Contlerentiar universitar dr. Virgil DARLE BIOCHIMIE MEDICALA vol. | ORGANIZAREA MOLECULARA §] MACROMOL ECULARA A ORGANISMULUT TIMAN LDITURA > AMON « CRALOVA - 1994Motto. Cel care munceste, gresegte. Ca s& nu gregesti, trebuie si nu muncesti... Dar asta-i cea mai mare gregeala! Albert Szent-Gyorgyi PREFATA In arsenalul ytiingelor contemporane Biochimia s-a impus cao discipling de bazd, de insemndtate primordiala, cu implicagii profunde in sfera yuirgelor biologice tcoretice st aplicate. Dezvoltarea dinamicé, rapidé si multilaterala a biochimiei in ultimele patru decenii, repreeinta una din cele mai remarcabile cuceriri ale stiintelor contemporane. te semnificativ fuptul ca cele mai multe din Premiile Nobel pentru medicind au fost decernate cerceidtorilor din domeniul Biochimiet. Lucrarca de fata se adreseazd, in primul rand, studengilor de la facultdqile cu profil medical, biologic, chimic, cét si medicilor specialisti in laboratorul clinic. In acest prim volum, informatia biochimica se refera la" organizarea molecular $i macromoleculard a organismului wan, find in acelasi timp un indreptar pentru inelegerea fenomencior biologice normale si patologice. Redactarca prezentei lucréri s-a facut findind seama de nomenclatura actualé utilizata in biochimia moderna. In speranta cé manualul de fad va fi un material documentar util pentru cei interesati, asteptdm sugestiile si eventualele observatii constructive, care vor constitui pentru autor puncte de referinté in elaborarea editiilor viitoare. AutorulPREFACE In the “arsenal” of the contemporary sciences, Biochemistry has compelled recognition as a fundamental science of primordial importance, having deep implications in the sphere of theoretic and applied biological sciences. The dynamic, rapid and multilateral development of Biochemistry in the last four decades represents one of the most remarkable conquests of the contemporary sciences. It is very significant the fact that the most Nobel Prizes in Medicine were awarded to the researchers in the line of Biochemistry. This work is applied to both medical, biological and chemical students and specialists in clinical laboratory. in the first. volume, biochemical information refers to "the molecular and macromolecular organization of the human body", being in the same time a guidebook for the correct understanding of the biological phenomena in normal state and Pathology. In order to elaborate this work I tock into account the topical nomenclature used in the modern Biochemistry. T hope that the present piece of work will be an useful documentary material. I'm looking forward to all the constructive suggestions. The AuthorAla Arg Asn Asp Asp-NH, ADN ARN mARN tTARN cpP cTP CoA—SH 3 DP FAD,PADH, 6 GABA Gal GalNAc Glu Glu-NH, GMP GbP GIP Hb HbO, HDCO His Lr Abrevieri utilizate in text = adenina = alanina. arginina. asparagina. acid aspartic. = asparagin. = acid deoxiribonucleic. acid ribonucleic. = acid ribonucleic mesager. = acid ribonucleic ribozomal. = acid ribonucleic de transfer. = acid adenozin monofosfat. acid adenozin difosfat = acid adenozin trifosfat. = citozina. cisteina. citidin monofosfat. citidin difosfat. citidin trifosfat. coenzima A = acid 2,3 difostogliceric. = enzima. = complex enzima substrat. = Enzime Comission. = acid etilen diamino tetraacetic. = flavin-adenin dinucleoid oxidat si redus. = guanina. = acid y = galacto: = N.acetil galactozamina. = acid glutamic. = glutamina. = guanozin monofosfat. = guanozin difosfat = guanozin trifostat = hemoglobina. = oxihemoglobina. = carboxihemoglobina. = histidina. = leucotriene minobutiric. hormon adrenocorticotrop. Lx |ipoxine. v pseudoracil NAD*,NADH = nicotinamid adenindinucleotid -oxidat $i redus. NADP’ ,NADPH= nicotinamid adenindinucleotid -oxidat gi redus. NANA = acid N-acetil neuraminic. Pi = fosfat anorganic. PPi pirofosfat anorganic PTA proteina transportoare de grupari acil SAM = S-adenozil metionina. ic = timina. TSH = hormon tireotrop TPP: tiamin pirofosfat tromboxan. uracil. uridin monofosfat. uridin difosfat. = uridin trifosfat. Unitati internationale. acid tetrahidrofolic. 1,25-dihidroxi cuie- calciterol = acid paraaminobenzoic.iy NeRWNHN in 8 CUPRINS PROTEINE (PROTIDE) . . : : Consideratii generale . . . . . . Caracterizare generalad a proteinelor Clasificarea proteinelor Rolurile biologice ale proteinelor Aminoacizi. . : + ‘ . . . Caracteristici generale, clasificare Aminoacizi care nu participa in structura proteinelor Proprietatile fizice, chimice si biologice ale aminoacizilor Aminoacizi esentiali Proprietatile ionice ale aminoacizilor Proprietatile chimice ale aminoacizilor Peptide « . . . . . Caracterizare generala Dipeptide ‘Tripeptide Polipeptide cu activitate biologic’ Structura proteinelor . ‘ * re 7 5 Structura primara Structura secundara Modelul @ helix Tipuri de legéturi din structura proteinelor Modelul in * planuri pliate " Modelul tip colagen Structura terfiara Structura cuaternara Morfologia moleculelor proteice Proprictitile generale ale proteinclor . ¢ . Proprietaji electrochimice. Blectrotoreza Denaturarea proteinelor Proprietati imunologice HETEROPROTEIDE . . . . . Metalproteide . . . . . s « Fosfoproteide : c 3 7 2 Glicoproteide. Proteoglicani . ¥ < Lipoproteide . . . . é . Cromoproteide . ss * = . 7 . 13 13 13 13 14, 17 17 23 24 25, 27 30 30 31 32 34NaAWRwDE 2.1 Hemoglobinele Structura hemoglobinei Hemoglobine fiziologice Hemoglobine anormale si patologice Combinarea hemoglobinei cu gazele Interactiunea 2,3-DPG cu hemoglobina Mioglobina Citocromii Nucleoproteide . > < . . Caracterizare general Componenti structurali Componenta proteica Pentoze Baze azotate Nucleozide Nucleotide Nucleotide naturale libere Nucleotide polifosfati cu rol de compusi macroergici Caracterizare generala a nucleotidelor Polinucleotide. Structura primara a ADN “10 Structura secundara a ADN 1 Functiile biologice ale ADN 2 Proprietiti generale ale ADN 3 Acizii ribonucleici 4 Acizii nucleici virali ENZIME. . : . . . . Consideratii generale. « . * . Generalitati. [storie Caracteristici generale ale enzimclor Nomenclatura si clasificarea enzimelor Localizarea intracclulara a enzimelor Structura enzimelor =... . . 7 Enzime monocomponente gi bicomponente Situs catalilic. Situs alloateric Cofactori enzimatici Mecanismul de actiune al enzimelor Tpoteza tip "lacdt-cheie" Teoria ajustarii induse Cataliza covalenta Cataliza acido bazica generala Izoenzime Specificitatea enzimelor —. . . + Specificitatea de reactie 101 101 101 103 105 106 106 107 109 112 112 113 113 115 116 8 118= bu NQUNRNEL bo bo bo BRR ARSE 4.3.8 4.3.9 4.3.10 Specificitatea de substrat 119 Specificitatea optica 119 Specificitatea relativa de grup 120 Specificitatea absoluta 121 Influen{a factorilor fizico chimici asupra activitatii enzimelor Influenja temperaturii 122 Influenja pH-ului 123 Alfi factori care influenjeaza activitalea enzimalica 124 Cinetica enzimatica . ‘ e Z . ¥ 125 Energia de activare 125 Ordinul de reactie 126 Curba de saturare cu substrat 128 Ecuatia Michaelis-Menten 129 Constantele cinetice ale enzimelor 132 Ecuajia Lineweaver-Burk 133 Efectori enzimatici 134 Activatori enzimatici 135 Inhibitia competitiva 135 Inhibijia necompetitiva 138 Inhibifia allosterica 140 Postulat tructurii enzimelor allosterice 141 Mccanismul de actiune al enzimelor allosterice 142 VITAMINE SI COENZIME = * * . 145 Consideratii generale . . . . . 145 Istoric. Generalitati 145 Clasificare. Corclajia vitamine-enzime 146 Vitamine liposolubile % fe ® ‘ 147 Vitamina A 148, Vitaminele D 152 Vitaminele E 155 Vitamincle K 158 Vitamine hidrosolubile . . . : ei 161 Vitamina C lol Vitamina P 164 Vitamina B, 105 Vitamina B, 167 Vitamina PP 169 Vitamina Bs 171 Acidul pantotenic 173 Biotina 175 Acidul lipoic 178 Acidul paraaminobenzoic 179 12.aR Ce win au pe be 5. 5 5. 5. RNY ‘ow poe Bene Acizii folici Vitamina B,. GLUCIDE . ‘ . : . Consideratii generale ‘ , i . ‘ Definitie. Nomenclatura Clasificarea glucidelor. Roluri biologice Structura monoglucidelor 5 z Caracterizarea monoglucidelor Structura gi izomeria monoglucidelor Structura perspectivic’ tip Haworth Seriile D si 1, ale monoglucidelor Proprietati fizice si chimice ale monoglucidelor . . Proprietati fizice si optice Proprietati chimice ale ozclor Reactii datorate gruparii carbonil Proprietati chimice datorate -OH Epimerizarea ozelor Principalii reprezentanti ai ozelor ‘ : . ‘Trioze gi tetroze Pentoze Hexoze Deoxiglucide. Aminoglucide Oligoglucide . + . . . = Poliglucide. Poliozide * “ . . ., Homoglicanii Glicoproteide. Proteoglicani is . = a Glicoproteidele Biosinteza’ glicoproteidelor Importanta biologic’ a glicoproteidelor Proteoglicani. Glicozaminoglicani Acidul hialuronic Heparina Condroitin sulfajii. Dermatan sulfatii LIPIDE . . . . - . = Definitie. Clasificare. Roluri biologice — . . . Componen{ii structurali ai lipidelor . ‘ 5 Acizii gragi Acizii gragi saturati 2G Acizii grasi nesaturati Lgl L429 Acizii grasi particulari 180 183 187 187 187 187 188 188 188 190 191 194 194, 195 195 197 200 201 201 201 203 203 205 207 208 212 226 227 227 22 228 2316.8 6.8.1 6.8.2 6.8.3 6.8.4 6.8.4.1 6.8.4.2 6.8.4.3 6.8.4.4 Bibliografie 12 Proprictati generale ale acizilor grasi Alcooli constituienti ai lipidelor Alcooli alifatici neazotati Aminoalcooli Alcooli ciclici Acil gliceroli (Gliceride) : Caracterizare generala. Structura. Transport Proprietati generale ale acilglicerolilor Ceride . . . . . Steride : . Generalitati. Clasificare. Reprezentan{i Colesterolul Surse de colesterol. Sinteza Structura colesterolului. Tzomerie. Rolurile biologice ale colesterolului Acizii biliari Acizii biliari primari si secundari ) Circuitul enterohepatic al acizilor biliari Proprietatile si rolurile biologice ale acizilor biliari Lipide complexe. (Heterolipide) —. . Glicerofosfolipide Glicerofosfolipide cu azot Gilicerofosfolipide fara azot Sfingolipidele Sfingolipide cu fosfor Gilicolipide Prostaglandine. Icosanoizi . « Generalitati. Clasificare. Structura Biosinteva icosanoizilor Roluri biologive ale icosanoizilor Mecanismul de actiune al PGe la nivelul celular Actiunile biologice ale icosanoizilor asupra organismului uman Biomembrane Tipuri de biomembranc Organizarea structuralé a biomembranelor Functiile biomembranelor Procese de transport prin biomembrane Difuziunea simpla Difuziunea mediata Transportul activ Translocarea de grup 237 241 242 yy1 PROTEINE (PROTIDE) 1.1 Consideratii generale 1.1.1 Caracterizare general a proteinclor Proteincle sunt biocomponente structurale si functionale de insemnatate primordiala pentru procesul viefii gi care prezinti cel mai tnalt grad de complexitate, varietate si specificitate de specie sau de organ. Denumirea de "proteina" deriva de la cuvantul grecese "xporcws" [proteos] = primul,care este in deplin acord cu rolul fundamental al acestor substante in lumea vie. Proteinele sunt cele mai rispindite biomolecule din celule, constituind 50% sau mai mult din masa lor uscata. Legatura indisolubila dintre proteine si viafa este marcaté de faptul producator de proteine este organismul viu. Proteinele se caracterizeaza prin urmatoarcle particularitaji definitorii: reprezinta purtatorii materiali ai viefii, constituienji universali yi indispensabili ai Wuturor formelor de viata: asigura organizarea $i menfinerea structurii morfologice a celulelor; @ sunt biomacromolecule informationale, caracter conferit de varictatea structurala a aminoacizilor constituienti, care reprezinta unitéi repetitive ale structurii acestor importante macromolecule; sunt biomacromolecule cu o paleti larga de mase moleculare cuprinse intre 5*10" - X*10° daltoni® constituite din 20 -22 de aminoacizi care se unese covalent intre ei prin reactii de policondensare; @ sunt intr-o strdnsd leg&dtura cu acizii aucleici, informatia geneti determina biosinteza proteinelor specifice organismului respectiv; @ prezinta proprietii{i fizico-chimice distincte, care sunt 0 consecin{a a organizarii structurale si respectiv a conformatiei spatiale a macromoleculelor; prezinta un inalt grad de organizare structurali caracterizat printr-o entropie scazuta st posedi un surplus de energie libera care le asigura atributele unui sistem dinamic in permanenta interactine cu mediul ambiant; @ manifesti un puternic dinamism caracterizat printr-o continua autoinnoire ca rezultat al proceselor anabolice si catabolice; au o specificitate remarcabild ca o reflectare a particularitaqilor structurale i conformationale care le confera functii biochimice variate; se prezinta intr-o extrem de larga diversitate de tipuri diferite structural si functional. singurul sistem stocata in ADN 1.1.2. Clasificarea proteinelor Pentru clasificarea proteinclor se folosese simultan mai multe criterii: a) produgii de hidroliza; b) solubilitate in apa; c) structura; d) comportare chimici. Holoproteinele, prin hidroliz alcalin’, acid& sau enzimatic numai e aminoacizi vor pune in libertate14 GREU SOLUBILF| [ PRotEME Fibrinogen | | FIBRILARE - j | Colagen | { | . INSOLUBILE | Elastine T Actina Miozina | Keratine - | Scleroproteine HONOERGUEINE Albumino | | | Gtobunine | Protamine Histone | | | CROMOPROTEIDE | y | FOSFOPROTEIDE araryay yi ara LIPOPROTEIDE 1 EPEROPRO OE | meracoprore we | | NUCLEOPROTE IDE | GLICOPROTEIDE ! PROTEOGLICANI | Solubilitatea proteinelor fibrilare se refera la apa si la solutii saline concentrate. Solubilitatea limitata in solutii saline a unor proteine fibrilare: fibrinogen, actina, miozind, se datoreste faptului ca aceste proteine contin in anumite portiuni ale moleculei lor structuri asemanatoare proteinelor globulare. Aceste proteine constituie 0 categorie de proteine intermediarg intre cele globulare gi cele fibrilare, avand caracteristici structurale lipice atat proteinelor globulare, cat si celor fibrilare. Heteroproteidele au o structura complexa si prin hidroliza rezulta pe langa aminoacizi si © Componenta neproteica denumita componenta prostetica. Componenta prosteticé poate fi de naturd chimica diferité (glucide, lipide, acizi nucleici, porfirine, metale). in cazul heteroproteidelor legarea gruparii prostetice de proteina propriu-zisa se face prin legituri chimice covalente si necovalente care le confera un caracter de stabilitate. 1.1.3 Rolurile biologice ale proteinclor Proteinele indeplinesc functii extrem de variate, ca 0 reflectare a unui inalt grad de15 organizare structurala. Rolurile biologice sunt diferite in functie de tipul proteinelor (vezi tabela 1.1). I. Proteine fibrilare intervin in procesul de coagulare al singelui: fibrinogen, trombina @ Participa in procesul contractiei musculare avand proprictatea de a transforma energia chimica in cnergie mecanica: actina, miozina, actomiozina. @ Actioneaza ca substante de sustinere, protectic si rezistenta mecanica: keratina, clastina, colagenul. IL. Proteine globulare @ Proteinele din hrana servesc ca sursi primara de aminoacizi din care se sintetizeaza protcinele proprii. @ Constitie suportul chimic, structural si functional al materiei vii si al tuturor fenomenelor specifice agesteia, incalitate de enzime proteincle indeplinesc un ral catalitic, inlesnind desfagurarea, coordonarea i reglarea tuturor reactiilor biochimic« @ Unele proteine functioncazi ca hormoni purliciptnd 1a reglarea procesclor biochimice: insulina, hormonii hipofizari. # Actioncazi ca pigmenti respivatorii transportind pe cale sanguind la toate {esuturile oxigenul molecular (hemoglobina) sau depozitind oxigenul in mugchi (mioglobina). Rol de transport in singe: siderofilina transporti ioni de Fe; ceruloplasmina transport ioni de Cu inclusi in structura sa. ® Participa in procesele imunochimice de aparare a organismelor de actiunca agentilor externi-anticorpi Participa la ultrastructura biomembranelor in asociere cu lipidele @ Datoritd caracterului coloidal si amfoter proteinele intervin in procesele de permeabilitate selectiva a biomembranelor, in transportul apei si ionilor, mentinerea echilibrului acido-bazic functionand ca sisteme tampon. Au rol energetic in cazuri extreme: subalimentalic, inanitie, procese patologi @ JFxista un grup de proteine cu efect toxic - loxine, existente in unele plante, agenti patogeni, venin de sarpe, viper’, scorpion, albina, viespe. UL. Proteine cu functii biologice neobignuite - fibroina secretata de paianjen si viermele de matase, care se solidifica rapid formand un fir insolubil si cu rezistenta mecanicd remarcabila; - proteina “antifrezee" (contra inghejului) se géiseste in sangele unor pesti care traicse in apele de sub gheata din jurul Antarcticei. Interesant de observat ci toate proteinele, inclusiv cele care nu au intensa activitate biologicd sau toxic’, sunt formate din aceiasi 22 de aminoacizi, care fiecare luat separat nu are deloc sau are o foarte slaba activitate biologica gi nu are actiune toxicd. Conformatia tridimensionala este unul din factorii cei mai importanti care confera fiecarui tip de proteina o activitate biologica distincta gi o anumita stabilitate, ceea ce permite ca proteina sa poata fi izolata, pastrata si studiati in stare nativaTabela 1.1 16 Rolul biologic al proteinelor (dupa A.L.Lehninger 1987) Tipuri gi exemple Localizare sau functie A - Proteine de rezerva - Cazeina - Ovalbumina ~ Feritina - Gliadina - Zeina B - Enzime ~ Hexokinaza - Lactat dehidrogenaza - Glicogen sintetaza - Amilaza - Acid gras sintetaza - Pepsina - ADN_polimeraza C - Proteine de transport - Hemoglobina - Mioglobina - Transferina ~ Ceruloplasmina - Citocromi b,c,a - Serumalbumina D - Proteine contractile - Miozina ~ Actina FP. - Proteine eu rol de protectic - Imunoglobuline - Fibrinogen - Trombina F - Hormoni ~ Insulina - Hormonul adreno- corticotrop (ACTH) - Hormonul de crestere | Proteina din lapte Proteina din albugul de ow Depoziteaza fierul in splina Proteina din scminjele de grau Proteina din boabele de porumb Fosforileaza glucoza, fructoza, manoza Enzima, catalizeaza oxidarea Jactatului la piruvat Participa la sinteza glicogenului Digestia amidonului si glicogenului Participa la sinteza acizilor grasi Participa la digestia proteinelor Rol in replicarea ADN Transporta O, in singele vertebratelor Transporta O, in cclulele musculare Transporta ioni de fier in singe Transporta ioni de cupru in sange Transportori de electroni Proteina plasmatica, transporta loni, Vitamine, hormoni Filamente groase in miofibrile Pilamente subtiri in miofibrile Anticorpi care fixeaza gi imobilizeaza agentii bacterieni Precursor al fibrinci in coagularea sangelui Participa in procesul de coagulare a sdngelui Hormon hipoglicemiant Regleaza sinteza hormonilor corticosteroizi Stimuleaz& cresterea oaselor gi biomasei musculareTabela 1.1 (continuare) 17 G - Proteine structurale ~ Colagenul - w Keratina ~ Elastina - Histone - Glicoproteide Proteoglicani H - Toxine - Toxina difteriei - Veninul de sarpe, scorpion ~ Ricinul Toxina din Clostridium Principala proteina a tesuturilor conjunctive (tendoane, cartilaje) Unghii, par Tesut conjunctiv elastic (tendoane) Proteind nuclear asociaté cu ADN Anvelisul si peretele celular Secretii mucoase, lichid sinovial Toxina bacteriana Contine enzime care hidrolizeaza fosfolipidele-fosfolipaze Proteina toxica (seminte de ricin) Produce intoxicatii alimentare bacteriene botulinum 1.2 Aminoacizii 1.2.1 Caracteristici generale, Clasificare. Prin hidroliza acida, alcalini sau enzimatica a proteinelor, rezult’ aminoacizii componenti, care reprezintA unititile chimice de baz ale macromoleculelor proteice. Se cunose aproximativ 200 de aminoacizi, dar organismele utilizea7’ pentru edificiul structural al proteinelor proprii 20 - 22 aminoacizi. Toti cci 22 de a aminoacizi au o serie de caracteristici structurale comune: gruparea lor amino este in pozitia a cu doud exceptii - prolina si oxiprolina | ® gruparea aminica este indreptata spre stanga - sunt deci L - minoacizi. Forma D a aminoacizilor se gaseste in polipeptide de prigine microbiana; # cuo singura exceptic (glicocolul), tofi aminoacizii conjin cel putin un atom de carbon asimetric, avand deci activitate optica; @ prezenta simultand a celor doua grupari, carboxilica si amino, invecinate spatial, fae posibild formarea Jegaturii peptidice caracteristice moleculelor cu semnificatic biologic’ - proteinele; In functie de caracterul polar sau nepolar al radicalului R exisid 4 categorii de aminoacizi: # aminoacizi cu grupari nepolare sau hidrofobe Rb; # aminoacizi cu grupari polare neincdrcate electric Rp ionizate partial la pH - ul fiziologic; @ aminoacizi cu -— HN—C—H COOH srupiiri polare inciircate electronegativ, avand deci un caracter avid Rpa;18 @ aminoacizi cu grupari polare incarcate electropozitiv, avand deci un caracter bazic Rpb Caracterul polar sau nepolar al aminoacizilor este de o mare importanti pentru a prevedea proprietatile fizico - chimice si biologice ale proteinelor studiate. Protcinele care sunt bogate in aminoacizi polari sunt solubile in apa, in timp cc proteinele care au un continut ridicat in aminoacizi nepolari sunt insolubile in apa. Radicalul R constituie catena laterali a ficcdrui aminoacid, in timp ce catena principala reprezinta component’ structurala comuna. Particulari e structurale ale radicalului R (aciclic sau ciclic) si prezenta altor grupari chimice functionale réprezinti criteriile care stau la baza clasificarii aminoacizilor. Monoaminomonocarboxilici. - Monoaminomonocarboxilici cu grupari hidroxil Aciclici_ 4 (hidroxiaminozeizi). Monoaminomonocarboxilici cu sulf (Lioaminoaci7i) AMINOACIZI Monoaminodicarboxilici Diaminomonocarboxilici. - Homeociclici. Ciclici ~ Ileterociclici Acizii organici de la care deriva aminoacizii cu structurd alifaticd au in catena lor (2 -6) atomi de carbon: acidul acetic, propionic, butiric, valerianic, izovalerianic, caproic, izocaproic Aminoacizii homeociclici $i heterociclici confin in structura lor urmatoarele upuri de nuclee: benzenic, fenolic, imidazolic, indolic si pirolidonic. In catena laterald gruparea NH, poate ocupa si alte pozitii decat alfa: B (beta), y (gama), 4 (delta), © (epsilon). In tabela 1.2 sunt prezentati aminoacizii care participa in structura proteinelor gi principalcle lor caracteristici. Rh = radical hidrofob; Rp = radical polar nedncareat electric; Rpa ~ radical polar eu caracter acid; Rpb = radical polar cu caracter bavic.ARE | SIMBOL CU | ere mask _ | OuTeRa | MP-CAL | OLECULARA ay GRUI PA I - Amino cial menoamino monocarboxilici | _ = ae eee a | | Acid ; _ | | _. | Glicecol | amino | Gly i G Rho 15) | | | acetic | | | {oo eee | | | Acid Alanina | o amino Ala A Rh 89 | | Propionic | aa al > 1 — i, | | Acid iy | |3 Valina |. ao amino | Val | V Rh WL? | {4 zevalerianic | | | co ' — + - | 1 Acid | | | \4 | Leuciaa a amino | eu | L Rh 131 if | izocaproic | | pot j | Acid | | | [5 CHy CHC ~G-COOH ' Feeteucina «=p metil | He | I Rh 131 CH; NH) valerianic 61GRUPA [Ef - Aminoacizi cu grupiri hidroxil ( hidroxiaminoacizi ) L 2 a 4 a Se 4 | Acid a amino i | 4,C —C—COGH | Serni |). : cal Ser | 8 Rp | 105 ro | | P hidroxi propionic | | OH NH) | | | i . | . | Acid ¢ sans 7 7 ot oe | ; - CHS CH— C—~COOH freonina | {slo & Amie Thr : Rp | 119 3 Ls ses | . § hidrexi butiric t i P GRUPA II] - Aminoacizi cu sulf ( tieaminoacizi) 5 T T | | - dona | eaomy | Acido amino | | eng c — COOH Cisteina Btio propionic Cys | c Rp 121 SH NH | | | . 4 | | < ; | toning, Acid m amino | S—CH—-CH.— C—-C Aetior i : ce | NM RA 149 } ij CH=CH; : OOH | Medtionina | ymetil butiric | Met A | cH Nk> | | | 0z‘mito: monoaminodicarboxilicl si amidele lor Acid | Acid «amino | aspartic succinic t | < fect =H | Asparagina Acid @ amino Zi f amido succinic aon glutamic glutaric | Acid | Acid jamino | ' | | | ~ . | Acid @ amino | Ghatamina ¥ amidoglutaric Gin Q Rp | 146 si ~ ! a ! ee GRUPA V - Aminoacizi diamino monocarboxilici - = ey a wcateans | Acid camino mG R 4 Arginina 5 ouanidovalerianic| ““® Rpb | 174 semesters, pe wis keen aor sci ade | | | | | Timd | Acidaediamine | Lys | K Rpb | 146 | caproic | | | | | ——-— ~ 7 | 5 Hidroxi | Acid «e diamino | | Rpb | 162 | i Ho-Lys Lizina | 3oxi caproic IzGRUPA VI -. czi homeociclici 2 3 4 ra hop = 4 i 6 7 rR eld a 1 U/ SS, rn | a wr Acid Camino | | 7. € Sch,-c-coor | F mule cramming | 5 ; <> 4 ; . Fenlaianine B fenil propionic | Phe i F Rh af Me — _ __ { | 7 a | Acid & amino | | of \ 2 cape | , i *| ea 18 HOY YC G ~COOH | Tirozina 6 para hidroxi | Tyr Y¥ Rp | | = NH | | fenil propionic | ' — ee 3 | GRUPA VI - Aminoacizi heterociclici ' | cu a Oct i | Acid amino lio | PtH, C-COCH | | send — er] NaN Aa, | Histidind | imidozol propionic | His | H Rp i | . | | | | | 1 _ — 1 1 i — r —T . . mae + + . pr CH,-¢—cooH | |. Acid o amino » | | 20) e: SH, | Triptofan | ( indolil propionic | Ty w Rh | 4 | I i E peer dene | | perce = i | | 21) Protina | ACd pirolidon | pro P Rh | | 2 carboxilic | i 4 lo Hid | Hi | | 3 idroxi \cid 4 Hidroxi “8 | | 22 i roxd | Ack Hox? | | Prolina pirolidon 2 carvoxilic ooure xe | \ _ _ I | i}23 1.2.2 Aminoacizi care nu participa in structura proteinelor in afara celor 22 de aminoacizi care intra in structura proteinelor, in natura se gasesc » serie de aminoacizi care sunt constituents aj altor biomolecule sau produgi intermediari in rite procese biochimice (vezi tabela 1.3). Tabela 1.3. Aminoacizi neproteinogeni +1 CH, Formula Denumire Rol biologic COOH | ~ Component a CH, 8 Alanina dipeptidelor I carnozina gi anserind CH, - NH, - Component’ a acidului pantotenic si coenzimei A COOH | CH, Acid y amino | - Transmiterea impulsului | buticic nervos CH, GABA - Agent de blocare a 1 sinapsclor CH, - NIL, H.C - COOH | Sarcozina - Utilizard in wratamentul | HEN - ch, cancerului ILC - COOH Betaina - Rol lipolitic NH, ILC - SH | Cisteamina Component al coenzimei H.C - NH, Asi PTA H.C - SO,H Taurina - Component al acizilor H,C - NH, biliari (HC), - NH, | HC - COOH | Omitina = Intermediar al ciclului ureogenetic24 Tahela 1.3 (continuare) dees NH, | NH-C=0O H ~ Citrulina ~ Intermediar al ciclului ureogenetic (CH,), - C - COOH | Ni, 1.2.3 Proprietati fizico - chimice gi biologice ale aminoacizilor Aminoacizii sunt subsianje solide, albe, cristalizate, solubile in apa cu doud except tirozina si cisteina. Datorit acestei insolubilititi, cisteina in anumite condifii formeazd o calculoza renal - cisteinuri Cu exceptia glicocolului, amincacizii au un atom de carbon asimetri au 2 alumi de carbon asimetrici: treonina, izoleucina, hidroxilizina gi hidroxiprolina, 2, iar 4 aminoacizi 1.2.3.1 Aminoacizi esentiali Biosinteza proteinelor proprii specifice organismului este direct corelata cu aportul de aminoacizi exogeni proveni{i pe cule alimentara. Sinteza tuturor acestor biomolecule fundamentale nu poate fi efectual decat de catre plante si de unele specii de microorganisme. Organismul uman si animal in cursul evolutiei lor au pierdut capacitatea de sintez: a 8 aminoacizi pe care nu ii poate obtine decat prin aport exogen din proteinele de natura vegetala Aminoacizii care sunt absolut necesari pentru cresterea si dezvoliarea organismului uman si animal furnizati prin alimentatie au fost denumiti aminoacizi esentiali (indispensabili). Lipsa acestor aminoacizi din alimentatie, (tabela 1.4), determina o serie de tulburari foarte grave . Doi aminoacizi: histidina si arginina, sunt indispensabili organismelor in cregtere, sinteza lor endogena nu este suficienté pentru a acoperi nevoile mai mari din perioada de crestere (aminoacizi semiesentiali). Ceilalti aminoacizi pot fi sintetizati in organism prinu-o serie de reactii care au ca Tabela 1.4 Aminoacizi esentiali, semiesentiali gi neesentiali Esentiali Semicsentiali Neesentiali Valin Arginina Glicocol Leucina Histidind Alanina Izoleucina Serina Lreonina Cisteina Metionina Acid aspartic Lizina Acid glutamic Fenilalanina ‘Tirozina Triptofan Prolina Oxiprolina25 puncte de plecare diversi metaboliji; ei sunt aminoacizi neesentiali (dispensabili) si, prin urmare, pot lipsi din hrana. Carenta in anumiti aminoacizi prin aport alimentar insuficient se manifesia printr-o simptomatologie complexa: @ carenta in lisinad - determina incetinirea cresterii; @ carenta in triptofan - determina tulburiiri vasculare $i modificarea tabloului leucocitar; carenta in tirozin’ —_- determina atrofia tiroidei si hipofizei; © carenta in tioaminoacizi - determina atrofia testiculelor, degenerarea ovarclor si sterilitate. 1.2.3.2 Proprietatile ionice ale aminoacizilor Aminoacizii datorita prezentei simultane in structura lor a cel pujin unci grupari amino sia cel putin unei grupari carboxilice, se vor comporta in mod diferit in funcie de pH - ul » Solutici. Intr-o solutie apoasd coexisté 4 forme intr-un raport cantitativ dependent de natura ediului, dar in care forma nedisociaté este prezenta intr-o cantitate minima. _R—CH—COOH a | N NH> oN EY R- oa COOH NH3 AK “SR-cH-coo® # 3 Speciile ionizate nu se gasesc ca entitafi individuale, ci numai in prezenfa unui alt ion cu sarcina opusa: acid + H,O ==? H,O* + baza baza + H,O &= acid + HO7 sau evidentiind in mod separat gruparile carboxil, respectiv amino ale aminoacizilor: R- COOH + H,O€* R - COO-+ H,O7 R-NH, + H,0==R- NH; + HOM26 Disocierea acida sau bazica va fi dependenta de cate o constanté Ka sau Kb care conform legii actiunii maselor, va fi egala cu: ~ [R-c00 J.oj [re -Nu,'][E0; Ka = : Ree [R - NHJH.0] f G 3 Jeet : =~ Fr A ]= 3 I Pack [R= COO}=|R- COOH] si |R- NI, [r NH} a 7 [R - COOKH.O } Ka=[H"] sideci tog ka =-og{i"]; pk = pH Asadar, pentru a caracteriza aciditatea sau bazicilaltea aminoacizilor se folosesc cxponenfii de aciditate pK. Funcjia carboxil este caracterizata prin pK, - COOH, iar functia aminica prinu-un pK, - NH); la unii aminoacizi se adauga si a treia marime pK, corespunzatoare functiei acide aditionale (vezi tabela 1.5). Tabela 1.5. Valorile pK gi pl ale aminoacizilor (dupi Lebninger 1989) Aminoacid pK,-COOH | pK,-NH,* | pK, | pl (25°C) (25°C) 1. Glicocol 2,34 9,60 5,97 2. Alanina 2,35 9,69 6,02 3. Valina 2,32 9,62 5,97 4. Leucina 2,36 9,60 5,98 5. Tzoleucina 2,36 9,68 6,02 6.Fenilalaning 1,33 9,13 5,98 7. Prolind 1,99 10,69 6,10 8. Lriptofan 2,38 9,38 5,88 | 9. Serina 2,21 9,15 5,68 10, Treonina 2,63 10,43 6,53 LL. Tirozina 2,20 9,11 10,07 | 5,65 12. Cisteina 1,71 10,78 8,33 | 5,02 13. Metionina 2,28 21 5,75 14. Asparagina 2,02 8,80 5,41 15. Glutamin& 2,17 9,13 5,65 L6. Acid aspartic 2,09 9,82 3,86 | 2,97 17. Acid glutamic 2,19 9,67 4,25 | 3,22 18. Histidina 1,82 9,17 6,00 | 7,58 19. Lizinit 2,18 8,95 10,53 | 9,74 20. Arginina 2,17 9,04 12,48 | 10,76 Un numar de 5 aminoacizi din cei 20 cuprind in radicalul R de la Co grupari acide saul bazice: acidul aspartic, acidul glutamic, lizina, arginina si histidina. Funciile fenol din tirozina si tioalcool din cisteina sunt acizi foarte slabi care la pH - ul fiziologic se ionizeazi intr-o masura neglijabila. La acesti aminoacizi se adaug’ o constanta pK suplimentara (pK).27 La un pH egal cu semisuma valorilor pK, sarcina neta a aminoacidului este nula, in solutie existand practic numai ioni bipolari. Acest pH este denumit pH izoelectric (pl) si reprezinta o constanté dependenta de numarul de grupari amino sau carboxil pe care le contin aminoacizii respectivi. La punctul izoelectric (pl) aminoacizii se afl disociati ca anioni $i cationi in proportii egale din care cauz& nu vor migra in camp electric; solubilitatea lor este minima datorita atractillor electrostatice dintre anionii i cationii existen{i. In figura 1. este prezentata curba de titrare a alaninei, a neutralizarii functiilor ~COOH ‘si -NHG cu o solutic de NaOH Ints-o solujie cu pH diferit de pI atat aminoacizii cat gi proteinele vor avca o anumita incarcare elccirica, pozitiva sau negativa, ceea ce face sa migreze intr-un camp electric spre anod sau spre catod, find posibild separarea lor dintr-un mediu care confine mai multi aminoacizi, respectiv mai multe proteine. | 12: [H,N—cH—coo’] = [H.N-cH—co0'] CH3 CH; | [H,N-CH-COOH] CH: [HsN—CH—Co0"] CHs 1 | Echivalenti HO” Fig. 1.1 Curba de titrare a alaninei 1.2.3.3 Proprietatile chimice ale aminoacizilor Reactivitatea chimica a aminoacizilor este deierminatd de prezenya gruparii -COOH, a gruparii NH, sau de prezenja simullani a ambelor grupari. A. Propricti{ile chimice datorate gruparii carboxil @ Hormarea de amide constituie un proces de mare important’ biologica gi care are28 loc th mod eontinuu in organism. NH; Acid glutamic + Glutamini NH, Acid aspartic —- —_—» Asparagina Aminoucizii se pot decarboxila, formandu-se aminele respective. Reactiile de decarboxilare ale aminoacizilor sunt catalizate de enzime denumite aminoacid decarboxilaze care apartin clasei liazelor si care au drept coenzima piridoxal fosfatul (PALPO). R R \ | H—— fe —— H,C——NH, + CO, COOH Aminele se pot incadra in trei grupe dupa actiunea sau rolul Jor metabolic: amine biogene, structurale sau toxice. Tabela 1.6 Exemple de amine biogene Aminoacidul, | Demumire |” Formula Rol biologi de origine Acid 7 Transmiterea Acid glutamic | amino HOOC.(CIT,),-NF,, impulsului nervos butiric Cisteina Cisteamini | HS-CH,-CH,-NI, Component al coensimei A gi PTA Serink Colamini | HO-CH;-CH, NH, Component al fosfolipidelor Tirozing Tiramin’ | HO-C,H.(CH,),NU, | Tipertensiv Contractia uterului Lisin’ Cadaverint | H,N-(CH,) NH, Diamin’ torica Omnitina Putresceint | HyN-(CH,)-NU, ‘Diamina toxict Hipertensiv B. Reactii datorate grup @ Alchilarea Atat in laborator, cat si in organismul viu gruparea amino se poate metila, formandu-se derivatii metilati respectivi. In laborator "in vitro" reactia are loc in prezenta iodurii sau sulfatului de metil (CH,),SO, In vivo reactia are loc sub actiunea metilanté a unei substante specializata pentru aceast reactie: metionina activaté sau $ - Adenozil Metionini (SAM). SAM H,C - COOH ——> H, COOH | | CH NH, [Glicocol] N°SCHs [Betaina] CH,oF Betaina se adminisireaza in insuficienta hepatica. @ Dezaminarea Prin dezaminarea aminoacizilor se formeaza in organism cetoacizi intermediari metabolici de mare importanta si concomitent se formeaza si amoniac. NAD* NADH + H* R - CH - COOH S 2 nA R-C - COOH R - C- COOH ll HOH, |l NU, > NH NH, O Reactia Sanger Sub actiunea 1-fluor-2,4-dinitrobenzenului se formeaza derivatii dinitrofenilati ai aminoacizilor respectivi, compusi de culoare galbena care. pot fi separati cromatografic. Accasta relatic prezinia deoscbit interes din punct de vedere analitic,c&ci serveste ta separarea si recunoasterea aminoacizilor N-terminali din structura polipeptidelor. NO, NO» HR HE ‘ i 0.N ES HLN-CH—cooH + 0,N N=CH oot Reactia a fost uiilizati de Sanger pentru stabilirea structurii insulinei (1950). @ Reactia Edman Fenilizotiocianatul se condenseaza in mediu alcalin cu gruparea - -NH, a @ aminoacizilor sau a aminoacidului N- terminal din structura peptidelor. COOH $ COOH H Nee + N—CH N=C-N-CH 1 ot HR R [Fenit Izotiocianat] [Aminoacid] [Acid Feniltiohidantoic } Prin incalzire in mediu acid se ciclizeara formandu-se feniltiohidantoina (PTH) aminoacidului corespunzator30 i s c N7 NH gee a \ . [HOI-C—CH — (H'; Nitrometan ) 6 3 tol oR [Acid Feniltiohidantoic] [Feniltiohidantoina ] Pe peptida ramasa cu un aminoacid in minus fala de cea inijiala, se aplica in mod repelat acelayi procedeu. PTH - aminoacizii objinuti in fiecare etapa, sc identificd cromatografic, obtinandu-se secven{a tuturor aminoacizilor componenti ai peptidei luate in studiu. @ Reactia cu clorura de dansyl este de asemenea utilizata pentru identificarea aminoacidului N-terminal din structura peptidelor, prin formarea unor derivati sulfoamidici fluorescenti. IH BOGEN S03 . 2 COO! ZS cH COOH CHa Ne oN CH3 CHa {Cloruré de Dansy! ] Dezavantajul acestei_metode este acela c& permite numai determinarca primului aminoacid si reactia nu se mai poate repeta 1.3. Peptide 1.3.1 Caracterizare:generala Datoritd preventei simultane a grupirilor -COOH si -NH, a fost posibild formarea legaiturii peptidice specifica peptidelor, polipeptidelor si proteinelor. Peplidele sunt substante naturale si sintetice constituite dintr-un numar restrans de aminoacizi 2 -50 care se condenseaz intermolecular la nivelul gruparii carboxil a unui aminoacid si gruparca « amino a altei molecule de aminoacid. Constituirea moleculclor de peptide se hazeazi pe capacitatea aminoacizilor de a se lega covalent unul de altul.31 0 Q 0 HN—CH—C-LOH « HN—cH-C-60H ’ Hiy-CH—C-OH an SH PO Noo! | Zz 4 ac | OO; | Zz | [vod | R, H Rp H Peplidele reprezinta compusi intermediari intre aminoacizi si proteine. Peptidele constituite din 2 pana la 10 aminoacizi se definese ca oligopeptide; peptidele a ciror structura este formati din 10 pana Ja 50 de resturi de aminoacizi se definesc ca polipeptide. Pentru a denumi un peptid se specifica in ordinea de succesiune, incepand cu restul de aminoacid-NH,-terminal - numele radicalilor aminoacizilor, iar la s/rsit se adauga numele intreg al aminoacidului care reprezinta restul cu gruparea -COOH - terminala De exemplu denumirea unei tetrapeptide ipotetice cu structura: HN - Arg - His) Glu Ala - COOH. se numeste: Arginil - Histidil - Glutamil - Alanina. Peptidele formate din mai mult de trei molecule de aminoacizi, care au deci cel putin doua legaturi peptidice, dau pozitiva reactia biuretului, evidentiind prezenta lor in lichide biologi Ca origine, peptidele prezente in organismul uman pot proveni prin biosinteza din aminoacizi - cum este in general cazul peptidelor cu functit biologice - fic ca produgi intermediari in procesele biochimice de degradare si biosinteza a macromoleculelor proteice. 1.3.2. Dipeptide In organismul animal yi uman au fost identificate si caracterizate peptide ce indeplinese importante functii biochimice. Principalcle dipeptide naturale sunt earnozina si anserina cu structuri aseminidtoare amandoud fiind componente specifice ale muschilor, carnozina find prezenta in muschiul mamiferelor, iar anserina in mugchiul pectoral al pisarilor. Atat camozina, cat si anserina, iau nagtere prin condensarea histidinei cu alanina, diferenja constind in faptul c& anserina contine © grupare metil in ciclul imidazolic, care provine de la metionina activata (S-adenozil metionina)" CH—-C—COOH NH N NH ; QW ‘0 i : [caRNozINA] CH : [ ANSERINA ] CH, PALANIL HISTIDINA NH, pALANIL NMETIL NH, HISTIDINA Ambele dipeptide sunt considerate atipice nefiind constituite numai din a aminoacizi; fiecare cuprinde un « aminoacid - histidina si un 8 aminoacid - § alanina. Roluri biologice @ = carnozina exercita actiunc hipertensiva; carnozina este un stimulator al secretiei glandelor; joucd un rol activ in transportul acidului fosforic in cursul procesului de glicoliza si in formarea creatiniosfatului; ® sub forma de carnozintosfat este donor de grupari fostat in contractia musculara; 1 @ au rol de subsiante tampon in mentinerea pH-ului fiziologic in contractia musculara. 1.3.3 Tripeptide Glutationul este un tripeptid descoperit de Hopkins (1921) in celulele de drojdie, dar nt in tuale celulele de origine vegetala si animala. Este constituit prin condensarea 3 f _ NH—CH —¢ —NH—CH=-COOH iM it H-C-NH, : [ GLUTATION] COOH [$ GLUTAMIL CISTEINIL GLICINA] Gluiationul este considerat un tripeptid atipic deoarece prima din legiturile sale peptidice s-a format prin eliminarea de apa intre grupul amino al cisteinei si carboxilul din pozifia 6 al acidului glutamic (nu cel din pozitia a). Prezenta gruparii tiolice libere, provenite de la cisteina, confera glutationului o serie de proprietati aparte. Hidrogenul gruparii tiolice poate fi cedat unei substante acceptatoare33 de hidrogen cu unirea a dou&d molecule de glutation redus, formandu-se o molecula de glutation oxidat, proces catalizat de glutation peroxidazi (enzimi NADP* dependenta) localizata in eritrocitele umane. HO, GOSH 6G - 8-816 =~ NADP’ NADPH + H* Reactia inversa este catali: de glutation reductaza (enzimi NADPH dependenta) localizata in ficat, rinichi si drojdie de bere. NADPH +H" NADP* G-S-S-G—S._ 4 > G - su + is -G Cuprul yi fierul stimuleaza procesul de oxidare reversibil al glulationului redus (G-SH) in glutation oxidat (G - $ - S - G). Una din caile de catabolism ale glutationului consta in desprinderea glutationului i in hidroliza cistcinil-glicinci la glicini si cistein’, in prezenta unci enzime ribozomale; glulationul poate fi convertit la glutamina sau transferat unei peptide, proces catalizat de enzima + glutamil transpeptidaza. Rolu biologi _ # Glutationul face parte din categoria transportorilor neenzimatici de hidrogen, ca siacidul ascorbic @ Functia de sistem redox a glutationului este catalizata de doud enzime (NADP*) dependente: glutation reductaza si glutation peroxidaza Glutationul are rol de protectie al enzimelor -SH dependente. Iniensifica actiunea a numeroase enzime, cum ar fi: pepsina, catepsini, hexokinazd, alcooldehidrogenaza, arginaza etc., participa las gruparea_ prostetica. a enzimei _ glicolitice triozofosfatdehidrogenaza. Protejeaz’i punjile disulfitice ale hormonului insulina La animale cu diabet experimental carora li s-a administrat glutation, dezechilibrul glicemic este corectat partial. @ Participa in reglarea si stimularea biosintezei proteice. @ Glutationul redus reactioneaz’ ca antioxidant intervenind in protejarca anumitor substanfe contra oxidarii: acidul ascorbic, adrenalina, hemoglobina. @ Concepjia moderna asupra procesului de imbatranire presupune o acummulare a gruparilor -S-S-gi, prin urmare, glutationul participa la acest proces prin menjinerea unui echilibru -S-S-42-SH. Conjinutul in glutation redus (G-SH) al pupilei descreste cu varsta; cata este insopita si de o scadere a glutationului redus. @ Arc efect antiinfectios si antitoxic. senila34 1.3.4 Polipeptide cu activitate biologica Tehnicile moderne de investigare biochimica’ au permis sa se separe gi si se stabileascd structura unor peptide formate dintr-un numar restrans de aminoacizi si cu activitate biologic’ importanta. Hormonii hipofizotropi numifi si “factori de eliberare hipotalamici’ (releasing factors) indeplinesc rolul de stimulare a hormonilor propriu igi Acestia aclioneazd direct la nivelul adenohipofizei prin reglarea secretiei hormonilor adenohipofizari. A lost confirmata prezenta mai multor hormoni hipofizotropi dintre care au fost obtinufi in stare pura yi caracterizati din punct de vedere chimic. Primul studiat si caracterizat a fost factorul de eliberare a hormonului de stimulare al tiroidei (PRE) format din acid glutamic ciclizat, histidina si prolinamida. HAC £13 ‘, CH o=t? sl CN L G gf | es es oe H H OHH O fA fa ve NH 2 [2- PIROLIDON-5 HISTIDINIL- PROLINAMIDA ] Acest factor a putut fi objinut intr-o cantitate de 2 mg,pornindu-se de la 750.000 fragmente de hipotalamus. In tabela 1.7 sunt consemnate o serie de polipeptide cu roluri biologice foarte diverse, in special cu activitate hormonala: hormoni propriu zisi, hormoni tisulari, hormoni digestivi, asupra cdrora vom reveni intr-un studiu aprofundat in capitolul Hormoni (vezi vol. 11) Exista polipeptide naturale elaborate de microorganisme (origine bacteriana), dintre care uncle manifesta actiune antibiotica, prezentind un larg interes in chimioterapia moderna Din aceasta categorie fac parte: gramicidine, tirocidine, bacitracine, polimixine, actinomicine, kapreomicine, walinomicine, etamicine, stafilomicine a ciiror caracteristica esentiali, este prezenta in lanjul polipeptidic al acestora, al aminoacizilor din seria D alaturi de aminoacizi din seria L, formand uncori o structura ciclicd. Freevent in structura acestor antibiotice intalnim acidul faspartic si acidul T-glutamie Actinomicetele produc au numai antibiotice macromoleculare, dar si polipeptide cu nticanceres, ca de exemplu, careinomicina, carcinomidina aplicate in clinica umana. efect35 ‘Tabela 1.7 Alte polipeptide cu activitate biologicd Denumirea Numar de Roluri biologice aminoacizi 1. Ocitocina 8 Stimuleazi contractia muschiului neted 2. Vasopresina 8 Actiune hipertensiva. Antidiuretic 3. Angiotensina I 10 Cresterea presiunii sanguine 4. Angiotensina II 8 Cregterea presiunii sanguine 5. Bradikinina 9 Determina contractia muschilor netezi. Efect vasodilatator 6. Insulina 51 Actiune hipoglicemianta 7. Glucagon 29 Actiune hipoglicemianta 8. Corticopropina 39 Stimuleaza biosinteza hormonilor corticosteroizi 9, Gastrina I 17 Stimularea secretiei gastrice 10. Gastrina IL 17 Stimularea secretiei gastrice 11. Secretina 2 Controleaza secretia pancreasului 12. Hormonul melanocit(®) 13 Stimuleaza producerca de pigment in celulele melanocite ale pielii 13. Hormonul Stimuleari producerea de pigment in melanocit(h) 18 celulele melanocite ale piel 1.4 Structura proteinelor Numarul izomerilor posibili ai polipeptidelor, ca gi cel al proleinelor rezultate din unirca mai multor aminoacizi este imens Numai in cazul unor polipeptide rezultate din unitea unui numar restrans de aminoacizi pot rezulta tcoretic: 4aminoacizi N = 4! = 4*3*2*1 = 24 izomeri S aminoacizi N = 5! = 5*4*3*2*1 = 120 izomeri 6 aminoacizi N = 6! = 6*5*4*3*2*1 = 720 izomeri Taminoacizi N = 7! = 7*6*5*4*3*2*1 —5040 izomeri 10 aminoacizi N 10! 10*9*8*7*6*5*4*3*2*1 = 3.628.800 izomeri. Intr-o singura bacterie se apreciaza c exista 3000 de protcine, in timp ce omul are 5*10' proteine diferite. Proteinele difera de la o specie la alta gi se apreciaza cA existi peste un milion de organisme diferite. Din cele 5 milioane de proteine existente in organismul uman este cunoscutd numai structura cétorva zeci de proieine. Pe baza observatillor asupra proteinelor cunoscute, s-au putut generaliza si legifera cunostiintele despre structura altor proteine Complexitatea structurala a proteinelor rezulta din faptul ca sunt macromolecule gi din aranjamentul lor spatial configurational. Notiunea de "Configuratie” reprezinta orientarea in spaliu, respectiv dispunerca tidimensionala a atomilor sau grupirilor de atomi ai molecule’ in raport cu un anumit centru36 de referinté sau cu 0 anumita componenta a structurii considerat& ca rigida. Proteinele se caracterizeaz4 printr-o arhitecturd spatiald bine definita care reflecta organizarea lor conformationala stereospecifica. Structura de ansamblu a macromoleculelor proteice se manifesta ca rezultanta coexisten{ei $i interactiunii mai multor tipuri de structuri sau niveluri de organizare si anume: primar, secundar, terfiar si cuaternar. Intre aceste niveluri de organizare structurala nu exist delimitari precise, ele interactionand in cadrul unci structuri gencrale unice. Interdependenja inte aceste structuri defineste arhitectura de ansamblu a macromoleculelor proteice manilestatd prin existenfa unor particularitéji structurale i functionale. 1.4.1. Structura primara Acest nivel de organizare constituie structura de baz a oricarei proteine. Asamblarea aminoacizilor cu formarea de lanjuri polipeptidice desemneazit struectura primar: p 4 oo b 4 CH N C CH N NA A ee ee a a ae: H 0 il H 0 R Legiitura pepridic’ - legatura de tip covalent este cca mai importanta din structura proteinelor. Caracterul legiturii peptidice. Legiitura peptidic’ manifesta un caracter apreciabil de dubla legatura covalent de tip C-N Acest caracter se explica prin un peptidice: oarele structuri limitd de rezonan{a ale legaturit i i H rex +7 ya Ma 0 x Prin delocalizarca electronilor legatura covalent C-N dobindeste un caracter de dubla legatura Legatura peptidica devine coplanara si poate fi reprezentala prin urmaloarea structura global, ca exprimare a celor doua structuri limita de rezonanga:37 Geometria legaturii peptidice. Legatura peptidic’ avand caracter parfial de dubla legatura, planul relativ rigid in care se aflé legdtura C-N nu permite o rotatie libera, ci numai 0 rotatic restransa a atomilor de C si N in jurul axei legaturii coplanare C-N. Orientarea geometricd a celor doi C w adiacenti legaturii peptidice, ca $i a atomilor de O si H atasati la legdtura peptidica este in pozitia trans stabili din punct de vedere energetic. Ca o consecin{a a acestei orientari spatiale precum gia configuratiei L a aminoucizilor constituenti, catenele laterale R ale acestor aminoacizi grefate la fiecare atom C a sunt dispuse intr-un aranjament trans repetabil Organizarea intracatenard este determinuta de: numarul, natura si ordinea aminoacizilor care difera de la o proteind la alla si formeaza secventa proteica. Structura primara constituie coloana vertebrala a oricatei proteine, determina configuratia specifica si activilatea biologica a fiecarci proteine. Argumente in favoarea structurii poli @ nu exist decdt un numar foarte mic de grupari -COOH si -NH, libere fata de numarul mare de aminoacizi, deci’ sunt angajate; hidroliza lanqurilor polipeptidice determina aparitia unui numar cgal de grupari -COOH 3i -NH, libere; @ = reactia biuretului caracteristica pentru substanta numita biuret, dar yi pentru produsii care au in structura lor gruparea peptidicd (CO-NH-) repetat& este pozitiva deci pentru toate polipeptidele si proteinele, confirmand astfel prezenta legaturii peptidice repetate; # spectrul in UV si IR, ca de altfel si studiile difractici cu raze X, care permit terizarea exacta a structurii diferitilor compusi, dovedese existenta legAturii covalente - CO-NH- ca forma de unire a aminoacizilor in lanjul polipeptidic38 Tabela 1.8 Comppozitia in aminoacizi a unor proteine globulare gi fibrilare (unitati per molecula) Proteine globulare Proteine fibrilare Aminoacidul albumin _pepsini’ | elastin __colagen Ala 3 | os 56 107 val 4 | 21 118 29 Leu 58 28 56 28 Hew 9 7 26 15 Pro 31 15 136 | 131 Phe 30C«Sd 29 15 Try 1 | 6 0 0 a Met 6 | 5 0 5 ! Cly Is | 38 376 363 Asp - NH, 46) 44 4 41 Glu eso | 27 22 7 Lys 58 1 3 31 Arg 25 2 6 49 22 44 9 2 27 | 28 10 19 20 4 0 0 18 | 18 8 5 | 4 0 5 Radicali ss | *50 93 72 nepolari % Operatiile analitice necesare elucidarii swucturii primare a proteinclor sunt extrem de complexe, laborioase si de mare finefe din care cauza au fost stabilite structurile unui numar restrains de proteinc. Prima sccvenga proteica care a fost stabilita este insulina (Sanger 1953); 10 am mai tarziu trei cchipe de cercetitori din $.U.A., R.E si China realizeaza concomitent sinteza insulinei in laborator, confirmand descoperirea lui Sanger. Dupa aceasta a urmat ribomucleaza (124 aminoacizi), citocrom C (104 aminoacizi), mioglobina (153 amineacizi), chimotripsinogenul (245 aminoacizi), tripsinogenul (229 aminoacizi) etc, Cunoasterea secventei proteice ne permite si deducem proprietatile biologice ale proteinei respective (vezi tabela 1.8). Proteinele globulare au peste 50% aminoacizi cu grupari polare find deci hidrosolubile. Proteinele fibrilare au peste 70-90% aminoacizi cu grupiiri nepolare hidrofobe, proteinele fiind insolubile in apa gi avind o mare rezistenti mecanica. Prin compararea structurilor primare ale proteinelor care indeplinese functii biologic: omoloage la organisme diferite se poate stabili gradul de varictate structurala, compatibila cu o anumita functie si aceste comparatii permit urmarirea istorici evolutive a proteinei la mai multe specii animale. Sinteza proteinelor este comandata de un cod genetic memorizat in structura acizilor nucleici si deci secventa lor aminoacida reprezinté expresia unui mesaj genetic. Prin dereglarea sintezei proteice, datorita unei cauze genetice, in cadrul proteinelor cu activitati biologice inlocuirea unui singur aminoacid in seevenja proteica are consecin\e metabolice deosebit de grave. Daca in hemoglobina umand, in unul din cele patru lanturi (2@+2$) un singur39 aminoacid, acidul glutamic (pozijia 6 din catena §) este inlocuit cu valinad duce la aparitia in eritrocitele umane a hemoglobinei $ care caracterizeazd "anemia falciforma". 1.4.2 Structura secundara Proteinele native nu reprezinta simple catene polipeptidice, ci ele se constituie intr-o otganizare spatiala uidimensionala. Aranjamentul spatial unic pe care un Janf polipeptidic il adopta in mediul intern al organismului este coordonat de cerinje termodinamice gi este rezultanta tuturor interactiunilor necovalente care se pot stabili in ansamblul moleculei, astfel ca nivelul siu energetic si fie minim. Structura secundard reprezint&é organizarea spatial a catenelor _polipeptidelor, organizare generatd si stabilizata datorit& leg&turilor de hidrogen care se stabilesc: intracatenar si intercatenar intre gruparile -NH- si -CO- ale legaturii peptidice. Desi legaturile de hidrogen sunt relativ slabe, totusi stabilitatea structurii, secundare cste asiguraté prin posibilitatea formarii acestor legaturi intr-un numar mare si prin repartizarea lor uniforma de-a lungul catenclor polipeptidice. Aceste interactiuni necovalente de energie joasd au energii de activare mici, se stabilesc cu viteze foarte mari, {ari interventia unor factori externi gi sunt eficiente prin insumarea efectelor unui numar mare de legaturi. H QO R H OO R H OR i W ie 1 I dy ! i I I M1 e cH “ye Nee Sgr \W 8 oye, i i i 0 R HO R H 0 H R 6 H R © & Lod f | I it | a sy “yo Sef ee Sas 0° H R O H oR H OF R HO i ot | \ i | Se” Nau Ny bey S a a nes too | Ul i | i 0 Oo OR Fig.1.2 Legituri de hidrogen intre trei catenc polipeptidice Structura secundard se reprezinta in trei modele sau variante structurale: A - Modelul a helix; B - Modelul in planuri pliate; C - Modelul de tip colagen. 1.4.2.1 Modelul a helix Acest model prevede faptul ca lanqurile polipeptidice sunt dispusc sub forma unei40 conformajii elicoidale denumite « helix cu ingurubare spre dreapta. Lanjul polipeptidic se risucesie la nivelul legaturilor simple pentru ca grupirile -CO si -NH s& devini adiacente stereochimic pentru a forma punti de hidrogen Aceasta orientare este favorizata din punct de vedere energetic, are o stabilitate mai mare in raport cu orientarea spre stanga si este predominanta in structura proteinelor native. Fig.1.3-Reprezentari ale conformatiei oc-helix Prin difractia cu rave X s-a stabilit cd o helixul se caracterizeazd prin urmitoarele wrasaturi: ~ cu fiecare rest uminoacidic se avanseazd pe vertical’ cu 1,47 A; pasul elicei, disianja dintre doua puncte echivalente pe verticala este de 5,4 A si cuprinde 3,6 resturi aminoacidice;41 radicalii R ai tuturor aminoacizilor sunt orientati spre exteriorul elicei, conliguratia atomilor C a fiind aceiagi pentru toji aminoacizii; spirele formate au un ax de simetrie longitudinal; - 0 grupare -NH- formeaza legatura de hidrogen cu gruparea -CO- apartindind celui de-al patrulea rest aminoacidic din secventa linear, aga ineat toate gruparile NH- si -CO- formeaza legaturi de hidrogen. Proteincle native nu sunt aledtuite din conformaii a helix regulate decat in anumite proportii, structura lor conginand gi regiuni neelicoidale, iniercalate intre regiuni elicoidale Gradul de spiralare al proteinelor globulare variazi de la 0 proteina Ja alta, majoritatea reprezentand atat portiuni « helix, cat si portiuni rasucite neelicoidale. [ PROTEINE : Mioglobina Hemoglobina Lizozim Subtilizina Carboxipeptidaza Anhidraza carbonica Papaina Ribonucleaza Chimotripsina Citocrom pete ed 0 25 50 I 100 hig. L.4 Continutul in a helix al unor proteine Exist unele proteine fibrilare, ca o keratina din lana care sunt constituite numai din @ helixuri regulate. o keratina din lana este formata din trei catene elicoidale (a helix) intrepatrunse si stabilizate prin punti disulfurice care alcdtuiesc o protofibrila; ansamblul a 11 protofibrile formeaza microfibrila de Jina. Discontinuitatea produsa in conformatia « helix a catenelor plopeptidice este datorata existentei_ unor radicali ai aminoacizilor care pot actiona ca factori stabilizatori sau destabilizatori ai clicei respective Dezorganizarea « helixului in zonele in care apare protina sau hidroxiprolina, se explicd pri faptul cd avand gruparea amino mascaté mu pot participa la formarea legaturilor de hidrogen si prin urmare se intrerupe rasucirea clicoidala a lanjurilor polipeptidice configuratie’incompatibila cu geometria elicei Efectul destabilizator al altor aminoacizi ca valind, izoleucina si treonina, se datorese radicalilor voluminogi de king’ C a care determina o impiedicare sterica a a helixului. Serina destabilizeaza clicea prin capacitatea de a forma legaturi de hidrogen la gruparea alcoolica, iar resturile de cisteina formeaza legaturi disulfurice, legand rigid porjiuni ale lanqului polipeptidic, fcand imposibila rasucirea elicoidala Dependent de natura radicalului, precum gi a legaturilor pe care le pot genera42 aminoacizii au fost clasificati in functie de capacitatea lor de a forma « helix (veri tabela 1.9) Tabela 1.9 Aminoacizii care influenteaz4 stabilitatea helixului P) stabitizeaza _[{OLabitizeaza Rup a helixul Alanina Acid glutamic Prolina ‘ Asparagina Acid aspartic Hidroxiprolina Fenilalanina Arginina Glutamuna Cistena Histiding Glicocol Leucina Tzoleucina Metionina Lizina Tirozina Serina ‘Triptofan Treonin’ Valina 1.4.2.2. Tipuri de‘legituri din structura proteinclor In cazul structurii proteinelor interactiunile care se produc intre diversi radicali ai aminoacizilor pot conduce la formarea urmatoarelor tipuri de legaturi: A - Legaturi covalente - legiitura peptidica ( CO-NH-) specifica structurii primare; @ — legitura disulfuricd (-S-S-) stabilite intre radicalii de cisteina - specifica structunii terjiare; B - Legaturi necovalente - legaturi de hidrogen intracatenare - intre gruparea CO-de pe 0 spira si -NH- de pe alta spira; ® - legaturi de hidrogen nepeptidice - datorita gruparilor alcoolice (din restur seril, treonil), fenolice (din resturi tirozil), amidice (din resturi glutaminil si asparaginil); @ - forte Van der Waals (legaturi apolarc) si interactiuni hidrofobe mai slabe decat cele de hidrogen, la care participa aminoacizii cu grupari nepolare: valina, Icucina, izoleucina, fenilalanina; regiunile hidrofobe constituite mumai din aminoacizi cu catene nepolare hidrofobe se gaisesc localizate spre interiorul moleculei proteice globulare (miezul moleculei) exercitand 0 functie esentiala de stabilizare a componentei structurale si interne in timp ce regiunile hidrofile se gasesc dispuse spre exteriorul moleculei; @ - forte de interactiune hidrofile se stabilesc intre radicalii care tind sa formeze legaturi de hidrogen cu molecula apei; @ - legaturi ionice - implica fortele de atractie ce se stabilesc intre alomii sau gruparile incarcate cu sarcini electrice de semn contrar si anume, gruparile -COOH ale aminoacizilor, aspartic si glutamic cu grupirile NH, ale lisinei si argininei.43 1.4.2.3. Modelul in “planuri pliate" Acest model,denumit si modelul in “foaie pliata", reprezinté o conformatie ordonata si stabilizata prin legaturi de hidrogen in care se realizeazd potentialul maxim de legare al gruparilor>C =O gi -NH- din legaturile peptidice. In acest caz legaturile de hidrogen se stabilesc intereatenar, realizand cea mai stabila inleractiune daca lanfurile evolueaza antiparalel, unul de Ja capatul N-terminal spre cel C- terminal si celalalt in sens invers. . Spre deosebire de modelul a helix, in cel al "planurilor pliate” legaturile de hidrogen intercatenare sunt dispuse aproape perpendicular pe axa catenei polipeptidice. Prototipul modelutui in "foaie pliata” il reprezinta B-keratina - protcina fibrilara din lana, par, unghii si fibroina secretata de viermele de matase Bombyx mori. D a D Fig.1.5 a) Reprezentarea modelului in "planuri pliate" cu evidentierea legaturilor de hidrogen intercatenare;b) reprezenta simplificata a modelului. Reprezentarea spajiald a 6 - keratinei se caracterizeaza prin urmatoarele: @ conformatie "destins’" in "zig zag" a catenelor polipeptidice; catencle polipeptidice sunt dispuse antiparalel intre ele stabilindu-se legaturi de hidrogen intercatenare; @ Ja constituirea unei asemenea conformatii participa toate legiturile peptidice care sunt implicate in formarea legaturilor de hidrogen intercatenare, conditie care confera 0 mare stabilitate acestui tip de structura secundara: @ radicalii R ai aminoacizilor sunt dispusi alternativ deasupra si dedesubtul planurilor in zig zag ale catenelor polipeptidice; @ in cele mai multe upuri de f-keratina aminoacizii frecvent intalniti sunt glicocolul sialanina avand grupele R relativ mici, deoarece un R voluminos sau incarcat electric poate destabiliza structura in foaie pliata. In anumite conditii experimentale, « keratina - proteind nativa cu structura secundara de tip @ helix - supusa actiunii cdldurii, umezelii $i a unei tractiuni se Wansforma reversibil in B keratina proteina cu structura secundara de tip "planuri pliate"44 a - Keratina === 8 - Keratina Aceasti conversie este insojita de o desfacere a legaturilor de hidrogen intracatenare ale @ keratinei si de stabilirea concomitenta a unor legaturi de hidrogen intercatenare; catenele polipeptidice vor suferi o 8 - pliere, organizandu-se-asticl intr-un model structural de tip “planuri pliate" caracteristic §-keratinei. In acest proces a-keratina se transforma reversibil dintr-o structura secundara constransa (a helix) intr-o structurd secundara relaxata (planuri pliate). 1.4.2.4 Modelul tip colagen Colagenul este un alt tip de proteina fibrilara cu o larga raspandire in majoritatea \csuturilor animale: oase, cartilagii, tendoane, piele, cornee si membrana bazala. Rolul sau in organism este atét structural, cat gi functional, find implicat in mecanisme complexe de reglare in timpul cresterii yi refaverii esuturilor. Constituie 30% din totalul proteinelor animale si este bogat in: glicin’, prolina, hidroxiprolina, 5 - hidroxilizina, Doi dintre aminoacizii constituenti - hidroxiprolina si hidroxilizina - nu pot fi incorporati ca atare in lanturile polipeptidice formatoare de colagen; hidroxilarea are loc numai dupa incorporarea prolinei gi lizinei in lantul polipeptidic b) @ OXIPROLINA © PROLINA © GLICICOL Fig. 1.6 Molccula de tropocolagen triplu elicoidal Acesti aminoacizi fac imposibila formarea lc} aturilor de hidrogen gi din aceasta cauza molecula de colagen este multiplu spiralata, prezenténdu-se ca un "superhelix" format din45 trei tene polipeptidice spiralate care constituie un “triplu helix" (vezi figura 1.6). Colagenul este constituit din unitati care se repeti, molecule tricatenare de tropocolagen (monomeri), avand capete distincte. Tropocolagenul este considerat a fi unitaiea fundamentala in structura colagenului, reprezentati de molecule care alcatuiesc fibrele de colagen. Lanturile polipeptidice ale tropocolagenului sunt legate covalent intre ele prin resturi de dehidrolizinonorleucina rezultate din reactia enzimatica a dou resturi de lizind din doua molecule de tropocolagen alaturate. H H | | HOOC-C-CH,-CH,-CH,-CH =N-CH,-CH,-CH-CH,-C-COOH | NH, [DEHIDROLIZINONORLEUCINA] NH, Stabilitatea structurii colagenului este asigurata gi de formarea unor legaturi ester inte gruparile w carboxilice ale acizilor dicarboxilici si gruparile -OH ale hidroxilizinei. Colagenul datoreaza functiile sale unei configurajii moleculare distincie care cuprinde intrcaga gama de nivele de organizare: # structura primara a colagenului este determinata de sceventa aminoacizilor care compun lanturile polipeptidice ale moleculei; structura secundara se refera la organizarea si structura spatial a lanturilor polipeptidice; # structura terfiara reflect natura legaturilor intercatenare a celor trei languri polipeptidice; @ aranjarea macromoleculelor in spatiu si conformatia lor in fibra de colagen constituie structura cuaternara Procesul de biosintez’ al colagenului are loc in fibroblasti si osteoblasti, desfasurindu-se in dowd faze: {. Faza intrafibroblastica si If. Faza extrafibroblasti {. Faza intrafibroblasticé are urmatoarele etape: a) Transcrierea; b) Translatia; c) Hidroxilarea prolinci si a lizinei; d) Trans- glivovilarea. Initial biosinteza colagenului debuteaza ca o sintezd a unci proteine obisnuite, dar Incepe sa se deosebeasca, pe de o parte datoriti hidroxikirii prolinei si lizinei, aminoacizi ce nu exista in stare libera in citoplasma celulara, iar pe de alta parte datorita formarii la nivelul microzomilor a celor trei lan{uri polipeptidice. Prezenta hidroxiprolinei si hidroxilizinei este 0 caracteristica metabolic’ a jesutului conjunctiv. Hidroxilarea prolinei si lizinci are loc simultan cu incorporarea acestor aminoacizi in lanjurile colagenului. Hidroxilarea prolinei si lizinei are loc sub actiunea a doua enzime: colagenprolinhidroxilaza si colagenlizinhidroxilaza La hidroxilul hidroxilizinei se fixeaza unititi glicozidice sub actiunea nor transglicozilaze (colagenul find o glicoproteida).46 I. Faza extrafibroblastica care consta din urmatoarele etape: a) - expulzia tropocolagenului; b) - asocierea moleculelor de tropocolagen; ©) - formarea legiturilor incrucisate; 4) - gruparea moleculelor de colagen. Legaturile incrucigate se realizeazd cu concursul lizinei si hidroxilizinei care sunt oxidate de catre o aminooxidaza specifica colagenului - lizinoxidaza Un colagen cu cat are in structura sa mai multe legaturi incrucisate, cu atat viteza sa de reinnoire va fi mai mica si invers. In procesele de cicatrizare elemente ale tropocolagenului sunt transportate pe cale sunguina si incorporate rapid in colagenul neoformat. 1.4.3 Structura tertiara Structura primara si secundaré a proteinelor nu pot explica proprietatile fizico - chimice gi biologice ale proteinelor fibrilare sau globulare. Structura tertiata reprezinta un stadiu avansat de organizare spatiala a structurii proteinelor si consi in replierea catenelor polipeptidice elicoidale asupra lor insile. In struciura tertiara catena polipeptidicd manifesta tendinja de a suferi 0 infagurare spontana intr- © organizare spatiala complexa, cu pliuri ce nu sunt ordonate regulat in spafiu. Structura secundara, dar mai ales cea tertiara, induc moleculelor o stereospecificitate care este responsabili de reactivitatea chimica si biologic’ a protcinclor. Jn cazul proteincior fibrilare conformatia proteinelor este ordot dimensiune a moleculei, ceea ce le va conferi un grad de rezistenta mecanica deosebit de ata pe intrea mare in cazul proteinelor globulare zonele ordonate eficoidale vor alterna cu zonele in care Janjurile polipeptidice sunt incolacite in aparenta dezordonat Vorjele de interactiune care intervin in structura tertiara sunt identice cu cele intilnite in structura secundara si in plus, apare legatura covalenta de tip disulfuric -S-S- formata inire doua molecule de cisteina, caracteristica structurii tertiare. He— SH HS — CH: H.C-}S— St CH, r 2H i Sa ane a H-C— NH, + H- c— NH, =, HAG, H-C-NH, CooH COOH COOH COOH [CISTEINA] [CISTENA] [CISTINA] Resturile cisteinil formeaza legaturi disulfurice, care leagi covalent regiuni mai departate ale lan(urilor polipeptidice.COOH Fig.1.7 Reprezentarea puntilor disulfurice in structura tertiara Structura terfiara prezinta un grad mare de labilitate in raport cu diferitii factori fizici si chimici; desfacerea legaturilor implicate in organizarea structurii tertiare (legaturile disulfurice) determina denatura proteinelor, proces insofit de regula, de pierderea proprictatilor biologice. Prima proteind a cdrei structura tertiard a fost precizandu-se pozitia in spatiu a tuturor atomilor componenti este mioglobina. Mioglobina este 0 proteina abundenta in {esutul muscular al mamiferelor si este constituita dintr-un lant polipeptidic continand 153 de resturi de aminoacizi si o grupare prostetic’ denumitt "Hem" bilita in cele mat mici detalii, 1.8 Structura teriara a mioglobinei (A) Reprezentarea schematic’ a mioglobinei (B) (Liniile duble indica segmentele cu a helix, iar cifrele numarul resturilor de aminoacizi) au scoase in evidenta pe supratata In general proteinele intracelulare, solu moicculei gruparile polare si inearcate electric. Forma sfericd sau clipsoidala a molecule depinde de raportul dintre numarul resturilor aminoacide cu radical polar si numarul48 resturilor cu radical hidrofob. Daca raportul nr Rp/nr Rh este cuprins intre 0,9 - 1,4 se favorizeaza adoptarea unei forme alungite a proteinelor, in timp ce o valoare a raportului de 0,3 - 0,6 face ca proteina si adopte o forma sferoidala, deoarece resturile hidrofobe se acomodeaza mai usor in centrul unei structuri globulare. 5 La proteinele membranare inglobate in stratul dublu lipidic repartizarea radicalilor polari si nepolari ai aminoacizilor este inversd; partea exterioara a moleculelor in contact cu lipidele membranare cuprinde radicalii hidrofobi, iar in interiorul molecule: se delimiteaza zona cu radicali polari si incdrcati electric. In cazul enzimelor, structura tertiar asigura plasarea in anumite puncte Ja suprafaja a radicalilor polari, care au si calitatea de a fi centrii activi ai enzimei si vor putea actiona asupra unui substrat adecvat. 1.4.4 Structura cuaternara Reprezinti cca mai complex organizare structural a proteinelor gi este specifica doar proteinelor globulare. A fost descoperita i descrisa de Jacob si Monod (premiul Nobel 1965 - pentru studiul “enzimelor allosterice cu rol de reglare in metabolismul intermediar"). Suprastructura cuaternara reprezinté asocierea unor catene polipeptidice denumite “protomeri” intr-un ansamblu sau agregat denumit "oligomer". ‘In functie de numarul protomerilor constituenti, structura cuaternara este frecvent din dimeri, tetrameri ete. Funetia specifica a unei proteine oligomere care prezinti subunitati protomere, de regula un numar par, se manifestA numai la nivelul structurii cuaternare, protomerii separati find inactivi. Interactiunile prin care se realizeaza agregatul molecular si care stabilizeaza structura cuaternara se tealizeazd numai prin forte slabe necovalente: @ - legaturi clectrostatice; @ - legaturi de hidrogen; @ - icgaturi Van der Waals. forma Fabel 1.10 Proteine oligomere Proteina Masa proteins: Nomar Masa protomerilor Kealtoni protoineri Kdattons Miozini 468 2 212 Creatin kanaza 80 2 40 Fosfatazd alealinh 20 2 40 Hemoglobin’ as 4 16 Lactat dehidropenazs 150 4 35 Aldolaza 160 4 40 Glicogen fosforilazk 210 4 925 Piruvat Kinaza 4 57,2 Ceruloplasmin’ 1st 8 8 Glutamin sintetazd 592 12 48,5 Un exemplu tipic de organizare stracturala il constituie hemoglobina, pigment sanguin49 cu rol in transportul O,. Structura cuaternara a hemoglobinei reprezinti un tetramer constituit din 2 catene a identice (141 resturi de aminoacizi) si 2 catene f identice (146 resturi de aminoacizi) Asocierea celor patru protomeri pentru formarea structurii cuaternare a hemoglobinei poate fi redata prin relatia: 200" % 2p - oe X Po 52 $2 Le]. | WD A 89) BB) SS Db f Fig.1.9 Asocierea protomerilor structurii cuaternare a hemoglobinei Aceasta asamblare corespunde necesitatilor termodinamice de realizare a unr sisteme stabile. Structurile cuaternare permit funclionarea unor mecanisme fine de reglare a activitatii proteineazimelor - reglare allosterica - caracteristica enzimelor allosteric (vezi cap.3.5.7.4). 1.4.5 Morfologia moleculelor proteice In functie de forma gi aspectul lor, precum gi pe baza diferentelor in structura iridimensionala gi a solubilitatii in apa, proteinele se incadreaza in doua categorii: protcine fibrilare si proteine globulare I. - Proteinele fibrilare se caracterizeaz’ prin: @ ~ au aspect filiform fiind compuse din catene polipeptidice lungi in forma de filament; @ -catenele sunt unite lateral prin legaturi incrucisate pentru a forma o structura stabila; @ - aceasti morfologie confera proteinclor fibrilare rezisten{aé mecanica si insolubilitate in apa; ® ~ prezinta structura primara, secundara si terfiara; ~ prezinté conformatii: « helix, planuri pliate,’triplu helix care se caracterizeaza prin faptul cé sunt ordonate gi prezinté axe sau planuri'de simetrie; @ - au mase moleculare mari si structura repetitiv: @ - indeplinesc roluri biologice specifice: elasticitate, rezistenfa mecanica, si intervin in exercitarea unor importante funcjiuni fiziologice: contractia musculara, coagularea singelui. II. - Proteinele globulare se caracterizeaza prin: @ - posed o structura tridimensionala mult “infagurata" care rezulta din incolaciri50 ale lantului polipeptidic fntr-o forma nefibrilara, elipsoidald sau aproape sfericd; # - proteinele globulare au un aspect cémpict ‘si sunt solubile in apa, deoarece poseda radicali polari intr-o mare proportic; % - prezinta proportii diferite in « helix; # - prezinta toate cele patru nivele de organizare structurala a proteinelor: primar, secundar, tertiar si cuaternar; - proteinele globulare existd intr-o mare-varietate si indeplinesc multiple roluri biologice in organism inclusiv cele enzimatice; - proteinele globulare nu sunt molecule rigide, ci sunt molecule caracterizate Printr-o anumita flexibilitate, capabile sd suporte tranzilii semnificative la alte stari conformationale; aceste tranzitii sunt permise numai intre anumite limite, fiind insotite de modificari discrete si reversibile denumite tranzitii conformationale ale intregii molecule, ® - structura tridimensionala a proteinelor, adica nivelul secundar, teryiar si cuaternar al proteinelor, este programata si conditionata de informajia conjinuta in structura primara. 1.5 Proprieta{i generale ale proteinelor Proteinele se caracterizeazit printr-un ansamblu de’ proprietiti fizico - chimice si biologice. Cercetarea proprieta{ilor proteinelor in scopul caracterizarii lor impune existenta acestora in stare pura, ceea ce necesita extractia prin metode gi tehnici foarte laborioase gi de mare finete. In cele ce urmeazd vom prezenta o parte din cele mai importante caracteristici ale proteinelor 1.5.1 Proprietati electrochimice. Electroforeza Proteinele sunt amfoliji macromoleculari, posedand un caracter amfiionic datorat unui numar variabil de aminoacizi care cuprind grupari polare disociabile cu caracter acid sau bazic Contributia cea mai importantiio au resturile glutamil, aspartil, lizil, arginil si histidil. Datorita acestér grupari libere ionizabile proteinele se comport ca anioni (in mediu bazic) sau cationi (in mediu acid), in functie de pH; la pH - ul fiziologic toate aceste functii acide sau bazice sunt ionizate complet. Datorita caracterului lor amfoter proteinele se comporta ca sisleme tampon participand la mentinerea valorii consiante a pH - lui mediului biologic. Exist o valoare a pH - ului la care proportia sarcinilor electropozitive ale moleculei de proteina este egala cu cea a sarcinilor electronegative, caz in care sarcina ‘electrica neta a moleculei devine nula; accasta valoare a pH - ului poarti denumirca de punet izoclectric al proteinei (pl). Valoarea pl este independenta de concentratia proteinei si depinde de compozitia sa aminoacidi, de predominanta resturilor acide sau a cclor bazice (vezi tabela 1.11),51 Tabela 1.11 Valorile pl pentru unele proteine Proteine pl Proteine pl Pepsina 1,00 | Serum y globulin’ | 6,4 - 7,2 Cazeina 4,60 Mioglobina 6,99 Ovalbumina 4,60 Hemoglobina 7,07 Serumalbumina | 4,90 Citrocrom C 10,60 Miozina 5,20 Lizozim 11,00 Insulina 5,35 Histona 10,80 Fibrinogen 5,50 | Salamina 12,10 O proteina cu pl > 7 contine un exces de lizina si/sau arginina in timp ce o proteina cu pI < 7 are un continut mare de aminoacizi dicarboxilici La pH - ul izoelectric (pl) solubilitatea si mobilitatea proteinelor in cdmpuri electrice este minima, in timp ce la pH - uri departate de pl aceste proteine au incarcatura neta (+) sau (-). CATOD™ B AU MIGREAZAW ANOLE 7 Proteina J¢ Proteina | NIL, NH NUL, f x >) Proteina \ cooH N coo pH = pl pH =pl pH = pl ea proteinclor in campul electric la pH - uri diferite de pl Sub forma ionizabila, de anioni si cationi, proteinele au proprictatea de a migra inur- un camp electric. Aceasia proprietate denumita electroforetica sia la baza_tehnicilor electroforetice de separare a proteinelor dintr-un amestec eterogen. Migrarea unci proteine sub actiunea unui camp electric se exprima printr-o marime caracteristica si anume mobilitatea electroforetica (u) care reprezint& viteza de deplasare a unei particule corespunzatoare unui camp de un volticm. Mobilitatea clectroforaticd este direct proportional cu viteza (v) si invers52 proportionala cu intensitatea campului (J = oma ss tin Vt Separarea fractiunilor proteice si mobilitatea electroforetica a acestora este dependenta de pH - ul solutiei tampon in care se efectueaza electroforeza, deoarece disocierea gruparilor ionizabile si repartizarea sarcinilor electrice ale proteinei sunt influenjate de valoarea pH - ului Datorita faptului cé proteincle difera prin pl si valoarea global a sarcinilor electrice, mobilitatile lor clectroforetice vor diferi la o anumiti valoare de pH si pe aceasta baza ele pot fi fractionate electroforetic in scop analitic sau preparativ 1.5.2 Denaturarea proteinclor Prin expunerea solutiilor proteice la conditii incompatibile cu conditiile necesare mentinerii integritatii structurale a proteinelor se produce denaturarea acestora. Denaturarea poate fi: a) reversibila; b) ireversibila. In cazul denaturarii reversibile sunt afectate interactiunile necovalente de energie joasi din structura proteinclor, dar la inlaturarea factorului denaturant proteinele isi revin la starea lor nativa. In cazul denaturarii ireversibile au loc modificari profunde in structura spatiala a proteinelor, acestea sufera o deplicre, 0 dezorganizare, ca rezultat al desfacerii diferitelor legaturi ce menfin structura secundaré gi terfiar gi in primul rand a legaturilor disulfurice, fara a se scinda legaturile peptidice cu eliberare de aminoacizi. Fig.1.11 Denaturarea proteinelor Denaturarea ireversibild implicd deci trecarea de la o conformatie spatiala ordonata a moleculelor proteice la o stare dezordonata insotita de cresterea entropici. Consecintele denaturarii sunt: - pierderea activitatii biologice; diminuarea solubilitiii: cresterea numarului de grupari -SH libere; picrderea capacitajti de a se combina cu apa; modificarea vascozitafii $i a presiunii osmotice; eeooeoe53 @ ~ cresterea susceptibilititii 1a hidroliza enzimatica. Agentii care provoacd denaturarea proteinelor sunt de natura fizicA (temperaturi de peste 60°C, agitare, raze X si y, radiatii ultraviolete, ultrasunete) si chimica (acizi, baze, siruri ale metalelor grele, solventi organici, agenti tensioactivi). Denaturarea proteinelor sub actiunea agentilor tensioactivi sau a solventilor organici demonstreaza rolul interactiunilor hidrofobe in realizarea conformatici native a unei proteine. Denaturarea proteinelor are si importanta teoreticd pentru clucidarea structurii si a forjclor implicate in diferitele niveluri de organizare structurala. 1.5.3 Proprietatile imunologice Una din manifestirile specificitatii proteinelor este reprezentata prin proprictatile lor imunologice Ja baza c&reia sti reactia antigen - anticorp. Procesele imunologice se definesc ca reactii de aparare ale organismului, reactii prin care se realizea7i neutralizarea toxinelor, a microorganismelor, sau chiar ale celulelor organismului care au dobindit caractere anormale Antigenii - reprezinta proteine care sunt straine pentru organismul in care au patruns pe cale naturala sau prin injectare si care declanseaz4 elaborarea sau biosinteza unor proteine de aparare denumite anticorpi. Antigenul reactioneazd cu anticorpii formati determinand reactia antigen - antitorp, reactie prin care actiynea nociva a antigenului este anihilata Conceptul de antigen prezinti o dubld semnificaie: ~ desemneaza 0 substan{a straina organismului care reactioneaza cu anticorpil corespunzatori; - reprezinté 0 substanja imunogenaé care provoaca reactia imunitara prin formarea de icorpi Molecula de antigen prezintd mai multe zone de combinare denumite determinanti antigenici, Determinantii antigenici sunt reprezentati prin diferite grupari; -NH,, -OH, -SH sau radicali de aminoacizi ciclici (Phe, Tir, Trp). Structura unui antigen polivalent poate fi asticl schematizata (fig. 1.12). Fig.1.12 Structura stilizata a unui anti: (1;2:3:4 - determinanti antigenit 4 2 Anticorpii sunt substante de natura proteica cu rol de aparare, a cdror biosinteza este declangsaté de catre antigen si care poseda capacitatca de a reactiona specific cu antigenul 3 Anticorpii apartin categoriei y globulinelor si se mai numesc imunoglobine (Ig), datorita proprietatilor lor imunologice. Imunoglobinele se clasificd in tei clase majore: IgG, IgA si IgM, ficcare in parte se divide in mai multe subgrupe produse de cclule specializate (splina, maduva, cclule limfatice) si sunt eliberate in ser. Anticorpii spre deosebire de antigeni sunt "bivalenti avand doua situsuri sau zone54 de combinare la nivelul carora se leaga antigenii si care se cdracterizeaza printr-o organizare spatiala complementara determinantilor antigenici. Pig.1.13 Reprezentarea zonelor specifice de combinare ale anticorpilor Molecula de imunoglobina apare constituita din doud lanturi polipeptidice "gréle" (H) (M=52.000) gi din douai lanjuri “ugoare” (L) (M=23.000); aceste lanturi polipeptidice sunt legate prin legaturi disulfurice intercatenare (vezi fig. 1.14). LLEIIIIIIIIIII SS [ FRIIZZIIZIZZIZZO H =H Fab 2 Hye Fab |, Ss 7] ieee | ‘cH Hoy HY Fig.1.14 Structura unei molecule de imunoglobulina Reactia antigen - anticorp constituic un proces imunologic de aparare a organismului si se manifesta prin blocarea, respectiv neutralizarea antigenilor patrunsi in organism a caror actlune nociva este astfel anihilata Reaclia antigen - anticorp (A: Ac) are la baza existenfa unei complementaritali structurale intre situsul Ac gi determinantii antigenici, fiind astfel stereospecifica © schema intuitiva a reactiei antigen - anticorp cu formarea unci refele este prezentati in fig.1.15. Reactia antigen - anticorp este insoyita de formarea de precipitate sau de aglutinare, care determina o stare de rezistenta specifica a organismului - starea de imunitate. Imunitatea creata se datoreste unei "memorii imunitare’ a anticorpilor biosintetizali de catre organism in cadrul raspunsului imun @ Intoleranja organismului uman fata de jesuturile de provenienta straina, este cea mai importanta barieré in transplantarea unor organe importante ca rinichi, ficat si cord. Transplantarile cu efect durabil au reuyit numai intre indivizii prezentand compatibilitate ditar-genetica. # Incompatibilitijile la transfuzii de sdnge se datorese reactici imunologice de aglutinare a hematiilor straine, deoarcce izoaglutin ele « gi) cu rol de anticorpi in reactie,55 se produc in mod spontan si permanent in sangele uman. xc xp ek LU Ag RETEA Ac Fig. 1.15 Mecanismul reactiei antigen-anticorp @ Imunoelectroforeza reprezinta inca una din aplicatiile practice ale imunologiei, de importan{a majora pentru laboratorul clinic. Imunocleciroforeza esie 0 metoda foarte sensibila de identificare a proteinelor si fractiunilor proteice bazata pe reactia antigen-anticorp gi capacitatea proteinelor de a migra in campul electric Prin imunoelectroforezd se pot astfel izola fractiuni inseparabile clectroforetic si s pot pune in evidenta schimbari minime ale structurii spatiale si denaturari ale proteinelor, greu sesizabile cu alte mijloace. Daltonul este unitatea de masa moleculara folosita pentru caracterizarea biopolimerilor; 1 dalton = masa unui atom de hidrogen = 1,67*10%g.2 HETEROPROTEIDE Diversitatea structurala a proteinelor permite legarea unei varietiii_ de compusi chimici, formand ansambluri moleculare eterogene ca structura. Hetcroproteidele reprezinta proteine conjugate care rezulté din asocierea unei componente proteice gi a unci componente neproteice, denumité componenta sau grupare prostetica. Componenta prostetica este de natura chimica foarte diversi si se Jeagd de componenta proteica - apoproteina - prin legaturi covalente sau interactiuni slabe de tip necovalent (ionic sau apolar). In functie de natura componentei prostetice, hetcroprotcidele se clasifi cromoproteide, nucleoproteide, metalproteide, fosfoproteide, glicoproteide, proteoglicani si lipoproteide. 2.1 Metalproteide PROTE IN4 Metalprotcidele sunt heteroproteide care contin joni metalici sau combinatii simple ale metalelor asociate direct cu apoprotcing — conferind PL acestora — proprictayi AS L/ in: functionale deoscbite. » Metalele care au fost puse in evidenfa freevent in fa structura metalproicidelor Lf KS [3 sunt: Fe, Cu, Mn, Zn, Co, Mg. Legatura dintre metal TT si apoproteina se realizeaza prin intermediul gruparilor polare libere (R) ale aminoacizilor din molecula apoproteina — prezinta 0 numita regiune din LU molccula susceptibila de a stabili legaturi cu metalul, Fig.2.1 Structura general a unei metalproteide in conformitate cu distributia (A,B = liganzi) spatiala a grupdrilor capabile sa formeze asemenea legaturi. Metalul (Me?*) se fixcazd de apoproteina prin anumite grupari chimice denumite Se considera cd PR OTE \N bh |57 liganzi, grupari care pot dona electroni metalului, stabilindu-se astfel legaturi covalente coordinative, metalul devenind coordinat. Prin intermediul liganzilor,metalul fixat pe apoproteind, formeaza un complex intern numit chelat care se caracterizcaza prin existenta unui ciclu in care se stabilese covalente coordinative intre atomii N sau O ai ligandului gi ionul metalic (Me?*) coordinat (vezi fig.2.1) 2xisienfa acestor structuri cu caracter de chelat sunt posibile in metalenzime, structuri care explicd mecanismul functional al acestora in procesele biochimice 1a care intervin In tabela 2.1 sunt consemnate céteva exemple de metalproteide gi unele caracteristici ale lor (dupa M. Serban). Tabela 2.1 Metalproteide importante pentru organismul uman Metalproteide Metal Sediul Functia Hemoglobina Te Hematii Transportor de O; Mioglobina Fe Muschi ‘Transportor gi re- zerva de O, in muschi Feritina Fe Ficat Depozit de Fe Hemosiderina Fe Maduva Depozit de Fe Siderofilina Fe Splina,plasma_ | Transportor de Fe Transferina Cu/Zn,Fe | Plasma Transportor de Fe Ovotransferina Fe Albus de ou Transportor de Fe Lactotransferina Fe Lapte Transportor de Fe Xantinoxidazd Fe,Mo Ficat,lapte ‘Transportor de ¢7 Ceruloplasmina Cu Plasma Transportor deCu Carbonic anhidraza Zn Hematii Hidratarea CO, Carboxipeplidaze Za Pancreas Digestia proteinelor 2.2. Kosfoproteide Fostoproteidele sunt heteroproteide in care componenta prostetica este constituitd din restul fosforil (-PO,H,) legat esteric la gruparile hidroxilice ale serinei (cel mai freevent), treoninei sau tirozinei. In general un fragment din siructura fosfoproteidelor poate fi prezentat astfel:58 Asadar, componenta care introduce eterogenitatea in structura catenei polipeptidice a fosfoproteidelor este acidul ortofosforic sub forma fosforil serinei. Fosforul din fosfoproteide poate fi eliberat sub acliunea unor enzime specifice - fosfoproteinfosfatazei. Prezena acidului fosforic in molecula fosfoproteidelor le confera acestora un caracter 1 si in consecinta, proprictatea de a forma sarari de calciu sau potasiu fiind predominante in lapte si oud. Principalele tipuri de fosfoproteide sunt: cazeinele, ovovitelinele, fosfovitelinele, serinenzime (pepsina,hexokinaza, fosfoglucomutaza). a) - Cazeine, Sunt fosfoproteide cel mai mult studiate, localizate in lapte, unde se gasese sub forma de cazeinat de calciu solubil; cazeinele constituie 80% din totalul proteinelor din lapte (4%). : Cazeinele sunt substante cterogene, constituind un’ ansamblu format din 3 fractiuni denumite generic (a, 8 si y cazeine) Aceste fractiuni difera intre ele prin mobilitatea electroforetica, prin continutul in fosfor si raportul cantitativ al acestora 75:20:5. Masa moleculara a cazeinei este 75.000 - 100.000 daltoni si fosforul este prezent in proportie de 40% sub forma de monoesteri, 40% sub forma de diesteri, iar 20% sub forma de pirofosfat find legat de resturile de serina si treonina. Prin fierberea laptelui cazeinele nu coaguleaza si exercita un rol de protectie asupra albuminelor si globulinelor din lapte pe care le menjine necoagulate. Cazeinele sunt insa coagulate gi partial hidrolizate sub actiunea unor enzime proteolitice ca chimozina yi pepsina. In procesul de coagulare care necesita gi prezenta ionilor de Ca’* se formeaza un produs denumit paracazeinat de calciu care rezulié prin scindarca enzimatica a cazeinei paracazcinatul de calciu este insolubil si digerat ulterior de diferite enzime proteolitice la stadiul de aminoacizi. De mare important biolog' este coagularea laptelui in stomac,intrucat permite utilizarea eficienté de catre organism a proteinelor continute in lapte; in absenta coagularii, tranzitul laptelui sub forma lichida ar fi prea rapid, caz in care cazeinele nu ar putea fi utilizate prin degradarea lor pana la stadiul de aminoacizi. Deoarece cazeinele contin practic toti aminoacizii esentiali, se poate acorda laptelui atribuiul unui aliment cu valoare nutritiva completa b) - Ovoviteline si fosfoviteline - sunt fosfoproteide existente in galbenugul de ou asociate cu lecitinele, Rolul lor fiziologic este de a furniza fosforul si aminoacizii necesari in alimentajia rationala a sugarilor dupa primele 6 luni de viata 2.3. Glicoprotcide Proteoglicani Glicoproteidele yi proteoglicanii sunt heteroproteide in care componenta prosteici este repreventata de substanje din clasa glucidelor. Diferenta esentiala dintre aceste doua clase de substan{e const in aceea ca in glicoproteide predomin’ componenta proteic’, iar in proteoglicani predominanté este componenta glucidica. Componenta glucidici din glicoproteide prezinta grade variate de complexitate structurala, monoglucide, diglucide, polighucide eterogene coproteidele au o larga raspandire in toata lumea animala si vegetala, ceea ce evidentiazd importanta lor pentru organismele vii. Locul secretici si climinarii glicopro- teidelor la mamifere este extrem de divers si multiplu, sub raport structural si functional - plasma sanguinad, mucoasa gastricd si duodenala, bila, lichid amniotic, secretii vaginale,59. secretii ale glandelor submaxilare, plasma seminala, glanda mamara,ficat, pancreas, placenta, hipofiza, tiroida, etc. Funciile glicoproteidelor sunt dintre cele mai diverse: protectia mucoaselor gastrointestinale, ale aparatului respirator si urogenital fata de actiunea enzimelor proteolotice, a unor compusi chimici sau agenti mecanici; factori de coagulare ai sangelui; constituien{i siructurali ai membranelor celulare; substante transportoare si componente specifice de grup sanguin; participa la asigurarea imunitajii organismului fafa de diversi agenti patogeni; hormoni, enzime etc. Acestor substan{e, le vom acorda un spajiu amplu in capitolul 5.7 odata cu precizarea noliunilor generale privind structura glucidelor componente. 2.4 Lipoproteide Datorita caracterului hidrofob al lipidelor, acestea nu sunt vehiculate ca atare de catre singe, ci sub forma unor complexe solubile cu proteinele serice denumite lipoproteide. Lipoproteidcle sunt asociatii intre proteine (apolipoproteine) gi una sau mai multe grupe de lipide amfipatice: acizi grasi, triacilgliceroli, fosfolipide, colesterol liber sau esterificat. Legaturile dintre componenta proteic’ si cea lipidica se realizeaza prin: interactiuni de tip hidrofob, datorita existentei in structura apoproteinelor a unei proportii relativ mari de aminoacizi nepolari; forje Van der Waals si - legaturi ionice care se stabilese inire grupirile ionizate ale fosfolipidelor (colina, colamina) si ionii -COO- si -NH} din structura proteinelor. Lipoproteidele plasmatice pot fi separate prin ultracenurifugare si prin electroforeza. Prin ultracentrifugari in medii cu densitati potrivite au fost separate din ser patru fractiuni lipoprotcice majore: @ - chilomicronii; - lipoproteidele cu densitate foarte mica (VLDL de la very low density lipoproteins); @ - lipoproteidele cu densitate mic&d (LDL de la low density lipoproteins); $ - lipoproteidele cu densitate mare (HDL de la high density lipoproteins). Datoriti componentelor proteice, lipoproteidele poarta sarcini electrice gi pot fi separate prin electroforeza pe geluri de agaroza, de poliacrilamida ctc. Cele patru fractiuni separate prin accasta tehnica sunt: ~ chilomicronii la linia de start; pre f lipoproteidele; { lipoproteidele; « lipoproteidele. Intre aceste fractiuni exista urmatoatea Corespondenya: - pre B lipoproteide = VLDL - Blipoprotide = LDL - « lipoproteide HDL In organismul animal lipoproteidele prezinté o larga distributic, fiind componente. structurale ale membranclor celulare, mitocondriale, reticulului endoplasmatic, tecilor de eoeoe mielina ale neuronilor ete Lipoproteidele intervin in permeabilitatea biomembranelor, participa la transportul lipidelor si a altor substanfe liposolubile (steroli, caroteni, uni hormoni, medicamente ete.) Caracteristicile generale si compozifia fractiunilor lipoproteidice vor fi prezentate in60 capitolul "Metabolismul lipidic" (vol.11). 2.5 Cromoproteide Cromoproteidele sunt heteroproteide care conjin drept component prosteticd 0 substanjai care absoarbe anumite radiatii din spectrul vizibil al spectrului si face ca intreaga molecula sa fie colorata. Tabela 2.2 Clasificarea cromoproteidelor Cromoproieide porfirinice Cromoproteide neporfirinice Cu rol respirator ~ hemoglobin - mioglobina I. - Cu rol respirator - hemeritrine (nevertebrate) ~ hemocianine (moluste) - citocromi b,c,a - citocromoxidaza Il. - Fara rol respirator - purpura retiniand - catalaze ~ feritina - peroxidaze - siderofilin’ Il. - Fara rol respirator - hemocupreind - cloroplastine (plante) - ceruloplasmind | ~ ficocianine (alge) zine proteine - ficoeritrine (alge) - flavoproteine - transmetilaze (B,) - carotenoide In functie de natura chimicd a componentei prostetice, cromoproteidele se clasifica in doud grupe mari: cromoproteide porfirinice si cromoproteide neporfirinice, avand sau nu rol respirator (vezi tabela 2.2). Unele cromoproteide (hemoglobina, mioglobina, citocromii, feritina, siderofilina, ceruloplasmina) sunt si metalproteide. 2.5.1 Hemoglobinele Hemoglobinele (deoarece au fost identificate mai multe hemoglobine diferite din punet de vedere cantitativ, structural si functional) sunt cromoproteide porfirinice, componente ale hematiilor din sangele vertebratclor si deci gi al omului Roluri biologice ale hemoglobinelor: @ - transportul oxigenului molecular de la plimani pana la cele mai indepar pentru alimentarea arderilor tisulare: We jesuturi @ - participarea la transportul CO, in singe; - participarea la mentinerea echilibrului acido-bazic $i a concentratici de H” in spajiul extracelular,61 2.5.1.1 Structura hemoglobinei Hemoglobina este formata din urmatoarele componente: a) - 0 grupare proteicd cu proprietaji bazice - globina, b) - 0 grupare prostetica constituita din protoporfirina - Hemul, in centrul careia se afla un atom de fier in stare bivalenta Fe** (Protoporfirinalx+ Fe’ * ———+ Hem). In structurile de baza ale Hemului si derivajiilor acestuia, patru molecule ale unui heterociclu simplu cu azot, pirolul sunt legate inure ele prin punti metilenice sau metinice, astfel incat formeaza sisteme ciclice complexe. Pungile metilenice sau metinice fac joncjiunea intre atomii de carbon a ai nucleclor pirolice; compugii ciclici nesubstituiti sunt porfinogenul, dacd puntile sunt metilenice si porfina, daca puntile sunt metinice. Porfirinogenul si porfirina nu apar in stare liberi in organismele vii, deoarece in cursul biosintezei se formeaza direct derivatii substituiti ai acestora; substituiensii pot fi: (-CH,), hidroxietil (CH,-CH,-OH), vinil (CH=CH,) sau propionil (-CH,-CH,-COOH) In organismul uman au fost identificate urmatoarele porfirine: etio, mezo, deutero, copro, uro, hemato si protoporfirina. Aceste porfirine care difera intre ele prin natura radicalilor, constituie nu numai etape intermediare ale biosintezei hemului, dar si etapele sale de degradare. Derivatii substituifi cu diversi radicali ai porfinei se numese porfirine, iar cei ai porfinogenului se numese porfirinogeni | Ho ——- CH ro HC CH , Sw \ ‘SS | i | PIROL N @ ® _[ PORFINOGEN } _ [ PORFINA} Porfina care intra in structura hemului este protoporfirina care are trei radicali: metil, vinil, propionil. Desi sunt 15 izomeri, cu tofii sintetizati in laborator, in organismul uman si al animalelor superioare nu este intalnit decat un singur izomer denumit "pretoporfirina IX" care in pozitiile 1,3,5,8 are radicali metil, in poziiile 2,4 are radicali vinil, iar in pozitiile 6 si 7 are radicali propionil (conform numerotarii lui H. Fischer). In protoporfirina IX (si in general in toate porfirincle) legaturile simple alterneaza cu cele duble pe intreg sistemul format din nuclee pirolice legate prin punti metinice. Conjugarca continua a legaturilor in nucleul porfirinic determina planaritatea porfirinet gio mare stabilitate a acestui sistem (energic minima); tot conjugarca explica gi capacitatea62 ridicaté de absorbtie a unor radiatii din spectrul vizibil pe care 0 prezinta porfirinele. Pe COOH COOH | | PROTOPORFIRINA IX ] Kig.2.3 Structura protoporfirinei 1X Porfirinele absorb in special radiatiile cu A = 400 nm, iar aceasta banda de absorbtie se numeste “banda lui Sorét"; pe baza intensitatii ei diverscle porfirine pot fi dozate. | Fig. 2... Obtinerea Hem-ului63 Prin iradierea porfirinelor cu radiatii situate in banda lui Sorét se obtine o puternica fluorescenta rosie, care la randul ei, poate fi utilizata ca mijloc de dozare. Lipsa conjugarii continue cum este in cazul copro si uroporfirinelor se traduce prin lipsa culorii. Hemul rezultd prin unirea ionului feros Fe’* cu protoporfirina IX - un chelat de culoare rosie care este gruparea postetica a tuturor cromoproteinelor porfirinice. Structura hemului prezint& urmatoarcle caracteristici: contine 4 cicluri pirolice legate prin grupari metinice = in pozifiile 1,3,5 si 8 sunt grefati radicalii metil; contine 11 duble legaturi conjugate; in pozigiile 2 si 4 sunt grefaji radicalii vinil in pozitiile 6 si 7 sunt grefati radicali ai acidului propionic; atomul de Fe in stare bivalenta este legat central de atomii de N ai ciclurilor pirolice B si D prin legaturi coordinative de ciclurile pirolice A si C; @ - cele patru cicluri pirolice, ca si atomul de Fe, sunt coplanare. Globina componenta proteic’ a hemoglobinei este o proteina oligome prin asocierea a patru catene polipeptidice asamblate intr-o structura cuaternara. Globina este un tetramer format din doua perechi de catene identice (2 alfa si 2 beta). Structura de ansamblu a globinei se caracterizeaza printr-o proportie apreciabila de @ ~ helix (75 - 80°} care alterneazd cu porfiuni nespiralate. Structurile primare ale celor douti tipuri de lanturi av fost stabilite de Perutz, Kendrew si Ingram (catena w are 141 resturi de aminoacizi, iar catena ® are 146 resturi de aminoacizi) Fiecare subuniltate a tetramerului are compozitia [a,8,], iar stabilitatea ansamblului macromolecular este asigurata prin ituri electrosta are sunt implicate gruparile -COO- si -NH¥ ale acizilor monoaminodicarboxilici; b) - legaturi de hidrogen; c) - forte Van der Waals. In interiorul fiecareia dintre aceste catene polipeptidice exist o cavitate in care este nplasata molecula Hem-ului. CH: ; eoeteee ‘A constituita Fig.2.4 Organizarea cuaternara a structurii globinei64 Prin legarea coordinativa a celor patru Janjuri polipepiidice se creeaza 0 conformatic care: a) - accept cu ugurinya O, la nivelul pliménilor; b) - este mai solubilé decdt monomerii; ¢) - datorita solubilitayii ei hemoglobina se poate concentra in eritrocit Molecula tetramer de hemoglobina confine patru molecule de hem, deoarece fiecare patru catene polipeptidice leag cate 0 moleculd de Hem (vezi fig.2.4). Structura hemoglobinei rezultd prin cuplarea globinei cu hemul. De mentionat ca globina conjine un numar mare de unititi de histidind si anume aproximativ 10% din totalul aminoacizilor care © compun. Asamblarea structural a globinei cu fierul se realizeaza prin intermediul unor legaturi de tipuri diferite: din ce 4 ~SBSSE Ny pan . 00c Ha i too" | > NH, V" THis (CH Me Cy is| A de [Lis c i a 6 Nl WIS YOING ina} 2.5 Structur hemoglobinei65 intre atomul de fier din Hem si doi radizali de histidin& (cicluri imidazol) aflati in pozitii diferite ale catenei polipeptidice (unul din radicalii de histidina - histidina proximala - se leaga direct de atomul de fier printr-o covalenta coordinativa, iar celalalt radical de histidina @ histidina distala - se va lega direct prin intermediul unei molecule de apa care stabileste - pe de o parte - 0 legaitura de hidrogen cu radicalul histidine’ - iar pe de alta parte - 0 legatura covalent coordinativa cu atomul de fier al Hemului). @ intre gruparile carboxil ale radicalilor propionil din pozifiile 6 si 7 ale hemului si gruparile amino ale unor aminoacizi bazici (lizina) din catenele polipeptidice ale globinei, realizandu-se astfel doua legaturi electrovalente; @ intre radicalii metil si vinil ai Hemului si radicalii unor aminoacizi cu catene apolare (triptofan, alanina, fenil alanina, valind, leucina) prin forye Van der Waals. Structura hemoglobinei este prezentata in figura 2.5 Hemoglobinele sunt substante cristalizabile; forma cristalelor este insa caracterisiica rei speci, ceea ce permite diferenticrea si stabilirea provenientei_hemoglobinci Componenta proteica - globina - confer specificitatea de specie hemoglobinelor diferind de la o specie la alta. Hemul este componenta invariabila avand acecasi structura pentru hemoglobina tuturor speciile 2.5.1.2 Hemoglobinele In eritrocitele umane s-au identifical urmatoarele tipuri de hemoglobina a ciror prezen{a este constant gi anume: Hb A,, Hb A, (adulte), Hb F (fetala) si Hb E (embrionara) La modul general - tinand cont de compozitia tetramerica a moleculei de hemoglobina formula sa poate fi exprimata astfel: [X; Y;] in care X, desemneazi o pereche de lanturi § (beta), 7 (gama), 4 (de! sau ¢ (epsilon) | Hb At [xs Pol | Ho F [x2 v2] | Hp A2[x> $5] | Hb E [x €2| Hemoglobina F se sintetizeaz’ in primele luni dup de viata intrauterina. conceptie si dispare dupa 3-4 luni Hemoglobina F reprezinta tipul de hemoglobina adaptat conditiilor de oxigenare din wer si care reprezinta intre lunile a 3-a si a8-a de viata intrauterind aproximativ 80% din totalul hemoglobinelor din sangele fatului. Dupa nastere Hb F este inlocuita cu HbA, si Hb A, adulte, astfel incat intr-un ml de sange adult se gasesc 0,15 g Hb A,; 0,04 g Hb A, si numai 0,0007 g Hb E66 Evolutia tipurilor de hemoglobina din faza intrauterina pana in cea extrauterina este prezentata in fig.2.6. (eC Soon, ~. ed Hefnoglobing fetalé Lantut ¢*5 ‘ Hemogiobina Adult Ai Lantul 6 A A 1 4, Hemoglobina 14 ombrionaré < Lantul € Hemoglobina A2 Lantul 6 Evolutia in timp a hemoglobinelor fiziologice Fiecare din formele de Hb fiziologice se caracterizeaza prin: mobilitate clectroforetica; ~ punct izoelectric: viteza de denaturare in mediu alcalin sau acid; au secventa Janturilor « identice; au secventa lanturilor § diferite; ficcare reprezinui adaptari ale organismului fad de diverse conditii de viata ~ hemoglobina umana cristalizeaza in bipiramide ortorombice simetrice, ceca ce permite lui de om de celelalte feluri de sange, observatic utilizata in laboratoarcle teoeoveoe diferenticrea sar criminalistice. 2.5.1.3 Hemoglobine anormale gi patologice In literatura de specialitate sunt mentionate peste 150 de tipuri diferite de hemoglobina, denumite dupa literele alfabetului latin, iar ulterior dupa localitatea unde au fost descoperite, sau numele propriu al pacientilor la care s-a facut prima oara descrierea anomaliei Lste stiut faptul ca secventa aminoacizilor in Janturile polipeptidice este codificata in structurile ADN; inlocuirea uneia sau mai multor baze azotate in structura ADN care codified seeventa unci protcine, va determina o secventa modificata a aminoacizilor67 ‘Tabela 2.3 Cateva hemoglobine anormale A.CATENA ALVA] NATURA SI POZITIA RESTURILOR DE AMINOACIZI SUBSTITUFTT MODIFICATA, we - 2 16 30 47 57 S868 87 116 120 127 ‘THULE His Lys Glu Asp Gly Mis Asn Mie His Alois, HEMOGLOBIN | coweeeaags Ae 21 Ae 3 | on Gn 4 | ttastacon Mis 5 | Maniobe Hs 6 | Nook as 7 | Boson Te & G Philadelphia Lys 9 | tate Tie 10 | 0. tndonecie Lys 1 | Meerut Gu 12_| s« Gude We nearenapera | 2 6 2 % 32 6 67 9 98 U7 IZ MODIEICATA His Giu_Ala Glu Leu_His_ Val Wis Val_ttis Glu 1 | sonata are 2/6 bys 5 va 4 | Faun ctu s | bys 6 | Abratam Lincotn Feo 7 | Saskatoon ie 8 Fanich Arg 9 | attwaukse ou 10 | nyde Past hw i | xo 12 | stata we 13 [ Dtnnias d , Gin Consecinta, va fi sinteza unor globine cu o structura primara diferité de cca a globinclor din hemoglobinele normale, puse in eviden{a prin electroforeza sr electrocromatografic (Ingram). Hemoglobinele anormale pot persista mai multe genegatii, altele sc elimina prin faptul ca nu permit condilii de oxigenare optime si in consecinja va surveni moartea, eliminandu-se agadar perpetuarea defectului de sinteza, prin transmiterca sa urmasilor. Nu toate hemoglobinele anormale sunt si patologice, deoarece ex: modificate care pot sa transporte oxigenul in conditii optime. Mentionam ca au fost puse in evident o serie de variante transmise genetic descendentilor, tipice anumitor populatii care traiesc in anumite zone yi pot constitui criterii de puritate rasiali; hemoglobinele din Africa de sud, Africa de vest, HbO si HbD din Asia (veri tabla 2.3). Categoria hemoglobinelor patologice nu este dependent de criterii: geografive gi rasiale; cle prezintaé modificari ale secventelor ambelor lanturi, sau secventa unui singur lant. In cazul hemoglobinei § (HbS) in lanturile de tip beta locul acidului glutamic din pozitia 6 este luat de valina; prezenta in sange a acestui tip de Hb face ca hematiile st se deformeze capitand aspectul unei seceri (sickle-cell) ceea ce duce la o anemie grav (anemia faleiforma) ~~~ Shudiul teoretic al diverselor variante de hemoglobin’ a permis intelegetea rolului fiecdrut aminoacid dia ambete tancuc (de tip alfa saa heta) precizdandu-se care dinire et gi hemoglobine68 participa la legarea globinei de fier, la legarea celor patru lan{uri polipeptidice, la legarea oxigenului. Hemoglobinopatiile se impart in doua categorii: a) - calitative - in care anomalia genetica determina structura chimica anormala a molecule: de hemoglobina - vezi tabela 2.3. In aceste cazuri, se inlocuiesc aminoacizi polari cu nepolari sau invers, ceea ce va conduce la modificari ale interactiunilor dintre Hem gi globina, care au drept consecinta perturbari in legarea gi transpotul oxigenului la fesuturi. b) - cantitative - in care anomalia priveste doar rata de sintezd a unuia sau mai multor lanjuri polipeptidice dintre care unele sunt prezente in structura normala. Aceste hemeglobinopatii cantitative se numesc talasemii caracterizate la nivel molecular prin incetinirea biosintezei unuia din cele doua tipuri de lanjuri ale Hb in eritroblastii maduvei osoase (anomalii prezente in bazinul mediteranean). 2.5.1.4 Combinarea hemoglobinei cu gazele Functia escntiala a hemoglobinci este dé a accepta oxigenul, de a-l transporta de la plamani la jesuturi si posibilitatea de eliberare trepta acestuia ugurata de structura sa letramericd. Acest transport se realizeazi pe baza capacitatii hemoglobinei de a forma un compus disociabil - oxihemoglobina - (HbO,). Hb + 0, ===» HbO, tesuturi plimani Sensul tel {ii reversibile este dependent de presiunea par{iala a oxigenului. Se defineste ca "“putere oxiforica" a hemoglobinei volumul de oxigen pe care Kb il poate lega de 100 ml GLOBINA Hemoglobina Oxihemoglobina (Hb) (HbO,) Vig.2.7 Mecanismul formarii oxihemoglobinei69 Legarea oxigenului de hemoglobina se face la nivelul celor patru atomi de fier din Hem, este potenjata de globina si se realizeaza fara modificarea starii,de valenta a Fe care ramane bivalent. Fixarea reversibila a O, la atomul de fier (Fe) s-ar realiza prin eliberarea uneia din legaturile pe care Hemul le stabileste cu globina prin intermediul moleculei de apa, respectiv prin eliberarea unui radical de histidind conform mecanismului (figura 2.7). Capacitatea de legare a oxigenului de catre hemoglobina se reprezinta printr-o curba de saiurare cu oxigen. 80 PROCENTE SATURARE 60 CU 0, 40 ae eee eed 20 40 60 80 100 120 lig.2.8. Curba de saturare cu oxigen a hemoglobinei Procesul de saturare al Hb cu O, are un aspect sigmoid datorité fuptului ca Hb este © proteind oligomera formata din patru lanturi polipeptidice si patru molecule de Hem, fiecare putand sa lege o molecula de Hem, Venomenul de oxigenare al hemoglobinei se manifesta ca un "pliman molecular", a de hemoglobina schimbandu-si configuratia cu fixarea gi eliberarea oxigenului. Fixarea O, pe un lanj alfa determina modificari conformationale discreté si printr-o anumita orientare a sarcinilor determina o labilizare a lanqului imediat invecinat c: pregatit pentru a accepta 0 molecula de oxigen. Vom ilustra modificarea conformationala prin teccrea de la forma indicata prin © la forma indicata prin (J. ° 0, + Or © este, Fixarea O,de catre un lant a conduce la © modificare dicreta, conformational care la rindul ci determina modificarea celuilalt lan} - lanjul 8.Modificarea conformatici catenci a creste afinitatea acestcia pentru O,, Hemul catenei 6 fixdnd 0 a doua molecula de O;. Oxigenarea complet a subunitafii a8 asociata cu modificarile conformationale respective, va determina 0 modificare conformational’ si a celorlalte dou lanturi ale celuilalt dimer, care va deveni apt pentru acceptarea a inca doua molecule de oxigen, ceea ce va duce in ultima etapa la saturarea hemoglobinei [P] L Reactia globala poate fi privita in cele patru etape sui cchilibru de oxigenare diferite: cesive avand constante de 0, 0; 0, 0, Hb === HbO, ==—=—=* HbO,z=——* HO —— HO, Din interpretarea acestui proces cooperativ s-a ajuns la concluzia ca prima molecula de oxigen se retine lent, a doua si a treia mai usor, iar a patra de cdteva sute de ori mai rapid Combinarea gradata yi controlata a hemoglobinei cu O, precum gi existenta unor forme partial saturate cu oxigen, permite oxigenarea tuturor cclulelor indiferent de presiunea de oxigen existent la nivelul lor. Acest mecanism secvential este in concordan{a cu profilul sigmoidal al curbei de saturare a Hb cu O,. In afara de O,, Hb se mai poate uni reversibil si cu CO cu care se combina de 220 de ori mai usor decat cu oxigenul, formand carboxihemoglobina, mai stabila decat oxihemoglobina. Daca 50% din hemoglobina eritrocitara se afla sub forma de carboxihemoglobina apar ameteli, cefalee, iar daca procentul de carboxihemoglobina cresie in continuare apar intoxicatii mortale, deoarece functia respiratorie a hemoglobinci este blocata. Datorita faptului ca fixarea CO pe componenta porfirinica a hemoglobinci reversibila, oxihemoglobina poate fi refacuta prin ridicarea presiunii oxigenului; asa se explica aplicajia terapeutica in intoxicatii cu oxid de carbon ‘prin terapie cu oxigen, la presiune ridicata. Important pentru actiunea de prevenire primara a unor procese degenerative este si observatia ci la fumiitori concentratia CO in sange poate determina formarea de pana la 10% carboxihemoglobina in sange Ambele combinatii, oxi si carboxihemoglobina, se pot transforma prin desfacerea oxigenului, respectiv oxidului de carbon, simultan cu o oxidare a ionului feros la feric, intr-un compus denumit methemoglobina (hemiglobina) ce nu mai poate exercita functia le71 capitald a hemoglobinei - transportul de oxigen. In eritrocitul normal hemoglobina atinge concentrajia medie de 1% fiind mentinuta la acest nivel in special-prin actiunea NADH methemoglobin reductazei (NADH diaforazei). Deficienja enzimei produce methemoglobinemia familiala. O serie de medicamente apartinind celor mai diferite clase farmacodinamice, pot produce la persoanele normale o cantitate de methemoglobina care depgeste capacitatea reductazelor existente de a mentine Hb in stare redusa: @ - antipiretice si analgezice: paracetamol, fenazol, chinina; @ - agenti antibacterieni: sulfamide, cloramfenicol; - agenti antimalarici: primachina, pamachina, chinina; Hemiglobina (Methemoglobina) Fig.2.9 Combinatiile hemoglobinei cu gazcle # — dermo prepa Combinajiile dintre hemoglobina si gaze sunt prezentate in figura 2.9. Prin fixarea CO, la © grupare-NH, libera a globinei cu formarea unui compus disociabil de tip carbaminoderivat ¢: KMaQ,, pirogalol, benzocaina. R- NH, + CO,===* R - NH - COO" + Ht sl reactic reversibild se bazeaz’i proprietatea Hb de a transporta CO, de la fesuturi unde presiunea partiala a acesteia este mare - la plimani unde CO, este expirat Eliminarea prin plamani a CO, va determina 0 crestere a aciditatii ceea ce va fa afinitatea Hb pentru oxigen sa creasca. Acest proces este strict dependent de intensitatea proceselor oxidative din organism, deci de consumul de oxigen. Bioxidul de carbon format in timpul catabolismului glucidic reactioneazd spontan cu apa formand acidul carbonic (H,CO,) proces catalizat de anhidraza carbonica (Zn’* dependenta). e ca 5.1.5 Interactiunea reglatorie dintre acidul 2,3 - DPG si Hemoglobina Afinitatca hemoglobinei pentru oxigen este dependenté si de concentratia unor compusi fosforici ca ATP gi in special acidul 2-3-difosfogliceric (2,3 - DPG). Sinteza de acid 2,3-DPG implica acjiunea enzimei 1,3 bisfosfoglicerat mutaza care transforma ireversibil acidul 1 ,3-bisfosfogliceric in acid 2,3-DPG.72 20 (20 SOPO3H OH | ane, 4,3. DPG | H—C —OH ——MUTAZA _ H-C-O-PO3H) | HC —OPO5H, H,C-O-PO3H, [acio 1,3-o0P6] [acto 2,3-pe6 | In eritrocitele umane acest ultim compus are aceeasi concentratie moleculara cu Hb reprezentand de cca. 4 ori concentratia moleculara a ATP. Prin fixarea in eritrocitele umane a acidului 2,3-DPG pe molecula de hemoglobina scade alinitatea acesteia pentrd oxigen. Aceasta-actiune constituic un mecanism prin care critrocitul isi regleaza activitatea gi functia de transport a oxigenului asigurand alimentarea {esuturilor cu acest gaz in condifii exterioare defavorabile, ca de exemplu altitudine ridicata, sau scaderea numéarului de eritrocite circulante. In hipoxie pH-ul eritrocitar joacd un rol important in reglarea nivelului acidului 2,3-DPG Hipoxia (lipsa de oxigen) conduce la hiperventilatie cu eliminare crescuta de CO, ceea ce are drept urmare starea de alcaloza cu cresterea pH-ului intraeritrocitar si concomitent scade concentratia acidului 2,3-DPG liber prin legarea acestuia cu dezoxihemoglobina. Alcalinizarea intracritrocitara duce.la 0 crestere a ratei glicolitice preponderent prin actiunea fosfofructokinazei (PFK) care conduce la ridicarea concentratiei de acid 2,3-DPG. Deoarece enzima 2,3-DPG - fosfataza este inhibata prin cresterga pH-ului, aceasta modificare constituie incé un factor de crestere a rezervei de acid 2,3-DPG in hipoxie, Cresterea concentratiei de 2,3-DPG, ce nu trece prin membrana eritrocitara ca si scaderca pl ului intracclular determina schimbari ionice prin echilibrul de membrana Donnan (fig 2.10) ———-—— Se no) Desfacerea p-2-3-DPG Fosfatazal ~»23-DPG 1 ' 1 ) Hiperventilatie --sangurt fis Hi IPOXTE ae coe a { A b 23Ditosio- | AN 1 | Dezoxihemoglobna |—»Glicerat |» 2-3-DPG-Mutaza | | | liber oY So” | DIFOSFOGLICERAT 23. ig.2.10 Inductia prin hipoxie a acidului 2,3-DPG eritr73 Rata de sintezi a 2,3-DPG revine la normal, iar variatiile de pH eritrocitar influenteaza totodata si afinitatea pentru oxigen a hemoglobinei. Cresterea pH-ului intraeritrocitar deplaseaza curba de saturare cu oxigen la stanga in limp ce cresterea concentratiei de 2,3-DPG determina insa o deplasare a curbei de saturare spre dreapta. Efectul 2,3-DPG prezinta un mare interes pentru o seric de procese fiziologice, patologice gi in conservarea sangelui, ca de exemplu comparativ cu HbA, hemoglobina fetala HbF leagd mai putin 2,3-DPG. O problema interesanta in fiziologia respirajiei, este mecanismul de adaptare al persoanelor care igi schimba locul de la 0 altitudine Ia alta. Deplasarea de Ja nivelul marii la altitudine ridicata este insojita de o scadere a afinitatii fata de oxigen concomitent cu creyterea nivelului acidului 2,3-DPG din eritrocite gi invers in cazul coborarii locuitorilor de la munte Ja nivelul mari. 2.5.1.6 Mioglobina Mioglobina este cromoproteida care coloreaz in rogu muschii striati, fiind denumita si pigmentul respirator al mugchilor. Ca structura si functie prezinta similitudini cu Hb de care se deosebeste prin faptul ca este formata dintr-o singura catena polipeptidica si o singura grupare Hem. Catena polipeptidica a mioglobinei contine 153 resturi de aminoacizi si are 0 masa moleculara de 17.000. Studiile cristalogratice au permis elaborarea unui model al mioglobinei care releva faptul ca lantul polipeptidic este pliat intro forma de ghem compact (Kendrew) care se aseamana cu a lanturilor alfa sau beta ale hemoglobinei (vezi fig 2.11 A). In cadrul moleculei exist’ 8 segmente majore dispuse in alfa helix spre dreapta (75%); liniile duble indicé segmentele cu structura alfa helix, iar cifrele arata numarul resturilor de aminoacizi din Gecare segment (veri fig.2.11 B). extremitatea ,N”_N termincla Fig.2.11 Structura mioglobinei A - Structura tridimensionali B -Structura schematicé a mioglobinei74 Deoarece confine 0 singuré moleculi de Hem, mioglobina are o capacitate limitata de a accepta oxigen, din care cauza principalul rol al mioglobinei este acela de a constitui un depozit de oxigen in muschi, care se utilizeazd in cursul unui efort fizic prelungit. Curba de saturare cu oxigen a mioglobinei are aspectul unei hiperbole datorité faptului ca mioglobina spre deosebire de Hb are un singur lant polipeptidic. | a | PROCENTE SATURARE 60: cu O, a a ia 0 2 40 60 80 100 120 —— PRESIUNEA 02.(-mm Hg} Fig.2.12 Curba de saturare cu oxigen ale mioglobinei gi hemoglobinei privite comparativ 2.5.1.7 Citocromii Citocromii fac parte din categoria cromoproteidelor porfirinice cu rol respirator. Au fost pusi in evidenta de Mac-Munn (1866) si caracterizati de Lord Keilin (1926) care a corelat functia lor cu procesul de respiratie celulara. Citocromii participa la reactiile biochimice de oxido-reducere prin transfer de electroni Citocromii au proprietatea de a absorbi radiatiile luminoase de diferite lungimi de unda si dupa dispozitia benzilor de absorbtie intre 549-599 nm, au fost clasificati in a, b sic. Se considera c& sunt citocromi acele substante care au ca grupare prostetica Hem stal caror mecanism de actiune se bazeaza pe posibilitatea de a-si schimba reversibil valenta fierului, din ion feros in ion feric si invers (in langul respirator). Ey Toti au activitali enzimatice fiind citocromoxidaze, oxigenaze sau hidrolaze, iar funefia lor este in majoritatca cazurilor, aceca de transportori de electroni sau hidrogen. Citrocromul C este cel mai cunoscut - arc funetia de a reoxida coenzima Q din lanyul transportorilor de hidrogen si clectroni. Este singurul in care legatura dintre proteina si Hem se face covalent prin intermediul cisteinei.75 CH, CHy-CH)-$—CH,— {el wl. /3| N aa | des Tl a N>FeeN HOOC—H,C —H,C ¢ | \ ye —cH—| Hose’ \== cH F——*CcH: (He i by COOH Fig.2.13. Structura citocromului € Inima este organul cu cel mai ridicat confinut in citocrom C,procentul descrescand in ordinea: rinichi, ficat, muschi Tabela 2.4. Compusi heminici Nr_ | Compusii M Localizare Funefie biologica 1. | Hemogiobink 68.000 | Fritrocite Transportor de O, 2. | Mioglobina 17.000 | Muschi Depovit de 3. | Citrocrom a, 180.000} Membran% mitocondriala | Reoxidear’ citocromul C 4. | Citrocrom b 28.000. | Mitocondrit Transport de electroni 5. | Citrocrom ¢ 12.000 | Mitocondrii ‘ 2 6. | Citoctom Piso 40.000. | Reticul endoplasmatic sf 2 4 7, | Catala’ 240,000 | Peroxizomi Degradare HO; 8. | Peroxidave 44.000. | Peroxizomi H,0,*H,O + 1/2 0, In tabele 2.4 sunt prezentali principalii compusi heminici, localizarea gi functia lor biologica. Citocromul P-450 isi datoreste numele absorbtiei sale caracteristice la Jungimea de unda de 450 nm, Este localizat in microzomi si are o participare directa in procesele de oxidare gi de hidroxilare a sterolilor, acizilor biliari si medicamentelor cu nucleu aromatic. Citocromut a, - sau citrocromoxida: cu cel mai ridicat potential redox, ceea ce oxideze citocromul C redus. este componentul final al lanjului respirator, permite si reacioneze cu O, molecular si sa Citocromoxidaza este singurul citocrom care necesita cupru legat covalent de apoproteina i nu poate fi indepirtat fra denaturarea reversibila a proteinei.76 2.6 Nucleoproteide 2.6.1 Caracterizare generali Nucleoproteidele sunt heteroproteide alcatuite dintr-o componenta de natura protei cu proprietati bazice si o componenta prostetica constituita din acizii nucleici. Dintre tipurile de heteroproteide, nucleoproteidele prezinté cea mai mare masa moleculara datorita caracterului macromolecular al componentei prostetice - acizii nucleici. Au fost extrasi din puroiul chirurgical de catre Miescher (1868), dar sunt intalnite in absolut toate celulele de origine animala, vegetala, bacteriana, precum gi in virusi. Dupa natura chimicd a gruparii prostetice nucleoproteidele se clasifica in ribonucleoproteide dacd gruparea prosteticd este ARN si deoxiribonucleoproteide daca gruparea prostetica este ADN. Ribonucleoproteidele sunt localizate in citoplasma celulara cu precadere la nivelul ribozomilor gi intr-o anumita proportie, in nucleul celular; deoxiribonucleoproteidele sunt localizate in nucleul tuturor celulelor si reprezinta componente structurale ale cromozomilor. Acizii nucleici sunt biomacromolecule de importanja biologica fundamentala, care detin un loc aparte in organizarea, functionarea materici vii si prezinté urmatoarele caracteristici generale: @ - Acizii nucleici si proteinele constituie pivotul intregii biologii, care polarizeaza si determina ansamblul activitatilor biochimice st funcfionale caracteristice manifestarilor vitale; ® ~ Acizii nucleici detin o dubli functie biologica esentiala deoareve constituic: a) suportul molecular pentru pastrarea gi transmiterea informatici genetice; b) mecanismul prin care controleaza gi directioneaza biosinteza proteinelor; @ - Acizii nucleici reprezinta baza moleculara pentru: a) diferenticrea gi reglarea celularai; b) constanja replicarii celule ¢) modificarile naturale sau induse in constitutia genetic’ a unui organism; d) reglarea schimburilor metabolice ale unci celule datorate unci necesitati fiziologice sau unei variatii a mediului ambiant; e) men{inerea si perpetuarea unui organism viabil; @ - Acizii nucleici sunt biomacromolecule ubicuitare ale materiei vii; @ - In acidul deoxiribonucleic (ADN) se afld inscris programul genetic al dezvoltarii oricarui organism si constituie baza biochimica moleculara a evolutici, deoarece mutatiile reprezinta alterari precis localizate in structura ADN; @ - Acizii nucleici sunt biomacromolecule care posed’ mase moleculare ce acopera un spectru larg cuprins intre 10* si 10 daltoni; - Pluxul de informatie in lumea vie, esta exprimat prin "dogma centrali a geneticii moleculare" care reda relatia celor trei procese fundamentale (replicare, transcriptie, translatie) prin care se asigura continuitatea geneticd a organismelor. In studiul acizilor nucleici si-au inscris numele o serie de cercetatori cum ar fi: Casperson, Brachet, Davidson, Chargraff, Crick, Watson, Holley, Sutherland, George Palade (laureat al premiului Nobel - 1975).Tt ay Transcriptie ARN Translatie PROTEIME | { (Transcriere) (raducere) Ma ~Replicare -Duplicare [Nucleu] [Citoplasmd] [Ribozomi|] .14 Dogma centrala a geneticii moleculare 2.6.2 Componentii structurali ai acizilor nucleici Prin hidroliza acidd sau enzimatica au fost izolaji si identificaji componentii nucleoproteidelor NUCLEOPROTEIDE ¥ “ACIZI. NUCLE polinucleotide Ribo eHistone nucleaze-—=] Y Deoxiribo~ [ MONONUCL EOTIDE | Fosfataze | me | [NUCLEOZIDE} | J |_Nucteozidaze | BAZE AZOTATE @ “SOZE is _s eo. Purine Pirimidine Riboza Deoxiriboza ae SIAL ATEN ROSESE oe SS 5 Degradarea nucleoproteidelor pe cale chimica78 Din schema de degradare se constati c& cele doud componente de baza ale nucleoprotcidelor sunt acizii nucleici gi o holoprotein’. Acizii nucleici sunt biopolimeri formaji din unirea unui mare numar de nucleotide care Ja randul lor sunt formate din baze azotate pentoze gi acid fosforic. 2.6. Componenta proteica Componenta proteica a nucleoproteidelor face parte din grupa proteinclor bazice: protamine si histone. Caracterul bazic pronuntat este datorat conjinutului lor in arginina, lizina, histidina. Protaminele au o masa moleculara de 5000 si un pH situat in domeniul puternic alcalin. Catena polipeptidica a proteinelor se formeaza prin repetarea unui tetrapeptid al argininci inte care se includ resturi de aminoacizi neutri. Acest lant polipeptidic infasoara in aga fel clicea ADN incat arginina formeaza legaturi de tip salin cu gruparile fosfat ale ADN. Histonele s-au identificat in nucleoproteinele din nucieii celulelor. Se cunosc doud puri de histone: a) unele cu masa moleculara 10000. bogate in lizind si arginina fiind lipsite de metionina si histidina; b) altele cu masi molecular’ 20000 bogate in lizina gi arginina, dar contin metionina gi histidina. Legitura care se stabileste cu acizii nucleici este o legatura de tip salin ca si la proteine. 2.6.2.2 Pentoze Pentozele care intra in structura acizilor nucleici sunt reprezentate de riboza in ARN yi 2-deoxiriboza in ADN care se gasesc in forma ciclica 8 furanozica. | | H-G=0 | H-C-H H-C—0H { H—+C—-OH | H H,C—OH OH OH OHH | [Riboza] — P-D-Ribofuranoza 2-Deoxi P-D-2-Deoxt Riboza Ribofuranoza Legarea cu bazele azotate se realizeaz’ prin -OH semiacetalic din pozitia 1. 2.6.2.3 Baze azotate In constitujia chimica a acizilor nucleici intra diferite baze azotate care deriva de la doua tipuri de heterocicluri: pirimidina si purina Bavele pirimidinice principale prezente in mod freevent in structura acizilor nucleici sunt: Citozina (C), Uracil (U), Timina (1)79 ¢ pei. NG CH t 2. 6 | HOA | | pirimidina | { Y ! Y NH, 9 9 N HN HN CH, sh, et ea H H H citozina uracil timina (2oxi, 4aminopirimidina) {2,4-dioxipirimidina) (3 4 -dioxi, S-metilpirimidina } Bazele purinice principale sunt: Adenina (A) si Guanina (G). pee - - ee | NH, 3 0 | | “ N. N N | u \ a PURINA-—___ HN | H wh | N: N 2 iy NI | H oH | ADENINA GUANINA | L 6 - AMINOPURINA 2-AMINO-6-OXIPURINA | Distributia bazelor azotate in structura acizilor nucleici este prezentata in tabela 2.5. Tabela 2.5 Bazele azotate din acizii nucleici ARN ADN Uracil ‘Timina Citozina Citozina Adenina Adenina Guanina Guanina Se observa ‘4 citozina, adenina si guanina sunt comune structurii ambelor tipuri de acizi nucleici, uracilul se g2iseste numai in ARN, iar timina numai in ADN80 Bazele pirimidinice si purinice (cu exceptia adeninei) prezinta fenomenul de tautomerie pe baza caruia intre forma ceto(lactam) si forma enol(lactim) se stabileste un echilibru care este dependent de pH-ul mediului; la pH-ul fiziologic este predominanta forma Jactam 0 OH HN N Lactam —> Ai See ~<-Lactim 07 Sn H HO Ny [URACIL] Forma lactam fiind predominanta, bazele azotate stabilesc legituri covalente de tip N-glicozodic intre atomul de N din pozitia 1 a ciclului pirimidinic sau atomul de N din pozitia 9 a ciclului purinic si hidroxilul semiacetalic C, al ribozei si 'respectiv al 2-deoxiribozei Bazele azotate prezinté un maxim de absorbtie in ultraviolet intre 251-271 nm (260 nm) ceea ce permite determinarea cantitativa prin spectrofotometrie in ultraviolet a acizilor nucleici. 2.6.2.4 Nucleozide Nucleozidele sunt combinatii constituite din doud unitati chimice, 0 baza azotata si 0 pentoza (riboza sau deoxiriboza) i + Pentoza Nucleozid = Baza azotat ein care otul din Nucleozidele sunt considerate N-glicozide ale bazelor pirimidinice sau purin’ > sabileste o legatura N-Glicosidica intre hidroxizilul semiacetalic al ozei si a pozifia 1 al bazelor pirimidinice si azotul din pozitia 9 al bazelor purinice. Tabela 2.6 Exemple de nucleozide Baza azotata | Ribonucleozide | _2-deoxiribonuckeozide Uracil Uriding : Timin’ - Deoxitimidind Citosind Citidin’ Deoxicitidina Adenina Adenozina Deoxiadenozina Guanin’ Guanozin’ Deoxiguanozina Nucleozidele pot fi considerate ca produsi de hidroliz partial’ a nucleotidelor si se clasifici in doua categorii: ribonucleozide si deoxiribonuclozide. Datorita prezen{ei ozelor, nucleozidele au o solubilitate in apa mai mare decat bazele81 respective: pot fi hidrolizate chimic sau enzimatic sub actiunea unor nucleozidaze cliberand componentele lor, Reprezentantii principali ai fiecdrei categorii sunt indicati in tabela 2.6. [ ° NH | | | i | | | H HAT | | H H ; | OH OH | URIDINA DEOX/ADENOZINA leotidele Nucleotidele sunt unitatile monomere structurale ale polinucleotidelor respectiv ale macromoleculelor de acizi nucieici. Nuclvotidele rezulta prin hidroliza partiala a acizilor nucleici sub actiunea enzimelor denumite - nucteaze. Nuclcotidele pot fi definite ca esteri fosforici ai nucleozidelor, in care acidul fosforic poate fi esterificat cu una din grupirile OH ale pentozei. Deci in structura nucieotidelor intra trei componenti: Nucleotid = Baza azotaté + Pentozd + Acid fosforic In nucleotide distingem doua tipuri de legaturi: N- glicozidicd si legdtura esterica. Natura pentozei criteriul de clasificare al nucleotidelor in doua categorii: ribonucleotide care conjin D-riboza si deoxiribonucleotide care contin 2-deoxi-R-D-riboza. In ribonucleotide, acidul fosforic poate fi esterificat la gruparile -OH ale ribozei din pozitiile 2’,3” si 5’, iar in deoxiribonucleotide la grpirile -OH din pozitiile 3° si 5’ ale fi-deoxiribozet. In urma hidrolizei menajate a ADN sau ARN se ob{in atat nucleozid-5’-monofosfati, cat si nucleozid-3’-monofosfali, fapt care demonstreazd cA acestia sunt unit&tile structurale ale acizilor nucleici. Nucicotidele predominante in celula in stare libera sunt nucleozid-5’- fosfatii care indeplinesc importante roluri metabolice. Structura generala $i nomenclatura principalelor ribonucleotide si deoxiribonucleotide sunt consemnate in tabela 2.7,82 Tabela 2.7 Principalele ribonucleotide si deoxiribonucleotide [ baz H,03P-O-CH, | azotata __DEOXIRIBONUCL -EOTIDE. baza H,0,P-0-CH, — [9z0tata nonofosfat UMP Citidin-5’-monofosfat CMP Adenozin-5’-monofosfat AMP Guanozin-5’-monofosfat GMP Deoxitimidin-5’-monofosfat, dTMP Deoxicitidin-5’-monofosfat,dCMP_ Deoxiadenozin-5'-monofosfat,dAMP_ Deoxiguanozin-S'-monofosfat,dGMP 2.6.2.6 Nucleotide naturale libere Un nucleotid important care nu face parte din structura acizilor nucleici este 3°5’- AMP-ciclic (acid adenozin-3’ ,5’-monofosfat ciclic) care prezinté o legatura fosfodiester interna (3° —S’) Nucleotidul Adenovin -3’,-5,mono fosfatul ciclic (AMP ciclic, AMPc) mediaza actiunea a numerosi hormoni (mesageri primi) care nu traverseaza membrana celulara. Prin interactiunea primului mesager (hormonul) cu enzima membranara adenilat ciclaza, asupra careia actioneaza, din ATP ia nastere adenozin monofosfatul ciclic ) AMPc care este considerat_ mesagerul secund al actiunii hormonilor respectivi in celula, el realizand prin fosforilarca reversibila a unor enzime activarca sau inactivarca acestora (weoria lui Sutherland). Actiunea hormonului (mesagerul prim) poate fi suprimati prin hidroliza AMPe sub actiunea fosfodiesterazei. Q=-P——0 | OH OH 3,5'- AMP-CICLICGuanozin — -3’,5’-monofosfatul (GMPe)se comporta de asemenea ca un OH important mesager secund In vederea efectuarii unor reactii de transfer, este necesari activarea prealabila @unor molecule ce se realiveaza prin cupiarea acestora cu un nucleozid; astfel metionina este activalaé ca S-Adenozil, metionina (SAM), giucoza ca uridin difosfatglucoza (UDP diacilglicerclul ca citi diacilglicerol (CDP - diacilglicerol) 2.7 Nuclco trifosfati cu rol de compusi macroergicé Nucleoticiele pot contine in molecula lor waul sau mai multi radicali ai acidului ontofosioric, numarul acestor radicali constituind un criteriu de sub clasificare a nucleotidelor84 in: nucleotide monofosfat XMP, nucleotide difosfat XDP, nucleotide trifosfat XTP (X reprezinta diferite nucleotide). Exemplul tipic pentru acest tip de nucleotide il constituie AMP (adenozin ~ monotosfat), ADP (adenozin-5’-difosfat), ATP (adenozin-5’-trifosfat) prezentate alaturat. NH. | | ou \, J | OH OH OH | | | i i HO—P~O —P~0-—-P—0 —Chp g | 1 ! 0 0 Scindarea hidrolitica a ATP in dependenta de enzimele respective poate avea loc in doua moduri: ATP ———+ ADP + Pi (AG 7300 cal/mol) ATP —— AMP + PPi (4 G = -7300 cal/mol) Pi = acid fosforic; PPi = acid pirofosforic. Intracat scindarea [—— froliticd a celor doua logaturi fosfat din ATP este insotitit de o seadere a energiei libere AG -7300 cal/mol, se poate considera ca Jegaturile oi fosfat 2 si 3 precum si | OH OH OH 07 SN si 2 sunt legituri | | | 5 macroergice gi se noteaza HO— P~.O—P~ 0—P—O—CH, prin simbolul —. y J ‘Toate procesele y Y bioenergetice se 0 0 0 realizeaza in strdinsd corelajie cu interventia unui grup de biomolecule OH OH specializate, — denumite _ compusi macroergici care participa la evoluyia luxului de energie in cadrul celulei vii. Hidroliza acestor compugi caracterizati printr-un inalt potential energetic este insofita85 de o descrestere a energiei libere AG > -7000cal/mol ATP-ul poate transfera acidul fosforic ribonucleotiddifosfatilor uridilici, citidilici si guanilici de tipul: ATP+XDP*ADP+XTP unde X poate fi deci |; unidina,citidina sau guanozina. | CITIDIN- S-TRIFOSFAT Ribonucleotid trifosfatii cTP (UTP, CTP si GTP) servese nu numai in calitate de monomeri pentru sinteza ARN ci si in calitate de compugi OH OH OH mserdersio | | | 5 UTP transfer restul WO=Panp GCCUCAAGCAUCGCUUUCAACCUUA aa U os ( et hig 2.23 Structura ARN monocatenar95 ~ ARN mesager (ARNm) “ARN de transfer sau solubil (ARNt); 4 ARN ribozomal (ARNr). . Aceste tipuri de ARN se deosebesc prin anumite caracteristici generale: masa moleculara (M), coeficient de sedimentare (S), compozitia in baze azotate si numarul de nucleotide $i procentul de reprezentare. @ ARN-mesager (ARNm). Ludnd in considerare faptul ci molecula de ADN este localizatt in nucleu, iar procesul de biosintez’ al proteinelor se desfigoara in citoplasma Jacob si Monod au postulat existenta unui intermediar care transmite mesajul genetic din nucleu in citoplasma. Acest intermediar este un tip de ARN denumit ulterior ARN-mesager, ‘are este sintetizat in nucleu pe matrita de ADN. Moleculele de ARNm sunt molecule monocatenare liniare, rezultatul unui proces enzimatic de transcriere a secventei nucleotidice de pe ADN, cu deosebirea ca timina din ADN este inlocuita cu uracil in ARNm. Rezulta astfel cd bazele azotate din secvenja ARNm sunt complementare cu bazele azotate ale uneia din catenele ADN care functioneaza ca un tipar pentru sinteza din ARNm. Genele care codifica proteinele sunt intrérupte de secvente de ARN necodificatoare numite introni; secventele codificatoare separate prin introni poarta numele de exoni, Segmental de ADN compus din exoni si introni care este wanscris intr-un ARNM nuctear constluie o unitate de wanscriere. Prin procesul de transcriptie informatia genetica couificata in secventa de nucleotide a ARN, este transmisa in sceventa de nucleotide a ARNm. Functia biochimica majora a ARNm este aceea de a transmite la nivelul ribozomilor citoplasmatici mesajul preliat de a ADN i'de a servi ca tipar (matrice,modél). pentru biesinte/a prateinetor Timpul de supravictuire a ARNm in celula este variabil; astfel ARNm bacterian are 0 vial& scurta (2-3 minute), in timp ce ARNm Ja eucariote are o viala de ordinul orelor. Dupa ce serveste la sinteza citorva zeci de proteine este degradat de nucleaze. 2) ARN de transfer (ARN1). Acizii ribonucleici de transfer sunt poliribonucleotide cu molecule mai mici decdt ARNm: (70-90 nucleotide) sunt monocatenare gi au un procent de baze complementare mai mare decat alte specii de ARN. Raportul A + G/U + C este aproximativ egal cu 1. Speciile moleculare de ARNt sunt solubile in citoplasma gi neasociate cu proteinele. O tasatura caracteristica tipurilor de ARN este existenja unui numar mare de baze atipice “baze minore”. Se presupuné ca aceste baze intervin in stabilizarea conformatiei ARNt favoriznd interactiunile intre acele segmente ale catenci poliribonucleotidice care sunt complementare si care apar ca regiuni spiralate. ARNt prezinti o conformatie lobatai de "foaie de trifoi" aviind patru zone de perechi complementare gi patru necomplementare, expulzate ca bucle (vezi fig.2.24)96 —-- YF Amino acid ‘ lop oop ¢ ow. La capatul 5’terminal cei mai multi ARNt au restul acid guanilie, iar la capatul 3° loli au secventa nucleotidica -CCA Functia biochimica a ARNt const in legarea specifica a diferijilor aminoacizi liberi din citoplasma si transferul individual al acestora la nivelul ribozomilor. Pentru ficcare din cei 22 de aminoacizi din molecule de peoteine exist cel putin un ARNI specific. ARNt functioneaza vacceptori pentru diferiji aminoacizi gi totodata ca molecule adaptor care ordoneazd fiecare aminoacid inu-o secventa precisa in molecule de proteine pe baza recunoasterii mesajului genetic (informational) continut in secventa de nucleotide a ARNm Legarea aminoacidului se face la restul adenilic din secvenja CCA gi consta in stabilirea unei legaturi esterice formand complexul aminoacil- ARNt. La capatul buclei inferioare se gasesic asa numita zona anticodon (o secven{a de tret nucleotide) care variaza in functie de natura ARNt Portiunea anticodon din ARNL este complementara succesiunii de nucleotide din ARNm denumita codon ce codifica aminoacidul iransportat de ARNt si ca atare cele doua regiuni pot stabili legaturi de hidrogen. In lobul 1 exist o anumita seevenya nucleotidicd care asigura legarca la ribozom a complexului Aminoacil-ARNUcIn lobul IV exista o secventa nucleotidica care recunoaste si se leaga specific la aminoacil-ARNt-sintetaza ci 4 care inca ARNE cu un aminoacid specific activat97 ARN ribozomal constituie tipul de ARN cel mai abundent (75% din totalul ARN celular) si cel mai stabil din punct de vedere metabolic. Macromoleculele de ARN sunt flexibile si deformabile care contin zone dublu catenare intrerupte de zone monocatenare Acizii ribonucleici ribozomali nu se gasesc in stare liber ci agregati cu proteine diverse si lipide constituind particule ribonucleoproteice denumite ribozomi (descoperiti de George Palade laureat al Premiului Nobel 1975). Acestia sunt particule citoplasmatice (agregate multimoleculare) localizate pe reticulul endoplasmatic gi contin 65% acizi ribonucleici si 35% proteine. Ribozomii constituie sediul biosintezei proteinelor; aceste unitati mecanochimice permit conlucrarea ARNm, ARNi, ARNr in vederea desfigurarii procesului de sinteza a proteinelor. Astfel ribozomii au rolul de a contribui la traducerea mesajului adus de la ADN de catre ARNm, mesaj care comanda modul de inlanfuire a aminoacizilor in proteinele biosintetizate. Structural, fiecare ribozom este un dimer format din doud subunitati care difera intre ele prin coeficientul de sedimentare (S). Ansamblul format din mai multi ribozomi la care se afla atagat ARNm constituie un polizom. Legarea subunitafii mari (60S) la complexul ARNm-subunitate mica (40S) determina formarea ribozomului functional. ARNm si ribozomii se pot deplasa unul in raport cu celdlalt, ribozomul glisand pe ARNM BUNITATI | 40s 60s Fig.2.25 Reprezentares ale unui po schematica a subunitatilor unui ribozom 80S om Ribozomii din celulele eucariote au mase moleculare de ordinul 10° si un coeficient de sedimentare de 80S; disociaza in dowa subunitati (408 si 60S) care constau din specii moleculare diferite de ARNr. ARNr din fiecare unitate ribozomala esie combinat cu un numar diferit de tipuri de protcine (fig.2.26). Subunitafile ribozomale se afi intr-un echilibru de asociere-disociei celular de factori de natura proteica: reglat la nivel98 Nat K+ 80S ===" 408 +608 Me" RIBOZOM } 80S | i PROTEINE RN in38) Fig.2.26 Schema combinarii speciilor moleculare din ARNm cu diferite proteine (dupa M.Serban) Astiel ARNr din subunitatea 40S esie combinat cu 21 tipuri de proteine, iar ARNr din subunitatea 60S este combinat cu 35 tipuri de proteine diferite gi toate au un caracter bazic. Acestor proteine ribozomale li se atribuie un rol in mecanismul de traducere a mesajului genetic adus de ribozomi de citre ARNm precum si asigurarea functionalitatii gi conformatiei fiecarui ribozom. Proieinele ribozomale participa la modificarile conformationale in cursul biosintezei fie proteice, proces in care atat Janjul polipeptidic format cat si catena ARNm tebuie s translocate de-a lungul ribozomului. Din acest punct de vedere, ribozomii pot fi considerali ca sisteme mecanochim aceeayi categorie de biostructuri ca actomiozina din muychi99 ‘Tabela 2.8 Caracteristici generale ale tipurilor de ARN racteristica ARNm ARNt ARNr T IL it Coeficient de 6-25 4 5 18 28 sedimentare Masa moleculara 25*10°-1*10% 20-30*10* 3,5*108 | 5,5*10° 1,1* 10% Numar de 75-3000 15-90 100 1500 3100 nucleotide Speci 10-10 60 moleculare Structura Monocaten’ liniari_ | Monocateni partial | Monocatend pliata neordonatt dublu elicoidala Repartie Citeplasma Citoplasma Citoplasma % din total ARN 5 10-20 75-80 2.6.2.14 Acizii nucleici virali Baltimore, Dulbeco si Temin au primit premiul Nobel pentru medicina in anul 1973 pentru studivl virusurilor. Virusurile sunt considerate complexe supramoleculare cu 0 organizare tridimeRSTORal, constituite i acizi nucleici si, proteine. specifice Considerat® WT State Ta Timita dintre viu si neviu, nu posed un metabolism propriu care s& le poat conferi atributul de organism viu Toate virusurile inclusiv bacteriofagii (virusuri ale bacteriilor) sunt nucleoproteine formate dintr-o component’ ADN sau ARN ca material genetic si o componenta proteica. Acizii nucleici virali sunt inconjurati de un invelis (capsida) constituit din agregate de subunitali proteice specifice numite capsomere; componenta proteica’ reprezinta astfel o anvelopa al carui miez il formeaza ADN sau ARN Acidul nucleic specific fiecdrui tip de virus prezinti doua caracteristici: - este purtatorul proprietafii infectante potentiale; - este purtatorul informatici genetice responsabil pentru autoreplicarea virusului in celula infectata. Acidul nucleic viral este codificat atat pentru replicarea sa cat si pentru sinteza inveligului sau specific de molecule protcice, invelis care este esential pentru completarea structuril particulei virale. In funcjie de tipul acidului nucleic pe care il contin, virusurile se clasific’ - din punct de vedere chimic - in dova categorii: virusuri ADN (herpes, tumori maligne) si virusuri ARN (gripa, poliomielita,SIDA). Acizii nucleici virali - fie ADN, fie ARN - contin codificat programul informatiei genetice si se comportd ca nigle cromozomi virali. Avand un aparat genetic propriu, virusurile patrunse intr-o celul& gazda, pot deturna cursul normal al proceselor de biosinteza ale celulei, pe care o obliga astfel sa sintetizeze cu precdere componentele moleculare ale particulei. virale invadate, in detrimenuul componcniclor specifice ale celulei. In asemenca condijii ADN sau ARN virali se atayeaza Ja ribozomii celulei gazda, manifestand prioritate in competitia cu ARNm al acestei celule,100 Acidul nucleic viral, care a ocupat la concurent cu ARNm al celulei gazda, situsurile active de pe suprafaja ribozomilor, actioneazd ca un tipar pentru biosinteza proteinelor invelisului viral, precum gi a unor enzime necesare pentru partile componente ale virusului. Prin acest mecanism, acidul nucleic viral induce transcriptia seeventei sale intr-un ARNm complementar, determinand ulterior waducarea mesajului viral pentru formarea de icine specifice virusului, aceste proteine se asambleaza cu acidul nucleic viral producand noi particule virale. In acest fel, virusul se replica de multe ori intr-un ritm rapid actionand in celula respectiva ca un cromozom de control. Procesul biochimic al multiplicarii virale in celula infectata gi al dereglarii functionarii normale a acesteia se desfagoara in trei etape: 1 - biosinteza acidului nucleic viral; 2 - biosinteza proteinelor virale specifice; 3 autoasamblarea structurii virusului. Aceste procese sunt reglate de insagi cromozomul viral. Structura virusurilor a fost stabilita prin microscopie electronica si difractia cu raze X. Studiul virusurilor si mecanismul multiplicarii virale au permis alegerca si aplicarea unci chimioterapii antivirale adecvate yi eficiente.3.1 Consideratii generale 1.1 Generalitati. Istoric Toate procesele biochimice care au loc in organismele vii sunt guvernate de substante de natura proteica - enzime care au rolul de catalizatori. Acesti catalizatori biologici - biocatalizatori - se incadreaza in definitia clasica data de Ostwald, conform careia "catalizatorii" sunt agen{i care afecteaza viteza unei, reactii chimice si care raman neschimbati la sfarsitul reactici. Data fiind importanta acestor substante, se poate spune ca foarte mult din istoria biochimiei reprezinta istoria conceptiilor despre enzime. Principiile esentiale ale catalizei enzimatice sunt cunoscute gi utilizate de mai bine de doua milenii. Obtinerea vinului, inacrirea laptelui, macerarea carnii -acestea sunt doar cateva procese care au loc sub actiunea unei forje magice, pe care alchimistii arabi o numeau “aliksir". Prima relatare despre enzime ne parvine din sec. XVII, cand Van Helmont descopera ca Ja arderea carbunelui, fermentarea mustului si respiratie se degaje acelasi gaz, pe care-1 denumeste "gaz silvestrae", iar agenwl care provoaca transformarea substan{elor in cursul acestui proces a fost numit “fermentus". Un secol mai tarziu, Réaumur si Spallanzani (1762) fac primele observatii cu privire la actiunca sucului gastric asupra carnii. Lavoisier gi Gay Lussac au aratat ca din fermentatia glucozei, un alt proces enzimatic complex, rezulti numai alcool etilic si CO,. Enzimologia constituie un domeniu al biochimiei care se ocup’ cu studiul enzimelor sub raportul structurii, mecanismelor de actiune gi al participiirii lor la procesele metabolice. Un lung sir de cercetitori gi-au inscris numele in descoperirea, separarea gi caracterizarea a peste 2000 de enzime si care au facut din Enzimologie, unul din marile capitole ale biochimiei moderne (vezi tabela 3.1) 3.1.2 Caracteristici generale ale enzimelor Denumirea de catalizd a fost introdusa in stiinté de Berzelius si dezvoltata apoi de catre Ostwald. Cataliza reprezinta fenomenul de modificare a vitezei de reactie accelerandui desfasurarea prin introducerea in sistemul de reactie a unor substante numite catalizatori, care desi participa in proces si influenteazd viteza lui, raman nemodificate chimic la sfarsitul reactiei. Din punct de vedere al naturii fazei sau a sistemului pe care-] formeaza reactanui si catalizatorul se disting doua tipuri principale de cataliza: omogena si heterogena. Cataliza omogenda se caracterizeaza prin faptul ca atat reactantii, cat si catalizatorul constituic impreuna o fazi omogend gi este caracteristic’ mediilor biologice. Cataliza heterogena se caracterizeaza prin aceca ca reactantii gi catalizatorii constituic un sistem polifazic heterogen. In general enzimele se incadreaza in grupa catalizatorilor microeterogeni. poy £IQG102 Tabela 3.1 Date importante in istoria Enzimologiei Anul Numele cercetatorilor Descoperirea, observatia 1833 Payen si Persoz Descopera diastaza capabild si hidrolizeze amidonul. 1834 Th. Schwann Descoperd pepsina in stomacul animalelor. 1837 J. Liebig si F. Wohler Descopera emulsina care hidrolizeaza amigdalina. 1856 Claude Bernand Descoperd tripsina in sucul pancreatic. 1860 Louis Pasteur Prezinta teoria vitalista. Cerceteaza fermentatia alcoolica, fermentatia acetica, ofetirea vinului 1878 W. Kihne Introduce termenul de enzime. 1894 Emil Fischer Descopera specificitatea enzimatica 1897 F. H. Biichner xtrage zimaza din Sacharomyces cerevisiae 1902 Brown si Henry Studiul cineticii enzimatice. 1913 Michaclis - Menten Cinctica enzimatica. 1926 J. B. Summer Separa ureaza cristalizata din soia. 1929 Fiske - Subarow Izoleaza fosfocreatina din mugchi. 1037 G. Cori Studiaza glicogen fosforilaza. 1043 A. Green, G. Cori Cristalizeaza fosforilaza musculara. 1951 Lynen, Ochoa Ivoleazi enzimele complexului acid gras sintetaza 1961 Jacob, Monod, Changeux | Studiaza enzimele allosterice. 1965 D. C. Phillips Stabileste modelul spatial al lizozimului. 1969 Merrfield, Gutte Sinteza in laborator a primei enzime: ribonucleaza. 1971 Lynen, Stadtman Sisteme multienzimatice in reglarea i metabolismului intermediar. Din punctul de vedere al teoriei catalizei, enzimele se pot caracteriza prin urmatoarele trisaturi generale: @ - actioneaza in cantitati extrem de mici, dar manifesta o actiune extrem de intensa, find cei mai eficienti catalizatori; @ - nu se consuma gi nu se transforma in reactiile catalizate; @ - catalizeazd numai reacjii termodinamic posibile, adica reactii care corespund unei diminuari a energiei libere; @ - orienteaza gi marese vi a reactiilor biochimice determinand scaderea energici de activare a moleculelor de substrat asupra carora actioneaza; - nu modifica starea finala de echilibru a reactiilor, ci m&rese numai viteza cu care se103 realizeara aceasta reactie; @ - intr-o reactie reversibila care conduce la o stare de echilibru, enzima accelereaza numai cele doud viteze de reactie (1 si 2) care evolueaz’ simultan si in sens invers determinand astfel atingerea mai rapida a stirii de echilibru; 1 A+BamC+D 2 @ -enzimele se disting printr-o specificitate a functiei catalitice, determinand atat mecanismul de producere a unui anumit tip de reactie, cat si capacitatea de a recunoaste un substrat sau 0 grupa limitata de substanje; @ - asigura coordonarea, reglarea si controlul proceselor biochimice si participa la reglarea metabolismului celular, 3.1.3 Nomenclatura gi clasificarea enzimelor Nomenclatura si clasificarea enzimelor au fost precizate pe baza criteriilor siabilite de catre Comisia de enzime a Uniunii Internationale de Biochimie (1.U.B.). Clasificarea enzimelor se bazeaza pe un sistem numeric codificat, fiecare enzima fiind identificata prinu-un numar de ordine si un nume sistematic. Conform acestei clasificari, sistemele enzimatice cunoscute pana in prezent, pot fi impartite in functie de tipul reactiilor pe care le catalizeaza, in ase Clase; prima cifra indica deci clasa de care aparjine 0 enzima. 1, Oxidoreductaze 4. Liaze 2. ‘Transferaze 5. Izomeraze 3. Hidrolaze 6. Ligaze (Sintetaze) Fiecare din aceste clase are un numar mai mare de subclase, care la randul lor se vor diviza in clase secundare (sub — subclase) dupa specificul de cataliza si dup natura substratului catalizat. A doua cifra indicia deci subclasa care furnizeaza unele detalii asupra mecanismului de reactie la care participa o anumita enzima. A treia cifra indica sub-subelasa si furnizeaza detalii suplimentare asupra reactici catalizate de o anumita enzim A patra cifra indica pozitia pe care o detine o enzima in subclasa respectiva. Numele sistematic indic’: a) natura donatorului; b) natura acceptorului; c) tipul de alizata Codul este precedat de abrevierea EC (Enzyme Comission); ex: alcool dehidrogenaza C LAA Notarea cu patru cifre serveste ca sistem de codificare pentru aparatele de calcul electronic. 1. Oxidoreductazele - sunt sisteme enzimatice care catalizeaz’ reactii de tip redox, caracterizate prin transfer de hidrogen sau electroni IL- Transferazele - catalizeaza reactii de transfer prin care o parte din molecula unui substrat numit donor, este cedaté unui alt substrat numit acceptor. reaclie R,-A+R,-B==2R,-B+R,-A104 IIL - Hidrolazele - sunt enzime care catalizeaza scindarea hidrolitica a substratului sub actiunea apci. Tabela 3.2 Clasificarea enzimelor (extras orientat 1. Oxidoreductaze 1.1 - Actioneaza asupra gruparii> CH - OH 1.2 - Acfioncaza asupra grupirii >C = O 1.3 - Acfioneaz’ asupra gruparii >CH - CHG 1.4 - Acjioneaz’ asupra gruparii >CH - NH, 1.5 + Acfioneaza asupra gruparii SC. = NH 1.6 - Actioneaz’ asupra NADH sau NADPH 2. Transferaze 2.1 - Transfer’ gruptri monocazbonate. 2.2 - Transferd grupiri aldehidice sau cetonice. 2.3 - Transfer grupari acil. 2.4 - Transferd grupari glicozil. 2.5 - Transfer’ grupan alchil. 3. Hidrolaze 3.1 - Hidrolizeaza esterii carboxilici 3.2 - Hidrolizeazi ticesterii. 3.3 - Hidrolizeaz& esterit monofosforici. 3.4 - Hidrolizeaz legaturi peptidice. 3.5 - Hidrolizeazi alte legituri C -N 4.1 - Scindeaza legaturi3C - CO turi C= Ne turi3C - S- indeaza legaturi3C - X jeaza legaturi P -O 5. Homeraze 5.1 - Racemaze gi epimeraze. 5.2 - Izomeraze cis-trans. 3 - Oxidoreductaze intramoleculare: 5.4 - Transferaze intramoleculare. 5.5 - Liaze intramoleculare. 6. re 6.1 - Pormare de legitun C 6.2 - Formare de legaturi C 6.3 - Formare de legituri_ C 6.4 - Formare de legituri. C 6.5 - Formare de legituri esterice fosfat IV - Liazele - catalizeazi scindarea moleculelor de substrat Ja nivelul le; C-C, C-O, C-N, -C-S, fra interventia moleculelor de apa.105 R,-C-C-R, s=2R,-C-+-C-R, V - Izomerazele - catalizeaza reactiile de transformare dintr-o forma izomera in alta, anumite rearanjari interne in molecula substratului. Alanin racemaza D - Alanina —=—— L - Alanina VI - Ligazele - enzime care catalizeaza sinteza a doi reactanti utilizand ca sursa de cnergic ATP. A +B + ATP ———+A -B + AMP + PPi Acest sistem de clasificare are marele avantaj ci 0 enzim& nou descoperiti poate fi 4 si codificaté fara a modifica esential pozitia celorlalte enzime. In tabela 3.2 sunt prezentate clasele si principalele subclase ale clasificarii actuale ale enzimelor. In terminologia internationala, pe langa denumirea stiintifica impusa prin sistemul de clasificare internationala, pentru diferite enzime se utilizeaz’ denumiri empirice uzuale. Astfel, denumirea multor enzime rezulta prin addugarea sufixului - az la numele substratului asupra caruia actioneazd enzima. De exemplu, enzima arginazi are ca substrat arginina, ureaza are ca substrat ureea, lactaza are ca substrat lactoza, etc. Aceste denumiri comune sunt utilizate in paralel cu denumirile stiintifice stabilite prin sisiemul actual de clasificare incadra\ 3.1.4 Localizarea intracelulara a enzimelor In interiorul celulei, enzimele prezinta o distributie topografica specifica, fiind localizate in diferite compartimente - organite celulare si citoplasma. Separarea prin ultracentrifugare a organitelor celulare, urmata de identificarea prin tchnici histochimice a constituit metodologia de baza, prin care s-a putut stabili localizarea intracelularé a enzimelor. Deoarece uncle cdi metabolice au loc in toate tipurile de celule, enzimele corespunzaitoare au o raspindire generala. Anumite procese biochimice, cum ar fi biosinteza proteinelor si a acizilor nucleici, glicoliza gi ciclul acizilor tricarboxilici, sunt universal prezente in celula, deoarece fiecare celula igi sintetizeaza proteinele si acizii nucleici proprii producand in acelagi timp energia necesard tuluror activilatilor. In toate aceste procese intervin seturi de enzime care au raspandire ubicuitara. Pe de alta parte, fiecare tip de celule dispune de seturi de enzime care catalizeaza procese metabolice specifice: biosinteza hormonilor tiroidieni are loc numai in tiroida, biosinteza ureei are loc numai in ficat. La nivel intracelular, localizarea enzimelor coincide cu locul de desfasurare al ci metabolice pe care o catalizeaza. Astfel, in citoplasma sunt localizate enzimele care participa in glicoza si sinteza acizilor grasi. Ureogeneza se desfasoara partial in citoplasma gi parjial in mitocondrie, deci unele enzime ale acestei cai sunt citoplasmatice si altele mitocondrial Mitocondriile care sunt inzestrate cu doua membrane se’ ¢ distributic foacte complexa a enzimelor (tabela 3.3). ! ‘acterizeaza_printr-o106 Tabela 3.3 Localizarea unor enzime in mitocondriile hepatocitelor | Membrana externa | Membrana interna Matrix } -Monoaminooxidaza, -NADH dehidrogenaza, | -Citrat sintetaza |] -Acil iA sintewaza, -Citocromi(b,c,&s) -Izocitrat dehidrogenaza || -Fosfolipaza A), -Succinat dehidrogenaza. | -Glutamat dehidrogenaza. || -Nucleozid difosfat Kinaza, Spatiul dintre membrane Adenilat ciclaza | Exista si enzime cu localizare mixta: aspartat aminotransferaza (ASAT = GOT) este localizata. 70% in mitocondrie si 30% in citoplasma; malat dehidrogenaza (40% in mitocondrie si 60 in citoplasma). Uneori enzimele care catalizeaza reactiile unci cai metabolice sunt organizate in complexe multienzimatice: complexul piruvat decarboxilazei, complexul multienzimatic al lantului respirator, complexul acid gras sintetazei, complexul enzimatic al ureogenezci. In sistemele mullienzimatice, enzimele componente ale sistemului constituie un mozaic¢ organizat, in cadrul careia fiecare enzima are o anumild localizare secventiala, catalizand 0 reaclic si permitand Lotodata cuplarea reactiilor care compun secventa respectiva. 3.2) Structura enzimelor 3.2.1 Enzime monocomponente si bicomponente Enzimele sunt biocatalizatori a ciror natura proteica s-a dovedit a fi universala. Singura exceptic 0 constituie o enzima din grupul ribonucleazelor - ribonucleaza P ~ care const din dou’ subunititi, un ARN si o proteina, subunitatea catalitic’ find ARN - ul Dializa a stabilit ca enzimele sunt formate din o parte nedializabila (proteina) si o pane dializabili (grup prostetic) Conform formulirii lui Van Euler: Holoenzima Apoenzima si cofactorul - inactive un complex molecular enzima-cofactor denumit holoe Manifestarea proprictitilor catalitice este rezultanta interactiunii si cooperarii dintre componenta proteica si componenta prosietica (cofactori sau coenzime) Aceste enzime sunt heterogene si bicomponente. Componenta de natura proteica din structura enzimelor confera acestora specificitatea de substrat, iar gruparea prostetica determina tipul gi viteza de reactie. Apoenzima are urmatoarele caracieristici generale: @ - este de naiuré proteica, termolabila yi nedializabila; ‘a enlitall separate - formea.107 @ - in structura sa este localizat situsul catalitic si situsul allosteric (la enzimele allosterice); determina legarea substratului la situsul catalitic sau a efectorului la situsul allosteric; formeazé complexe enzima-substrat si enzima-cofactor; imprima specificitatea de substrat in reactia catalizata; manifest grade diferite de afinitate pentru cofactor; este susceptibila de modificari conformationale intre anumite limite. Exist enzime care reprezintd proteine omogene (holoproteine) fara a avea cofactor saul coenzima; proprietatile catalitice sunt exercitate in exclusivitate numai de componenta proteica pe care este localizat situsul catalitic (enzime monocomponente). Asadar, se poate considera ca structura. dualisté a enzimelor, desi foarte larg pandita, nu poate fi generalizata. Din categoria enzimelor monocomponente fac parte un numar restrans de enzime cum pepsina, tripsina, chimotripsina, ribonucleaza gi lizozimul eoooe 3.2.2 Situs catalitic. Situs allosteric. Situsul catalitic - reprezinta o zona specifica gi delimitata constituita dintr-un numar mic de radicali de aminoacizi. Acestia formeazi o geometrie spatiald perfect ordonata yi structural asimetrica la nivelul c&reia se exercita activitatea cataliticd a enzimei, prin capacitatea de a interactiona cu moleculele de substrat asupra carora actioneaza. Situsul catalitic este localizat in portiunca intern’ hidrofob’ a molecule. de protein enzima, iat conformatia sa structurala caracteristicd este determinata gi stabilizata de catre conformatia intregului edificiu molecular al enzimei. Situsul catalitic include grupari chimice active din radicalii unor aminoacizi (-OH, SH, -NHb, COOH, imidazol,ete.) care in mod individual sau grupati - participa la stabilirea urii dintre enzima si substrat, determinand reactia cataliticd specifica. Funetionalitatea aminoacizilor care constituie situsul catalitic este consecinta structurii patiale a moleculei protein enzimei, care, prin infagurarea sa spajiala, aduce anumiti radicali i unor aminoacizi (A,B,C) distantayi in secventa structurii primare, intr-o anumita pozitic apropiatd spatial (2A) 14 dispunere permite realizarea unui ansamblu de grupari ale aminoacizilor care participa la constituirea situsului catalitic. les HOOGC AEN, | ORGANIZARE SPATIAL A Y SITUS. site CATALITIC Fig.3.1 Constituirea situsului catalitic (dupa M. Serban) enzima cu aciune prowolitica ~ esenfiale ined din pozitia 57, gruparea carboxil Astfel in cazul particular al chimotripsinei pentru situsul sau catalitic sunt ciclul imidazol al histi108 a acidului aspartic din pozitia 102 si gruparea -OH (a serinei) din pozitia 195 a lanqului polipeptidic; ele sunt foarte apropiate in spatiu ca urmare a configuratiei specifice a chimotripsinei care realizeaza un contact intim intre gruparea -OH si nucleul imidazolic prin intermediul unei legaturi de hidrogen. Aminoacizii din situsul catalitic detin un rol decisiv in legarea directa a substratului si in transformarea sa catalitica Radicalii acestor aminoacizi contin grupari chimice reactive care intervin: @ - ca agenti de complexare a substratului cu care stabilese interactiuni ionice sau covalente; @ - ca donatori sau acceptori de electroni si de protoni in mecanismul catalitic de reactie; @ - in stabilirea unei topografii adecvate in molecula de enzima necesara pentru interactiunea substratului si coenzimei, ambele fixate la un moment dat pe molecula enzimei. Geometria spatiala a situsului catalitic este asigurata si mentinutd prin interactiunea aminoacizilor structurali (care determina mentinerea unei conformatii stabile) si a celor ari care permit o anumita flexibilitate a regiunilor limitrofe situsului catalitic. Situsul allosteri¢ apare la enzimele oligomere constituite din doua sau mai multe unilati oligomere, denumite enzime allosterice gi care au rol de reglare enzimatica. Agadar in cazul enzimelor allosterice apar doua situsuri, unul catalitic si altul allosteric (fig.3.2). auxi SITUS : ALLOSTERIC Viy.3.2 Structura enzimelor allosterice In aceste mecanisme de reglare prin interactiuni allosterice intervine cu rol determinant un efector allosteric (activator sau inhibitor) care se leaga la locul allosteric 3) moduleaza tranzitiile moleculei de enzima intre diferite conformatii posibile pe care acesta Je poate Ia (vezi cap.3.3). In functie de structura lor moleculara, enzimele isi exercitd proprictatile catalitice in mod diferit. Enzimele holoproteine actioneaza direct prin intermediul situsului catalitie, in timp ce enzimele heteroproteine vor actiona prin intermediului situsului catalitic gi al unor factori enzimatici indispensabili pentru manifestarea activitatii catalitice. Cenirul catalitie reprezinti ansamblul regiunilor funcjionale ale enzimei care participa cfectiv la reactia catalitica. In cazul enzimelor holoproteine ce nu ne tivitatea lor ld pentru a unui factor, centrul catalitic este sinonim cu situsul catalitic atalitica prezenta centrul catalitic = situsul catalitic109 In cazul enzimelor heteroproteine, care necesita pentru activitatea lor catalitica si prezen{a unor cofactori: Centrul activ = situs catalitic + cofactor 3.2.3 Cofactorii enzimatici Cofactorii enzimatici sunt_micromolecule de natura chimicad foarte diferita si indispensabili pentru manifestarea activitdtii catalitice a enzimelor bicomponente. Deoarece adeseori in loc de cofactor se utilizeazd termenii de coenzima sau grupare prosteticd s-au facut recent urmatoarele precizari ~ termenul "cofactor" se va utiliza pentru totalitatea compugilor neproteici_din_structura heteroenzimelor; ~ — - temenul “coenzima" se va utiliza numai pentru componentele neproteice de natura organica care se leaga prin legaturi foarte slabe de apoenzime; termenul "grupare prostetica" este utilizat tot pentru cofactori de natura organica, dar care se leagd de apoenzime prin legaturi puternice. Cofactorii pot fi deci: a) derivati de la vitamine; b) derivati de la hem; c) trifosforibonucleotide; d) ioni metalici. Cofactorii prezinta urmatoarele caracteristici generale: @ - sunt termostabili si dializabili; - unii sunt ugor disociabili de apoenzima gi altii sunt legati intim de apoenzima; @ - determina specificitatea de reactie, respectiv tipul mecanismului de reactie pe care o catalizeaza enzima, Cofactorii intervin in mecanismul general de actiune astfel @ prin introduccrca unci conformatii optime, necesare interactiunii enzimei cu substratul; @ asigurarea dispuncrii enzimei si substratului intr-un aranjament spatial adecvat, prin siluarea cofactorului in vecinatatea situsului catalitic gi a substratului; participarea cofactorului la reactia enzimatica prin acceplare gi transfer de electroni, atomi sau grupari chimice de la un substrat la altul. Coenzimele (vezi tabela 3.4) reprezinté micromolecule organice care se ataseaza temporar la enzime si sunt usor disociabile de acestea Principalele tipuri de coenzime sunt @ coenzime derivate de la vitamine, @ coenzime de tip heminic, coenzime de tip nucleozid polifosfati. 2xisti cdteva sute de hidrogenaze - dehidroganaze a ciror coenzima este NAD Datorita legiturilor foarte slabe intre coenzima NAD" si diversele apoenzime, un numar mare de hidrogenaze - dehidrogenaze pot actiona simultan intr-un compartiment celular utlizand o cantitate restransa de coenzima, chiar in conditiile in care coenzima se consuma in fiecare reactie in proportie egala cu substratul (coenzimele se numese “al doilea substrat"). ‘Trecerea cu ugurinja a coenzimei de pe o apoenzima pe alta asigura vitezele corespunzatoare pentru un numar important de oxido-reduceri celulare: este explicabil de ce in celule, cantitajile de NAD' sunt reduse, in raport cu multitudinea si intensitatea reactiilor care au loc. Un exemplu similar il reprezinta piridoxal fosfatul (PALPO) care este coenzima aTABELA Nr.3.4. EXEMPLE® DE 110 COENZIME SE-FUNCTIILE LOR a pment T-PENt + antl F ¥ COENZIMA TEPUL DE Gaupare’ | PRECURSOR REACTIE ‘TRANSFERATI TT. COENZIME TRANSPORTOARE DE | TIDROGEN SL ELECTRONI 1 \ -Nicotinamtd Adentn Oxidoreducere H Vitamina PP Dinucleotid cnap*) Adenin Fosfat (NADP*) Dinucleotid ~Coeazime hemiaice L | -Nicotinamid I TL. COENZIME TRANSPORTOARE DE GRUPART FUl | -Tiamin Pirofosfat (TPP) Fosfat (PALPO) H | | Oxidoreducere | u | Oxidoreducere Oxidereducere i Transfer acil ‘transfer unitati | monocarbonate Vitamind Vitamind CitocromL Vitaming By | Biotin’ i- a | Acid Folic Izomerizari fo - | | -Dottcolfosfat Transfer grupari | Nanoza |nonozaharidice | Glucozd | i |Glucozamin’ | LIT. NUCLEOZID POLIFOSFATI | -Adenozin trifosfat (ATP) Fosforilare | -OPO3H2 - | -uriain-difostac (UDP)! | biosinteza Jerscozit - ' | Glucidelor }a Vcieiain trifosfat (CTP) Lewes (Gliceridd [sonjugats Biosiateza fosfolipidelorLL aminotransferazelor si care in cursul reactiilor isi revine la forma initialé dupa parcurgerea seeventelor corespunzatoare transformarii a doua substrate. La multe enzime cofactorii sunt ioni metalici (metalo enzime) care se leaga de componenta proteicd (apoenzima) prin legaturi electrostatice. S-a ajuns la concluzia ca resturile aminoacizilor care elibereaza protoni (acizii aspartic, glutamic gi serina) sau care au atomi de azot cu electroni neparticipanti constituie liganzii pentru ionii metalici. In reactiile catalizate de metaloenzime, ionii metalici indeplinesc de la caz la caz urmatoarele roluri: @ stabilizeaza structura enzimei, @ participa la legarea substratului, @ induc unele modificari in conformayia enzimei, participa nemijlocit in cataliza (uncle reactii de oxido-reducere). Exist& enzime omoloage localizate in compartimente diferite ale aceluiagi tip de celule care contin ioni diferiti, exemplu superoxiddismutaza extras din mitocondrii contine Mn’*, iar cea extras’ din citosol contine Cu ', Zn?*. Unele enzime necesiti pentru activitatea lor simpla prezenja in mediu a anumitor ioni; exemplu Ca®* este utild pentru activitatea lipazelor. Exist si enzime a caror activitate este dependenta de prezenta unor anioni: amilaza salivara necesita prezenta ionilor de Cl. In tabela 3.5 sunt prezentate unele enzime cu ionii pe care ii contin sau ionii aicaror prezenta este necesara activitatii lor. Tabela 3.5 Enzime metal dependente Enzime loni Citocromi Peroxidaze Fe’*, Fe’! Catalaze Alcooldehidrogenaza Anhidraza carbonica Zn** Carboxipeptidaza Citocromoxidaza Tirozinaza Cues, Cut Ascorbicoxidaza Fosfataze Mg?! Fosfotransferaze Peptidaze Mn?" Arginaza Xantinoxida Mo’* Nitratreductaza Piruvatfosfokinaza Kt Adenozintrifosfataza Na’ Piruvat Kinaza Kt, Mg”*112 3.2.4 Mecanismul de actiune al enzimelor Referitor la mecanismul interactiunii dintre enzima si substrat, s-au emis mai multe ipoleze dintre care vom prezenta urmatoarele: 3.2.4.1 Ipoteza tip "lacat-cheie" Modelul clasic al structurii spatiale a centrului activ in raport cu structura substratului este acela de “lacat-cheie", propus de Emil Fischer. Modelul postuleazd existen{a unei complementaritafi reciproce intre geometria moleculei de substrat (S) si geomeiria situsului catalitic al enzimei (E). situs catalitic 4 Ui; » SUBSTRAT comPLex ES 3 Compatibilitatea dintre enzimi (E) gi substrat(S) Dispunerea riguroas a substratului (S) la situsul catalitie creeaza 0 compatibilitate prin care se favorizea7A recunoasterea de catre enzima a substratului su specific si formarea complexului binar de tranzitie ES. Molecula de substrat este potrivita rigutos in spatiul situsului catalitic in conformitate cu topografia si orientarea sa slericd. Legarea temporara a substratului la situsul catalitic se realizeaza prin interventia a trei tipuri de radicali de aminoacizi care intra in constitulia situsului catalitic si anume: @ un radical care asigura legarea; @ un radical care induce orientarea sterici; @ un radical care determina activarea substratului. Astfel, in cazul chimotripsinei: histidina prin nucleul imidazolic asigura legarea substratului; serina prin gruparea -OH induce orientarea substratului; acidul aspartic produce activarea substratului Modelul “lacat-cheic" este rigid, dar plastic si confirmat pentru cazul specificitayi absolute a unei enzime pentru un anumit substrat; ipoteza nu este adecvata pentru explicarea specificita{ii relative a unei enzime pentru un grup mai larg de substraturi.113 3.2.4.2 Teoria "ajustarii" induse (Koshland) Modelul lui Koschland este unul din cele mai actuale modele care a primit numeroase confirmari experimentale. Modelul presupune existenja unei anumite flexibilitéti a zonei in care se afl centrul activ Interactiunea dintre enzima gi substrat este un proces dinamic si cooperant, deoarece apropricrea substratului poate induce modificari fine, discrete in conformatia situsului catalitic care isi orienteaza gruparile active ale aminoacizilor, astfel incat se realizeaza configuratia optima necesara pentru legarea corecta a substratului. Inainte de legarea substratului, situsul catalitic se gaseste intr-o forma relaxata, iar gruparile sale active nu se gasesc in pozitia optima de fixare a substratului; odala cu legarea substratului, acesta induce 0 ajustare a situsului catalitic care capa o pozitie geometrica favorabila pentru formarea complexului intermediar BS gi tansformarea ulterioara a substratului (S) in produs (P). Fig.3.4 Modelul centrului activ indus al lui Koschland Din punct de vedere termodinamic, dispunerea cea mai potriviti a substratului in faport cu enzime, reduce la minimum gradele de libertate in ceea ce priveste translatia si rotalia substratului, proces care are loc cu scaderea entropiei, ceea ce favorizeaza atingerea usoard a starii de tranzitie Specificitatea sterica si, in special, inhibitia competitiva a enzimelor pot fi explicate cu usurinta pe baza modelului lui Koschland. 3.2.4.3 Cataliza covalenta Legarea reversibila a substratului (S) la situsul catalitic al unor enzime, se poate realiza prin stabilirea de legaturi covalente cu formarea unui intermediar enzima - substrat (lS), instabil $i foarte reactiv, care se poate transforma in produsul de reactie (P) prin scdderea energie de activaré. Formarea compusilor intermediari covalen{i devine posibili prin intermediul unor grupari chimice nucleofile (capabile sa doneze electroni) ale urmatorilor aminoacizi din constitujia situsului calalitic: serina, histidina, lizina, cisteina. Legaturile covalente se stabilesc inure acesti aminoacizi si substratul de reactie pe baza unui mecanism care implica alacul nucleofil al gruparilor active din constitufia situsului catalitic la un atom de carbon clectrofil din molecula substratului.114 —[CH2),-N H, Fo | N NH i ' QT SCH OSH) - jewel eee aecaed NY) H8S—CH, 4 ~ Atom electrofil it Fig.3.5 Al muparilor nucleotile din molecula enzame asupra gruparilor electrofile din molecula substratului Mecanismul intim de actiune al enzimelor bazat pe interrelatiile substratului cu centrul activ al enzimei,este cunoscut pentru un numar important de enzime._ H OHH H OH H Ooriid © oO 1 tii © HJ INC=C-NeG- COO” HN—C—E-N—E—COO Ry Ro i R, i Re on oo DoF GH N7AyH ee | ee ot | ¥5 | CH, His 67 CH, CH, (| CHIMOTRIPSINA CHIMOTRIPSINA | i [b] L _ Ri HN tH + | COOH- > " NZ NH CH, CH, CHIMOTRIPSINA115 Astfel in centrul activ al chimotripsinei sunt implicate restul de histidina 57 si restul de serina 195, care desi departaji in lanjul polipeptidic sunt apropiafi unul de celalalt, avand in vedere structura spafiala a enzimei. Activitatea proteolitic’ a chimotripsinei este absolut dependenta de prezenja in centrul catalitic al resturilor de histidina gi serina, acesti aminoacizi fiind necesari gi altor enzime cu acliuna proteolitica (tripsina, pepsina). Restul moleculei proteice, degi nu participa direct in procesul de cataliza, are un rol decisiv deoarece acest edificiu exista ca o entitate bine conturata. Formarea intermediarilor covalenti este posibila prin intermediul gruparilor nucleofile (-OH serinic si N- imidazolic) capabile si doneze electroni. Mecanismul scindarii unei legaturi peptidice sub actiunea chimotripsinei este prezentat in figura 3.6 si include urmatoarele etape: @ Hidrogenul de la gruparea -OH a serinei 195 este rapid transferat ca proton pe azotul radicalului imidazolic al histidinei 57 @ Protonul formeaza o legatura de hidrogen cu azotul gruparii peptidice a substratului in timp ce -O al restului de serind atacd nucleofil atomul de carbon al gruparii peptidice ntand restul carboxilic al aminoacidului angrenat in legatura peptidica. faz intermediara gruparea carbonil a legaturii peptidice (cu restul proteic de care este atasata) se leaga covalent de serina, in timp ce gruparea indepartata este aminoacidul O- terminal al substratului @ Final, restul proteic de la gruparea -OH a serinei este deplasat de apa regenerandu-se enzima libera in starea ci inifiala. 3.2.4.4 Cataliza acido - bazica generala Majoritatea relatiilor biochimice care au loc in organismele vii, implica uransferari de protoni, fie de la un atom Ja altul in cadrul aceleiagi structuri chimice, fie de Ja un substrat la alwl, in cazul seactiilor bimoleculare. Deci, in reactiile catalizate de acizi sau baze generale, catalizatorii functioneaza intr-o anumita etapai a ciclului catalitic ca niste acceptori sau donori de protoni. Cataliza prin acizi sau baze determina 0 accelerare a vitezei de reactic. Mecanismul catalizei acido-bazice consta in capacitatea enzimelor ca, prin anumite upari chimice (COOH, -NH,, -OH, -SH, ciclul imidazolic) sa functioneze ca acizi sau ca baze, prin cedare sau acceptare de protoni. De exemplu ciclul imidazolic din histidin’ prezinta viteze de protonivare si deprotonizare foarte rapide si se comport (la pH adecvat) ca un donor sau acceptor de H* participand astfel la cataliza prin acizi si baze. Donor H’ CARACTER ACID - ic Acceptor H’ -CARACTER BAZIC- Heer Deoarece cele mai multe proteine confin relativ puline resturi de histidina, acest cid a fost sclectionat in cursul evolutiei biologice pentru a juca un rol important in enzimatica.116 Factorii care influenteaza eficienta unui catalizator acido-bazic sunt urmatorii: @ miarimea vitezei transferului de protoni intre catalizator si substrat; @ eradul de polarizare a legaturii formate intre enzima gi substratul a carei transformare 0 catalizeaza; 4 constanta de echilibru pentru formarea complexului ES. Reactiile biochimice care decurg prin cataliz’ generala acido-bazici includ hidroliza anor esteri carboxilici si fosforici, tautomerizari, izomeriziri ete 3.2.3 Yoenzime Fxist{ enzime care prezinta fenomenul de pelimorfism enzimatic, existand in mai multe varietati sau specii moleculare. Izoenzimele reprezinta forme moleculare multiple ale unei enzime care catalizeaza acevasi reactic chimicd si care se intalnesc nu numai in tesuturi si organe diferite, ci chiar in acelasi organ, {esut sau lichid biologic dintr-un anumit organism. Izoenzimele se pot separa prin mai multe metode, dar in special prin metoda electroforetica in gel de agar, agarozd sau poliacrilamida. Izoenzimele, desi poseda o activitate cataliticd identica manifestind acecasi specificitate de substrat, prezinta insa configuratii spatiale diferite si se deosebese intre ele printr-o serie de propricti{i fizico - chimice diferite: @ - mobilitatea clectroforetica; ® ~ secven{a aminoacida; ® - cineticd de reactic - stabilitate la cildura - comportare faa de diversi efectori enzimatici ete Ivoenzimele sunt considerate ca protcine oligomere, fiind constituite prin asocierea unui nui par de subunitati analoge denumite protomeri Lactat dehidrogenaza (DH) este una din primele enzime la care s-a constatat sicnta polimorfismului enzimatic LDH catalizeazd reactia de oxido-reducere reversibila NACH + H" COOH 0 PIRUVIC LDH se prezintaé ca un ansamblu de cinci tipuri de izoenzime separabile electroforetic gi denumite in ordinea descrescdtoare a mobilititilor electroforetice -LDH,, LDH), LDH, LDH, LDE,. S-a stabilit cd cele cinci izoenzime sunt tetrameri rezultati prin asocicrea in modurt diferite a doua lan{uri polipeptidice de baz4, notate M (de la muscle = muschi scheletic) gi H (de la heart = inima), care sunt determinate genetic, sinteza lor fiind realizata de catre doua gene distinete.117 Prin asocierea tetrametrica in proportii diferite care compun formele izoenzimatice parentale "pure" H,(LDH,) si M,(LDH,), asociere care urmeaza o distributie binominala, se genereaza trei forme hibride de izoenzime desemnate ca LDH), LDH;, LDH, (vezi figura 3.7). M iM M|M | | A wr Sie : on __LDHs Fig.3.7 Tzoenzimele k tat dehidrogenazei Aceste izoenzime pot fi separate electroforetic, objinandu-se zimograme de felul prezentat in figura 3.8 Le Vig.3.8 Zmograma lactat dehidrogenazei serice In qesuturile cu profil metabolic aerob (creier, inima, rinichi) este favorizata sinteza izoenzimelor de tip H(LDH, si LDH,) in timp ce in fesuturile cu metabolism anaerob accentuat (muschi scheletic, ficat) este favorizati sinteza izoenzimelor de tip M(LDH,, LDH). O alta enzima care prezinta polimorfism enzimatic este creatinkinaza (CK sau CPK) implicata in fosforilarea creatinei; enzima are trei izoenzime care sunt dimeri (M,, MB, B,) rezultali prin asocicrea a doua lanjuri de baza M si B. lzoenzimele au o semnificafie deosebita in reglarea cailor metabolice, in cunoasterea barelor moleculare ale morfogenezei si diferentierii celulare. Pe Langa aceasta importanta, determinarea raportului in care se afla in ser (zimograma serica) este extrem de utila in precizarea unor afectiuni ale ficatului gi inimii.118 3.3 Specificitatea enzimelor Specificitatea de actiune constituie o caracteristica esentiala a enzimelor care este de partea sa proteica (apoenzima). Enzimele poseda o inalta specificitate de substrat deoarece majoritatea lor participa la Wansformarea unui anumit substrat sau a unui numar limitat de substrate inrudite structural. Specificitatea de substrata enzimelor, este unul din cele mai remareabile atribute biologice care stau la baza vietii In cazul in care enzimele n-ar fi catalizatori cu o stricta specificitate de actiune gi de substrat, inalta ordine specificd metabolismului ar disparea, diferigii constituienti celulari ar fi degradayi sau sintetizati haotic, pundnd sub semnul intrebarii insdgi esenja vietii. Manifestarea proprictijilor specifice ale enzimelor, la nivelul celular face posibila metabolizarea lent compatibila cu fenomenele vitale. Multitudinea formelor de manifesiare a specificitayii enzimelor poate fi incadrata in doua categorii: specificitatea de reactie si specificitatea de substrat. confer 3.3.1 Specificitatea de reactie Enzimele catalizeazi un anumit tip de reactie bine determinati, in functie de specificitatea lor faja de substrat si de modul de actiune asupra acestuia. Specificitatea de reactie este capacitatea fiecdrei enzime de a cataliza un anumit tip de reachic si acest criteriu sta la baza clasificarii enzimelor. De exemplu, un a aminoacid poate constitui substrat de reactic pentru mai multe envime care Catalizeaza reactii diferite de transformare a aceluiasi substrat cu formare de oredusi diferiti de reactie: . R=CH,—NH> 4 cecarBoxiLazk Hi % Ht jf 0 1 pvipazk | ! 7 it R-C-COOH—=* DAA R-C—COOH | —TRANSAMNAZA eC-cOOH ' OH ! ue \ | OE ZAMINAZA =COOH + NH; o=0— Pig.3.9. Enzime diferite actioneazit asupra accluiagi substrat Specificitatea de acliune este imprimaté de componenta sa proteica, In cazul in care o enzima poate cataliza doud sau mai multe reactii diferite, se poate admite faptul ca aceasta poscda centre active distincte pentru fiecare tip de reactie.119 3.3.2 Specificitatea de substrat Gradul specificitatii de substrat variaz’ de la o enziméa la alta, in functie de natura acesteia si de mecanismul de reactie. Enzimele prezinta trei tipuri distincte de specificitati % - specificitatea geometrica sau stereochimica, # - specificitatea relativa de grup, % - specificitatea absoluta. Clasificarea are un caracter convenfional, deoarece inte aceste tipuri de specificitate hu se poate face 0 delimitare absoluta. In cazul reactiilor bimoleculare, enzima poate fi absolut specifica numai pentru unul din cele doua substraturi; in cazul reactiilor reversibile, enzima poate fi specifica pentru substraturi si in nici un caz pentru produsii de reactie. 3.3.2.1 Specificitatea optied sau stereochimica Asimetria structurala este 0 particularitate general a sistemelor biologice si deci, enzimele existente in organismele vii, prezinta adeseori specificitate optica sau stereochimica. Enzimele din aceasta categorie actioneaza: @ - asupra unei serii optice D sau L; - asupra unui anumit izomer cis sau trans; - formeaza un anumit izomer geometric sau optic. Aminoacid oxidaza + O, a - Aminoacid —-—-——_—__» a - Cetoacid + NH, + H,O, Lactat dehidrogenaza (LDH) actioneaza asupra acidului L - lactic pe care il transforma in acid piruvic gi niciodaa nu va acjiona asupra acidului D - lactic. CH NAD" NADHHT CH, COOH COOH [Aco L-Lactic] [Aci PiRuvic] [ACID D-LacTiC] In aceste cazuri, substratul optic activ este transformat in produs de reactie care poate fi optic activ sau nu. Exista si situatia inversa cand substratul este optic inactiv, dar este optic activ produsul de reactie. Reactia catalizata de lactat dehidrogenaza fiind reversibila, poate servi ca astfel de exemplu, considerata ca 0 "sinteza asimetrica". Succinat dehidrogenaza (SDH) catalizeaza preferential dehidrogenarea substratului sau - acidul succinic - prin eliminarea a 2H in pozitia trans cu formarea izomerului trans (acidul fumaric); izomerul cis, acidul maleic nu se poate forma.120 \ | FAD FADH, / \ COOH COOH HCOOH [Acid maleic] [Acid succinic] {Acid fumaric] Specificitatea opticd sau stereochimica poate fi explicata prin faptul cd enzima leagé substratul prin trei puncte (centri activi) pe care le consideram coplanare. 3 | Enzima 2 Substrat Fig.3.10 Lustrarea simplificata a stereospecificitatii In acest fel trei substituienti ai atomului de carbon asimetric al substratului sunt fixali pe suprafala enzimei, pe centrii activi complementari lor Asacar, pentru un substrat ce are doi enantiomeri (un carbon asimetric) numai unut din acestia va putea fi legat si deci supus transformarii chimice catalizata de enzime; antipodul optic nu corespunde pozitiei centrilor activi si in consecinta, nu poate fi atacat de cde enzima, 3.3.2.2. Specificitatea relativ’ de grup In acest caz enzima manifesta un spectru larg de activitate, actionind asupra unui grup de substraturi care prezinta 0 constitufie chimica asemanatoare. a) Alcooldehidrogenaza catalizeaza transformarca prin dehidrogenare a unui grup de alcooli monohidroxilici cu numar mic de atomi de carbon. ADH RCH: Obs Re CHO a NAD* NADH + H*121 Viteza de reaclie este functie de alcoolii care servesc ca substrat, cea mai rapid transformare fiind a alcoolului etilic. b) Hexokinaza catalizeazd fosforilarea unei serii de hexoze (glucoza, fructoza, manoza, galactoza) ca substraturi, in prezenta ATP. Hexokinaza Hexoza + ATP ———————» Hexoza-fosfat + ADP. In cadrul acestui grup de substraturi, hexokinaza are o afinitate mare pentru glucoza. ¢) Glicozidazele actioneaza asupra unui tip de legatura glicozidica (alfa sau beta). d) Fosfatazele catalizeaza hidroliza esterilor fosforici avand o gama larga de actiune - de Ja un grup de substraturi (fosfomonoesteraze) pana la un anumit substrat (glucozo-6- fosfataza, adenozin trifosfataza). oye of Chimotripsina Tripsina R= [Pre tv rp] R=|Liz| Arg] Fig.3.11 Specificitatea enzimelor proteolitice c) Bnzimele proteolitice hidrolizeazd legaturi peptidice din peptide si proteine. Actiunea lor este diferentiaté in functie de resturile aminoacizilor care formeazd aceste legaturi. Astfel chimotripsina catalizeaza hidroliza legaturilor peptidice laa caror formare au participat cu gruparea carboxil aminoacizii fenilalanina, tirozina, triptofan; wipsina are specificitatea de actiune pe legaturile peptidice (formate prin gruparile carboxil) ale lizinei si argininei f) Specificilatea lipazelor digestive este corelata cu pozilia legaturii esterice intre glicerina si acizii grasi; astfel lipaza de origine pancreatica hidrolizeaza numai legaturile esterice @ si a’ in timp ce lipaza intestinala hidrolizeaza numai §-monogliceride. 3.2.3. Specificitatea absolut Enzimele din aceasta categorie actioneaz4 strict asupra unui anumit substrat si nu recunose nici-o modificare la nivelul substratului respectiv. In acest caz particular, enzimele recunose intreaga arhitectura a substratelor si nu sunt specifice numai pentru o anumita legatura sau grupare din structura lor. a) - Anhidraza carbonica intervine in procesul de biosinteza a acidului carbonic. CO, + HO==* HCO, b) - Arginaza actioneaza asupra argininei gi nu va actiona asupra derivatilor metilati la nivelul122 grupei amine. ©) - Ureaza catalizeaza reactia de hidroliza a ureei. ° ll UREAZA H,N-C-NH, + HOH —————+ CO, + 2.NH, Ureaza nu actioneaza asupra derivatilor N-metilati ai ureei In cazul enzimelor care prezintd specificitate absoluti, substantele inrudite cu substratul reactiei enzimatice pot fi legate la situsul activ al enzimei, fara a fi transformate, actionand astfel ca inhibitori enzimatici competitivi. & S 3.4 Influenta factorilor fizico - chimici asupra activita{ii enzimelor Natura proteica a enzimelor face ca acestea sa fie substante labile la actiunea unor tactorl de mediu Enzimele igi pastreaza activitatea lor catalitica daca nu sunt denaturate, ceea ce inseamni ca orice factor de mediu cu efect denaturant, poate altera activitatea enzimatica 3.4.1 Influenfa temperaturii Datorita termolabilitajii lor, enzimele isi manifest& activitatea intre anumite limite de temperatura, in cadrul acestor limite prezentind 0 valoare optim’. Ffectul temperaturii asupra vilezei unei reactii enzimatice este rezultanta interactiunir 2 doi factori opusi gi dependent de temperatura: zei de reactie, ® - denaturarea termica a anzimei. Ramura ascendentd (A) 2 curbei evidenjiaz faptal c& pan’ la valoarea t, care, pentru enzinele din organismul uman, este 37-40°C, viteza de reactie creste regulat cu temperatura atingdnd © valoare maxima care corespunde la temperatura optima a enzimei. ® - cresterea ty oo Temperatura > Fig.3.12, Efectul temperaturii asupra activitai{ii enzimelor123 bili (in conditiile mentinerii constante a celorlalyi " (Qio) dat de raportul vitezelor de reactie la o Pentru fiecare enzima se poate s parametri un "coeficient termic al reactiei temperatura Kt + 10°C fata de cea la Kt. Kt + 10°C 0) ae Kt Valoarea Qyy pentru reactiile enzimatice este cuprinsa intre 1 si 2 fiind mai mica decat pentru reactiile chimice necatalizate (Qi intre 2-4). Relatia este valabili pana la o temperatura numité temperatura optima, peniru care viteza de reactie atinge valoarea maxima. Ramura descendenta (B) a curbei t,;—t, indicd o diminuare rapida a vitezci de reactie, odaté cu cresterea temperaturii si corespunde cu inactivarea progresiva prin denaturarea termica a enzimei, al carei edificiu molecular se altereazd. Valoarea t, indica temperatura de inactivare la care viteza de reactie este nula, functia cataliticd a enzimei fiind anulata. Daca la organismul uman temperatura optima a enzimelor este cuprinsd intre 37- 40°C, la enzimele din plante este 50-60°C gi poate ajunge la temperatura de 80-100°C la enzimele din microorganisme care trdiesc in ape termale. 3.4.2 Influenta pi-ului Influenta pH-ului asupra enzimelor este mult mai complex gi mai variaté, Enzimele sunt active intr-un domeniu limitat de pH, in majoritatea cazurilor efectul catalitic find maxim la o anumiti valoare de pH denumit pH optim de actiune. Influenja pH-ului asupra activitajii enzimelor se reprezinti dupA o curba in forma de “elopot" al c&rei_ maxim constituie pH-ul optim de actiune al enzimei respective (vezi fig.3.13) Valoarea pH-ului optim este determinata de: @ - gradul de ionizare al radicalilor aminoacizilor implicati in activitatea enzimatica, 100% -->>- ACTIVITATE, RELATIVA Fig.3.13 Efectul pH-ului asupra activititii enzimelor124 @ - natura si originea enzimei, @ - mediul de reactie $i forta sa ionica. In general activitatea enzimelor din organismul uman este optima intre pH 5,0 gi 9,0 si reprezinté chiar pH-ul normal al mediului in care ele isi indeplinese functia catalitica Existé si enzime care prezinta activitate optima in afara acestui interval, spre exemplu pepsina are pH optim 1,5 ‘Trebuie ins remarcat ca exista gi situatii in care doud enzime cu acceasi specificitate, dar provenind din doua esuturi diferite au pH-uri optime diferite; este cazul fosfatazei alcaline hepatice cu pH optim apropiat de 9 gi al fosfatazei acide din prostata cu pH optim Se Vv PH optim pH Fig.3.14 Variatia activiti{ii unor enzime in functie de pH Uneori activitatea enzimei mse schimbs pe un interval larg de pH; ex: colinesteraza si papaina (vezi fig.3. 13) Scdderea activitatii enzimatice fa valori de pH mai mici sau mai mari decat cel optim, se realizeazd in mod diferit pentru fiecare enzima in parte. Ionii H’ si HO” au efecte multiple asupra enzimelor si in primul rand un efect denaturant. Spre deosebire de efectul denaturant al temperaturii, in acest caz se rup mai ales legiturile disulfurice caracteristice structurii terliare (denaturare ireversibila). Enzimele al caror centru activ cuprinde grupari ionizabile acide sau bazice interactioneaza direct cu ionii H* si HO” rezultatul fiind cresterea sau scaderea gradului lor de disociere. Se poate considera c& in cazul unui amestec de enzime aga cum exist in fiecare celula, pH-ul celular si extracelular poate constitui un factor important de reglare al proceselor metabolice. Acidul lactic - factorul de oboseala rezultat al unei activiti{i musculare intense, duce la acea stare de epuizare prin acidifierea celulei (modificarea pH-ului) gi blocarea proceselor de sinteza a ATP, deoarece sunt inhibate enzimele din intreg fluxul glicolitic. 3.4.3. Alli factori care influenteaza activitatea enzimatica Potentialul redox al mediului influenjcaza starea gruparilor din constitutia enzimelor care pot suferi oxidari sau reduceri. Aceasta influenji se exerciti in special asupra125 grupirilor -SH. +2H Aceste modificari determina schimbari conformationale ale enzimei care vor influcnia activitatca enzimatica. Oxidarea grupirilor -SH antreneaza inactivitatea enzimelor gi de aceea pentru mentinerea activitatii se adauga uncori in mediu reductori fiziologici de tipul cisteinei sau glutationului care find compusi cu grupiri tiol (SH) reduc grupul -S-S-inactiv al enzimei, iar ei se considera treednd in forma oxidatd. SH PO | + 2RSH == Re +RSSR s ‘su Acesti compusi sulfhidrilici cu potential oxidoreducator scizut actioneaza deci ca protectori ai enzimelor -SH dependente. Radiatiile ionizante (raze X,radiatii radiactive, a, 8, sau y in doze mici formeaza substante oxidante prin descompunerea apei gi a oxigenului dizolvat partial in apa; aceste substante inactiveaz enzimele si in special acele enzime care au grupe -SH in centrul activ. Electul acestor radiatii poate fi si direct prin producerea ionizarii moleculelor de enzima. Vibratiile sonore si ultrasunetele provoaca reac|ii multiple in macromoleculele enzimelor cum ar fi: oxidarea nucleclor aromatice, eliberarea grupelor -SH, depolimerizarea Actiunea presiunilor inalte. Presiuni de peste 10.000 atmosfere — determina urmatoarele modificari asupra: - gradului de ionizare al proteinei; - derulirii lanqutui polipeptidie; - structurii solventului si gradului de ionizare al tamponului. Actiunea presiunilor inalte provoaca deci, o denaturare reversibila a enzimei. Cinetica enzimatica Mecanismul general al reactiilor enzimatice comportd interactiunea a doua categorii de fenomene: unul termodinamic si altul cinetic 3.5.1 Energia de activare O reactie de tipul $-*P poate avea loc numai in cazul cnd o parte din moleculele Lui A posed& mai multé energie decat restul moleculclor, 0 energie ce trebuie si atinga,o stare activata. In aceasta stare se, pot forma sau se pot rupe legaturi chimice. Agaglar, pentru ca moleculele substratului (SS sa reactioneze si sa se transforme in produsul (P) este necesar ca specia de molecule S$ si posede la un moment dat o stare activata (s). Alingerea acestei stari activate (socuri intermoleculare eficace) confera moleculelor respective capacitatea de a reactiona determinand formarea produsului de reactie si atingerea stirii finale. Energia de activare (B) ~ reprezintt o valoare termodinamica ce exprima cantitatea de energie necesara pentru a aduce toate moleculele pana la starea de activare. Moleculcle trebuic si depaseascé © anumitd barieri cnergetic’, care impiedicd transformarea lui126 S——»P. Prin energie de activare se desemneaza astfel cantitatea de energie (in calorii gi Ja o temperatura dat) necesara pentru ca toate moleculele dintr-un mol de substan{a sa atinga o stare activataé. Ca orice catalizator, enzimele scad energia de activare a moleculelor de substrat. Mccanismul reactiilor enzimatice prin sciderea energici de activare este ilustrat, conform teoriei lui Eyring, in fig.3.15. ik S bgp | | ti a a xt ss | Ss = AREA INITIALA j energie! libere | a ie in reactie \ \ [= rT ee 4S STAREA FINALA | a : | |. ___DESFASURAREA REACTIEl—= a Fig.3.15 Scaderea energici de activare in reactiile catalizate De exemplu, in cazul reactici: H,O,—»H,0+ 1/2 O,, valoarea energiei de activare este: AE = 18,000 calorii/mol in absenta de catalizator, AL = 12.000 calorii/mol in prezenta de catalizator metalic (Pt), AE = 6,000 calorii/mol in prezenta enzimei catalaza, Procesul de scadere a energiei de activare a moleculelor $ in prezenta enzimclor are ‘consecinte extrem de importante: @ - cresterea vitezei de producere a starii de tranzitie; % ~ cresterea coliziunilor intermoleculare, a numaralui de molecule activate gi implicit « potentialului lor reactiv; @ - accelerarea vitezei de reactic a moleculelor activate pentru transformarea lor in produs de reactie; @ - sciderea energici de activare permite ca reactia enzimaticd sA se desfigoare cu un randament bun la temperatura de 37°C 3.5.2 Ordinul de reactie Cinelica enzimatica studiaza procesele care au loc sub actiunea enzimelor in functie de evolutia in timp a transformirilor caracteristice unci reactii chimice. Intr-o reactie de tip general: aA + bB +... +cC ——>dD + cE +... + fF A,B,C reprezinta substantele initiale si D,E,F substantele rezultate din reactie;127 a,b,c,d,e,f coeficientii stoechiometrici ai reactantilor si produsilor de reactie. Viteza de reactie va fi data de formula: V = K(A)’ * (BY * (CY in care K este constanta vitezei de fie. Suma exponentilor concentratiilor din formula vitezei notate cu m reprezinta ordinul acestei reactii Daca A = B = q expresia vitezei devine: pore] Sub raport cinetic, reactiile chimice, inclusiv cele enzimatice, se diferenjiaza printr-un anumit ordin cinetic de reactie care exprima dependena vitezci de reactie de concentratia reactantilor care pot reactiona sub influenta biocatalizatorilor exista: - reactii de ordin 0 n = 0; = reactii de ordin |_n = 1; - reactii de ordin 2 n = 2 ii de ordin 3 n =3. le de ordin 0 sunt independente de concentratia reactantilor indiferent cati ar acest caz viteza de reactie depinde de concentratia enzimel. Reactiile de ordin 1 cele mai frecvente © sunt de forma: Enzima Substrat-— —> Produs Viteza de reactie creste linear cu concentratia. [n functic de timp concentratia substratului scade direct proportional cu aparifia produsului respectiv (vezi fig.3. 16). Fig.3.16 Sedderea in functie de timp a concentratiei substratulu In acest caz intervine viteza de reaclie marime cu care opereaza cinctica enzimatica, care se defineste ca fiind cantitatea de substrat (S) care se transforma in unitatea de timp $1 se exprima prin relatia: dS dt128 Reactiile de ordin 2. In acest caz participa doi reactanti pentru a forma produsul: S, + S,-—*P. Cand unul din reactanti tinde catre zero atunci reactia se reduce la 0 reactie de prim ordin Reactiile enzimatice cele mai frecvent intalnite sunt de ordinul zero gi de ordinul intai. 3.5.3 Curba de saturare cu substrat Un fenomen caracteristic enzimelor este curba de saturare cu substrat Jn conditiiie in care concentrajia enzimei este menjinuta constant, iar concentratia substratului [S] creste, viteza reactiei enzimatice variazd dupa o curba care corespunde unei erbole echilatere ce tinde asimptotic la valoarea maxima a vitezei (vezi fig.3.17). In faza Ta in care viteza initial variaz& linear cu concentratia substratului ~ reactii de ordinul intai -, fapt ce denot c& la concentratii mici de substrat situsurile catalitice ale moleculelor nu sunt saturate de substrat. Kig.3.17 Influenta concentratiei substratului asupra vitezei de reactie In faza intermediara, viteza de reactic nu mai variaza direct proportional cu concentratia substraiului [S], si inregistreaza o crestere lenta - reactie de ordinul int: zero. In faza a Ila, la concentratii-mari de substrat, viteza de reactie devine maxima capitand o valoare constanta si devine independenta de concentratia substratului - reactii de ordin zero -in aceste conditii factorul care determina viteza de reactie este concentratia enzimei. In faza H-a toate situsurile catalitice ale moleculei de enzima devin complet saturate cu substrat, iar enzima actioneaza la capacitatea maxima. O repreventare intuitiva a efeciului diferitelor concentrayi de substrat asupra capacititii moleculelor de enzima de a lega moleculele de substrat este redati in fig.3.18.129 Din aceasta reprezentare rezulté c& randamentul de formare a produsilor de reactie este acelasi, atat in conditiile de saturare completa a enzimei cu substrat, cat si in exces de substrat. Cinetica reactiei enzimatice reprezentata prin curba hiperbolica tipicd indica - dupa Michaelis si Menten - 0 tranzifie de la o faz& dependenta de concentratia substratului (faza I-a) la o fazd independent de concentratia substratului (faza [-a). Corespunzator fazei H-a se deduce - din curba respectiva - ca, pe masura ce concentratia substratului tinde cdtre infinit, viteza reactiei enzimatice tinde catre valoarea maxima. Concentrate substrat Saturare 3/4 Saturare completa Fig.3.18 Efectul diferitelor concentratii de substrat asupra capacitat enzimelor de legare a substratului 3.5.4 Ecuatia Michaelis - Menten Dintre factorii care determina viteza unei reac{ii enzimatice, concentrati substratului este de o importanja deosebita. Efectul de saturare cu substrat a facut ca Michaelis si Menten sa conceapa in 1913, o teorie generala a actiunii enzimelor privitoare la aspectele cantitative ale dependenjei vitezer de reactie de concentratia substratului. Aceasti teorie se bazeazi pe ipoteza confirmata experimental ca in cazul unei reactii enzimatice intre enzima si substratul ei se formeaza complexe intermediare activate, enzima substrat (ES) care apoi se scindeaza, punand in libertate produsii de reactie si enzima libera, aceasta fiind capabila sa se combine cu o alta molecula de substrat. Formularea generala a unei reactii enzimatice poate fi redata prin urmatoarea reactic:130 vy Vy E+ SS ESSE + P da) v2 Vom face urmatoarele notatii: {81 - concentratia totala a enzimei libere; {ES} - concentratia complexului Enzima - Substrat; [E] - [ES] - concentratia enzimei libere necombinate; {S] - concentratia substratului care esie mult mai mare decat E. Reactia (1) include urmatoarele dowa reac{ti partiale: Vv, V5 E + Ss==cES (2); BSz Vo, Bk @) Sub aspect cinetic, fiecare reactie se caracterizeaz’ printr-o viteza de reactie, respectiv printr-o constanta de vitezi specifica. Astfel din ecuatiile (2) gi (3) rezulti: V.= KFS]; V. = K,[ES] ; V; = KES} @) unde K,, K>, si K; reprezinta constantele de vitez’. Vom lua in considerare reactia de formare a complexului ES (Enzima - Substrat) - reactia (2). {ES} dts] = = K, [E] - ES} [S] 6) dt dt Similar viteza de desfacere a complexului ES esta data de: [ES] dP] sa = = KES] + KGLES] © dt dt Condijia stiri stationare de echilibru reflect’ faptul ci viteza de disparitie a substratului este egal cu viteza de formare a produsului de reactie: dS dP a we a at at K (6) - LES} 1ST}= KALES} + KES) @ K,{IE] - {ESI [SI}= (K+ KLE) a K, + Ky Ky131 K, + Ky Vom nota —--——. = K,, - constanta lui Michaelis -reprezinta constanta de K, disociere a complexului Enzima-Substrat. {te [ESTAS] = KalES] aly desfacem paranteza in termenul intai: TE] [S] - [ES] [S] = K,,ES] (12) regrupand termenii vom avea: [E] IS] = K,1ES] + [SITES] (13) sau: [E] [S] = [ES|(K,, + [S]) (14) E[S] [BS] = - - as) Ra + [S] Deoarece viteza int J V a unei reactii enzimatice este proportional’ cu [ES] putem serie: Vv V = KES] de unde: [ES] = —— (16) K, Inlocuind in relatia (15) vom avea: Vv LE] LS] K; LE] [SI] = 2 (17); v=— (18) Ky K,, + [S] kK, + [SI Deoarece concentratia substratului est atat de mare, incat toatA enzima din sistem se gaseste sub forma de complex ES. Dar viteza de reactic (Vag) va fi atinsa cind concentratia [ES] devine maxima; cand totalitatea enzimei este combinata cu substratul putem. considera: = KE] a9) Inlocuind in relatia (19) se obtine ecuafia Michaelis - Menten: Vex [8] V=- (20) K, + IS]132 Ecuatia Michaelis - Menten este expresia matematica ce defineste relatia cantitativa dintre viteza de reactic enzimatica, concentratia substratului gi valoarea K, gi care indeplineste conditiile unei curbe hiperbolice. 3.5.5 Constantele cinetice ale enzimelor Constanta Ini Michaelis (Km) reprezinté un indicator al afinitatii enzimei pentru substrat. Daca in ecuatia (20) vom inlocui Vooax vom avea: 2 Vex Venacl S] — oe (21) 2 Km + [S] Folosind legile proportiilor vom avea: — Vaa(Kmt[5]) = 2¥aadS] (22) operand si grupand termenii vom avea: VeaKn + VaalS1 ~ 2¥aalS1 (23) (24) YoxKe = YoulS1s Ka = 1S Prin urmare, K,, reprezinta 0 concentratie de substrat (exprimata in moli/litru) care este necesara pentru a satura jumatate din moleculele de enzima prezente in solutie (vezi figura 3.19). Pp Fig 3.19 Dependenta vitezei de reactie enzimatice de concentrat substratului Constanta lui Michaelis, K, substrat; cu cat K,, are o valoare n mai scazutii si invers. reprezinté un indicator al afinitatii enzimei pentru mare, cu alat afinitatea enzimei pentru substrat este si K,, definese capacitajile cinetice ale enzimelor si sunt caracteristice acestora.133 Aceste notiuni nu se intalnesc "in vivo", dar “in vitro" pot caracteriza o enzima cu aceeasi precizie cu care constantele fizice caracterizeaza substantele minerale si organice. In general, valorile K,, sunt cuprinse intre 10'- 10°M. In tabela 3.6 sunt prezentate valorile Km pentru cateva enzime sau substratele asupra carora actioneaza. Tabela 3.6 Valorile K,, ale eitorva enzime Enzima Substratul Km (moli/l) Catalaza H,0, 25 x 10% Anhidraza carbonica CO, si 9x 10° Hexokinaza Glucoza 15 x 10° Hexokinaza Pructozé, ‘| 1S x 104 Glutamat dehidrogenaza Acid glutamic | 12 x 10° Aspartat amino transferaza | Acid aspartic 9x 10* { hiss Ecuatia Lineweaver - Burk Ecuatia Michaelis - Menten poate fi transform reprezentari mull mai sugestive ale activitafii enzimatice. Lineweaver - Burk au propus pentru simplificare sa se utilizeze forma reciproca a ecuatiei Michaelis - Menten algebric in forme care sa redea ‘nad ST 1 Ky + 1S} Ky 1 {s] = ;-=— ss — (25) Ky + ES] v Vaowt SI} Vaux [8] Vinal ST 1K, 1 1 = 26) Vv ‘max _:LS] Vonax Aceasta reprezinté ecuatia Lineweaver - Burk (26). Din geometria analiticd ne reamintim c& aceasta este ecuatia unci drepte de forma y = ax + b (dreapta intersecteaza cele dowd axe). Ecuatia Lineweaver - Burk reprezin functic ‘ 1 1 — = {(——) $i are urmatoarca reprezentare graficd in Vv {S] sistemul de axe de coordonate: '134 Fig 3.20 Reprezentarea graficd a ecuatiei Lineweaver - Burk Pentru a afla punctele de intersectie, vom face urmatoarele artificii de calcul: a) - punctul de intersectie de pe axa y (1/V) se afla atunci cand x = 0; respectiv pe axa x toate coordonatele y = 0 0; y= ax0 +B; y =D; ¥ = Maw 27) b) - punctul de intersectie de pe axa x (1/[S]) se afla atunci cand y = 0; respectiv toate coordonatele y = 0 0; ax + b = 0; ax = -bp x = -bla; x = -I/ky 28) Constanta K,, poate fi determinata trasand dreapta Lineweavver ~ Burk prin masurarea experimentala a vitezei de reactie 1/V corespunzatoare la cel putin trei valori cunoscute ale concentratie’ substratului 1/[S]. Constanta K,, poate fi determinata gi prin calcularea pantei dreptei obtinute: 3.5.7 Efectori enzimatici Activitatea enzimelor mai poate fi influenjata intr-un sens sau altul de catre diferite substanje denumite efectori. Efectorii cnzimatici sunt substante de natura foarte diferita care aclioneaza asupra enzimelor modificand cinetica reactiilor enzimaticc. Dupa modul in care vatori, inbibitori si allosterici actioneard, efectorii enzimatici se clasifica in: a135 3.5.7.1 Activatori enzimatici Activatorii enzimatici influenjeaz in sens pozitiv activitatea enzimelor pe care 0 favorizeaza sau o stimuleazii. In functie de natura lor, activatorii enzimatici isi pot exercita actiunea in mod diferit: 1. - Activatori ai unor proenzime. Forma inactiva a enzimelor poarta denumirea de zimogen, proenzima, precursor. In starea inactiva centrii activi ai enzimelor sunt mascati ‘Trecerea in stare activa consta in eliminarea unei parti din molecula si astfel centrii activi ai moleculei sunt demascati. Exemple: Enterochinaza Tripsinogen + Tripsina ‘Tripsina ——» Chimotripsin’. “himotripsinogen — 2. re prin antiinhibifie. Exista activatori care actioneaza asupra enzimelor prin Pi protejarea acestora fafa de anumifi inhibitori si se numesc protectori, Exemple: - vitaminele FE, K, C - protejeazi enzimele de actiunea peroxizilor. 2 Prote Pp 3. - Activatori propriu-zigi. Activarea are loc in acest caz prin efectul unor ioni sau metaboliti care favorizeaza activitatea cataliticd a enzimelor sau fixarea moleculei de substrat de enzima. Fxemple: ionii de Mg?*. sunt activatori ai fosfatazelor, Mn?* si Co?* ai peptidazelor, Zn?" ai alcooldehidrogenazei si ai unor peptide, Cl ai amilazei ete. 4. - Substante cu caracter reducdtor. In acest caz activarea are loc prin protejarca gruparilor tiol (SH) active de 1a situsul catalitic al enzimelor, grupari necesare pentru aclivitatea cnzimatica, de cxemplu: cisteina, glutationul redus (G-SH) exercité un rol protector. 3.5.7.2 Inhibitia competi Inhibitorii enzimatici influenteaza negativ activitatea enzimatica pe care o pot anula definitiv, ireversibil sau temporar, reversibil. Inhibitorii enzimatici pot afecta fie situsul catalitic, fie oricare alt regiune a moleculei de enzima, in ambele cazuri find influentatt legarea substratului. a enzimelor este determinati de actiunea inhibitorilor care © anumita afinitate Inhibitia_competitiv prezintd o analogie structurala cu substratul si in consecinta, manifest pentru situsul catalitic Inhibifia competitiva este rezultanta competijici moleculare dintre substrat gi inhibitorul competitiv pentru ocupared silusului catalitic. Legaturile dintre enzima gi inhibitor fiind de aceeagi natura cu. legiturile enzima- substrat, inscamna ca inhibitorul si substratul se pot substitui reciproc. Reactiile care au loc sunt urmatoarele:136 Ca rezultat al inhibijici competitive, formarea complexului EI determina, prin sciderea situsurilor catalitice, 0 reducere a numarului de molecule. de enzime libere disponibile pentru a reactiona cu substratul; in aceste conditii proportia moleculelor de substrat care mai poate fi convertita in produs de reactic se micsoreaza considerabil. Asa dar inhibitorul competitiv se leaga reversibil de situsul catalitic al enzimei si diminueaza accesul moleculelor de substrat; astfel situsul catalitic nu mai poate actiona asupra substratului pentru a-l transforma in produs de reactie. Aceastt inhibijie competitiva poate fi anulati prin cregterea concentratici de substrat, caz in care cresterea populatiei de molecule de substrat favorizeaza formarea in proportie mai mare a complexului ES cu transformarea ulterioara a substratului in produs. Cregterea concentratiei de subsirat deplaseaza inhibitorul competiliv de la situsul catalitic pe care-] ocupa. Din punct de vedere cinetic, se poate considera ca inhibitorul competitiv modifica afinitatea enzimei pentru substratul sau de reacle si, deci, vatoarea K,,. Reprezentarea grafica a cineticii procesului de inhibifie competitiva a enzimelor apare is Vig.3.21 L. - Curba de saturare de substrat Il. - Graficul Lineweaver - Burk Din analiza cineticii celor doua reactii se constata: a) - in reactia inhibata competitiv valoarea Km cregte; b) - viteza maxima ramane neschimbata pentru ambele reaciii ¢) - deoarece moleculele de inhibitor actioneaza compelitiv cu substratul pentru ocuparca137 situsului catalitic al enzimei, rezulta ca o cantitate mai mare de substrat va fi necesara pentru semisaturarea enzimei, ceea ce va determina o crestere a Km. Exemple de inhibitie competitiva a) - Enzima succinatdehidrogenaza (SDH) care are drept coenzima FAD si catalizeazi reactia de transformare a acidului succinic in acid fumaric, va fi inhibata competitiv de o serie de acizi dicarboxilici care au analogie structural cu acidul succinic. COOH COOH COOH COOH COOH HCH H-C-OH C-0 . HCH COOH HOH HGH HG-H COOH COOH COOH ~—S COOH ~ acio ) f ACIDY ACID ACID =| Aco | UCCINC LMALIC | oxaLi acericl~ [MALONIC] OXALIC| b) - Enzima aconitaza catalizeaz’ conversia acidului citric in acid izocitric si cis aconitic, Aceasta enzima este inhibata competitiv de acidul florcitric. c) - O serie de substante cu actiune chimioterapic& pot actiona ca inhibitori competitivi. Astfel sulfonamidele igi exercita actiunea lor bacteriostatica printr-un proces de inhibifie competitiva. Acidul tetrahidrofolic (FH,) biosintetizat de catre bacterii are un rol esential in activitatea unor enzime care participa la biosinteza bazelor purinice si deci, a acizilor nucleici, fiind si un factor de crestere al unor bacterii. Sulfanilamida este un compus de sintez cu o structura asemanatoare PAB, aceste doud substante fiind izostere (fig.3.22 dupa M. Serban). {PABA] H>N COOH Neca Precursori—= Te eae tetrahidrofolic (FH, ) H2N SO2NH2 inhibitie competitiva { SULFANILAMIDA] Fig.3.22. Efectul bacteriostatic prin inhibiie competitiva Sulfanilamida se va comporta ca un inhibitor competitiv ocupand prin concuren(a situsul138 catalitic al enzimelor care au ca substrat PAB. Ca urmare, incorporarea PAB in structura coenzimei FH, este inhibata, biosinteza acesteia fiind diminuata sau blocata. In absen{a producerii acidului folic sau coenzimei FH,, multiplicarea bacteriilor J prin afectarea biosintezei acizilor nucleici. incetea: Pe acest mecanism de inhibifie competitiva se bazeaza efectul bacteriostatic al unor substante cu actiune chimioterapica. In procesul de biosinte/a a proteinclor, antibioticul puromic actioneaza ca un inhibitor competitiy. -7.3 Tohibii necompetitiva Inhibitia necompetitiva este determinata de actiunea unor inhibitori care nu prezinta analogie structurala cu substratul si in general, nu sunt substante care se giasesc in mod normal in organism, avand o origine exogena. Inhibitorul necompetitiv actioneaza: ® - asupra enzimei intr-o alta regiune a moleculci, diferita de situsul catalitic, formand un complex enzima- inhibitor (ED; @ - asupra complexului enzima- substrat formand un complex inactiv enzima-substrat- inhibitor (EIS); @ - concomitent asupra enzimei gia complexului ES. Reactiile care au loc in sistemul ce confine enzima, substratul si inhibitorul suni orezentate schematic astfel {iy | Spre deosebire de inhibitia competitiva, cea necompetitiva nu este dependenta de concentratia substratului, deoarece inhibitorul necompetitiv nu poate fi deplasat prin cresterea concentratici de substrat. Ambele complexe la care participa inhibitorul necompetitiv (EI si EIS) sunt combinatit inactive. Reprezentarea grafica a cineticii procesului de inhibiie necompetitiva a enzimelor este prezentat in fig.3.23139 Alls} Fig.3.23 1. - Curba de saturare cu substrat in inhibitia necompetitiva Il. - Graficul Lineweaver - Burk in inhibitia necompetitiva Din analiza cineticii de reactie se constata: @ - in reactia inhibata necompetitiy valoarea K,, nu se modifica; + iteza maxima a reactici enzimatice inhibat&é necompetiliv se micgoreazd, comparativ cu reactia neinhibata Deci si In comparatic cu inhibifia. competitiva, in inhibitia necompetitiva se produce concomiteat o modificare a vitezei maxime de reactie, precum gi a valorii Km deoarece insagi afinitatea enzimei pentru substrat se modifica. Cinetica de reacyie in inhibijia necompetitiva este net deosebiti de cinetica reacliei enzimatice fara inhibitor si de cinetica reactiei enzimatice in prezenta unui inhibitor competitiv (fig.3.24). Tipuri de inhibitori necompetitivi a) - Inhibitorii care actioncaza la nivelul cofactorilor, de obicei He"; HS; CN; CO. b) - Inhibitori ai gruparilor -SH libere ale enzimelor: acidul iodacetic, iodacetamida, paracloromercuribenzoat (RCMB); c) = Meltale grele care vor actiona asupra grupelor -SH_ libere ale cnzimelor:Ag, Hg, Pb. d) - Agenti de chelare: EDTA care formeazi complexe cu cofactorii.140 Vig.3.24 Reprezentarea cineticii de veactic in absenta catalizatorului (1); in prezen{a de inhibitor competitiv (2) gi in prezenta de inhibitor necompetitiv (3) 3.5.7.4 Inhibitia allosteric Autocoordonarea activititii celulare pentru mentinerea unui echilibru dinamic intre procesele de catabolism si cele de anabolism, reprezinté una din cele mai remarcabile proprictui ale organismelor vi Fig.3.25 Modularea activitatii enzimelor allosterice ie feed-back intr-o cale metabolica lineara; @ - inhibitit feed-back in cai metabolice cu ramificatii. Inhibijia prin intermediul produsilor finali de reactie, care intervine in toate etapele de biosinteza a compusilor de importanta biologica, este unul din multiplele mecanisme care acioneaza in reglarea metabolismului intermediar. Acest tip de inhibitic s-a numit inhibijic prin produs final ie de Lip feed-back141 sau retroin ; enzimele inhibate au fost denumite "enzime allosterice" Enzimele allosterice intervin in controlul si reglarea diferitelor secvente dintr-un lant metabolic, ceea ce constituie un fenomen necesar in cvolutia procesclor metabolice. Participarea enzimelor allosterice in mecanismele de reglare si control ale diferitelor cai metabolice se incadreaza in teoria allosterica (Jacob - Monod -Changeux, premiul Nobel 1965) ce se bazeaza pe interactiuni care se manifesta prin procese de activare si de inhibitie. Termenul “allosterism" desemneaza proprietatea caracteristicad a enzimelor allosterice de a functiona prin variatii (allo-) in anumite limite, ale conformatiei lor tridimensionale (-sterism). Efectorul allosteric care se leaga la situsul allosteric moduleaza anumite tranziti intre diferite conformatii pe care le poate lua molecula de enzima. 3.5.7.5 Postulatele structurii enzimelor allosteri Enzimele allosterice se caracterizeaza prin urmatoarele: a) - Reactiile catalizate de enzimele allosterice au un A G negativ, fiind d ireversibile; b) - Enzimele allosterice sunt proteine oligomere cu structura cuaternara, avand un numar par de protomeri (2, 4, 6 etc.) care ocupa pozitii echivalente si prezinta o structurd simewica; ©) - Enzimele allosterice posed’ doua situsuri de legare, un situs catalitic la care se leagaa substratul care este responsabil de activitatea catalitica, gi un situs allosteric la care se leaga selectiv si reversibil - e allosterici; aceste situsuri pot fi ocupate simultan; d) - Comportarea cinetica a enzimelor allosterice este diferita de cea postulata prin teoria Michaelis - Menten. Relaia dintre concentratia substratului si viteza de reactie ( curba de saturare cu substrat) indica pentru enzimele allosterice o curba cu aspect sigmoid, spre deosebire de celelalte enzime pentru care curba are aspect hiperbolic Aspectul sigmoidal al curbei la enzimele allosterice este datorat structurii oligomere a acestora, respectiv existenjei mai multor situsuri intr-o molecula in care se exercila efecte de cooperare: @ }+ cinetica de tip Michaelis-Menten b)-cinetica de tip allosteric Fig.3.26 Curba de saturare cu substrat a) - pentru enzime obignuite b) - pentru enzime allost ice©) - Intre situsul catalitic gi situsul allosteric exista interrelatii mutuale, desi legarea efectorului allosteric este independenta de legarea substratului SE 3.5.7.6 Mecanismul de actiune al enzimelor allosterice Asemanarea functionala dintre enzimele allosterice si hemoglobina, sau mai precis relatia sigmoidala dintre concentratia substratului gi viteza initial la enzimele allosicrice cu cea dintre presiunea partialé a oxigenului gi Jegarea lui de hemoglobina a dus la aparitia a doua modele in legatura cu modul de actiune al enzimelor allosterice. 1) - Modelul concertat simetric dat de Monod - Wyman - Changeux (MWC) 2) - Modelul secvential propus de Koshland - Nemethy - Filmer (KNF). Cele doua modele au cateva elemente comune: a) - Monomerii "coopereazi" in fixarea substratului gi, deci, in desfagurarea procesului catalitic; prin cooperare se intelege cA la fixarea substratului monomerii se influenteaza reciproc. Fixarea substratului de un monomer poate si mareasca capacitatea de fixare a acestuia de catre ceilal{i monomeri (cooperare pozitiva) sau poate diminua capacitatea de fixare a acestuia de catre ceilalti monomeri (cooperare negativa). Cooperarea se refera atat la intera sentrelor active (centre de acelasi tip) fiind cooperare homotropa, ca si inire centrele active si locusurile allosterice fiind interactii de tip heterotrop. Cele mai multe enzime allosterice sunt de tip mixt homotrop-heterotrop. b) - Interactiunile intre monomerii oligomerului nu implica modificari_ profunde (formare sau rupere de leg&turi covalente) Din acest motiv si pentru faptul ci modulatorii allosterici sunt compusi chimici, in fondul metabolic celular reglarea allosterica se face cu consum minim de energie. ¢) - Oligomerul poate exista numai in doud conformatii: conformatia T (tensionata, constransa), cu afinitate mica fata de substrat si conformayia R (relaxatit) cu afinitate mare peatru substrat. Cele doua stari se afl in cchilibru, constanta de echilibru fiind 1 (constanta allosterica) @ ft STAREA T STAREAR | I w Fig.3.27 Starea T yi starea R In cazul unci interactii de tip homotrop, fixarea substratului la starea T a unui singur143 monomer induce 0 modificare conformational’ concertati a tuturor monomerilor (pentru a tra simetria). Cu cét echilibrul Tae R este mai deplasat spre R, cu att fixarea substratului se produce mai usor justificdndu-se astfel cooperativitatea. ” it Fig.3.28 a) Modelul simetric MWC; b) Modelul secvential KNF La © enzima allosteric formata din patru monomeri starile posibile si legarea substratului sunt reprezentate in figura 3.28; probabilitatea maxima de existena o au starile din zona hagurata. Modelul secvential este mai elastic in raport cu modelul simetric, caruia i s-a imputat © anume rigiditate (prin postularea obligativitafii simetrici oligomerului), cat si faptul ca nu ofera © interpretare pentru cooperativitatea negaliva. Modelul secvential postuleaza si cl existenta celor doua stiri conformationale (R,T), dar spre deosebire de modelul simetric, subunitijile pot suferi schimbari secventiale individuale ale conformatiei, Intre stirile funcyionale sau nefunctionale exista stari conformationale intermediare ale moleculei de enzima, fiecare avand propria-i activitate catalitica. Legarea de catre primul monomer a substratului se face cu dificultate datorita starii T a tuturor monomerilor enzimei. Modificarea conformatiei acestui monomer va induce modificarea corespunzatoare numai a monomerului vecin, care va fixa substratul cu mai multi usurinté. In felul acesta modelul secvential, in comparatic cu cel simetric, ofera posibilitatea unci regléri sau modular mai fine a activititii enzimelor allosterice. Eigen considera cele dowd modele ca find cazuri particulare ale unei scheme mult mai complexe; dependent de particularitajile structurii tertiare gi cuaternare unele enzime actioneazé dupa modelul simetric, altele dupa modelul secvengial Sub aspect cinetic, Hill a stabilit o ccuajie cu valabilitate gencrala atit pentru enzimele Michaeline, cat si pentru cele allosterice.144 log ———— = ny log [S] - log K Vax - Vo unde Vo, Vine si [S] av semnificatile cunoscute; K - este constant specified pentru interactiunea enzima ligand; ny este "coeficientul Hil A empirica ce reflecta ata numarui locusurilor de fixare a liganzilor, cat si intensitatea interactiunii acestora. 0 constai | Vo. sr \ 5 og Vinax-Vo 3. ~ oe a) {S] Fig 3.29 Reprezentarea grafic& a ecuatiei Hill 1. pentru enzime lipsite de cooperativitate (pornind din origine) 2. pentru enzime cu cooperati ectie abscisii) 3. pentru enzime cu cooperativitate negativa (intersectie ordonat’4 VITAMINE SL COENZIME 4.1 Considerafii generale 4.1.1. Istoric. Generalititi Witamincle kunt substante naturale, diferite ca structura chimicd si, proprietii, cu activitalé biologica in doze foarte mici; nu constituie pentru organism_o. sursa energeticd.sau plastica, -dar-sunt absolut necesare pentru asigura a funcjiilor vitale. Aceste substante de origine animalt, vegetali, microbiana patrund in organism prin alimentatie. In general, cu mici exceptii, organismul animal nu este capabil si claboreze aceste substante din compusi simpli si intr-o micd m&sura la nivelul florei intestinale.Inca din antichitate se stia ca intre alimentatie si profilaxia anumitor boli existé o corelatie directa. Vitaminele se gasesc raspandite, in special, in regnul vegetal fie ca atare, fie sub forma de polivitamine, precursori inactivi care prin diverse transformari se transforma in vitamine. Lipsa vitaminelor din alimentatie conduce la boli carentiale - hipovitaminoze -determinate de carente vitaminice partiale si, in fine, avitaminoze - determinate de lipsa totaki a vitaminelor din alimentatic. Avitaminozele se manifesta prin anumite “leziuni biochimice" asociate cu disfunctii metabolice, moditicari structurale la nivelul unor (esuturi, imbolnaviri severe si infertililate. Aceste boli pot fi cauzate si de absorbtia defectuasa la nivelul intestinului, de consumul sporit (graviditate, cfort fizic intens, boala etc.), sau de existenta unor inhibitori specifici. Pentru vitaminele care se gasesc in mai multe variante structurale cu aceleagi efecte biologice, s-a introdus termenul de vitamere. Istoria vitaminelor, unul din cele mai importante episoade din istoria biochimiei, a avut un impact profund asupra sinatijii si a starii de confort, ca si asupra in{elegerii proceselor catalitice ce au loc in metabolismul organismelor vii. CAteva momente din istoria acestor descoperiri sunt prezentate in tabela 4.1. Fabela 4.1 Date importante in istoria vitaminelor Anul Numele (sursa) Descoperitea. Observati 1500 } Papirusul Eber Mentioneaza si descrie scorbutul Len. 1750, | G.Casal Semnaleazi pelagea in Spania 1887 | A. Eluber Tzoleazi vitamina PP 1997 | C.Bykman Provoacé experimental boala “beri-beri’ 1912, | Kazimir Punck Sugereazd denumirea de vitamina, 1912. | ¥.G. Hopkins Vitaminele nu sunt sintetizate in organismul uman. 1913 | Mae Collum Identificd vitamuna A in alimente. 1914 | K.Punck Toleazi vitamina By. 1916 ac Collum Desomacazi vitaminele cu litere: majuscule latine.146 Tabela 4.1 (continuare) 1921 | Mac Collum Vroleaza vitamina D,, 1922 | Me Lean Evans Descopera vitamina E. 1928 | Albert Srent-Gydrgyi Hzoleaza vitamina C. 13h A. Windaus Sintetizeaza vitanuna D,. 1932, | A.Windaus,D. Wiliams Determina structuta vitamines B, 1933) | R.Rubn Yzoleaza vitamina B,. | 1934 | C.P.Damm si Me.Parlane Descopera vitamina K in spanac. | 1934 | P.Gydrgyi Descoperd vitamina B, 1935. | Van Euler,O. Warburg Descoperd corelatia vitamine-enzime. 1936 | E.Kogl Descopera vitamina K in ou. 1936. | H.Evans Jeoleaza vitamina E. 1940 V.Du Vigneaud Izoleaza vitamina H. 1953. | 1.3 Reed, L..C.Gunzalus Teoleaz acidul lipoic. 1958 | Dorothy Hodgkin Stabileste siructura vitaminei B,, 1960 | Emest Lester Extrage vitamina B,, din ficat de bou. 1972 | Robert Woodward Sinteza in Jaborator a vitaminei B,» 4.1.2. Clasificare. Corelatia vitamine - enzime. Antivitamine Din punct de vedere structural, vitaminele apartin unor clase de substanje foarte diferite si singurul criteriu de diferentiere arbitrar al acestora este solubilitatea. Se disting: I. Vitamine liposolubile (solubile in lipide si in solventi organici): Vitaminele A, D, BE, K I. Vitamine hidrosolubile (solubile in apa): Vitaminele B (By, B>, Be, Bio, Bis), acidul pantolenic, biotina, nicotinamida, acidul lipoic, acidul folic, acidul para-aminobenzoic, vilaminele P, vitamina C. Majoritatea vitaminelor hidrosolubile detin un rol major in reactiile biochimice catalizate de enzime, functionand in calitate de coenzime. Viiaminele cu rol de coenzime participa direct la manifestarea activitatii enzimelor respective, fic ca vitamine propriu-zise, fie ca derivali ai acestora sub forma de esteri fostorici, esteri pirofosforici si nucleotide; aceste vitamine cu functii de coenzime intervin in reactii de oxidoreducere gi de transfer al unor grupari chimice. Exista uncle vitamine care actioneaza si in procesele de oxidoreducere din organism (vitamina C, B, K, Biotina). Existé compusi de constitutie foarte asemanatori cu vitaminele, analogi structurali ai acestora ~ antivitamine - care prin inhibitie competitiva impiedica incorporarea vitaminelor in sistemele enzimatice in care joaca rolul de cocnzime; aiecteaza sistemele enzimatice, la care participa vitaminele, deturneaza evolutia normala a anumitor procese biochimice cu cusiuni nefavorabile pentru buna functionare a organismului. , sulfonamidcle si chiar uncle enzime care rep Ca antivitamine se comporta antibiotic inactiveaza diferite vitamine cum ar fi ascorbaza care actioncazA asupra vitaminei C, a care actioneaza asupra Vitaminei By, lipoxigenaza oxideaz’ provitaminele A. ura vitaminelor este eterogena, coexistind ata denumiri chimice, cat gi tiamin Nomenc! denumiri empirice uzual Denumirea uvuali a diferitelor vitamine poart& indicativul unor Jitere sau deriva de ina si, respectiv, de la efectele produse prin carenta la efectele fiziologice pe care le deters147 Jor (vezi tabela 4.3). In tabela de mai jos sunt prezentate cateva din exemplele mai reprezentative ale corelatici vitamine-enzime. ‘Tabela 4.2. Vitamine cu functii de coenzime gi tipurile de reactii enzimatice la care participa Nr. Coenzima. Tipul de Gruparea crt Teactie. transferata. 1. | Riboflavina | Flavin adenin Oxido- H (B). dinucleotid(PAD), | reducere. 2. | Nicotinamida | Nicotinamid adenin | Oxido- H (PP). dinucleotid (NAD). | reducere. 3 ‘Tamind Tiamin pirofusfat. | Transfer, (By) grupare acil. oO 4. | Acid lipoic. Acid lipoic. ‘Transfer Mi grupare acil. R -C- 5. | Acid Coenzima A Activare gi oO pantotenic. transfer I grupare acil R-C- 6. | Piridoxal Piridoxalfosfat, ‘Transaminarea -NH> (By). aminoacizilor. 7. | Biotina Biotina Fixare CO). co, 8. | Acizii folici. | ‘Tetrahidrofolat Transfer -CH,-OH,CO, (PH). fragmente CH, CHO monocarbonate 9. | Corinoide Coenzima& Conversia Rearanjare (By). (B,,). metil-malonil | intramolecula- CoA, ri, 4.2 Vitamine liposolubile. Din aceasta categorie fac parte vitaminele A, D, E, K, avand ca o caracteristica esential insolubilitatea in apa gi solubilitatea in solvengi organici. Catena laterala a vitaminelor din aceasta categorie este formata din resturi de izopren sau izopentan ji reprezinta faze intermediare in sinteza de colesterol.148 Tabela 4.3. Vitamine, roluri principale gi efecte carentiale Vitamine Rol biologic principal Efecte carentiale principale Retinoli (A) Chimism vizual Hemeralopie i Xeroftalmic Keratomalacie Ieiferoli (D) Metabolismul fosfocaleic | Rahitism Tocoferoli (E) Antisterilic Sterilitate Antioxidant Miodistrofie Menattone (K) Biosinteza protrombinei | Hemoragii Tiamine (B,) Decarboxilare Polinevritt Riboflavina (B,) ‘Transfer H Dermatite Nicotinamida (PP) Transfer H Pelagra si dermatite Piridoxina (Bs) Metabolism aminoacizi Dermatite Biotina Carboxilare Dermatite Acizi folici Transfer unitati Anemie monocarbonate id pantotenic ansfer grupéiri acil Dermatite amino benzoic | Formarea acizilor folici Tulburari de cregtere vide (Bip) Biosinteza Hem Anemie pernicioasa Biosinteza ADN | Acid ascorbic | Oxido-reducere Scorbut Bioflavonoide Permeabilitate Fragilitatea vaselor sanguine 4.2.1 Vitaminele A Vitaminele A sau retinolii se gasesc raspandite in natura sub forma de provitamine, facand parte din clasa carotenilor, care sunt de origine exclusiv vegetala. Plantele nu_ sintetizeaza relinoli, prezenta acestora in diferitele {csuturi animale rezultind din transformarca provitaminelor ingerate. Carotenii sunt pigmenti nesaturati polienici, cu catene constituite din 20-50 atomi de carbon, derivati ai condensarii izoprenului, prezentand 0 larga raspandire in toate plantele (unde se gisese in asociere cu clorofila), in alge si microorganisme. Carotenii se caracterizeaza din punct de vedere structural printr-un sistem de duble legaturi conjugate $i prin prezenta la capetele catenei a unor cichiri iononice: a, 8 si y pseudoiononice Carotenii ingerati se absorb prin peretele intestinal in prezenta lipazelor sia biliare: absorbtia este insofit’ de reactii de oxidare si izomerizare.149 Carotenoidele absorbite se acumuleaza in diferite organe, mai ales in ficat, ovare, lapte si galbenusul de ou sub forma de esteri cu acizii grasi superiori ‘G. H,C\ CH, CHg see ‘ [Bionona] [& ionona , fi ou diona d H3CyCH, Transformarca carotenilor in vitamina A se face la nivelul ficatului sau peretelui intestinal. Structura si proprieti{i. Retinolii sau vitamina A se prezinta in douad forme structurale denumite retinoli (vitamina A,) si dehidroretinoli (vitamina A,), ambele forme sunt alcooli primari nesatura{i continand un ciclu beta-iononic, care le confera activitatea biologicd si o catend lateral cu 9 atomi de carbon H.C -CH3 CH3 CHa HyC_ CH; GHz CH, | 3 3 HjOH >< cHpH| CH, SCH; [Retinol] __{ Behicroretindl ] Formarea retinolilor in organismul animal se produce prin scindarea oxidativa a carotenilor in prezenta enzimei carotenaza. Cel mai important dintre caroteni este beta- carotenul din care se obtin prin hidroliza enzimatica doi moli de vitamina Ay. H3C | | | | | | TINOL, a ‘4 CH3 CH HyC “CH 3 | LC. CH, CHs CHs tO Re ee Axi RETINAL { NADH + HY eae |G shed | |150 Retinolul manifesta cea mai intensa activilate vitaminica, iar produsul de oxidare al acestuia (acidul retinoic) are numai 40% activitate, iar dehidroretinolul 60% din cea a retinolului Roluri biologice. Retinolii si derivatii lui indeplinese functii biologice si fiziologice multiple: - stimuleaza procesul de crestere in inaljime si in greutate; ~ previn aparitia unor leziuni ale tractului epitelial, keratinizarea epidermei gi a mucoaselor; ~ intervin in biosinteza proteoglicanilor; @ =~ asigura functionarea normali a aparatului genital, spermatogeneza gsi reproductia normali, prevenind avorturile; @ - stimuleaza organele hematopoetice; ® - protejeaza epiteliile, cu activitate antiinfectioasa si confera rezisten{a organismului; @ - intervin in functionarea normala a ochiului, cu rol in biochimia procesului vizual. Biochimia procesului vizual. Procesul vederii se realizeaza in cadrul unui "ciclu vizual" la care participa retinalul, retinolul si pigmenii fotosensibili de natura proteic: rodopsina si porfiropsina - in celule din retina tip "bastonase" si scotopsina si idopsin’ - in celule de retina tip "conu Retinolul si retinalul intervin in ciclul vizual ca stereoizomeri hd | INTUNERIC. i : 1 ' ' _ > [RODOPSINA }~ -7> Influx nervos COPSINA x HW ociecretinen x —Retinen_izomeraza___ —{“Ali-trans-retinen * a ae NADH + H ~ Teatpen Areductaza —— Seen: Alle trans Fett || Fig, 4.1. Ciclul rodopsinei151 Senzatia luminoasa, mediatd de bastonase, ia nastere in urma absorbtiei cuantelor de lumina de c&tre rodopsina. Absorbtia de lumina determina insd descompunerea rodopsinei in opsina gi retinen (all-trans); aceste transformari sunt asociate cu producerea influxului nervos. Pentru receptia unei noi cuante de lumini este necesara refacerea rodopsinei. Refacerea rodopsinei are loc relativ incet Ja intuneric si in stratele profunde ale bastonaselor (ande lumina nu pitrunde), proces catalizat de enzima retinen-izomeraza. O mare parte din retinen (all-trans) este redus sub influenta unei dehidrogenaze alcoolice (NADH dependenta) transformandu-se in vitamina A care trece in singe; rezulti cd refacerea rodopsinei va depinde de cantitatea de vitamina aflata in circulatie. Se admite ca forma cis a retinenului are o configuratie. care se potriveste mai bine decat cea a formei trans cu dispozitia spatiala si suprafata exterioara a opsinei. De aceca intre grupul aldehidic al 11-cis-retinenului si un grup amino liber dintr-un aminoacid diaminomonocarboxilic cuprins in opsina are loc o condensare cu formarea unei baze Schiff de tipul R-CH=N-opsina (in care R = radicalul 11-cis-retinen). FEfectele carentei vitaminei A. Carena in retinol poate fi consecinta unei alimentatit sdrace in provitamine, a unor defecte de absorbjie a vitaminelor respectiv a provitaminelor, sau imposibilitatii conversici provitaminelor in vitamine. La om carenta in vitamina A se manifesta prin mai multe semne clinice, care dupa gravitatea Jor au fost denumite: hemeralopie, xeroftalmie si keratomalacie, Hemeralopia, sau “orbul gainilor", se manifesta prin aceea cd bolnavii nu mai sunt capabili sa se orienteze la lumina crepusculai Daca avitaminoza A este accentuaté sau de lunga durata, edemului retinian ii urmeaza modificari degenerative mai mult sau mai putin grave: uscarea conjunctivei, sclerozarea coreci, orbirea; aceasta stare este cunoscuta sub denumirea de xeroftalmie. Keratomalacia este determinat’ de 0 avitaminozd A avansata gi se manifesta prin inmuierea gi sclerozarca comeei, concomitent cu © atrofie si o regresiune a globului ocular. Keratomalacia este 0 afectiune acuta care progrescaza rapid si de obicei, afecteaza ambii ochi La nivelul aparatului urogenital apar modificari ale cpiteliilor germinative ale testiculului, mucoasei uterine si vaginale; prezenja celulclor keratinizate in lichidul vaginal duce la un estru prelungit denumit colpokeratoza. Surse de vitamina A, Atat in organismul animal cAt gi in plante se pot gisi diversi carotenoizi, dintre care unii sunt dotati cu proprieta{i de provitamine A. La animale, este probabil sa fie de origine exogena alimentara Tabela 4.4 Continutul vitamina A a unor alimente Sursa. Sursa. UL/100 g. Unt Pomate, 1100-3000 Oua 1100-1140 Banane 500 Lapte 10-230 Cartofi 3800-7700 Branza 1200-1740 Ulei de peste. 40000-400000 Vicat 4000-45000 Somn 30-25000 Carne de vit 0-50 Sardele 136-290 Ulei de palmier 100000 Ton 70-200 Morcovi 10000-20000 Zarzavat 80-1200152 UI/100 g. - Unitafi internationale la 100 g aliment, In tabela 4.4 sunt prezentate date privind continutul in vitamina A al unor alimente pa Matilda Rosetti Coljoiu, 1980). 4.2.2 Vitaminele D Mai in infantil caracterizata printr-o mineralizare intarziat& a oaselor; oasele nu ajung si hidroxilapatita in cantitate suficienta gi, de aceea ele sunt relativ moi gi flexibile. La adulti boala carentiala corespondenta rahitismulai se numeste osteomalacie, caracterizata printr-un bilant negativ al calciului. Ambele boli se datoresc unei scideri a continutului scheletului in substante minerale. Faptul c& vitamina D poate sa vindece rahitismul, administrata ca atare sub forma de untura de peste (bogata in vitamina D), a facut ca aceasta vitamina si fie considerata ca vitamina antirahitica. Vitaminele D se gasesc raspindite in cantitati mici sub forma de provitamine derivind de la micosteroli, fitosteroli si zoosteroli. Pe langd aportul exogen relativ scdzut in calciferoli, omul si animalele beneficiaza de cai naturale de obtinere a acestora.sub actiunea radiafiilor ulfraviolete ale luminii solare asupra provitaminelor de natura sterolica din piele. Mecanismul de formare al vitaminelor D. Sub actiunea radiatitlor ultraviolete se yealizeaza deschiderea ciclului B din structura sterolilor cu rol de provitamine gi se constituie un sistem de duble legaturi conjugate in ciclul B deschis. Acest proces de transformare 2 vitaminelor in vitamina D a fost studiat in special la ergosterol. Transformarea crgosterolului in vitamina D, este unproces fotochimic ireversibil care se produce in functic de energic si de lungimea de unda a luminii absorbite (275-300 nm) gi in care apar ca produsi intermediari: tumisterolul si tahisterolul. a) Inu-o prima etapa, ergosterolu! in care gruparca metil din pozitia 18 se afld in fafa lor A si B, deci unit prin legatura f, trece in lumisterol la care acelasi metil se afla in lurilor A si B, deci unit prin legatura a Ai a fost cunoscutd la copii maladia datorita carentei vitaminei D, rahitismul si fixeze cichir spatele [ Lumisterol | [Ergosteral} b) In etapa secundara, se rupe legatura intre Cy $i Cy din ciclul B, concomitent cu stabilirea unei duble legaturi intre C, si Cyo, Substanja rezultata se numesie tahisterol (desi nu mai este sterol) ©) In urmétoarea etapa are loc o rearanjare a dublelor leg uri care ajung sé formeze tin153 sistem cu trei duble legaturi. In urma acestei rearanjari, tahisterolul trece in ergocalciferol. vot] {Lumistero CH; CH CH, ——— CH, | [Tahisterol] [ Er gocalciferot } Structura generalaé a vitaminelor D esie: R Pentruactivitatea biologica este necesara c = prezen(a grupei OM in pozitia 33 -ciclul B deschis; -prezen{a a trei duble legaturi HO conjug: = Rol biologic. Surse. Pentru organismul animal cei mai importan{i calciferoli sunt: ergocalciferolul (vitamina D,) si, mai ales, colecalciferolul (vitamina D,). Date recente au demonstrat ca vitamina I) participa la procesele metabolice sub doua forme active obtinute prin hidroxilarea sa suplimentara in pozifiile 1 si 25. HO’ ys) | ( 1-25 Dihicroxicolecatciferol J ([2 Hlcroxicclecalciferal] Formarca acestor compusi are loc in fieat si rinichi conform schemei din fig.4.2.ii 154 Tabela 4.5 Structura si denumirea calciferolilor Vitamina | Provitamina Denumirea Structura R Ds Ergosierol. Brgocaleiferol “Ui D, 7-Dehidro- Colecaleiferol } colestero. XK ghee D, 22-Dihidro- | Dihidro CH, ergosterol. | ergocalciferol | 7 Ds 7-Dehidro- Dehidro C,H, sitosterol. sitocaleiferol I O De 7-Dehidro Dehidro CoH stigmasterol stigmacalciferol |S. Ratie alimentara ( colecalciferol } [gt | RINICHI SINGE ~[ ee (colecalciferot ) Piele 7 ~ dehidr ocalesterol| | 4 1,25- Dindroxicolecaleiteral a Muschi scheletic Hig 4.2 Circulatia vitaminei D in organism155 1,25-DHCC se comport ca un hormon. Activitatea sa se manifesta la nivelul intestinului subtire unde controleaza gi absorbjia calciului, la nivelul nucleilor celulari unde influenteazi transcriptia ARN mesager; participa la formarea sistemelor de transport al calciului, inclusiv a celor controlate de cdtre parathormon., Calciferolii si 1,25 DHCC exercité urmatoarele functii: @ ~ previn si vindeca rahitismul; @ - mares permeabilitatea celulelor mucoasei intestinale pentru ionii Ca’* si actioneaza ca factori de reglare a calciului in organism; @ - induc formarea si controleaz4 producerea unei proteine specifice care leaga calciul in mucoasa intestinal (aceasta proteina Calmodulina - leaga si transporta calciul in raportul de 4 ioni Ca’* la o molecula de proteina); @ - asigura mentinerea in raporturi constante a ionilor de Ca’* si POY, prin stimularea absorbtiei calciului in intestin si a resorbtiei renale. a fostatilor; @ - intervin in procesul de osteogeneza, determinand osificarea normala; @ - stimuleaza glicogenogeneza hepatica si musculara. enja vitaminei D determina rahitismul la copii, osteoporoza si osteomalacia la C: adulti, insojita de o crestere a activititii fosfatazelor alcaline din ser cu eliberarea consecutiva de fosfor din diferijii compusi organici, tetanic datoritt sc&derii accentuate a calcemici gi iritabilitate accentuala. Principalele vitamine D sunt raspéndite preponde. ent in regnul animal (vezi tabela 4.6 ~ dupi Matilda Rosetti Coljoiu). Tabela 4.6 Continutul in vitamina D al unor alimente Sursa Ulla 100 g Micrograme la 100 g Ulei de ficat de morun 8000 - 12000 200 - 300 Galbenus de ou 200 - 500 5-125 Ficat de vit 20 - 200 0,5 -5 Unt 40 - 100 1-12,5 4.2.3 Vilaminele E 5 4 6 3 Vitaminele F sau tocoferolii sunt substante de origine vegetala care intervin in procesul de 7 fertilitate fiind denumite si factorii antisterilitatii. 2 of Tocoferolii sau vitaminele E reprezinta [ cROMAN ] denumirea genericaé a unui grup de compusi chimici derivati de ia heterocitul roman (dihidro benzopiran). Tocoferolii deriva dintr-o structura de baz comuna denumita tocol care are grefali pe nucleul croman radicalul OH in poitia 6 si radicalii metil si fitol in pozitia 2. In functic de natura radicalilor Ry, R,, Ry, avem toati gama tocoferilor:156 CH3 CH, CH, CH, 0 (CH2],—CH—(CH,},—CH—(CH2)3—-CH—CH, R3 Tabela 4.7 Constitutia chimicd a tocoferolilor Tocoferolii | Ri(5) | RA(7) | R3(8) Denumire chimicd Alfa (a) -CH, | -CH, | 5,7,8,- trimetil - tocol Beta (B) -H -CH, | 5,8, - dimetil ~ tocol Gama (y) | -H -CH, | -CH, | 7,8, - dimetil - tocol Delta (4) -H H CH, 8 - metil - tocol Ipsilon («) H -CH, -H 7 - metil - tocol Zeta (%) -cH, | -CH, | -H 5 - metil - tocol Roluri biologice. Vitaminele E sunt denumite gi vitaminele antisterilitatii, deoarece ipsa Jor determina la barbati sterilitatea ireversibild, iar la femei intarzierea dezvoltarii embrionului gi avortul, Activitatea ant maxima 0 are « tocoferolul si scade in sensula > B > y > 6 Vocoferelii manife ivitate antioxidant protejand contra oxidarii gi formirii de peroxivi acizi gragi nesaturati, retinolii si carotenii. Proprietatea antioxidamta si de participare ca transportori de hidrogen in procesele de oxidoreducere se bazeaz% pe urmatoarca real eversibila care se petrece cu deschiderea ciclului piranic gi trecerea de la forma croman Ta forma chinona. ie CH, CH3 HO: Hac S2H=HO i ‘ 07 SR “hac 0 HOT cy, CH, CH, [ TOCOFEROL [ & TOCOFERILCHINONA J Activitatea antioxidanta scade in sensul invers activitafii antisterilice (vezi fig,157 Fig.4 Rolurile Eo biologice ale tocoferolilor we @ Tocoferol fi 6 Tocoferol In calle, tocoferoi | sunt localizati in : mitocondrii a, aceasta a fcut ee a si se emita ipoteza ACTIVITATE ANTIOXIDANTA 20000 interventiei lor in lanqul respirator prin intermediut = sistemului redox tocoferol - tocoferil chinondé. De asemenea, tocoferolii protejcaza anumite enzime care participa in procesul de respiratie celulara, intervin in controlul vitezei de biosinteza a ADN, favorizeaza sinteza cromatinei, participa in reglarea consumului de oxigen in {esutul muscular, cresc rezistenta organismului fata de infectii etc. Un alt rol specific al vitaminei E in organism este interventia sa in metabolismul seleniului i s-a remarcat conlucrarea acestui element cu vitamina E in procese antioxidante. Stare naturala. Vitaminele F sunt foarte raspandite in natura in toate plamtele verzi, precum si in unele microorganisme producatoare de clorofili Sur i imai bowata in Vitamina B o-constituie uleiurile vegetale, in care Contindtul in’ Vitaitiina TE este proportional cu Cantitatea de acizi grasi nesaturaqi. In organismul animal si uman tocoferolii provin din alimentatic, predominand in {esutul adipos si in glandele suprarenale; in organismul feminin sese cantit&ti globale de tocoferoli mai mari ca in cel masculin. “TACTIVITATE ANTISTERILICA ‘Tabela 4.8 Continutul in tocofcroli al unor alimente ( Dupa Matilda Rosetti Coltoiu, 1980). Sursa mg tovoferol Sursa mg tocoferol 100 g 100 g 225 Ulei de soia 118 Spanac Ulet de porumb 100 Usturot {38 Ule de floarea soaretui 50 Patrunjel 3,5 Ulei de arahide Uler de germeni de orez Ulei de bumbac 92 Rinichi de vita 8-1 Ulet de ricin 45 Ulei de ficat de peste 30 - 45 marin158 4.2.4 Vitaminele K Vitaminele K sunt vitaminele coagularii sau antihemoragice; lipsa lor determina predispozijii la hemoragii (diateze hemoragice) datoriti prelungirii timpului de coagulare a singelui. Sunt sintetizate de catre partile verzi ale plantelor sau de catre flora microbiana 4 intestinului gros, Flora microbiana constituie 0 importanta sursi de vitamina K pentru organismul uman si animal care devine astfel, mai putin expus carentei vitaminice K Vitamineie K deriva de la metil naftochinona. 7 Substunjele cu activitate biologicd in a caror 0 constituyic intra. 2-metil, 1-4 naflochinona poarta denumirea genericd de menaftone. Ele se diferengiaza a prin natura radicalului R sau a substituentilor din CH, | »acleul nafiochinonic. | De precizat ca vitaminele K naturale fac parie SS R din categoria vitaminelor liposolubile in timp ce vitaminele K sintetice sub forma de clorhidrati sunt hidrosolubile (vezi tabela 4.9) 0 Vitaminele K, una in raport cu alta, sunt caracterizate drept vitamere (termen introdus pentru vitaminele care prezinia mai multe variante structurale). Fuocolul (2-metil-3hidroxi-nafiochivona), constituent al membranelor lipidice din bacilul Koch, are si el activitate de vitamona K fabela 4.9 Caracteristicile vitaminelor K SE == Solubilitate Denumirea stiintifica famine K | Liposolubi Vuamiaa K, | Liposotubi Larnochinone mina K, | Hidrosolubila. | Menadiona. Vitamina K, | Hidrosolubila. | Clorhidrat de 2-metil 4-amino {-nattol. Vitamina K, | Hidrosolubila. | Diclorhidratul de 2-metil 1-4 Diamino naftalen ij Hidrosolubila Diester de menadiona. Vitamina K, | Hidrosolubila. | Clorhidratul de 2-metil l-amino 4-naftol. Roluri biologice ale vitaminclor K Rolul biologic fundamental al vitaminelor K in procesul de coagulare a sangelut este posibil datoritd participarii acestora in biosinteza protrombinei, care intervine in coagularea singelui, nivelul sedzut al protrombinei (asociat cu diminuarea factorilor VIL, 1X si X) determina cresterea timpului de coagulare al sangclui (de Ja 12-15 see. la 30 see.) gi fenomene hemoragice (in aceste condifii protrombina este insuficienta pentru a fi convertita159 intr-o cantitate corespunzatoare de trombina, enzima proteolitica implicata in etapa finala a procesului de coagulare a singelui) Ciroza sau alte afectiuni hepatice dau efecte de avitaminozd K, deoarece scade ficatului de a meds esac ou nisculi, in primel le zile dupa hastere, 0 CH, CH H CH;-CH att cucu pon CH [Vitamina K1] Oo CHs Hs CH, CH cH=C— cH a 0 0-CO-R [Vitamina K2] [ Vitamina K3] | cH, OH NHS cr CH, CH; O-CO-R | NH3CU NH3Cl | [Vitamina K4] [Vitamina K5] [Vitamina K 6 ] Fig.4.4 Structurile principalelor vitamine K Deoarece flora intestinald sintetizeazi o parte din necesarul de vitamina K, tratamentul cu antibiotice, bacteriostatice, bactericide determina 0 hipoprotrombinemie; din aceasta cauza tratamentul de mai sus se asociazd cu vitamine din complexul B care au rolul de protectie a florei intestinale. Pe de alta parte, vitaminele K intervin in reacjii de oxidoreducere yi participa in procesele de respiratic celulara, functionand ca transportor de hidrogen cu localizare intre dehidrogenazele NADH-dependente si citocromi160 Ubichinona sau coenzima Q care participa in lanjul respirator are o structura asemanatoare. in mitocondriileorganismelor superioare predomin’ ubichinona in care numarul radicalilor izoprenoide H.C-0 cH din catena laterala este egal cu 10(UQ;). Hs 3 R: Antivitamine K In organismul animal, vegetal, ca gi in micro- organisme au fost puse in evidenté numeroase substante cu 0 actiune vitaminica K. In tabela 4.9 sunt consemnate princi- palecle surse alimentare de vilamina K (dupa Matilda Rosetti). T amina K | Aliment (100 g). mg. vitamina K | a — | Produse animale i i i. Cenopid 1. Carne de oaic 0,1 - 0,2 || 2. Prenze castan 2. Carne de pore 0,1 - 0,2 i 4. Lucena | 3. Came de vit 0,1- 0,2 4. Spanac | 4. Ficat de pore 0,4 - 0,9 | 5. Tomate verzi 5. Ficat de vita 0,1 - 0,2 6. Uraica 6, Lapte de vaca 0,002 7. Varza 7, Lapte de femeic 0,02 Necesa rul zilnie de vitamina K pentru un adult este de 2 mg. Antivitaminele K sunt substanfe cu structuré asemanatoare vitaminelor K, dar care exercila o actiune fiziologica antagonista. Principalii compusi cu actiune antivitaminica K fac parte din trei grupe mari: a) derivati de la cumarina: dicumarol, warfarina; b) derivati de la indandion: 2 fenil indandiona: co) derivati de sinteza: diftiocolul, 2 clor 1,4-naftochinona. Acesti compusi sunt folositi in clinica in cazuri de tromboze (flebite, embolii, ctc.), cdnd este necesar s@ se intarzic coagularea sangelui, deoarece cheagurile formate spontan produe accidente grave, uncori mortale161 00 0 0 [DICUMAROL } 4.3, Vitamine hidrosolubile Aproape toate vitaminele hidrosolubile fac parte din complexul B: B,, By, By, By, nicotinamida, acidul pantotenic, biotina, acidul lipoic, PAB, acizii folici; vitaminele C si P sunt considerate separat Datorita progreselor remarcabile ale biochimiei in ultimii ani, in prezent se cunosc si mecanismele intime ale proceselor in care vitaminele hidrosolubile sunt implicate; asifel vitaminele hidrosolubile ca atare, sau ugor modificate sub forma de coenzime, intra in structura unor enzime ce catalizeaza reactii fundamentale in cadrul_metabolismului intermediar. Vitaminele complexului B prezinta urmatoarele caracteristici: @ ~ sunt solubile in apa si termolabile; @ - indeplinesc functia de coenzime; @ - aciioneaza ca activatori stimuland diferite procese metabolice si intervin in reglarea acestor procese; @ - constituie factori de crestere pentru microorganisme; - sub forma de coenzime uncle vitamine participa in procesele energogeneratoare; - majoritatea pot fi sintetizate de catre microflora bacteriana din rumen si intestinul gros, o parte din necesarul organismului din aceste vitamine fiind furnizata pe aceasta cale. 4.3.1 Vitami Cc Boala determinata de lipsa vitaminei C - scorbutul - se intélneste Ia om, unele maimule gi cobai, acestea fiind singurele fiinte care nu-I pot sintetiza. Incapacitatea acestor mamifere de a sintetiza acidul ascorbic se datoresie absentei din ficat a enzimei L-Gulonoxidaza care intervine in ultima etapii a sintezei de acid L-ascorbic Structura. Proprietati. Acidul ascorbic este din punct de vedere structural lactona acidului 2-3 endiol - 1. gulonic si ii corespunde formula de mai jos. Biosinteza acidului ascorbic la plante are drept precursori monozaharide din seria D; la animale biosinteza constituie 0 deviatie a ciclului acizilor uronici Caracterul acid ii cste conferit de existenja in molecula sa a gruparii endiol care disociaza cu punere in libertate de ioni de H", acidul L-ascorbie transformandu-se in forma sa oxidata, acidul L-dehidroascorbic.162 AcidulL-dehidroascorbic poate fi redus de catre o=C H diferiji agenti reducatori H ot 1 si in primul rand, de T 0 HO—H.C—C—OH catre glutationul redus HO—C 5 0 (G-SH). ! Roluri biologice. H —% \ o | Parvciparea —acidului te asvorbic in diferite HO—C —H H | procese biochimice este a] | determinata si corelatii de H.C 0H see ; OH OH capacitatea sa de a forma [Acid L-Ascorbic] un sistem reversibil de oxidoreducere. Intervine ca transportor de hidrogen in reactiile catalizate de oxidoreductaze (dehidrogenaze, catalaze, peroxidaze, citocromoxidaze). | | | | | H,C—-0OH 2 | [Acid L-Ascorbic ] [Acid L-Dehidroas ! : oa Ca atare, sau sub forma de acid dehidroascorbic, vitamina C participa la unele transforméiri pe care le sufera in organism diverse categorii de substanje: aminoacizi, steroizi, acid folic ete. In majoritatea cazurilor aceste transformari constau in hidroxilari cu participarea oxigenului molecular si acidului ascorbic. 0, R -H +Acid L-ascorbic ——*-——» R - OH +. Acid L-dehidroascorbie H,O lati cdteva exemple de reactii metabolice in care participa acidui ascorbic (abeta 4.10)163 Tabela 4.10 Procese metabolice in care participa acidul ascorbic Nr. | Procesul metabolic. Tipul de reactie 1. | Prolina —+Hidroxiprolina Hidroxilare-cu acid ascorbic 2. | Tirozina —*DOPA Hidroxilare-cu acid ascorbic 3 Dopamina —+Noradrenalina Hidroxilare-cu acid ascorbic 4. y-Butirobetaina —*Carnitina Hidroxilare-cu acid ascorbic 5. | Colesterol +Acizi biliari Hidroxilare-cu acid ascorbic 6. | Steroid --Hidroxisteroid Hidroxilare-cu acid ascorbic 7. Triptofan —+Hidroxitriptofan Oxidare-cu acid dihidroascorbic & Acid folic —eAcid tetrahidrofolic Reducere-cu acid ascorbic 9, | Fe Fe?’ Reducere-cu acid ascorbic Formarea colagenului sia substantei intracelulare este incd una din funefiile biologice de bara ale acidului ascorbic. Cercetirile experimentale au aratat rolul acidului ascorbic in producerea fibrelor si maturatia reticulului de colagen. Lipsa vitaminei C intarzie cicatrizarea ranilor si consolidarea fracturilor, datorité faptului ci formarca fibrelor este ingreunat Cercetari recente au pus in eviden{a posibila interventie a acidului ascorbic in activitatea hormonala. Aceasta este evidenfiata dacé se iau in considerare urmatoarele observatii: a) activitatea multor hormoni este mediati de AMP-ciclic; b) formarea AMP-ului ciclic este catalizata de adenilateiclaza care la randul ei este activatit de catecolamine; ©) biosinteza catecolaminelor are loc cu participarea acidului ascorbic in procesul de hidroxilare. Deci, un nivel corespunzator de vitamina C in organism, asigura formarea de AMP. ciclic necesar unei bune activitati hormonale. Boala determinati de lipsa vitaminei C - scorbutul - prezinti urmatoarele simptome: @ - fragilitate capilarai cu hemoragii discrete la nivelul piclii, mucoaselor si articulajiilor; $ -inflamatii necrotice ale gingiilor, mobilitatea si caderea dintilor; alterari in procesul de formare a oaselor yi dintilor care capata un caracter spongios; @ - scaderea revistentei la efort si infectii In stadiul avansat survin: f pra, cangren uncori complicatii pulmonare (pleuresii, pneumonii, tuberculoza etc.) hemoragii viscerale, necroze osoase gi Acidul ascorbic are o larga rispandire in regaul vegetal, in bacterii gi mucegaiuri. In tabela 4.11 sunt menfionate o serie de alimente de origine vegetal bogate in acid ascor164 Tabela 4.11 Confinutul in acid ascorbic al unor alimente (dupa Matilda Rosetti Coljoiu, 1980) Surse mg Acid ascorbic | Surse mg Acid ascorbic /100 g /100g, Afine 160 Macese 400 - 600 Ardei 160 Mazare 18 ‘ 8,5 Mere 5,9 6 - 24 Patrunjel 180 10 Ridichi 1S 49 Spanac 80 100 Sparanghel 44 40 - 60. ‘Tomate 24 Fasole verde 26 Urzici 350 Fragi 58 varza 180 Gui ig Zmeura 28 2 Vitamina P Albert Szeni-GySrgyi constatd cai in produsele naturale, acidul ascorbic este asociat cu o substantit caze fi potentear: antiscorbutic’. Ulterior subst vitamine P (ale pe a demonstrat ca aceasta WA actioneazd : bilitzitii) Vitaminele P sunt derivati de la flavond (quercitina) gi prezinta constitutia unor slicozizi Cole mai raspandite in natura sunt: rutinul si hesperidina. Componenta glucidica a celor doi derivati este un dizaharid numit rutinoza (R) format din ramnoza si ghicori OH OO OH [ RUTINA] [HESPERIDINA] oe 5 => Oo oO tT D g = 6 _ a I Oo ap | | or | = f | = Flavonoidele sunt foarte raspandite in regnul vegetal, mai ales in flori si fructe, insofind acidul ascorbic in citrice, maces, fructe de padure. In organismul uman bioflavonoidele stimuleaza biosinteza adrenalinei si asigurdi permeabilitatea vaselor sanguine yi rezistenfa acestora. la rupere, manifesta actiune165 farmacodinamica intensificand tonusul cardiac si ind tensiunea arteriala. Datorita structurii lor, este posibil s& participe ca transportori de hidrogen in reactii de oxido-reducere, activitatea acestora fiind corelat& cu cea a acidului ascorbic. Carenta in vitamina P se manifesta prin fragilitatea vaselor sanguine, tulburari ale permeabilitatii acestora, hemoragii locale ete. 4.3.3 Vitamina B, Vitamina B, a fost denumita "aneurin" datorita actiunii sale antinevritice. Denumirea de "tiamina" este cea mai noua si cea mai utilizata, deoarece molecula sa contine sulf si o grupare amino. Vitamina B, se géiseste predominant in plante, in special in leguminoase, in seminte si drojdie, dar este raspanditi i in regnul animal Tn tabela 4.12 este indicat continutul in vitamina B, pentru o serie de produse alimentare (dupa Matilda Rosetti Col{oiu). ‘Tabela 4.12 Confinutul in vitamina B, al unor alimente Sursa. mg Vitamina B, | Sursa mg Vitamina B; la 100g la 100g. Arahide 0,5-1 Mazaire uscata 0,3 - 0,5 Carne de vita 0,05 - 0,2 Muschi bovine 0,04 - 0,1 Drojdie us 3 - 30 Nuci 0,3 - 0,5 Drojdie de bere Ln Ou (galbenus) 0,05 - 0,15 Ficat de vita 0,2- 0,4 Ovaz Germeni de grau 1,2 - 3,7 Paine integrala Jambon,rinichi 05-1 Paine alba Leguminoase 0,5 - 0,9 Seminte cereale 2,5- 5,6 Lapte 0,04 - 0,07 | Soia 0,3 - 1,2 Structuri. Roluri biologice. Tiamina este cich tiazolic legate print-o punte metilen. NH, . @ A" N CNH nek, H-CQOEC— CH CHS OH Forma activa a iaminei 0 constituie esterul sau pirofosforic denumit tiaminpirofosfat (TPP) care se transforma prin fosforilarea vitaminei in prezenta ATP gi a ionilor Mg?*.166 a i imatice; a-celoacid ctolaze gi si | fosfocctolaze. In mecanismul tor are > atomnul de H disociaza ca decarboxilaze, a-cetoacid oxidaze, t camoxaze,, oeceloscld-oxideze reaciTt Togul de actiune este C, din ci proton rezultand un Carbanionul format participa in reactia de decarboxilare a « cetoacizilor. De exemplu, acidul piruvic este decarboxilat pana la acetaldehidd dupa urmatorul mecanism: HC EH wn In deficitul de tiamin’, metabolizarca acidului piruvic nu se mai produce, fapt care determina acumularea acestuia in lichidele si {esuturile organismului, ceea ce antreneaza o serie de manifestiri patologice, caracteristice bolilor de avitaminoza B,: crampe musculare, fenomene toxice pentru sistemul nervos, tulburiri cardiace, edem, somnolenti, oboseala,167 atonie gastrointestinala, tulburari de resorbtie, pierdere in greutate etc. Tiamina intervine gi in alte procese biochimice ca: stimularea biosintezei lipidelor din glucide, reglarea metabolismului glucidic si al unor procese energogeneratoare, stimularea activitalii acetilcolinei- mediator al transmiterii influxului in sistemul nervos vegetativ. In medie omul adult are nevoie de 2 mg vitamina B, /24 ore. 4.3.4 Vitamina B, Generalitati. Raspandire. Vitamina B, se mai numeste si riboflavina potrivit structurii sale de flavina (pigment galben) cu radical ribitil. I se mai spune si lactoflavina, deoarece a fost identificata in lapte. Riboflavina este foarte raspandita in natura, in bacterii, drojdie de bere, ciuperci si alimente de origine animala yi vegetala (vezi tabela 4.13, dupa Matilda Rosetti Coljoiu). Tabela 4.13 Continutul in vitamina B, al unor alimente Sursa mg. vit. B,/L00g Sursa mg. vit. B,/100z Albus de ow 0,30 - 0,45 Lapte de vack 0,1 - 0,2 Galbenus de ow 0,20 - 0,60 Mavaire yscativ 0,13 - 0,30 Brana 03 Paine integrala 0,15 Carne O41 - 0,4 Rinichi vita 0,8 - 2,5 Drojdie de bere 2,5 - 5,0 Soia 0,13 - 0,30 Ficat de vit 1,7 - 3,0 Varzi 0,13 - 0,30 Structura. Roluri biologice. Riboflavina face parte din clasa flavinelor gi este constituita din ciclul izoaloxazind pe care sunt grefati doi radicali metil si, in acclasi timp, este atasat un radical ribitil (derivat de la riboza). eee [RIBOFLAV INA] H-€—C—E—C—CH,—OH | ROA OA Riboflavina in forma sa libera se gaseste in lapte, retina, lichidul seminal. In celule, riboflavina se. afla exclusiv sub forma combinataé cu proteinele (flavoproteine sau flavocnzime) fiind un constituient a doua coenzime flavinice:168 FMN-Flavinmononucleotid; FAD- Flavinadenin dinucleotid, care functioneaz’ ca transportori de hidrogen in sistemele de oxidoreducere biologic’ f HOH OHHH * 4 N Ne eo [Flavin Mono-Nucleotid] i —FMN [ HOH OOH OOH Me | Hotei ‘ | $—C—t—C— cerry (a ‘ | y Hac—k NH 0 '3 N7 C7 1 th 0<-P—0—CH, 3 1 OH | [Flavin Adenin-Dinucteotid] FAD109 sau schematic Existd peste 40 enzime flavinice oxidoreducatoare. Rolul riboflavinei se extinde si asupra altor procese biochimice, cum ar fi: biosinteza hemoglobinei, stimularea producerii de HCI de catre mucoasa gastric’, actioneaza in procesul vederii transformand radiatiile luminoase cu lungime de und’ mica in lumina cu lungime de unda mare, perceptibila, pentru care ochiul are o sensibilitate mai mare. Carenfa de riboflavina se manifesta prin: dermatite cheiloza (inflamarea gi fisurarea colturilor gunii), glosodimie (sensibilitatea dureroasd a limbii), limba magenta (limba devine rosie purpurie si foarte dilatata), oboseald vizuala, vascularizarea accentuata a corneci etc. Tabela 4.14 Enzime flavinice Enzime FMN dependente Enzime FAD dependente - Citocrom reductaza - D-Aminoacid oxidaza L-aminoacid oxidaza - Xantinoxidaza Glucozoexidaza Succinatdehidrogenoza Lipoildehidrogenaza ~ Acil CoA-dehidrogenaza Fermentul galben al lui Warburg 4.3.5 Vilamina PP Generalitati, Raspandire. Vitamina PP este vitamina care inlatura simptomele pelagrei - pelagropreventiva. Pelagra (pella agra - "piele aspra" - 1b. spaniol) se intilneste in randul populatici consumatoare de porumb gi este cunoscuta sub numele de "maladia celor D": dermatita, diaree, dementa Vilamina PP sau nicotinamida este raspanditi in jesuturile animale si vegetale, dar mai poate fi furnizaté organismului si de catre flora bacteriana din intestin, care are capacitatea de a o sintetiza avand ca precursor ornitina; nicotinamida poate fi sintetizata si in diferite {esuturi animale, precursorul fiind insa triptofanul. Zeina, proteina din porumb este siracd sau lipsii de tiptofan, ceca ce explica prevalent boli a consumatorii de porumb. In tabela 4.15 este prezentat conjinutul in nicotinamida al unor alimente (dupa Matilda Rosetti Coloitt, 1980)170 Tabela 4.15 Continutul unor alimente in nicotinamida Sursa mg/100g Sursa mg/100g Drojdie de bere 40-62 | Ficat 10-27 Grau 2,8- 5,0 | Inima 5,9 Cartofi 1,0- 1,2 | Rinichi 6 -10 || Ovaz 0,9 Muschi 3-10 Orez nedecorticat 1,6- 2,4 | Carne de vila 44-49 Porumb 1,3- 1,5 | Lapte 0,4 - 1,0 Structurd. Rol biologic. Nicotinamida deriva din acidul nicotinic, ambele substante tivitate vitaminica si poarta denumirea generica de niacina. poseda COCH ao" 3 [Acid nicotinic] [Nicotinamida] Nicotinamida indeplineste 0 functic biochimica esenfiala in calitate de componenta « r 7 NH» ‘P)=-PO,H | | | CO—NH) rm Si CHy-O—P—0—P—0—0—CH; YoY | 0 0 HOH H H OH OH R=H ~NAD’ R=€P)->NADP” structurii coenzimelor NAD" si NADP". NAD! - Nicotinamid adenin dinucleotid. NADP® - Nicotinamid adenin dinucleotid fosfat.1 NAD* si NADP* functioneaza drept coenzime a fumeroase enzime oxido- reducatoare, Mecanismul de actiune este urmatorul: CO—NH- CO=NH> +2H N 1 R NAD) + +H NADP* In general, NADH cedeaza H enzimelor din catena de respiratie celulara, pe cand NADPIT i! cedeaza sistemelor enzimatice care intervin in reactiile de bi Carenta de nicotinamida se manifesta prin simptome ca: iritabilitate, anxietate, lipsd de apetit, intarirea si uscarea pielii. Pelagra se datoreste si incapacitatii organismului de a transforma triptofanul in nicotinamida, cum ar fi in cazuri de: alcoolism cronic, cirozi hepatica etc. De mentionat si faptul cd porumbul confine analog: structurali ai triptofanului ce actioneaza ca inhibitori competitivi, blocind conversia triptofanului in vitamina PP. 4.3.6 Piridoxina (vitamina B,) Generalitati. . Descoperirea vitaminei Bg este legata de numele lui Goldberg si Lilie (1926), care au stabilit existenta unui factor,care este eficient in tratamentul unei nalite caracteristica la sobolanii supugi unei diete carentate in vitamina By, numita acrodinie; boala se caracterizeaza prin inflamajia si descuamarea piclii extremitatilor. Vitamina B, este raspandita in regnul animal si vegetal, asociata cu celelalte vilamine ale complexului B. Vabela 4.16 Continutul in vitamina B, al unor alimente (dupa Matilda Rosetti Coljoiu, 1980) Sursa mg/100g | Sursa | mg/100g Banane 0,50 Carne de vitel 0,57 Cartofi 0,22 Ficat de pui 0,63 Grau 0,40 Ficat de pore 0,51 Moreovi | 0,90 cat de vie — | 0,71 Ores 0,15 Lapte de vac | 0,05 Paine alba | 0,10 Oua 0,68 Portocale | 0,05 Rinichi de pore | 0,32172 Structura. Rol biologic. Denumirea generica de vitamina B, include un numar de trei compusi derivaji de la piridina si anume: piridoxol, piridoxal si piridoxamina. CoH oO H,C—NH, | | 2 | | HO CH,-0H CH.-OH HO CH OH | | H,C Hac | | N N: | [PiRiDOXOL | { PIRIDOXAL | [ PIRIDOXAMINA ] Forma este piridoxalul, in care sunt convertite celelalte doud forme. Derivatul fosforilat al piridoxalului - Piridoxalfosfatul (PALPO) - indeplineste rolul de coenzima in toate transformarile neoxidative ale aminoacizilor: transaminarea, decarboxilarea, dezaminarea, racemizarea, precum $) biosinteza sfingofosfolipidelor. In calitate de coenzima, piridoxal fosfatul participa gi la alte reactii speci aminoacizi ca terconversia serinei gi glicocolului, sinteza triptofanului, transformarea triptofanului in acid nicotinic, transulfurarea, biosinteza hemului, stimuleaza hematopoeza ele. S-a demonstrat ca in toate enzimele care implica participarea piridoxalfosfatului drept 2 labil de gruparea amina a lizinei (sub forma de aldimina) din srvetura envimei respective. coenzima, aceasta se h Lizinil-Enzima >O-PO;H™ | H.C | Nv sttus catalitic Calabolizarea-aminoacizilor sub actiunea PALPO presupune intr-o prima etapa, formarea unei baze Schiff intre piridoxal si aminoacid. Aceasta determina 0 deplasare electronica de Ja carbonul alfa al aminoacidului spre avotul electrofil din ciclul piridinic al piridoxalului. In acest mod, aminoacidul este activat in vederea transformarilor urmatoare:H-C=#0 + HjN—C—COOH H-C=N-C—COOH me A 4 HO CHr Oe) HO CH-0-P) __ HESS -H,0 HC Carenta in piridoxina produce: dermatite, anemii severe, uncori convulsii asociate cu tulburari profunde ale sistemului nervos central, diminuarea ritmului de crestere,sciderea nivelului hemoglobinei si colesterolului seric, precum gi cresterea in greutate a unor organe (ficat, rinichi, suprarenale). 4.3.7 Acidul pantotenic Generalitati. Raspandire. Acidul pantotenic este un compus universal rispandit, din care cauza simptomele carentiale apar destul de rar. Acidul pantotenic se gaseste réspandit ca atare sau sub forma sa activa, Coenzima A, in organele cu un metabolism intens (ficat, rinichi, icrele si lapfii de peste), precum gi unele produse biologice, in care se concentreazi produsi biologic activi, cum este laptisorul de mated, cortexul cerealelor etc. In organismul uman mai este sintetizat si de citre flora intestinal Tabela 4.17 Continutul in acid pantotenic al unor alimente (dupa Matilda Rosetti Coltoiu, 1980) Sursa mg Acid pantotenic Sursa mg Acid pantoter 100g 100g Ficat de mamifere 40 - 100 Ciuperci 20 Galbenus de ou 70 Cereale 10 - 20 Lapte de vaca 2-5 Cartoft 6 Lapte de femeie 2-4 Fasole 8-10 Muschi de mamifere 40 - 20 Macare 8-10 Peste 10 Portocale 1-3 Rinichi de mamifere 40 Spanac. 2 Structura. Rol biologic. Acidul pantotenic este constituit din acidul pantoic (y-dihidroxi-B8-dimetilbutiric) gi -alanina, unite printr-o legatura amid substituita. Poseda un atom de carbon asimetric, izomerul natural fiind cel dextrogir. Biosinteza sa este realizati de microorganisme si are ca precursori acidul izovalerianic pentru acidul pantoic si acidul aspartic pentru f alanin’. Importanta biochimica a acidului pantotenic, deriva din faptul ca el este constituent structural al Coenzimei A (CoA—SH) cu rol determinant in metabolismul glucidic, lipidic si hormonal Participa 1a metabolismul energetic fiind una din substantele cu caracter macroergic. Structura Coenzimei A a fost elucidata de Lippman, iar sinteza sa a fost realizata de Moffat si Khorana.wet fl ia ‘ HE —C—C—C~OH + H.N—CH)~CH,-COOH OH CH, OH “Hone 7 Gh Hue —t —C-—C—N—CH;-CH,-COOH OH CH; OH H [Acidul PANTOTENIC } Coenzima A prin gruparea sa tiolicd, poate stabili legdturi macroergice cu majoritatea acizilor gragi existenji in celule, pe care-i tansporta in vederea oxidarii enzimatice, participa in decarboxilarea oxidativa a acidului piruvic, in acctilarile biologice gi in biosinteza acizilor gragi | H,03P-O OH GH; u Oom~ f —— 0 ——H,C ——€ — € —CO—NH— CH=CH CO | | on cH, CH perme ee | yh | | N’ N | | N J preg | O——H,C CoA ~ SH SH! | | 0 | | O—--P—OH ve | HoH | | | CH, | | H H 2 Structura ¢175 Pe de alta parte, in biosinteza acizilor grasi liberi mai intervine o protein transportoare de grupari ACIL (PTA) sau in terminologia anglo-saxona Acyl Carrier Prot (ACP), care participa in procesul de transport al acizilor grasi prin membrana mitocondriala; gruparea Sa prosteticd fosfopantoteina contine acid pantotenic. OH / ~ [FOSFOPANTOTEINA] 0-—P-0H oy i: ra H iH 0 Hl a 0-CH,-C-G-G-N-C-C-O-N-C-C-SH I i] 6H0H0 HH KA Prin gruparea tiol a pantoteinei molecula PTA—SH functioneaza ca un transportor de grupari acil formand tioesteri la gruparea sa tiol, in mod analog cu Coenzima A La om nu se cunoaste un sindrom determinat de carenfa acestei vitamine, deoarece este foarte raspandita in natura gi, pe de alta parte, este sintetizati de catre flora intestinala. CAnd, din diverse cauze, aceasta deficient apare, simptomele caren{ei sunt multiple si variate: varsdturi, dureri abdominale, crampe musculare, infectii ale cailor respirator’ sensibilitatea organismului la alte infectii. Datorita acestui ultim efect se pot produce si alte tulburari: hipoglicemic, reducerea fizice, disfunctii ale nervilor motori, etc. 4.3.8 Biotina eralitati. Raspan In 1940 Albert Szent-Gydrgyi a aratat c& biotina este identica cu vitamina H - factorul care impiedica intoxicarea cu albus de ou crud. Du Vigncaud, in 1942, stabileste structura biotinei gi doi ani mai tarriu se realizeazi sinteza sa. Biotina este universal rispanditi in microorganisme, drojdii, organisme animale si vegetale. Surse bogate in biotind sunt ficatul si rinichiul mamiferelor (100 -250 mg/100g); gailbenusul de ou cu un continut de cca. 50mg/ 100g, laptele 5-10mg/ 100g, fructele si legum proaspete. Cea mai mare parte din biotin’ necesara organismuhi uman si animal asiguraté de sinteza bacteriana la nivelul intestinului. Structuri. Rol biologic. Biotina rezulta din condensarea unui ciclu tetrahidroimidazol si un ciclu tetrahidrotiofenic substituit. Biotina se gaseste in organism sub forma libera si mai ales, sub forma de Angele uman prezinta o enzima biotinolaza datorita careia hidrolizeaza biocitina la biotin si lizina Rol biologic. Biotina indeplineste functia de coenzima, participand in reactiile enzimatice de transfer al gruparii carboxil, respectiv reactiile de carboxilare st decarboxilare a cetoacizilor. In reactiile de carboxilare catalizate, biotina, in calitate de coenzima, functioneazd ca un transportor de CO,(COO). Mecanismul de reactie implica participarea unei proteine cu masa moleculara mica (20.000) denumita Proteina-Biotin-Carboxi-176 Transportoare (PBCT), care leagd covalent 1 mol de biotina prin intermediul lizinei. In prezenta enzimei biotin carboxilaza PBCT este carboxilaté prin fixarea CO,, formand un complex intermediar carboxil - biotinil - proteina. Tabcla 4.18 Tipurile de biotin’ Pormula | structar: | “Tipu dl de generala © dennmir | biotina - - - enicnpannnees Snopes TPH CH=CH) fee Biotina | | COOH CH; j i 0 i | Acid i izov: alerianic 1! | c ON | HN7 NH | | | | | | —(CH),— COOH | £6 Biotina] i r { Acid valerianic ] | | | Hy CHR nt 7 { i Re | BL (CH2),-CO i ' Aa (cH), i [ Biocitina | HC NH» | &-N-biotini | t-hising | coon { lt Acid valenanie + Lisina |) | Pra 3 ee ese aranmecneas We O- a ow “ r HC. CH= (CH, = CO—NH—LISIL S$ In urmatoarea etapa a reactici de carboxilare, gruparea COO™ este transferata pe o7 molecula acceptoare. In tabela 4.19 sunt prezentate cdteva procese in care biotina participa in calitate de coenzima. Tabela 4.19 Enzime biotin dependente Enzima Reactia catalizala 1) Acetil-CoA-carboxilaza Acetil CoA +Co,*Malonil~_CoA 2) Propionil-CoA-carboxilaza Propionil—_CoA +CO#*Metil malonil— 3) Pituvat - carboxilaza Piruvat+CO—Oxalilacetat 4) Metil malonil-CoA- Metil malonil—CoA + Piruvat—— -carboxitransferaza Propionil——CoA + Oxalilacetat Modul cum intervine o enzima biotin dependenta este prezentat in exemplul de mai jos care ilustreazd carboxilarea acidului piruvic (ctape cheie din gluconeogeneza) —"="00C-PBCT + ADP + Pi COO" Trans CH2 ley meet _ Biotin - PBCT + HCO; + ATP = carboxilaza Q |b) OOC—PBCT + CH; te COOH =— GO carboxilaza COOH In toate sistemele enzimatice de carboxilare biotina in stare potential functionala afla numai sub forma de complex proteic analog cu PBCT; sub aceasta forma, biotina isi manifesta capacitatea de a fixa reversibil CO, necesar reactiilor de carboxilare si, respectiv, uanscarboxilare. Biotina este implicata in procese biochimice de o imporianja deosebita: # - biosinteza acizilor grayi gi a colesterolului; # — biosinteza si interconversiunea unor aminoacizi; @ - biosinteza bazelor purinice gi pirimidinice; @ - biosinteva proteinelor tisulare gi enzimatice; @ - biosinteza acidului aspartic si oleic + PBCT Carenta biotinica este rara, deoarece flora intestinala sintetizeaza biotina in cantitati corespunzatoare. Efecte carentiale s-au constatat la om si animale hranite cu oua crude. Albusul de ou contine o proteina bazica - avidina - care poseda o afinitate accentuata pentru biotina; avidina blocheaza biotina sub forma unui compus inactiv, actionand ca un inhibitor al sistemelor biotin dependente. Simptomele carentiale se manifesta prin: dermatite la extremila{i, paloarea pielii, somnolen{a, oboseala, dermatita seboreicd insopita de astenie, dureri musculare gi precordiale. Toate acesie tulburiri se suprima prin administrarea parenterala de biotina.178 Biotina mai poate functiona si ca transportor neenzimatic de hidrogen conform reactiei de mai jos: 4.3.9 Acidul lipoic Acidul lipoic sau acidul tioetic repreinta 0 substania cdireia i se atribuie caracter de vitamina, degi au s-a putut pune in eviden{a o avitaminoza tipicd fata de aceasta substanta. © justificare pentru inctuderea sa in grupul vitaminelor 0 constituie fapiul cd, in anumite procese envimatice, esentiale, pentru metabolismul intermediar, acidu! lipoic joaca un rol de cocnzima comparabil si complementar celui indeplinit de unele vitamine ale complexului B (tisnina, riboflavina si niacinamida) Acidul lipoic se afla raspandit in diferite tesuturt: ficatul si drojdia constituie surse cin acid Lipoic. Se gaseste sub forma legata cu proteinele, din care este cliberat prin Structura. Acidul lipoic are o structura relativ simpla, care consti din opt atomi de carbon si din doi atomi de sulf, i confer si denumirea de acid tiotic (1.2 diticlan-3-valerianic), In {esuturi se giseste att sub forma oxidat’i, cat si redusd (acid dihidrolipoic) Acidul lipoic a)oxidat; b)redus179 Forma biologic activa, cu functie de coenzima, este lipotiaminpirofosfatul (LTPP) produsul de conjugare al acidului lipoic cu esterul pirofosforic al tiaminei; cele dowd componente se unesc printr-o legituri de tip amidic - CO - NH - care se stabileste intre gruparea carboxil a acidului lipoic si gruparea aminic’ fixata de Cs din ciclul primar al tiaminei. | : ecm | CHy—N CHs oH oH | new Soicici alt Bk CH, Lhe CH:0-P-0-P-CH s—'s | v DIPOTIAMIN PIRDEDSEATUL {LTPP} Q Lipotiaminpirofosfatul (TPP) functioncaza ca un sistem oxido-reducator reversibil “SH Principala functie biologica a acidului lipoic 0 constituie participarea sa in reactia de decarboxilare oxidativa a a cetoacizilor (acidul piruvic si @ ceto glutaric), sub actiunea complexului multienzimatic piruvat dehidrogenaza In afectiunile hepatice care se manifesta cu o dereglare a metabolismului cetoaci se administreaza acid lipoic. 4.3.10 Acidul para amino benz: Acidul p ~ aminobenzoic (PAB) este cunoscut de mai bine de 100 de ani; este considerat ca vitamina din momentul in care s-a consiatat actiunca sa antagonist fai de sulfamide | [acta p-amino benzoic} [ Acid p-amino benzsulfonamida] Este raspandit in-plant combinata find constituent al aci {esuturi animale si microorganisme sub forma libera si ilor pteroilglutaminici (acizi folici).180 PAB participa la formarea acizilor pteroilglutamici intervenind in procesul de crestere, stimuleaza biosinteza acidului pantotenic si a biotinei, intervine in metabolismul fierului, favorizand transportul acestuia la organele hematopoietice, interactioneaza cu sulfonamidele administrate, in raport cu care manifesta o actiune antagonista. Sulfamidele prezinta analogic structural cu PAB si se comporta ca antivitamine; exercita si un efect bacteriostatic, inhiband cresterea bacteriilor. v bela 4.20 Continutul in PAB al unor alimente(dupa Matilda Rosetti Coltoiu, 19805 Sursa PAB/100g_ | Sursa PAB/100g Drojdie uscatd 123 - 264 | Muschi 0,6 Drojdie proaspatt | 32- 64 | Rinichi 6,6 0,6-0,8 | Tomate 1,0 - 1,9 2,6 Zer de lapte | 1,9 - 3,8 Mecanismul prin care se realizeazd acest efect se bazeavi pe proprictatea sulfonamidelor de a substitui PAB in structara acizilor pteroilglutamici (acizi folici) acizi cu structura astfel modificatd nu-gi mai pot exercita actiunea lor de stimulare a cresterii bacteriilor. Proprietatea sulfamidelor de a se comporta ca inhibitori_necompetitivi in biosinteza acizilor folici sta la baza utilizarii lor in combaterea unor boli infectioase 3.11 Acizii foli Generaliliiti. Raspandire. Acidul folic a fost izolat din spanac si din plantele verzi unde este Fispandi foarte mult, dcoarece au capacitatea de a-| sintetiza. In organismul animal tc cel mai bogat {esut in acid folic, iar carenja in acid folic duce Ja incetinitea resterii gi la diferite forme de anemie. In tabela 4.21 se prezinta continutul in acid folic al unor alimente. ‘Vabela 4.21 Centinutul in acid folic al unor alimente(dupa Matilda Rosetti Coltoiu, 1980). Sursa ing Ac. folic | sursa mg Ac.folic /100g 100g Carne de vila 30 - 100, Drojdie 200 - 800, Carne de vilel 20 - 170 Fasole verde 90 - 100 Galbenus de ou 30 Germeni de grau | 330-1100 Ficat de vita 150 - 450, Grau 50 - 200 Ficat vijel 430 - 880 Grape-fruit 24 Lapte de femeie - 50 Mere 8 Rinichi de vita 30 -- 100 60 - 150 Spanac 100 - 300, 17 | fomate 40 - 10 90 - 100181 Structuri. Rol metabolic sai sunt denumiti generic Folaci Acizii pteroilglutamici incluzand acidul folic si derivatii Acidul folic contin trei clemente constitutive: a) - pleridina substituita; b) - acid para - aminobenzoic; c) - acid glutamic, care se condenseaza. 2-Amino- 4- hidroxi Acid ! | 6-metil pteridina p-aminobenzoic COOH In _ st Acid ‘ptercic | Acid glutamic ee a np ere _ Acid Pteroilglutamic In jesuturile vii, acidul pteroil monoglutamic (n= 1) este insofit de derivatii sai, acidul pleroil glutamic (n=3) si pteroil hepta glutamic (n=7); sub aciunea unor enzime denumite conjugaze, acesti derivali se transforma in acid pteroilmonoglutamic. Acidul folic ca atare are rol de vitamina, insi derivatii rezultali prin reducerea sa in celule, si anume dihidrofolic (FH,) si acidul tetrahidrofolic (FH,) functioneaza in calitate de coenzime. OH N N Saas Yeo R a cc se HN Sy SH HN wos { | H 4 Acid dihidrofolic (FH) Acid tetrahidrofolic (FHe y Acidul folic (F) se transforma in acid dihidrofolic (FH,) sub aciunea enzimei folic intr-o etapa ulterioara intervine enzima dihidrofolic reductaza care reduce FH; la182 acid tetrahidrofolic (I'H,), coenzima in ambele cazuri este NADPH. 2) F + NADPH + Ht —+FH, + NADP* b) PH, + NADPH + Ht —*PH, + NADP’ Acidul tetrahidrofolic, in calitate de coenzima, indeplineste un rol central functionand ca transportor al fragmentelor monocarbonate pe care le activeaza gi Ie transporta in diferite reaclii de biosinteza. COOH CH — wl os we re COOH ‘Transportul fragmentelor C, de la o substanta la alta se realizeazi de e&tre FH,, care formeara derivati Ng, Nyo sau NjN,o tetrahidrofolici Fabela 4.22. Part = aial erse procese parea FH, in | Gruparea N. Reactia catalizati fee eu sto |) Formil -CHO + Biosinteza purinelor || Formiming -CH=NH | + Ac. glutamic-Histidin Glhicocol - Serina { Hidroximetil, -CH,-OH + || Metil -CH, 4 Homocisteina-Metionina | Metilen CF + | + | Serina - Glicocol [a etenil -CH= + + Biosinteza purinclor Astfel FH, intervine ints-o serie de procese, cum ar fi: biosinteza bazelor purinice gi pirimidinice, conversiunea uracilului in timind (formarea ADN-ului), sinteza N - formil metioninei (implicala in reactia de initiere a biosintezei proteinelor), interconversiunea. metionina-colina (participand astfel_ in metabolismul aminoacizilor si a_ fosfatilor), transformarea glicocolului in serina, in biosinteza Hemului si a histidinei. Prin participarea sa la biosinteza bazelor purinice si pirimidinice, deci la biosinteza acivilor nucleici se subliniazi rolul fundamental pe care-I joaca acidul folic in cresterea si reproducerea celulara. Legdnd acest rol de faptul ca celulele sanguine sunt supuse unui ritm de sintezd si dislocare, se intel usor de ce deficienta de acid folic se waduce printr-o anemic caracterislica. Pe de alti parte se injelege de ce formarea leucocitelor este inhibata imediat de antagonistii acidului folic, utilizati in tratamentul leucemiilor: acidul 4 amino folic (aminopterina) si acidul 4-amino-10-metil folig(metotrexatul). In celulele neoplazice, acest compusi difuzeaza pe baza unui transport activ, mai ugor decat acidul folic gi acidul tetrahidrofolic, perturband procesele in care aceslia iat parte in mod normal.183 4.3.12. Vitamina B,; Generalitati, Raspandire. Descoperirea vitaminei By, a avut ca punct de plecare observatia, Ricut in anul 1926 de Minot si Murphy ca ficatul crud, consumat in cantitati mari, are actiune curatiya in anemia pernicioasi de tip Biermer. Aceasti observatic a constituit punctul de plecare a numeroase cercetiiri biochimice si fiziologice intreprinse pe parcursul a 20 de ani, care au condus la izolarca factorului antipernicios din ficat, realizata concomitent de Folkers si Rickes in SUA si de Lester Smith in Anglia. Structura sa complicata a fost elucidaté in 1955, printr-un efort comun al unor colective heterogene de cercetatori din care au fcut parte: chimisti, fizicieni, biologi, cristalografi, matematicieni, sub indrumarea lui Dorothy Hodgkin si E.L.Smith: Utilizarea vitaminei B,, in terapeutica a fost posibila din punct de vedere economic, dupa ce sa observat ci unele microorganisme ca Streptomyces griseus, Bacillus meghaterius, Streptomyces olivacens, sintetizea7a si elibereaza in mediu de cultu i importante de vitamina B,,; vitamina B,, constituie deci un produs secundar al fabricarii streptomicinei. Vitamina B,. se gaseste rispindita numai in organismul animal si in microorganisme, pentru care constituie un factor de crestere. ‘Tabela 4.23. Conjinutul in vitamina B,, al unor alimente (dupa Matilda Rosetti Coltoiu 1980) Sursa Micrograme | Sursa Micrograme fa 100 g la 100g Branza 20 Lapte de femeie 0,003 - 0,15 Ficat de pore 20 - 180 Lapte de vaca 0,3- 1,2 Ficat de vité 30 - 150 Qua intregi 5-1 Ficat de viel 240 Splina de vitel 95 Galbenus de ou | 10- 40 Stridii 15 - 280 Heringi 9-1 Rinichi de vita 20 - 32 Structura vitaminei B,,. Vitamina B,, reprezinta un grup de compusi biologic activi, care contin in structura lor nucleul corinic. Componentele vitaminei B,,sunt urmatoarele: a) Un macrociclu derivat de la porfirina (corina) format din patru nuclee pirolice (A,B,C,D) cu gase duble legaturi conjugate, intr-o aranjare diferita de accea din nucleul porfirinic: trei pun{i metinice de legatura la trei nuclee pirolice. La acest nucleu sunt fixate opt grupari metil la atomii de carbon (C resturi de acetamida (C),.,) si patru resturi de propionamida (Cy 2,15) 3,12,12,13,17)» WEL b) Un nucleotid format din 5,6 dimetil-benzimidazol, ribofuranoza si acid fosforic, se184 numeste Ribazol c) 0 moleculd de aminopropanol: H,N - CH, - oH - CH, OH care stabileste legatura dine nucleotidul mentionat cu ciclul corinic, prin intermediul acidului fosforic din structura nucleotidului si un rest de propionamida din pozitia 17 a ciclului D (legatura se face prin eliminarea unei molecule de amoniac). CH CH, d) Un atom de cobalt trivalent situat in centrul nucleului tetrapirolic fixat prin legaturi coordinative de atomii de azot ciclurilor A,B,D,D si legat in acelayi timp de atomul N, [RIBAZOL |] din ciclil imidazolic al 5,6- dimetil-benzimidazolului Datorit& prezenjei atomului de cobalt, vitamina B,, se mai numeste si cobalamina De atomul de cobalt central se pot lega diferite grupari ca: -CN, -OH sau -NO,, iar cobalaminele care contin. aceste grupiri poarta denumirea de ciancobalamine, oxicobalamine, sau nitrocobalamine. Cianocobalamina (vitamina B,, propriu-zisa) este 0 substanta cristalina, constituita din ace rosii rubinii, care se descompun fara topire la temperaturi mai mari de 300°C. Este solubila in ap, alcool metilic, alcool etilic, insolubilé in acetona, eter, cloroform. In solutie apoasd, vitamina B,, prezinta un spectru de absorbtic caracteristic cu maxime la 272, 361 si 560 nm. Rol biologic. In organismul uman, vitamina B,, se gaseste predominant sub forma de coenzima denumiti coenzima B,). Aceasta rezulta prin conversia vitaminei B,, a cirei grupare -CN este inlocuité cu radicalul 5’-adenozil sub acjiunea enzimei coenzim-B,, sintets Coenzima B,, intervine intr-o serie de procese: a) - Catabolismul propionatilor - Propionil Coa apare ca recultat al catabolismului acizilor grasi cu numar impar de atomi de carbon gi al timinei.185 CH;—CONH> CH, CH, CHy CH,-CONH, ~S \ NZ vitamin (ciano- cobalamina) oO 9 OH VITAMINA B12 c—c [ ciancobalamina] S Hee Ho ANey HO-CH, ~o i scaiss HescNON CH,—CH,—C ~SCoA “8M GAREOE AAS CH, CH C-~SCoA > [PROPIONIL-CoA] COOH ([METIL MALONIL CoA] q sats »HO0C—CH,—cH.—L~scoa (KREBS ) [SUCCINIL- CoA] eS b) - Transformarea acidului glutamic in acid B-metilaspartic sub acjiunea glutamatmutazei si in prezenta coenzimei B,;186 NH) NH) CH, 4 GLUTAMAT MUTAZA I | HOOC —CH—CH;—CH;—COOH > HOOC—CH—CH—COOH [ACID GLUTAMIC] [ACID BMETIL ASPARTIC, SH NH, CH, S—CH, NH> | | | COENZIMA 8 12 | | CHCH—CH—COOH + [FH] => H.C—CH— CH—COOH d) - Reducerea ribonucleozidtrifosfatilor la 2’-dezoxiribonucleozidirifosfapi. In aceasta reactie sunt implicate doua proteine: tioredoxina, continand o grupare disulfurica si tioredoxin reductaza, 0 enzima ce catalizeazi in prezenta NADPH, reducerea legaturil disulfurice din molecula tioredoxinci. Tioredoxina redusi efectueaza in prezenja 5'- orinoidului reducerea nucleozidtrifosfatilor (NTP) la deoxinucleozidtrifostati deoxiadenozil (d-NIP) Vitamina B,, prezinta un spectu larg de actiune intervenind in reaciiile de metilare, carboxilare si biesinteza ADN, biosinteza Hemului, biosinteza proteinelor, ca. si stinularea anabolismului protic gi lipidic. Sub aspect fiziologic, manifesta un rol esential in procesul de hemiatopoeza prevenind anemia, constituie un factor de crestere pentru unismele tinere, favorizeaza diviziunea celular’, mentine integritatea cclulei_ nervoase Carcrja in corinoide provoacd anemia pernicioasa; procritoblastii maduvei osoase nu se mai pot maturiza in normobiasti, ci dau nastere unor cclule imature deformate de tip negaloblastic. Instalarea anemiei pernicioase poate fi consecinja unor defecte de absorbtie; absorbfia acestor vitamine este conditionati de existenta unei glicoproteide claborata de muvoasa gastric’, si care formeaz’i un complex de cobalamine, denumit "factorul intrinsee al lui Castle", vitamina B,, reprezentind "factorul extrinsec La bolnavii cu anemic pernicioasa, mucoasa gastric nu produce "factor intrinsec" astfel incit ci nu-si pot implini nevoia de factor antipernicios gi acesta trebuie si fie furnizat ca atare (sub forma de ficat sau extract de ficat). Aldturi de alterarile hematologice (caracieristice) se inregistreaza si alte simptome: astenie, paloare, atrofia mucoaselor digestive, afectiuni neurologice etc. Adminisirarea acidului folic concomitent cu vitamina By, face ca toate aceste fenomene sa dispara @ Desi vitaminele sunt considerate ca "factori exogeni" se precizeazd cai flora intestinala este specializata in vitaminogenezd deoarece unele microorganisme pot produce cantitati apreciabile de vitamine: K, PAB, biotina, B,, B,, By, PP, acid pantotenic, acizi folici, care pot acoperi partial necesitatile normale ale organismului uman. Dintre microorganismele. producatoare de vitamine amintim: Pseudomonas fluorescens, Proteus vulgaris, Clostridium butylicum, Acrobacter faecalis etc.5 Giucwe 5.1 Consideratii generale 5.1.1 Definitie. Nomenclatura Glucidele sunt biomolecule ternare, foarte rispandite in lumea vie atat in regnul vegetal, cat si animal, dar cu precadere in regnul vegeial unde sunt rezultatul fotosintezei. Denumite inijial "hidrati de carbon", deoarece raportul dintre C, H, O, este identic cu al unor hidrati C,(H,0),, formulé valabila pentra cele mai multe substante din aceasta clas, excepfie fac unele substanje (ramnozi, fucozi, deoxiriboz’) care nu corespund formulei de mai sus. Alte substante cum ar fi: acid acetic, acid lactic, desi corespund formulci generale, nu au caracterele acestei clasc. In terminologia internajionala exist gi denumirea de zaharuri de la cuvantul latin "saccarum" - substanti dulce. Denumirea nu a corespuns pe deplin, deoarece exista substanje din aceasta clasa care nu au gust dulce: celuloza gi amidonul: pe de alta parte exista si substante care nu fac parte din aceasta clasa, cum ar fi ciclamatul de sodiu si zaharina, care sunt mai dulci ca zaharul (prima de 30 de ori, i de-a a doua de 300 de ori). In terminologia actuala s-a atribuit denumirea de glucide, de la cuvantul grecese yAuxde [glyeos| = dulce, adoptat de Comisia Internationaki de Chimie Biologica. Din punctul de vedere al structurii chimice glucidele sau zaharurile sunt compusi polihidroxicarbonilici si deriva(i ai acestora 5.1.2 Clasificare glucidelor. Roluri biologice In functie de comportarea la procesul de hidroliza, glucidele se clasifica in doua clase: oze si ozide. Ozele sunt glucide nehidrolizabile care conjin un numar mai mic de atomi de carbon (3-7) - se denumese si monoglucide. Ozidele sunt glucide care in urma hidrolizei (acide sau enzimatice) dau nastere la oze (holozide); altele elibereaza pe langa oze $1 compusi de natura neglucidica (heterozide). Clasificarea glucidelor este prezentata in schema de mai jos: Glucoza ALDOZE A a cs OZR = Manoza (monoglucide) Fructoza Ribuloza }Zaharoza GLUCIDE pe ORIGOGIUEIDE! Maltoza POLIGLUCIDE 4Glicogen O7IDE Celuloza SS Glucozizi HETEROZIDE, Glicoproteide (heteroglucide) Proteoglicani HOLOZIDE Lactozi \ J thotogtusidey ‘Amidon188 In organismele vii glucidete indeplinesc functii variate: @ - Rol energetic. In organismul animal si uman glucidele furnizeazi pana ta 70% din cnergia totala. - Roi de substante de rezerva. In organismele animalelor superioare si al omului, glucoza se depoziteaza sub forma de glicogen hepatic si muscular. La plante forma majora de depozit 0 constituie amidonul. % ~ Rol plastic. Glucidele indeplinesc roluri de substante structurale gi de sustinere. Celuloza este principalul component structural din perefii celulari ai plantelor. Membrana celular animela conjine glicoproteide, iar substanfa fandamentald intercelular’ este format din proteoglicani @ - Rol in detoxifiere. Acizii uronici obfinuti prin oxidarea menajaté a ozelor participa in procesele de detoxifiere la nivelul ficatului. - Rolul nuclear. Riboza si deoxiriboza sunt componente structurale ale acizilor nucleici (ARN si ADN’ 5.2 Structura monoglucidelor 5.2.1 Caracterizarea monoglucidelor irvl de atomi de carbon din molecula monoglucidele se clasifica in: trioze, area sufixului -o7& la arbonil acestea pot Dupa nu tetrove, pentoze, hexoze, etc. (denumirea lor facandu-se prin adau, ridacina numarului grecesc al atomilor de carbon), Dupa natura gruparii fi aldoze sau cetoze, Exemple: aldotrioze - aldehida glicerica D si 1: ‘Trioze. cototrioze - dihidroxiacetona aldotetroze - eritroza Tetroze cetoictroze - eritruloz’ aldopentoze’ - ribo’, ‘xilozaé Petitoze oa cetopentoze - ribuloza, xiluloza aldohexoze - glucoz’, galactoza Hexoze cetohexoze - fructoza, sorboza Folosind metodologia de studiu a chimiei organice s-a stabilit ca_glucidele’ au urmatoarele caracteristici structurale comune: @ - av o catend neramificata de atomi de carbon - exceptie: apioza, streploza i hamameloza; @ - au o grupare earbonil aldehida sau cetona; — au mai multe grupari hidroxil secundare si una primara. Coreland datele de mai sus'se poate afirma c& ozele pot fi considerate produsi de oxidare ai poliolilor aciclici, in case o grup de alcool primar este oxidata la aldehida, iat una de alcool secundar la cctona. §.2.2 Structura gi izomeria ozelor (monoglucidelor) Principalul reprezentant al acestei clase este ghucoza. Structura, sa lincara a fostcorelata cu datele experimentale: H-C=O_ are comporitia C.H),0, ¢ -OH - are o grupare carbonil de tip -CHO evidentiata prin reactii de reducere. (Fehling si Tollens) - formeaza derivati pentaacetilali avand cinci grupari hidroxil; JH - structura neramificata a glucozei a fost precizat& prin reducere cu HI cu H,-C-OH formare de iodhexan normal; - conform relatiei lui Van't Hoff, o molecula care prezinta n atomi de carbon asimetrici poate exista sub forma a 2" izomeri optici; glucoza are patru atomi de carbon asimetrici si conform relatiei de mai sus prezinta 16 izomeri optici. Formularea lineara sau aciclica a monoglucidelor, scoate in eviden{a prezenta grupei carbonil. Date experimentale au scos in evidené unele neconcordante dintre proprietatile fizico-chimice ale monoglucidelor si formularea aciclicd. Astfel glucoza care este o aldohexoza mu da pozitiva reactia Schiff (nu recoloreaza in rogu fuxina decolorata cu bioxid de sulf) - una dintre cele mai sensibile reactii ale aldehidelor. De asemenea glucoza nu formeaza 0 combinatie bisulfitica cu NaHSO,. Toate aceste observatii experimentale scot in evident faptul cd gruparea carbonil din molecula ozelor nu este liber, ci implicata in legdtura semiacetalica. In sfaryit existenta fenomenului de mutarotajie si a izomeriei a/B, manifestata prin variajia in timp a rotatiei specifice, nu poate fi explicata decat prin existenta a doi stereoizomeri cu rotatii specifice diferite. Fig.5.1 Fenomenul de mutarotatie190 Solutia proaspat preparatié de «-D-glucoza roteste planul luminii polarizate cu un unghi de +112° care scade apoi treptat pani la +52,5°. Folosind solutia de 8-D-glucoza, planul Juminii polarizate este rotit initial cu un unghi de +18,7°, ca dupa un timp sa se stabilizeze la +52,5°, Coreland toate aceste observatii experimentale, inseamna ca in soluyie coexist atat forma ciclic& cu cei 2 izomeri, cat gi forma lineara libera intr-o proporgic mult inferioara. Ca urmare a reactiei de ciclizare prin semiacetalizare, atomul de carbon carbonilic devine carbon asimetric putand s& adopte doua configuratii sterice diferite. Izomerii « si B se numesc forme anomere si au functii biologice distincte 2.3. Structura perspectivicd tip Haworth Formularea ciclicd semiacetalicd Tollens nu red& corect pozitia pe care o ocupa in spatiu atomii de carbon gi oxigen ai glucozei, fapt confirmat de diagramele de difracjie cu Haworth, ciclurile furazonice gi piranozice sunt proicctate ca poligoane regulate perpendiculare pe planul hartiei si tinand seama de valoarea normala a unghiului dintre valentele carbonului. Latura poligonului apropiata de observator se reprezin a adesea prin linii ingrogate. Substitu enfii care in formulele de proicctie se zasesc in stanga se figureaza in formulele tip Haworth deasupra planului, iar cei din dreapta sub plan. lizarea pentozelor si hexozelor se realizeazd in asa fel incat sa ia nastere un pentaciclu heteroatomic cu un atom de oxigen (ciclu furanic) sau un hexaciclu cu un atom de oxigen (ciclu piranic), deoarece penta si hexaciclurile au cele mai mici tensiuni energetice si deci stabilitatea cea mai mare. raze X. In reprezentar r HC CH | | He tH | ; _o oO | { FuRAN {TETRA | PIRAl TRE | | [furan J [ HiDROEFURAN (ore | HORE EAN | Formele corespunzitoare ale monoglucidelor poarti denumirea de structuri furanozice si piranozice CH,OH i H 0 om H q OH H | OH H ! ——_ | H OH191 in timp ce pentru fructoza pentru glucoza este forma "piranozit Caracteristic: este forma "furanozit In cazul glucozei intalnim atat forma «, cat si 8, in timp ce fructoza apare numai in forma 8. { Hye ~ OH Hye —OH | C=0 WO—C—0H HO HO—C—H sHow = HO—-C-—H Hou HO | aS i Se ; fF OH “HoH ¢ OH on HC | | HCH H—C— OH H--C——1s | | a H,C — OH H.C —OH 6 OW nD i | [@-FRUcIO Ff wreAanozaly | Deoarece s-a constatat ca formularea perspectivica nu corespunde intru-totul realitalii, s-a admis existen{a unor conformatii tensiune. Ciclurile piranozice pot adopta, ca 0 si ciclohexanul doua conformatii “scaun” si "bi Diagramele cu raze X au confirmat cA‘ hexaciclurile contindnd un atom de oxigen se gaisesc exclusiv in conformatie “seaun" - forma cea mai stabila Fig seaun" a unei piranoze 5.2. Conformatii a fi scoase in eviden{a siructurile slic sau perspectivic. Agadar, in functic de proprietiile care urmea monoglucidelor pot fi prezentate in mod curent linear, 5.2.4 Seriile D si L ale monoglucidelor cptia dihidroxiacetonei) contin in molecula lor atomi de Toate monoglucidele (cu & carbon asimetrici, fiind deci subsianje optic active gi se giisese fie izomeri optici (cnantiomeri sau antipozi optici) Din motive de sistematizare, compusii optic activi s-au impartit in doua seri sterice D sib, dup’ relatia configurational fata de un compus de referinta care este gliceraldehida. are sub forma a doioA193 H.C -—OH c=0 HC [-D-DIMIDROXIACETONA HC ——OH c=0 H—-C—OH H.C —— OH | DEERITRULOZA J cst pce 7 i HC OH | i c =0 H-¢ — OH HO—C —-H | He=6\—0H H—¢ —OH | i a | HxC—OH — H,C-—OH C=O c=0 HO~¢—H H~¢—0H H—C-0OH HO-C—H H ae OH H ea ~OH H,C—OH —-H,C—-OH [D-PSICOZAY [O-FRUCIOZAY | D ZA SERIA-D-A CE TOZELOR194 Se considera cd ozele care deriva de la D-gliceraldehida gi care au hidroxilul primului carbon asimetric vecin gruparii alcoolice primare fixat la dreapta, apartin seriei sterice D, iar cele avand configuraia aceluiasi atom de carbon identicd cu cea a carbonului din L- gliceraldehidd apartin seriei sterice L. In cazul cetozelor substanja de referinja este dihidroxiacetona. LICERALDEHIOA ] il In organismul uman i animal toate glucidele apartin serici D, deoarece atat enzimele de degradarc, cat si de sinteza a acestei clase de compusi prezinta 0 specificitate stricta si nu recunose decat reprezentan {ii acestei serii. Seria D a aldozelor se opreste Ja aldohexoze, deoarece in organismul uman importante sunt pentozele si hexozele: riboza, arabinoza, glucoza, manoza si galactoza. Studiind seria D a cetozelor precizaim ca cele mai importante cetoze pentru organismul uman sunt: dihidroxiacetona, ribuloza si fructoza. 5.3 Proprictatile fizice si chimice ale monoglucozclor 5.3.1 Proprietati fizice @ Ozele sunt substante solide, cristalizate, incolore. Datorita numarului mare di grupari -OH din structura lor, sunt solubile in apa si in solventi polari. @ Previnté o slaba solubilitate in alcool, insolubilitate in eter, cloroform si alti solventi organici, proprictate utilizata pentru separarea, identificarea gi dozarea lor prin metoda cromatografici pe hartie. @ Au gust dulce, variabil in funcfie de tipul ozei si proprietatea de a forma solutlii siropoase. O proprietate fizica ce diferentiaza ozele inire ele este puterea rotatorie specific datorité. faptului aceste substanje prezinté activitate optica. Activitatea optica este consecinfa a prezentei in molecula ozelor a atomilor de carbon asimetrici. Prin activitatea optica se in{elege proprietatea unor substante de a devia planul luminii polarizate (lumina in care vibratiile se propaga intr-un singur plan) spre dreapta sau spre stanga, in funcyie de cfectul final dat de suma algebrica a actiunii fiecdrui atom de carbon asimetric. Izomerul care roteste planul luminii polarizate spre dreapta se denumeste izomer dextrogir si se noteaza cu semnul (+), iar cel care roteste planul luminii polarizate spre stanga poarta denumirea de izomer levogir si se noteaza cu (-). Amestecul echimolecular al celor 2 izomeri reprezinta forma racemica, inactiva din punct de vedere al activitayii optice (datorita compensarii activitatii optice opuse de acecasi intensiiate) si se noteazd cu (+,-). Formele deatrogire si levogire sc mai numese si forme enantiomere. Prin sintezé organica sc objin formele recemice, in timp ce natura sintetizeazi numai unul sau altul dintre cnantiomeri, dator stercospecificititii enzimelor implicate in sinteza.195 Configuratia sterici a compusilor optic activi prezinti un mare interes biologic, deoarece organismul viu are tendinta de a utiliza selectiv numai una din formele optic active. 5.3.2. Proprictatile chimice ale ozelor Proprietatile chimice ale ozelor sunt determinate de prezenta gruparilor functionale carbonil, alcool si datorita prezentei simultane a ambelor grupari. Se vor prezenta numai acele reactii semnificative, pentru transformarile metabolice att la organismul sanatos, cat si bolnav. 5.3.2.1 Reactii datorate gruparii carbonil iruparea carbonil a ozelor se poate transforma prin reducere intr-o grupare hidroxil formandu-se polialcooli corespunzatori. Procesul are loc “in vitro" sub acliunea amalgamului de sodiu sau a hidrogenului activat, iar "in vivo" reducerea gruparit carbonil se realizeaza cu ajutorul unor enzime NADH dependente. Prin reducerea gliceraldehidei sau dihidroxiacetonei se formeaza gheerol, important in sinteza de triacilgliceroli si glicerofosfolipide. f H—C=0, 0. sto” HC-GH NAD -HoC—OH | | NADH H A | RNADHsHY | | | H-¢—0H nem nite eG 8 HC —OH H>C— 0H H)C — OH : 2AiDEHIDA [ GLICEROL (owior Prin reducerea ribozei se objine ribitolul, poliol care se intlneste in structura vitaminei B,, fF ae 1 | pet) Ae —OH | | x H—C—OH xH,; 4 H-G—OH . f H—G—OH —S—<“e- HC —OH H—C—OH HG —0H | | | H,—C —OH HC —OH | RiBl TC l — (Reto) J In aceleasi conditii D-glucoza se reduce la D-sorbitol, iar D- fractoza formeaza doi polioli: D-sorbitol si D-manitol D-sorbitolul reprezinta o substanyi de bazéi in sinteza vitaminei C, iar pe de alta parte in diabct zaharat formarea de sorbitol in retina, contribuie la instalarca retinopa diabetice.196 | H-C=0 HC—OH HE—OH 0 | H-C-OH,,,, i H-C—0H | yy, C=Oq, J HO-EH | HO-C—H ——< HO-C—H —~7HO-C—H “~“= HO—C—H H—C—OH H~C—08 H#-C—0H H—d—oH | H—C—OH H—C—OH H—C—0OH H—C—CH | H,0-08 H,C—OH 6-08 H.C —OH | ReIrOL J [o-FRUCTOZA [D-ManiTou J | Fig.5.5 Reducerea glucozei si fructozei. XH, = NADH + H*; X = NAD* rin oxidarea ovelor se obtin produsi de oxidare care difera prin gradul de oxidare al gruparii carbonil si al alcoolului primar (C,, C,). i COOH oH C=0 coon | H—C—0H H—t—0H H—G—0H HO--C—H 1 HO—C—H yy HO-C—H ies | ——_ H—C—OH H—C—OH H—=C—OH I H—C—OH H—G—OH H-C—OH | | HC OH H.C —OH COOH | GLUCOZA [ACID ZARARIC] |[_Acio GLUCONIC Fig.5.6 Oxidarea glucozei; - Oxidarea blind’; H- Oxidarea energica; TI- Oxidarea menajata.iT a) - Oxidarea bland “in vitro" cu api de brom sau de clor a gruparii carbonil, Se obtin acizii aldonici. "In vivo" oxidarea glucozei existent sub forma de ester glucozo-6-fosforic pana la acid 6-fosfo-gluconic se realizeazi sub actiunea catalitica a glucozo-6-fosiat dehidrogenozei (-enzima NADP! dependenta) si reprezinté prima etapa in calea pentozo fosfajilor. Gluconatul_de calciu reprezinta o forma asimilabila a calciului. b) - Oxidarea energicd. Prin oxidare energica (cu HNO, concentrat) se oxideaza atat gruparea carbonil de la C,, cat si gruparea alcool primar C, dand nastere acizilor zaharici. Din glucoza se formeaza acidul zaharic, iar din galactoza acidul mucic. Acizii zaharici au © mica importanta pentru organismul uman ¢) - Oxidarea menajati. Oxidarea gruparii alcool primare C, a aldozelor, dupa o prealabila protjare prin esterificare a gruparilor alcool secundare $i gruparii carbonil devenitd alcool prin semiacetalizare, se objin acizii uronici. Acizii uronici au un rol important in procesele de detoxifiere la nivelul ficatului, cat s un rol plastic deoarece intra in structura proteoglicanilor. Acidul glucuronic prezint{ un interes deosehit in_glucuronoconjugare proces prin care ficatul intervine in eliminarea unor compusi exogeni, sau produsiinintestin, ca de-exempla:Tenolit reailtaji in intestin sub imiluenga_florei_microbiene din aminoacizi aromatici, indoxilul format din triptofan, medicamente, toxice acc’ OH GLUCURONOCONJUGAT elect toxic ‘alizeaza la nivelul gruparii oxidril semiacetalice cu gruparea oxidril sau carboxil a substantei respective. Prin aceasta conjugare se realizeazd doua deziderat seade toxicitatea si creste solubilitatea in apa a compusului toxic care va fi transportat mai usor spre caile de excretie. In afara participarii sale in precesul de detoxifiere hepatica, acidul glucuronic este important datorita implicarii sale in | biosinteza glicozaminoglicanilor compusi cu roluri biologice majore in organismul animal st uman. In organismul animal si uman, acidul glucuronic este unul din metabolitii importanti rezultati pe calea acizilor uronici proces anabotic important al metabolismului glucidic. 5.3.2.2 Proprietati chimice datorate grupirii -OH Formarea de esteri - Funcjiile hidroxil din molecula ozelor (primare, secundare $i semiacetalica) pot fi esterificate. Cei mai importanti din punct de vedere biologic sunt esterii fosforiei format intre oze si acidul ortofosforic la nivelul hidroxilului semiacetalic, sau cel aleoolic primar.198 | as | H—C——OH —«}+ | H—C—OH —<} 0 Laioroxit ALC | HO —C —H | H “pt | H—c HC — OH. —e— widRoxit ALCooLIC PRIMAR ] a = J Glucoza poate forma esteri fosforici la nivelul grupirii -OH semiacetalice, cind rezulta Glucozo-|-fosfat (1) sau la nivelul gruparii -OH primare cdnd va rezulta Glucozo-6- fosfat (II), ambii esteri find intermediari ai unor procese ale metabolismuluiglucidic (glicogenoliza si glicoliza) H,C -OH Majoritatea monoglucidelor sunt reactive sub forma de esteri fosforici si pot participa in diverse procese metabolicc, ceea ce nu este posibil in cazul in care ar fi in stare libera.199 In organismul animal si uman cei mai impotanti esteri’-fosforici sunt: glucozo-1-fosfat, glucoz0-6-fosfat, fructozo-6-fosfat, fructozo-I,6-bisfosfat (vezi fig.5.7) care reprezinta produsi intermediari ai metabolismului glucidelor. H—~G-0-POH HE-O- POH, H—G-OH Ho \ HO—G—H 0 HO-C—H ui | H—~C—OH H—C—0H | | H—-¢ HE H,C OH H,C-O-PO,H> [eLucoza -P At l ESTER COR! Fig.5.7 Esteri fostorici ai glucozei si fructozei Exist’ gi esteri ai acidului sulfuric intalniti sub forma de componente ale proteoglicanilor (heparina, condroitin sulfatii, dermatan sul fati). Fsterificarea proteoglicanilor are loc sub-actiunea Fosfo adenozil-5-fosfosulfatului (PAPS) care este donor de grupari sulfat active (veri fig. 5.20) Formarea glicozidelor. Gruparea “OH semiacetalica este mult mai reactivé decat gruparile -OH alcoolice, puténd forma cu alti compusi care contin 0 grupare -OH (alcooli, oze) compusi de tip eteric denumiti glicozide sau heterozide. Glicozidele se pot prezenta sub forma celor doi anomeri (a sau §). | CHOH CH,OH | H OH H | { OH 4H | | | OH O-CH, ' HOH HOH | | METIL 0-0-6 [mer 8-0- oLUCOP Daca eterificarea se face cu gruparea -OH a altei oze se obtin oligo si polighucide. In cazul in care reactia are loc cu © component neglucidica, desemnat cu termenul de aglicon, formeaza, oxigen, sulf sau azotglicozode. De exemplu, nucleozidele sunt N-glicozide ale D-ribozei sau D-deoxiribozei, iar agliconul este o bazi azotath purinic sau pirimidinic’. Importante din punct de vedere200 farmaceutic sunt glicozidele cardiotonice care au ca aglicon, steroli, Daca sunt administrate in insuficienta cardiaca scad frecventa si cresc intensitatea batiilor inimii. 2.3 Epimerizarea ozelor Una din proprietatile ozelor,datorate prezentei simultane a celor doud grupani functionale si deci, a ansamblului catenei este epimerizarea. Sub actiunea bazclor slabe, la rece, asupra ozelor, face ca ele si sufere un proces de izomerie sterica,la atomul de carbon vecin gruparii carbonil, proces care are Joc printr-o transpozifie speciala, denumita Lobry de Bruyn van Bekenslein sau epimerizare. Ozele epimere sunt glucoza, manoza si fructoza; cle difera prin conformatia C, si Cy. Daca in mediu slab alcalin se dizolva una din ozele de mai sus, dup& o anumiti perioadi de timp se constata prezenta unui amestec de oze in urmatoarea proportie: 63% D-Glucoza, 6% D-Manoza gi 31% D-Fructoza. Interconversia celor trei oze se poate explica prin mecanismul de mai jos (fig.5.7) H—=C=0 cigs fH ce OH fh H- c OH: oa 4,0 —0H H=C-0H i ¢- oH” “HO- ¢ c=0 | R ! R R R { Endioli instebili Fig.5.7 Mecanismul epimerizarii201 Acest proces important din punct de vedere metabolic are loc si la nivelul ficatului, fiind catalizat de enzima epimeraza. 5.4 Principalii reprezentanti ai ozelor 41 ioze si tetroze Principala trio7a este D-gliceraldehida care avand un singur carbon asimetric, se prezinta sub forma a doi stereoizomeri optic activi (enantiomeri),care se deosebesc intre ei prin sensul in care rotesc planul luminii polarizate, celelalte proprictati fizice si chimice find identice. Prin conventic cei doi cnantiomeri au fost desemnati D si L-gliceraldchida si au importanja terapeutica deoarece sunt substangele perentale de la care se formeazai seriile D si L ale glucidelor (vezi capitolul 5.2.4). Aceste trioze nu se gasesc libere in natura ci ele rezulté ca intermediari metabolici, formandu-se in continuu in organism sub forma de esteri fosforici in procesul de glicoliza H—C =0 H,C — OH nesee | | | H—C—OH gy C=0 on H—C—OH I | | | i | . H,C—O—P—OH =H,C—O—P-OH H—C—OH Gg, | | | es V \ H,C—O—P—OH | 0 0 | ror i. QO RALDEHID | DIHIDROX!ACE TON RITROZO-4-FOSFA’ O-GLIC | | 3-F OSFAT L.=3-FOSFAT Dintre tetroze prezinta interes biologic numai eritrozo-4-fosfatul care apare ca intermediar in "calea pentozo fosfatilor" proces al metabolismului glucidic. 5.4.2 Pentoze Dupa rolu! biologic exercitat, ozele cele mai importante pentru organismul uman gi animal sunt pentozele yi hexozele. Dintre acestea un numar limitat sunt utilizate freevent de organismul uman yi animal Pentozele sunt raspandite in regnul vegetal in structura unor biopolimeri: numiti pentozani (arabani, xilani), fara valoare alimentara pentru om In organismul animal gi uman se giisese sub forma de esteri fosforici, constituienti ai aucleotidelor si deci, ai acizilor nucleici si ai unor enzime importante. Riboza, principalul reprezentant al pentozelor, este sintetizati in toate organismele pe “calea pentozo-fosfatilor". Riboza, in forma 8, este component structural al nucleotidelor nucleozidelor, ARN, 3'-5'-AMP-ciclic, ATP si a unor coenzime importante ca NAD‘, NADP*, FAD, Cocnzima A, a caror structura semnificatie a fost prezentata in capitolcle i Rte.202 anterioare. \ _ | H-C=0 | | H-C—0H H-C—OH H—C—OH HjC—OH | rc aay) | Lo !BOZA) | L - Deoxiriboza este 0 pentoza in care gruparea -OH din pozijia C, este substituita cu un atom de hidrogen gi intra in constitusia ADN si nucleotidelor corespunzatoare. | fais | | Bae | H Hf/l | nl HF H-¢—0H H | 4 H H—-C—OH io | | OH oH | | H,C—OH HC — OH Fs TEoRInIBOF URAN Prin reducerea enzimaticd a ribozei se obtine ribitolul, component structural al vitaminei B, (riboflavina). Ribuloza si xiluloza, sub forma de esteri, sunt intermediari ai caii pentozo-fosfatilor ie —0OH He— OH H—C=0 H—C=0 oo) =O H—C—OH HO—C—H Ho—b—H a—¢—on Ho—b—H n—¢—oH H—¢—oH 4—d—oH u—t—on H—G—0H H,C OH He —OH Ke —OH | : D-XILULOZA ] { o- aiauLoza] o-xtoza]203 Existé o pentozurie alimentara temporara, intalnit’ dupa ingestia unor alimente bogate in pentoze sau pentozani, cirese, visine, prune, care se manifesta excretia urinara a unor cantitati de diverse pentoze, ca D-ribozd, L-arabinoza, L-xiloza. De asemenea, exista o maladie ereditara pentozuria esentiala care const in eliminarea unei anumite pentoze L- xiluloza, care se datoreste absenei sau sintezei hepatice deficitare a unei enzime din "ciclul acizilor uronici", xilitoldehidrogenaza. 5.4.3 Hexoze Hexozele sunt cele mai rispandite oze, existind sub forma libera, de diglucide si de poliglucide. Intalnim hexoze gi, in special glucoza, in structura unor glicozide. Cel mai important reprezentant al hexozelor este glucoza care in organismul uman si animal are o origine exogena (alimentara) si una endogena. Glucoza intra in constitutia diglucidelor (zaharoza, maltoza, lactozd, celobioza) si a poliglucidelor (amidon, celuloza, glicogen) In organism, glucoza provine-prin hidroliza enzimatica a diglucidelor si poliglucidelor de origine alimentara (exogena), sau este rezultatul procesului de gluconeogenezd sau epimerizare a ovclor (origine endogena). Glucoza absorbita prin intestin este transportata prin vena porta la ficat, unde urmeaza trei cai diferite: #0 parte este metabolizat& pentru cliberarea energie necesara manifestarilor vitale; - alta parte este depozitata sub forma de glicogen hepatic si muscular; @- a treia parte este eliberata in sdnge gi distribuita tuturor organelor si fesuturilor, In organism sdngele asigura transportul glucozei care se gaseste intr-o concentratie de 50-110 mg /100m1 sange si orice scddere sau crestere peste aceste limite, este consecinja unor tulburiri metabolice grave. Acidul glucuronic este unul din derivatii importanti ai glucozei utilizat in procesul de detoxifiere, dar si ca unul din componentii structurali ai proteoglicanilor. Manoga nu se g’iseste libera in natura find constituient important al unor produsi de condensare vegetali manani, al glicoproteidelor si al unor poliglucide bacteriene (bacilul Koch). In organism se mai gaseste si sub forma de manozo-6-fosfat. Galactoza este component structuraid a lactozci, diglucidul din lapte. In ficat se transforma usor in glucoza sub actiunea unei enzime galacto-waldenaz’. Intra in structura glicoproteidelor si a unor lipide complexe, numite cerebrozide, localizate in creier si sistemul nervos central. Fructoza este 0 cetohexozi care se afla in stare libera, in lichidul seminal; de asemenea in fructe, flori si miere. Este component structural al zaharozei (zabiirul comercial) si al poliglucidului numit inulina, utilizata pentru explorarea filtratului glomerular. In celulele seminale exist o cale ‘specifica de transformare enzimatica a glucozei in fructoza, printr-o serie de procese de oxidoreducere. Esterii fosforici ai fructozei sunt intermediari importanti in metabolismul glucidic. 5.4.4 Deoxiglucide. Aminoglucide Dinu acesti compusi vom mentiona numai aceia de importanja fundamental pentru organismul uman.204 Deoxiglucidele sunt compusi care corespund unor glucide cu mai putini atomi de oxigen, decat de carbon. Deoxiriboza este constituient al acizilor deoxiribonucleic prezentata la capitolul 5.4.1 ADN, structura find L-ramnoza(6-deoxi-L-manoza) se gaseste in structura unor glicozide, H—C=0 H—C=0O dintre care cea mai importanti este | | vitamina P, care are in constitutia sa H#—¢—0H HO 6SH diglucidul numiti rutinozX, formata din ramnoza si glucoza. H OOH H ii —0H HO—Cc— H—C—OH L-fucoza(6-deoxi-L-galactoza) | | esié constituent al glicoproteidelor HO—C—H HO—C—H dintre care menj{ionam | izoaglutininele, implicate in reactii CH, CH,, imunologice $i heteropoliglucidele grupelor sanguine (in grupa B sanguina se gaseste intr-o concentratie de 17%). Atét ramnoza cat si fucoza sunt considerate a fi yi metilpentoze. Aminoglucidele sunt derivati ai glucidelor care rezulta din substituirea unei grupari OH de la C, cu gruparea -NH). Glucozamina, galactozamina 51 manozamina sunt cele mai rispindite aminoglucide care participa in structura glicoproteidelor $i proteoglicanilor . Aminoglucidele intra si in constitutia unor antibiotice (eritromicin’, carbomicin’); se considera ca sunt implicate in activitatea antibiotica a acestora Acidul neuraminic este 0 cetoza cu 9 atomi de carbon, care rezulta prin condensarea acidului piruvic cu D-manozamina In plasma au fost identificati derivaji N-acilati ai acidului neuraminic, numiti acizi205 sialici, componenti ai glicoproteidelor gi glicolipidelor membranelor celulare: Joaca un rol fundamental in fixarea sipenetrarea virusurilor in celule. Agentii holerei, gripei si orcionului posed’ o enzima specific’ neuraminidaza sau. sialidaza care distruge receptorul membranar, indepartand specific legatura dintre acidul neuraminic si diversi constituienti ai membranei. i | HOOC GH \ | O 4H [AciO_ PIRUV J 5.5. Oligoglucidele (oligozaharide) Oligoglucidele rezulta tcoretic din condensarea a 2-8 molecule de oze, cu climinare de apa. Sunt derivati funcjionali ai monoglucidelor la una din grupirile -OH semiacetalice, cu caracter de eteri. Pentru organusmul uman cele mai importante sunt diglucidele (dizaharidele), rezultate prin condensarea hexorelor. De exemplu: -H,0 —C1L,0,, 2C11,,0, - Eliminarea moleculei de apa se poate face in doud moduri, formandu-se doua tipuri de legaturi @ - Eliminarea de apa intre un -OH semiacetalic af unei molecule de oz yi un -OH alcoolic al celeilalte molecule de oza; diglucidul format are un caracter reducdtor deoarece un -OH semiacetalic ramane neblocat si poate actiona ca o aldehida. In acest caz legatura de tip eteric formata este monocarbonilica. @ - Hliminarea de apa intre doi -OH semiacetalici aparjinand la doua oze diferite formeaza un diglucid care nu prezinta caracier reducator. In acest caz legétura de tip eteri¢ formata este dicarbo!206 ‘Tabela 5.1 Diglucide nereducitoare si reducitoare Nr. | Diglucidul. _| Componente structurale. | Tipul de legatura. 1 Zaharozi. a-Glucora + 8-Fructoza. Dicarbonilica 1-2 Trehaloza. a-Glucora+a-Glucoza. Dicarbonilica 5-2 Maltoza. a Glucoza +a-Glucoza. Monocarbonilica 1-4 4. Lactoza. §-Galactoza+a-Glucoza. | Monocarbonilica 1-4 EY Celobioza. B-Glucora + 8-Glucoza Monocarbonilica 1-4 6. Tzomaltoza. a-Glucoza + a-Glucoza. Monocarbonilica 1-6 In functie de tipul de legatura formata diglucidele se clsifica astfel: % - Diglucide reducatoare, care prezinta legaturi monocarbonili % - Diglucide nereducatoare, care prezinta legaturi dicarbonilice. Cele mai importante diglucide de importané biologica pentru organismul uman yi animal sunt prezentate in tabela 5.1. Zaharoza este principalul diglucid nereducator si reprezint& una din cele mai CH;-OH H AO H 4 OH H Lig Fiy.S.9 Cele mai importante oligoglucide pentru organismul uman207 importante surse exogene de glucide pentru organismul uman (25%). Denumirea stiintificd este a-D-glucopiranozil-1-2-}-D-fruictofuranoza. Este sintetizata in exclusivitate de plante: sfecla de zahar gi trestia de zahar, Zaharoza are o mare solubilitate in apa si are o activitate optica dextrogira. +66,5°. Sub acjiunea enzimelor “in vivo" sau a acizilor “in. vitr zaharoza este hidrolizata intr-un amestec echimolecular de glucoz& cu activitate opticd +52,5° si fructoza cu activitate opticd -92°, denumit zahar invertit. Aceasté denumire este datorata faptului cé amestecul respectiv este levogir, deoarece puterea rotatorie a fructozci rezuliate (-) prin hidroliza zaharozei, este mai mare decat a glucozei rezultate (+). Procesul respectiv poarta denumirea de “invertirea zahdrului", iar enzima care determina hidroliza zanarozei - invertaza. Maltoza este un diglucid reducator cu denumirea stiintifi glucopiranoza (vezi figura 5.9). Maltoza constituie produsul de degradare al amidonului si glicogenului si reprezinta unitatea diglucidicd repetitiva a celor doua polighicide. Maltoza poate fi eliberata din amidon si glicogen sub actiunea hidrolitic’ a amilazei (salivara si pancreatic). Hidroliza enzimatica a maltozei sub actiunea maltazei (a-glucozidaza intestinala), ca si hidroliza acida efectuaté "in vitro" are ca rezultat final doua molecule de a-glucoza. Lactoza este singurul diglucid reducator existent in stare libera in natura. Denumirea stiinqifica a lactozei este §-galactopiranozil-1,4-a-glucopiranoza. Este prezenta in laptele tuturor mamiferelor, secretata find de glanda mamara in proporjii diferite (2-8%), variind de la o specie la alta. Laptele de femeie contine 6,5g %, iar cel de la vaca 5g%. Lactoza este scindata hidrolitic pana la ozele componente de catre enzima denumita lactaza (6-galactozidaza), localizala in intestin. Galactoza odata formata este convertita, in condifil normale, in ghicoza de catre enzima galactowaldenaz. Se cunoaste o maladie congenitala, galactozemie esentiala, insoyita de galactozurie frecventa in primele zile de viala ale copilului si datorita sintezei deficitare Ia nivelul ficatului a enzimei de conversic. Celobioza este un glucid reducator cu denumire stiintifica B-glucopiranozil-1,4 B-glucopiranoz’. — Reprevintii unitatea respectiva din structura poliglucidului denumit celulozi. Deoarece intre cele dowd molecule de glucozd existd o legatura & glicozidica, aceasta nu poate fi scindata. de catre _arsenalul enzimatic al organismului uman care nu dispune de o B glucozidaz Din acest motiv,celobioza si celuloza nu au valoare alimentara pentru organismul uman, nefiind posibila hidroliza acestora sub actiunea eazimelor digestive. a-glucopiranozil 5.6 Poliglucide (Poliozide) Poliglucidele sau glicanii au o structur’ macromoleculara, find constituite dintr-un mare numér de monoglucide (hexoze) sau derivati ai acestora (glucozamina, galactozamina,208 acizi uronici, acizi sialici), legate intre ele prin legaturi glicozidice. Legaturile glicozidice existente in aceste lanjuti macromoleculare sunt legdturi 1-4, dar pot fi si legaturi 1-6 sau 13. Prin hidroliz& enzimatica sau acida, poliglucidele se scindeaza in produsi cu grad: de condensare din ce in ce mai mic, iar in final in monoglucidele de baza. Nu au proprietati reducdtoare deoarece hidroxilul glicozidic al tuturor monoglucidelor este angrenat permanent in lanjul macromolecular. Clasificarca poliglucidelor. Se disting doua categorii: 1)- Homoglicani - poliglucide omogene - produsi de policondensare a unui singur tip de unitate structurala: amidon, glicogen, celuloza. 2) - Heteroglicani - poliglucide neomogene - produsi de policondensare a mai multor tipuri de unitaji structurale, precum si componente neglucidice. Exemple: glicoproteide, proteoglicani si poliglucide bacteriene. Glicanii indeplinese roluri structurale (Celuloza, proteoglicanii) sau de depozitare a rezervelor energetice (amidonul, glicogenul) 5.6.1 Homoglicanii Formula yencrala a poliglucidelor omogene constituite pe baza de glucora este (CytljgOs)y-. unde n=300-+1000, ceea ce te confera mase moleculare de ordinul 10°-10°. Sunt de origine vegetal si animala. Amidonul este poliglucidul de rezerva al regnutui vegetal, fiind forma in care este depovitat in celule surptusul de glucide. Amidonul ‘este componenta principala a rajici alimentare a omului si reprezinta 50% din ghucoza exogend. Amidonul este amorf, insolubil in apa rece; in apa calda se dizolva parfial, formand © solutic eoloidala, © pasta Amidonul se identifica prin coloratia albastra cu 0 solutic de iod Ja rece, coloratie care dispare la cald. Fenomenul se explica prin faptul ca iodul se comporta ca un compus de incluziune in spatiile goale situate intre resturile de D-glucoza gi lasa si ueacd numai razele albastre ale luminii. Disparitia culorii albasire la cald evidentiaza faptul ca iodul nu se leagd covalent de amidon, Prin hidrolizi enzimaticd progresiva se formeaza produsi intermediari denumiti dextrine (amilodextrine, critrodexirine, flavodextrine, acrodextrine) si, in final, maltoza. Fermenul final al hidrolizei acide sau alcaline a amidonului este a-glucoza. Asadar, amidonul este format dinu-un numar mare de resturi de a-giucoza, numar care variaza in funcyic de sursa vegetala din care a fost extras. Amidonul nu este o substan{a unitari, ci un ainestec de doua componente distincte localizate diferit in graunjele de amidon:209 @ - ocomponenté cu structura liniard, denumita amiloza, in interiorul grauntelor de amidon; # - 0 componenti ramificata, amilopectina in exteriorul acestora. a H h| i I | jo} Hoon 1 on HOH P| ) «| Is | | CH,-OH i CHy-OH | ("| uf en \y H | Oo! | VA NJ, “ KG i wi on W/L 9 fi Poo tt | | | A | HOH HOR a on | Fig.5.10 Structura amilozci si amilopectinei Amiloza reprezinté 20% din structura amidonului si este constituita dintr-o structura liniard neramifica din resturi de a-glucoza legate 1-4. Lanturile lungi neramificate ale amilozei se organizeaza spatial intr-o configuratie helicoidaka, un pas al elicei cuprinzand 5-6 resturi glucozil forma Vig.5.11 Structura helicoidala a amilozeiAmilopectina reprezinti 80% din macromolecula amidonului si are o stretura ramificata arborescenta, pentru cd resturile glucozil sunt reunite prin doua tipuri de legaturt slicovidice: legituri 1-6 glicozidice Portiunile liniare din amilopectina au structura amilozicii gaturi 1-4, iar la punctele de ramificare se afla legaturi 1-6 Prin studiul enzimelor hidrolitice care actionea7’ asupra amidonului, se pot evidentia diferentele structurale ale componentelor acestui poliglucid cu h © - a-amitaza - este 0 metalenzima digestiva (salivara $i pancreatic’) care desface legaturile imeriorut lanqului; @ — Beamilaza este encima care actioneaza turilor 1-4, incepind de la extremitatea_nereduciitoare a lanjului polighucidic, cu eliberarea succesiva de unititi de maltoza @ - «-1-6-glucozidaza - este o enzimi de deramificare care catalizcaza scindarea hidrolitica legaturilor 1-6 ale amilopectinci care este astfel deramificata; @ © Maltaza - actioneazi asupra maltozei pe care o scindeazii hidrolitic in dowd molecule de w-ghucoza. In urma hi molecule de glucoza, care sunt absorbite prin perctele intestinal si ulterior, polimerizate s form’ de glicogen ‘olizei_ enzimatice a amidonului, Ja nivelul tubului digestiv rezulta b Glicogenul este echivalentul animal al amidonului vegetal si reprezintd forma de depovitare a excesului de glucide in muschi si fieat. Accast’ acumulare este realizati prin oligoglucide, poliglucide si monoglucide care, mai intéi, sunt hidrolizate pana la2u1 monoglucide, se resorb prin mucoasa intestinal gi servese apoi la sinteza glicogenului; proces denumit glicogenogenez4, al c&rei sediu este in ficat si muschi. In functie de necesitatile organismului, glicogenul se transforma progresiv in glucoza. Din punct de vedere structural glicogenul prezintd o similitudine cu amilopectina; deosebirea esentiala consti in faptul ci gradul de ramificare al glicogenului este cu mult mai mare decat al amilopectinei. Se apreciaz4 cd la fiecare 3-5 unitati de glucoz4 apare o ramificatie, o legatura 1-6 glicozidica. La nivelul celulei hepatice glicogenul ocupa un spatiu cit mai restrans, prin faptul ca structura sa arborescent& se incadreaza intr-o sfera in care coexist legaturile 1-4 gi 1-6, acestea din urma fiind mult mai frecvente decat amilopectina. Din aceasta cauza masa moleculara a glicogenului este de ordinul 10°-10" dalton’ In fesuturile animale, glicogenul nu éste scindat pana la molecule de glucoza print-o simpla hidroliza enzimatica (ca in cazul digestici amidonului), ci printr-un proces de fosforoliz’, proces in care intervin cnzimele denumite fosforilaze (a gi b); legaturile 1-6 sunt scindate enzimatic in prezenta enzimci amilo-1-6-glucozidaza. Prin actiunca conjugata a acestor enzime glicogenul hepatic este astfel fragmentat pan’ nge pentru a mentine nivelul glicemici In moleculele de glucoza pe care Ie eliberea74, glicogenul muscular constituie si sursa de energie a contractiei musculare Glicogenul este partial solubil in ap3 cu care formeaz’ iar cu iodul da o coloratic brun-roscala ce nu dispare la cald. solutii coloidale opalescente, Celuloza - este un important poliglucid omogen de natura vegetala; reprezinta constituentul principal al peretilor celutelor plantelor, cu rol de sustinere al acestora. Celuloza este constituitd din lanturi filiforme dispuse paralel, stabilizate prin legaturi de hidrogen, care confera acestui edificiu macromolecular, 0 remarcabil& rezisten{& mecanica Celuloza are o structura liniard neramificata format din 2000-10000 resturi de 8 glucopiranoza, unite prin legaturi § 1-4 glicozidice: Unitatea structurala repetitiva a celulozei 0 constituie celobioza (fig. 13). Fig.5.13 Structura celulozei Nu are valoare alimentara si deci nici energetica, datorita faptului c& in organismul uman nu exisla sisteme enzimatice care si desfach legaturile B-glicozidice (-glucozidaze). Flora intestinalé din intestinul gros are capacitatea de a hidroliza o cantitate limitaté de celuloza. Cel mai important rol fiziologic al celulozei pentru organismul uman este212 participarea acesteia in motilitatea intestinala. Inulina este un poliglucid de rezerva din tuberculii plantelor compozee (dalie, cicoare). Este constituita din resturi de §-fructofuranoza unite prin legaturi 1-2. Inulina introdusi in organismul uman se climind ca alare, nefiind metabolizata lizatZ). Din acest motiv poate fi utilizaté ca test pentru explorarea filtratului giomerular, dcoarece dupa filtrarca ci la nivelu! glomerulului renal nu este resorbita de tubii uniniferi. Dextranii sunt formati din molecule de D-glucopiranozé unite prin legaturi 1-6 glicozidice. Datorita proprictatilor lor speciale sunt utilizali ca substituienti de plasma. In solutie ei au 0 vascozitate si o presiune osmotica asemanatoare plasmei, iar pe de alta parte, nu sunt metabolizati datorita lipsei unei enzime care sa scindeze legaturile 1-6 glucozidice. Mentinerea Jor in circulatia sanguina in solujie coloidala, pana la refacerea proteinelor proprii oiganismului, face posibila restabilirea volumului de lichid circulant. 5.7 Glicoproteide. Proteoglicani Aceste clase de heteroproteide contin in molecula lor o grupare de natura poliglucidicd. Datoritd vascozitatii lor s-a considerat initial cd existé o singura grupa de substante numite mucosubstante. Ulterior, au fost diferentiate in doua clase de heteroproteide distincte, glicoproteide si proteoglicani. Diferen{ele dintre acestea constau din: a) ~ structural; b) - natura ozelor si a derivatilor glucidici; ¢) - raportul glucide/proteine; d) - tipul de legatura dintre partea glucidica gi proteine. In glicoproteide predomina componenta protei pe cand in proteogli ani predomina componente glucidi 5.7.1 Glicoproteidele Glicoproteidele sunt heteroproteide in care componenta proteici ste: predominant, iar componenta prosteticd esie reprezentaté de substan{e din clasa glucidelor. Componenta glucidica din glicoproteide prezinta grade variate de complexitate structurala. Unitatile glucidice care participa frecvent la alcdtuirea componente prostetice a glicoproteidelor sunt: pentoze (xilozi, arabinoza), hexoze (glucoza, manoza, galactoza), metilpentoze (fucozi), hexozamine (glucozamina, galactozamina), derivati acetilati ai hexozaminelor (N-acetil glucozamina, N= acetil galactozamina), acidul neuraminic, acidul sialic, Legaturile care se formeaza inire glucide gi proteine sunt Jegaturi covalente de tip N- sau O- glicozidice si se stabilesc fie prin azotul amidic al asparaginei, fie prin gruparile hidroxil ale serinci, treoninei, hidroxilisinei, tirozinei, hidroxiprolinei La formarca legaturii N- sau O- glicozidice participa cu precadere N~ acetil glucozamina si N-acetil-galactozamina.