o: - cetoglutaratul. cei doi cetoacizi ai ciclului, pot forma, prin tvansaminare sau aminare reduetivi, aminoacizii corespunztori - aspartic si glutamic, dc’ celula ti reclam’ GOoH—=CH,—CO— COOH CH,—GH—COOH <= COOH — CH, NA, NH ° COOH oH, —p--cBOH COOH EH=CHy-CO-DOOHHCHL-GH-LOOH = COOHCH CH fergie NA NM SOOH-CH-EH-€O--COOH + N+ NADH == COOH-CH—CH--GHCOOH + NADP" HO NH Acidul aspartic constituie un panct de plecare in biosinteza nucleotidelor pirimidinice, {in timp ce giulamina proveniti din glutamat iniiazt biosinteza nucteotidelor|purinieg, Suceinatul, alt intermediar al ciclului Krebs, este anirenat in biosinteza hemului prin, ciclul suecinatelicint. Citratul, reprezint forma de transport a acetil CoA din mitosol th citosol; acetil-~ CoA citesolic este antrenat in sinteza de novo a aciailor gtasi sana colesterolului: Ct, COOH + CoAsH ciratiaza CH.~cooH —¢ —coon I + GH.CO-SCoA co~cooH CH— coon ATP TROP Oxaloacetatyl tansportat din mitosol in citosol ca malat, este convertit fa fosfoendlpi- val care Se angajeazt in gluconeogenez, Aspartatul, glotamatul, porfirinele, glucoza, pirimidinele, acizii gragi fst construiese scheletul hidrocarbonat pe seama intermediasilor ciclului Krebs. 339Functionarea ciclului Krebs, pe de 0 parte dreptcale catabolic iar pe de ath parte fi Grept_cale_de_initiere_anabolicd, il consacra drept cake amfibolic anabolic’ si i auaelicy Relileinvermetabolice ale ciclulut Kees suede hig. VIL 16. 1 Utilizarea in diferite procese biosintetice a intermediarilor ciclului Krebs necesitit, evident, ‘mecanisme complementare ce permit efacerea acestora. Resi cae. pomnil-fumizarea intermedi | Slor ciclului Krebs poartt numele de reacti anapleroice. (ana = din now; pli = a umple, a completa). ~~ ‘Necestatea .eumplerii" cu subsite decurge din carscerul endergonic al eatilor biosintlice a chror desfgurae se asigurd prin fun snaboHes Cele Keb, | "SRetcia anaplerod cca mai importa este cea de eaboxilare a piruvatuti la | oxaloacela (veei mai sus) Scidetea concenttae! orieanaia dings IMERNGLAR. CLT Krebs se traduce prin acumulare de acetil-CoA,, .perceputt de cltre piruvat carboxiligaz’ ae, actlvindu-e, oduce-Oxtoacla Acosta va ult tn rence de sintezt Say | vva crete vileza de desftigurare a ciclului Krebs (dac& nu este suprasaturat), in ihen catbolicd enzimelecheic ale cilului Krebs de NADH. provent prin B oxides at : reduce la malat si iese in-eiiosol unde zat ta pluconeogenez / Teco goles sunt considera gi clle do dott acegg gras cu nurnic iar dont deco nr sc olni.vlg meona, sokat cu for iLCoA. i Oniarea haat rai mai acetatul Se ce-cetogiutarat este, de asemer Gucoaa { it Desoaceiat, —+ Festoencl ————+ Prpvat =~ Ciena © reacjie anaplerotic’, Ie pruvet ‘Nanina Tp Serina lip Gliéna ib 7 ‘Troonina | ! stpct.coA pet oh —e hd pad ' en | ‘ioe i tn I Levens Wome) roy site I; Fenisnne —apincact ange : Troe I ft faparat-—e Cordpatcial Teva = Clrate + aceblCok i 1 nok Glulgnina —+ Pune t iitart -— utamat { ‘Aging Protna fesdna ‘Teonina Ls Prepionat Fig. Vil. 16 - Ciclul Krabs - cale amfbolica (m = mitosol; © » ctesol) i 340NADH By Fabia, 5 2 BILANTUL ENERGETIC AL ARDERM GLUCOZEL in succesiunea de reactii ce reprezint4 ciclul Krebs, semnificative din punct de vedere cenergetic sunt reacfile de oxidave. in ciclul Krebs, reactile de oxidare se_soldeaz’ cu formarea de schisle oduct: NADH, FADS, . Oxidarea coenzimelor reduse are foc 1 vel! lanlut- respira, rows in cursil cBruia, prin cuplarea oxidirii cu fosforilarea, este gencral_ATP, a polismului energetic. Cuplares ‘ecfilorcilutui Krebs cu anu 1 respinlot este pasbit aati localiza i Jocalizairii intramitosohice ‘i-vecinafduit spatiale «-sisiemclor enzimatice implicate in cele dow procese. Oxidarea JNADH| duce, asa cum s-a arial a formarea di moll ATES fn imp ce oxidarca FAD, “is nagere a > nll de ATP. Penini stabilirea ilanjului energetic al oxidasit pirwvatului, vom urmari etapele ‘oxidative gi bilanyul lor energetic. Etapele catalizate de dehidrogenaze NAD dependente, care se soldeaz.i cu formaren NADH, deci a catel3 moli ATP) sunt: xii priv in prezeia pinavat dehidrogenazei —+ NADI cifatulu in-prezenia izocitrat dehidrogenazei NAD dependente, — decarboxilatea oxidativi a.o-cetoglutaratului in preventa ace nazei > NADH = 3 ATP; - dehidrogenarea malanului in prezenta malat dehidrogenazei 9 NADH = 3 ATP. ‘Big de oxidare a succinatult la fumarase face in prezenit FAD si duce la 2 mali A in afara etapelor oxidative, care reclam& cuplarea acestora cu catena de oxkdafie celulard in vederea formarii ATP, existh in ciclul Krebs 0 etapa care sintetizeazi ATP 1a nivelul substratilui si anume etapa conversiei succinil~CoA (objinut prin decarboxi- larga oxidativa a o-cetoglotaratului) fa succinat insumand numarul de moli de ATP rezultai prin oxidarea_unui_mol.de.piruyat in ciclul Krebs, cuplat cu catena de oxidatie celular, se obfine un total de 15 mol ATP. Oxidatea unui_mol de acelil

You might also like

• The Subtle Art of Not Giving a F*ck: A Counterintuitive Approach to Living a Good Life

  

  From Everand

  The Subtle Art of Not Giving a F*ck: A Counterintuitive Approach to Living a Good Life

  Mark Manson

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (5819)
• The Gifts of Imperfection: Let Go of Who You Think You're Supposed to Be and Embrace Who You Are

  

  From Everand

  The Gifts of Imperfection: Let Go of Who You Think You're Supposed to Be and Embrace Who You Are

  Brene Brown

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (1093)
• Never Split the Difference: Negotiating As If Your Life Depended On It

  

  From Everand

  Never Split the Difference: Negotiating As If Your Life Depended On It

  Chris Voss

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (845)
• • Magazines
  • Podcasts
  • Sheet music
• Principles: Life and Work

  

  From Everand

  Principles: Life and Work

  Ray Dalio

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (609)
• The Glass Castle: A Memoir

  

  From Everand

  The Glass Castle: A Memoir

  Jeannette Walls

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (1717)
• Grit: The Power of Passion and Perseverance

  

  From Everand

  Grit: The Power of Passion and Perseverance

  Angela Duckworth

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (590)
• Sing, Unburied, Sing: A Novel

  

  From Everand

  Sing, Unburied, Sing: A Novel

  Jesmyn Ward

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (1104)
• Hidden Figures: The American Dream and the Untold Story of the Black Women Mathematicians Who Helped Win the Space Race

  

  From Everand

  Hidden Figures: The American Dream and the Untold Story of the Black Women Mathematicians Who Helped Win the Space Race

  Margot Lee Shetterly

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (897)
• Shoe Dog: A Memoir by the Creator of Nike

  

  From Everand

  Shoe Dog: A Memoir by the Creator of Nike

  Phil Knight

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (540)
• The Perks of Being a Wallflower

  

  From Everand

  The Perks of Being a Wallflower

  Stephen Chbosky

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (2104)
• The Hard Thing About Hard Things: Building a Business When There Are No Easy Answers

  

  From Everand

  The Hard Thing About Hard Things: Building a Business When There Are No Easy Answers

  Ben Horowitz

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (348)
• Bad Feminist: Essays

  

  From Everand

  Bad Feminist: Essays

  Roxane Gay

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (1018)
• Elon Musk: Tesla, SpaceX, and the Quest for a Fantastic Future

  

  From Everand

  Elon Musk: Tesla, SpaceX, and the Quest for a Fantastic Future

  Ashlee Vance

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (474)
• Her Body and Other Parties: Stories

  

  From Everand

  Her Body and Other Parties: Stories

  Carmen Maria Machado

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (822)
• The Outsider: A Novel

  

  From Everand

  The Outsider: A Novel

  Stephen King

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (1866)
• The Emperor of All Maladies: A Biography of Cancer

  

  From Everand

  The Emperor of All Maladies: A Biography of Cancer

  Siddhartha Mukherjee

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (271)
• The Sympathizer: A Novel (Pulitzer Prize for Fiction)

  

  From Everand

  The Sympathizer: A Novel (Pulitzer Prize for Fiction)

  Viet Thanh Nguyen

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (122)
• Angela's Ashes: A Memoir

  

  From Everand

  Angela's Ashes: A Memoir

  Frank McCourt

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (441)
• Brooklyn: A Novel

  

  From Everand

  Brooklyn: A Novel

  Colm Tóibín

  Rating: 3.5 out of 5 stars

  3.5/5 (1947)
• The Little Book of Hygge: Danish Secrets to Happy Living

  

  From Everand

  The Little Book of Hygge: Danish Secrets to Happy Living

  Meik Wiking

  Rating: 3.5 out of 5 stars

  3.5/5 (401)
• A Man Called Ove: A Novel

  

  From Everand

  A Man Called Ove: A Novel

  Fredrik Backman

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (4771)
• The World Is Flat 3.0: A Brief History of the Twenty-first Century

  

  From Everand

  The World Is Flat 3.0: A Brief History of the Twenty-first Century

  Thomas L. Friedman

  Rating: 3.5 out of 5 stars

  3.5/5 (2259)
• Steve Jobs

  

  From Everand

  Steve Jobs

  Walter Isaacson

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (808)
• The Yellow House: A Memoir (2019 National Book Award Winner)

  

  From Everand

  The Yellow House: A Memoir (2019 National Book Award Winner)

  Sarah M. Broom

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (98)
• Devil in the Grove: Thurgood Marshall, the Groveland Boys, and the Dawn of a New America

  

  From Everand

  Devil in the Grove: Thurgood Marshall, the Groveland Boys, and the Dawn of a New America

  Gilbert King

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (266)
• The Art of Racing in the Rain: A Novel

  

  From Everand

  The Art of Racing in the Rain: A Novel

  Garth Stein

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (4208)
• A Tree Grows in Brooklyn

  

  From Everand

  A Tree Grows in Brooklyn

  Betty Smith

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (1929)
• A Heartbreaking Work Of Staggering Genius: A Memoir Based on a True Story

  

  From Everand

  A Heartbreaking Work Of Staggering Genius: A Memoir Based on a True Story

  Dave Eggers

  Rating: 3.5 out of 5 stars

  3.5/5 (231)
• Yes Please

  

  From Everand

  Yes Please

  Amy Poehler

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (1902)
• Team of Rivals: The Political Genius of Abraham Lincoln

  

  From Everand

  Team of Rivals: The Political Genius of Abraham Lincoln

  Doris Kearns Goodwin

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (234)
• The Woman in Cabin 10

  

  From Everand

  The Woman in Cabin 10

  Ruth Ware

  Rating: 3.5 out of 5 stars

  3.5/5 (2522)
• Fear: Trump in the White House

  

  From Everand

  Fear: Trump in the White House

  Bob Woodward

  Rating: 3.5 out of 5 stars

  3.5/5 (738)
• Wolf Hall: A Novel

  

  From Everand

  Wolf Hall: A Novel

  Hilary Mantel

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (3811)
• John Adams

  

  From Everand

  John Adams

  David McCullough

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (2409)
• On Fire: The (Burning) Case for a Green New Deal

  

  From Everand

  On Fire: The (Burning) Case for a Green New Deal

  Naomi Klein

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (74)
• The Light Between Oceans: A Novel

  

  From Everand

  The Light Between Oceans: A Novel

  M.L. Stedman

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (789)
• Manhattan Beach: A Novel

  

  From Everand

  Manhattan Beach: A Novel

  Jennifer Egan

  Rating: 3.5 out of 5 stars

  3.5/5 (792)
• The Constant Gardener: A Novel

  

  From Everand

  The Constant Gardener: A Novel

  John le Carré

  Rating: 3.5 out of 5 stars

  3.5/5 (104)
• The Unwinding: An Inner History of the New America

  

  From Everand

  The Unwinding: An Inner History of the New America

  George Packer

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (45)
• Anuarul Bucurestilor 1892-1893

  

  Document441 pages

  Anuarul Bucurestilor 1892-1893

  JohnnieKy

  100% (5)
• 1922 - Plan Si Ghid Al Orasului Bucuresti

  

  Document143 pages

  1922 - Plan Si Ghid Al Orasului Bucuresti

  JohnnieKy

  100% (3)
• 193x - Ghidul Municipiul Bucuresti - Ghid - Harta

  

  Document81 pages

  193x - Ghidul Municipiul Bucuresti - Ghid - Harta

  JohnnieKy

  100% (6)
• Rise of ISIS: A Threat We Can't Ignore

  

  From Everand

  Rise of ISIS: A Threat We Can't Ignore

  Jay Sekulow

  Rating: 3.5 out of 5 stars

  3.5/5 (137)
• Little Women

  

  From Everand

  Little Women

  Louisa May Alcott

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (104)
• Anatomia Omului-Atlas Multimedia Ed Syntagma PDF

  

  Document94 pages

  Anatomia Omului-Atlas Multimedia Ed Syntagma PDF

  Sorin Puie Moliticienilor Sorin

  No ratings yet
• Eugen Barbu - Incognito Volum 1

  

  Document501 pages

  Eugen Barbu - Incognito Volum 1

  Daniel Manu

  91% (11)
• 1935 - Ghidul Bucurestilor - Alexandru Cicio Pop

  

  Document201 pages

  1935 - Ghidul Bucurestilor - Alexandru Cicio Pop

  JohnnieKy

  100% (3)
• 1830 - Edilitare 1830-1832 PDF

  

  Document245 pages

  1830 - Edilitare 1830-1832 PDF

  JohnnieKy

  No ratings yet
• 1920 - Ghidul Bucurestilor - 1920 - 1930 - Ocr

  

  Document110 pages

  1920 - Ghidul Bucurestilor - 1920 - 1930 - Ocr

  JohnnieKy

  100% (1)
• Răzvan Theodorescu Bizanţ Balcani Occident La Inceputurile Culturii Medievale Romaneşti PDF

  

  Document394 pages

  Răzvan Theodorescu Bizanţ Balcani Occident La Inceputurile Culturii Medievale Romaneşti PDF

  draganescucristi5800

  100% (4)
• Hunter, K, Kiffmeyer, D - Constructia Cu Saci de Pamant PDF

  

  Document352 pages

  Hunter, K, Kiffmeyer, D - Constructia Cu Saci de Pamant PDF

  JohnnieKy

  100% (2)
• Strategie Modificata GAL BVC

  

  Document218 pages

  Strategie Modificata GAL BVC

  JohnnieKy

  No ratings yet
• Dicţionar Istoric, Arheologic Şi Geografic Al României - Lecca (1937)

  

  Document619 pages

  Dicţionar Istoric, Arheologic Şi Geografic Al României - Lecca (1937)

  Izabela Gontaru

  No ratings yet
• Cartea Sobarului - Tondach

  

  Document54 pages

  Cartea Sobarului - Tondach

  VDL09

  No ratings yet
• Calatori Straini Despre Tarile Romane Vol 1

  

  Document662 pages

  Calatori Straini Despre Tarile Romane Vol 1

  enacherenato

  93% (29)