| METODOS DE MICROBIOLOGIA GENERAL
4, Si ha podido observar microorganismos
méviles, explique qué tipo de esteucturas
cree que generan ese movimiento.
O TINCIONES
Ti
jones negativas:
jon de cépsulas
Los colorantes que se emplean en tinciones
negativas se caracterizan porque no son capa-
ces de fijarse ni penetrar en las células. Como
cconsecuencia, as bacterias se ven wen negativon,
cs decir, sin tefiir, contrastando con el fondo
que si aparece coloreado.
‘Aleunas especies bacterianas estin rodeadas
de una capa gencralmente gruesa denominada
cépsula. Las cépsulas suelen estar constituidas
por exopolimeros casi siempre de naturaleza
polisacérida que la propia bacteria excreta a tra-
@ OBJETIVOS
1. Entender el fundamento de las tinciones
ncgativas
2. Observar la morfologia de las cépsulas
MATERIAL NECESARIO
— Caltivos liquidos de Leuconostoc mesente-
rides en
4) Medio con glucosa como tinica fuente
de carbon
4) Medio con sacarosa como tinica fuente
de carbono
— Colorante: tinta china
— Portaobjetos y cubreobjetos muy limpios
— Microscopio y aceite de inmersién
— Papel de filtro
2
—"
vés de su pared celular. Las condiciones nutri-
ionales y fisioldgicas pueden reprimir 0 acti-
var la sintesis de la cdpsula, estructura que m0 €S
estrictamente necesaria para la supervivencia de
la bacteria fuera de su habitat natural. Por ello,
para estudiar organismos productores de cfpst-
las en el laboratorio se deben cultivar las bacte-
rias en medios adecuados y en condiciones que
favorezcan la produccidn de estas estructuras.
Se ha desctito que las cpsulas son responsa-
bles de la resistencia de las bacterias productoras
ala fagocitosis, a los bacteridfagos, al comple-
mento sanguinco y a otros mecanismos bacteri-
cidas. Asimismo, las cépsulas parecen propor
cionar a la bacteria capacidad de adhesién a
algunas superficies y confieren resistencia ala
desecacién gracias a que pueden retener agua en
su interior
Hl FUNDAMENTO
Las cépsulas, por sus caracteristicas quimi
«as, no se tifien por lo general con colorantes bé-
sicos como el cristal violeta o la saftanina, Sin
embargo, se pueden observar indirectamente
‘mediante tincién negativa con tinta china. Este
colorante est compuesto por particulas finas,
de carbono suspendidas en agua formando un
auténtico coloide. Las particulas son demasiado
grandes para penetrar a través de la mattiz de la
cApsula, por lo que s6lo se tefiiré el medio cir-
cundante y las células apareceran sin tefir sobre
un fondo de color negro. Para distinguir bien la
cpsula del resto de la edlula se debe aumentar el
contraste cerrando el diafragma del condensa~
dor. En estas condiciones, la cdpsula aparecerd
como un halo transparente alrededor de la clu-
la, que se verd de color grisicco.
En esta prictica se emplear Leuconostoc me-
senteroides, microorganismo que produce wn
cépsula que contiene dextranos extracelulares-
L. mesenteroides sintetiza estos polisaciridos &™
pleando como materia prima el disaciride #°
a MASSON, SA. Ftooonar sn aurea es un dts.
carosa, ya que es incapaz de hacerlo a partir de
otros azticares, como glucosa.
@ REALIZACION (fig. 3-4)
1. Seleccionar portaabjetos que estén perfecta-
‘mente limpios.
2. Tomar una gota de cada medio de cultivo
(L. mesenteroides ncubado en un medio con
glucosa o incubado con sacarosa como tini-
«a fuente de carbone) y depositarla en un
portaobjetos cerca de uno de los extremos
del mismo.
3. Afadir una gota de tinta china que no supere
el tamafo de la gota de muestra y mezclar.
‘Nota: a suspensin mezcla de ambas gotas
debe extenderse por una amplia superficie
del portaobjetos. Para ello, toque la suspen-
si6n inal con el extremo de otro portaobjetos
y arrastre ese portaobjetos sobre el primero
hacia el extremo libre de muestra. Detenga
la extensién cuando le queden unos 2.em de
vidrio sin muestra. De esta manera, habra
creado una extensi6n gradualmente més fina
‘conforme sc aleja del punto de partida
4, Colocar un cubrcobjetos en la zona central
de cada portaobjetos. Para evitar la forma-
cién de burbujas, deposite el cubreobjetos
primero sobre una arsta y luego, lentamen-
te, deje reposar el resto.
5. Dejar secar a temperatura ambiente (no
aplicar calor en ningtin caso). Si se desea
acelera el secado, se puede colocar la prepa-
racién entre dos papeles de filtro con cui-
dado de no frotar y procurando hacer la mi-
hima presién sobre el cubreobjetos.
Tirar el papel de filtro en un contenedor
adccuado (para material contaminado).
Examinar al microscopio (v. «Microsco-
pio éptico»), Trabajar con el diafragma del
condensador casi cerrado para aumentar
dl contraste. Anotar las diferencias entre los
dos tipos bacterianos.
5. OBSERVACION DE MICROORGANISMOS
——
1. Coleeala musa
2. Tinta china
af
8. Mezclery extender
e&
4. Colocare potaobjtos
'5. Absorber el excoso con papel de fro
Ficuea 3-4 Tincidn negativa de cépsulas.
23 | meroo0s DE MICROBIOLOGIA GENERAL
lm PREGUNTAS
1. Qué diferencias puede observar entre las oé-
lulas procedentes de los dos medios de cultivo?
2. ¢Qué hipétesis podria formular para expli-
car el hecho de que L. mesenteroides pueda
sintetizar cépsula en presencia de sacarosa
pero no en medios con glucosa? Disefte un
experimento para probar esa hipétess.
3. Por qué el aspecto de las colonias de L. me-
senteroides cultivadas en medio con sacarosa
y medio con glucosa es diferente?
Preparacién de un frotis bacteriano.
Tincién simple
La mayorfa de las bacterias son transparen-
tes, por lo que sucle ser necesario recurtir al uso
de tinciones si se desea observar a estos seres vi-
‘vos con tun microscopio éptico convencional de
campo claro. Las tinciones aumentan artificial-
mente el contraste entre las células bacterianas y
el medio circundante. La tincién que hace uso
de un solo colorante se denomina tincién
ple. Las tinciones més usadas en bacteriologia
requieren previamente que la muestra en estu-
dio se someta al proceso de fijacién. Habitual-
mente, las muestras bacterianas se preparan
™ OBJETIVOS
1. Preparar frotis bacterianos y realizar tin-
ciones simples empleando dos tipos de co-
lorantes
2. Observar la morfologla bacteriana y
aprender a distinguir los distintos tipos de
agrupaciones
3. Practicar la observacién con el microsco-
pio al maximo aumento y familiarizarse
con cl correcto empleo del aceite de in-
mersién
para ser observadas en forma de frotis 0 exten-
sidn sobre portaobjetos, lo que asegura una ade-
cada separacién entre las células y facilira que
la tincidn posterior se distribuya de manera ho-
mogénea. Para hacer un frotis o cextensién, la
suspensién bacteriana se homogeneiza bien, ©
extiende sobre un portaobjetos y se fj.
'@ FUNDAMENTO
La fijacién tiene como finalidad inmovilizar
las células bacterianas sobre el portaobjetos para
que no sedin arrastradas en los procesos poste-
riores de tefiido y de lavado. Aunque es inevi-
table que la fijacién y posterior tincién cause la
muerte de los microorganismos y altere algu-
nas de sus caracte!
adecuado puede minimizar estas alteraciones.
La preparacién del frotis bacteriano se rea-
liza de modo distinto dependiendo de si se pat-
te de un cultivo bacteriano liquido o sélido. En
ambos casos, una vez. preparada la extensién la
muestra se puede fijar aplicando calor sobre el
portaobjetos. Es muy importante no excederse
cen esta etapa para que las bacterias no se defor-
‘men o se lisen, Adems, la fijacién de bacterias
procedentes de medio liquido también puede
hacerse empleando un procedimiento alternati-
s, un procesamiento
| MATERIAL NECESARIO
— Mechero Bunsen
= Asade siembra
— Portaobjetos
— Cultivos bacterianos de Escherichia coli y
Staphylococcus spp.
— Colorantes para tincién:
a) Solucién de cristal violeta al 1%
4) Solucién de safranina al 0,5%
— Microscopio y aceite de inmersion, @MASSON. SA Fetecoir sh atrzactn es n dee
vo como la fijacién con metanol, que en este
‘caso da mejores resultados que la fijacién con
calor, aunque sea més lento.
1 REALIZACION
Preparacién de trotis bacterianos (fig. 3-5):
Nota: si el material de partida es liquido
(cultivo en medio liquide), pase directamente
al punto 2b. Si es un cultivo en medio sélido
(colonias) proceda desde el punto 1. Prepare
dos muestras con objeto de comparar la tincién
con safranina de la tincién con cristal violeta.
1, Coloque sobre un portaobjetos limpio una
pequefia gota de agua. La cantidad de agua
no debe superar la que se pucde reunir to-
mando dos veces con el asa de siembra.
4) Transfiera una pequesia cantidad del cul-
tivo (la equivalente a una pequefia porcién
de una colonia) a la gota. Empleando el asa
de siembra previamente flameada (¥. cap. 2),
disperse los grumos y luego remueva la gota
mediante movimientos citculares hasta for-
‘mar una suspensién homogénea. Extienda la
preparacién para faciitar su secado.
2. B) Si parte de un cultivo bacteriano en me-
dio liquido, coloque una gota pequeia de
Ja suspensién bacteriana (p. ¢j., tomando
muestra varias veces con el asa de siembra)
sobre el portaobjetos. Extienda la prepara-
‘in para facilitar su secado.
3. Fijacién de ls bacterias al vidrio portaobjetos:
4) Por calor, Caliente el portaobjetos ala llama
on ripidos pases sobre el mechero Bunsen.
No utilice pinzas: recuerde que el calor en
cxceso dafiarfa la integridad-estructura de
fas edlulas,
4) Con metanol (especialmente apropiado
para bacterias procedentes de medio liqui-
do). Afiadir unas gotas de metanol sobre la
extensiGn previamente desecada al aire, Re-
3. OBSERVACION DE MICROORGANISMOS
g
01.208 V,
ins
‘Eten
2.1.Fcdn por eslor 2.2. Fipcén con metanol
en yao!
Bs i f Ed J
Ficura 3-5 Preparacion de un frotis bacteriano.
tirar de inmediato el exceso de metanol del
portaobjetos, golpedndolo ligeramente por
su canto sobre un papel de filtro. Esperar a
que el metanol se evapore completamente
Tincién simple (fig. 3-6):
4. Cubrir un frotis con cristal violet y el otto
con safranina de manera que no quede nin-
{guna porcién sin cei, Permita actuar a los
colorantes durante al menos | minuto.
5. Lavar las preparaciones con agua para elimi-
nar el exceso de colorante. Para elo, incline
el portaobjevos y aplique el agua corriente
de grifo en su parte superior de manera que
resale poco a poco sobre el frotis. No diri-
ja cl agua directamente sobre el frotis pues
podria despegar parte de la preparacién.
6. Secarel portaobjetos por simple presién en-
tre dos papeles de filtro © mediante calor
(\. punto 3a anterior). En ningtin caso fro-
tee portaobjetos con papel u otto tejdo.
7. Observar la preparacién al microscopio con
el objetivo de inmersién. Seleccionar un
25 |
[METODOS DE MICROBIOLOGIA GENERAL
Tenir
Ficura 3-6 Tincién simple.
ee oe
rene. ae eo ph
- 88 88 ‘Tetrada.
o°© .. 3 88
oa
Forma de «coma» om 29 Estreptococos
N= °*
?
Espo
ey
— ~h g =
Ficuna 3-7 Morfologia bacteriona ytipos de agrupaciones,
1 26 TO MASSON. SA. Fotos sh avtorzacn es un do
'5. OBSERVACION DE MICROORCANISMOS
Graal volta
vim)
a
z
Lagol ma)
r
Lavar con aa
cS
So
==>
co
| sotventes oginicos
+
{evar con agua
‘Satranina (Yin
cura 3-10 Tincion de Gram.
buen campo de observacién y dibujarlo
ilustrando la morfologla y agrupacin de ls
bacterias (v fig. 3-7, y figs. 3-8 y 3-9 en Ii
minas en color).
1 PREGUNTAS
1. ;Qué tipos de morfologia y de agrupacién
ha podido observar en las muestras de los
cultvos de E; coli y Staphylococcus?
2, Indique que etapas debe seguir para prepa-
5
rar una extensin de las siguientes muestras:
yyogur, saliva, una colonia bacteriana resus-
pendida en agua, sedimento de un rio.
Qué finalidad iene fijar las muestras cuan-
dose realiza un frots bacteriano?
Sefiale las ventajas y desventajas de la tin-
ign simple respecto del examen en fresco.
Con los resultados de una tincién simple,
ise puede saber sila muestra tefida es un
ccultivo puro?
Py ‘METODOS DE MICROBIOLOGIA GENERAL
y Acido-alcohol resistente
TINCION DE GRAM
Las tinciones diferenciales se denominan ast
porque son capaces de diferenciar estructuras 0
incluso microorganismos que poseen caracteris-
ticas superficiales distintas. Este tipo de tinciones
requicren el empleo de més de un colorante. La
tincién diferencial mas empleada en los labora-
torios de bacteriologia es la tincién de Gram
™ OBJETIVOS
1. Ser capaz de diferenciar entre bacterias
grampositivas y gramnegativas
2. Comprobar las limitaciones que existen.
en la tincién cuando se utilizan cultivos
bacterianos en fase estacionaria
3. Familiarizarse con el uso del microscopio
lm MATERIAL NECESARIO
— Portaobjetos con frotis bacterianos previa-
‘mente preparados a partir de cultivos det
a) Staphylococcus aureus (cultivo exponen-
ial y cultivo estacionario)
4) Bacillus sphaericus
) Escherichia coli
d) Neiseriasicca
= Colorantes:
@) Solucién de cristal violeta al 19%
6) Solucién de safranina al 0,5%
@) Solucién diluida de yodo (Lugol) (1%
1, +2% IK)
4) Branol-acetona (1:1)
— Microscopio y aceite de inmersién
— Papel de filtro
28
Esta tincién se llama asf en honor de Christian
Gram, patdlogo danés que la describié por p
‘mera vez en 1884. A pesar del tiempo transcur
do, a tincién se sigue empleando sin apenas mo-
dificaciones y casi siempre constituye la primera
cexapa de cualquier proceso de identificacién bac-
tetiana. La aplicacién de esta tincidn permite cla-
sificar las bacterias en dos grandes grupos: las
bacterias grampositivas y las bacterias gramne-
gativas. Estos dos grupos poseen caracteristicas
‘esiructurales superfciales notablemente distintas
(fig. 3-10).
lm FUNDAMENTO
La tincién de Gram requiere la utilizacién
de cuatro soluciones en el siguiente orden:
1. Primer colorante. Es de naturaleza bisica y
tiene, por tanto, afinidad por estructuras
cargadlas negativamente, como es el caso de
la pared celular de la mayorfa de las bacte-
rias. El colorante penetra en la pared celu-
lar y la tific. El compuesto de este tipo mis
utilizado ¢s el cristal violeta. Como conse-
‘cuencia de este tratamiento tanto las bacte-
rias grampositivas como las gramnegativas
aparecerin tefiidas de violeta
2, Solucién mordiente. Se combina con el
primer colorante y forma un complejo que
¢5 insoluble en el caso de los grampositi-
vos. Los mordientes empleados suelen ser
sales metdlicas, 4cidos 0 bases como, por
ejemplo, una solucién diluida de yodo.
Este tratamiento no altera la coloracién
que la muestra adquirié en el primer trata-
miento.
3. Agente decolorante. Es un disolvente or
giinico 0 una mezcla de disolventes como,
por ejemplo, etanol-acetona (1:1). Mien-
tras que este tratamiento decolora a las bac-
terias gramnegativas, no tiene capacidad
para disolver el complejo formado en la pa- red celular de las bacterias grampositivas,
que, por tanto, no pierden la coloracién en
este paso.
4, Colorante de contraste. Es un colorante
bisico de distinto color que el primer colo-
ramte. El colorante de contraste més utiliza-
does la safranina, que tife de color rojo.
Este tratamiento tefird sélo a las bacterias
que han perdido previamente el primer co-
lorante, es decir, a las gramnegativas.
Como resultado de la tincién de Gram, las
bacterias grampositivas quedarin refidas de
violeta, mientras que las gramnegativas aparece-
rin de color rojo. Este comportamiento dife-
rente frente a la tincién de Gram obedece a la
distinta composicién de la pared celular de es-
tos dos grupos bacterianos. Asi, mientras las
bacterias grampositivas poseen una gruesa ma-
lla de peptidoglicano en su parte mas externa,
has bacterias gramnegativas poseen sélo una fina
capa de peptidoglicano, que est ademés en-
vuelta por una membrana, la membrana exter-
na (v, fig. 3-10). Sin embargo, a veces las bac-
tetas grampositivas en fase estacionaria pueden
aparecer como gramnegativas debido a procesos
de degradacién y autdlisis de su capa de pepti-
doglicano. Por tanto, para evitar resultados con-
fasos es siempre aconsejable trabajar con culti-
0s en fase exponencial
| REALIZACION (fig. 3-10)
Nota: se usarin cultivos en fase exponencial
de bacterias grampositivas y gramnegativas que
dificran en su morfologia y en su tipo de agru-
Pacién, Ademés, se incluird un cultivo en fase
‘stacionaria de una bacteria grampositiva para
comprobar que estas bacteria tienden a perder
Sus caracteristicas tintoriales con el tiempo de
recimiento,
'3, OBSERVACION DE MICROORGANISMOS
1. Preparar frotis bacterianos (v. «Preparacién
de un frotis bacteriano. Tincién simple»),
recordando que en las extensiones dema-
siado densas de células, los colorantes no
llegan a tefir la muestra homogéneamente.
Prepare una extensién con cada uno de los
siguientes microorganismos:
4) Staphylococcus aureus (cultivo en fase expo-
nencial y cultvo en fase estacionaria)
2) Bacillus sphacricu.
©) Excherichia coli
d) Neisseria sicca.
@) Una meacla de Staphylococcus aureus y
E coli.
2. Tefir con cristal violera (1 min).
3. Lavar con abundante agua el exceso de co-
lorante.
Nota: en este paso y en el resto de pasos de
lavado o decoloracién es esencial no arras-
trar parte de la preparaci6n en el proceso.
Para evitar que ocurra esto, incline el por-
taobjetos y aplique el agua o disolvente en
su parte superior de manera que el liquido
resbale lentamente sobre el frots
4, Cubrir con Lugol (1 min).
Lavar con agua el exceso de Lugol.
6. Lavar la preparacién con eranol-acetona
hasta que observe que no puede arrastrar
ss colorance de la muestra (unos 10-20 s).
7. Lavar con agua para eliminar los restos de
disolvente.
8, ‘Tefiir con safranina (1 min).
9. Lavar con agua para climinar el colorante
de contraste.
10. Secar la preparacién entre dos papeles de
filtro con cuidado de no frotat, o bien, sé-
quelo al calor de la llama.
11. Examinar al microscopio con el objetivo
de inmersién (v, «Microscopio éptico»).
Dibujar la morfologia y anotar el color que
toman los distintos tipos bacterianos en es-
tudio (v. figs: 3-8, 3-9 y 3-11 en liminas en
color).
29 METODOS DE MICROBIOLOGIA GENERAL
lm PREGUNTAS
1, Sicambiara el orden de empleo de los colo
rantes primario y de contraste, gcree que la
tincién seguiria permitiendo distinguir en-
tre bacterias grampositivas y gramnegativas?
2. Cémo afectarfa a las coloraciones finales si
no se efectuara correctamente el lavado con
los solventes orginicos.
3. cExiste alguna rclacidn entre el tipo de mor-
fologia y la tincién de Gram?
4, ¢Ha observado al microscopio alguna
rencia estructural entre bacterias gramposi
tivas y gramnegativas?
TINCION ACIDO-ALCOHOL RESISTENTE
La mayorfa de las células procariotas del do-
minio Bacteria se pueden clasificar en funcién
del resultado de la tincién de Gram como
grampositivas 0 gramnegativas. Sin embargo,
pata tefiir algunas bacterias del grupo de los ac-
‘omicctos, como por ejemplo las pertenecien-
tes.al género Mycobacterium, se nccesitan proce-
dimicntos més invasivos. El microbiélogo
alemin Robert Koch ided una técnica capaz de
tefiira la bacteria Mycobacterium tuberculosis
cen tejidos obtenidos a partir de pacientes con
tuberculosis. Gracias a esta tincién, Koch fue
capaz de identificar al agente causal de la cu-
berculosis. Esta técnica se basa en el hecho de
que, una vez tefidas con colorantes especiales
yaalta temperatura, las cdlulas de M, tuberen-
Isis resisten el efecto decolorante de una mezcla
de écido y alcohol. Por ello, este tipo de tin-
cidn se llama dcido-alcohol resistente y a los
microorganismos que comparten estas propic~
dades tintoriales con M. tuberculosis se les cono-
ce como icido-aleohol resistentes. En la actuali-
dad la técnica més utilizada para tefiir bacterias
de este tipo es una modificacién de la original,
gue recibe el nombre de los microbidlogos que
Ja deseribieron: tincién de Ziehl-Neelsen.,
es
lm FUNDAMENTO
La dcido-alcohol resistencia se correlaciona
con el alto contenido en lipidos de la pared ce-
lular y con la presencia de un tipo especifico de
dicidos grasos llamados dcidos micélicos. Esta
uliar composicién confiere ala célula una alta
hidrofobicidad. Para poner de manifiesto la dci-
do-alcohol resistencia, la tincién de Ziehl-Neel-
sen requiere el empleo sucesivo de tres soluciones:
1. Mezcla de fucsina-fenol (carbofuesina), que
cuando se aplica en caliente es capaz de te-
fir todo tipo de células bacterianas, inclui-
= OBJETIVOS
1. Estudiar la morfologia y las propicdades
tintoriales de las bacterias écido-alcohol
resistentes,
2. Comprobar la capacidad para diferes
este tipo de bacterias en una poblacién
mixta con otras bacterias
lm MATERIAL NECESARIO
— Portaobjetos con frotis de las bacterias:
a) Mycobacterium smegmatis
4) Escherichia coli
— Soluciones:
4) Carbofucsina
4) Acido clorhidrico (0,36 N) en etanol
¢) Auul de metileno (0,3 %)
— Pinzas de madera
— Mechero Bunsen
— Microscopio y aceite de inmersién
— Papel de filtro
‘M. smegmatis, a diferencia dle M, tuberculosis
‘una especie no patégena del género Mycobacterium. MASSON, SA. Fetooper sh areas eur oto
'3. OBSERVACION DE MICROORGANISMS
Bacio
‘Acido alcohol resistente
Carbotucena
(en caliente, 5 min)
Leneatente Sn]
[aver con agua
Lineman
Teaver con
edo-acoho!
|
‘var con agua
ao
‘Raul de metieno
| (min
Aeido-sloholresistnte
Tinclén con earbotuesna
Flours 3-12 Tincién dcido-alcoholresistente (ZiehNeetsen).
das las de Mycobacterium. Bl fenol facilta la
penetracién de la fucsina en la pared celular.
2. Agente decolorante: es una solucién de dci-
do clorhidrico (0,36 N) en ctanol con un ee-
vado poder de decoloracién que, no obstante,
¢s insuficiente para arrastrar la fucsina aso-
ciada a la pared celular de Mycobacterium.
3. Colorante de contraste: azul de metileno,
‘que cumple el mismo papel que la safrani-
nan la tincién de Gram.
‘Tras el tratamiento con fucsina y fenol todas
las bacterias se tifien de rosa-rojo. Sin embar-
{g0, mientras las bacterias écido-alcohol resisten-
tes no cambian de color cuando se tratan con
elagente decolorante, el resto de bacterias se
decoloran y podrin tomar posteriormente el
colorante de contraste. En conseeuencia, las
células de Mycobacterium quedarin tefiidas de
rosa-rojo y las bacterias 4cido-alcohol sensibles
aparecersn de color azul.
l@_REALIZACION (fig. 3-12)
(Segtin el método modificado de Ziehl-
‘Neelsen.)
1, Preparar un frots (y. «sPreparacién de un
frotis bactriano. Tincién simple») con una
mezela de:
44) Mycobacterium smegmatis (especie no pats-
gena del género Mycobacterium).
B) Ecol.
2. Cubrir completamente la preparacién con
carbofucsina.
3. Tomar el portaobjetos con la pinza y, me-
diante pases cortos sobre el mechero Bun-
sen, calentar la preparacién durante 5 mi-
‘nutos sin permitir que hierva la muestra.
Nota: afiadit més carbofucsina conforme
esta se evapora; la preparacién no debe
_quedarse seca en ningsin momento.
31 METODOS DE MICROBIOLOGIA GENERAL
4, Lavar con abundante agua el exceso de co-
lorante.
5. Decolorar con la solucién écido-aleoho!
hhasta que la muestra adquiera un color rosa
claro (unos 30 5).
6. Lavar con agua para eliminar los restos de
disolvente.
7. Tefir con azul de metileno (1 min).
8. Lavar con agua el exceso de colorante.
9. Secar la preparacién entre dos papeles de
filero con cuidado de no frotar
10, Examinar al microscopio (¥. «Microscopio
Sptico»). Anorar las diferencias morfol6gi-
cas y de coloracién que observe entre los
dos tipos de células bacterianas presentes
en la preparacién (v. fig. 3-13 en Kiminas
en color).
lm PREGUNTAS
1. Cua cree que seria el resultado de la tin-
Gién de Ziehl-Neelsen si no se aplicara ca-
ora la muestra?
2. Los microorganismos
tentes, ;son grampositivos o gramnegati-
vos?, zcémo aparece tefido Mycobacterium
smegmatis en una tincibn de Gram?
-alcohol resis-
Tinciones especifica
tincién de endosporas
Las tinciones especificas se llaman as por su
capacidad para poner de manifesto estructuras
especificas de los microorganismos como, por
cjemplo, el flagelo, el nucleoide, los grénulos de
reserva o las endosporas, entre otros. Como
cjemplo de tincién especifica en este apartado
se explicaré una de las tinciones més usadas
para tefiir endosporas bacterianas.
Cuando las condiciones ambiemtales son des-
favorables algunos géneros bacterianos, entre los
que destacan Clostridium y Bacillus, son capaces
| 32
@ OBJETIVOS
| Observar las formas y tamafios de las en
dosporas en varias especies bacterianas
formadoras de endosporas
2, Comparar la distinta disposicién de las
endosporas dentro de la célula vegetati-
Yan las diferentes especies empleadas.
Utilizar este criterio de identificacién
mm MATERIAL NECESARIO
Portaobjetos con frotis bacterianos pre~
viamente preparados a partir de cultivos
de:
a) Bacillus subtilis
b) Baill sphaericus
o) Bacillus thuringiensis
— Colorantes:
4) Solucién de verde malaquita (5%)
4) Solucién de safranina (0,5 %)
— Pinzas de madera
— Mechero Bunsen
— Microscopio y aceite de inmersién
— Papel especial para dptica
— Papel de filtro
de producir en su interior formas de resistencia
denominadas endosporas. Cada célula vegetati-
‘va forma en su interior una tinica endospora. Al
finalizar el proceso de esporogénesis, la célula
vvegetativa se lisa y libera la endospora al exterior.
Las endosporas son extremadamente resistentes @
numerosos factores fisicos (altas temperaturas,
radiaciones) y quimicos (sequedad, valores extre~
mos de pH, mutdgenos quimicos), y ademas
pueden permanecer viables durante largos perio-
dos de tiempo. Cuando las condiciones ambien-
tales vuelven a ser favorables, la endospora ger mina generando una vinica célula vegetativa,
‘Aunque las bacterias productoras de endosporas
son mayoritariamente de vida libre, algunas es-
pecies son patdgenas para cl hombre y para los
animales, y pueden provocar enfermedades mor-
tales como el tétanos el carbunco.o el botulism.
l@ FUNDAMENTO
Las endosporas poscen una pared celular es-
pecialmente consistence rodeada de una serie de
capas exteriores con una estructura muy orga-
nizada. Esta sucesién ordenada de capas muy
hidrofdbicas hace que las esporas brillen de ma-
nera intensa cuando se observan con el micros-
copio dptico. Este fenémeno dptico se denomi-
nado birrefringencia. La posesién de esta
envoltura tan especial explica sdlo en parte la
clevada resistencia de las endosporas a Factores
medioambientales. Otros factores implicados
enesta resistencia son la presencia de ciertos
compuestos quimicos exclusivos entre los seres
vivos y el elevado grado de deshidratacién que
prescnta cl citoplasma de la endospora. Todas
¢stas propiedades hacen de la endospora bacte-
riana una estructura de dificil tincién.
Latincién especifca de endosporas equiere
cl empleo sucesivo de dos colorantes:
1. Verde malaquita: capaz de tehir las endos-
poras cuando se aplica en caliente.
2. Safranina: colorante de contraste que tine
Jas formas vegeratvas.
“Tras el tratamiento con verde malaquita en
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