REPLIKACIJA, POPRAVAK I REKOMBINACIJA DNA

PREDAVANJA IZ BIOKEMIJE 1
REPLIKACIJA
PREDAVANJA IZ BIOKEMIJE 1
SEMIKONZERVATIVAN PROCES
DNA-POLIMERAZA
 Katalizira nastajanje polinukleotidnih lanaca
 Kataliziraju dodatak deoksiribonukleotidnih jedinica lancu DNA

(DNA)n + dNTP (DNA)n+1 + PPi

 Katalizira nastanak fosfodiesterske veze

 DNA-polimeraza je enzim ovisan o kalupu i početnici
 Svojstva:
 Velika katalitička moć
 Vjernost
 Procesivnost
ZNAČAJKE SINTEZE DNA
1) reakcija zahtjeva sva četiri aktivirana deoksiribonukleozid-5΄-trifosfata (dATP, dGTP, dCTP i TTP) i ion Mg2+

2) novi lanac DNA slaže se izravno na postojećem DNA kalupu

 DNA-polimeraza

3) Da bi započele sintezu, DNA-polimerazama je potrebna početnica (primer)

 Početnica sa slobodnom 3΄-OH skupinom vezana je na kalup
 Nukleofilni napad 3΄-OH rastućeg kraja na unutarnji atom fosfora deoksiribonukleozid-trifosfata
 Nastaje fosfodiesterska veza - oslobađa se pirofosfat (PPi)
 Hidroliza PPi na dva ortofosfata Pi pomoću pirofosfataze
 Omogućava daljnje kretanje reakcije u smjeru sinteze
 Lanac DNA raste u smjeru od 5΄ prema 3΄

4) DNA-polimeraze ispravljaju pogrešno sparene nukleotide u DNA

 Egzonukleazna aktivnost
 početnica početnica
L L
A A
BAZA BAZA N BAZA BAZA N
A A
C C
D D
N N
A A
K K
A A
L BAZA BAZA
L
BAZA BAZA U U
P P
A A

 DNA-polimeraza katalizira nukleofilni napad 3΄-OH skupine na kraju polinukleotidnog lanca α-fosforilnu skupinu
pridošlog nukleozid-trifosfata

REAKCIJA PRODUŽENJA LANCA

 STRUKTURNA SVOJSTVA DNA-POLIMERAZA

 Klenowljev fragment DNA-polimeraze I iz E. coli

 Polimerizacijska regija
 Oblik desne šake: domene prsti, palac i dlan

 Domena s 3΄→ 5΄ egzonukleaznom aktivnosti

 Provjera i popravak polinukleotidnog produkta

 najmanje 5 strukturnih razreda polimeraza

 Ista strategija katalize polimerizacije u kojoj važnu ulogu imaju dva iona metala

Klenowljev fragment DNA-polimeraze I iz E. coli

 Za aktivnost DNA-polimeraze potrebni su ioni metala (Mg2+)
 2 iona Mg2+ u aktivnom mjestu:
 Jedan ion koordinira 3΄-OH skupinu početnice i dNTP
 Olakšava napad na α-fosforilnu skupinu dNTP

 Drugi ion stvara interakciju samo s dNTP

 Stabilizira negativni naboj PPi

 Dva iona stabiliziraju negativni naboj prijelaznog stanja

MEHANIZAM DNA-POLIMERAZE
POČETAK REPLIKACIJE - INICIJACIJA

 Oba lanca služe kao kalupi za sintezu

 Replikacijske rašlje – mjesto sinteze DNA vodeći lanac
roditeljska
 Sinteza lanca u smjeru 5΄→ 3΄ DNA
 Vodeći lanac – kontinuirano Okazakijevi
fragmenti
 Tromi ili spori lanac
 diskontinuirano – sintetizira se isprekidano
 Okazakijevi fragmenati (1000 nukleotida) tromi lanac

 Povezuje ih DNA-ligaza

 Na nukleotidnoj razini polimerizacija u smjeru 5΄→ 3΄

 Cjelokupan smjer sinteze 3΄→5΄
PRIMAZA

 RNA-polimeraza - primaza
 Sintetizira RNA-početnicu komplementarnu DNA-kalupu

 RNA početnica se kasnije uklanja hidrolizom i zamjenjuje s DNA

 DNA-LIGAZA

 Povezuje krajeve u dvolančanim regijama DNA

 Katalizira stvaranje fosfodiesterske veze između 3΄-OH skupine na jednom kraju DNA i 5΄-fosfatne
skupine na kraju druge DNA
 Potreban izvor energije:
 Eukarioti i arheje – ATP
 Bakterije - NAD+

DNA-ligaza
HELIKAZE
DOMENA B2
 Razdvajaju lance DNA koristeći energiju hidrolize ATP
 Bakterijska helikaza PcrA
 monomer
 4 domene: A1, A2, B1, B2 DOMENA A2

 Domena A1 sadrži NTP-aznu strukturu s P-petljom

 Sudjeluje u vezanju i hidrolizi ATP

 B1 homologna A1 bez P-petlje

 Jednolančana DNA se veže na domene A1 i B1 blizu sučelja s domenama
A2 i B2

DOMENA A1
DOMENA B1
P – PETLJA
 Translokacija DNA u smjeru 3΄→5΄

B1 A1

MEHANIZAM DJELOVANJA HELIKAZE

 heksamer

HELIKAZA BAKTERIOFAGA T7
 KLIZNA HVATALJKA - Procesivnost DNA-polimeraze

 Sposobnost enzima da katalizira mnogo uzastopnih reakcija bez otpuštanja supstrata

 β2 podjedinica DNA-polimeraze III iz E. coli
 drži polimerazu združenu s dvolančanom DNA
 služi kao klizna hvataljka DNA
 Podjedinice postavljači hvataljke (clamp loaders)
 Koriste ATP
 Razdvoje dvije podjedinice klizne hvataljke
 DNA prolazi kroz procjep i smješta se u središnju šupljinu
 Hidrolizom ATP se otpušta hvataljka koja se zatvara oko DNA
REPLIKACIJSKE RAŠLJE

 DNA-polimeraza III istodobno sintetizira i tromi i vodeći lanac

 Helikaza DnaB odmata dvolančanu DNA
 SSB (single-strand-binding) proteini vežu jednolančanu DNA
 Primaza sintetizira RNA-početnicu
 DNA-polimeraza III sintetizira vodeći lanac
 Topoizomeraza II uvodi desne supernavoje
 Dvije polimerazne srži enzima
 Podjedinice α – polimerazna aktivnost
 Podjedinica ε – 3΄→5΄ egzonukleazna aktivnost
 Podjedinica θ
 dvije β (klizna hvataljka)

 Središnja struktura
 Podjedinični sastav γτ2δδ΄χ,φ
 Kompleks γτ2δδ΄ - postavljač hvataljke
 Podjedinice χ i φ stvaraju interakcije s SSB proteinima
 Helikaza DnaB

HOLOENZIM DNA-POLIMERAZA III

 Replikacija vodećeg i tromog lanca usklađena je stvaranjem omče na tromom
lancu
 Kalup tromog lanca stvara omču koja prolazi polimeraznim mjestom DNA-
polimeraze III
 Dodatkom 1000 nukleotida otpušta se kalup tromog lanca otpuštanjem klizne
hvataljke
 Trombonski model – veličina omče se produžuje i skraćuje kao pomicanje
povlačka na trombonu
 DNA-polimeraza I – popunjava jazove među fragmentima
 Ima 5΄→ 3΄ egzonukleaznu aktivnost za odstranjivanje RNA-početnice
 DNA-ligaza povezuje fragmente

TOMBONSKI MODEL
MJESTA POČETKA REPLIKACIJE U E. coli

 Ishodište replikacije – locus oriC

 254 pb
 5 sljedova – vezno mjesto za DnaA
 Niz sljedova od 13 pb bogato AT parovima
 ….pripremni koraci za početak replikacije
1) Vezanje proteina DnaA na DNA
 DnaA – NTP-aza s P-petljom,ATP-aza tipa AAA
 ATP-azna domena
 C-terminalna domena - veže DNA

2) Stvaranje kompleksa koji prethodi vezanju početnice (prepriming complex)

 Helikaza (DnaB) veže se oko DNA
 DnaC - Postavljač helikaze
 Odmatanje AT-bogatih sekvenci
 SSB proteini
 Jednolančana DNA izložena je drugim proteinima
 Primaza (DnaG) – sintetizira i dodaje početnicu
3) Slaganje DNA-polimeraze holoenzima
Struktura cikličkog heksamera – ishodište replikacije
 Počinje interakcijama DnaB i β2 podjedinice (klizne hvataljke)
 Hidroliza ATP unutar DnaA – najava početka replikacije
MJESTA POČETKA REPLIKACIJE KOD EUKARIOTA

 Višestruka ishodišta replikacije

 Replikon – jedna replikacijska jedinica
 Nema specifičnih sekvenci, već AT-bogate sekvence u širem smislu
 Origin of replication complex – ORC
 Kompleksi koji prepoznaju ishodišta replikacije
 6 različitih proteina homologni DnaA
 Replikacija ide u oba smjera od ishodišta replikacije, dok se susjedni replikoni ne susretnu i spoje
 O ciklinu ovisna kinaza 2 (cdk2) – veže se na komplekse u ishodištu replikacije i regulira replikaciju
…pripremni koraci za replikaciju kod eukariota
1) Slaganje ORC
2) Licencijski faktor veže helikazu
 Vezanje Cdc6 i Cdt1
 helikaza Mcm2-7
 6 različitih podjedinica

 Replikacijski protein A (SSB protein)

3) Za kopiranje eukariotskog replikona potrebne su dvije različite polimeraze
 DNA-polimeraza α – inicijacijska polimeraza
 Primazna podjedinica – sintetizira RNA-početnicu
 Polimerazna podjedinica – dodaje 20-ak nukleotida na početnicu

 Replikacijski faktor C – RFC – uklanja DNA-polimerazu α

 Privlači kliznu hvataljku PCNA (proliferacijski stanični nuklearni antigen)

 DNA-polimeraza δ
 Ime Funkcija
Prokariotske polimeraze
DNA-polimeraza I Uklanja početnicu i popunjava jazove u tromom lancu
DNA-polimeraza II (stvara mnogo pogrešaka) Popravak DNA
DNA-polimeraza III Primarni enzim sinteze DNA

Eukariotske polimeraze
DNA-polimeraza α Inicijacijska polimeraza
Primazna podjedinica Sintetizira RNA-početnicu
Polimerazna podjedinica Dodaje niz od oko 20 nukleotida na početnicu
DNA-polimeraza β (stvara mnogo pogrešaka) Popravak DNA
DNA-polimeraza δ Primarni enzim sinteze DNA

NEKI TIPOVI DNA POLIMERAZA

TELOMERE
 grč. telos – kraj
 Nukleoproteinske strukture na krajevima linearnih kromosoma
 Čuvaju kromosome od razgradnje, međusobnog sljepljivanja i održavaju duljinu molekule DNA
 Nukleotidne sekvence na krajevima
 Stotine tandemski ponavljanih sekvenci od po 6 nukleotida (kod čovjeka AGGGTT)
 telomere se cirkuliziraju i tako štite krajeve kromosoma
 Jedan lanac bogat G-nukleotidima na 3΄-kraju i malo duži od drugog lanca
 Jednostruki lanac napada dvolančanu strukturu i stvara dvolančanu omču
 u nastajanju i stabilizaciji omče sudjeluju proteini koji se vežu na telomere
 prosječna duljina telomera sisavaca iznosi oko 15 kb
 dinamične strukture, tijekom staničnih dioba se skraćuju
 Telomeraza
 Replicira telomere
 Reverzna transkriptaza koja nosi vlastiti RNA-kalup
 Eksprimirana u stanicama koje brzo rastu (spolne stanice, matične stanice - embrijskim
i odraslim, te tumorske stanice)
 Važna uloga u staničnoj biologiji raka i staničnom starenju
 aktivnost telomeraze – dodatno dijagnostičko sredstvo za neke karcinome
 Inhibitori telomeraze - terapeutski potencijal

MEHANIZAM SINTEZE TELOMERA

 Praznina na tromom lancu
REPLIKACIJA
TELOMERA
Telomeraza sa RNA-kalupom
1. ELONGACIJA

2.TRANSLOKACIJA

SINTEZA TROMOG LANCA

RNA klica

DNA polimeraza
Metafazni kromosomi čovjeka. Telomerni položaj je prikazan fluorescencijskom hibridizacijom
in situ pomoću PNA sonde (crveno) specifične za telomere. Kako bi se odredio položaj
hibridizacijskog signala kromosomi su obojeni DAPI bojom (plavo)
GENI VIRUSA GRAĐENI OD RNA
 Virus mozaične bolesti duhana
 Jednolančana RNA
 RNA-polimeraza – RNA-ovisna RNA-polimeraza – kopira virusnu RNA
 Retrovirusi
 HIV-1
 Jednolančana RNA
 Reverzna transkriptaza - kopira RNA u DNA
 katalizira sintezu cDNA, razgradnju RNA
 te sintezu konačnog lanca DNA reverzibilna reverzibilna reverzibilna
tanskriptaza tanskriptaza tanskriptaza

virusna hibrid DNA-transkript dvolančana

RNA DNA-RNA virusne RNA virusna DNA
POPRAVAK DNA
PREDAVANJA IZ BIOKEMIJE 1
 TIPOVI OŠTEĆENJA DNA
1. Promjena pojedinačne baze
 depurinacija
 deaminacija citozina u uracil
3. Lomovi lanaca
 deaminacija adenina u hipoksantin
 Ionizacijsko zračenje
 alkilacija baze
 Radioaktivna dezintegracija elemenata okosnice
 insercija ili delecija nukleotida
 Stvaranje slobodnih radikala
 umetanje analoga baze
4. Križano povezivanje
2. Promjena dviju baza  Između baza u istom ili nasuprotnom lancu
 Stvaranje pirimidinskih dimera
 Između DNA i proteina
 UV-svijetlost

 Poprečno povezivanje bifunkcionalnog alkilirajućeg

agensa
Oštećenja DNA

Rezultat:
 Smrt stanice
 Transformacija stanice
 Promjene u slijedu DNA koje mogu biti nasljedne
 Blokiranje procesa replikacije

 Sustav za popravak DNA prepoznaje i popravlja oštećenja

Uzroci oštećenja: Pogreške tijekom replikacije
 Najjednostavniji uzrok oštećenja
 Dodatak krive baze
 Uzrok su lokalnih distorzija u uzvojnici DNA
 Mogu biti mutagena – uzrokovati stalne promjene u sekvenci DNA
 Insercije
 Delecije
 Lomovi jednog ili oba lanca
 Zastoj u replikaciji
 DNA-polimeraze koje mogu replicirati DNA unatoč lezijama
 DNA-polimeraza II – prokarioti
 DNA-polimeraza β - eukarioti
 Stvaraju pogreške
 Rekombinacija DNA
 Pogreške tijekom replikacije – Huntingtonova bolest

 Sekvence DNA sklone pogreškama pri replikaciji

 Dugi tandemski niz ponavljanja triju nukleotida
 Uzročnik nekih genetičkih bolesti
 Huntingtonova bolest
 Autosomski dominantni neurološki poremećaj
 Mutirani gen eksprimira protein u mozgu - huntingtin
 sadrži niz Gln kodiran tandemskim nizom CAG
 Niz Gln sklon agregaciji
 Zdrave osobe 6-31 ponavljanje
 Oboljeli 36-82 ponavljanja
 Anticipacija (predviđanje)
TIPOVI OŠTEĆENJA DNA - PROMJENA POJEDINAČNE BAZE

Oksidacija baze Deaminacija baze

 Oksidirajuća sredstva  Deaminacija adenina = hipoksantin
 ROS (OH-)  Sparuje se s citozinom

 OH- reagira s gvaninom = 8-oksogvanin

 Sparuje se s adeninom
 TIPOVI OŠTEĆENJA DNA - PROMJENA POJEDINAČNE BAZE

Alkilacija baze
 Alkilirajuća sredstva
 Citokrom P450 prevodi aflatoksin B1 u jako reaktivni epoksid
 Epoksid reagira s N-7 gvanina
 Nastaje mutageni adukt koji uzrokuje transverziju G-C u T-A
TIPOVI OŠTEĆENJA DNA - PROMJENA DVIJU BAZA

Stvaranje pirimidinskih dimera

 UV svijetlost
 Kovalentno povezuje susjedne pirimidine duž lanca DNA
 Pirimidinski dimeri ne pristaju u dvostruku uzvojnicu
 Blokirane replikacija i ekspresija gena
TIPOVI OŠTEĆENJA DNA - LOMOVI LANACA

Elektromagnetsko zračenje visoke energije

 Oštećuje DNA
 Visoke koncentracije ROS-a
 Jednolančani i dvolančani lomovi
TIPOVI OŠTEĆENJA DNA –KRIŽNO POVEZIVANJE

Psoraleni
 Kineska biljka
 Induciraju križno povezivanje dva lanca DNA
 Stvaraju adukte s nukleotidnim bazama
 Ometa replikaciju, ne dopušta razdvajanje lanaca
SUSTAVI ZA OTKRIVANJE I POPRAVAK OŠTEĆENJA DNA
 Koriste se informacijom neoštećenog DNA lanca
Mehanizam djelovanja:
1) prepoznaju oštećenu bazu
2) uklanjaju oštećenu bazu
3) popravljaju nastali jaz
 DNA-polimeraza
 DNA-ligaza

1. Popravak krivo sparenih baza

2. Popravak izrezivanjem baza
3. Popravak izrezivanjem nukleotida
4. Popravak dvolančanih uzvojnica
…Egzonukleazna domena DNA-polimeraze
 podjedinica ε DNA-polimeraze III
 3΄→ 5΄ egzonukleazna aktivnost
 uklanja pogrešno sparene nukleotide s 3΄-kraja

 Kako enzim prepoznaje pogreške?

 Sinteza DNA usporava
 Krivo spareni par je slabo vezan
POPRAVAK KRIVO SPARENIH BAZA
Pogrešno sparene baze

 sustav za uklanjanje krivo sparenih parova

 mismatch-repair system
 Uklanja pogreške nakon replikacije
 Kod E. coli:
 MutS - detektira krivo sparene baze
 MutL – privlači endonukleazu Egzonukleaza 1

 MutH – cijepa novonastalu DNA i zatvara leziju

 Egzonukleaza I uklanja pogrešno sparenu bazu
 DNA-polimeraza III sintetizira novi lanac

DNA-polimeraza III
POPRAVAK IZREZIVANJEM BAZA (E. coli)
 Enzim AlkA
 Glikozidaza
 Cijepa glikozidnu vezu i oslobađa oštećenu bazu

 AP-mjesto
 AP-endonukleaza
Apurinsko/apirimidinsko
 Prepoznaje oštećenje i zarezuje okosnicu mjesto

 Deoksiriboza-fosfodiesteraza
 Izrezuje deoksiriboza-fosfat

 DNA-polimeraza I
 dodaje nukleotide

 DNA-ligaza Kompleks enzima AlkA za poravak DNA i

analoga apurinskog mjesta
…Popravak uracila
uracil-DNA glikozidaza

 Deaminacija citozina = uracil

 Mutagena
 Uracil-DNA-glikozidaza
 Homolog AlkA AP-endonukleaza

 Hidrolizira glikozidnu vezu između uracila i deoksiriboze

 AP-mjesto
 Metilna skupina timina razlikuje timin od deaminiranog citozina (uracila)
 Timin u DNA umjesto uracila povećava vjernost genetičke poruke
DNA-polimeraza I
DNA-ligaza
POPRAVAK IZREZIVANJEM NUKLEOTIDA izrezivanje
12-nukleotidnog
fragmenta pomuću
uvrABC ekscinukleaze

sinteza DNA pomoću

 Izrezivanje pirimidinskih dimera DNA-polimeraze I

 ekscinukleaza uvrABC
 Otkriva distorziju nastalu oštećenjem
 Cijepa oštećeni lanac DNA na dva mjesta
 8 nukleotida od oštećenja na 5΄ i 4 nukleotida na 3΄

 DNA-polimeraza I
 DNA-ligaza
spajanje pomoću
DNA-ligaze
POPRAVAK DVOLANČANIH UZVOJNICA - Povezivanje nehomolognih krajeva

 NHEJ (nonhomologous end joining)

 Popravak loma oba lanca
 heterodimeri dva proteina Ku70 i Ku80
 povezuju slobodne dvolančane krajeve
 Stabiliziraju krajeve i obilježavaju za druge proteine
RAK UZROKOVAN MANJKAVIM POPRAVKOM DNA
 nastanka tumora uzrokuju mutacije gena povezanih s kontrolom rasta
 tumor-supresorski geni
 geni uključeni u popravak DNA
 utišavaju razvoj tumora

 Li-Fraumenijev sindrom
 Ljudi koji naslijede opasne mutacije u jednoj kopiji tumor-supresorskog gena
 Velika vjerojatnost razvoja različitih tipova raka
 Kemoterapeutici
 Djeluju kao oštećivači DNA
 Ciklofosfamid
 Cisplatin

Cisplatin
Ciklofosfamid
…RAK UZROKOVAN MANJKAVIM POPRAVKOM DNA

Xeroderma pigmentosum "Moon children"

 Rijetka kožna bolest čovjeka
 Autosomno-recesivna
 Koža oboljelih osjetljiva na UV-svjetlost
 Mutacije gena za proteine sustava za put popravka
izrezivanjem nukleotida
 Ljudski homolog uvrABC enzima
…RAK UZROKOVAN MANJKAVIM POPRAVKOM DNA
Lynchov sindrom
 Nasljedni nepolipozni kolorektalni rak – HNPCC
 1 od 200 ljudi
 Mutacije gena hMSH2 i hMLH1
 Ljudski homolozi MutS i MutL E. coli
Gen za protein p53
 Tumor-supresorski gen
 Mutiran u više od polovine tumora
 Mutacije nisu nasljedne, pojavljuju se u somatskim stanicama
 Protein p53
 Nadzire sudbinu oštećenih stanica
 Otkriva oštećenja DNA (posebice dvolančane lomove)
 Potiče popravak DNA ili aktivira apoptozu
REKOMBINACIJA
PREDAVANJA IZ BIOKEMIJE 1
VAŽNOST REKOMBINACIJE
 1. Kada zastane replikacija, rekombinacija može ponovno omogućiti daljnju replikaciju
 2. Neki se dvolančani lomovi DNA popravljaju rekombinacijom
 3. U mejozi, ograničena izmjena genetičkog materijala sparenih kromosoma osigurava jednostavni mehanizam
stvaranja genetičke raznolikosti u populacija
 4. Rekombinacija ima ključnu ulogu u stvaranju molekulske raznolikosti protutijela i nekih drugih molekula imunog
sustava
 5. Neki virusi koriste putove rekombinacije za integraciju svog genetičkog materijala u DNA stanice domaćina
 6. Rekombinacija se upotrebljava pri manipulaciji genima
 Dobivanje knockout miševa
 Najučinkovitija je između sličnih DNA sekvenci
 Homologna rekombinacija
PROCES – PRODOR LANCA (strand invasion)
 Molekula DNA sa slobodnim krajem rekombinira s molekulom bez slobodnih krajeva za interakciju
 Molekule sa slobodnim krajem
 Rezultat dvolančanih lomova
 Rezultat prekida replikacije
 Protein RecA
 ATP-aze AAA
 Inicira rekombinaciju
 Prodor lanca
 Jednolančana DNA premješta lanac dvostruke uzvojnice
 Istisnuta petlja ili D-petlja
 Trolančana struktura

 3΄-kraj može djelovati kao početnica za sintezu novog lanca

REKOMBINACIJA STVARANJEM HOLLIDAYEVA KRIŽANJA
 Hollydayevo križanje
 Međuprodukti od četiri polinukleotidna lanca u obliku križa

 Rekombinaze
 Rekombinaza Cre bakteriofaga P1
 Katalizira stvaranje Hollydayeva križanja i njihovo razdvajanje
 Cre i topoizomeraza I nastali divergentnom evolucijom

 Mehanizam rekombinacije:
 četiri molekule enzima vežu se na dvije molekule DNA – REKOMBINACIJSKA SINAPSA
 Reakcija započinje cijepanjem jednog lanca na svakoj uzvojnici
 5΄-OH skupina ostaje slobodna a 3΄-fosforilna skupina veže se na Tyr
 Slobodni 5΄-krajevi napadaju drugu uzvojnicu u sinapsi – DNA-Tyr – nastaje nova fosfodiesterska veza
 Izomerizacija Hollydayeva križanja
 Ponavljanje postupka
 stvaranje
cijepanje veze

rekombinacijska Hollidayevo križanje

sinapsa
izomerizacija

stvaranje
veze cijepanje
Hollidayevo križanje

MEHANIZAM REKOMBINACIJE