Sveučilište u Zagrebu

Farmaceutsko-biokemijski fakultet

ODABRANE TEME IZ BIOANALITIKE

4. izdanje

Svjetlana Luterotti
Dane Bicanic

Zagreb, 2013.

http://www.pharma.hr/download.aspx?file=/Upload/ANALIT_KEM/odabrane_teme_iz_bioanalitike.pdf
Recenzenti

Prof. dr sc. Ivana Čepelak

Prof. dr sc. Biljana Nigović

Nakladnik

Farmaceutsko-biokemijski fakultet
Sveučilišta u Zagrebu

CIP zapis dostupan u računalnom katalogu Nacionalne i sveučilišne knjižnice u

Zagrebu pod brojem 695369

ISBN 978-953-6256-25-9

Umnožavanje, preslike ili pretisak nisu dopušteni bez odobrenja autora.

Analytical chemistry is a scientific discipline that develops and applies methods,
instruments and strategies to obtain information on the composition and nature of
matter in space and time. Chemical analysis is that part of analytical chemistry where
the reagent which reacts with the sample under investigation is a chemical.

Preuzeto iz: Analytical Chemistry, The Approved Text to the FECS Curriculum Analytical
Chemistry (ur. R. Kellner, J.-M. Mermet, M. Otto i H.M. Widmer), Wiley-VCH,
Weinheim, 1998.

Analitička kemija je znanstvena disciplina koja razvija i primjenjuje metode,

instrumente i strategije u svrhu dobivanja informacije o sastavu i naravi tvari u
prostoru i vremenu. Kemijska analiza dio je analitičke kemije kada je reagens koji
reagira s uzorkom neka kemijska tvar.
Predgovor

Priloženi nastavni materijal namijenjen je slušačima izbornog kolegija poslijediplomskog

studija «Odabrane teme iz bioanalitike» a dijelom i slušačima prijediplomskog
izbornog kolegija «Odabrane metode instrumentalne analize». Teme 1-3 date su na
dvjema razinama; razina I predviñena je kao razina prijediplomskog studija a razina II
poslijediplomskog studija. Tema 4 predviñena je isključivo za slušače poslijediplomskog
studija.

Unutar sve četiri teme uklopljeni su i dijelovi teksta koji se bave koncepcijom i razvojem
novih analitičkih postupaka, tipovima bioloških/ekoloških uzoraka, postupcima
predobradbe kompleksnih, poglavito bioloških uzoraka, te obradom i procjenom
rezultata.

Kako se ovaj nastavni materijal nudi slušačima u elektroničkom obliku valja ga prihvatiti
kao temelj koji će doživljavati stalne nadopune, korekcije i unapreñenja.

Svjetlana Luterotti

Zagreb 2008, 2009, 2011, 2013

SADRŽAJ str.

Tema 1

ATOMSKO-APSORPCIJSKA SPEKTROSKOPIJA
(s osnovama drugih atomskih spektroskopija) I. dio 1-23
S. Luterotti II. dio 24-54

Tema 2

ION- I MOLEKULSKO-SELEKTIVNE ELEKTRODE I. dio 1-27

S. Luterotti II. dio 28-39

Tema 3

VALIDACIJA BIOANALITIČKIH METODA I. dio 1-21

S. Luterotti II. dio 22-34

Tema 4

FOTOTERMIČKE METODE U KEMIJSKOJ ANALIZI 1-31

D. Bicanic i S. Luterotti
 Svjetlana Luterotti

ATOMSKO-APSORPCIJSKA SPEKTROSKOPIJA
(s osnovama drugih atomskih spektroskopija)

I. DIO

Uvod
Spektrokemijske metode poznate su više od 150 godina. Ekscitacija elektrona
temelj je ne samo atomskih spektroskopija, apsorpcijske i emisijske, koje se odvijaju u
UV-Vis području već i molekulsko-apsorpcijske UV-Vis spektroskopije (slika 1).

Ovdje treba kazati da atomsko-spektroskopska analiza nije samo vrlo važno

područje kemijske analize, nego i područje koje se vrlo brzo razvija. Zadnjih 15-ak
godina dramatično se promijenila instrumentacija za atomsku spektroskopiju koja sada
omogućuje snimanje cijelog atomsko-emisijskog spektra kompleksnog kemijskog
uzorka odjednom, te su razni oblici maseno-spektrometrijske instrumentacije
primijenjeni u atomsko-masenoj spektroskopiji.
Atomske spektroskopije služe u analizi metala i metaloida, te su meñu najvažnijim
metodama elementarne analize. Temelje se na tri procesa: atomskoj apsorpciji, atomskoj
emisiji i atomskoj fluorescenciji. Prvo se pojavila atomsko-emisijska spektroskopija
(AES) kao analitička metoda koja se već od 1930-ih godina koristi u kemijskim i
kliničkim laboratorijima za analize Na, K i Li u biološkom materijalu. Australski
kemičar sir Alan Walsh 1955. piše o atomsko-apsorpcijskoj spektroskopiji (AAS). 60-ih
godina prošlog stoljeća pojavljuje se i prva odgovarajuća instrumentacija za AAS te
dolazi do naglog uspona njezine analitičke primjene poglavito u analizi Ca, Mg, Cu, Fe,
Zn, Pb, Hg, Cd.

Sustavi stvaranja atoma u atomskim spektroskopijama

Slika 2 shematski prikazuje sustave atomizacije u atomskoj spektroskopiji. Lijevi
dio sheme prikazuje plamene i plazma sustave, a desni neplamene atomizacijske
sustave. Središnji dio sheme opisuje sustave kemijskog stvaranja para elementarne žive
ili isparljivih hidrida, koje se dade detektirati atomskom apsorpcijom ili fluorescencijom,
u plamenu ili u grafitnoj peći.

1
 ν
Stanje E0+hν

Apsorpcija
zračenja ili

Emisija
druge energije
(npr., toplinske)

Stanje E0

Slika 1. Kvantizirani prijelazi izmeñu dva energetska stanja. (pres. 1)

Ioni Ekscitirani atomi

Ionizacija Ekscitacija

Atomi
Bombardirsnje površine ionima,
izbijanje atoma ("sputtering"), itd.
Atomizacija

Molekule
Laserska ablacija
Vaporizacija

Čestice Pepeo

Otparavanje otapala Hidrid, Grijanje, spaljivanje

pare metala
Kapljice Suhi depozit
otopljene tvari
Kemijska reakcija
Nebulizacija Sušenje,
(raspršivanje) suha depozicija

Otopina uzorka

Priprava uzorka

Čvrsti uzorak

Slika 2. Shematski prikaz uobičajenih puteva atomizacije uzorka u atomskoj spektroskopiji. (pres. 1a)

2
 Metode detekcije u atomskim spektroskopijama

Principi AAS i AES

Temelj AAS i AES je ekscitacija elektrona u vanjskoj ljusci metalnog atoma tj.
kvantizirani prijelaz slobodnog atoma u više energetsko stanje, npr., apsorpcijom
toplinske energije ili energije zračenja (slika 1). Energetske razlike ovih prijelaza su
odreñene atomskom strukturom elementa budući da je energija emitiranog ili
apsorbiranog fotona karakteristična za element. Naime, slobodni atomi pokazuju linijski
spektar pa mogu apsorbirati energiju svjetla pri odreñenim, diskretnim energijskim
razinama. Ako se atomska para koja sadrži slobodne atome nekog elementa u osnovnom
stanju (nepobuñeni, neionizirani atomi) osvijetli izvorom svjetla koje zrači frekvencije
karakteristične za element prisutan u pari onda će ti slobodni neutralni atomi apsorbirati
rezonantnu frekvenciju tj. upravo onu koju bi emitirali kada bi bili pobuñeni na emisiju.
Kod elemenata s kompleksnim spektrima postoji nekoliko rezonantnih linija pogodnih za apsorpciju.

Slika 3. Elementi koji se mjere atomsko-apsorpcijskom spektroskopijom (označeni sivo). (pres. 2)

Izmeñu njih se, ako je moguće, bira ona kod veće valne duljine. Apsorpcijom energije
atomi se dovode u pobuñeno stanje te se vraćaju u osnovno stanje re-emisijom kod iste
frekvencije. Kako svaka specija atoma može egzistirati samo u stanjima definirane
energije atomi mogu apsorbirati fotone definirane energije odnosno ν i λ. To znači da
apsorbirani mogu biti samo fotoni onih λ koje odgovaraju linijama AA-spektra elementa
(slika 1, pres 1):

E1 = E0 + hν E0,1 - energija u nižem i višem energetskom

stanju
∆E = E1-E0 = hν = hc/λ ∆E - razlika E
h - Planckova konstanta = 6,625x10-34 J s
ν = c/λ λ, ν - valna duljina, frekvencija zračenja
c - brzina svjetla = 3,0x108 m s-1
λ = hc/∆E

AAS primjenjljiva je u analizi oko 70 elemenata u nizu različitih uzoraka (slika

3, pres 2), Flame-AAS naročito je pogodna za analizu elemenata poput Pb, Cd, Zn,

3
Cu i Cr te uzoraka poput tkiva bilja ili tla ili tjelesnih tekućina/tkiva nakon postupaka
predobradbe.
Razlika izmeñu plamene AES ("flame atomic-emission spectrometry", FAES) i
plamene AAS ("flame atomic-absorption spectrometry", FAAS) je ta da se kod FAAS
energija ekscitacije dobiva u obliku zračenja, a plamen služi samo kao sredstvo
stvaranja populacije slobodnih, neutralnih atoma u osnovnom energetskom stanju
(slika 4, pres 3). Kod AES inverzno, odnosno kod svih emisijskih tehnika (u plamenu,
u luku, iskri ili plazmi, kod rentgenske fluorescenije i neutronske aktivacije) uzorak se
pobuñuje da bi emitirao karakteristično zračenje. On naravno zrači i takve frekvencije
koje nisu zanimljive za identifikaciju pa se pogodnim sustavom odabire ona koja je
analitičaru korisna. I kod FAAS i kod FAES zračenje koje dolazi iz plamena sakuplja
se, selektira i mjeri. Kod FAES potrebna energija dobiva se plamenom koji atomizira
i ekscitira uzorak u isto vrijeme te se mjeri zračenje koje takav uzorak emitira. Ovo
zračenje ide u svim smjerovima ali instrument vidi i mjeri samo onu frakciju koja
proñe kroz ulaznu pukotinu uzduž optičke osi.

KORAK EMISIJA APSORPCIJA

ν
E1=E0+hν ν
E1=E0+hν

A
E0 E0

I0

ν
hν ν
hν
C

Slika 4. Usporedba procesa uključenih u atomskoj emisiji i atomskoj apsorpciji. (pres. 3)

Atomsko-emisijska tehnika je i ICP-AES («inductively coupled plasma atomic-

emission spectrometry», induktivno spregnuta plazma-atomsko-emisijska
spektroskopija) ili ICP-OES («inductively coupled plasma optical emission
spectrometry“) gdje se koriste plazma atomizatori i koja osigurava vrlo visoku
osjetljivost analize (vidi i str. 46) datira već od 1964. Otopina uzorka pumpa se u
instrument te strujom plinovitog argona uvodi u argonsku plazmu (ionizirani argon).
Plazma stvara temperaturu od oko 7000-8000 0C što efikasno atomizira uzorak i
termički ekscitira elektrone iz vanjske ljuske atoma. Istovremeno dolazi do intenzivne

4
atomske emisije elemenata prisutnih u uzorku što, uz primjenu multikanalnog
detekcijskog sustava, omogućava multielementnu analizu do 50 elemenata
istovremeno. Jedna analiza zahtijeva 5 cm3 uzorka ili manje a traje 2 min; LOD
vrijednosti kreću se od niskih ppm („part per million“, 1:106, µg cm-3 ili mg dm-3 u
otopini, ili mg kg-1 u čvrstom uzorku) do niskih ppb („part per billion“, 1:109, 10-3
ppm, ng cm-3 ili µg dm-3 u otopini, ili µg kg-1 u čvrstom uzorku) vrijednosti. Rutinski
se koristi za odreñivanja oligoelemenata i elemenata u tragovima (Al, As, Ba, Ca, Cd,
Ce, Co, Cr, Cu, Fe, K, La, Li, Mg, Mn, Mo, Na, Ni, P, Pb, Rb, S, Sc, Si, Sr, Ti, V, Y,
Zn, Zr) u geologiji i metalurgiji, industrijskoj higijeni i ekologiji, kliničkim
ispitivanjima, analizirajući geološke, biološke, industrijske uzorke te uzorke voda.
Danas se za visoko osjetljivu multielementnu analizu koristi i metoda ICP-MS
(«inductively coupled plasma mass spectrometry») čiji razvoj započinje iza 1980. god
(vidi i str. 47). To je tip masene spektrometrije koja može detektirati niz metala i
nekoliko nemetala pri koncentracijama nižim od ppt (parts per trillion, 1:1012).
Dinamičko područje proteže se obično preko deset redova veličine. Vrlo je korisna u
analizi tragova elemenata u prirodnim vodama, mineralima, stijenama, predmetima
opće namjene, itd. Temelji se na kombinaciji induktivno spregnute plazme kao
metode koja proizvodi ione i spektrometra masa kao metode odjeljivanja i detekcije
iona na temelju omjera m/z. ICP-MS daje podatke o prisutnim izotopima i njihovim
odnosima u uzorku. ICP-MS karakterizirana je čak 100-ak puta nižim granicama
dokazivanja od atomske emisije a današnji proizvoñači instrumenata govore čak o
LOD vrijednostima u području ppq („part per quadrillion“, 1:1015). Rutinski se koristi
u analizama tragova i ultra tragova elemenata (Li, Be, Sc, Co, Ni, Cu, Ga, Rb, Y, Zr,
Nb, Mo, Cd, Sn, Sb, Cs, Ba, Hf, Ta, W, Re, Tl, Pb, Th, U) u ekološkim i biološkim
uzorcima (vode, tla, stijene i minerali, hrana), te naročito rijetkih zemalja (lantanida) u
geološkim uzorcima.
Najvišu osjetljivost nudi atomsko fluorescentna spektroskopija (AFS). Ona
detektira pojedinačne atome elementa; visoka osjetljivost posljedica je toga što je
pojedinačni atom moguće detektirati mnogo puta jer se on može ponovno i ponovno
ekscitirati. Svaki puta kada atom emitira foton, on može biti re-ekscitiran upadnom
zrakom fotona, obično iz lasera. Za razliku od AFS, detekcija u atomskoj masenoj
spektroskopiji je destruktivna pa postoji samo jedna šansa da se vidi pojedinačni ion.
Kod atomsko-fluorescentne analize mjeri se zračenje emitirano nakon ekscitacije
atomske pare zračenjem iste (rezonantna fluorescencija) ili različite λ;
konvencionalno spominje se granica dokazivanja do 10 ng dm-3 (ppt), a danas i niže.
AFS je najpogodnija za mjerenje razrijeñenih otopina gdje su procesi rasipanja i
emisije od strane drugih sastavnica uzorka minimalni. Primjenjuje se za odreñivanje
As, Cd, Cu, Pb, Mg, Hg, Se, Zn u biološkom materijalu.
Kod FAAS zraka svjetla odreñenog intenziteta i λ dolazi iz izvora zračenja i
prolazi kroz apsorbirajući medij. U slučaju slijepe otopine apsorpcija je vrlo mala ili
je uopće nema (instrument na nuli) te svo svjetlo ulazi u ulaznu optiku
spektrofotometra. Ali ako u plamenu ima slobodnih neutralnih atoma u osnovnom
energetskom stanju oni apsorbiraju dio zračenja te dolazi do njihove ekscitacije. Oni
takoñer vraćaju energiju kao zračenje koje ide u svim smjerovima ali ono ne utječe na
mjerenje neapsorbiranog zračenja iz izvora.
Uzorak se nakon postupka raspršivanja unosi u plamen u obliku finog aerosola
sa zapaljivim plinovima (acetilen i zrak ili acetilen i dušik suboksid) te nastaju

5
kompleksni procesi. Neki koraci su jednostavni fizički procesi redukcije veličine kapi
uz nastajanje aerosola tekućina-plin, zatim isparavanje otapala uz nastajanje
prezasićene otopine i aerosola krutina-plin; daljnji procesi su komplicirani te
uključuju toplinsku razgradnju spojeva i atomizaciju uz nastajanje atomske pare. Dio
atoma u plamenu postiže viša energetska stanja već zbog dovedene toplinske energije
koja povećava kinetičku energiju atoma kao i zbog neelastičnih kolizija. Ipak je
većina atoma u atomskoj pari u plamenu u osnovnom stanju tj. elektroni atoma su u
najnižem energetskom stanju. Nastoji se izbjeći gubitke neutralnih atoma zbog
ionizacije ili kondenzacije (stvaranje molekulskih spojeva sa sastavnicama otopine,
interferencije kondenzirane faze), nastojanjem da ih se disocira pod pogodnim
uvjetima plamena.
Ako se pretpostave dva energetska stanja E1 i E2 kod iste temperature, broj
atoma u svakom stanju je dat relacijama (pres 4):

N1 = konst g1 e-E1/kT N1, N2 – broj atoma u energetskom stanju E1, E2

N2 = konst g2 e-E2/kT
N1/N2 = g1/g2 e[ (E2 - E1)/ kT)]
konst – konstanta neovisna o E1 i E2
T – termodinamička temperatura (K)
k – Boltzmanova konstanta = 1,381x10-23 J K-1
g1, g2 – statističke mase u stanju E1, E2

Prema tome, općenito, za prijelaz atoma u atomskoj pari izmeñu osnovnog stanja E0 i
stanja Ej kod temperature T, vrijedi:

Nj = N0 (gj/g0) e(-Ej/kT) N0, Nj – broj atoma u osnovnom, ekscitiranom

stanju
g0, gj – statističke mase atoma u stanju E0, Ej
Ej – energija ekscitacije

Omjer Nj/N0 raste s porastom temperature i opada s porastom Ej. Za tipične

temperature plamena (2000-3000 K) Nj = (10-4-10-6)N0, ovisno o elementu, što
pokazuje da je broj pobuñenih atoma zanemariv. Dakle, kod osrednjih temperatura
koje prevladavaju u plamenu gotovo su svi atomi u osnovnom stanju. FAAS ima
prednost pred FAES zbog relativne neosjetljivosti na fluktuacije u temperaturi
plamena jer je Nj vrlo malen u odnosu na N0, tj. N kao ukupni broj slobodnih atoma
praktički je jednak N0.
Za sve spektrokemijske metode karakterističan je njihov kvalitativni i
kvantitativni aspekt. Promatranje λ fotona, emitiranih ili apsorbiranih od strane
atomiziranog uzorka, dakle detekcija emitirane ili apsorbirane linije karakteristične za
element temelj je kvalitativne analize. Kada su uvjeti atomizacije standardizirani
mjere se intenziteti spektralnih linija elemenata koje smo ranije dokazali u uzorku pa
je to temelj kvantitativne analize.
U plamenoj AAS plamen je apsorbirajući medij debljine d, jer sadrži neutralne
atome u osnovnom energetskom stanju. Dužina optičkog puta odreñenja je duljinom
plamenika (obično 5-10 cm). Fluktuacije plamena dovode do vrlo malih varijacija u
dužini optičkog puta. Ako nema efekata raspršenja svjetla te ako zraka intenziteta I0
prolazi kroz optički put dužine d izlazna zraka će imati intenzitet I. Prema tome
vrijedi (pres. 5):

6
 I = I0 e(-Kd) K – konstanta
d – dužina optičkog puta
T = I/I0 = e(-Kd)
I0, I – intenzitet upadnog, izlaznog zračenja
AS = m C
AS – analitički signal (apsorpcija, apsorbancija)
C = ϕ (c) T , A – transmisija, transparencija; asporbancija
m – konstanta koja uključuje duljinu optičkog
puta i apsorptivnost kao vrijednost
karakterističnu za analitički sustav (analit,
instrumentalni parametri)
C, c – koncentracija atoma u apsorbirajućem
mediju, odnosno analita u otopini uzorka

Posljednja funkcionalnost ovisi o efikasnosti procesa raspršivanja i atomizacije

uzorka. U radnim odnosno kalibracijskim krivuljama postavlja se grafička ovisnost
apsorbancije o koncentraciji otopine c.
Lambert- Beerov zakon
Bouguer-Lambert-Beer-Bernardov zakon je temelj kvantitativnog aspekta AAS.
U apsorpcijskom mediju debljine d koji sadrži koncentraciju atoma C, transparencija
medija je (pres. 5):

T = I/I0 = e(-Kd) = 10-acd a – apsorptivnost (apsorbancija A po jedinici c

A = log (I0/I) = log (1/T) = i d koja ima karakterističnu vrijednost za
svaki analitički sustav tj. svaki analit i
acd = log [100/(100-Ap)] = svaki set instrumentalnih parametara)
2 - log (100 - Ap) Ap – apsorpcija (%)

Iz vrijednosti postotne apsorpcije i transmisije (0-100%) iz tablica se lako dobivaju

vrijednosti apsorbancije. Vrijednosti apsorbancije odnosno kvantitativno mjerene
varijable (% apsorpcije) su funkcija koncentracije u otopini pa se u kvantitativnom
radu koristi linearna relacija:

A=bc b – konstanta, nagib pravca

b = 0,0044/cc cc – karakteristična koncentracija
(vidi dolje i str. 25, 26)

Linearnost se može izgubiti iznad vrijednosti apsorbancije od 0,5-1, pa onda krivulja

pokazuje varijacije apsorbancije u funkciji koncentracije.

Izvedbene značajke AAS

Osjetljivost se kod AAS najčešće izražava kao kalibracijska osjetljivost tj. kao
nagib kalibracijskog pravca što zapravo znači brzinu promjene analitičkog signala s

7
 promjenom koncentracije analita. Analitički je postupak osjetljiv onda kada male
promjene u koncentraciji analita rezultiraju velikim promjenama mjerenog analitičkog
signala, npr. postotne apsorpcije ili transparencije, ili apsorbancije. Kod AAS
osjetljivost se često izražava kao ona koncentracija ili masa analita koja uzrokuje 1%
apsorpcije odnosno apsorbanciju od 0,0044 (karakteristična koncentracija, masa).
Granične vrijednosti dokazivanja ili odreñivanja predstavljaju najniže
koncentracije analita koje se mogu pouzdano dokazati ili odrediti u uzorku pod
navedenim eksperimentalnim uvjetima. Za elemente koji se uobičajeno mjere AAS-
om granice detekcije se kreću od µg cm-3 ("part per million", ppm, 1:106), preko
µg dm-3 ("part per billion", ppb, 1:109) do ng dm-3 ("part per trillion", ppt, 1:1012)
(vidi tablicu 1). AAS osjetljivija je od klasičnih metoda analize (gravimetrijskih i
volumetrijskih), fotometrijskih pa čak i nekih elektrokemijskih što ju čini
primjenjljivom u analizi subultratragova analita (slika 5, pres. 7).
Procjenjuje se takoñer koncentracijsko područje linearnog odgovora, te značajke
kalibracijskog pravca i koeficijent korelacije ili koeficijent odreñivanja.
Ispravnost je odreñena blizinom eksperimentalno dobivene vrijednosti kao
srednje vrijednosti nekoliko ponovljenih analiza i stvarne vrijednosti za sadržaj analita
u uzorku. Izražava se kao eksperimentalna pogreška. Za dobru ispravnost sastav
standardne otopine treba podesiti tako da on koliko je to moguće odgovara sastavu
matrice uzorka.

Tablica 1. Granice detekcije u atomsko-apsorpcijskoj spektroskopiji (µg dm-3)* (pres. 6)

Element FAAS** GFAAS*** Element FAAS** GFAAS***

Ag 1,5 0,005 Li 0,8 0,06
Ba 15 0,35 Mg 0,15 0,004
Be 1,5 0,008 Mn 1,5 0,005
Bi 30 0,05 Mo 45 0,03
Ca 1,5 0,01 Na 0,3 0,005
Cd 0,8 0,002 Ni 6 0,07
Co 9 0,15 Pb 15 0,05
Cr 3 0,004 Rb 3 0,03
Cs 15 - Sb 45 0,05
Cu 1,5 0,014 Se 100 0,05
Fe 5 0,06 Sr 3 0,025
K 3 0,005 Zn 1,5 0,02
* µg dm-3 = ppb
** FAAS - plamena atomsko-apsorpcijska spektroskopija.
*** GFAAS - atomsko-apsorpcijska spektroskopija s grafitnom peći.

Preciznost predstavlja raspršenost pojedinačnih rezultata oko aritmetičke

sredine te se izražava standardnom devijacijom, relativnom standardnom devijacijom,
varijancom ili standardnom pogreškom aritmetičke sredine. Ona ukazuje na
ponovljivost tj. podudaranje mjernih vrijednosti.
Slijedeći grafički prikaz ilustrira odnos analitički korisnog koncentracijskog
područja u AAS i drugim analitičkim tehnikama (slika 5).
Kod AAS ispravnost ovisi o kvaliteti poredbenih standarda, matrici uzorka,
gubicima analita ili kontaminaciji analitom, operativnim i osobnim pogreškama. Za
dobru preciznost treba strogo kontrolirati eksperimentalne uvjete kao što su otapalo,

8
izvor zračenja, plamen, visina zone u plamenu, širina pukotine, brzina usisavanja
uzorka, priroda uzorka (drugi metali i dominirajući anioni). Preciznost poglavito ovisi
o emiterskom i apsorpcijskom sustavu te je vezana uz veličinu šuma. AAS-om
moguće je postići visoku ispravnost i preciznost; kod FAAS postiže se relativna
standardna devijacia (RSD) od 0,5-1% kod dobrih radnih uvjeta, a kod GFAAS
(takoñer i «electrothermal atomic absorption spectrometry», ETAAS) 5-10%. S
obzirom da RSD raste pri niskim i visokim koncentracijama, razrijeñivanjem se
postiže interval najbolje preciznosti.

GRAVIMETRIJA
VOLUMETRIJA
FOTOMETRIJA

ELEKTROKEMIJA

ATOMSKA APSORPCIJA

10-6 10-4 10-2 1 100

Koncentracija analita (%)

Slika 5. Analitički korisno koncentracijsko područje u AAS u odnosu na neke druge analitičke tehnike.
(pres. 7)

Jako razrijeñene standarde najbolje je prirediti svježe jer je njihova stabilnost

stajanjem nepredvidiva. Ona ovisi o sastavu standarda i materijalu posuña (za čuvanje
vrlo razrijeñenih otopina bolje je starije posuñe!).
Glavni izvori interferencija su spektralne i nespektralne. Spektralne
interferencije su one u kojima je izmjerena apsorpcija zračenja djelomično
uzrokovana i drugim specijama osim analita. S obzirom da je AA λ-specifična
metoda, spektralne interferencije u kojima se AA profil jednog elementa preklapa s
emisijskom linijom drugog elementa su rijetke. Kod AAS/AES osim spektralnih
smetnji, zbog nepotpune diskriminacije izmeñu analitičke spektralne linije i ostale
radijacije (npr. smetnja jake emisije natrija pri odreñivanju kalija AES-om), nastaju i
fizičke interferencije zbog prisutnosti organskog materijala u biološkim uzorcima koji
mijenja viskoznost i napetost površine otopine uzorka (npr. brzina protoka seruma
razrijeñenog s vodom 1+1 kroz pneumatski raspršivač niža je 10-20% od brzine
protoka vode). Kemijske interferencije nastaju zbog prisutnosti takvih supstancija u
uzorku koje mijenjaju raspršenje ili uvjete ekscitacije odreñivanog elementa. Npr.,
zakiseljavanje vodene otopine Mg acetata (0,5 mg cm-3) s HCl do koncentracije od
0,1 mol dm-3 HCl povećat će AA-signal za 6%. Ovo je glavni uzrok pogreške kod
većine analitičkih problema. Kod plamenih metoda interferencije ovise o zoni
plamena te anionima i kationima u uzorku. Ako interferencija nastupa u procesu
atomizacije kod FAAS i FAES najbolje je zamijeniti zrak kao oksidans dušik
suboksidom. Razne smetnje moguće je ukloniti prethodnom separacijom smetajuće
specije ili analita. Fizičke interferencije moguće je smanjiti razrijeñivanjem uzorka,

9
dodavanjem agenasa koji smanjuju razlike u sastavu uzorka i standardne otopine, tj.
podešavanjem matrice (dodatak pufera, kelatirajućih ili otpuštajućih agenasa),
dodatkom suviška interferirajućeg iona u uzorak i standard, ili primjenom metode
standardne adicije, kemijske interferencije primjenom otpuštajućih agenasa ili
pogodnim plamenom, a ionizacijske interferencije primjenom pufera.

Poredba AAS i AES

Važne prednosti AAS su slijedeće:
- analiza oko 65 različitih elemenata u cijelom nizu različitih uzoraka (biološki,
ekološki, petrokemijski, metalurški materijali, itd.);
- niske granice detekcije (µg cm-3, µg dm-3, ng dm-3) i moguća analiza tragova
metala i malih količina uzoraka. AAS je osjetljivija za odreñivanja npr. Ca,
Mg, Cu, Fe, Zn, Pb, Hg, Cd u biološkom materijalu. Visoka osjetljivost
omogućuje analize tragova analita, analize malih količina materijala i
razrijeñivanje otopina što smanjuje interferencije;
- visoka preciznost i ispravnost;
- ako su uzorci otopine ili fine suspenzije predobradba uzoraka je praktički
suvišna te je moguća njihova izravna analiza;
- visoka selektivnost što dozvoljava jednostavnu pripravu uzoraka. Spektralnih
interferencija i efekata matrice gotovo da nema jer zračenje karakteristično za
analit apsorbiraju samo atomi analita. Kemijske interferencije koje izazivaju
elementi ili spojevi koji kemijski vežu odreñene atome stvarajući nedisocirane
spojeve su rijetke, ne tražeći preliminarno odjeljivanje interferenata iz matrice
uzorka;
- relativna neovisnost o temperaturi plamena kod FAAS (za razliku od FAES)
jer se koriste samo atomi u osnovnom stanju.
- apsorpcijski proces neovisan je o ekscitacijskom potencijalu tj. λ što AAS čini
neovisnom o faktorima koji kod AES mogu utjecati na postotak ekscitiranih
atoma. Za elemente visokog ekscitacijskog potencijala s rezonantnim linijama
AAS je osjetljivija nego AES (Mg, Cd, Zn);
- brzina i niska cijena analize;
a nedostaci AAS su:
- neki elementi (refraktorni) teško prelaze u atomsku paru u osnovnom stanju u
plamenu pa tvore nedisocirane okside ili druge stabilne spojeve (Al, Be, Mo,
Si, Ti, W) te ih se može analizirati samo uz plamen bogat gorivom;
- apsorpcija atmosfere ili otapala u UV području;
- preciznost varira od elementa do elementa jer je vezana uz stabilnost emitera i
plamena, a kod FAES samo plamena;
- kod FAAS za multielementnu analizu potrebno je više monoelementnih izvora
zračenja ili jedan multielementni, a ponekad je potrebna i promjena plamena
(plinske smjese) i plamenika. Čak i noviji izvori kontinuiranog zračenja su
ograničenih mogućnosti (ili zato što ne pokrivaju traženo UV područje, ili

10
 zbog potrebe za novim temperaturnim programom za svaki element u slučaju
grafitne kivete);
- AAS ponekad treba više uzorka nego AES.
Prednosti AES su:
- dobra kvalitativna analiza jer se dobiva kompletan uvid u emisijski spektar;
- veća osjetljivost za neke elemente (alkalije: Na, Li, K);
- polukvantitativna analiza procjenom intenziteta emisije kod svake λ kod koje
sastavnice emitiraju;
- kemiluminescencijski fenomeni kod emisije kod nekih elemenata omogućuju
povećanu osjetljivost;
- lako se radi multikomponentna analiza, pa i kvantitativna, jer nije potrebna
izmjena emitera već samo filtera, monokromatora i podešavanje pukotine.
Konačna odluka o izboru tehnike ovisi o analitu, tipu i količini uzorka, broju uzoraka,
prirodi otopine, ostalim sastavnicama uzorka, traženoj osjetljivosti i o tome da li je
potrebna mono- ili multikomponentna analiza; npr za odreñivanje Zn u malim
koncentracijama preferira se AAS.

Osnove instrumentacije za AAS

Dijagram instrumentalnih funkcija u analitičkoj atomskoj spektroskopiji
prikazan na slikama 6-9 (str. 12 i 15) ukazuje da je instrumentacijski sustav za AAS
grañen iz:
- emisijskog sustava koji emitira spektar karakterističan za element koji se
odreñuje (žarulja sa šupljom katodom ili bezelektrodna žarulja uz izbijanje) ali
može biti i izvor kontinuiranog spektra;
- atomizatora tj. sustava koji stvara atomsku paru (plamen u koji se injicira
aerosol uzorka, ili elektrotoplinski atomizator, ili sustav nastajanja lako
isparljivih hidrida ili hladnih para, npr. Hg);
- sustav spektralne selekcije (filtri, monokromatori: optičke mrežice i prizme);
- fotodetekcijski i mjerni sustav (detektor, fotomultiplikator i dr.).

Princip je taj da svjetlo iz lampe prolazi kroz plamen u koji se usisava otopina uzorka
te atomi analiziranog elementa apsorbiraju dio energije svjetla. Rezonantna linija se
izdvaja pomoću filtera ili monokromatora te registrira fotodetekcijskim sustavom.
Spektrofotometar može biti izgrañen s dvije ili s jednom zrakom; u posljednjem
slučaju svjetlo koje izlazi iz lampe je isprekidano (npr. rotirajućim sektorom,
"chopper"-om) dok plamen zrači konstantno. Isprekidano svjetlo na izlazu iz
detektora daje izmjeničnu struju pa se tako anulira svjetlo plamena.

Atomizatori služe tome da prevedu uzorak u atomsku paru plamenom,

električnom strujom ili laserom. Idealni atomizator u potpunosti pretvara uzorak u
atomsku paru. Efikasnost stvaranja atomske pare odreñuje osjetljivost analize.
Ukoliko uzorka imamo više, koristi se FAAS i tada se uzorak kontinuirano usisava u
plamen; tada je signal proporcionalan koncentraciji analita. Ako uzorka imamo malo

11
koristimo elektrotoplinski atomizator i analiziramo mikrolitarske alikvote uzorka; tada
je signal proporcionalan apsolutnoj množini/masi analita u uzorku. Prvi sustav je
precizniji ali manje osjetljiv.

IZVOR SVJETLA
(FLUORESCENCIJA)

MJERENJE
ATOMSKA PARA ZRAČENJA
IZVOR EMISIJA
SVJETLA SELEKCIJA λ
APSORPCIJA
FOTODETEKTOR
FLUORESCENCIJA
IZLAZNI SIGNAL

ATOMIZACIJA

UZORAK

Slika 6. Dijagram instrumentalnih funkcija u analitičkoj atomskoj spektroskopiji. (pres. 8)

Žarulja Plamen Detektor+pojačalo

"Chopper" Monokromator

Slika 7. Izmjenični sustav s jednom zrakom. (pres. 9)

Plameni predstavljaju najčešći sustav za atomizaciju u kliničkim laboratorijima.

Tekući uzorci prolaze najčešće kroz pneumatski raspršivač, nastaje aerosol sa
srednjim dijametrom čestica od 2 µm (sadrži 5-10% izvornog uzorka) koji ulazi u
plamen. Najefikasniji sustavi za raspršivanje su grijane komore, ultrazvučni i
elektrostatski raspršivači koji su još efikasniji od pneumatskih raspršivača. Za
poboljšani protok uzorka u plamen koriste se ponekad organska otapala, npr. etanol,
propanol, koja biološkim uzorcima smanjuju površinsku napetost. U obzir dolaze
različite smjese plinova; za analizu većine elemenata pogodan je zrak kao oksidans i
acetilen kao gorivo s temperaturom od 2500 K. Kod onih uzoraka koji stvaraju
termički stabilne spojeve ili gdje matrica sadrži takve materijale tj. za refraktorne
elemente potrebne su više temperature (npr. N2O-C2H2, 3100 K); ova plinska smjesa
može biti i vrlo osjetljiv izvor kod FAES. U FAES uzorak se najčešće raspršuje u
relativno hladni plamen zrak-propan (2100 K). Tlakovi i brzine protoka oba plina
moraju biti strogo kontrolirani da bi se dobili reproducibilni rezultati. Kod FAES

12
temperatura plamena treba biti dovoljno visoka da atomizira uzorak i da ekscitira
dovoljno atoma na emisiju, da se dobije tražena osjetljivost ali ne smije biti toliko
visoka da doñe do ionizacije. Emisijski spektar samog plamena neće se preklapati s λ
spektralnih linija koje mjerimo. Kod FAAS plamen prevodi uzorak u atomsku paru pa
mu temperatura treba biti toliko visoka da dovede do potpune atomizacije elementa i
maksimalnog boravka atoma u optičkom putu instrumenta ali ne i da doñe do
ekscitacije i ionizacije (tablica 2).
Za atomizaciju lako isparljivih elemenata (Cu, Cd, Pb, Zn) dobri su plamenovi
niske temperature (vidi tablicu 2) dok alkalije koje čine refraktorne okside trebaju
višu temperaturu (plamen zrak-C2H2), a Al, Be, rijetke zemlje koje čine vrlo stabilne
okside trebaju visoke temperature, npr., plamen kisik-acetilen, N2O-acetilen. Npr.,
zamjenom zraka kao oksidansa dušikovim suboksidom mogu se izbjeći mnoge
atomizacijske interferencije u FAES i FAAS. Ova plinska smjesa zbog povećane
efikasnosti atomizacije daje bolje granice detekcije za Si, Al, Sc, Ti, V, Zr. Tablica 2
daje uvid u temperature nekih plinskih smjesa.

Tablica 2. Plinske smjese i temperature plamena (pres. 10)

Smjesa plinova Temperatura

plamena (K)
Zrak-C2H2 2500
Zrak-propan 2100
Zrak-vodik 2300
Kisik-C2H2 3250
Kisik-vodik 2950
Kisik-dušik-C2H2 3000
N2O-C2H2 3100

Brzina isparavanja otapala iz uzorka ovisi o njegovom kemijskom sastavu i

temperaturi plamena; plameni visoke temperature osiguravaju brzo i potpuno
isparavanje, no istovemeno dolazi do veće ekspanzije plinova plamena tako da se
smanjuje gustoća atomske pare. Kada je uzorak atomiziran on može reagirati s
plinovima plamena što dovodi do sniženja osjetljivosti ukoliko se stvaraju stabilni
spojevi. Gustoća ekscitiranih atoma u plamenu varira s visinom iznad plamenika pa za
svaki element treba naći najpogodniju zonu u plamenu da se postigne maksimalna
osjetljivost i minimalne interferencije.
Kod elektrotoplinskih atomizera plamenik je zamijenjen drugim načinom
toplinske disocijacije uzorka; uzorak se suši, spaljuje u procesu pirolize pa toplinski
atomizira prolazom električne struje. Grafitna peć (kiveta) (vidi i str. 29) je grafitna
cijev u čijoj se sredini nalazi kruti ili tekući uzorak i kroz koju prolazi svjetlosna zraka
koja izlazi iz izvora zračenja. Cijev ima na svakom kraju kvarcne prozorčiće. Kroz
cijev se propušta inertni plin (argon, N2)koji ju štiti od oksidacije, a na krajeve cijevi
dovodi električni napon pri čemu se ona zagrije najprije do temperature sušenja i
spaljivanja uzorka, a zatim atomizacije [≤3000 K, kod THGA ("transverse heated
graphite atomizer"-a) <2800 K] te pisač registrira pik čija je visina proprcionalna
apsolutnoj masi analita. Grafitna kiveta omogućuje potpunu atomizaciju cijelog

13
uzorka i dulje zadržavanje atoma u optičkom putu nego što je to slučaj kod plamene
tehnike. Zbog toga grafitna peć omogućuje značajno osjetljivije odreñivanje metala
nego klasična aspiracija u plamen pa su granice detekcije snižene i do tisuću puta i u
području su µg dm-3 do ng dm-3 (ppb do ppt) (vidi tablicu 1, str. 8). Osim toga grafitna
peć omogućuje analizu i tekućih i čvrstih uzoraka kao i onih dostupnih u vrlo malim
količinama (npr. biološki ili drugi teško dostupni uzorci) jer se analizira 1-100 mm3
(µl) uzorka (tipično 20 mm3). Ovakvim sustavom odreñuju se tragovi elemenata, npr.,
toksičnih metala, a mogu se odreñivati i refraktorni elementi. Nedostatak grafitne peći
je slabija preciznost: RSD je 5-10%.
Kod ove tehnike moguće je kontrolirati sušenje i spaljivanje uzorka do
mineralizacije; zatim se temperatura diže do one koja je potrebna za disocijaciju spoja
pa druga predobradba uzorka nije niti potrebna. Na kraju postupka grafitna peć se
termički očisti. Svaki korak optimiran je i programiran vremenom postizavanja i
vremenom održavanja zadane temperature (vidi i tablice 4 i 5, str. 30 i 32).
Sagorijevanjem organske matrice nastat će dimni signal koji će maskirati signal
analita. Nadalje, kalibracija je teška zbog efekata matrice koji mogu modificirati
brzinu atomizacije uzorka pa i visinu pika. Zato su ispravnija mjerenja površine ispod
pika. Grafitna kiveta može se kombinirati sa solvent ekstrakcijom da se dodatno
dobije poboljšana osjetljivost.
Zračenje koje emitira ekscitirani atom može se detektirati pretvorbom svjetlosne
energije u električni signal koji će se kasnije elektronički pojačati i registrirati.
Sustavom za selekciju izdvaja se samo jedna spektralna linija te koristi za aktiviranje
fotoelektričnog detekora koji stvara signal proporcionalan intenzitetu upadnog
zračenja. Kako se u AAS raspolaže s relativno malim energijama signal se pojačava
106 puta u sustavu fotomultiplikatora; intenzitet svjetla može se mjeriti s RSD ≤0,1%.
Izlazni signal fotomultiplikatora struja je elektronskih pulseva čija je frekvencija
mjera brzine kojom fotoni udaraju u fotokatodu. Ova fotoosjetljiva katoda može biti
izrañena iz raznih legura. U idealnom slučaju je izlazni signal proporcionalan
koncentraciji analita preko koncentracijskog područja od nekoliko redova veličine.
Posebnim električkim sustavom odabire se samo dio izlaznog signala koji se stvara u
isto vrijeme kada prolazi zračenje iz izvora svjetla kroz sustav te automatski oduzima
svaki kontinuirani signal pozadine. Izlazni signal nekada se registrirao klasično (na
mjeraču, štampaču, pisaču) a danas digitalno.

Analitička primjena AAS

AAS se koristi za analize niza metalnih iona u najrazličitijim tipovima uzoraka i
u različitim područjima, kao u polju javnog zdravstva i ekologije (npr. analize voda,
čestica u zraku), u medicini, kliničkoj kemiji i farmaciji (analize lijekova, krvi,
seruma i plazme, urina, tkiva), u industriji hrane i poljoprivredi (analize hrane, aditiva
hrani, životinjskih i biljnih tkiva, tla, gnojiva), u petrokemijskoj industriji (analize
benzina, mazivih ulja), metalnoj industriji i metalurgiji (analize željeza, čelika, ruda,
raznih legura), u analizi kozmetičkih proizvoda, stakla, vlakana i cemenata.
AAS se često primjenjuje za odreñivanje tragova metala u biološkim
uzorcima. Granica detekcije/odreñivanja obično je u biološkom uzorku viša od one u
čistim otopinama. Uzorci se predobrañuju razrijeñivanjem, puferiranjem,
ekstrakcijom, deproteinizacijom, suhim ili mokrim spaljivanjem, dodavanjem
kelatirajućih ili otpuštajućih agenasa (vidi str. 18). U krvi i njezinim derivatima, urinu

14
i tkivima AAS-om odreñuju se npr. Al, As, Au, Bi, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Hg, Mn, Ni,
Pb, Se, V, Zn, a u cerebrospinalnom likvoru Zn i Cu. Kod odreñivanja Pb, Cu, Hg,
Mg, Ca i Mn u krvi, urinu i tkivima treba ukloniti organsku tvar ili primijeniti
ekstrakcijski postupak.
Pri analizi bioloških uzoraka nastaju poteškoće zbog dimnog signala i
apsorpcije molekulskih specija, odnosno nespecifične apsorpcije pozadine. Ovi se
efekti uklanjaju primjenom deuterijskog luka kao neovisnog izvora kontinuiranog
spektra (slike 8 i 9) ili Zeemanovim korektorom pozadine (vidi str. 38) ili
pulzirajućom šupljom katodnom lampom, koja istovremeno služi kao izvor i uske i
široke linije. U slučaju deuterijskog luka, kao dodatnog neovisnog izvora zračenja,
koristi se razlika intenziteta izmeñu uske atomske linije i široke molekulske
apsorpcije/raspršenja. Zeemanov korektor pozadine temelji se na Zeemanovom
efektu, tj., cijepanju atomskih linija koje nastaje kada se atomi nalaze u magnetskom
polju što dovodi do promjene polarizacije spektralnih linija.

Deuterijev luk

"Chopper
Žarulja "

Plamen Detektor+pojačalo
Monokromator

Slika 8. Optička shema AA-spektrofotometra s deuterijskim korektorom nespecifične apsorpcije

pozadine. (pres. 11)

Opći analitički postupci

Za ispravno odreñivanje treba provesti kalibraciju standardnim otopinama te
ako je potrebno podesiti sastav standarda ili uzorka, naročito kod kompleksnih
bioloških uzoraka. Ako to nije moguće, koristi se metoda standardne adicije (slika
10).
Kalibracija je postupak postavljanja kalibracijske krivulje kao grafičkog prikaza
varijacije eksperimentalnih mjerenja (mjerenja kvantitativne varijable analitičkog
sustava) kao funkcije koncentracije analita u otopini. Ako ima trenutnu primjenu to je
radna krivulja koja se mora kontrolirati za svaku seriju mjerenja. Zakrivljenje
kalibracijske funkcije može nastati zbog sastavnica matrice uzorka, nevodenih
otapala, optičkog sustava, prirode plamena, značajki emitera i intenziteta struje lampe.
Linearni analitički odgovor dobiva se kada se mjerenje radi pri valnoj duljini pika i
ako je koncentracija atomske pare uniformna kroz cijeli volumen plamena kroz koji
prolazi zraka svjetla (slike 6-9).

15
 Slika 9. Optički dijagram AA- spektrofotometra. (pres. 12)

Za kalibraciju valja pripraviti seriju standardnih otopina analita iz «stock»

(matične) otopine u istom otapalu i uz iste sureagense kao i otopine uzorka, a koje
svojom koncentracijom moraju pokriti cijelo područje koje nas interesira. Na temelju
njihovih mjerenja konstruira se kalibracijski graf. Otopine uzorka prireñuju se
otapanjem, razrijeñivanjem ili nakon neke druge predobradbe (vidi str. 9, 17, 26).
Standardi se mjere na početku i na kraju mjerenja i periodički tokom duljih serija
mjerenja. Slijepi uzorak ili otapalo mjeri se izmeñu svakog uzorka ili standarda da se
provjeri stabilnost bazne linije. Kod vrlo razrijeñenih otopina može se koristiti
ekspanzija skale instrumenta (3, 5, 50, 100x) radi povećanja ispravnosti rezultata. Sve
vrijednosti analitičkog signala podijele se tada s faktorom ekspanzije prije daljnje
obrade (signal postotne apsorpcije prevodi se u apsorbanciju te korigira vrijednošću
apsorbancije slijepe probe). Primjenom ekspanzije dolazi i do porasta šuma.
Serija standarda koji pokrivaju odreñeno koncentracijsko područje omogućuje
konstrukciju kalibracijske odnosno radne krivulje (A vs. koncentracija analita, slika
10). Ako se radi u linearnom području i ako sve varijable održavamo konstantnima,
dovoljan je samo jedan standard i slijepa otopina. Tada se mjerenje standarda često
ponavlja a najbolji je redoslijed: slijepi uzorak, uzorak, standard, slijepi uzorak,
uzorak, standard. Radna krivulja može se mijenjati pa ju treba kontrolirati pred svaku
seriju mjerenja:
γu = Au γs /As
γu, γs – koncentracija analita u uzorku, standardu; Au, As – korigirana apsorbancija
uzorka, standarda.
Ovamo se mogu ubrojiti i mjerenja uz dva standarda, jednog malo veće i drugog malo
manje koncentracije od uzorka.

16
 Prilikom mjerenja najbolje je ići od manje ka većoj koncentraciji jer se
izbjegava kontaminacija i pogreške zbog memorije. Općenito, aspiracija vode ili
drugog otapala ide iza najkoncentriranijeg uzorka ili standarda, zatim slijedi
«nuliranje» te mjerenje slijepe otopine ili druge otopine niske koncentracije. Kada
uzorci ili standardi sadrže puno soli ili puno organske tvari dobro je izmeñu mjerenja
ponavljati ispiranja vodom ili drugim otapalom te eventualno raditi meñuočitanja
slijepe probe i «nuliranja».
Metoda standardne adicije primjenjuje se onda kada je teško pripraviti standarde
koji su dovoljno slični uzorcima (kada oni sadrže velike i promjenjljive koncentracije
matrice ili krutine koji utječu na apsorpciju). Postupak se u pravilu provodi tako da se
uzimaju tri alikvota uzorka. Prvi se razrijeñuje s otapalom do odreñenog volumena,
drugi i treći se razrijeñuju do istog volumena s odgovarajućom količinom poznatih
standarda dodanih tako da konačne otopine sadrže različite dodatke metala koji se
odreñuje. Uzorak se tada mjeri sam i ponovno s poznatim dodacima analita;
koncentracija analita u uzorku dobiva se ekstrapolacijom pravca dok on ne siječe
koncentracijsku os (slika 10b). Dodaci trebaju biti približno iste koncentracije kao što
je ona koja se očekuje u uzorku. Umjesto postavljanja grafičkog prikaza rezultat se
može izračunati pri čemu trebaju biti zadovoljena tri uvjeta: sve otopine valja
prirediti do istog ukupnog volumena, unutar cijelog koncentracijskog područja u
kojem radimo mora biti zadovoljena linearnost odgovora, sva očitanja trebaju biti
iskazana kao apsorbancije ili koncentracije:
cu = cs RuVs/[Vu(Rs - Ru)]
cu, cs – koncentracija analita u uzorku, standardu; Vu, Vs – volumen uzorka, standarda;
Ru, Rs – analitički signal za razrijeñeni uzorak i obogaćeni «spiked» uzorak
Odreñivanja AAS-om rade se pri strogo kontroliranim i stalnim instrumentalnim
uvjetima kao što su λ, struja ili napon lampe, tlakovi i protoci plinova (goriva i
oksidansa) kod FAAS-a, širina pukotine, ekspanzija skale, itd. Za svako mjerenje
FAAS-om potrebno je oko 2 cm3 uzorka, a minimalno je potrebno načiniti barem tri
neovisna mjerenja istog uzorka. Optimalno područje mjernog intervala apsorbancije u
AAS-u kreće se izmeñu 0,12 i 0,70 ako je zadržana linearnost, odnosno 25-30%
apsorpcije. Ako mjerenja izlaze izvan tih granica gubi se na ispravnosti rezultata.
Može se postaviti i ovisnost postotne apsorpcije o koncentraciji kod niskih analitičkih
signala.

Predobradba bioloških uzoraka

Na ovaj način moguće je izbjeći niz interferencija. Priprema uzorka za AAS
mjerenje jednostavnija je nego za AES. U obzir dolaze slijedeći postupci pripreme
uzoraka prije AAS analize: razrijeñivanje, puferiranje, primjena kelatirajućih (EDTA)
ili otpuštajućih agenasa (LaCl3, SrCl2), ekstrakcija uz amonij pirolidin ditiokarbamat
(APDC) i metilizobutilketon (MIBK), deproteinizacija nekim od standardnih
reagenasa (kiselinom: HClO4, CCl3COOH, volframova kiselina i dr., organskim
otapalom), suho ili mokro spaljivanje. Zadnjih godina ovi klasični postupci bivaju
zamijenjeni primjenom mikrovalnog zračenja (MW) u peći ili bombi (digestija,
mikrovalna termička desorpcija, odmrzavanje) i ultrazvučne kupelji (za otapanje,
suspendiranje, ekstrakciju u organsko otapalo).

17
 6 7
Analiticki signal

Analiticki signal
a) 6 b)
5

5
4
4
3
3
2
2

1 1

0 0
0 1 2 3 4 5 6 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5
c c (stand. dodaci)

Slika 10. Radne krivulje analitički signal vs. koncentracija analita kod metode: a) kalibracije, b)
standardne adicije. (pres. 13)

Krv i njezini derivati

Odreñivati se mogu : Ca, Cd, Cu, Cr, Hg, K, Mg, Mn, Mo, Na, Pb,Th, Zn.
Kod analiza krvi serum je najpogodniji jer se izbjegava kontaminacija
antikoagulansom. Ako je potrebna deproteinizacija seruma ili plazme ona se može
provesti s nekim od standardnih reagenasa [HClO4, CCl3COOH, volframova kiselina,
HNO3, H2SO4, kiseline uz mikrovalno zračenje u MW-peći, ref. 4]. Valja osigurati da
se mjereni element ne koprecipitira s proteinima i da se komponenta vezana na
protein kvantitativno oslobaña. Puna krv, serum ili plazma može se čuvati pri 4 oC
nekoliko dana ili dulje. Za analizu stanica krvi potrebno je dugotrajno centrifugiranje
da se osigura reproducibilno pakiranje stanica; stanice je moguće hemolizirati
suspendiranjem u vodi uz zakiseljavanje radi taloženja staničnih membrana.
U obzir dolaze slijedeći postupci predobradbe: razrijeñivanje, deproteinizacija,
maskirajući agensi (EDTA), otpuštajući agensi (La, Sr), ekstrakcija.
Kod Na, Mg i K uzorak seruma ili plazme samo se razrijeñuje s vodom; za
analizu Ca eventualno je potrebna obrada sa CCl3COOH nakon čega se smjesa
centrifugira te koristi supernatant. Treba paziti da ne doñe do gubitaka Ca vezanog na
protein. Kod odreñivanja Ca interferencije Na i K kompenziraju se dodatkom Na u
standard, interferencije sulfata i fosfata uklanjaju se otpuštajućim agensom LaCl3 ili
primjenom ionsko-izmjenjivačke smole u koloni. Interferencije kod odreñivanja Mg
smanjuju se dodatkom EDTA, ili SrCl2 kao otpuštajućeg agensa. Kod odreñivanja K
interferencije se mogu ukloniti razrijeñivanjem s EDTA ili kompenzacijom standarda
s Na.
Preliminarna razrijeñenja mogu se provesti s Na2EDTA. Npr., Pb se ekstrahira s
APDC iz pune krvi u MIBK. Serum se analizira s obzirom na Fe, Cu i Zn kod
razrijeñenja 1:1 ili 1:2 s vodom. Ovo se obično radi u slučaju malih uzoraka. Kod
odreñivanja Fe u serumu u sve standarde treba dodati protein.
Standardi mogu biti izravne vodene otopine ili mogu biti kompenzirani s
obzirom na otapalo, otpuštajuće agense, maskirajuće agense ili interferente.

18
Urin

U urinu mogu se odreñivati: Ag, Au, Bi, Ca, Cd, Cr, Co, Cu, Fe, K, Mg, Na,
Hg, Ni, Th, Zn.

Uzorci urina čuvaju se uz bakteriostatike, kisele konzervanse (CH3COOH, HCl)

ako prije analize stoje dulje. Predobradbe koje se često primjenjuju su razrijeñivanje,
kemijske separacije, suho spaljivanje, ekstrakcija (APDC+MIBK), primjena
otpuštajućih agenasa. Urin obično zahtijeva manje predobradbe od drugih fizioloških
tekućina ali ga se čuva u frižideru uz dodatak bakteriostatskih agenasa ako ga se ne
može analizirati u roku od 24 sata. Svaki sediment treba otopiti zakiseljavanjem s
HCl. Zamrznuti uzorci se mogu čuvati dulje vremena. Prije analize urin se obično
centrifugira da se uklone čvrste čestice i po potrebi razrijeñuje.
Ako se ne radi ekstrakcija s organskim otapalom radi se jednostavno
razrijeñivanje ili kemijska separacija. Razrijeñivanje se radi s vodom ili s
otpuštajućim agensom (npr. kod analize Ca). Može se provesti i suho spaljivanje, pa
otapanje ostatka u HCl, eventualno uz otpuštajući agens, ili odjeljivanje taloženjem
(npr. Ca s oksalatom).
Za analize Pb, Hg, Bi, Cu i Ni dobre su ekstrakcije s APDC nakon kojih slijedi
izmućkavanje u MIBK. Ovdje je važna prethodna kontrola pH. Zn i Cd mogu se
odrediti i bez ekstrakcije.
Standardi trebaju sadržavati konzervanse, aditive, kiseline u istim količinama
kao i uzorci. Kod ekstrakcijskih procesa treba ih ekstrahirati na isti način kao i uzorke.
Slina
Predobradbe koje dolaze u obzir su razrijeñivanje, maskiranje ili dodavanje
otpuštajućih agenasa (EDTA, SrCl2, LaCl3) te deproteinizacija (CCl3COOH).
Npr., Ca se može odrediti nakon razrijeñivanja s vodom ili s vodom +
Na2EDTA ili s vodom + Sr ili La + CCl3COOH; nakon toga uzorak se centrifugira i
mjerenje radi u supernatantu. Radi interferencije natrija iz uzorka, standard se
kompenzira s Na. Uzorke nije poželjno centrifugirati jer dolazi do gubitaka Ca.
Cerebrospinalni likvor
Uobičajena predobradba je razrijeñivanje.
Odreñuju se Mg i Ca u razrijeñenim uzorcima.
Tkiva
Odreñuju se: Ca, Cu, Zn, Mg, Mn, Se.
Predobradba uključuje suho ili mokro spaljivanje, dodatak otpuštajućih agenasa
(soli La, Sr). Pogodno je suho spaljivanje kod odreñivanja Ca ili Zn, ili digestija s
HNO3 kod Mg.
Kod Ca i/ili Mg kao otpuštajući agens koristi se La ili Sr. Mn, Cu, Zn mogu se
odrediti u sušenoj jetri, a Cu, K i Zn u sušenom mišiću.
Analiza mekih i krutih tkiva, hrane i fecesa traži razgradnju organske tvari
nekim spaljivanjem. To se može provesti grijanjem do visoke temperature, tekućim
kemijskim sredstvima ili mikrovalnim zračenjem. Tkivo se prvo mora odvojit od

19
okolnog materijala, zatim mljeti ili homogenizirati s vodom da se dobije jednolična
smjesa od koje se uzima alikvot za analizu. Ako je potrebna znatnija predobradba
uzorka mora se paziti da se ne kontaminira metalnim priborom i posuñem. Ako se
uzorak može zamrznuti ili osušiti najbolje je usitnjavanje u ahatnom tarioniku s
pistilom. Nakon predobradbe se reprezentativni uzorak tkiva uzima po masi, a ne po
volumenu.
U starijim postupcima spaljivanja nakon preliminarnog sušenja alikvota uzorka
u lončiću, npr., na pješčanoj kupelji, prelazilo se na suho spaljivanje obično u
termostatiranoj mufolnoj peći. Tu je važna temperatura radi potpune razgradnje
organske tvari bez gubitka isparljivog metala. U praksi je dobro spaljivanje pri 500 oC
kroz 16 sati. Obično se ostatak nakon suhog spaljivanja zakiseljavao s nekoliko cm3
konc. HCl da bi se otopili metalni oksidi. Nekad je dobar i Mg(NO3)2. Suho
spaljivanje može se provoditi u Pt-, kvarcnim ili Ni-lončićima. Prvi su najbolji ali i
skupi. Kvarcni su dobri ali ih treba baciti čim nestane glazure, jer dolazi do gubitaka
analita na poroznim stijenkama. Gubici mogu nastati i zbog kemijskih reakcija s
materijalom lončića. Kod malih uzoraka dominantni su gubici zbog isparljivosti
analita. Ako temperatura potrebna za spaljivanje organskog materijala vodi do
isparavanja analita valja koristiti zatvoreni sustav koji koristi kisik.
Postupci mokrog spaljivanja brži su od suhog spaljivanja (1-2 sata), ali ovdje
nastaje problem kontaminacije zbog dodanih reagenasa. Zato treba koristiti ultračiste
kiseline. Najčešće korištena smjesa kiselina je HNO3, H2SO4 i HClO4, zatim
KMnO4+H2O2, kvarterni amonijum hidroksid.
Npr. kod simultanih odreñivanja više metalnih iona GFAAS-om urin se
razrijeñuje u odnosu 1+1, 1+2 ili 1+4, serum 1+3 a puna krv 1+9, vino 1+1, s HNO3
ili smjesom HNO3+Triton X-100 (neionski detergent). Ovo razrijeñivanje radi se već
izravno u čašici «autosamplera». Ponekad se dodaje i oksidacijska smjesa
H2O2+HNO3, a dodaju se i kemijski modifikatori, te eventualno i unutarnji standard.
GFAAS se često koristi u analizi metalnih iona u vodi.
Standardi moraju sadržavati ekvivalentne količine kiselina i otpuštajućih
agenasa.
U novije vrijeme preferiraju se postupci mikrovalne digestije, npr., uzoraka
dagnji pri visokom tlaku u teflonskoj bombi prije FAAS analize kadmija (npr., ref.
13).
U izolaciji analita i redukciji signala pozadine mogu poslužiti ionska izmjena i
ekstrakcija organskim otapalom.

Neki proizvoñači AAS - PerkinElmer Instruments (SAD), Thermo Scientific (SAD),

Varian, Inc. (SAD), Analytik Jena AG (Germany), Shimadzu (Japan).

20
 Odreñivanje cinka i bakra u ljudskom serumu FAAS-om
oficijelnim analitičkim postupcima (ref. 1)

Odreñivanje Zn

Reagencije i pribor
osnovni standard Zn2+ (500 ili 1000 µg cm-3)
humani serum
glicerol 5%
redestilirana voda

Analitički postupci

Najprije se razrijeñivanjem s vodom iz osnovne otopine cinka pripravi

meñurazrijeñenje koncentracije 20 µg cm-3 Zn. Iz njega se pripravi serija standardnih
otopina slijedećih koncentracija u 5% glicerolu: 0,05, 0,1, 0,3, 0,5, 0,7 i 1,0
µg cm-3 Zn. Uzorak seruma peterostruko se razrijedi s vodom. Ukoliko uzorka imamo
dovoljno, priprave se 3 neovisna razrijeñenja istog uzorka. 5% glicerol služi kao
slijepi uzorak.
Postave se i održavaju konstantnima instrumentalni parametri kako je za cink
navedeno u tablici 3. Kada je instrument uključen i plamen upaljen najprije se sustav
raspršivača ispire s vodom nekoliko minuta, a nakon toga aspirira i mjeri 5% glicerol.
Nakon toga se aspiriraju i mjere standardne otopine prema rastućoj koncentraciji Zn, a
zatim uzorci. Svaku otopinu valja izmjeriti barem 3 puta. Raspršivač se ponovno
ispire s vodom, gasi plamen te pažljivo isključi instrument. Posebnu pažnju treba
obratiti zatvaranju dovoda acetilena, a zatim zraka.
Srednja vrijednost analitičkog signala (postotna apsorpcija) za svaku izmjerenu
otopinu se očita, prevede u apsorbanciju i tabelira u funkciji koncentracije cinka.
Svaku apsorbanciju valja korigirati signalom slijepog uzorka pa se korigirane
vrijednosti apsorbancije postavljaju u grafičku ovisnost o koncentraciji cinka. Iz
kalibracijskog grafa se očita koncentracija u izmjerenom uzorku. Ona nakon
množenja s faktorom 5 daje koncentraciju cinka u izvornom uzorku.
Odreñivanje Cu
Reagencije i pribor

osnovni standard Cu2+ (500 ili 1000 µg cm-3)

humani serum
glicerol 10%
redestilirana voda

Analitički postupci

Najprije se razrijeñivanjem s vodom iz osnovne otopine bakra pripravi

meñurazrijeñenje koncentracije 20 µg cm-3 Cu. Iz njega se pripravi serija standardnih
otopina slijedećih koncentracija u 10% glicerolu: 0,1, 0,3, 0,7, 1,0, 1,5 i 2,0 µg cm-3

21
Cu. Uzorak seruma razrijedi se dvostruko s vodom. Ukoliko uzorka imamo dovoljno,
priprave se 3 neovisna razrijeñenja istog uzorka. 10% glicerol služi kao slijepi uzorak.
Postave se i održavaju konstantnima instrumentalni parametri kako je za bakar
navedeno u tablici 3. Kada je instrument uključen i plamen upaljen najprije se sustav
raspršivača ispire s vodom nekoliko minuta, a nakon toga aspirira i mjeri 10%
glicerol. Nakon toga se aspiriraju i mjere standardne otopine prema rastućoj
koncentraciji bakra, a zatim uzorci. Svaku otopinu valja izmjeriti barem 3 puta.
Raspršivač se ponovno ispire s vodom, gasi plamen te pažljivo isključi instrument.
Posebnu pažnju treba obratiti zatvaranju dovoda acetilena, a zatim zraka.
Srednja vrijednost analitičkog signala (postotna apsorpcija) za svaku izmjerenu
otopinu se očita, prevede u apsorbanciju i tabelira u funkciji koncentracije bakra.
Svaku apsorbanciju valja korigirati signalom slijepog uzorka pa se korigirane
vrijednosti apsorbancije postavljaju u grafičku ovisnost o koncentraciji bakra. Iz
kalibracijskog grafa se očita koncentracija u izmjerenom uzorku. Ona nakon
množenja s faktorom 2 daje koncentraciju bakra u izvornom uzorku.

Instrumenti i instrumentalni parametri

- atomsko apsorpcijski spektrofotometar Perkin-Elmer 305B (Perkin-Elmer,

Norwalk, CT, SAD)
- atomsko apsorpcijski spektrofotometar AAnalyst 800 (PerkinElmer Instruments,
Norwalk, CT, SAD)
Tablica 3. Instrumentalni parametri pri mjerenju Cu i Zn u plamenu (pres. 14)

Element Bakar Cink

,
Žarulja HCL (15 mA)* ** EDL (6 W)*, HCL**
Valna duljina (nm) 325,1*, 324,8** 214,5*, 213,9**
Širina pukotine 0,7 nm*,**
Signal INT 2*
Funkcija ABS*
Multiplikacija signala 3* 1*
Gorivo acetilen (protok 3,9 dm min , tlak 56 kPa)*†
3 -1

acetilen (protok 2,0)**

Oksidans zrak (protok 22,5 dm3 min-1, tlak 210 kPa)*†
zrak (protok 17,0)**
Korekcija nespecifične DBC*,**
apsorpcije pozadine
Pisač, računalo, Perkin Elmer 56, 10 mV*
štampač AAWinlab 32 Software,
Dell OptiPlex GX270 računalo+monitor+printer HP 5652**
* Perkin-Elmer 305B
** AAnalyst 800
† Oznake na kontrolnoj kutiji za protok: acetilen 8,5, zrak 9,0; za tlak: acetilen 8 psig, zrak 30 psig.
HCL – lampa sa šupljom katodom, EDL – bezelektrodna žarulja uz izbijanje, DBC – deuterijski
korektor nespecifične apsorpcije pozadine

22
 Literatura
1. BC-5 - Analysis of serum and plasma: Copper and zinc, u: Analytical Methods for Atomic
Absorption Spectrometry, PerkinElmer™ Instruments, August 2000, pp. 160.
2. Atomic Spectrometry – The THGA Graphite Furnace – Techniques and Recommended Conditions,
PerkinElmer Bodenseewerk, Überlingen, 1999.
3. R. D. Beaty i J. D. Kerber, Concepts, Instrumentation and Techniques in Atomic Absorption
Spectrophotometry, Perkin Elmer Inc., Shelton (CT), 2002.
4. D. Bohrer, P. C. do Nascimento i S. G. Pomblum, Deproteinization of blood serum by acid
treatment and microwave irradiation for the determination of aluminium by electrothermal atomic
absorption spectrometry, J. Anal. At. Spectr. 13 (1998) 635-639.
5. G. D. Christian i F. J. Feldman, Atomic Absorption Spectroscopy: Applications in Agriculture,
Biology and Medicine, Wiley, New York, 1970.
6. J. B. Dawson, Analytical atomic spectroscopy, u: Scientific Foundations of Clinical Biochemistry,
Volume 1, Analytical Aspects (ur. D. L. Williams, R. F. Nunn i V. Marks), William Heinemann
Medical Books, London, 1978, str. 95-120.
7. H. T. Delves, The analysis of biological and clinical materials, Progr. Anal. Atom. Spectr. 4 (1981)
1-48.
8. R. D. Eastham, Biochemical Values in Clinical Medicine, John Wright & Sons Ltd., Bristol, 1978.
9. Guide to Atomic Spectroscopy. Techniques and Applications, Perkin Elmer Inc., Shelton (CT), 2002.
10. J. Ramírez-Muñoz, Atomic-Absorption Spectroscopy and Analysis by Atomic-Absorption Flame
Photometry, Elsevier Publishing Co., Amsterdam, 1968.
11. D. A. Skoog, D. M. West i F. J. Holler, Fundamentals of Analytical Chemistry, 6. izd., Saunders
College, Fort Worth, 1992.
12. M. J. Soriano i M. De La Guardia, A comparative study of flame atomic-absorption methods for
determination of zinc in serum and blood plasma, Talanta 31 (1984) 347-352.
13. M. C. Yebra i M. F. Enriquez, Optimized microwave digestion procedure for cadmium analysis of
mussel samples, Analusis 26 (1998) 261-263.

23
 II. DIO

Važnost širine linije u apsorpcijskom procesu

Apsorpcijske linije puno su šire od emisijskih i imaju prirodnu širinu od oko
10-14 m; u praksi takva linija se proširuje zbog raznih utjecaja na 2 do 5 pm. Proširenje
linije nastaje zbog gibanja atoma (Dopplerov efekt), kolizija atoma s atomima drugog
plina (Lorentzov efekt), kolizija meñu atomima iste vrste (Holtsmarkov efekt),
magnetskog polja (Starkov efekt) i drugih vanjskih faktora kao što je npr. električno
polje.
Prema klasičnoj teoriji disperzije integrirana apsorpcija je (pres. 15):

∫Kdν =(Πe2/ mec)N f N – broj atoma u jedinici volumena (cm3) koji

apsorbira zračenje izmeñu ν i ν+dν
K – koeficijent apsorpcije koji ovisi o ν,
temperaturi, tlaku i prirodi atoma
f – jačina oscilatora (prosječni broj elektrona u
atomu koji se može ekscitirati upadnim
zračenjem)
me, e – masa, naboj elektrona
c – brzina svjetla = 3,0x108 m s-1

Očito je da je integrirana apsorpcija linearna funkcija broja atoma tj. koncentracije

apsorbirajućih atoma u uzorku. Ako se efekt širenja apsorpcijske linije može potpuno
pripisati Dopplerovom efektu, dobivamo relaciju izmeñu koeficijenta apsorpcije u
centru linije (Kmax) i broja apsorbirajućih atoma N (pres 15):

∆λ – širina linije odreñena Dopplerovim

Kmax=(2λ2/∆λ) (loge2/Π)1/2 (Πe2/mec) N f efektom
∆λ = 1,67( λ/c) (2RT/Mr)1/2 R – plinska konstanta = 8,314 J K-1 mol-1
T – termodinamička temperatura
Mr – relativna atomska ili molekulska masa

24
Gornji izraz za Kmax vrijedi kod niskih koncentracija dok kod viših širina linije može
potjecati i zbog drugih faktora osim Dopplerovog širenja. Širina apsorpcijske linije
održava se što manjom uz minimalnu temperaturu, tlak i električno polje.
Pod optimalnim radnim uvjetima nije potrebno namještati širinu pukotine na ½
apsorpcijske linije već je dovoljno da spektrofotometar izdvoji traženu emisijsku
liniju od drugih linija emitiranih iz izvora. Rezolucija uobičajenih instrumenata slabija
je od širine emisijske i apsorpcijske linije (vidi i str. 37). Zato se koriste izvori
zračenja koji daju vrlo uske emisijske linije, npr. šuplje katodne lampe

Osjetljivost, ispravnost i preciznost mjerenja

Osjetljivost ima konstantnu vrijednost onda kada je baždarna funkcija linearna,
no općenito osjetljivost je funkcija koncentracije analita pa ju treba izražavati pomoću
koncentracijskih jedinica. Iz kalibracijske funkcije proizlazi kalibracijska osjetljivost
H (pres. 5):

H = dA/dc
a ako je kalibracijska funkcija pravac koji polazi iz ishodišta vrijedi:
H = b = A/c
tj. A = bc
Nagib kalibracijske funkcije, b, mjera je osjetljivosti analitičke metode; to je
kalibracijska osjetljivost. To je dakle brzina promjene izlaznog signala s promjenom
koncentracije ili količine analita.
Prema nekim starijim izvorima može se definirati i analitička osjetljivost, Ha,
kao omjer nagiba kalibracijske funkcije i standardne devijacije skupa mjerenja, SDx,
pomoću kojih je ta krivulja nacrtana:
Ha = (dA/dc)/SDx
U literaturi postoji niz načina izražavanja osjetljivosti, poglavito kada se
izražava osjetljivost odreñene metode. Tako se u AAS-u još uvijek definira
osjetljivost na temelju neke arbitralno postavljene apsorbancije. Ako se ispituje niz
elemenata, svaki od njih treba biti prisutan u koncentraciji c1, c2, ..., da proizvede tu
apsorbanciju. Ta fiksirana apsorbancija iznosi 0,0044 i odgovara 1% apsorpcije:
log A = log b + log c
Te funkcije su linearne i paralelne s teorijskim nagibom +1 ali s različitim ordinatama.
Karakteristične koncentracije (cc) su apscise kod te arbitralne apsorbancije (pres 5):
b = 0,0044/cc
Karakteristična masa (mc), masa je analita u pg koja daje 1% apsorpcije odnosno
apsorbanciju od 0,0044 te smije odstupati ±20%.
Granične vrijednosti otkrivanja su najmanje koncentracije ili količine analita
čija se prisustnost još može otkriti s odreñenom sigurnošću potpunim analitičkim
postupkom. Granica detekcije (LOD) obično se izražava kao koncentracija ili količina
elementa koja stvara signal jednak srednjoj vrijednosti signala slijepe probe plus tri

25
standardne devijacije signala slijepe probe. Kako se srednja vrijednost signala slijepe
probe oduzima od svih mjerenja, LOD se često izražava na temelju 3 ili 3,3
standardne devijacije slijepe probe (SDB) (pres. 5):
LOD = 3,3SDB/b
gdje je b nagib kalibracijskog pravca. LOD vrijednosti služe za karakterizaciju
analitičkog sustava, radi usporedbe metoda ili radi karakterizacije jedne metode, te
kao kriterij odabiranja metode.
Sa stanovišta medicinskog biokemičara često je važna granica odreñivanja tj.
najniža koncentracija ili količina analita (LOQ) koja se može izmjeriti s traženom
preciznošću (RSD). Nove definicije prema ICH (ref. 16) i USP (ref. 29) kažu da je
LOQ:
LOQ = 10SDB/b
ali prema nekim starijim izvorima (ref. 13) vrijedi i:
LOQ = 0,3LOD/(RSDr – RSDH)1/2
gdje su RSDr i RSDH tražena preciznost i preciznost kod puno veće koncentracije od
LOD (npr. 100x) uz pretpostavku da je slijepi uzorak jednak nuli. Posljednji izraz
temelji se na pretpostavci da postoje dva izvora fluktuacija mjerenja, jedan
proporcionalan koncentraciji analita i drugi neovisan o toj koncentraciji. U većini
slučajeva se korisna mjerenja mogu načiniti kod koncentracije 10xLOD.
Kako se analitički signal mjeri u odnosu na signal pozadine koji može nastati
u atomskoj pari ili instrumentu, granica detekcije metode odreñena je veličinom i
stabilnošću signala pozadine i osjetljivošću analitičkog postupka. Noviji AAS
priručnici definiraju LOD kao koncentraciju elementa koja stvara odnos signal-šum
od 3 (ref. 2). Procjena LOD-a FAAS-om temelji se na mjerenjima dvaju standarda,
ranije pri LOD i dvostrukoj LOD a danas pri 5- i 10-strukoj koncentraciji od
očekivane LOD vrijednosti. S obzirom na to da LOD uključuje i amplitudu signala i
šum bazne linije a karakteristična koncentracija (vidi str. 7, 25) samo veličinu
apsorpcijskog signala, moguće su različite LOD vrijednosti za elemente koji pokazuju
istu karakterističnu koncentraciju.
Ako se osjetljivost analitičkog postupka mijenja s vremenom koristi se unutarnji
standard koji poboljšava preciznost i ispravnost mjerenja (vidi str. 27). To je element
koji se u poznatoj količini dodaje u uzorak da bi se pratile promjene analitičkih
značajki postupka. On nije prirodno prisutan u uzorku ali je kemijski sličan analitu te
ima spektralnu liniju blizu one analita. Kalibracijska krivulja je tada grafički prikaz
ovisnosti omjera intenziteta ili apsorbancija spektralnih linija analita i unutarnjeg
standarda o koncentraciji analita u uzorcima poznatog sastava.
Sustavi za poboljšanje osjetljivosti i preciznosti

Osjetljivost se može poboljšati ili pogodnom obradbom uzorka ili uvoñenjem

veće količine uzorka u instrument. U sustavima s raspršenjem, dodatkom organskog
otapala koje se miješa s vodom, u vodeni uzorak, poboljšava se osjetljivost do 3 puta.
Ona se nadalje povećava postupcima ukoncentriravanja. Nekada se metal može
taložiti ili ekstrahirati u pogodno organsko otapalo nakon kelatacije. Npr., s APDC
kompleksira bakar i drugi teški metali, te se ekstrakcijom dobivenog kelata u
organsko otapalo (npr. MIBK), postiže ukoncentriravanje i pročišćavanje elementa.

26
Sekvencijskom solvent ekstrakcijom može se odrediti 11 elemenata u samo 2 cm3
pune krvi. Metali se mogu ukoncentrirati i adsorpcijom na koloni kationskog
izmjenjivača. Nakon eluacije s HCl ili NaCl postižu se efekti ukoncentriravanja od 3-
5 puta.

Poluplameni i neplameni atomizacijski sustavi takoñer dovode do značajnog

poboljšanja osjetljivosti (vidi str. 28, 29).
Da bi se povećala preciznost primjenjuju su neke varijacije instrumentalnih
tehnika. Kada se uzorak raspršuje u instrument efekt pomaka («drifta») bazne linije
može se reducirati modificiranjem protoka uzorka. Ako dolazi do promjena u
osjetljivosti potrebne su ponovljene standardizacije. Efekti brzih fluktuacija signala
reduciraju se integriranjem površine ispod emisijskog ili apsorpcijskog signala.
Linearnost i standardi

Područje linearnosti ovisi o odabranoj rezonantnoj liniji, izvoru zračenja, brzini

grijanja peći, sloju na grafitnoj cijevi i širini pukotine koja može propustiti
neapsorbirane linije. Linearnost je u funkciji apsorpcijskih karakteristika (ne samo
mase!) analita; šire područje linearnosti obično se postiže s integriranom
apsorbancijom a ne s visinom signala.
Niže temperature atomizacije mogu proširiti područje linearnosti širenjem pika
(smanjenjem visine pika ali ne i integrirane apsorbancije) i povlačenjem "rollovera"
prema višim koncentracijama (str. 41).
Kod analiza GFAAS-om najčešće su prihvatljive vodene standardne otopine za
kalibraciju. Kod GFAAS koriste se često i unutarnji standardi koji poboljšavaju
ispravnost i preciznost odreñivanja. Npr., kod odreñivanja As i Se u urinu trebamo
«matrix-matched» standarde s dodanim unutarnjim standardom, Co2+ (ref. 8). Za
odreñivanje Pb i Cd u punoj krvi koristi se kao unutarni standard Ag+ (ref. 10) a kod
odreñivanja Pb u vinima bizmut koji produljuje životni vijek grafitne cijevi za 25% i
repetabilnost odreñivanja (ref. 14).
Interferencije i ispravnost

Interakcije izmeñu analita i matrice koje dovode do pojačanja ili slabljenja

analitičkog signala su interferencije. One nastaju kada se koncentracija analita
prividno mijenja u prisutnosti drugih supstancija u uzorku. Ako interferencija nastupa
u procesu atomizacije najbolje je promijeniti sustav za atomizaciju. Nastanak
interferencija ovisi o korištenom postupku, ponekad i o instrumentu. Zato je važno
testirati interferencije pod preporučenim radnim uvjetima. Spektralne ili kemijske
interferencije mogu se detektirati dodatkom pogodne koncentracije glavne anorganske
sastavnice uzorka u standardnu otopinu analita. Testira se kumulativni efekt ostalih
iona jer on može biti drukčiji od zbroja njihovih pojedinačnih efekata. Fizički efekti
zbog prisutnih organskih sastavnica uzorka mogu se ispitati poredbom rezultata
dobivenih na alikvotima uzoraka s i bez prethodnog spaljivanja.

Jedan od glavnih uzroka interferencija su interferencije izmeñu analita i matrice

uzorka. Nedisocirane molekule matrice mogu pokazivati AA-spektre širokih vrpci, a
male čvrste čestice mogu rasipati svjetlo preko širokog područja λ. Ovakve spektralne
interferencije su vrlo česte u GFAAS, npr. AA spektri NaCl i KCl često prisutnih u

27
okolišnim uzorcima i biološkim matricama se preklapaju. Zato su potrebne DBC ili
Zeeman-ova korekcija pozadine (slika 11). Kod trajnih problema smetnje matrice
može se modificirati priprava uzorka, npr. razaranjem organskog materijala kiselom
digestijom (reagensi mogu dovesti do kontaminacije, zato treba koristiti ultračiste
kiseline!) ili suhim spaljivanjem (može dovesti do gubitka lako isparljivih analita!)
čime se minimalizira apsorpcija pozadine zbog organske matrice. Ionska izmjena i
solvent ekstrakcija mogu služiti u izolaciji analita i redukciji signala pozadine.
Nespektralne interferencije utječu na formiranje atoma analita što može
povećati ili potisnuti AA signal. Npr. 1% S2- ili Cl- smanjuje signal olova jer dolazi do
njegovog isparavanja ali ne i atomizacije. Ovaj tip interferencija može se detektirati
kroz vrijednosti analitičkog povrata (izmjere) te je potrebno "skrojiti" program peći
prilagoñen uzorku.
Podešavanje sastava standardne otopine, onom uzorka, osigurava visoku
ispravnost rezultata. Kod analize tragova često treba izmjeriti sadržaj analita u
reagensima, naročito ako se koriste sastavljeni standardi u kojima je prisutna jedna ili
više komponenata u velikom suvišku s obzirom na analit. Npr. standard za
odreñivanje Cu2+ u serumu traži dodatak Na+ u suvišku od 3000 puta, da bi bio
sličnog ionskog sastava uzorku.

Slika 11. Apsorpcijski spektri dobiveni u otopinama klorida natrija i kalija (200 mg dm-3). (pres.
16)

Sustavi za atomizaciju
Plameni

Osim plamena (vidi tablicu 2, str. 13) za atomizaciju mogu služiti električna
struja koja prolazi kroz nosač uzorka ili laser.
Poluplameni sustavi

Osim što se uzorak uvodi u plamen kao aerosol on se može i sušiti na

pogodnom držaču i tada unijeti u plamen. Tzv. „poluplameni“ ili «microsampling
system» atomizacijski sustavi uvedeni su u analitičku praksu 70-80-ih godina prošlog
stoljeća te čine premosnicu prema elektrotoplinskim atomizerima i čine sustave koji

28
osiguravaju veću osjetljivost analize ali nižu preciznost od konvencionalnih sustava s
plamenom. To su «sampling boat» i «Delves cup» („Delves cup microsampling flame
atomic absorption spectrometry“, DC-MSFAAS) tehnike, prva predviñena za rad s
vodenim otopinama, a druga s biološkim materijalom. U principu su obje metode iste;
uzorak se stavi u posudicu pa prinese bliže plamenu da tekućina ispari (ev. oksidira s
H2O2 i ponovno osuši) te brzo unese u najtopliju zonu plamena. Dobiva se pik koji će
zbog kratkog vremena isparavanja biti relativno visok i izvan područja šuma. Da bi se
cijela posudica jednoliko zagrijala treba raditi sa širokim plamenom tj. s glavom koja
ima tri pukotine. Nastaju i apsorpcijski signali od dima i molekulskih para te je
potrebna korekcija pozadine. Preciznost je lošija od one s plamenom, RSD je ca 6%,
no ponovljenim analizama se preciznost može popraviti. Preciznost se gubi zbog
distribucije uzorka na dnu lončića i uništavanja površine lončića. Lončići su
izrañivani od nikla, kvarca za kisele uzorke, plemenitih metala, grafita te se u njih
aplicira mali volumen uzorka, npr. od 10 mm3. «Delves cup» mali lončić od Ni,
plemenitog metala ili silicija kapaciteta ca 0,2 cm3 zajedno se s uzorkom unosio u
plamen ispod šupljine u centru grijane kvarcne apsorpcijske cijevi. Time se
produljivalo vrijeme boravka atomske pare u apsorpcijskom putu 5-10x u odnosu na
ono u konvencionalnom plamenu, a sukladno tome snizivala i granica dokazivanja
nekoliko desetaka puta. Ograničenja su bila ta da je zbog niske temperature
isparavanja moglo doći do neočekivanih interferencija te činjenica da se ova tehnika
koristi samo za lako isparljive elemente (Ag, As, Bi, Cd, Hg, Pb, Se, Te, Th, Zn), npr.
za odreñivanje Pb u punoj krvi i urinu «Delves cup»-om. Korišten je takoñer i
«sampling boat» od tantala zapremnine ca 1 cm3.

Elektrotoplinski atomizeri

Grafitna peć (kiveta )(GFAAS) (vidi i str. 13)

Temperaturna distribucija u transverzalno grijanoj peći. – THGA («transverse

heated graphite atomizer») peć se grije postrano te pokazuje jednoličnu temperaturnu
distribuciju kroz cijelu dužinu cijevi (slika 12). Pod tim uvjetima je optimirano
nastajanje slobodnih atoma, a rekombinacija atoma u molekule, gubitak atoma i
kondenzacija na hladnijim krajevima cijevi, što može izazvati efekte memorije, su
izbjegnuti.
Moguće je definirati početnu i konačnu temperaturu kao i brzinu podizanja
temperature u svakom koraku. Temperatura se podiže do tražene temperature
atomizacije što je brže moguće (obično do 2000 oC s-1). Ovom tehnikom dobiva se
dobra osjetljivost i za refraktorne elemente jer se postiže termička ravnoteža prije
atomizacije. Niže temperature atomizacije mogu biti dobre za mnoge elemente što
produljuje i vijek trajanja cijevi. Cijevi i integrirane platforme se rade iz jednog
komada spektralno čistog elektrografita visoke gustoće prije nego ih se presvlači
tankim slojem pirolitičkog grafita. Posljednji daje glatkiju i gušću površinu koja
onemogućuje penetraciju matrice uzorka te reducira difuziju plinovite faze tokom
atomizacije. Da bi se reakcija analita s grafitnom površinom svela na minimum
visokokvalitetne elektrografitne cijevi presvučene su pirolitičkim grafitom. S cijevima
presvučenim pirolitičkim grafitom, postižu se viša osjetljivost i smanjeni efekti
memorije te dulji vijek trajanja i veća otpornost.

29
 Slika 12. a) Distribucija temperature u transverzalno grijanoj peći. b) Grafitna peć s prikazom
zrake svjetla, grijanja peći i magnetskog polja (H). (pres 17)

Jedna grafitna cijev može podnijeti 50 do nekoliko stotina odreñivanja ovisno o

vremenu atomizacije, temperaturi, protoku plina i tipu uzorka. Kako cijev stari
analitički signal mijenja oblik; kada integrirana A padne za 20-25% od izvorne
vrijednosti cijev treba zamijeniti. Primjenom «end-capped» THGA (EC-THGA) vijek
života cijevi produljen je na 500 ciklusa grijanja (npr., ref. 7). Kod odreñivanja Mn i
Se u serumu, modifikator [Mg(NO3)2+Pd(NO3)2] i oksidativna smjesa (H2O2+HNO3)
dodani u uzorak omogućuju 250 grijanja cijevi bez promjene signala (ref. 6). Sa
starenjem cijevi opada i preciznost mjerenja. Da bi se vrijeme života cijevi
maksimalno produžilo treba koristiti što niže temprature atomizacije i što kraća
vremena atomizacije; temperature atomizacije iznad 2550 oC i atomizacija duža od 7 s
rijetko su opravdani. Pirolitički obloženu cijev ne treba hvatati golim prstima jer to
uništava površinu i skraćuje vijek trajanja.
Novu grafitnu cijev treba čistiti grijanjem. Tako se uklanjaju nečistoće s
površine i iz materijala cijevi. Treba koristiti protok plina od 250 cm3 min-1 u svim
koracima te očitavanje u koraku 9 (vidi tablicu 4). Cijev je kondicionirana onda kada
slijepa vrijednost za program peći postane konstantna.

Tablica 4. Program peći za kondicioniranje grafitne cijevi (pres. 18)

Korak Temperatura Vrijeme Vrijeme

(oC) podizanja (s) održavanja (s)
1 2000 60 2
2 20 1 20
3 2200 10 10
4 20 1 20
5 2300 10 10
6 20 1 20
7 2400 10 10
8 20 1 20
9 2500 1 5

30
 L'vov je preporučio atomizaciju uzorka s male pločice od čvrstog pirolitičkog
grafita umetnute u grafitnu cijev Ova platforma odgaña atomizaciju sve dok se ne
postigne ravnoteža izmeñu grafitne cijevi i inertnog plina. U tom periodu grafitna
cijev i inertni plin se griju direktno vodljivošću. L'vovljeva platforma se primarno
grije indirektno zračenjem zidova cijevi. Ovo dovodi do vremenskog pomaka što
omogućuje sustavu da postigne termičku ravnotežu prije nego što doñe do atomizacije
analita. Time se smanjuju interferencije koje nastaju zbog otparavanja analita u
hladniju okolinu. Takoñer se produžuje vijek trajanja cijevi te smanjuje širenje kapi
uzorka.
THGA ima uklopljenu L'vovljevu platformu koja je dobra u analizi refraktornih
elelemenata, npr., V, Ti, Mo. Brzo zagrijavanje lagane L'vovljeve platforme dovodi
do maksimalne efikasnosti atomizacije i nižih temperatura atomizacije (slika 13).

Slika 13. Isječak THGA cijevi s integriranom L'vovljevom platformom. (pres. 19)

Uz THGA koristi se «autosampler» koji je koristan jer na preciznost mjerenja

ne utječe samo odmjereni mikrolitarski volumen nego i pozicija kapljice na grafitnoj
cijevi. Hlañenje vodom koristi se da bi se THGA brzo ohladila izmeñu dva mjerenja.
Interni protok plina služi da ukloni isparljive nuzprodukte. Obično se preporučuje Ar
kao vanjski zaštitni plin i kao unutarnji plin za ispiranje jer on ne reagira s grafitom ili
atomima analita, no može se koristiti i O2 ili zrak.
Koncept koji osigurava maksimalni signal analita, a minimalni signal
interferenta za uklanjanje fizičkih i kemijskih interferencija kod GFAAS je tzv «STPF
– stabilized temperature platform furnace». Ovo se postiže:
- brzom elektronikom instrumenta
- integracijom signala
- ispravnom korekcijom pozadine (preferira se Zeemanova korekcija)
- brzim grijanjem peći (2000 oC s-1)
- L'vovljevom platformom i pirolitički presvučenom grafitnom cijevi
- zaustavljanjem plina tokom atomizacije
- primjenom modifikatora matrice.

Optimiranje programa peći. - Uobičajeni program peći uključuje (tablica 5):

- sušenje – isparavanje otapala
- pirolizu – služi uklanjanju što više komponenata matrice. Modifikator matrice
može stabilizirati analit ili potpomoći uklanjanju komponenata matrice

31
 - atomizaciju – uzorak se atomizira dajući atome u temeljnom energetskom
stanju na put zrake svjetla
- čišćenje – priprema peći za slijedeće uzorke.
Svaki korak valja optimirati za odreñeni element i matricu.

Sušenje, piroliza, atomizacija i čišćenje. - Uz svaki element su dati preporučeni

uvjeti: λ, širina pukotine, cijev/platforma, modifikator matrice, temperatura
predobradbe, temperatura atomizacije, «rollover», karakteristična masa, provjera
osjetljivosti, ev. sredstvo za razrijeñivanje, preporučeno vrijeme atomizacije, tip
lampe, kemijski modifkator, etc.

Tablica 5. Program peći za ispitivanje instrumenta* (pres. 20)

Korak Temperatura Vrijeme Vrijeme Protok

(oC) podizanja održavanja plina
temperature (s) temperature (s) (cm3 min-1)
Sušenje 1 110 1 20 250
Sušenje 2 130 5 30 250
Piroliza Iz tablica 10 20 250
Atomizacija Iz tablica 0 5 0
Čišćenje 2400 1 2 250
*
Tipični volumen uzorka je 20 mm3 (µl).

U postupku sušenja treba otpariti otapalo iz uzorka bez špricanja uzorka jer
posljednje može dovesti do nepravilnih ili dvostrukih pikova i narušiti preciznost.
Ako se čuju zvukovi špricanja ili pucketanja peć je prevruća ili je vrijeme izmeñu dva
uzorka prekratko. Voda za hlañenje peći treba biti pri 20-40 oC, a vrijeme izmeñu
uzoraka barem 20 s. Temperatura sušenja je obično 20-40 oC iznad točke ključanja
otapala, a vrijeme podizanja 1-5 s. Uzorak veći od 20 mm3 treba dulje vrijeme
sušenja. Kako volumen utječe na širenje kapljice uzorka na platformi, što utječe na
atomizaciju, preporuča se koristiti stalno isti volumen.

Svrha termičke pirolize je da se ukloni što više matrice uzorka prije atomizacije
analita. Ovo smanjuje kemijske interferencije i veličinu signala pozadine.
Temperatura pirolize se može optimirati grafički: A vs. temp. pirolize (oko
preporučene vrijednosti koristeći skokove od 100 ili 200 oC (slika 14). Optimalna
temperatura pirolize je najviša temperatura koja ne dovodi do pada signala. Obično se
koristi temperatura koja je 100 oC niža od maksimalno dozvoljene. U fazi pirolize
obično se koristi vrijeme podizanja temperature od 5-10 s. Primjena kemijskih
modifikatora i oksidansa omogućuje pirolizu kod niže temperature što ublažava
nastajanje ugljikovih ostataka na integriranoj platformi i produljuje vijek iskoristivosti
grafitne cijevi.

Temperatura atomizacije treba biti dovoljno visoka da osigura potpunu

atomizaciju analita pa ovisi o svojstvima spoja u kojemu se analit nalazi. Modifikator
matrice ponekad prevodi element u predvidljivi oblik čineći atomizaciju analita
reproducibilnijom u nizu matrica. Ovo može biti posebno korisno kada se matrica
uzorka i standarda razlikuju. Zbog podjednake distribucije temperature te efikasnije
atomizacije temperatura atomizacije u THGA sustavima obično ne treba biti viša od
2500 oC; u HGA sustavu su one više.

32
 Integrirana A (A-s)

800 1000 1200 1400 1600

Temperatura pirolize (oC)

Slika 14. Optimizacija temperature pirolize. (pres. 21)

Kod odabira temperature atomizacije iz grafa se očitava minimalna temperatura

koja osigurava najvišu apsorbanciju (slika 15). Ispravnost izbora temperature
atomizacije pokazuje i oblik pika; povišenjem temperature nastaje uži pravilniji pik
jer analit brže isparava (slika 16). Zbog produljivanja vijeka trajanja grafitne cijevi
preferira se najniža temperatura koja osigurava potpunu atomizaciju. Vrijeme
podizanja je 0 s jer se koristi maksimalna brzina zagrijavanja. Osim toga, da bi se
slobodni atomi zadržali na putu zrake što duže gasi se protok argona u fazi
atomizacije. Ovo osigurava i bolje termičko uravnoteženje. Vrijeme integracije od 3-5
s obično je dovoljno dugo, kod refraktornih elemenata (npr., Ba, Mo, Ti, V) i do 7 s.

Različita linearna područja za berilij u funkciji odabranih uvjeta atomizacije

prikazana su na slici 17.
Integrirana A (A-s)

2100 2200 2300 2400 2500

Temperatura atomizacije (oC)

Slika 15. Optimizacija temperature atomizacije. (pres 22)

Veliki signal pozadine može se smanjiti primjenom niže temperature

atomizacije ili razrijeñivanjem uzorka.
Kod THGA pri visokoj temperaturi nisu potrebna duga čišćenja. Čišćenje pri
2400-2500 oC kroz 3 s je obično dovoljno dok čišćenje pri >2550 oC dulje od 5 s

33
može skratiti vijek trajanja cijevi. Preferira se niža temperatura ako ona potpuno očisti
zaostalu matricu. Nakon čišćenja pisač se treba vratiti na baznu liniju. Kao «blank»
služi obično 0,2% HNO3.

signal atomske apsorpcije

Apsorbancija

signal pozadine

Vrijeme (s)

Slika 16. Idealni oblik pika pri optimalnoj temperaturi atomizacije. (pres 23)

1.2
Integrirana apsorbancija (A-s) ili

2300 oC
(apsorbancija pika)
1.0
apsorbancija pika (A)

0.8
2300 oC
(integrirana apsorbancija)
0.6

0.4 2650 oC
(integrirana apsorbancija)

0.2

10 20 30

µg
Be (µ dm-3)

Slika 17. Različita linearna područja za berilij u funkciji odabranih uvjeta atomizacije. (pres. 24)

Modifikator matrice. - Modifikator matrice poboljšava analizu većine

elemenata. To je sol koja se u visokoj koncentraciji dodaje uzorku prevodeći analit u
bolje definirani spoj te čineći termičku pirolizu reproducibilnijom i bolje
predvidljivom za mnoge matrice. Glavna uloga modifikatora matrice je da reagira s
analitom da bi ga stabilizirao, ili da učini matricu isparljivijom da bi se mogla
primijeniti viša temperatura pirolize (spaljivanja) koja ju čini efikasnijom. Najčešći
modifikator je Pd s Mg(NO3)2, takoñer NH4H2PO4, Mg(NO3)2, soli lantana i nikal.
Miješani Pd-Mg modifikator je efikasan pri stabiliziranju niza elemenata.

34
Ostali sustavi za atomizaciju

Može se koristiti pulzirajuće zračenje; laser se usmjeri na uzorak koji se

atomizira te se mjeri apsorpcija u stvorenoj atomskoj pari. Takve pare mogu se
ekscitirati na atomsku emisiju izbijanjem iskre. Ovako se mogu analizirati mali
volumeni uzoraka ali je preciznost slaba i teška je kalibracija zbog jakih efekata
matrice.
Redukcijom sa SnCl2 ili NaBH4 u zatvorenom sustavu moguće je stvoriti hladne
pare elementarne žive iz vodenih uzoraka; to je hladna atomizacija. Isparljiva
elementarna Hg se izbacuje prolaskom plina (zrak ili Ar) kroz otopinu te uvodi u
apsorpcijsku komoru gdje se mjeri signal apsorcije ili fluorescencije. Granica
detekcije iznosi oko 1 ng odnosno 0,02 µg dm-3 (ppb), a RSD ca 5%. Sb, As, Bi, Ge,
Pb, Se, Te i Sn stvaraju isparljive hidride koji se lako raspadaju grijanjem i daju
slobodne atome. Moguće je koristiti različite reducense, a najbolji je Na-borhidrid
koji se može primijeniti za sve navedene elemente. Ovi hidridi raspadaju se u
plamenu (LOD 1 µg dm-3, RSD 5-10%). Za odreñivanje Hg i As koji čine isparljive
hidride uspješno se kombinira tehnika hladne pare s atomskom apsorcijom ili
fluorescencijom dajući još bolju osjetljivost od one FAAS pa i elektrotoplinskih
atomizera. Meñutim, priprava uzorka je zahtjevnija upravo zato da bi bili sigurni da je
on u pogodnom obliku za redukciju u metal ili prelazak u hidrid. Standardne i slijepe
otopine moraju se provesti kroz cijeli preparativni postupak da se dobiju dobre
kalibracijske krivulje. Može se koristiti i metoda standardne adicije.

Izvori svjetla
Za korekciju apsorpcije pozadine koriste se kontinuirani izvori svjetla.
Kod AAS koriste se izvori atomske linije. Ovakav izvor emitira rezonantno
zračenje elementa sa širinom linije manjom od one apsorpcijske linije. Apsorpcijska
mjerenja su pojednostavljena onda kada je emisijska linija intenzivna, stabilna i kada
nema značajne apsorpcije pozadine ili interferirajućih linija koje mogu proći kroz
monokromator te dovesti do smanjene osjetljivosti i nelinearnih kalibracijskih
grafova. Neželjeni efekti svjetla iz plamena mogu se svesti na najmanju mjeru
upotrebom ili vrlo intenzivnog izvora svjetla ili moduliranjem tog izvora prije prolaza
svjetla kroz plamen. Kako analit apsorbira vrlo usku spektralnu liniju čija širina ne
prelazi 3 pm niti izvor svjetla ne smije emitirati širu spektralnu liniju.
Lampa s električnim pražnjenjem (EDL)

Izbijajuće lampe bez elektroda izgrañene su od kvarcne cijevi punjene inertnim

plinom koja sadrži odreñivani metal ili neki njegov hlapljivi spoj. One emitiraju
spektar analita na taj način da se struja provodi kroz prostor u kojem se nalaze pare
analita. Atomska emisija je pobuñena zbog apsorpcije energije mikrovalnog polja
stvorenog u rezonantnoj šupljini. Ove lampe stvaraju intenzivno zračenje hlapljivih
elemenata, npr. As, Cd, Hg, Se, Zn te su naročito dobre za alkalije. Obično se koriste
kod atomske fluorescencije.

35
Šuplja katodna lampa

Šuplje katodne lampe služe kao najčešći izvor svjetla (slika 18). Ovakva lampa
sastoji se od cilindrične katode koja sadrži analit u obliku ili čistog metala, legure ili
prevlake na pogodnom temeljnom metalu (promjer i visina ca 1 cm). Anoda je žica od
volframa, a prozor je od borosilikatnog stakla ili kvarca ako je analitička linija u UV
području. Punjena je neonom, argonom ili helijem pod tlakom od nekoliko mm Hg.
Na lampu se primjenjuje električni potencijal od 100 do 500 V. Tada katoda stvara
elektrone koji se ubrzavaju u električnom polju i dovode do ionizacije plemenitog
plina a ovi ioni bombardiraju katodu i izbacuju atome s njezine površine. Kolizije
izmeñu tih atoma i iona punećeg plina/brzih elektrona vode do ekscitacije atoma i
emisije karakterističnog linijskog spektra. Izbor plina za punjenje ovisi o elementu; za
Pb, Fe i Ni najbolji je neon, dok Li i As bolje emitiraju s argonom jer sam neon ima
jaku emisijsku liniju u blizini spektralnih linija ovih dvaju elemenata. Za mnoge je
elemente svejedno koji će se od ova dva plina koristiti. Optimalna struja lampe ovisi o
elementu i konstrukciji lampe te se kreće izmeñu 5 i 100 mA kod 100-300 V.
Maksimalna propisana struja ne smije se prekoračiti jer se može uništiti katoda dok se
ispod te vrijednosti ona smije varirati. Povećanjem struje raste intenzitet emisije i
poboljšava se odnos signal-šum.
Za mnoge elemente povećanje struje preko izvjesne granice smanjuje emisiju
jer dolazi do samo-apsorpcije tj. atomi koji su izbijeni iz katode ne emitiraju već
samo-apsorbiraju dio emitiranog svjetla. Samo-apsorpcija može dovesti do gubitka
osjetljivosti i zakrivljenja kalibracijskih grafova što se svodi na minimum radom kod
najniže moguće struje (najčešće 5-10 mA). Izvor napona mora biti stabiliziran jer je
svjetlosni signal vrlo osjetljiv na promjene struje. Prvi znaci kvarenja lampe su
smanjenje osjetljivosti i pojačani šum.
Osim monoelementnih konstruirane su i multielementne lampe koje omogućuju
izvoñenje nekoliko analiza s jednom lampom te nije potrebno «zagrijavanje» kod
prijelaza na drugi element. Lampe s električnim pražnjenjem bez elektroda
kombiniraju do 9 elemenata, a šuplje katodne lampe do 4 elementa. Njihova emisija
nije tako intenzivna kao kod monoelementnih lampi. Daljnja ograničenja su ta što su
moguće samo neke kombinacije elemenata, što je tlak punjenja plina kompromis
izmeñu optimuma za pojedine elemente i što su skuplje od monoelementnih lampi.

štitnik

katoda anoda
prozor

He, Ne ili Ar

Slika 18. Lampa sa šupljom katodom. (pres. 25)

36
Laseri

Laser je uska koherentna linija (svi emitirani fotoni su u istoj fazi) tj. izvor
visokog intenziteta. Usklañeni laseri služe za AAS i fluorescentnu analizu. Ako se
koristi pulzirajući laser visokog intenziteta postiže se gotovo zasićenje energijom u
atomskoj pari tj. većina prisutnih atoma su ekscitirani. Pod tim uvjetima signal
fluorescencije nije jako pod utjecajem stabilnosti izvora te se dobivaju linearnije
kalibracijske krivulje. Za Na+ npr. LOD iznosi 0,2 ng dm-3.

Monokromatori
Uloga monokromatora je da selektira odreñenu λ te da traženu liniju izolira uz
maksimalni odnos signal:šum, odnosno da primi toliko svjetla iz izvora koliko je
moguće. Šum predstavlja nestabilnost analitičkog signala i najčešće proizlazi iz izvora
zračenja zbog kompleksnih interakcija tijekom ekscitacijskog procesa. On utječe na
intenzitet spektralne linije i njenu pozadinu, naročito u slučaju slabih signala gdje
dominira slučajnost emisije fotona.
Kod monokromatora prvenstveno treba voditi računa o rezoluciji i energiji.
Rezolucija se definira kao sposobnost monokromatora da razlikuje dvije spektralne
linije koje su meñusobno razmaknute. Energija je količina svjetla koja može proći
kroz monokromator; što je ona veća monokromator je bolji. Specifičnost AA
spektrofotometra ne ovisi o monokromatoru budući da je njegova rezolucija slabija od
širine linije lampe sa šupljom katodom (ca 2 pm) i apsorpcijske linije elementa u
plamenu (ca 4 pm) (vidi i str. 24).
Temeljna funkcija monokromatora je da odijeli rezonantnu liniju analita od
ostalih linija koje lampa emitira, a koje odreñivani element ne apsorbira. Kao
dovoljna pokazala se rezolucija od 0,2 nm (200 pm). Slaba rezolucija smanjuje
osjetljivost i daje zakrivljeni kalibracijski graf. Zahtijeva se takoñer da se omogući rad
i sa širom pukotinom tj. propusni opseg monokromatora treba biti promjenjljiv, npr.
kada se radi analiza elemenata čiji spektri nisu komplicirani (alkalije, As, Ca, Pb, Zn,
itd.). Uz širi propusni opseg kroz monokromator prolazi više svjetla pa se može
postići bolja preciznost i granica dokazivanja. Osim toga, ne treba raditi s užim
propusnim opsegom od potrebnog, jer uži propusni opseg znači manje energije i više
šuma. Promjena rezolucije monokromatora postiže se promjenom širine ulazne i
izlazne pukotine. Količina energije koja će proći kroz monokromator takoñer ovisi o
veličini prizme ili optičke rešetke u monokromatoru. Što je ta površina veća veći je i
raspoloživi udio svjetlosne energije.
Selekcija λ može se provesti ili sustavom za disperziju ili filterom (manje je
selektivan, obično se koristi u FAES). Kao filtri koriste se obojeni materijali (staklo,
želatina ili otopina, film) ili interferencijski filtri. Posljednji propuštaju kod bilo koje
željene λ podešavanjem debljine transparentnih dielektričnih slojeva. Kod
interferencijskih filtara prolazna je vrpca puno uža nego kod obojenih materijala.
Sustavi za disperziju su prizme i optičke rešetke. Kada paralelno svjetlo pada na
prizmu ili difrakcijsku rešetku ono dispergira čineći spektar. Disperzija mrežice je
obično veća nego prizme i praktički neovisna o λ dok kod prizme ona snažno raste od
Vis do UV (slika 19).

37
Sustavi korekcije pozadine
Sustav korekcije pozadine mjeri apsorpcijski signal pozadine i odbija ga od
ukupnog signala absorbancije dajući korigirani signal. To su Zeemanova korekcija i
kontinuirani izvor korekcije pozadine. Korekcija pozadine potrebna je za sve tipove
uzoraka uz grafitnu kivetu; to nije slučaj u plamenu.
Korekcija pozadine Zeemanovim efektom

Korekcija pozadine Zeemanovim efektom uklanja spektralne interferencije i

molekulsku apsorpciju u GFAAS. Atomske linije, emisijske ili apsorpcijske, cijepaju
se u 3 ili više polariziranih komponenti pod utjecajem magnetskog polja (slika 20).
Ove dodatne linije nastaju zbog cijepanja energetskih nivoa elektrona u atomu. U
najjednostavnijem slučaju ovo cijepanje daje 3 spektralne linije, Π komponentu pri
izvornoj λ analita i komponente σ+ i σ- koje su simetrično pomaknute sa svake strane
izvorne linije. Veličina ovog cijepanja ovisi o jačini magnetskog polja; ovaj se
fenomen zove Zeemanov efekt. S obzirom da se on pojavljuje samo kod atomskih
specija on može poslužiti odjeljivanju atomske od ne-atomske (pozadinske)
apsorpcije. Uobičajeno se koristi magnetsko polje od 0,9 T koje dovodi do tipičnih
pomaka linija od oko 0,01 nm.

a) konveksne leće

700
ulazna
pukotina λ (nm)
prizma
200 spektar
konkavna
b) zrcala

700

λ (nm)

200
optička
mrežica
ulazna
pukotina

Slika 19. Sustavi za selekciju λ: a) s prizmom, b) s optičkom mrežicom. (pres. 26)

Korekcija pozadine Zeemanovim efektom može se primijeniti u transverzalnom

(magnetsko polje i mjerna zraka su pod kutem od 90 o) ili longitudinalnom sklopu
(magnetsko polje i mjerna zraka su paralelni). U transverzalnom sklopu vidi se i
nepomaknuta linija i dvije pomaknute linije (slika 21), a u longitudinalnom vide se
samo pomaknute linije (slike 22-24).
Magnetsko polje alterira se pri frekvenciji od 50 ili 60 Hz. S isključenim poljem
vidi se samo jedan signal analita pri analitičkoj λ koji je superponiran na neki signal
pozadine (ukupni signal analit + pozadina). Kada je magnetsko polje uključeno signal

38
analita se pocijepa u dvije σ komponente; signal koji se mjeri pri analitičkoj λ potječe
samo od pozadine. Razlika mjerenja s isključenim i uključenim magnetom dovodi do
apsorpcijskog signala samog analita točno pri λ mjerenja analita.

Magnetsko polje

ν1 Π ν2

Pomaknuta Π komponenta Pomaknuta

komponenta σ+ pri izvornoj λ komponenta σ-

Slika 20. Jednostavan Zeemanov efekt cijepanja spektralne linije. (pres. 27)

Π
σ- σ+

σ komponente σ komponente
pomaknute linije, horizontalno
kružno polarizirane polarizirane
ν1 ν0 ν2

Π komponenta
nepomaknuta linija,
linearno polarizirana

Magnetsko polje
Mjerena zraka

Slika 21. Zeemanov efekt promatran u transverzalnoj konfiguraciji. (pres 28)

39
 σ komponente
Mjerena zraka
pomaknute linije,
kružno polarizirane

Π komponenta
nepomaknuta linija,
linearno polarizirana

Magnetsko polje

Slika 22. Zeemanov efekt promatran u longitudinalnoj konfiguraciji. (pres 29)

Isključeno magnetsko polje Uključeno magnetsko polje

N S Atomizirani N S
uzorak

Mjerena zraka

H
Magnetsko polje paralelno
s mjerenom zrakom

σ- σ+

Apsorpcijski
profil signala

ν0 – analitička λ
ν0 ν1 ν0 ν2

Slika 23. Signali analita dobiveni longitudinalnim Zeemanovim efektom. (pres. 30)

Magnetsko polje isključeno Magnetsko polje uključeno

apsorpcija

apsorpcija

Apsorpcijski
profil
Komponenta σ- Komponenta σ+

Emisijska linija
izvora

ν0 ν0
ν0 – analitička λ

Slika 24. Korekcija pozadine s longitudinalnim Zeemanovim efektom. (pres. 31)

40
 «Rollover». - "Rollover" je fenomen koji se javlja kod Zeemanove korekcije
pozadine pri visokim apsorbancijama, obično većim od 0,4. Kako raste koncentracija
analita ukupni signal (magnetsko polje isključeno) zasićuje se i postiže plato. Uz
uključeni magnet σ komponente apsorbiraju samo mali dio svjetla pa zasićenje ovog
signala nastupa pri puno višim koncentracijama. Rezultirajuća krivulja korigirana za
Zeemanov efekt (manget isključen – magnet uključen) prolazi kroz maksimum kod
visokih apsorbancija i taj se fenomen zove «rollover» analitičke krivulje i dogaña se
kod mjerenja apsorbancije u piku. Iako se ovaj efekt poglavito javlja kod
kompliciranih, anomaličnih, sustava, može se pojaviti i kod normalnih Zeemanovih
sustava ako su koncentracije analita ekstremno visoke. Tada signal prvo raste s
porastom koncentracije analita pa opada uz pojavu dubleta. Apsorbancija pri kojoj se
"rollover" pojavljuje ovisi o elementu. Snižavanjem temperature atomizacije širi se
pik i snizuje apsorbancija bez značajnog utjecaja na integriranu apsorbanciju, pa se
povećava masa kod koje dolazi do "rollover"-a.

Kontinuirani izvor korekcije pozadine

U ovom sustavu svjetlo iz primarnog izvora i iz kontinuiranog izvora

naizmjenično prolaze kroz plamen ili peć. Rotirajući sektor naizmjenično kroz plamen
propušta rezonantnu liniju analita i kontinuirani spektar deuterijskog izvora (vidi sliku
8, str. 15). Analit apsorbira samo svjetlo iz primarnog izvora, dok pozadina apsorbira
obje zrake podjednako. Kada se elektronički mjeri odnos obiju zraka eliminira se
efekt apsorpcije pozadine pa odnos ovih intenziteta predstavlja veličinu koja će biti u
proporciji s koncentracijom analita, a utjecaj raspršenja svjetla je kompenziran. Da bi
se provela ispravna kompenzacija nespecifične apsorpcije pozadine potrebno je
izjednačiti intenzitete obiju zraka. Lampa s deuterijskim lukom koristi se za duboki
UV, a za bliski UV i Vis se koristi volfram-jodidna lampa.

Slika 25 ilustrira korekciju pozadine za selen u punoj krvi, kontinuiranim

izvorom i Zeemanovim sustavom. Prvi sustav korigira signal analita srednjom
apsorpcijom pozadine. Na taj način može doći do prekompenzacije signala analita jer
se za korekciju ne koristi apsorpcija pozadine pri odgovarajućoj liniji analita.

«Simultaneous atomic-absorption spectrometry» (SIMAAS)

SIMAAS instrumenti prevladali su glavnu manjkavost GFAAS (ETAAS) jer
omogućuju odreñivanje do 6 analita istovremeno, nakon samo jednog ciklusa grijanja,
skraćujući vrijeme analize i snizujući cijenu analize. Kao i svaka multielementna
tehnika i SIMAAS traži kompromise što se tiče radnih uvjeta, npr. temperature
pirolize i atomizacije i kemijskog modifikatora što može dovesti do značajnog pada
osjetljivosti odreñivanja. Ovo se može prevladati primjenom transverzalno grijane
grafitne peći s integriranom platformom i Zeemanovom korekcijom pozadine pod
STPF uvjetima. Dok SIMAAS omogućuje odreñivanje do 6 elemenata, ICP-AES i
ICP-MS (vidi str. 4 i 5) mogu istovremeno ili sekvencijski odrediti desetke elemenata.
Osjetljivost koju nudi ICP-AES slabija je od one GFAAS, dok skupa ICP-MS nudi
najbolju osjetljivost za većinu elemenata ali pokazuje izobarične interferencije koje
mogu narušiti odreñivanja nekih elemenata.

41
 0.35

Aposrbancija
Deuterij

analit
pozadina
0.35
Aposrbancija

Zeeman

0
1 2 3
Vrijeme (s)

Slika 25. Korekcija pozadine: kontinuirana vs. Zeeman za Se pri 196,0 nm (puna krv). (pres. 32)

SIMAAS spektrometri korišteni su u analizama kliničkih i drugih kompleksnih

materijala, npr., pune krvi: Cd i Pb (ref. 10, 13), seruma: Cu, Fe i Zn (ref. 18), Al, Co,
Cr, Mn, Mo, Ni i V (ref. 19), Mn i Se (ref. 5), urina: Co i Mn (ref. 17), Cr i Mn (ref.
23), As i Se (ref. 8), Pb i Cd (ref. 6), dijalizata i suspenzija stanica: Cu, Mn, Ni i Se
(ref. 28), otpadnih i nepitkih voda: Cd i Pb (ref. 9), As, Cd, Pb i Se (ref. 21), vina: Pb
(ref. 14).

Kao kemijski modifikatori koriste se Mg(NO3)2 ili vrlo često smjesa Pd(NO3)2 i
Mg(NO3)2. Npr. kod odreñivanja Pb u vinima ovi modifikatori stabiliziraju i analit i
Bi kao unutarnji standard (ref. 14). Oni sprečavaju isparavanje Cu, Mn, Ni i Se pri
temperaturi pirolize od 1200 oC koja je potrebna da se onemogući smetnja NaCl-a
(ref. 28). Kod odreñivanja Mn i Se u serumu ovaj modifikator zajedno s oksidativnom
smjesom (H2O2+HNO3) omogućuje 250 grijanja grafitne cijevi bez promjene signala;
simultani program grijanja osigurava pirolizu pri 1400 i atomizaciju pri 2300 oC (ref.
5). Smjesa W+Rh termički deponiranog na platformu grafitne cijevi poslužila je kao
trajni kemijski modifikator za simultanu atomizaciju As, Cd, Pb i Se GFAAS-om (ref.
21). Dobar kemijski modifikator je i NH4H2PO4, npr. kod odreñivanja Cd i Pb u punoj
krvi i urinu kada su temperature pirolize i atomizacije bile 550 i 1700 oC (ref. 10)
odnosno 500 i 1800 oC (ref. 6).

Analiza biološkog materijala (kliničkog i ekološkog)

Kako je sve prepoznatljivija uloga metalnih iona u ljudskom metabolizmu to je i
povećana potreba za AAS/AES analizama. Od kliničkih uzoraka najčešće se analizira
krv, te su najčešći analiti Li, Na, K, Ca, Mg, tragovi Cu, Fe, Zn, Pb, Hg, Cl-, Au, Mn,
PO43-, Rb, Tl. AAS se primjenjuje poglavito u analizi onih metala koje je teško
analizirati AES-om, npr. Ca, Na, K i Mg u krvi, Ca i Mg u urinu, Ca u slini, Ca i Mg u
mlijeku, Ca i Mg u tkivima, Mg u fecesu, Ca, Mg, K i Na u kostima, Zn u urinu i
tkivima. Često se postiže visoka osjetljivost i ispravnost, priprema uzoraka često je
jednostavna, a uz primjenu elektrotoplinskih atomizacijskih sustava potrebna je mala

42
količina uzorka. Kod odreñivanja teških metala preporučuje se paralelno učiniti
analizu u krvi i u urinu.

Suvremeni instrumenti imaju mehanizirano rukovanje uzorcima

(«autosampling») i obradu podataka, a moguće je i simultano mjerenje nekoliko
elemenata da se dobije informacija o statusu pacijenta s obzirom na tragove metalnih
iona (vidi SIMAAS, str. 41). SIMAAS spektrometri koriste se u analizama kliničkih i
ekoloških uzoraka. Tako se, npr., odreñuju Cd i Pb u punoj krvi (ref. 10, 13), urinu
(ref. 6) i u otpadnim vodama (ref. 9), Cu, Fe i Zn (ref. 18), Al, Co, Cr, Mn, Mo, Ni i
V (ref. 19), Mn i Se (ref. 5) u serumu, Co i Mn (ref. 17), Cr i Mn (ref. 23), As i Se
(ref. 8) u urinu, olovo u vinima (ref. 14). Tseng et al. (ref. 28) razvili su «on-line»
sustav za mikrodijalizu povezan sa SIMAAS-om za kontinuirano promatranje Cu,
Mn, Ni, Se u dijalizatu u 0,9% NaCl-u i u suspenzijama stanica. Tablica 6 ilustrira
postupke multielementne analize SIMAAS-om u nekim biološkim uzorcima.
Granice dokazivanja u biološkim uzorcima mogu biti i 5 puta veće od onih u
čistim otopinama. Da bi se izbjegli efekti viskoznosti uzorka i napetosti površine kada
se uzorak aspirira u plamen, serum se razrijeñuje 2, 5, pa čak i 10-20 puta. Ovo
razrijeñivanje povećava potrebu za osjetljivošću analitičkog sustava. Prikladnost
metode za pojedinu svrhu može se jednostavno ustanoviti ako se prihvati pretpostavka
da je najniža koncentracija ili količina analita koja se može mjeriti s RSD od ca 3%
jednaka 10xLOD. LOD je u biološkom materijalu najčešće dvostruka od one u čistoj
otopini.
1. Npr. koncentracija Cu2+ u ljudskom krvnom serumu iznosi prosječno 1
mg dm-3 (ppm); nakon 20-erostrukog razrijeñenja to iznosi 50 µg dm-3 (ppb). LOD za
bakar u čistoj otopini FAAS-om iznosi 1,5 µg dm-3 (ppb) (vidi tablicu 1, str. 8) a u
biološkom uzorku će to biti 3 µg dm-3 (ppb). Slijedi da će koncentracija koja daje
RSD od 3% biti 30 µg dm-3 (ppb). Očito se pri stupnju razrijeñenja od 20 puta analiza
FAAS-om još jedva može izvesti; potrebno je razmišljati o postupku pri nižem
stupnju razrijeñenja ili o primjeni GFAAS.
2. Koncentracija Pb2+ u punoj krvi iznosi 200 µg dm-3 (ppb). LOD za Pb iznosi:
a) 15 µg dm-3 (ppb) FAAS-om, b) 0,05 µg dm-3 (ppb) GFAAS-om (vidi tablicu 1, str.
8). Koncentracija Pb u 10x razrijeñenom uzorku iznosi 20 µg dm-3 (ppb)
Koncentracija koja se može mjeriti s RSD 3% iznosi u slučaju a) 300 µg dm-3 (ppb), a
u slučaju b) 1 µg dm-3 (ppb). Dakle, za analizu 10x razrijeñenog uzorka nije
prihvatljiv sustav a) s raspršivanjem i plamenom već sustav b) s grafitnom kivetom
koji je dovoljno osjetljiv.

43
 Tablica 6. Neke multielementne analize SIMAAS-om (prema ref. 21) (pres. 33)
Analit Uzorak Kemjski modifikator LOD (µg dm-3, ppb) mc (pg)*
Mn Serum Pd + Mg 0,65 6,0
Se 5,0 46
Cu Serum - 4,0 26
Fe 2,2 16
Zn 0,4 2,7
As Pitka voda Pd + Mg 0,7 39
Cu 0,2 17
Mn 0,6 60
Sb 0,3 43
Se 0,.9 45
Bi Vino Pd + Mg - -
Pb 0,9 45
Cu Morska voda Pd + Mg + 5%H2 u Ar 0,4 -
Mn 0,7 -
Mo 1,2 -
Cr Urin Mg 0,08 7,8
Mn 0,16 4,6
Cd Vino Pd + Mg 0,03 0,6
Pb 0,8 33
As Čvrste čestice Pd + Mg 0,26 37
Cd u zraku 0,02 2,2
Ni 0,97 28
Pb 4,3 1400
Al Urin Pd + 5%H2 u Ar 0,06 -
Cr 0,05 -
Cu 0,08 -
Mn 0,06 -
Cd Hrana NH4H2PO4 + Mg 0,04 1,5
Pb 0,93 37
As Voda Ir 0,82 177
Bi 0,04 91
Sb 0,26 107
Se 0,29 90
Te - -
Cd Pitke i površinske Pd + Mg 0,1 -
Cr vode 1 -
Cu 1 -
Ni 1 -
Pb 1 -
Mo Morska voda NH4H2PO4 + Mg 0,35 -
V 0,32 -
Cr Serum - 0,05 -
Ni 0,2 -
Cd Puna krv NH4H2PO4 0,2 -
Pb 4,5 -
Cd Urin NH4H2PO4 0,06 -
Pb 2,6 -
Cu Morska voda Pd 0,07 1,5
Mn 0,10 37
Cd Tlo i sediment - 0,001 0,44
Pb 0,1 22
Co 0,05 22
Cu 0,02 35
Co Urin Mg 0,18 -
Mn 0,09 -
* Karakteristična masa.

44
 Sadašnje stanje i budućnost atomske spektroskopije u kliničkoj
laboratorijskoj praksi

Mnogi klinički laboratoriji prebacuju se s plamenih i elektrotermičkih AAS

metoda na ICP-MS. Izbor koji će laboratorij učiniti prvenstveno ovisi o analitima i
njihovim koncentracijama te matrici analiziranih uzoraka. Ako laboratorij radi
pojedinačne analize, npr., Pb u krvi, Al, Zn i Cu u serumu, tada neće koristiti ICP-MS
jer im je postojeća AAS instrumentacija zadovoljavajuća. Ako je meñutim zadatak
„biomonitoring“ niza elemenata u tragovima, logičan izbor će biti ICP-MS.

Većina biokemijskih laboratorija odreñuju Se, Zn, Cu i Al u serumu i/ili Pb, Cd,
Hg, As i Cr u krvi i/ili urinu dok se, npr., Pt, Au, etc., analiziraju u terapeutske svrhe.
Modificirani periodni sustav na slici 25 prikazuje elemente koji su od kliničkog i/ili
javno-zdravstvenog interesa.

Li Be F
Na Mg Al Si P S Cl
K Ca V Cr Mn Fe Co Ni Cu Zn As Se
Mo Cd I
Pt Au Hg Tl Pb

Esencijalni Esencijalni Neesencijalni

makro- elementi u toksični Terapijski
elementi tragovima elementi elementi

Slika 25. Elementi od kliničkog i/ili javno-zdravstvenog interesa (prema ref. 24). (pres 34)

Esencijalni elementi klasificirani su kao makro elementi (>10 mg dm-3 u

tjelesnim tekućinama ili >100 µg g-1 tkiva) i oni u tragovima (10-104 µg dm-3 u
tjelesnim tekućinama ili 0,01-100 µg g-1 tkiva). Esencijalni elementi u ultra tragovima
su oni na razini <10 µg dm-3 u tekućinama i <0,01 µg g-1 u tkivima. Većina kliničkih
metoda koje služe ustanovljavanju nedostatka elemenata u tragovima ili ukazuju na
izloženost toksičnim elementima pri radu ili u okolišu temelje se na analizama krvi,
seruma/plazme, i/ili urina. Izbor uzorka ovisi o toksikokinetici, invazivnosti odnosno
načinu dobivanja uzorka, i mogućem zagañenju uzorka. Stoga se koriste i neki ne-
tradicionalni, alternativni uzorci do kojih se dolazi neinvazivno, poput sline, kose i
noktiju. Pouzdanost ovih matrica kao biomarkera koncentracije elementa u organizmu
odnosno izloženosti i/ili nutritivnog statusa organizma je upitna.

45
ICP-MS
Induktivno spregnuta plazma-spektroskopija mase (ICP-MS) tehnika je koja je
komercijalno uvedena 1983. te su je prvi prihvatili geokemijski laboratoriji zbog
visoke osjetljivosti analize rijetkih zemalja. Koristi se za multielementnu analizu
metala u tragovima, u rutinskim analizama i u istraživanju.
Svoju primjenu ICP-MS nalazi u analizi voda (hidrogeologija), geologiji i
ispitivanju tla, rudarstvu/metalurgiji, ispitivanju hrane i biomedicini. Temeljne
prednosti ICP-MS pred drugim atomskim spektroskopijama su:

- niži (ili isti) LOD-ovi kao oni koji se dosižu GFAAS-om i ICP-AES-om.
Većina elemenata dade se detektirati u ppt („part per trillion“) području ali se
neki detektiraju čak u ppq („part per quadrillion“) području;
- veća radna efikasnost od one GFAAS-a
- mogućnosti baratanja jednostavnim i kompleksnim matricama uz minimum
interferencija zbog visoke temperature ICP-a
- informacija o izotopima. Ona ima sposobnost razlikovanja meñu masama
raličitih izotopa istog elementa koji egzistiraju istovremeno.

Instrumentacija

ICP-MS kombinira visoku temperaturu ICP-a (induktivno spregnuta plazma)

kao efikasnog izvora pozivnih iona za većinu elemenata, sa spektrometrom masa
(MS) (slika 26). ICP prevodi atome u ione koje spektrometar masa odjeljuje i
identificira. Plinoviti argon struji unutar koncentričnih kanala ICP mlaznice; preko
uzvojnice prenosi se radio frekvencija (RF) na zagrijani plinoviti Ar stvarajući Ar-
plazmu u mlaznici. Temperatura „plamena“ Ar-plazme iznosi 6000-10000 0K i
predstavlja odličan izvor iona. Ioni koji nastaju su obično pozitivno nabijeni (M+ ili
M2+), tako da je elemente koji rado tvore negativne ione, npr., Cl, I, F, etc., teško
analizirati ICP-MS-om. Uzorak se u ICP plazmu uvodi obično kao aerosol
aspiracijom tekućeg uzorka u raspršivač i dalje u komoru za raspršivanje (slika 27).
Samo mali dio aerosola se argonom dalje transportira u mlaznicu. Za jedno mjerenje
potrebno je oko 1 cm3 uzorka, od čega propada oko 99%. Danas se koriste vrlo
efikasni raspršivači koji procesiraju 10-200 dm3 tekućine u minuti; njima se
poboljšavaju i LOD i RSD vrijednosti. Kada aerosol uñe u komoru za raspršivanje
veće se kapljice ocjeñuju; kroz ovu komoru proñe samo 2% izvornog aerosola. Kada
je aerosol uzorka jednom unešen u ICP mlaznicu dolazi do potpunog gubitka otapala i
stvaranja najprije atoma u plinovitoj fazi pa ionizacije kretanjem atoma prema kraju
plazme. Atomi su u vrućoj plazmi ujedno i ekscitirani a taj se fenomen koristi u ICP-
AES (vidi i str. 4). Dijelovi instrumenta koji stvaraju ekscitiranu atomsku paru
odgovaraju ICP-AES instrumentu (slike 26-28). Za izravno prevoñenje čvrstog uzorka
u aerosol danas se koriste laseri (vidi str 47).

Ioni trebaju prijeći iz područja atmosferskog tlaka plazme u područje niskog

tlaka MS-a. Oni putuju u struji argona pri tlaku od 0,13-0,27 Pa u područje niskog
tlaka MS-a od <1,3 mPa. Ovo se odigrava u prostoru kojeg čine dva povezna konusa
(metalni diskovi s malom rupicom u centru dijametra ca 1 mm). Ioni prvo prolaze
kroz hladni konus za uzorkovanje (obično iz Ni) s otvorom od 1 mm; plin ekspandira

46
iza prvog otvora i dio prolazi kroz drugi otvor u „skimmer“ konusu. U slučaju
uzoraka s velikom količinom otopljene krutine može doći do začepljenja otvora u
konusima; zato je dobro raditi s uzorcima s koncentracijom nižom od 0.2%. Stoga se
digerirani uzorci tla ili stijena često moraju razrijeñivati.
Serija ionskih, elektrostatskih leća pri odgovarajućem naponu dalje fokusiraju
zraku iona u diskriminator masa i detektor, odnosno u ulaznu pukotinu spektrometra
masa. Najčešći tip spektrometra mase je kvadrupolni filter masa; ovdje ioni bivaju
separirani s obzirom na omjer masa-naboj (m/z) (slika 29). Ioni prolaze kroz
kvadrupolni analizator MS-a na temelju m/z omjera te bivaju detektirani
multiplikatorom elektrona. Kvadrupolni analizator masa ima rezoluciju bolju od
jedinice u podrućju do m/z=300. Konačno, nakon odjeljivanja iona prema omjeru m/z
oni nastavljaju svoj put u detektor, gdje se broj udaraca iona u površinu detektora
prevodi u električni signal. Danas su detektori tipa kanalnog elektronskog
multiplikatora zamijenjeni dinodnim detektorima. Intenzitet signala funkcija je broja
iona analita u plazmi i njihovog transporta kroz MS, koji ovisi o masi.
Nedostaci ICP-MS su interferencije koje stvaraju poliatomske specije iz plazme
i atmosfere, npr., izotopi Ar, O, N i H mogu se kombinirati meñusobno ili s drugim
elementima. Ovakve spektralne interferencije otežavaju analize nekih elemenata (npr.,
As, Cr, Fe, Ca, Sr). Zato se za dobivanje ispravnih rezultata primjenjuju modificirane
instrumentacije koje uključuje dinamičku (DRC) ili kolizijsku reakcijsku ćeliju (CRI),
ili magnetski sektorski analizator i/ili električni sektor, „sector field“ (SF-ICP-MS) ili
„high resolution“ (HR-ICP-MS). HR-ICP-MS instrument koristi i magnetski i
električni sektor. Kako je magnetski sektor disperzivan i s obzirom na energiju i s
obzirom na masu iona, on fokusira sve divergirajuće ione dok je električni sektor
disperzivan samo s obzirom na energiju iona i fokusira ih prema izlaznoj pukotini.
Takav instrumentalni sklop zove se „double-focusing“ HR-ICP-MS.
Tablica 7 prikazuje LOD vrijednosti za neke elemente postignute ICP-MS-om.

LA-ICP-MS

“Laser ablation” ICP-MS (LA ICP-MS) je relativno nova mikroanalitička

tehnika za odreñivanje tragova elemenata u čvrstim uzorcima koja se sve više koristi
u geokemiji, ispitivanjima materijala, forenzici i ispitivanju okoliša. Na ovaj način
izbjegava se postupak otapanja čvrstog uzorka. Uzorak se izravno analizira ablacijom
s pulzirajućom laserskom zrakom; stvara se aerosol koji se uvodi u ICP. Kako je laser
dio mikroskopskog sustava moguće je uzorkovati male ili velike površine čvrstog
uzorka. Jedna od važnih prednosti ove tehnike jesu i puno manje količine uzoraka
koje su potrebne (µg) nego kod postupaka rapršivanja otopina (mg). Takoñer, laserska
zraka koja je fokusirana omogućava prostornu karakterizaciju heterogenosti čvrstog
materijala, s mikronskom rezolucijom.

47
 RF generator
Kvadrupolni „Skimmer“
analizator konus Ar za hlañenje
Konus za Stvaranje hidrida
Pomoćni
uzorkovanje Ar
Ionske leće
Laserska
ablacija

GC/SFC

Elektrotermička
vaporizacija
Mlaznica s
„plamenom“
Komora
za
raspršivanje
Detektor
(multiplikator Difuzijske Područje Protok u
elektrona) pumpe ekspanzije raspršivaču
Raspršivač

„Flow
Analiza podataka injection“ HPLC
na računalu

Uzorak
(otopina, krutina)

Slika 26. Shematski prikaz ICP-MS sustava. (pres 35)

48
 Slika 27. Stvaranje aerosola u raspršivaču. (pres 36)

Slika 28. „Plamen„ Ar-plazme. (pres. 37)

Slika 29. Kvadrupolni analizator masa u ICP-MS. (pres 38)

49
 63
Cu

Intenzitet impulsa

65
Cu

63 65
Masa

Slika 30. Arbitralni spektar masa dvaju izotopa bakra dobiven ICP-MS-om. 63Cu i 65Cu prisutni u ca
70 i 30% udjelima. (pres. 39)

Tablica 7. LOD vrijednosti za neke elemente postignute ICP-MS-om (pres 40)

Analit LOD
(ppt, 1:1012)
Sr, Y, Zr, Nb, Mo, Tc, Ru, Rh, Ag, Sn, Sb, Cs, Ba, La, Hf, 0.1-1
Ta, W, Re, Os, Ir, Pt, Au, Tl, Pb, Bi
Li, Be, Na, Mg, Rb, Sc, Ti, V, Cr, Mn, Te, Co, Ni, Cu, Zn, 1-10
Ga, Ge, As, Rb, Pd, Cd, Sn, Te, Hg, U, Cs, Bi
Ag, Be, Cd, Rb, Sn, Sb, Au 10-50
Ba, Pb, Se, Sr, Co, W, Mo, Mg 50-100
Se, K, Ca 10-100
Cr, Cu, Mn 100-200
Zn, As, Ti 400-500
B, Si, P, Br, I 0.1-1 ppb*
Li, P 1-3 ppb*
S 1-10 ppb*
Ca <20 ppb*
*
ppb: 1:109

Primjena u biomedicini
ICP-MS povezana sa separacijskim tehnikama (tekućinskom kromatografijom
ili kapilarnom elektroforezom) osigurava niske LOD vrijednosti i dobar je izbor za
primjenu u nutricionizmu, medicini rada i okoliša, i toksikologiji. Pri analizi kliničkih
uzoraka koji sadrže visoke koncentracije organske matrice i anorganskih tvari dolazi
do interferencija matrice i/ili spektralnih interferencija poliatomskih iona. Takve
poliatomske interferencije javljaju se kod analiza atoma s Ar<80 (npr., As, Zn, Fe, Se,

50
Cr) što onda zahtijeva primjenu DRC-ICP-MS ili SF-ICP-MS ili HR-ICP-MS sustava.
Organski matriks može i začepiti raspršivač pri duljem radu a mogu se pojaviti i
naslage matriksa na mlaznici plazme. Ovi se efekti izbjegavaju razrijeñivanjem
uzorka, posebnim raspršivačima i manjom brzinom aspiracije uzorka.
Jedan od važnih primjera toksičnih analita je olovo čije je praćenje započelo
DC-MSFAAS-om u mikrolitarskom volumenu pune krvi (ref. 12), nastavljeno je s
grafitnom kivetom a danas se oslanja na ICP-MS uz niže LOD vrijednosti i bolju
ispravnost. ICP-MS danas je metoda izbora i za mjerenje Pb u plazmi i serumu.
ICP-MS danas zauzima dominanto mjesto u kliničkim analizama. To je metoda
simultane multielementne analize. Štoviše, ona osigurava niže LOD vrijednosti od
onih postignutih ICP-AES-om, jednostavniju spektralnu interpretaciju, te informaciju
o izotopima. DRC-ICP-MS je nedavno uspješno primijenjena za vrlo osjetljiva
simultana odreñivanja i do dvadesetak elemenata (npr., As, Ba, Be, Co, Cd, Cu, Cr,
In, Li, Mn, Mo, Ni, Pb, Pt, Rh, Sb, se, Sn, Tl, U, W, Zn) u urinu i krvi, riži, etc., u
okviru studija biomonitoriranja. Zanimljivo je spomenuti da je FAAS još uvijek
tehnika izbora za analize serumskog Zn i Cu u Kanadi i u Europi ali ne i u SAD gdje
dominira ICP-MS. Za Pb u krvi dominira ETAAS i u Europi i u SAD a za Cd u krvi u
Europi se dominantno koristi ETAAS a u SAD-u ICP-MS.
Identifikacija specifičnog oblika kemijskog elementa koji ima naglašene
toksične učinke ili koji ima veću bioraspoložljivost od drugih, dio je specijacijske
analize u kojoj važno mjesto pripada ICP-MS-u, u kombinaciji s tekućinskom
kromatografijom, kapilarnom elektroforezom ili plinskom kromatografijom. U obzir i
dalje dolaze i postupci stvaranja hladnih para (Hg) i hidrida (As i Se) kombinirani s
AFS i AAS. Vrlo je važna specijacija esencijalnih elemenata u serumu/plazmi, ali
adekvatnih metoda je malo. Problem čini i nedostatak odgovarajućih referentnih
materijala; do nedavno jedini CRMs („certified reference material“) s prirodno
prisutnim specijama u kliničkom matriksu bili su oni sa specijama arsena.
Gel kromatografija s ICP-MS-om kao detektorom čini atraktivnu metodu za
pretraživanje specija nekih esencijalnih elelemenata kao i metabolita nekih toksičnih
elemenata u tjelesnim tekućinama, zbog neosjetljivost ove metode na kompleksnu
matricu uzorka. Gel kromatografijom se najprije frakcioniraju specije koje sadrže
metale prema svojim molekulskim masama. Tako se uklanjaju biološki spojevi s
Mr>100 kDa. Specije koje sadrže metale se dalje frakcioniraju nekom drugom
separacijskom tehnikom. Ovaj se pristup naziva multidimenzijskom kromatografijom
i vjerojatno će biti sve popularniji u postupcima specijacije.

Atomska spektroskopija u kliničkim laboratorijima budućnosti

Danas se razvijaju i novi instrumenti s kontinuiranim izvorom zračenja no tek
treba vidjeti da li će oni naći svoje mjesto u rutinskim kliničkim analizama. Takoñer,
atomsko-flourescentna spektroskopija uz stvaranje hidrida („hydride generation
atomic fluorescence spectrometry“, HG-AFS) predstavlja alternativu za odreñivanje
elemenata koji stvaraju hidride (As, Se) u urinu i drugim tjelesnim tekućinama, uz
bolju osjetljivost od one AAS i ICP-AES.
Zahtjevi budućnosti u kliničkom laboratoriju su i povećana potreba za
mjerenjima omjera izotopa u svrhu identifikacije porijekla uzorka, kao npr., kod
trovanja olovom. ID-ICP-MS („isotope dilution“, ID) bit će metoda koja daje konačni

51
 podatak. ID je napouzdanija metoda odreñivanja koncentracije elementa. U ovoj
metodi mjeri se promjena u odnosu dvaju odabranih izotopa nekog elementa u otopini
nakon dodatka poznate koncentracije jednog izotopa.
U budućnosti se očekuje identifikacija mnogo većeg broja metabolita
specifičnih za elemente zahvaljujući sinergizmu tehnika koje se temelje na analitičkoj
atomskoj spektroskopiji i molekulskoj masenoj spektrometriji. Tako će se ESI-TOF-
MS („electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry“) i MALDI-MS
(„matrix-assisted laser desorption/ionization mass specctrometry“) koristiti kao
dopuna separacijskim metodama koje se vežu za ICP-MS.

Literatura

1. Analytical Methods for Atomic Absorption Spectrometry, PerkinElmer Bodenseewerk, Überlingen,

2000.
2. Atomic Spectrometry – The THGA Graphite Furnace – Techniques and Recommended Conditions,
PerkinElmer Bodenseewerk, Überlingen, 1999.
3. B. L. Batista, V. C. De Oliveira Souza, F. G. Da Silva i F. Barbosa, Jr., Survey of 13 trace elements
of toxic and nutritional significance in rice from Brazil and exposure assessment, Food Addit. Cont.
B 3 (2010) 253-262.
4. B. L. Batista, J. L. Rodrigues, J. A. Nunes, V. C. de Oliveira Souza, F. Barbosa, Jr., Exploiting
dynamic reaction cell inductively coupled plasma mass spectrometry (DRC-ICP-MS) for sequential
determination of trace elements in blood using a dilute-and-shoot procedure, Anal. Chim. Acta 639
(2009) 13–18.
5. P. R. M. Correia, E. De Oliveira i P. V. Oliveira, Simultaneous determination of manganese and
selenium in serum by electrothermal atomic absorption spectrometry, Talanta 57 (2002) 527-535.
6. P. R. M. Correia, C. S. Nomura i P. V. Oliveira, Multielement determination of cadmium and lead in
urine by simultaneous electrothermal atomic absorption spectrometry with an end-capped graphite
tube, Anal. Sci. 19 (2003) 1519-1523.
7. P. R. M. Correia i P. V. Oliviera, A fast procedure for the simultaneus determination of Cd and Pb in
whole blood by electrothermal atomic absorption spectrometry, At. Spectr. 24 (2003) 222-226.
8. P. R. M. Correia i P. V. Oliveira, Cobalt as internal standard for arsenic and selenium determination
in urine by simultaneous atomic absorption spectrometry, Talanta 67 (2005) 46-53.
9. P. R. M. Correia i P. V. Oliveira, Simultaneous atomic absorption spectrometry for cadmium and
lead determination in wastewater – A laboratory exercise, J. Chem. Educ. 81 (2004) 1174-1176.
10. P. R. M. Correia, P. V. Oliveira, J. A. G. Neto i J. A. Nobrega, Silver as internal standard for
simultaneous determination of Cd and Pb in whole blood by electrothermal atomic absorption
spectrometry, JAAS 19 (2004) 917-922.
11. J. B. Dawson, Analytical Atomic Spectroscopy, u: Scientific Foundations of Clinical Biochemistry,
Volume 1, Analytical Aspects (ur. D. L. Williams, R. F. Nunn i V. Marks), William Heinemann
Medical Books, London, 1978, str. 95-120.
12. H. T. Delves, A micro-sampling method for the rapid determination of lead in blood by atomic
absorption spectrophotometry with the Delves sampling cup technique, Analyst 95 (1970) 431-438.
13. A. Deval i J. Sneddon, Determination of cadmium and lead in blood reference samples by
simultaneous graphite furnace atomic absorption spectrometry, Microchem. J. 52 (1995) 96-100.
14. K. G. Fernandes, M. De Moraes, J. A. G. Neto, J. A. Nobrega i P. V. Oliveira, Evaluation and
application of bismuth as an internal standard for the determination of lead in wines by
simultaneous electrothermal atomic absorption spectrometry, Analyst 127 (2002) 157-162.

52
15. W. Frech, D. C. Baxter i B. Hütsch, Spatially isothermal graphite furnace for atomic absorption
spectrometry using side-heated cuvettes with integrated contacts, Anal. Chem. 58 (1986) 1973-
1977.
16. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of
Pharmaceuticals for Human Use: ICH Harmonized Tripartite Guideline. Validation of Analytical
Procedures: Text and methodology Q2(R1), Current Step 4 version. Parent Guideline dated 27
October 1994 (Complementary Guideline on Methodology dated 6 November 1996 incorporated in
November 2005).
17. B. S. Iversen, A. Panayi, J. P. Camblor i E. Sabbioni, Simultaneous determination of cobalt and
manganese in urine by electrothermal atomic absorption spectrometry - method development using
a simplex optimization approach, JAAS 11 (1996) 591-594.
18. S. A. Lewis, T. C. O'Haver i J. M. Harnly, Simultaneous multielement analysis of microliter
quantities of serum for copper, iron, and zinc by graphite furnace atomic absorption spectrometry,
Anal. Chem. 56 (1984) 1651-1654.
19. S. A. Lewis, T. C. O'Haver i J. M. Harnly, Determination of metals at the microgram-per-liter level
in blood serum by simultaneous multielement atomic absorption spectrometry with graphite furnace
atomization, Anal. Chem. 57 (1985) 2-5.
20. B. V. L'vov, L. A. Pelieva i A. I. Sharnopol'skii, Decrease in matrix effects in atomic-absorption
analysis of solutions in tube furnaces by evaporation of samples from a graphite substratum, Zh.
Prikl. Spektrosk. (J. Appl. Spectrosc., USSR) 27 (1977) 395-399.
21. C. S. Nomura, P. R. M. Correira, P. V. Oliveira i E. Oliveira, W+Rh as permanent chemical modifier
in simultaneous atomic absorption spectrometry: Interference studies on As, Cd, Pb and Se
determination, J. Braz. Chem Soc. 15 (2004) 75-82.
22. E. D. Olsen i P. I. Jatlow, An improved Delves cup atomic absorption procedure for determination of
lead in blood and urine, Clin. Chem. 18 (1972) 1312–1317.
23. P. V. Oliveira i E. Oliveira, Multielement electrothermal atomic absorption spectrometry: A study on
direct and simultaneous determination of chromium and manganese in urine, Fresenius J. Anal.
Chem. 371 (2001) 909-914.
24. P. J. Parsons i F. Barbosa, Jr., Atomic spectrometry and trends in clinical laboratory medicine,
Spectrochim. Acta B 62 (2007) 992-1003.
25. S. Sabet, J. M. Ottaway i G. S. Fell, Comparison of the Delves cup and carbon furnace atomisation
used in atomic-absorption spectrometry for the determination of lead in blood, Proc. Anal. Div.
Chem. Soc. 14 (1977) 300-302.
26. G. Schlemmer i B. Welz, Palladium and magnesium nitrates, a more universal modifier for graphite-
furnace atomic-absorption spectrometry, Spectrochim. Acta B 41B (1986) 1157-1165.
27. W. Slavin, D. C. Manning i G. R. Carnrick, Stabilised-temperature platform furnace, At. Spectrosc. 2
(1981) 137-145.
28. W. C. Tseng, P. H. Chen, T. S. Tsay, B. H. Chen i Y. L. Huang, Continuous multi-element (Cu, Mn,
Ni, Se) monitoring in saline and cell suspension using on-line microdialysis coupled with
simultaneous electrothermal atomic absorption spectrometry, Anal. Chim. Acta 576 (2006) 2-8.
29. United States Pharmacopoeia 24, National Formulary 19, USP Convention, Rockville (MD), 2000,
pp. 2150-2151.
30. B. Welz i M. Sperling, Atomic Absorption Spectrometry, 3. izd., Wiley-VCH, Weinheim, 1999.

53
 Svjetlana Luterotti

ION- I MOLEKULSKO-SELEKTIVNE ELEKTRODE

I. DIO

UVOD
Elektroda, u svom najširem smislu riječi, je vodič koji provodi električni naboj prema
nekom nevodičkom materijalu ili površini. U medicini elektrode se koriste za praćenje
unutarnjih tjelesnih signala. Traženjem pogodnog analitičkog sustava koji bi imitirao opažene
električke fenomene bioloških membrana došlo se do otkrića ion-selektivnih elektroda (ISE).
Pod membranom podrazumijeva se svaki materijal koji odvaja dvije otopine te uzduž kojeg se
stvara električni potencijal, dakle, to je tanko tijelo koje čini posebnu fazu koja odvaja dvije
otopine elektrolita. Membrane koje su temeljni dio ISE su elektrokemijske, ion-senzitivne,
semipermeabilne, permselektivne membrane. Priroda membrane odreñuje selektivnost elektrode.
ISE mogu mjeriti specifično ione i plinove u otopini.

Tijekom 19. stoljeća velika pažnja istraživača iz raznih polja znanosti (kemije, biologije,
biofizike, oceanografije, itd.) bila je usmjerena na studij i primjenu semipermeabilnih
membrana. U periodu 1888-1890. Nernst i Planck objašnjavaju difuzijski potencijal i električni
potencijal na granici tekuće-tekuće. Pojam semipermeabilne membrane uvodi Ostwald 1890.
Početkom 20. stoljeća u okviru ispitivanja krutih membrana pronalazi se prva ISE - staklena pH
elektroda (1906-1909.). Teoriju membranskog potencijala poroznih membrana (propusnih za
ione jednog naboja, a nepropusnih za ione suprotnog naboja) razradili su Teorell 1937, te Meyer
i Sievers 1936. Nikolskii i Tolmacheva su uveli princip ionske izmjene u svoja istraživanja
staklene membrane (1937.), a tekuće membrane s otopljenim ionskim izmjenjivačima prvi puta
koriste Sollner i Shean (1964, 1967.). Pungor i Hallos-Rokosinyi su 1961. ustanovili novi tip
elektrokemijskog senzora koji se sastoji iz taloga inkorporiranog u kemijski inertni materijal.
Frant i Ross su 1966. prvi puta primijenili monokristal za izradbu ISE. Pronalazak Moore-a i
Pressmana 1964. da antibiotik valinomicin pokazuje specifičnost za alkalije doveli su do toga da
su Štefanac i Simon 1966. pokazali da se kompleksi takvih makrocikličkih spojeva s alkalijama
mogu koristiti kao tekuće membrane u elektrodama osjetljivim na te katione. Komercijalni
razvoj ISE počinje onda kada se je inženjer J. Riseman udružio s dr. J. Rossom,
elektrokemičarem s MIT-a (Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts,
SAD) gradeći analizator za plinove u krvi. Oni su utemeljili Orion Research (SAD). Već
sredinom 1960-ih Orion je proizvodio Ca-elektrode za primjenu u analizatorima plinova u krvi, a
otada su razvijene elektrode za analizu mnogih iona.

ISE su naprave koje omogućavaju potenciometrijsko odreñivanje aktiviteta nekog iona "i"
u otopini, u prisustvu drugih iona. One se mogu dizajnirati za svaku ionsku speciju te su vrlo
pogodne za selektivno i kontinuirano praćenje aktiviteta iona (a ne koncentracija) u otopini bez
utjecaja na tu otopinu. To je dobro kod bioloških ispitivanja jer biološki procesi ovise ustvari o
aktivitetima. ISE je dakle elektrokemijski senzor koji odgovara na ion "i" te se najčešće sastoji
od membrane u obliku diska, ili drugog prikladnog oblika, izrañenog od specijalnog materijala

1
fiksiranog na plastičnu ili staklenu cijev u kojoj se nalazi unutarnja referentna elektroda i
unutarnja referentna otopina.

KONSTRUKCIJA ION-SELEKTIVNIH ELEKTRODA

Komercijalno su dostupni različiti tipovi ISE, a one se klasificiraju prema prirodi

membranskog materijala. Svaka ISE sastoji se iz ion-osjetljive membrane postavljene u
električki izoliranu plastičnu cijev. Unutarnja površina membrane nalazi se u kontaktu s
unutarnjom punećom otopinom koja sadrži neki ion u ravnoteži s unutarnjom referentnom
elektrodom. S obzirom na fizičko stanje elektroaktivnog materijala u membrani, ona može biti
kruta ili tekuća.
Kada se ISE koristi za odreñivanje u malim volumenima otopina, pogodno je koristiti
kombinirane membranske elektrode koje sadrže unutarnju referentnu elektrodu, unutarnju
referentnu otopinu i vanjsku referentnu elektrodu u zajedničkom elektrodnom tijelu.

ISE članak i vanjska referentna elektroda

voltmetar

unutarnja referentna
ion-selektivna elektroda vanjska referentna
elektroda elektroda

unutarnja referentna
otopina

membrana tekuća granica

otopina uzorka

Slika 1. Elektrokemijski članak s ISE. (pres. 1)

ISE (uključujući i pH elektrodu) radi na temeljnom principu galvanskog članka (slika 1,

pres 1). Temeljni instrumentalni sklop uključuje voltmetar, ISE za analit i vanjsku referentnu
elektrodu. Selektivnim prijenosom odreñivanog iona "i" iz otopine uzorka u membranu ISE
stvara se potencijalna razlika izmeñu unutarnje otopine i otopine uzorka. Mjeri se električki
potencijal koji se stvara uzduž membrane od strane “selektiranih” iona i njegovom usporedbom s
referentom elektrodom odreñuje se neto naboj čija je veličina izravno proporcionalna
koncentraciji selektiranog iona. Dakle, ISE članak je elektrokemijski članak izgrañen iz ISE i
vanjske referentne elektrode, pri čemu su obje u kontaku s otopinom uzorka pri istoj temperaturi
te povezane s voltmetrom. To znači da je ion-senzitivna membrana svojom vanjskom površinom
u kontaktu s otopinom uzorka i vanjskom referentnom elektrodom, a unutarnjom površinom s
unutarnjom referentnom elektrodom, npr. Ag│AgCl, i unutarnjom referentnom otopinom. To je
vodena otopina elektrolita koja sadrži stalnu koncentraciju iona kojeg unutarnja referentna
elektroda detektira, npr. Cl- u slučaju Ag│AgCl elektrode. Unutar takvog ISE članka nastaje
električka potencijalna razlika kod nulte struje, tzv. elektromotorna sila, EMF, koja čini zbroj
svih potencijala na granicama faza i potencijala tekućih granica (spojeva) (pres. 3, 5):

2
 Ag│AgCl│unutarnja ref. otopina│membrana│ispitivana otopina║KCl (zas.)│Hg2Cl2│Hg

ISE uzorak vanjska ref. el. (SCE)

Uz ISE u elektrokemijskom članku drugu polovicu elektrodnog para čini vanjska

referentna elektroda koja osigurava konstantni potencijal bez obzira na sastav uzorka. Interna
otopina vanjske referentne elektrode je otopina koja sadrži anion kojeg detektira referentna
elektroda ISE članka, npr. Cl- za Ag│AgCl elektrodu. Potencijal senzorske elektrode mjeri se u
odnosu na ovaj referentni potencijal dajući ukupni potencijal sustava, tj. EMF članka koji se
može prevesti u koncentraciju mjerene specije. Najčešća vanjska referentna elektroda je zasićena
kalomelova elektroda (SCE) koja ima unutarnji referentni element tipa Hg│Hg2Cl2. Unutarnja
otopina je obično 3,5 mol dm-3 KCl ili zasićeni KCl te je zasićena i s Hg2Cl2. Za specifična
ionska mjerenja i precizna pH mjerenja preferira se vanjska referentna elektroda s unutarnjim
referentnim elementom Ag│AgCl. Ove elektrode imaju bolje termičke značajke od kalomelove
(brže se uravnotežuje uz promjene temperature). Unutarnja otopina je zasićena sa Cl- (obično je
to zasićeni KCl ili 1 mol dm-3 KCl) i AgCl.

Kombinirane elektrode, npr. pH elektrode, u zajedničkom elektrodnom tijelu kombiniraju

vanjsku referentnu elektrodu, npr. SCE zajedno s elektrolitskim mostom iz zasićenog KCl, i pH
staklenu elektrodu.
Referentne elektrode mogu biti konstruirane kao:
1. "single junction" elektrode koje sadrže samo jedan elektrolit koji osigurava konstantni
aktivitet iona detektiranog reverzibilnim referentnim elementom, i konstantni "liquid junction
potential" (potencijal na granici tekućina, Ej) s otopinom uzorka;
2. "double junction" elektrode koje sadrže dvije odvojene otopine. Unutarnja osigurava
konstantni aktivitet iona detektiranog referentnim elementom a vanjska (elektrolitski most)
osigurava niski Ej s otopinom uzorka. Ej izmeñu unutarnje i vanjske otopine je konstantan ali ne
mora biti nula.

Elektrolitski most
Kako je Ej funkcija pokretljivosti, koncentracije i valencije iona koji formiraju tekuću
granicu, njegova će se vrijednost jako smanjiti kada se koncentrirana otopina ekvitransferentnih
iona nalazi u kontaktu s puno razrijeñenijim elektrolitom. Tako ga obično čini otopina soli
visoke koncentracije, npr. s kationima i anionima podjednakih pokretljivosti. Koncentrirani KCl
koristi se zato jer su pokretljivosti K+ i Cl- praktički jednake (tK+=0,49, tCl-=0,51). NH4NO3
mostovi koriste se kada uzorak sadrži ione koji sa Cl- stvaraju netopljive soli (npr. Ag+).
Elektrolitski most obično se stavlja izmeñu unutarnje otopine referentne elektrode i otopine
uzorka/standarda.
U odsunosti elektrolitskog mosta unutarnja otopina visoke koncentracije elektrolita s
kationima i anionima podjednake pokretljivosti služi tome da se Ej održava niskim i približno
konstantnim pri zamjeni otopine uzorka standardnom otopinom.
Ispravnost mjerenja ionskog aktiviteta ovisi o konstantnosti Ej kada se standardna otopina
zamijeni uzorkom. Ovo se rijetko postiže zbog nastajanja tzv. rezidualnog tekućeg potencijala,
∆Ej (vidi str. 5). Pogreška koja nastaje zbog rezidualnog potencijala tekuće granice nastaje zbog
pogrešne pretpostavke da se Ej ne mijenja zamjenom jedne otopine drugom. Ova pogreška unosi
nesigurnost reda veličine 1 mV.

3
Tekuća granica
Tekuća granica je svaka granica izmeñu dvije otopine elektrolita različitog sastava. Uzduž
takve granice nastaje potencijalna razlika, potencijal tekuće granice ("liquid junction potential",
Ej). U ISE članku nastaje granica izmeñu otopine uzorka i unutarnje otopine vanjske referentne
elektrode. Ako se koristi elektrolitski most nastaje konstantni Ej izmeñu njega i unutarnje
referentne otopine i promjenjljivi Ej izmeñu njega i otopine uzorka.
Da bi se Ej što više smanjio kontakt elektrolita provodi se na razne načine, npr. kroz
porozni čep od stakla ili keramički ili azbestni tampon ili perforirani disk, koji su dosta bliski
teorijskom modelu, iako se lako onečiste (slika 2, pres 2). U tim je slučajevima unutarnja otopina
referentne elektrode u kontaktu s otopinom uzorka preko porozne keramičke granice, vlakana
azbesta ili komada sintrovanog poroznog stakla. One često pokazuju nestabilne referentne
potencijale jer se ovakve granice lako onečiste, prevuku talozima ili kristalima KCl. Zato se za
specifična ionska i precizna pH mjerenja rado koriste referentne elektrode tipa "rukava". Ovdje
je unutarnja referentna otopina u kontaktu s otopinom uzorka, preko uskog otvora oblika prstena
izmeñu vanjskog rukava i unutarnjeg tijela elektrode. Taj se prostor širi iznad vrha čineći
rezervoar za unutarnju otopinu. Ove elektrode daju izuzetno stabilne Ej, a tekuća se granica teško
onečišćuje. Rukav se može ukloniti tako da se elektroda ako je to potrebno može očistiti.
A B
Razni tipovi tekućih granica

• A – keramički čep
• B – obloga od sintrovanog stakla
• C – azbestni stijenj
• D – spoj u obliku slova U s keramičkim čepom

C D

Slika 2. Geometrija granice tekuće-tekuće. (pres 2)

EMF se može mjeriti u člancima (vanjska referentna elektroda prikazuje se kao anoda) s ili
bez tekućih granica:

1. Članci bez tekućih granica

Ovakvi članci nastaju kada se ISE i vanjska referentna elektroda nalaze u izravnom
kontaktu s uzorkom (pres. 3):
ISE1│otopina uzorka│referentna elektroda koja može biti i ISE2
pa je:
EMF = EISE1 – Eref(ISE2)
Mjerenja u ovakvim člancima daju informacije o aktivitetu kombinacije iona pa su korisna
za odreñivanje srednjih koeficijenata aktiviteta ispitivanog elektrolita. Meñutim, za odreñivanje
aktiviteta ili koncentracije jednog iona, potencijal vanjske referentne elektrode mora biti
konstantan, tako da samo potencijal ISE daje uvid u aktivitet iona u uzorku.

4
2. Članci s tekućom granicom
Npr. za članak:
Na+(ISE)│otopina uzorka║zas. KCl│Hg2Cl2│Hg
vrijedi:
EMF = Eo + (2,303RT/F) log aNa+ + Ej – ESCE
a za članak:
F-(ISE)│otopina uzorka║zas. KCl│Hg2Cl2│Hg
EMF = Eo – (2,303RT/F) log aF- + Ej – ESCE
pa se aktivitet iona u uzorku računa kao:
pNa(x) = pNa(s) + (Ex-Es)F/2,303RT
pF(x) = pF(s) + (Ex-Es)F/2,303RT
EMF – elektromotorna sila članka, ESCE – potencijal SCE, Eo – standardni potencijal ISE, Ej – potencijal tekuće
granice ("liquid junction potential"), R – univerzalna plinska konstanta = 8,314 J K-1 mol-1, T – apsolutna
temperatura (K), F – Faradayeva konstanta = 96485 C mol-1 (A s mol-1), Ex, Es – EMF izmjerena u uzorku, odnosno
standardnoj otopini, p(x), p(s) – negativni logaritam aktiviteta iona u uzorku x odnosno u standardnoj otopini s,
E(x), E(s) – E u uzorku odnosno u standardnoj otopini.

ZNAČAJKE ISE

1. Membranski potencijal i potencijal ISE

Za razumijevanje fenomena na membrani ISE treba poznavati fenomene koji se dogañaju
na granici dvaju elektrolita. To su: (i) difuzijski potencijal koji se reflektira u potencijalu na
granici tekućina (Ej), te nastaje zbog različite pokretljivosti, naboja i koncentracije iona u
elektrolitima koji su u kontaktu, (ii) Donnanov potencijal koji potječe iz potpune nemogućnosti
prolaza jedne ili više vrsti iona kroz granicu izmeñu dva elektrolita.
«Liquid junction» potencijal (Ej) predstavlja najjednostavniji slučaj efekata na granici
izmeñu dva elektrolita. "Liquid junction" je područje slobodne difuzije iona. Kako su njihove
difuzije različite nastaje potencijalna razlika, Ej. Ovaj su problem rješavali Henderson i Planck.
Zbog privlačenja suprotno nabijenih iona, dolazi na tekućoj granici do razdjeljivanja naboja
kojim se nastoji izbalansirati razlike u pokretljivostima.Tako se brži ioni usporavaju, a sporiji
ubrzavaju dok se ne postigne da i pozitivni i negativni ioni difundiraju istom brzinom kroz
granicu. Ovaj ravnotežni Ej mjeri se kao razlika potencijala dviju otopina i računa prema
Planckovoj jednadžbi:
II
Ej = -(RT/F) ∫ Σ(ti/zi) dln ai
I II
ti – prijenosni broj iona "i", ai, zi – aktivitet i naboj iona "i", ∫ integracijske granice koje se odnose na sastav dviju otopina.
I

Razlika Ej u standardnoj otopini i u otopini uzorka, ∆Ej, je rezidualni Ej, dakle konstantnost Ej
bitno utječe na ispravnost rezultata (vidi str. 3):
∆Ej = Ej(x) – Ej(s)
Ej(x), Ej(s) – Ej u uzorku odnosno u standardnoj otopini.

5
 Stabilnost i reproducibinost Ej ovisi o načinu izvoñenja granice tekuće-tekuće i geometriji
te granice (slika 2, pres 2) (vidi str. 4). Donnanov potencijal nastaje kada je membrana potpuno
nepropusna za barem jedan ion. Najjednostavniji slučaj je kada membrana propusna za jednu
vrstu iona, npr. katione, dijeli dvije otopine istog kemijskog sastava (KCl) ali različitih
koncentracija. Kada mali broj kationa proñe kroz membranu iz otopine više koncentracije u
otopinu niže koncentracije nastaje električni potencijal koji onemogućuje daljnju difuziju; to je
slučaj kod elektrokemijskih membrana (slika 3). Navedeni potencijali nastaju na granici dviju
različitih faza zbog redistribucije električnog naboja. Na temelju difuzijskog potencijala i
Donnanovog potencijala može se objasniti membranski potencijal na permselektivnim
membranama koje zahvaljujući fiksiranim nabojima u membrani razlikuju ione s obzirom na
njihov naboj ali ne i vrstu.
Semipermeabilne membrane nisu jednako propusne za sve ione. Njihovo važno svojstvo je
membranski potencijal (EM) (slika 3) tj. električna potencijalna razlika koja nastaje izmeñu dvije
odijeljene otopine. ISE temelje se na elektrokemijskim membranama tj. fazama koje su
sastavljene iz krutih ili tekućih elektrolita koje perfektno odvajaju otopine dva elektrolita. One su
karakterizirane faznim granicama na kojima su električke potencijalne razlike uzrokovane
distribucijom iona izmeñu dva elektrolita, krutog-tekućeg ili tekućeg-tekućeg.

+ -
I - II
+

α + β - α
+ -
φ1 membrana φ2

otopina I ∆φI ∆φII otopina II

otopina uzorka ΕM = ∆φI - ∆φII unut. otopina ISE

Slika 3. Shematski prikaz elektrokemijske membrane. (pres. 4)

Ako se dvije faze, α i β, nalaze u kontaktu te obje sadrže nabijenu speciju "i", mjera
tendencije gibanja te specije iz faze α u fazu β data je razlikom njezinih elektrokemijskih
potencijala. Elektrokemijski potencijal nabijene specije "i" u datoj fazi (µi) je:
µi = µio + RT ln ai + ziFφ
µio, ai, zi - standardni kemijski potencijal, aktivitet, naboj specije "i", φ − unutarnji potencijal faze.
Svojstva membranske faze su odreñena njezinim sastavom i brzinama kojima sastavnice
penetriraju u membranu. Ako membrana koja dijeli dvije otopine ima kemijska i fizička svojstva
takva da propušta samo jednu vrstu iona da se kreće izmeñu tih otopina i ako su aktiviteti
promatranog iona u dvjema otopinama različiti, onda će termodinamička ravnoteža izmeñu te
dvije otopine biti karakterizirana razlikom njihovih potencijala što daje membranski potencijal.
Zbog razlike aktiviteta iona u te dvije otopine ioni se kreću u smjeru nižeg aktiviteta. Kako oni
nose električki naboj, njihovo kretanje konačno rezultira stvaranjem električnog polja. U
ravnoteži je veličina tog električnog polja takva da će zaustaviti svako daljnje gibanje iona kroz
membranu. Ova se ravnoteža brzo uspostavlja te onemogućuje svaku polaganu interdifuziju
izmeñu dvije otopine (slika 3). Za uspostavljanje ove ravnoteže potrebno je da doñe do
izjednačenja elektrokemijskih potencijala promatrane nabijene čestice "i" u dvjema fazama, pa
se u ravnoteži izmeñu dvije faze, α i β, može pisati:
µi (α) = µi (β)
µio(α) + RT ln ai(α) + ziFφ(α) = µio(β) + RT ln ai(β) + ziFφ(β)

6
Ravnotežna raspodjela naboja na granici rezultirat će stvaranjem potencijalne razlike izmeñu
dviju faza, tj.:
∆φ = φ(β) - φ(α) = ∆φo + (RT/ziF) ln[ai(α)/ai(β)]
∆φ – granični potencijal, ai(α), ai(β) – aktiviteti iona "i" u fazama α i β, ∆φo – konstanta.
Gornja relacija koja opisuje veličinu potencijala na granici faza vrijedi ako u ravnoteži
egzistiraju dvije faze sa zajedničkom nabijenom česticom i.
Distribucija električnog potencijala u membrani može se promatrati ako znamo da je
membrana podijeljena u tri regije: dvije granice membrana-otopina koje su karakterizirane
stvaranjem potencijala na granici (∆φ) i treća regija (unutrašnjost membrane) koja je
karakterizirana difuzijskim potencijalom, zbog gibanja iona za koje je membrana propusna. Za
membranu u sustavu:
otopina I| membrana |otopina II
otopina uzorka unutarnja otopina ISE
može se pisati za dva granična potencijala:
EM = ∆φI – ∆φII
∆φI = ∆φIo + (RT/ziF) ln[ai(I)/ai(mI)]
i
∆φII = ∆φIIo + (RT/ziF) ln[ai(II)/ai(mII)]
Uz uvjet da je difuzijski potencijal jednak nuli, te da su ∆φIo = ∆φIIo i ai(mI) = ai(mII) proizlazi za
membranski potencijal EM:
EM = ∆φI – ∆φII = (RT/ziF) ln [ai(I)/ai(II)]
Budući da je u unutarnjoj otopini ai(II) = konstanta proizlazi za EM:
EM = E' + (RT/ziF) ln ai(I)
EM – membranski potencijal, ai(I), ai(II), ai(mI), ai(mII) – aktivitet iona "i" u otopinama s obje strane membrane i
odgovarajućim slojevima membrane s njima u kontaktu.
Kako se kod ISE aktivitet iona "i" u otopini na referentnoj strani membrane (otopina II)
održava konstantnim, to rezultira konstantnim potencijalom na unutarnjoj granici membrane koji
je zajedno s potencijalom unutarnje referentne elektrode uključen u Eo pa se za potencijal ISE
može pisati Nernstova jednadžba:
EISE = Eo + (RT/ziF) ln ai(I) = Eo + (2,303RT/ziF) log ai(I)
R – plinska konstanta, F – Faradayeva konstanta, T – apsolutna temperatura, ai(I) – aktivitet iona "i" u otopini
uzorka, zi – naboj aktivne čestice u elektrodi, ln 10 = 2,303.
Treba reći da mehanizam ion-selektivnih membrana još nije sasvim razjašnjen.
Permselektivne membrane su uglavnom propusne za ione istog naboja (katione ili anione).
Njihova se selektivnost može postići i stavljanjem sintetskih polimera koji sadrže ionizirajuće
skupine (npr. sulfonsko kisele, kvarterne amonijeve) u poroznu membranu. Zbog privlačenja
iona suprotnog naboja fiksirani naboji na površini pore, kao posljedicu daju difuzijski električni
dvostruki sloj (slika 3). Ako je to područje puno manje od radijusa pore onda ti fiksirani naboji
ne utječu na permeabilnost iona kroz membranu. Ako mu je veličina približno jednaka radijusu
pore ili ako ioni suprotnog naboja potpuno ispune poru tada membrana postaje permselektivna
za ione koji su napunili poru. Tada ioni suprotnog naboja tj. istog naboja kao fiksirani naboj
mogu vrlo teško proći kroz membranu. Tako se mijenjanjem veličine pora ili debljine

7
difuzijskog električnog dvostrukog sloja (promjenom koncentracije elektrolita) mogu mijenjati
svojstva membrane od potpuno propusne za sve ione ("liquid junction") preko permselektivne
(uglavnom propusne za protuione) sve do membrane Donnanovog tipa, tj. one koja potpuno
onemogućuje difuziju nekih iona. Očito su Ej (difuzijski potencijal) i Donnanov potencijal
granične vrijednosti membranskog potencijala. Ako je u pitanju treći slučaj, onda je ukupni
membranski potencijal dat dvjema potencijalima faznih granica i difuzijskim potencijalom u
unutrašnjosti membrane.
Npr. kod odreñivanja Cl- iona može se primijeniti članak (pres. 5):

Hg│Hg2Cl2│zas. KCl│ elektrolitski most║ otopina uzorka│ membrana│0,01 mol dm-3 KCl│AgCl│ Ag

vanjska 1 mol dm-3 Ej I II (unutarnja

ref. ot. LiOAc ili KCl ref. ot.)
referentna elektroda SCE Cl--ISE

EMF ovog članka je:

EMF = Edesne el. – Elijeve el + Ej
EMF = EAgCl,Ag + EM + Ej – ESCE
EM – membranski potencijal koji ovisi o aktivitetu Cl- i HCO3- u I i II.
Sve vrijednosti koje se odnose na unutarnji sastav ISE daju Eo.
Eo se postavlja za svaku elektrodu i eksperimentalno odredi kalibracijom s pogodno odabranom
otopinom II. Eo se mijenja s vremenom kod nekih elektroda, nekad uniformno ("drift"
elektrodnog potencijala). EMF članka ovisi samo o promjeni sastava otopine I, a ne o unutarnjoj
otopini ISE. Takoñer, uz konstantni Ej, možemo pisati:
ECI-ISE = Eo – (RT/F) ln aCl-(I)
EMF = ECI-ISE + Ej – ESCE

2. Selektivnost ISE
Specifičnost je svojstvo da na membranski potencijal utječe samo jedan odreñeni ion u
otopini. Dakle, elektroda je specifična onda kada na njezin potencijal ne utječu druge specije u
otopini uzorka osim one za koju je elektroda selektivna. Selektivnost znači da iako na
membranski potencijal utječe više od jednog iona, ona preferira jednu odreñenu vrstu.
Selektivnost, dakle, je sposobnost razlikovanja izmeñu različitih ionskih vrsti prisutnih u uzorku.
Selektivnost ISE s obzirom na par iona (onaj za koji je elektroda selektivna i
interferirajući) je data koeficijentom selektivnosti, Kij. On izražava u kojoj mjeri strani ion, j,
interferira u normalnom odgovoru elektrode na primarni ion "i". (Kao sinonimi mogu se pojaviti
pojmovi faktor selektivnosti ili konstanta selektivnosti. Preporučuje se termin koeficijent
selektivnosti kao i metoda stalne koncentracije interferenta za njegovo odreñivanje.) Dakle,
potenciometrijski koeficijent selektivnosti definira sposobnost ISE da razlikuje analit od drugih
iona u otopini. Kij se procjenjuje na temelju potencijala ISE u miješanoj otopini analita "i" i
interferirajućeg iona "j" (ili manje poželjno, u odvojenim otopinama). Koncentracije iona "i" i "j"
trebaju biti definirane. Kij računa se prema proširenoj Nikolsky-Eisenmanovoj jednadžbi koja
prikazuje potencijal ISE u prisustvu interferirajućih iona. Dakle, ako se u miješanoj otopini koja
sadrži smetajuće ione "j" i "k" mjeri potencijalna razlika izmeñu ISE koja prvenstveno odgovara
na analit i, i pogodne vanjske referentne elektrode, dobiva se empirijska jednadžba (pres. 12):
EMF = konst + (RT/ziF) ln [ai + Kij(aj)(zi/zj) + Kik(ak)(zi/zk) + .........]

8
gdje konstanta uključuje standardni potencijal ISE, potencijal referentne elektrode i potencijal
granice tekućina. Za ISE smije se pisati:
n
EISE = E + (2,303 RT/ziF) log [ai + ΣKij aj(zi/zj)]
o

j=2
Kij, Kik – koeficijent selektivnosti elektrode za ion "j", "k", u odnosu na ion "i"; ai, aj, ak, zi, zj, zk – aktiviteti i naboji
analita "i", interferenata "j" i "k"; n – ukupni broj iona u otopini.
Što je Kij manji jača je preferencija ISE za analit "i". Gornji izraz vrijedi za membranski
potencijal elektroda osjetljivih na n ionskih specija naboja zj (istog predznaka). Npr. za Cl--ISE
vrijedi:
ECl-ISE = Eo - (2,303RT/F) log [aCl- + KCl-jz- (ajz-)(-1/z-)]
iz koje proizlazi (vidi dolje):
log KCl-jz- = [(ECl- - Ejz-)F/(2,303 RT)] – log (ajz-)(-1/z-) + log aCl-
ECl-, Ejz- – EMF mjerene u 0,1 mol dm-3 NaCl odnosno 0,1 mol dm-3 (Na+)zjz-.
Koeficijent selektivnosti ovisi o uvjetima u otopini i o metodi odreñivanja. U analitičkim
primjenama selektivnost elektrode za neki ion treba biti što veća tako da elektrodni potencijal
ima Nernstovu ovisnost o aktivitetu iona "i" preko što šireg područja aktiviteta. To je slučaj onda
kada je koeficijent selektivnosti Kij za druge ione vrlo mali:
ai >> Kij aj(zi/zj)
Veličina interferencije iona "j" odreñena je umnoškom Kij aj; interferencija je manja ako je Kij
manji. Ako Kij iznosi npr. 0,01 to znači da je ta elektroda 100 puta selektivnija za ion "i" nego
ion "j".
Selektivnost elektrode odreñena je ne samo ionskom pokretljivošću, snagom asocijacije
izmeñu iona, već i ionskom jakosti i odnosom koncentracija. Kod ISE tekućih membrana
selektivnost opada s povećanom ionskom jakosti. Kod krutih membranskih elektroda
(monokristalne, staklene) selektivnost o tome ne ovisi.
Koeficijent selektivnosti može se odrediti mjerenjem ili u odvojenim ili u miješanim
otopinama koje sadrže primarni ion "i" i interferirajući ion "j". Potencijalna razlika ISE članka
mjeri se s dvije odvojene otopine, jednom koja sadrži ion "i" aktiviteta ai (ali ne i ion "j") i
drugom koja sadrži ion "j" u istom aktivitetu aj (ai = aj) (ali ne i ion "i"). Kij računa se iz mjerenja
Ei i Ej (vidi gore). Kada je ai = aj vrijedi:
log Kij = ±[(Ei – Ej)ziF]/(2,303RT)] + [1-(zi/zj)] log ai
ili
±(Ej – Ei/s) = log Kij + [(zi/zj)-1] log ai
zi, zj - naboj iona "i" odnosno "j", s = 2,303RT/ziF.
Ako je Ei = Ej proizlazi (vidi gore):
ai = Kij aj(zi/zj)
Ovu je metodu moguće koristiti samo onda kada ISE pokazuje isti odgovor (nagib), po
mogućnosti Nernstov, za oba iona "i" i "j".
Prema metodi miješanih otopina (metoda stalne smetnje) radi se tako da se mjeri EMF u
otopinama koje sadrže stalnu količinu interferirajućeg iona "j" i promjenjljivi aktivitet primarnog
iona "i". Dobivene vrijednosti se postavljaju u odnos s aktivitetom analita. Sjecište ekstrapolacija
linearnih dijelova ovog grafa indicira aktivitet analita pa se Kij računa iz:

9
 Kij = ai/[aj(zi/zj)]
Kako opada koncentracija primarnog iona, interferencija iona "j" postaje sve jača dok ne
postane potpuna, te električni potencijal postaje konstantan (slika 4). Odsječak ekstrapolirane
Nernstove krivulje s linijom potpune interferencije daje aktivitet primarnog iona "i" prema
kojem se računa koeficijent selektivnosti. Ova se metoda može raditi i tako da koncentracija
primarnog iona "i" bude konstantna a da se varira koncentracija interferirajućeg iona "j".
Ukoliko je Kij < 1 elektroda uglavnom odgovara na ion "i", ako je Kij > 1 odgovara uglavnom na
ion "j".
Na koeficijent selektivnosti osim aktiviteta primarnog i interferirajućeg iona, pokretljivosti
iona, snage asocijacije izmeñu iona, ionske jakosti, osjetljivosti elektrode utječe i vrijeme od
njene priprave do primjene. Koeficijenti selektivnosti za alkalije su u početku povoljniji nego
nakon nekoliko tjedana.
Kod krutih membranskih elektroda koeficijenti selektivnosti odreñuju se iz omjera
produkata topljivosti (vidi str. 14). Kod njih interferirajući ioni reagiraju s membranom na njenoj
površini stvarajući novi netopljivi spoj. Pungor i Tóth postavljaju:
Kij = [Kpti(1/a)]/[Kptj(1/a)] = [(ai)s(b/a)]/[(aj)s(m/n)]
Kpti, Kptj – produkti topljivosti taloga (Ik)a(Ii)b i (Ik)n(Ij)m; (ai)s, (aj)s – aktiviteti primarnog i interferirajućeg iona u
točki koprecipitacije; a,b,m,n, - stehiometrijski koeficijenti taloga u membrani i onog stvorenog tokom reakcije.

t95
Eravn
E (mV)

E95% A B
• Utjecaj raznih aktiviteta Mg 2+ na vrijeme
C odgovora Ca 2+-ISE:
D
• A – čista otopina Ca 2+
• B – uz 10-3 mol l-1 Mg2+
• C – uz 10-2 mol l-1 Mg2+
5 mV • D – uz 5x10-2 mol l-1 Mg2+

t (s)
(mV)
ISE

Nernstov odgovor na ion i

E

Potpuna interferencija
ionom j

ai Aktivitet iona i

Slika 4. Vrijeme odgovora i selektivnost ISE (metoda miješane otopine). (pres. 7)

Tako se za Ag-halogenidnu elektrodu može pisati:

Kij ≈ KptAgi/KptAgj
KptAgi, KptAgj – produkti topljivosti taloga Agi i Agj.

3. Otklon potencijala ISE

10
 Otklon ("drift") elektrodnog potencijala predstavlja polagane neslučajne promjene
potencijala elektrodnog para koje nastaju u otopini konstantnog sastava i temperature. One su
vezane uz promjene u strukturi površine kod krutih membranskih elektroda zbog kontakta s
elektrolitom, i otapanja ionskih izmjenjivača kod tekućih membranskih elektroda, kod kojih taj
otklon može iznositi čak 2 mV na dan. Zapravo, s vremenom se mijenja Eo. To stvara potrebu za
svakodnevnom rekalibracijom ISE.
Procjena otklona potencijala ISE provodi se "fitanjem" pravca dobivenog iz podataka
sakupljenih u odreñenom vremenskom periodu u otopini konstantnog sastava, koncentracije i
temperature. Nagib pravca E vs. t (vrijeme) zove se "drift". Slučajne fluktuacije oko pravca
definiraju standardno odstupanje podataka za potencijal.

4. Temperaturni koeficijent
Promjene temperature mogu dovesti do promjene u potencijalu izmeñu senzorske i
referentne elektrode. Nagib kalibracijske krivulje ISE varira s temperaturom (T), odnosno raste s
porastom temperature. Za korekciju pH vrijednosti koristi se automatska temperaturna
kompenzacija (ATC) koja korigira pH vrijednosti zbog promjene nagiba pravca s promjenom
temperature. ATC se obično koristi uz pH-elektrode:
∆E/∆T = (R/ziF) ln[ai(I)/ai(II)]
Uz promjenu temperature mijenja se topljivost soli (npr. AgCl, Hg2Cl2) što dovodi do
promjene potencijala unutarnjeg referentnog elementa u referentnoj elektrodi. Zato se
preporučuje da se svi uzorci i standardi mjere pri istoj temperaturi.

5. Vrijeme odgovora ISE

Ova je značajka važna uz linearni odgovor i selektivnost ISE. Tekuće elektrode obično
imaju dulje vrijeme odgovora od krutih. Kada se ISE koriste za odreñivanje ionskog aktiviteta
izravnom potenciometrijom vrijeme od nekoliko minuta je prihvatljivo, no kod automatskih i
kontinuiranih mjerenja traži se brzi odgovor.
Vrijeme odgovora odreñuje se mjerenjem EMF u funkciji vremena kada se ISE uroni u
ispitivanu otopinu. Vrijeme odgovora je vremenski interval u kojemu elektroda postiže razliku
potencijala od ½(E1 – Est) (E1 je početni potencijal, Est konačni potencijal nakon uravnoteženja).
Osim kao t50 tj. kao vrijeme za postizanje 50% ravnotežne vrijednosti potencijala (slika 4):
t50= ln 2/k
k – konstanta brzine reakcije otapanja.
neki ga definiraju kao vrijeme za postizanje 95% ravnotežnog potencijala (t95) nakon brze
promjene aktiviteta iona (slika 4). Preferira se definicija stvarnog vremena odgovora, kao
vremena koje protekne izmeñu trenutka kada su ISE i vanjska referentna elektroda stavljene u
kontakt s otopinom uzorka (ili trenutka kada se promijeni koncentracija ispitivanog iona) i prvog
momenta kada nagib E vs. t postane 0,1 mV min-1.
Vrijeme odgovora iste elektrode različito je u miješanim i u nemiješanim otopinama i za
razne brzine miješanja. Ono je kraće uz miješanje otopine i u otopinama niže viskoznosti.
Vrijeme odgovora može se odrediti uranjanjem elektrode u otopinu koja sadrži odreñenu
koncentraciju iona koji utječe na potencijal. Injekcijska metoda temelji se na injiciranju
koncentrirane otopine u miješanu otopinu čime se inducira brza promjena koncentracije iona.
Ovisnost potencijala o vremenu je eksponencijalna; nakon promjene koncentracije prava se
vrijednost potencijala asimptotski približava stvarnoj vrijednosti (slika 4).

11
 Vrijeme odgovora ovisi o tipu elekrode, veličini i smjeru promjena koncentracije,
temperaturi i prisutnosti interferencija. Neki interferirajući ioni produljuju to vrijeme. Pokazalo
se da i uz vrlo povoljan koeficijent selektivnosti utjecaj interferirajućih iona na vrijeme
odgovora može biti značajan (slika 4).
Kod krutih ionsko izmjenjivačkih elektroda npr. kod Ag2S-ISE vrijeme odgovora iznosi 1
ms, dok je kod tekućih ono dulje, nekoliko sekundi ili nekoliko minuta. Većina elektroda pod
uobičajenim uvjetima pokazuje 90% konačne vrijednosti potencijala u roku od 1 minute. Neki su
autori našli da je vrijeme odgovora Ag-halogenidnih elektroda neovisno o debljini membrane.
Kada se mjeri vrijeme odgovora važno je navesti eksperimentalne uvjete, tj. miješanje ili
brzinu protoka, ionsku koncentraciju i sastav otopine, ionsku koncentraciju i sastav otopine s
kojom je elektroda bila u kontaktu prije sadašnjeg mjerenja, prethodnu upotrebu i prethodno
kondicioniranje elektrode, temperaturu.

6. Pamćenje elektrode
Efekti memorije dogañaju se nakon što je promijenjena koncentracija otopine i vraćena na
izvornu vrijednost; tada se uočava razlika u vrijednosti potencijala. Nastaje sustavna pogreška
koja je usmjerena prema koncentraciji otopine u koju je elektroda bila ranije uronjena, a
narušava se i preciznost mjerenja elektrodom.
7. Osjetljivost, ispravnost i preciznost mjerenja ISE
Prema Nernstovoj jednadžbi koja matematički opisuje ponašanje elektrode:
E = Eo + (2,303RT/ziF) log ai
faktor 2,303RT/ziF predstavlja Nernstov faktor koji ovisi o temperaturi te kod 25 oC iznosi
±59,16 mV za jednovalentne, odnosno ±29,58 mV za dvovalentne ione. Kada se postavi grafička
ovisnost potencijala elektrode o aktivitetu odreñivanog iona u standardnim otopinama
(kalibracijska krivulja) iz koje se odreñuje aktivitet iona u uzorku, ona treba u što širem
koncentracijskom području pokazivati linearnost odgovora s nagibom pravca od ±59,16 mV za
deseterostruku promjenu aktiviteta jednovalentnog iona, tj. Nernstov odgovor ili teorijski nagib
(slika 5). Niži nagibi tj. snižena osjetljivost nastaje zbog prisutnih interferencija ili ako tekuća
membrana zahtijeva zamjenu. Veći nagibi su rijetki i ukazuju da se dogaña više od jednog
elektrodnog procesa. Povišenje temperature može dovesti do povećanja nagiba.
Linearnost odgovora kreće se kroz 4-8 redova veličine. Npr. za Cl--ISE su nagibi
kalibracijske krivulje dobiveni iz grafova EMF vs. log aCl- postupkom regresije u
koncentracijskom području 10-4-10-1 mol dm-3 KCl.
EISE (mV)

(log) konc. iona (mol

-3

Slika 5. Funkcija EISE vs. koncentracija iona. (pres. 9).

12
 Osim nagibom kalibracijskog pravca ISE je karakterizirana i granicom dokazivanja, kao
najnižom koncentracijom iona koja se može razlikovati od nulte koncentracije. Granica
dokazivanja je odreñena topljivošću aktivne komponente membrane u otopini. Njezina
vrijednost je 3-10 puta niža od donje granice linearnosti. Spušta se obično do 10-8 mol dm-3 (kod
Pb2+, Cd2+, Ag+, S2-) ili čak 10-9 mol dm-3 (Cu2+), pa čak kod Ag2S elektrode do 10-12 mol dm-3
Ag+, kod Cu-elektrode do 10-17 mol dm-3 Cu2+, a kod Pb i Cd elektroda do 10-10 mol dm-3 Pb2+
odnosno Cd2+.
Ispravnost potenciometrijskih mjerenja ovisi o konstantnosti Ej, kada se standardna otopina
zamijeni otopinom uzorka. Rezidualni Ej, ∆Ej, koji proizlazi iz razlike Ej na granici KCl
most│stand. Otopina, i KCl most│uzorak predstavlja glavno ograničenje ispravnosti mjerenja
aktiviteta iona. Zato je važno provesti kalibraciju elektrode sa standardima čiji su sastav i ionska
jakost što bliži uzorku. Osim toga, kako uzorci vrlo često variraju po sastavu, dodaju se sredstva
za podešavanje ionske jakosti u uzorak i u standard da bi se postigla konstantna ukupna ionska
jakost elektrolita i maksimalno smanjile fluktuacije Ej i varijacije koeficijenta aktiviteta mjerenih
iona. Npr. kod odreñivanja F- koristi se TISAB∗, pufer koji podešava pH, uspostavlja konstantnu
ionsku jakost te maskira nekoliko smetajućih iona. Zatim, greška može proizaći i iz "drifta"
potencijala pa je zato potrebna česta rekalibracija ISE članka. Relativna pogreška procjene
koncentracije u % iznosi:
% greške = 100∆ci/ci ≈ 4│zi│∆E
∆ci – greška odreñivanja koncentracije, zi – naboj iona, ∆E – greška mjerenja potencijala.
Izvori pogreške mogu biti difuzija, promjenjljiva ionska jakost, temperatura, pH i
interferenti. Razlike u brzini difuzije iona zbog veličine mogu dovesti do pogreške u rezultatu.
Npr. kod NaJ, Na+ difundira kroz granicu nekom brzinom, a J- sporije zbog većih dimenzija. Ova
razlika stvara dodatni potencijal koji rezultira pogreškom. Da bi se ta pogreška kompenzirala
važno je imati slobodan protok kroz granicu te da se granica ne zabrtvi ili ne onečisti. Ukupna
ionska jakost uzorka utječe na koeficijent aktiviteta te je važno da ona bude konstantna. Da bi se
to postiglo koriste se podešavači ionske jakosti. Varijabilnost temperature dovodi do pogreške
mjerenja veće od 4% pa ispravna mjerenja treba raditi pri kontroliranoj temperaturi. Neki uzorci
zahtijevaju prevoñenje analita u neki oblik podešavanjem pH otopine (npr. NH3). Ako se ovo
podešavanje ne provodi ispravno može doći do značajnih pogrešaka mjerenja. Matrica uzorka
može utjecati na ispravnost mjerenja s ISE. Neke interferencije mogu se izbjeći maskiranjem
interferenata prije mjerenja.
Preciznost ovisi o temperaturi, "driftu" potencijala, šumu i brzini miješanja. Ona se
procjenjuje na temelju standardne devijacije nekoliko konačnih vrijednosti potencijala. Da se
dobije tražena preciznost treba koristiti osjetljivi voltmetar koji odgovara na 0,1 mV. Uz čestu
kalibraciju ISE može se postići ponovljivost od ±2%.

VRSTE ION-SELEKTIVNIH ELEKTRODA

Klasifikacija ISE koja slijedi nastoji sažeti različite pristupe. Prema nekim izvorima
elektrode se dijele na kristalinične (homogene i heterogene) i nekristalinične kamo spadaju
staklene elektrode i elektrode s pozitivno ili negativno nabijenim ionima, s nenabijenim
nosačima ili s hidrofobnim ionskim parovima; prema drugima dijele se na krute membranske
(uključujući i staklene) i elektrode tekućih membrana. Prema fizičkim značajkama materijala

∗
TISAB - Total Ionic Strength Adjustment Buffer (održava pH 5.5, sadrži kelatirajući agens koji onemogućuje
interferenciju viševalentnih kationa, npr. Fe3+, Al3+, odnosno nastajanje njihovih kompleksa s F-).

13
membrane ISE se dijele na one s fiksiranim ionsko-izmjenjivačkim mjestima i one s pokretljivim
ionsko-izmjenjivačkim mjestima.

1. ISE s fiksiranim ionsko-izmjenjivačkim mjestima u membrani

To su ISE krutih membrana i kristalinične elektrode (homogene i heterogene). Uz staklene

elektrode tu spadaju i membrane načinjene od neporoznih materijala: taloga, čistog ili miješanog
kristala praktički netopljivih u kontaktu s elektrolitom, ili kristaliničnih supstancija
inkorporiranih u inertni polimerni matriks. Komercijalno mogu se dobiti za slijedeće ione: Cd2+,
Cu2+, Cl-, Br-, J-, F-, Pb2+, Ag+, S2-, CN-, CNS-, Na+ (slika 6).

A B
3
4

• A – Staklena elektroda: 1 – staklena

membrana, 2 – unutarnja referentna
otopina, 3 – unutarnja referentna elektroda,
4 – stakleno tijelo
• B – Elektroda s homogenom krutom
2 membranom: 1 – homogena kruta
1 membrana, 2 – unutarnja referentna
otopina, 3 – unutarnja referentna elektroda,
4 - elektrodno tijelo
C 3 D
• C – Elektroda s heterogenom krutom
4 membranom: 1 – heterogena kruta
membrana, 2 – unutarnja referentna
otopina, 3 – unutarnja referentna elektroda,
4 – elektrodno tijelo
• D – Selektroda: 1 - ion-senzitivna površina
(”membrana”), 2 - grafitna peleta
hidrofobizirana s teflonom, 3 – kontakt od
nerñajućeg čelika, 4 – teflonska cijev

2
1

E F
• E – Elektroda s tekućom membranom: 1 –
porozna membrana impregnirana tekućim
ionskim izmjenjivačem, 2 – unutarnja
referentna otopina, 3 – unutarnja referentna
elektroda, 4 – elektrodno tijelo, 5 – tekući
ionski izmjenjivač, 6 – cijev koja nosi
unutarnju referentnu otopinu
• F – Enzimska elektroda: 1 – staklena
membrana, 2 – unutarnja referentna
otopina, 3 – unutarnja referentna elektroda,
4
4 – elektrodno tijelo, 5 - enzimski sloj
3
2 5
5
6 1
G
1
• G – Plinska elektroda: 1 – vanjska
referentna elektroda, 2 – Ion-selektivna
elektroda, 3 - unutarnja otopina, 4 –
membrana propusna za plin

3 3
4

Slika 6. Shematski prikaz različitih tipova ISE. (pres. 10)

14
a) Homogene membranske elektrode načinjene su iz čistih kristala, monokristala, teško
topljivih kristaliničnih supstancija ili rastaljenih soli, kao prešani pelete sitno usitnjenog
materijala, ili keramički sustav dobiven sintrovanjem i vrućim prešanjem. U njima je membrana
kristalinični materijal pripravljen iz jednog spoja ili homogene smjese spojeva (npr. Ag2S,
AgJ+Ag2S). Ove membrane su pripravljene iz netopljive anorganske soli koja je električki vodič.
Membrana treba biti neporozna, mehanički čvrsta, te netopljiva u vodi. Obično se zovu krute
elektrode i obično mjere ione poput F-, Br-, Cd2+, Cl-, Cu2+, CN-, J-, Pb2+, Ag+, SO42-, SCN-. Npr.
membrana za F- je izrañena iz čistog kristala LaF3 s europijem radi smanjenja električnog otpora.
F- ion je nositelj naboja u membranskoj fazi prema pretpostavljenom mehanizmu:
LaF3 + molekulska šupljina → LaF2+ + F-
Ove elektrode pokazuju Nernstov odgovor na aktivitet F- u koncentracijskom području 1-10-6
mol dm-3. Granica dokazivanja može se sniziti u čistim otopinama NaF. Jedina ozbiljna
interferencija je ona OH- iona pa se upotrebljivo područje elektrode kreće od slabo kiselih do
neutralnih otopina.
b) Heterogene membranske elektrode načinjene su iz elektroaktivne supstancije koja je
inkorporirana u inertni matriks (pogodni polimer: silikonska guma, parafinski vosak, celofan,
polietilen, PVC) tvoreći senzibilnu membranu. Senzor je kristalinična supstancija koja je teško
topljiva, kompatibilna s matriksom koji je inertan i hidrofoban, ne bubri u otopinama i dobro drži
čestice aktivnog senzora. Tu spadaju prešane pelete izrañene iz smjese Ag-halogenida ili sulfida
dvovalentnih teških metala uz dodatak Ag2S radi povećanja vodljivosti. Takoñer, ovamo spadaju
i keramičke membrane načinjene iz smjese sulfida teških metala. Ag-halogenidi spadaju meñu
malobrojne kristale koji pokazuju visoku ionsku vodljivost i to mehanizmom defekta rešetke, pri
čemu pokretljivi nositelj naboja (Ag+) koji se nalazi u blizini šupljine ulazi u nju.
Npr. potencijal halogenidne elektrode je:
EISE = Eo – (2,303RT/F) log ai
Kada su istovremeno prisutni razni halogenidi u uzorku selektivnost membrane odreñena je
odnosom produkata topljivosti soli promatranog iona "i" i interferirajućeg iona "j" (vidi
jednadžbu za Kij na str. 10).
Veliki otpor i neželjeni fotoelektrički efekti Ag-halogenida mogu se reducirati korištenjem
Ag-halogenida u smjesi s Ag2S koji je teže topljiv nego bilo koji Ag-halogenid. Njegovo
prisutnosti povećava vodljivost membrane bez utjecaja na njezin odgovor na halogenide.
c) Staklene elektrode su ISE u kojima je senzitivna membrana tanki komad specijalnog
stakla. Kemijski sastav stakla odreñuje selektivnost membrane. Staklo koje reagira na H+ ion je
prvi materijal upotrebljen u ISE.
Za pH staklene elektrode nañeno je da se uzduž tanke staklene membrane stavljene izmeñu
dvije otopine različitog pH stvara potencijalna razlika. Za mjerenja pH, aktivitet H+ u jednoj
otopini mora se održavati konstantnim. Staklena pH elektroda sastoji se iz tanke staklene
membrane, otopine stalnog pH i referentne elektrode, te se kombinira s vanjskom referentnom
elektrodom (najčešće SCE) dajući elektrokemijski članak (slika 7). pH-osjetljiva membrana se
puše ili stavlja na kraj staklene cijevi i dobiveni mjehur sadrži otopinu konstantnog pH (najčešće
0,1 mol dm-3 HCl). Debljina membrane iznosi 0,03-0,1 mm. Unutarnja referentna elektroda je
Ag/AgCl elektroda.
Za prvu staklenu elektrodu zaslužan je Max Cremer koji ju je opisao 1906., a 1949. G.
Perley je publicirao rad o odnosu sastava stakla i pH funkcije.

15
 Treba reći da sve staklene membrane ne pokazuju odgovor na pH. Tako su kvarcno i pyrex
staklo neosjetljivi na varijacije pH. Dugo korišteno staklo (Corning 015 staklo) sastava 22%
Na2O, 6% CaO i 72% SiO2 pokazivalo je specifičnost prema H+ do pH ≈ 9; kod viših pH
membrana postaje osjetljiva na natrij i druge alkalije. Ova alkalna pogreška uzrokuje pH
vrijednosti niže za nekoliko desetinki pH jedinice. Alkalna greška može se izbjeći korištenjem
stakla u kojem je natrij zamijenjen litijem.

staklena pH-elektroda: staklena elektroda:

Kiz Kiz
H+ ot + Na+ st- ⇄ Na+ ot + H+ st- B+ ot + Na+ st- ⇄ Na+ ot + B+ st-

suhi sloj stakla

vanjska otopina (I) hidratizirani gel hidratizirani gel unutarnja otopina (II)
sva mjesta okupirana s
površinska mjesta mjesta okupirana Na + mjesta okupirana površinska mjesta
okupirana s H+ s H+ i Na+ s H+ i Na+ okupirana s H+
[H+] = ai(I) [H+] = ai(II)
~10-4 mm ~0.1 mm ~10-4 mm

E1 staklena membrana E2

Slika 7. Shematski prikaz natopljene staklene membrane (ot - otopina, st – staklo). (pres. 11)

Pokazalo se da površine staklene membrane trebaju biti hidratizirane da bi funkcionirale

kao pH elektrode, pa nehigroskopna stakla ne pokazuju pH funkciju. Kada se staklena elektroda
nalazi u otopini molekule vode penetriraju u membranu i stvara se hidratacijski sloj koji
povećava brzinu kretanja kationa prema unutrašnjosti membrane. Hidratacija membrane vezana
je s reakcijom zamjene kationa stakla s protonima iz otopine. Reakcija ionske izmjene može se
pisati kao:

H+ + Na+st- ⇄ Na+ + H+st-

otopina krutina otopina krutina
Penetracijom vode u krutinu stvara se sloj gela silicijeve kiseline koji s vremenom dostiže
debljinu od 10-4 do 10-5 mm. Na vanjskoj površini gela sva su fiksirana jednostruko nabijena
mjesta okupirana s H+ ionima. Prema unutrašnjosti broj H+ opada, a raste broj Na+ (slika 7).
Potencijal uzduž staklene membrane sastoji se od graničnih potencijala i difuzijskog
potencijala, te je pod idealnim uvjetima samo prvi pod utjecajem pH. Granični potencijali su
potencijali na granicama gel-vanjska otopina i gel-unutarnja otopina. Membranski potencijal je
razlika graničnih potencijala (vidi str. 7):
EM = ∆φI – ∆φII = ∆φIo + RT/F ln ai(I)/ai(mI) - [∆φIIo + RT/F ln ai(II)/ai(mII)]
Ako dvije gel površine imaju isti broj mjesta s kojih protoni mogu odlaziti, tada su ∆φIo = ∆φIIo =
konst, ai(mI) = ai(mII), ai(II) = konst, pa vrijedi:
EM = RT/F ln ai(I)/ai(II) = E' + RT/F ln ai(I)
EM – potencijal staklene membrane, ∆φI, ∆φII – granični potencijali na granici gel-vanjska otopina odreñen
aktivitetom H+ u vanjskoj otopini i na odgovarajućoj površini gela, i granici gel-unutarnja otopina odreñen s H+ u
unutarnjoj otopini i odgovarajućoj površini gela, ai(I), ai(II) – aktivitet H+ u otopinama sa svake strane gela
(membrane), ai(mI), ai(mII) – aktivitet H+ u svakom odgovarajućem sloju gela (membrane) koji je u kontaktu s
otopinom.
U oba sloja gela stvara se i difuzijski potencijal zbog razlike u pokretljivosti H+ i alkalnih
iona u membrani. Kako su oba difuzijska potencijala jednaka i suprotnog predznaka onda je čisti

16
difuzijski potencijal nula pa membranski, odnosno elektrodni potencijal ovisi samo o graničnom
potencijalu:
EpH-el = Eo + RT/F ln aH+
Ako se sa svake strane membrane stave identične otopine i identične referentne elektrode i
ako obje površine membrane imaju ista svojstva onda bi mjerena EMF članka trebala biti nula.
Ipak se javlja mali potencijal (asimetrični potencijal) zbog mehaničkih ili kemijskih onečišćenja
vanjske površine, njezine kontaminacije masnoćom ili adsorbiranim supstancijama. Ovaj utjecaj
na mjerenje pH može se eliminirati čestom kalibracijom elektrode s puferom poznatog pH.
Alkalna greška – Neke staklene membrane u otopini niske koncentracije H+ (pH > 9) ne
odgovaraju samo na promjene koncentracije H+ već i alkalija. pH greška je negativna jer
elektroda odgovara na Na+ ione kao i na H+. Svi jednovalentni kationi uzrokuju ovu grešku čija
veličina ovisi o vrsti iona "i" sastavu stakla. Ona se objašnjava na temelju ravnoteže izmjene
izmeñu H+ na površini stakla i kationa u otopini, s konstantom ravnoteže Kiz (vidi dolje). Kada
su aktivna mjesta na površini okupirana drugim kationima osim H+ mijenja se ne samo granični
već i difuzijski potencijal. Zato modificirana jednadžba glasi:
EpH-el = Eo + (RT/F) ln [aH++Kiz(tB+/tH+)aB+] = Eo + (RT/F) ln [aH++Kij aB+]
tB+, tH+ - pokretljivost B+ odnosno H+ u gelu; aH+, aB+ - aktivitet H+ odnosno B+, Kij – koeficijent selektivnosti.
Kod mnogih stakala je izraz Kiz(tB+/tH+)aB+ mali u odnosu na aH+ sve dok je pH < 9 pa se
može zanemariti i primijeniti jednostavnija jednadžba. Kod viših pH ovaj izraz igra važnu ulogu
pri odreñivanju EpH-el. Veličinu ovog izraza odreñuje i sastav stakla te je on mali kod stakala koja
su dizajnirana za rad u alkalnim otopinama (npr. Beckman type E glass electrode).
Kisela greška – U otopini s pH < 1 staklena elektroda pokazuje pozitivnu pogrešku. Veličina
ove greške je nerazjašnjena i ovisi o nizu faktora.
Selektivnost – Stakla funkcioniraju kao tipični kationski izmjenjivači, tj. staklo se smatra
kompaktnom ionsko-izmjenjivačkom membranom. Ona sadrži nepokretna anionska mjesta
odreñene koncentracije pri čemu svako mjesto nosi jedinični negativni naboj i meñusobno su
ekvivalentna. Ako membrana odvaja otopine koje sadrže dva jednovalentna kationa i+ i j+ na
površini membrane odigrava se izmjena:
Kiz
j (ot) + i (mem) ⇄ j+(mem) + i+(ot)
+ +

Selektivnost membrane za neki ion ovisi o konstanti ravnoteže Kiz te pokretljivosti t, i+ i j+, u
membrani:
Kij = Kiz (tj/ti) = Kiz (tB+/tH+)
Pokazalo se da što je neki ion jače favoriziran od strane krutog izmjenjivača on se sporije kreće u
membrani što čini jedno od ograničenja selektivnosti krutih ionskih izmjenjivača.
d) Staklene elektrode za druge katione - Nañena su stakla takvogsastava kod kojih je izraz
Kiz(tB+/tH+)aB+ povećan tako da se aH+ smije zanemariti. Pod tim uvjetima potencijal elektrode
biti će neovisan o pH ali će se mijenjati s pB+ na isti način. Niz istraživača pokazao je da
prisutnosti Al2O3 ili B2O3 u staklu dovodi do traženih efekata. Eisenman i sur. sustavno su
ispitivali stakla koja sadrže Na2O, Al2O3 i SiO2 u raznim omjerima. Kod stakala s Al2O3 kod pH
> 5 potencijal postaje neovisan o pH tj.:
aH+ << Kiz (tB+/tH+) aB+
što ima za posljedicu da se potencijal linearno mijenja s pNa+, pK+ ili pLi+. Takvo se staklo
može koristiti za mjerenje koncentracije ovih iona.

17
 Tako se došlo do kationskih staklenih elektroda za Na+, K+, NH4+, Rb+, Cs+, Li+ i Ag+.
Treba reći da ove elektrode uglavnom pokazuju slabu selektivnost (osim pH- i Na+-elektrode).
Ipak su K+ staklene mikroelektrode našle široku primjenu za mjerenje unutarstaničnog K+. Iako
je selektivnost takve elektrode slaba (Kij ≈ 0,1) niske koncentracije Na+ u stanici ozbiljno ne
smetaju.

2. ISE s pokretljivim ionsko-izmjenjivačkim mjestima u membrani

To su ISE tekućih membrana (nekristalinične elektrode). Neki autori ovamo svrstavaju i
staklene elektrode. Kod njih se membrana sastoji od matrice koja sadrži neki organski ionski
izmjenjivač ili kelatirajući agens i obično je postavljena izmeñu dviju vodenih otopina. U ovom
slučaju elektroaktivna supstancija, tekući organski ionski izmjenjivač s kiselim, bazičnim ili
kelatirajućim skupinama, otopljen je u organskom otapalu odnosno membranskom otapalu koje
se ne miješa s vodom. Ovakva se otopina stavlja (u poroznoj dijafragmi, sintrovanom staklu,
omekšivaču ili polimernom filmu) izmeñu dvije otopine elektrolita. Matriks može biti porozan
(npr. celulozni ester) ili neporozan (npr. inertni polimerni materijal kao PVC). Aktivna
supstancija sposobna je izvršiti zamjenu s ionima iz otopine s kojima je u kontaktu preko inertne
porozne membrane. Kada takva membrana sadrži dovoljnu koncentraciju ionizirajuće specije
koja je prvenstveno topljiva u membranskoj fazi (npr. masna kiselina ili alifatski amin) ona
djeluje kao tekući ionski izmjenjivač koji se razlikuje od krutih ionskih izmjenjivača jer je
ionsko-izmjenjivačka sastavnica slobodna da se kreće unutar membrane. Tekući ionski
izmjenjivač je u kontaktu s uzorkom ali se miješanje faza mora svesti na minimum. On mora biti
visoke viskoznosti da se spriječi njegov brzi gubitak, mora biti stabilan i visokog ionsko-
izmjenjivačkog kapaciteta.
Aktivna supstancija u membrani je ili asocijat ili elektroneutralna sol mjerenog iona sa
suprotno nabijenim ionom, tj. ionsko-izmjenjivačkim mjestom, koji je topljiv u membrani. No to
može biti i kompleks primarnog iona s nabijenim ligandom ili nenabijenim makrocikličkim
spojem. Molekule asocijata kreću se kroz membranu te se na granici dogaña ionska izmjena
izmeñu iona asocijata u organskoj fazi i slobodnog iona u otopini. Selektivnost takve membrane
za primarni ion će u principu ovisiti o tome da li se stvara stabilniji kompleks s primarnim
ionom ili s interferirajućim ionom. Problem nastaje zbog postupnog gubitka ionskog
izmjenjivača njegovim otapanjem u ispitivanoj otopini. S obzirom na to da je punjenje pora
dijafragme otopinom ionskog izmjenjivača teško izvedivo, pristupa se punjenju polimernih
filmova otopinom ionskog izmjenjivača (PVC, celuloza acetat, kolodion). Otapalo kojim je
membrana zasićena mora biti netopljivo u vodi, niskog tlaka para, visoke viskoznosti da ne
proñe kroz membranski skelet. Otapalo treba imati nisku dielektričnu konstantu i visoku
relativnu molekularnu masu. Ove membrane selektivno vežu male ione iz vodene faze i
izmjenjuju ih uzduž membrane stvarajući električki potencijal.
Neki tipični analiti su: NH4+, Ca2+, Cl-, BF4-, NO3-, ClO4-, K+, ioni u vodi, pa su takve
elektrode i komercijalno dobavljive za analizu Ca2+, Cu2+, fluoroborata, NO3-, ClO4-, K+, tvrdoće
vode, Cl-.
a) Elektrode s nabijenim ligandima u membrani
I ovdje vrijedi da granični potencijali membrane s otopinom uzorka odnosno referentnom
otopinom ovise o aktivitetima odgovarajućih iona u otopini odnosno ionsko-izmjenjivačkoj
tekućini membrane pa proizlazi:
EISE = Eo + (RT/ziF) ln ai(I)
ai(I) - aktivitet iona "i" u otopini uzorka.

18
 Pozitivno nabijeni hidrofobni kationi, npr. kvarterne amonijeve soli ili soli kompleksa
prijelaznih metala s ligandima kao što su derivati 1,10-fenantrolina, kada su otopljeni u
pogodnom organskom otapalu i fiksirani u inertnoj podlozi (npr., celulozni ester ili PVC) daju
membrane koje su osjetljive na promjene aktiviteta aniona. Negativno nabijeni hidrofobni
anioni, npr. tipa (RO)2PO2- ili veliki anioni npr. tetrakis(p-klorofenil) borat, kada su otopljeni u
pogodnom otapalu i fiksirani u inertnom nosaču, npr. celuloznom esteru ili PVC-u, daju
membrane koje su osjetljive na aktivitet kationa.
Prema nekim autorima u elektrode s pokretljivim nabijenim mjestima spadaju i one s
hidrofobnim ionskim parovima koje sadrže otopljeni hidrofobni ionski par u plasticiziranom
PVC-u (npr. kationski lijek s tetrafenilboratom, ili s tetraalkilamonijum površinski aktivnim
anionom). One odgovaraju na aktivitete komponenata u otopini, koja npr. sadrži klorid
kationskog lijeka ili natrijevu sol površinski aktivne tvari.
Ovamo spada i Ca2+ elektroda temeljena na otopini Ca-di-(n-decil) fosfata u
dioktilfenilfosfatu u PVC matriksu (Orion) ili Ca2+-ISE temeljena na Ca-kelatu s di-(n-oktilfenil)
fosfornom kiselinom u PVC membrani. Potonja je bolja od prve jer pokazuje nižu osjetljivost
prema H+ i Na+. K+-elektroda temelji se na ionsko-izmjenjivačkim svojstvima K-soli s
tetrafenilboratom. Njezina selektivnost prema K+ u usporedbi s Na+ relativno je slaba (KK+,Na+ =
1,2x10-2) ali je znatno bolja od staklene K+-elektrode.
b) Elektrode s električki neutralnim ligandima u membrani
One se temelje na otopinama molekulskih liganada, npr. antibiotika, makrocikličkih
spojeva ili drugih sekvestrirajućih agenasa te se mogu koristiti u pripravi membrana sa
selektivnošću za katione. Aktivna ionsko-kompleksirajuća sastavnica može biti neki
makrociklički spoj (ciklički depsipeptidi, makrotetrolidi, sintetski polieteri tzv. krune), koji ima
mogućnost stvaranja vrlo stabilnih kompleksa, s nekim alkalijama i NH4+ ionima, topljivim u
ulju. Naboj nastalog 1:1 kompleksa je +1. Jedan od takvih liganada je valinomicin (sastavljen iz
36 α-amino i α-hidroksi alifatskih kiselina vezanih u prsten). Na njemu se temelji K+-elektroda.
Vezanjem K+ struktura valinomicina se mijenja u karakterističnu cilindričnu u kojoj su polarne
skupine usmjerene prema centru molekule te čine okolinu energetski sličnu onoj solvatiziranog
K+. U kompleksu je nesolvatizirani K+ u centralnoj šupljini cilindrične molekule, a vanjski
omotač čine nepolarne lipofilne skupine koje omogućuju topljivost stabilnog kompleksa u
otapalima niske ε. Valinomicin može biti otopljen u organskom otapalu (difenileter,
nitrobenzen) ili inkorporiran kao kruta supstancija u polimerni matriks (PVC, poliuretan,
silikonska guma). Ove elektrode pokazuju Nernstov odgovor prema K+ i uz suvišak Na+ (KK+,Na+
10-3). Ako je otopljeni elektroneutralni makrociklički spoj V teško topljiv u vodenoj otopini oko
membrane, a stvara komplekse s ionima i+ i j+ vrijedi (pres. 12):

i+ + V ⇄ iV+

j+ + V ⇄ jV+
te nakon pojednostavljenja proizlazi:
EISE = Eo + (RT/ziF) ln [ai + (tjV+kjV+KjV+/tiV+kiV+KiV+)aj] =
Eo + (RT/ziF) ln [ai + (KjV+/KiV+)aj]
tjV+, tiV+ - pokretljivosti kompleksa u membrani, kjV+, kiV+ - koeficijenti razdjeljenja kompleksa, KjV+, KiV+ - konstante
stabilnosti kompleksa.
Pokretljivosti ovih kompleksa ovise o njihovoj veličini koja je praktički jednaka jer je odreñena
veličinom makrocikličkog spoja, kjV+/kiV+ ≈ 1 i neovisan je o membranskom otapalu jer se
kompleksi ne razlikuju po veličini i naboju. Proizlazi da će koeficijent selektivnosti biti dat kao:

19
 Kij ≅ KjV+/KiV+
tj.
EISE = Eo + (RT/ziF) ln (ai + Kij aj)
Selektivnost elektrode može se povećati pravilnim izborom membranskog otapala.

NEKE POSEBNE VRSTE ISE (pres. 13)

1. Enzimske elektrode

To su specifične ionske ili pH-elektrode prekrivene slojem koji sadrži enzim koji reagira s
organskim supstratom uz oslobañanje iona za koje je elektroda specifična. Iako ih se teško
pripravlja zbog nestabilnosti enzima tvornički se rade enzimske elektrode za glukozu, ureu,
aminokiseline i amigdalin. Mjerenja se mogu raditi i tako da se enzim dodaje u uzorak te se
mjeri osloboñeni ion pogodnom elektrodom. Glavni problem ovih elektroda je slaba selektivnost
staklenih elektroda i pad koncentracije enzima otapanjem uzorka. One su vrlo važne u organskoj
analizi i biokemiji (vidi sliku 6, vidi str. 31).

2. Plinske elektrode
Plin propusne elektrode mjere otopljene plinove poput NH3, CO2, N-oksida, O2. Molekula
plina difundira kroz membranu i reagira s otopinom. Ovo je vjerojatno druga najčešće korištena
elektroda iza pH elektrode (vidi sliku 6, vidi str. 32).
Izgrañene su iz unutarnjeg referentnog elementa i unutarnjeg senzitivnog elementa, te
membrane koja je dobro propusna za plin. Plin prolazi kroz ovu membranu sve do uravnoteženja
tj. izjednačenja njegove koncentracije u otopini uzorka i u unutarnjoj otopini. Prolaskom plina
kroz membranu on se otapa u unutarnjoj otopini pri čemu se mijenja koncentracija neke ionske
specije, a to se detektira odgovarajućim senzitivnim elementom. Kako se otapanjem plina vrlo
često mijenja pH unutarnje otopine (oslobañanjem H+ ili OH-) ova promjena pH mjeri se
unutarnjom staklenom pH elektrodom. Meñutim, to može biti i Pt (redoks), F-, Ag+, S2-
elektroda, itd.

Npr.: NH3 + H2O ⇄ NH4+ + OH-

CO2 + H2O ⇄ HCO3- + H+

SO2 + H2O ⇄ HSO3- + H+

Cl2 + H2O ⇄ 2H+ + ClO- + Cl-

-1e
+1e

2NO2 + H2O ⇄ NO3- + NO2- + 2H+

-1e
+1e

H2S + H2O ⇄ HS- + H3O+

Ove elektrode pokazuju Nernstov odgovor, a vrijeme odgovora ovisi o brzini difuzije plina
tj. značajkama membrane i sastavu unutarnje otopine. Nadalje, ovdje su izbjegnute mnoge
interferencije. Komercijalno mogu se dobiti plinske elektrode za NH3 (i NH4+) (u biološkim
uzorcima, krvna plazma, urin, feces), za CO2 (i CO32-, HCO3-) (biološki uzorci), SO2 (i SO32-,

20
HSO3-), NO i NO2 (i NO2-), H2S (i S2-, HS-), HCN (i CN-), HF (i F-), CH3COOH (i CH3COO-),
Cl2 (i OCl-, Cl-).

3. Redoks elektrode
To su metalne elektrode, obično od Pt, koje se koriste za praćenje reverzibilnih
oksidacijsko-redukcijskih reakcija. Potencijal koji se stvara izmeñu redoks elektrode i referentne
elektrode je Nernstova funkcija omjera aktiviteta specija u dva različita oksidacijska stanja. Ove
elektrode prvenstveno se koriste za odreñivanje specije u jednom oksidacijskom stanju titracijom
s reagensom koji oksidira ili reducira analit. One se mogu primijeniti u temperaturnom području
0-80 oC, eventualno i 80-100 oC. Izrañuju se i kao kombinirane elektrode koje se mogu
primijeniti kod mjerenja uzoraka malog volumena, do 10 µl (mm3).
Ove elektrode služe za odreñivanja oksidacijskog ili redukcijskog kapaciteta otopine
izravnim mjerenjem redoks potencijala (onečišćene, klorirane, industrijske, otpadne vode) kao i
kod redoks titracija. Kod redoks titracija služe za odreñivanje Sb3+, As3+, H2O2, ClO-, Cl2, J2,
Fe2+, Fe3+ (i u čeliku), Mn2+, MnO4-, Sn2+, SO2, Tl+, S2O32-, UO22+, Zn2+.

ANALITIČKE METODE

1. Otopine uzorka i standardi

Otopina uzorka je otopina s aktivitetom iona ai ili ionskom koncentracijom ci koju treba
odrediti. Standardi su vodene otopine koje služe za kalibraciju ISE članka. Primarni standardi su
referentni standardi ili kalibracijske otopine čija je ionska jakost podešena na konstantnu
vrijednost, pomoću neinterferirajuće soli. Sekundarne kalibracijske otopine dobivaju se
komercijalno ili ih rade laboratoriji kao radne standarde. Sekundarne kalibracijske otopine
trebaju biti standardizirane prema primarnim standardima nekom referentom metodom.
Većina rutinskih metoda koristi sekundarne kalibracijske otopine. Rutinske metode često
daju vrlo precizne ali ne uvijek i ispravne rezultate zbog varijacija u elektrodnom sustavu,
granicama tekućina/tekućina, kalibracijskim i mjernim postupcima. Da bi se ustanovila
neispravnost rutinskih rezultata potrebno je koristiti otopine za kontrolu kvalitete rezultata.
2. Analitički postupci (pres. 14)
a) Izravna potenciometrija
Ona predstavlja odreñivanje aktiviteta iona iz jednog mjerenja potencijala.
a1) Odreñivanja temeljena na Nernstovoj jednadžbi – Mjeri se EMF članka koji se sastoji
iz ISE i referentne elektrode, obje uronjene u otopinu koja sadrži ion "i" nepoznatog aktiviteta,
ai :
EISE = Eo + (RT/ziF) ln ai = Eo + (RT/ziF) ln fici
fi - faktor aktiviteta iona "i" , ci – koncentracija iona "i", Eo - standardni elektrodni potencijal.
Nedostatak metode je taj što treba poznavati koeficijent aktiviteta fi.
a2) Odreñivanja temeljena na tehnici koncentracijskog članka – Može se raditi s člankom
s dvije identične ISE, ili s dvije različite ISE. Npr., ako se koriste dvije staklene elektrode (pH i
Na+-elektroda) potencijal se mjeri u otopini koja sadrži Na+ u koncentraciji kada je pH elektroda
referentna dakle stalnog potencijala. Nepoznata otopina stavi se u jedan polučlanak dok se u
drugi polučlanak dodaje standardna otopina dok EMF ne postane nula. Tada je koncentracija
mjerenog iona u oba polučlanka jednaka:

21
 ISEotopina ci৷solni most৷otopina csISE
EMF = (RT/ziF) ln (fici/fscs) + Ej
kada je fi = fs, Ej → 0
EMF = (RT/ziF) ln (ci/cs)
a kada je ci = cs, EMF = 0
ci, cs – koncentracija iona "i" u polučlanku s uzorkom i standardnom otopinom; fi, fs – odgovarajući koeficijenti
aktiviteta.
Kod ove metode pogreška je reducirana.
b) Odreñivanja temeljena na kalibracijskim krivuljama
Ovo je najjednostavnija metoda mjerenja koncentracije u uzorku. Postavlja se grafička
ovisnost (kalibracijska krivulja) EMF članka ili elektrodnog potencijala o aktivitetu iona "i" u
standardu, as, odnosno log as. ISE članak kalibrira se pomoću standardnih otopina izravnom
kalibracijom (električni potencijal mjeri se za seriju standarda i konstruira standardna krivulja).
Grafovi su obično linearni s Nernstovim nagibom. Serija standardnih otopina analita svojim
koncentracijama treba pokriti cijelo područje u kojem se očekuje koncentracija analita u uzorku.
Iz ovakve kalibracijske (radne) krivulje procjenjuje se koncentracija iona u uzorku. Ova se
koncentracija može i izračunati:
ai = as 10∆E/s
jer vrijedi:
s = ∆E/∆c = ∆E/∆log ai = ∆E/log (ai/as)
∆E – razlika potencijala očitanog u otopini uzorka i u standardnoj otopini; s – nagib pravca, promjena elektrodnog
potencijala uz deseterostruku promjenu koncentracije iona "i"; ai, as – aktivitet iona u uzorku i u standardnoj otopini.
Kod ove metode trebaju se eliminirati efekti matrice, tj. razlike u ionskoj jakosti ili pH
uzorka i standardne otopine. U tu se svrhu koriste podešavači ionske jakosti odnosno pH. Ako
uzorci variraju u temperaturi analiza standardnom kalibracijom postaje neispravna, dakle treba
paziti da sve otopine budu iste temperature.
c) Metode dodavanja
Metode standardne adicije analita (dodatak poznatih količina standarda) omogućuju da se
ISE koriste u vrlo kompleksnim matricama, bez potrebe za izravnom kalibracijom prije mjerenja.
Metode dodavanja imaju dva nedostatka u usporedbi s kalibracijom: (i) mora se poznavati red
veličine koncentracije analita u uzorku, (ii) količina uzorka i standarda koji se koriste moraju biti
volumetrijski odreñeni, (iii) mora se raditi u linearnom području. Kod metode standardne adicije
elektrodni potencijal mjeri se prije i poslije dodatka poznate količine analita. Može se dodati
poznati volumen standardne otopine u uzorak, poznati volumen uzorka u standardnu otopinu ili
suhi uzorak u standardnu otopinu, uz pretpostavku da se ne mijenja ionska jakost i Ej.
Granov graf čini metodu grafičkog prikazivanja prividne koncentracije (dobivene iz
elektrodnog potencijala) vs. volumen dodanog reagensa na Granovom papiru te se može
primijeniti na metode jednostrukog i višestrukog dodavanja. Granov papir stavlja elektrodni
potencijal na antilogaritamsku ordinatu i volumen dodanog reagensa ili koncentraciju uzorka na
apscisu. Ovi papiri automatski unose korekciju zbog promjene volumena. Na ovaj način postiže
se poboljšana ispravnost, preciznost i osjetljivost tj. granica dokazivanja.
c1) Metode jednostrukog dodavanja – Ove metode su ponekad bolje od metode kalibracije
jer se broj stupnjeva analize može reducirati. Ovom metodom mogu se ispravno analizirati

22
uzorci s promjenjljivim ionskim sastavom, bez dodatka podešavača ionske jakosti. Dodatkom
suhog uzorka izbjegava se priprava otopine uzorka, ako se suhi uzorak lako otapa u alikvotu
standardne otopine.
Dodatak standardne otopine u uzorak -
∆E1 = (RT/ziF) ln [Vici+Vscs/ci(Vi+Vs)]
Ovakve se jednadžbe mogu postaviti za ∆E2, ∆E3, ...
ci = cs/[10∆E1/s (1+Vi/Vs) – Vi/Vs]
Vs, Vi – volumen standardne otopine, otopine uzorka; ci, cs – koncentracija analita u uzorku, standardnoj otopini, s –
nagib pravca
Dodatak uzorka u standardnu otopinu -
ci = cs/[10∆E1/s (1+Vs/Vi) – Vs/Vi]
c2) Metode višestrukog dodavanja
Potenciometrijska titracija – U titracijskim postupcima ISE koriste se kao detektori koji
mogu pratiti speciju reagensa dodanog u uzorak prije titracije, speciju analita, ili speciju titranta
dodanog u uzorak. Na ovaj je način poboljšana preciznost taložnih i kompleksometrijskih
odreñivanja. Ova metoda ispravnija je od izravne potenciometrije gdje su prisutni efekti
interferirajućih iona tj. javljaju se sustavne pogreške. Titracijske metode koriste titrant (npr.
EDTA) koji će kompleksirati ili reagirati s ionom koji se analizira; koncentracija iona u uzorku
računa se iz volumena utrošenog titranta.
Ispravnost je poboljšana primjenom Granovih grafova. Umjesto grafičkog prikazivanja
ovisnosti potencijala o volumenu dodanog titranta, unosi se ovisnost koncentracije mjerene
specije ili njoj proporcionalne veličine o volumenu titranta. Ova je ovisnost linearna nakon što se
provede korekcija s obzirom na razrijeñenje koje nastaje tijekom titracije. Kako se točka
ekvivalencije dobiva ekstrapolacijom sve su točke važne. Konvencionalni grafički prikazi
titracija su često potpuno nepogodni zbog praktički nevidljivog skoka titracijske krivulje:
ci = ct (VTE/Vi)
ci, ct – koncentracija analita u uzorku, koncentracija titranta, Vi – početni volumen titrirane otopine, VTE – volumen
titrirane otopine u točki ekvivalencije.
d) Kontinuirana mjerenja
Kod kontinuirane analize važno je imati pogodni protočni sustav, automatsku kalibraciju i
automatsko dobivanje podataka. Glavni zahtjev ovdje je dobivanje dovoljno brzog odgovora ISE
uz promjenu aktiviteta ili koncentracije analita.
Tablica 1 daje uvid u radne značajke niza ISE. Koncentracijska područja navedena u
tablici su ona u kojima se dobiva linearna kalibracijska krivulja. Devijacije od pravca nastaju
kod viših i nižih vrijednosti koncentracija. Granice dokazivanja za većinu navedenih elektroda su
3-10x niže od donje navedene vrijednosti koncentracije: Ag+/S2- elektroda do 10-12 mol dm-3
Ag+, Cu2+ elektroda do 10-17 mol dm-3 Cu2+, Pb2+ i Cd2+ elektrode do 10-10 mol dm-3 Pb2+ tj.
Cd2+.

Neki proizvoñači ISE - Beckman Coulter (SAD), Corning (V. Britanija), Metrohm Ltd.,
(Švicarska), Orion Research Inc. (SAD), Philips (Nizozemska), Radelkis Electrochemical
Instruments (Mañarska), Radiometer-Analytical (Danska).

23
 Tablica 1. Neke ISE, njihove značajke i primjena
Analit Tip Linearno Nagib Temperatura Interferencije
koncentracijsko područje kalibracijskog (oC) (maksimalna koncentracija, mol dm-3)
ISE
(mol dm-3) pravca (mV dekada-1)
NH3 Plinska 1-1x10-6 -58 0-50 Hlapljivi amini
Br -
Kruta 1-5x10 -6
-57 0-80 S2-≤10-7, J-<2x10-4
Cd2+ Kruta 1-10-7 +25 0-80 Ag+, Hg2+, Cu2+≤10-7, visoke konc. Pb2+ i Fe3+ smetaju
Ca2+ Tekuća 1-10-5 +24 0-50 (10% greške) uz 10-3 mol dm-3 Ca2+: 3x10-1 Na+; 2x10-6 Zn2+;
5x10-6 Pb2+; 7x10-5 Fe2+, Cu2+; 8x10-3 Sr2+, Mg2+; 3x10-2 Ba2+;
5x10-2 Ni2+
CO2 Plinska 10-2-10-4 +53 0-50 Hlapljive slabe kiseline
Cl- Tekuća 1-8x10-6 -55 0-50 (10% greške) uz 10-3 mol dm-3 Cl-: 6x10-6 ClO4-; 8x10-6 J-; 3x10-5
NO3-, SO42-; 4x10-5 Br-; 10-4 OH-; 4x10-4 OAc-, HCO3-; 7x10-4 F-
Kruta (komb.) 1-5x10-5 -57 0-80 S2-≤10-7; Br-, J-, CN- u trag.; SO42-, NO3-, HCO3- ne smetaju
Cu2+ Kruta zas. do 10-8 +26 0-80 S2-, Ag+, Hg2+≤10-7, visoke konc. Cl-, Br-, Fe3+, Cd2+ smetaju
CN- Kruta 10-2-1-6 -54 0-80 S2-≤10-7; J-<0,1 CN-; Br-<5x103 CN-, Cl-<106 CN-
Dvoval. kationi Tekuća 1-6x10-6 +24 0-50 (10% greške) uz 10-3 mol dm-3 Ca2+/Mg2+: 3x10-2 Na+;3x10-5 Cu2+,
(tvrdoća vode) Zn2+; 6x10-5 Fe2+; 10-4 Ni2+; 4x10-4 Sr2+; 6x10-4 Ba2+
F- Kruta (komb.) zas. do 10-6 -56 0-80 OH-<0,1 F-
BF4- Tekuća zas. do 3x10-6 -56 0-50 (10% greške) uz 10-3 mol dm-3 BF4-: 2x10-2 NO3-; 2x10-1 Br-, OAc-,
HCO3-, F-, Cl , OH-, SO42-
H2S Plinska 10-2-10-6 -28 0-50 Nema
- -7
J Kruta 1-2x10 -57 0-80 S2-<10-7
Pb2+ Kruta 1-10-7 +25 0-80 Ag+, Hg2+, Cu2+≤10-7, visoka konc. Cd2+, Fe3+ smeta
NO3- Tekuća 1-6x10-6 -55 0-50 (10% greške) uz 10-3 mol dm-3 NO3-: 10-7 ClO4-; 10-5 J-; 10-4 ClO3-;
6x10-4 Br-; 4x10-3 HS-, CN-; 2x10-3 NO2-; 4x10-2 HCO3-, Cl-; 0,1
OAc-
NOx Plinska 10-2-5x10-7 +58 0-50 (10% greške) uz 10-3 mol dm-3 NOx: 3x10-2 CO2, slabe hlapljive
(NO, NO2) kiseline smetaju
ClO4- Tekuća 1-2x10-6 -55 0-50 (10% greške) uz 10-3 mol dm-3 ClO4-: 2x10-3 J-; 5x10-2 NO3-; 4x10-2

24
 Br-
pH Kruta pH 0-14 +54 0-100 Na+ smeta kod pH 14
(staklena)
K+ Tekuća 1-10-5 +54 0-50 (10% greške) uz 10-3 mol dm-3 K+: 10-4 Cs+; 3x10-3 NH4+; 10-2 H+,
Tl+; 0,1 Ag+; 0,5 Na+
Ag/S2- Kruta Ag+: 1-10-7 +56 0-80 Hg2+<10-7
S2-: 1-10-7 -28
Na+ Kruta (komb.) zas. do 10-6 +55 0-80 (10% greške) uz 10-3 mol dm-3 Na+: 3x10-7 Ag+; 10-6 H+; 5x10-5
Li+; 6x10-2 Cs+; 0,1 K+; 2x10-1 (C2H5)N+; 0,5 Tl+
CNS- Kruta 1-5x10-6 -56 0-80 OH-<SCN-; Br-<3x10-3 SCN-; Cl-<20 SCN-; NH3<0,13 SCN-;
S2O32-<1x10-2 SCN-; CN-<7x10-3 SCN-; J-,S2-<10-7 SCN-
komb - kombinirana

25
 PRIMJENA ISE

ISE se mogu koristiti za selektivno odreñivanje ionskih aktiviteta ili kao indikatori završne
točke kod titracija (vidi takoñer str. 28-32). Primjena im je u izučavanju okoliša, fizičko-
kemijskim, biološkim i medicinskim istraživanjima. Važna je mogućnost praćenja iona tijekom
operacija ili dijagnostičkih postupaka tj. kod kliničkih analiza, u poljoprivredi, kontroli
zagañenja zraka, ispitivanju lijekova, ispitivanjima pitke, prirodnih i morske vode. Mogu se
primijeniti u makro i mikro mjerilu. Mikroelektrode dobre su za stalno praćenje ionskog
aktiviteta pri biološkom radu in vivo, odnosno za praćenje elektrolita u krvi in situ.
Vrlo važna primjena je u biomedicini. Kako su neki patološki procesi u živim organizmima
vezani uz promjenu koncentracije iona (npr. Cl-) važna je priprema takve elektrode s dobrom
selektivnošću, visokom osjetljivošću i dobrom elektromotornom stabilnošću u biološkom
mediju. Tako analize krvi, seruma i plazme mogu uključiti praćenje metaboličkog raspada
anestetika (F-) te elektrolitsku ravnotežu tijekom hemodijalize (Ca2+, Na+, K+, Cl-). U punoj krvi
vrlo brzo mogu se odrediti K+ i Na+. Nadalje, odreñivanje ioniziranog Ca2+ u krvi vrlo je važno
radi ustanovljavanja hipokalcemije. Varijacije u ioniziranom kalciju su važne zbog povezanosti s
prestankom rada paratireoidee, nekih karcinoma, respiratornih i metaboličkih acidoza i alkaloza,
hemoragičnih šokova, transfuzije citratne krvi tijekom operacije, davanja heparina i drugih
antikoagulansa. NH3-elektrodom prate se niske koncentracije amonijaka u plazmi zdravih osoba
i onih s cirozom jetre.
Tijekom nekoliko zadnjih godina razni tipovi ISE primijenjeni su u enzimologiji:
konvencionalne staklene elektrode, homogene krute elektrode, elektrode s tekućim ionskim
izmjenjivačima, elektrode s neutralnim kompleksima i plinske elektrode. U većini slučajeva one
su modificirane tako da se matrica impregnirana s enzimom ili supstratom stavlja izmeñu
otopine uzorka i senzitivne membrane elektrode; to su onda enzimske elektrode.
Biološki uzorci najčešće zahtijevaju pogodnu predobradbu prije mjerenja s ISE (klasično
mokro ili suho spaljivanje, spaljivanje u mikrovalnoj peći, ekstrakcija, razrijeñivanje,
puferiranje, podešavanje ionske jakosti). Npr. analize kostiju traže da se uzorci spale ili otope u
kiselini prije analize. Ovdje se provodi analiza F- i prati veza izmeñu ingestiranog F- i skeletne
strukture kao i bolesti ovog sustava kao što je osteoporoza. Nadalje, u biološkim kulturama
mogu se pratiti Ca2+, CO2 i NH3. Zubna caklina i slina takoñer se analiziraju. Zubi se otapaju u
kiselini pa se mjeri F-; u slini analiziraju se Ca2+, F- i mjeri pH.

26
 LITERATURA

1. G. E. Baiulescu i V. V. Coşofret, Applications of Ion Selective Membrane Electrodes in Organic Analysis, Ellis
Horwood Ltd., Chichester 1977.
2. F. W. Fifield i D. Kealey, Principles and Practice of Analytical Chemistry, Blackwell Science, Oxford 2000, str.
232-247.
3. M. S. Frant, History of the early commercialization of ion-selective electrodes, Analyst 199 (1994) 2293-2301.
4. J. Havas, Ion- and Molecule-selective Electrodes in Biological Systems, Akadémiai Kiadó, Budapest 1985.
5. J. F. Kennedy, Analytical Chemistry: Principles, 2. izd., Saunders College Publishing, New York 1990, str. 519-
549
6. J. Koryta, Ion Selective Electrodes, Cambridge University Press, Cambridge 1975.
7. J. Koryta, Theory and application of ion-selective electrodes, Anal. Chim. Acta 61 (1972) 329-411.
8. J. Koryta, Theory and application of ion-selective electrodes – Part II, Anal. Chim. Acta 91 (1977) 1-85.
9. J. Kratochvil, Ion-selective electrodes, u Scientific Foundations of Clinical Biochemistry (ur. D. L. Williams, R.
F. Nunn i V. Marks), William Heinemann Medical Books Ltd., London 1978, pp. 406-418.
10. J.-M. Mermet, M. Otto i H. M. Widmer (ur.), Analytical Chemistry, Wiley-VCH, Weinheim 1998, pp. 390-392.
11. M. E. Meyerhoff i W. N. Opdycke, Ion selective electrodes, Adv. Clin. Chem. 25 (1986) 1-47.
12. G. J. Moody i J. D. R. Thomas, Development and publication of work with selective ion-sensitive electrodes,
Talanta 19 (1972) 623-639.
13. D. A. Skoog, D. M. West i F. J. Holler, Fundamentals of Analytical Chemistry, 6. izd., Saunders College, Fort
Worth 1992.

27
 II. DIO

PRIMJENA ISE U BIOKEMIJI, KLINIČKOJ KEMIJI I ORGANSKOJ ANALIZI

U širem smislu riječi možemo govoriti o ion-selektivnim i molekulsko-selektivnim

elektrodama, poglavito kada se radi o njihovoj primjeni u biološkim uzorcima. ISE se mogu
koristiti za analizu niza analita u biološkom materijalu, npr. NH3 u fecesu, krvnoj plazmi, urinu,
Ca2+, K+, Na+ u serumu, Cl- u serumu i biološkim tekućinama, F- u kostima i fecesu, slini,
serumu i drugim biološkim tekućinama, npr. urinu, J- u lijekovima i žuči, urea u biološkim
tekućinama, etanol i glukoza u krvi, proteini odnosno aminokiseline u biološkim tekućinama,
urati u urinu i serumu, razni metaboliti (pres. 13). Takoñer mogu se koristiti za odreñivanje
aktivnosti enzima u organizmu (npr. kolinesteraze i acetilkolinesteraze, α-glukozidaze, rodanaze,
arginaze, ureaze, itd.).
Npr., cistična fibroza koja napada jedno od 600-2000 roñene djece karakterizirana je
abnormalno visokim sadržajem Cl- u znoju. Znoj se stvara pod utjecajem pilokarpina te se Cl-
mjeri izravno na koži pomoću Cl--elektrode. Tijekom ishemije dolazi do ionskih poremećaja u
organima koji se mogu pratiti mjerenjem s ISE na površini organa i to onih s propustljivim
"spojevima" poput jetre, bubrega, žučnog mjehura (ref. 11). Nadalje, pH površine mišića
najosjetljiviji je indikator promjene vitalnih funkcija kod kritično bolesnog pacijenta. Ovo
praćenje pH može se provesti kontinuirano tijekom operacije i oporavka. Naročito je korisno u
pedijatrijskoj kirurgiji kada je važno brzo ustanovljavanje hemoragije ili kardijalne
insuficijencije.

1. Halogenirani spojevi
Za odreñivanje halogenida često se koriste krute homogene ili heterogene elektrode,
mjereći aktivnost halogenida izravno u otopini (izravna potenciometrija) ili potenciometrijskom
titracijom. Cl-, Br-, J- elektrode obično se temelje na membranama od kristala Ag-halogenida i
prešanih taloga. Važno je odreñivanje halogena u lijekovima i alkaloidima.

2. Hidroksi spojevi
Odreñivanje alkohola temelji se na katalitičkom djelovanju alkohol oksidaze koja
katalizira oksidaciju primarnih alifatskih alkohola:
alkohol

RCH2OH + O2 → RCHO + H2O2

oksidaza
Koristi se enzimska elektroda s imobiliziranom alkohol oksidazom na površini Pt-elektrode. Ona
služi za odreñivanje etanola u krvi do koncentracije od 10 mg% (0,1‰).

3. Spojevi sumpora
Pri odreñivanju spojeva sa sumporom uzorak se hidrogenira nekom reduktivnom metodom
uz nastajanje H2S. Ovako se analiziraju tioli (merkaptani), tiourea i njezini derivati. Koristi se S2-
selektivna elektroda, npr. Ag2S elektroda, kako za izravna potenciomerijska odreñivanja tako i za
potenciometrijske titracije. Ako se kao titrant koristi AgNO3 za mjerenje se koristi Ag-selektivna
elektroda.

28
4. Dušikovi spojevi
Odreñivanje raznih metabolita moguće je temeljiti na enzimskoj specifičnosti. Tako se
analitički korisna elektroda temelji na diaminoksidazi koja katalizira reakciju diamina:
diamin

RCH(CH2)n-NH2 + O2 + H2O → RCH(CH2)n-1-CHO + H2O2 + NH3

NH2 oksidaza NH2

Amino skupine mogu se odreñivati pomoću O2 elektrode, ili pomoću krute Cl--elektrode, mjereći
sadržaj klora nastalog reakcijom amino skupine i HCl.
5. Derivati ugljične kiseline
Odreñivanje uree temelji se na enzimskoj elektrodi u kojoj je imobilizirana ureaza. Tanki
film s ureazom stavlja se na kationsku staklenu elektrodu koja odgovara na NH4+ ione. Enzim
katalizira reakciju:
ureaza

(H2N)2C=O + H3O+ + H2O → 2NH4+ + HCO3-

Za odreñivanje uree može se koristiti i amonijačna plinska elektroda tako da se osloboñeni NH4+
ioni uz dodatak lužine prevode u slobodni amonijak koji difundira kroz membranu propusnu za
plin. Hidroksilni ioni koji se stvaraju u unutranjoj otopini disocijacijom amonijaka detektiraju se
unutarnjim senzitivnim elementom kao električni potencijal proporcionalan sadržaju NH3 u
uzorku.

6. Šećeri i njihovi derivati

Za odreñivanje glukoze u krvi koristi se glukoza-enzimska elektroda. Ovakva su
odreñivanja jednostavna, brza, osjetljiva i selektivna, pa se uspješno mogu koristiti u kliničkim
laboratorijima. Temelj je slijedeća reakcija:
glukoza

glukoza + H2O + O2 ⇄ glukonska kiselina + H2O2

oksidaza
peroksidaza

kromogenski akceptor kisika + H2O2 → kromogen + H2O

Npr. ako se tanki sloj smjese imobilizirane glukoza oksidaze i peroksidaze stavi na J--selektivnu
membransku elektrodu, prati se pad koncentracije J- iona prema reakciji:
katalizator

H2O2 + 2J- + 2H+ → J2 + 2H2O

Amigdalin je glikozid koji se može odreñivati enzimskom elektrodom koja se sastoji od
kristaliničnog CN--senzora prekrivenog slojem imobiliziranog enzima β-glukozidaze, koja
katalizira hidrolizu amigdalina u glukozu, benzaldehid i HCN (vidi str. 31). Osloboñeni CN-
odreñuje potencijal CN--elektrode:
β-glukozidaza

C6H5CHOC12H21O10 → 2 C6H12O6 + C6H5CHO + HCN

H 2O

29
7. Spojevi s dušikom i drugim fukcionalnim skupinama
Holin i njegovi esteri mogu se odreñivati pomoću tekućih ili krutih membranskih
elektroda. Kruta elektroda se sastoji od elektroaktivne PVC membrane pripravljene iz otopine
acetilholin tetra-p-klorofenila u ftalatnom esteru koji služi kao omekšivač za PVC.
ISE za aminokiseline dobivaju se stavljanjem tankog sloja odgovarajućeg enzima na
kationsku staklenu elektrodu. Enzim katalizira razgradnju aminokiseline do NH4+:
enzim

RCH(NH3+)COO- + H2O + O2 → R(CO)COO- + NH4+ + H2O2

NH4+ ion mjeri se aminokiselinskom elektrodom čiji je potencijal proporcionalan aktivitetu NH4+
iona u enzimskom sloju tj. koncentraciji aminokiseline u uzorku.
Postoje i neki drugi tipovi elektroda s tekućim membranama koje koriste kvarterne
amonijeve soli.

8. Heterociklički aromatski spojevi

Penicilin lako hidrolizira, naročito u kiselom mediju ili pod utjecajem penicilinaze.
Hidrolizom se otvara β-laktamski prsten:

H 3C S

CH-NH-CO-R penicilinaza
H 3C
H 2O
N CO
HOOC

H 3C S

CH-NH-CO-R
H 3C

NH COOH
HOOC

Elektroda se pripravlja tako da se na staklenu pH elektrodu imobilizira enzim jer se reakcijom

hidrolize stvara još jedna kiselinska skupina.
Odreñivanje urata važno je u dijagnostici i terapiji hematoloških poremećaja i gihta.
Koristi se enzimska elektroda pri čemu se Pt-disk presvuče imobiliziranom urikazom (za
odreñivanja u urinu i u serumu):

30
 O
H
N
HN N urikaza
C=O + O2
H 2O
N N
H H

H
O N
H 2N

C=O + CO2 + H2O2

N N
H
H H

9. Enzimi
Enzimi su organski katalizatori koje stvaraju žive stanice, a koji djeluju na supstrate. Za
odreñivanje njihove aktivnosti mjere se reakcijski produkti enzima s organskim supstratima.
Takvi tipični bioprodukti su NH3 i CN-.
Za mjerenje aktivnosti kolinesteraze (ChE) koristi se elektroda sastavljena iz pH-elektrode
i dva tanka sloja otopine. Jedan sloj sadrži acetilkolinski supstrat koji je stabiliziran da se
onemogući ne-enzimski gubitak supstrata, drugi sadrži serum. Na površini elektrode serumska
kolinesteraza reagira s acetilkolinom stvarajući CH3COOH koja se detektira pH elektrodom:
ChE

(CH3)3N+-CH2CH2-S-COCH3 → (CH3)3N+-CH2CH2-SH + CH3COOH

H 2O
Princip ovih elektroda je da se na površinu kationske staklene elektrode (pH, NH4+) stavlja
supstrat (npr. acetilkolin). Kada se ona uroni u otopinu odgovarajućeg enzima, suspstrat
difundira iz membrane i reagira s enzimom koji ne može difundirati kroz membranu, te se
stvaraju H+, NH4+ ioni koje detektira staklena elektroda (kod kolinesteraze, acetilkolinesteraze,
ureaze, arginaze).
Za odreñivanje aktivnosti α,β-glukozidaze, u članku koji sadrži otopinu amigdalina
detektira se osloboñeni CN- (vidi str. 29). Grafički prikazuje se ovisnost potencijala o vremenu te
je brzina reakcije proporcionalna početnoj koncentraciji enzima.
Aktivnost enzima rodanaze temelji se na reakciji:
rodanaza

CN- + S2O32- → SCN- + SO32-

Osloboñeni SCN- može se pratiti pomoću SCN--elektrode pri čemi je CN- ozbiljni interferent.
Aktivnost rodanaze može se mjeriti i praćenjem brzine nestanka CN- s CN--elektrodom pri čemu
su interferencije SCN- i SO32- male.

31
 α-kimotripsin može se odrediti pomoću F--elektrode prema reakciji:

DPCF + α-kimotripsin → DPC-α-kimotripsin + F-

difenilkarbamil fluorid
(specifični dezaktivator
α-kimotripsina)

10. Plinovi
NH3 odreñuje se u biološkim uzorcima (plazma, feces, urin). Kako u fiziološkom pH
području dominira NH4+, uzorak se alkalizira da se razvije NH3 koji difundira kroz plin-
propusnu membranu do uravnoteženja. Osloboñeni OH- ioni detektiraju se u unutarnjoj otopini
staklenom elektrodom čiji je odgovor proporcionalan sadržaju NH3 u uzorku. Ovo je vrlo
jednostavan postupak odreñivanja NH3 u biološkom materijalu, te se može provesti i
kontinuiranim mjerenjem. Za acido-bazni status pacijenta važan je i sadržaj CO2 (vidi i str. 20).

ISE U ANALIZI KOMPLEKSNIH UZORAKA: KLINIČKIH I EKOLOŠKIH

Meñu prednostima ISE kao analitičke tehnike spadaju relativno niska cijena i činjenica da
su postupci predobradbe uzoraka relativno malobrojni i jednostavni. To čini ISE vrlo dobrima za
primjenu u biomedicini (npr. klinička primjena za analize plinova u krvi).

1. Ponašanje ISE u nevodenim i biološkim medijima

Kationske staklene elektrode u nevodenom mediju pokazuju niži nagib kalibracijskog
pravca od Nernstovog zbog dehidratacije stakla. Osim snižene osjetljivosti pokazuju i sniženu
selektivnost i izdržljivost. Smolno-membranske elektrode koje se pripravljaju iz fino usitnjenih
ionsko-izmjenjivačkih smola [npr. Amberlite IRA-400, 401, Amberlite IR-45, Dowex 1X8,
veličine zrna 0,076 mm (200 mesha)] prešanjem s prahom polistirena (pri 130-150 oC pri
početnom tlaku od 28 MPa) u obliku diskova ponašaju se u biološkim medijima različito.
Amberlite IRA-400, 401 i Dowex 1X8 tj. njihove kvarterne amonijeve skupine zadržavaju svoj
stupanj disocijacije neovisno o dielektričnoj konstanti medija, dok se u Amberlite IR-45 zbog
slabo bazičnih skupina pokazuje slabija elektrokemijska aktivnost. Sulfonsko-kisele smole bolje
su u nevodenim medijima nego u vodi. I homogene i heterogene membranske elektrode dobro se
ponašaju u organskim otapalima. Kod posljednjih, granica dokazivanja ovisi o produktu
topljivosti membranskog taloga, te je niža u nevodenom mediju jer tada većina taloga ima
smanjenu topljivost u odnosu na vodu. Može se uočiti i slabija selektivnost u biološkom mediju.
Općenito, da bi elektroda bila primjenjljiva u nerazrijeñenom serumu ona treba pokazivati
dovoljnu selektivnost, dobru stabilnost, reproducibilnost i brz odgovor; prijenosom elektrode iz
vodenog medija u serum može doći do pada nagiba tj. osjetljivosti. Jedna od uspješnih Cl--ISE s
tekućom membranom je ona sastava: 27,3% metiltridodecil amonijum (MTDDA) klorida, 10,2%
5-fenilpentanola i 62,5% polivinilklorida (PVC) (ref. 9, 12). MTDDA-Cl pokazao se boljim od
drugih kvarternih amonijevih soli. Produženjem alifatskog lanca nagib odgovora elektrode
približava se teorijskom. Takoñer, uz povećanu lipofilnost elektroaktivne supstancije produžuje
se vijek elektrode. Procijenjene su granice dokazivanja od 10-5-10-6 mol dm-3 Cl-. Ponašanje ove
elektrode u nerazrijeñenom krvnom serumu promatrano je s obzirom na njezinu stabilnost,
preciznost, osjetljivost, ispravnost i selektivnost. Ova elektroda pokazala je visoku stabilnost i u
vodenim otopinama i u krvnom serumu, naročito kada je s njim u stalnom kontaktu. (Stabilnost
se ocjenjuje kao najveći i najmanji interval otklona potencijala ISE u mV tijekom zadnjih 10 min

32
kontakta sa serumom.) Minimalna selektivnost ove elektrode prema HCO3- (KCl-,HCO3- ≈ 0,1)
djelomično je postignuta u vodenim otopinama, te gotovo dostignuta u serumu.

2. Odreñivanja u kompleksnim uzorcima – kalibracija, osjetljivost, granica detekcije u

biološkom materijalu
Sastav kalibracijskih otopina bira se tako da se pretpostavlja da je faktor aktiviteta iona
identičan i u otopini za kalibraciju i u normalnoj plazmi, tj. plazmi zdravih ljudi. Postupci
standardne adicije dakle dodaci poznatih količina standarda omogućuju da se ISE koriste u vrlo
kompleksnim matricama bez potrebe za izravnom kalibracijom prije mjerenja.
Da bi se ustanovila neispravnost rezultata potrebno je koristiti otopine za kontrolu kvalitete
rezultata, npr. uzorke plazme ili simuliranih materijala za koje je vrijednost ionske koncentracije
poznata i ustanovljena nekom referentnom metodom.
Kalibracijska krivulja je grafički prikaz odnosa razlike potencijala članka ISE i log
aktiviteta (ili koncentracije) iona "i". Kalibracijska osjetljivost ISE, s, definira se kao nagib
kalibracijskog pravca:
s = ∆E/∆ log ai
Teorijska Nernstova osjetljivost, g0, tj. nagib funkcije idealne ISE, pri 37 oC je:
g0 = (RT/ziF) ln 10 = (0,0615/zi) J C-1 = (0,0615/zi) V
E - potencijal članka, ai - aktivitet iona "i", R - plinska konstanta, T – apsolutna temperatura (K), F – Faradyeva
konstanta, zi – naboj iona.
Relativna osjetljivost ISE, S, definira se kao:
S = s/g0 = (∆E/∆ log ai) (ziF/RT ln 10)
Relativna osjetljivost ISE ne bi trebala odstupati za više od +2% ili –5% od teorijske vrijednosti.
Priprava otopine koja sadrži poznati aktivitet nekog iona nije moguća jer zahtijeva
poznavanje faktora aktiviteta iona. Obično se koristi srednji faktor aktiviteta ili Debye-
Hückelova teorija ili Pitzerova obrada otopina elektrolita (prema ref. 8, 15). U praksi ISE se
može kalibrirati s otopinama poznatih koncentracija ili aktiviteta, zavisno o tome koji se
parametar odreñuje u uzorku.
Praktična granica dokazivanja definira se kao koncentracija ili aktivitet iona "i" u točci u
kojoj se presijecaju dvije ekstrapolirane linije, ona srednjeg i ona najnižeg koncentracijskog
segmenta kalibracijske krivulje. Budući da na granicu dokazivanja utječu mnogi faktori, treba
uvijek navesti eksperimentalne uvjete, tj. sastav otopine, prethodnu primjenu i prethodno
kondicioniranje elektrode, brzinu miješanja, itd.

3. Interferenti
Interferenti su sve specije u uzorku, osim analita, čija prisutnost u uzorku utječe na
ispravnost mjerenja, npr. ioni, proteini, površinski aktivne tvari. Npr. proteini mogu se
adsorbirati na površinu membrane ISE uzrokujući kod nekih membrana pomak od 0,3 do 0,5 mV
no zabilježeni su i pomaci od čak 10-15 mV. Proteini se mogu ukloniti, iako dosta teško, čestim
pranjem, ili upotrebom otopina za čišćenje s pepsinom koje obično sadrže i neionski detergent i
baktericid.

33
4. Efekt suspenzije ili Pallmanov efekt
Ovaj efekt (ref. 2, 17) dogaña se kada se ISE koriste u koncentriranim suspenzijama dok
vanjska referentna elektroda ostaje u supernatantu koji nije suspenzija. Aktivitet izmjeren u
suspenziji razlikuje se od vrijednosti u supernatantu za potencijalnu razliku na granici faza (Ej) i
odgovara višoj vrijednosti. Ovaj efekt gotovo iščezava kada se vanjska referentna elektroda stavi
u isto područje u kojem se nalazi i ISE.
Prisutnost proteina u uzorku utječe na Ej ali taj utjecaj ne da se kvantificirati i često je
opovrgavan. Prisutnost suspenzija i koloida, čestih u biološkim mjerenjima, jako utječe na
veličinu Ej. Da bi se Ej što više smanjio koristi se solni most punjen s konc. KCl ili agar-agarom
zasićenim s KCl (kod bioloških mjerenja) koji se stavlja izmeñu uzorka i referentne elektrode.
Kod mjerenja u uzorcima krvi dobar elektrolitski most je onaj s natrij formijatom jer su i Na+ i
HCOO- ekvitransferentni ioni.

5. Analiza uzoraka okoliša

Primjena ISE u analizi okoliša nudi neke prednosti pred drugim metodama. Prvo je to puno
niža cijena u odnosu na druge metode, npr. AAS ili ionsku kromatografiju. Kod mjerenja s ISE
nema smetnji obojenosti uzorka. Praktična je u analizi uzoraka okoliša gdje su potrebna in situ
odreñivanja. ISE se koriste u kontroli onečišćenja zraka, ispitivanjima voda. ISE uglavnom
nemaju isto područje linearnosti, osjetljivost i granice dokazivanja kao druge metode ali su
pogodne za one uzorke gdje problem čine modifikacija matrice ili boja uzorka. Takoñer, često su
primjenjljive u terenskim uvjetima.
Neke potvrñene metode koje koriste ISE, a prihvaćene su od raznih regulatornih tijela, npr.
EPA (US Environmental Protection Agency), AOAC (Association of Official Analytical
Chemists, ASTM (American Society of Testing and Material), APHA (American Public Health
Association, USGS (United States Geological Survey), su ispitivanje kiselosti i bazičnosti, pH i
pH titracije, ispitivanje vodljivosti, slanoće, mjerenje NH3, CO2, zaostalog klora i klora u
organskim tvarima, fluora i sumpora u ugljenu, Kjeldahlovog dušika, kisika, Br-, Cl-, Cl- koji se
ispire, ili ukupnog Cl- u ugljenu, CN-, F-, F- u zraku, J-, NO3-, K+, Na+, S2-.

6. Odnos izmeñu ionskog aktiviteta i ukupne koncentracije specije u plazmi (pres. 15)
International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (IFCC) kroz
seriju publikacija predlaže konvenciju o načinu prikazivanja rezultata mjerenja pomoću ISE.
Kada se ISE koriste za mjerenja iona u punoj krvi ili nerazrijeñenoj plazmi, npr. Na+, K+, Ca2+,
one odgovaraju na aktivitet iona u plazmi, a ne na ukupnu koncentraciju tvari kakvu dobivamo
npr. pomoću plamene atomsko-emisijske (FAES) ili atomsko-apsorpcijske (FAAS)
spektroskopije. Kada se mjerenja pomoću ISE provode u jako razrijeñenim uzorcima dobiva se
ukupna koncentracija tvari kao i FAES/FAAS-om. Mjerenja u nerazrijeñenim uzorcima su
pouzdanija, ali da ne bi došlo do pogrešne kliničke interpretacije, rezultate mjerenja pomoću ISE
u punoj krvi i u nerazrijeñenoj plazmi treba iskazati kao koncentraciju ionizirane tvari u plazmi
(mmol dm-3) za razliku od koncentracije ukupne tvari. Npr., pomoću FAES mjerimo
koncentraciju ukupnog natrija (cNauk), a pomoću ISE aktivitet iona natrija (aNa+).
Standardni uzorci plazme definirani su kao oni koji imaju masenu koncentraciju vode od
0,930±0,005 kg dm-3, pH 7,40±0,05, i koncentraciju albumina, ukupnih proteina, kolesterola i
triglicerida unutar referentnih granica za zdrave osobe. Masena koncentracija vode u plazmi
odreñuje se vaganjem plazme prije i, njezinog ostatka, poslije sušenja na zraku pri 45-50 oC do
stanja u kojemu se voda ne može dokazati Karl Fischerovim reagensom.

34
 Rezultati mjerenja iona mogu se izraziti kao molarna koncentracija specije (mol dm-3),
molalitet (mol kg-1) ili aktivitet. Usvojena konvencija je da se mjerenja iona iskazuju kao
molarna koncentracija specije (mol dm-3). Ionska koncentracija može se odnositi na ione u vodi
plazme ili u cijelom volumenu plazme. Koncentracija iona u ukupnoj plazmi bit će niža za faktor
od ca 0,93. Kako je koncentracija vode u normalnoj plazmi 0,93 kg dm-3, a u kalibracijskim
otopinama 0,99 kg dm-3 prikladnije je ionsku jakost u plazmi izraziti molalitetom nego
molaritetom. Primarne kalibracijske (standardne) otopine služe za kalibraciju članka s ISE.
Sastav kalibracijskih otopina treba biti takav da je koeficijent aktiviteta mjerenog iona isti u
kalibracijskoj otopini i u krvnoj plazmi zdrave osobe. Npr. u slučaju kalcija, prema konvenciji,
ionska jakost treba biti 0,160 mol kg-1.
Odnos izmeñu aktiviteta iona mjerenog pomoću ISE u nerazrijeñenim uzorcima i ukupne
koncentracije specije mjerene pomoću FAES/FAAS može se izraziti matematički. Ukupna
koncentracija specije M, cMuk može se prevesti u ukupni molalitet mMuk dijeljenjem s masenom
koncentracijom vode u uzorku (ρH2O = 0,93 kg dm-3):
mMuk = cMuk/ρH2O (1)
Da bi se dobio molalitet slobodnog iona M+, zbroj molaliteta prisutnih specija Bn- (n = 1, 2, 3, ...,
m) koje su vezane za M+ (npr. veza ion-protein Mpr, MCO3-, itd.) mora se oduzeti (vidi sliku 8
za Na+ i sliku 9 za Ca2+):
m
mM+ = mMuk - ΣmMBn (2)
n=1
ili, uvoñenjem konstanti ravnoteže ovih kompleksa:

KMBn

M+ + Bn- ⇄ MBn (3)

m m
ΣmMBn = Σ KMBn mBn- mM+ (4)
n=1 n=1
Kombiniranjem jednadžbi (2) i (4) dobiva se:
m
mM+ = mMuk/(1+Σ KMBn mBn-) (5)
n=1
Molalitet slobodnog M+ može se prevesti u aktivni molalitet m'M+ množenjem s molalnim
koeficijentom aktiviteta (γM+):
m'M+ = mM+ γM+ (6)
Aktivni molalitet može se prevesti u relativni molalni aktivitet dijeljenjem s m = 1 mol kg-1:
amM+ = m'M+/m (7)
Kombiniranjem i preureñivanjem jednadžbi (1) i (5)-(7) dobiva se:
m
cMuk = amM+ρH2O(1+ Σ KMBn mBn-) (m/γM+) (8)
n=1

35
pomoću koje je moguće izračunati ukupnu koncentraciju M na temelju molalnog aktiviteta M+ ili
obratno. Faktor:
m
ρH2O(1+ Σ KMBn mBn-) (m/γM+) (9)
n=1
pomoću kojega se amM+, mjeren s ISE, stavlja u relaciju sa cMuk može se nazvati faktorom
prilagoñavanja ISE, a dobiveni rezultat prilagoñeni aktivitet, umjesto ukupne koncentracije
tvari.
Za natrij u normalnoj plazmi vrijedi da je vezani natrij u odnosu na ionizirani Na+ (2,1
mmol dm-3 vs. 138 mmol dm-3, vidi sliku 8) ca 2% što znači:
m
Σ KMBn mBn- = 0,02 i γNa = 0,747
n=1
Iz jednadžbe (7) proizlazi jednadžba (10):
m
cMuk = c'M+ ρH2O (1+ Σ KMBn cBn-)/(γM+ ρH2O∗) (10)
n=1

gdje je c'M+ aktivna koncentracija iona M+ i ρH2O* je masena koncentracija vode u čistoj vodi
(gustoća). U ovom slučaju izraz:
m
ρH2O (1+ ΣKMBn cBn-)/(γM+ ρH2O∗) (11)
n=1
može se nazvati faktorom prilagoñavanja pomoću kojega aktivnu koncentraciju iona M+
stavljamo u relaciju s cMuk i rezultat je koncentracija ioniziranog, ili slobodnog M+, umjesto
ukupne koncentracije specije.
Npr., ionizirani kalcij u plazmi odnosi se na slobodne ione kalcija u hidratiziranom obliku;
termin vezani kalcij odnosi se na nekoliko specija koje se u kliničkoj kemiji razlikuju s obzirom
na veličinu molekule i to kao ne-ultrafiltrabilni proteinski vezani (uglavnom na albumin) i na
ultrafiltrabilni kalcij, kompleksno vezan pretežno s HCO3-, fosfatom, SO42-, citratom. Tako je
molarni koeficijent aktiviteta za ionizirani kalcij 0,36 u plazmi i 0,34 u kalibracijskim
otopinama, a molalni 0,34 u objema (pri 37 oC). U slučaju natrija, on je pretežno vezan na
albumin i globulin kao ne-ultrafiltrabilni, a kao ultrafiltrabilni vezan je s karbonatom ili
bikarbonatom.
Relativne vrijednosti za M+, MPr, itd., date su za Na+ na slici 8 i za Ca2+ na slici 9.

36
 Albumin, globulin Proteinski vezan Na (=1% =1,4 mmo, l-1)
NaCO3-, NaHCO3 Kompleksno vezan ili ionski par (=0,5% = 0,7 mmol l-1)
140 mmol l-1, 100%
138 mmol l-1, 98,5%
-+-
+ Na+ + “Elektrostatski
-+- vezani” Na+
102 mmol l-1, 73%

Ukupni Na

“Aktivni“ Na+ Ultrafiltrabilni

Na+ (γNa+=0,747) Na

Slobodni,
“ionizirani“
Na+

0 mmol l-1, 0%

Slika 8. Frakcije Na u krvnoj plazmi (prema ref. 3). (pres. 16)

-1
2.40 mmol l ,100%
Albumin
Proteinski
+ 2+
vezan Ca
-1 globulin
1.50 mmol l , 62.5% Kompleksno
CaHCO3,
-1 etc. vezan Ca 2+
1.20 mmol l , 50%

-+- “Elektrostatski Ukupni Ca

vezan” Ca2+
+ Ca2+ + Ultrafiltrabilni
Ca
-+-
Slobodni, 2+
ionizirani Ca
-1
0.41 mmol l , 17.1%
“Aktivni” Ca2+
Ca2+ (γCa2+ = 0.34)
0 mmol l -1 , 0%

Slika 9. Frakcije Ca u krvnoj plazmi (prema ref. 3). (pres. 17)

37
 LITERATURA

1. G. E. Baiulescu i V. V. Coşofret, Applications of Ion Selective Membrane Electrodes in Organic Analysis, Ellis
Horwood Ltd., Chichester 1977.
2. R. P. Buck i E. S. Grabbe, Eelectrostatic and thermodynamic analysis of suspension effect in potentiometry, Anal.
Chem. 58 (1986) 1938-1941.
3. R. W. Burnett, A. K. Covington, N. Fogh-Andersen, W. R. Külpmann, A. Lewenstam, A. H. J. Maas, O. Müller-
Plathe, A. L. Van Kessel i W. G. Zijlstra, Use of ion-selective electrodes for blood electrolyte analysis.
Recommendations for nomenclature, definitions and conventions, IFCC 2000/1, Clin. Chem. Lab. Med. 38
(2000) 363-370.
4. R. W. Burnett, A. K. Covington, N. Fogh-Andersen, W. R. Külpmann, A. Levenstam, A. H. J. Maas, A. L. Van
Kessel i W. G. Zijlstra, IFCC reference measurement procedure for substance concentration determination of
total carbon dioxide in blood, plasma or serum, IFCC 2001/3, Clin. Chem. Lab. Med. 39 (2001) 283-289.
5. R. W. Burnett, A. K. Covington, N. Fogh-Andersen, W. R. Külpmann, A. H. J. Maas, O. Müller-Plathe, O.
Siggaard-Andersen, A. L. Van Kessel, P. D. Wimberley i W. G. Zijlstra, Recommendations for measurement and
conventions for reporting sodium and potassium by ion-selective electrodes in undiluted serum, plasma or whole
blood, IFCC 2000/3, Clin. Chem. Lab. Med. 38 (2000) 1065-1071.
6. R. W. Burnett, A. K. Covington, N. Fogh-Andersen, W. R. Külpmann, A. H. J. Maas, O. Müller-Plathe, O.
Siggaard-Andersen, A. L. Van Kessel, P. D. Wimberley i W. G. Zijlstra, IFCC recommended reference method
for the determination of the substance concentration of ionized calcium in undiluted serum, plasma or whole
blood, IFCC 2000/2, Clin. Chem. Lab. Med. 38 (2000) 1301-1314.
7. A. K. Covington, Introduction: Basic electrode types, classifications, and selectivity considerations, u Ion
Selective Electrode Methodology, A. K. Covington (ur.), CRC Press, Boca Raton (FL) 1979, vol. 1, str. 1-20.
8. A. K. Covington i M. I. A. Ferra, Calculation of single ion activities in solutions simulating blood, Scand. J. Clin.
Lab. Invest. 49 (1989) 667-675.
9. K. Hartman, S. Luterotti, H. F. Oswald, M. Oehme, P. C. Meier, D. Ammann i W. Simon, Chloride-selective
liquid-membrane electrodes based on lipophilic methyl-tri-N-alkyl-ammonium compounds and their applicability
to blood serum measurements, Mikrochim. Acta 1978 II, 235-246.
10. J. Havas, Ion- and Molecule-selective Electrodes in Biological Systems, Akadémiai Kiadó, Budapest 1985.
11. J. Höper, M. Kessler i W. Simon, Measurements with ion-selective surface electrodes (pK, pNa, pCa, pH) during
no-flow anoxia, in Ion and Enzyme Electrodes in Biology and Medicine (ur. M. Kessler, L. C. Clark, D. W.
Lübbers, I. A. Silver, W. Simon), Urban & Schwarzenberg, München 1976, str. 331-334.
12. S. Luterotti, Cl- selektivne elektrode s kvarternim amonijevim solima, neobjavljeni rezultati
13. A. H. J. Maas, H. F. Weisberg, R. W. Burnett, O. Müller-Plathe, P. D. Wimberley, W. G. Zijlstra, R. A. Durst i O.
Siggaard-Andersen, Approved IFCC methods. Reference method (1986) for pH measurement in blood, IFCC
1987/3, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 25 (1987) 281-289.
14. A. H. J. Maas, H. F. Weisberg, R. W. Burnett, , O. Mueller-Plathe, P. D. Wimberley, W. G. Zijlstra, R. A. Durst i
O. Siggaard-Andersen, Approved IFCC methods: Reference method (1986) for pH measurement in blood, Clin.
Chim. Acta 165 (1987) 97-109.
15. P. C. Meier, D. Ammann, H. F. Oswald i W. Simon, Ion-selective electrodes in clinical chemistry, Med. Progr.
Technol. 5 (1977) 1-12.
16. M. E. Meyerhoff i W. N. Opdycke, Ion selective electrodes, Adv. Clin. Chem. 25 (1986) 1-47.
17. H. Pallmann, Hydrogen ion activity in dispersion and colloidaly dispersed systems, Kolloidchem. Beihefte 30
(1930) 334-405.
18. O. Siggaard-Andersen, R. A. Durst i A. H. J. Maas, Approved recommendation (1984) on physico-chemical
quantities and units in clinical chemistry with special emphasis on activities and activity coefficients, IFCC
1987/7, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 25 (1987) 369-391.

38
19. O. Siggaard-Andersen, R. A. Durst i A. H. J. Maas, Physicochemical quantities and units in clinical chemistry
with special emphasis on activities and activity coefficients, Ann. Biol. Clin. 56 (1987) 89-109.

39
 Svjetlana Luterotti

VALIDACIJA BIOANALITIČKIH METODA

«Doing a thorough method validation can be tedious, but the consequences

of not doing it right are wasted time, money and resources»

(iz J. Mark Green, A Practical Guide to Analytical Method Validation, Analytical

Chemistry News & Features, May 1, 1996, 305A-309A.) (pres. 1)

I. dio

VALIDACIJA U KEMIJSKOJ ANALIZI - TEMELJNI PRINCIPI I RAZVOJ

Kroz niz godina su analitički kemičari u farmaceutskom i biomedicinskom području

učili kako pokazati da njihove metode imaju značajke koje garantiraju pouzdane rezultate.
Nakon pojave dobre laboratorijske prakse (GLP) taj postupak poznajemo kao validaciju
analitičke metode. Validacija metode je važan zahtjev u kemijsko-analitičkoj praksi.
Zadnjih 20-ak godina mnogo pažnje je posvećeno standardizaciji i validaciji analitičkih
metoda s jedne strane te osiguranju kvalitete laboratorija s druge strane koji trebaju
poboljšati kvalitetu i pouzdanost analitičkih rezultata. Validacija metode mora biti
popraćena vrlo iscrpnom dokumentacijom.
Provedba temeljite i potpune validacije je mukotrpan proces ali je kvaliteta podataka
koji se dobivaju ispitanom metodom direktno povezana s kvalitetom ovog procesa.
Vremenska ograničenja često onemogućavaju dovoljnu validaciju metode. Mnogi su
istraživači iskusili posljedice nevaljanih metoda i ustanovili da su vrijeme i sredstva
potrebna da se riješe problemi na koje se kasnije naišlo nadmašili ona koji bi bili utrošeni u
početku da je validacija provedena ispravno.
Niz je meñunarodnih institucija i publikacija koje daju smjernice o validaciji
analitičkih metoda. To su US FDA Guidances [npr., Analytical Procedures and Methods
Validation, Requesting Methods Validation for Abbreviated New Drug Applications
(ANDAs)], Bioanalytical Method Validation, Mass Spectrometry for Confirmation of the
Identity of Animal Drug Residues - Draft, Guideline for Submitting Samples and Analytical
Data for Methods Validation, Protocol for the Conduct of Method Transfer for Type C
Medicated Feed Assay Methods) ;ICH (npr., ICH - Guidance for Industry, Q2A - Text on
Validation of Analytical Procedures, Q2B - Validation of Analytical Procedures -
Methodology); ostale oficijelne smjernice, npr., EURACHEM (The Fitness for Purpose of

1
Analytical Methods) koji je vjerojatno najdetaljniji oficijelni dokument za validaciju
metoda; EMEA Guide (Residues: Guidance for Generating and Reporting Methods of
Analysis in Support of Pre-registration Data Requirements for Annex II (part A, Section 4)
and Annex III (part A, Section 5) of Directive 91/414); US EPA Guide (Guide to Method
Flexibility and Approval of EPA Water Methods); TGA Guide (Australia) (Starting
Material Analytical Procedure Validation for Complimentary Medicines, March 2006);
NATA (Technical Note #17 - Guidelines for the Validation and Verification of Chemical
Test Methods, April 2009); IUPAC Technical Report (Harmonized Guidelines for Single
Laboratory Validation of Methods of Analysis, u Pure Appl. Chem. 74 (5) (2002) 835-
855.); AOAC (How to Meet ISO 17025 Requirements for Method Verification, 2007).

ŠTO JE VALIDACIJA?
Validacija metode proces je dokazivanja da je neka analitička metoda prihvatljiva za
svrhu kojoj je namijenjena, odnosno kojom se na temelju laboratorijskog rada ustanovljava
da li izvedbene značajke metode zadovoljavaju zahtjeve analitičke primjene. Dakle, proces
evaluacije izvedbenih kriterija i potvrda da je metoda pogodna je validacija metode.
Izvedbene značajke izražene su kao analitički parametri pa metode koje se podnose
na službeno odobrenje moraju uključivati ispitivanja tih analitičkih parametara
(«performance characteristics»). Proces validacije treba slijediti plan koji uključuje okvir
zadatka metode, njene izvedbene značajke i granice prihvatljivosti. Parametri koji se
obično ispituju su granice dokazivanja i odreñivanja, ispravnost, preciznost uključujući i
reproducibilnost («ruggedness»), selektivnost/specifičnost, linearnost, koncentracijsko
područje i robustnost («robustness»). Izvještaj o validaciji treba biti detaljan sa svim
eksperimentalnim uvjetima i potpunom statističkom obradom podataka te treba pokazati u
kojoj mjeri metoda zadovoljava postavljene kriterije.
Prije rutinske primjene, metodu treba validirati ili revalidirati kada god se mijenjanju
uvjeti pri kojima je metoda validirana (npr. promjena matrice uzorka; ili promjena
instrumenta, npr., ako je HPLC metoda validirana s pumpom volumena zadržavanja od 6
cm3, a nova pumpa je volumena zadržavanja od 0,6 cm3; ili kad god se mijenja metoda a
novi parametar je izvan radnog područja, npr. ako je temperatura kolone specificirana na
30-40 oC metodu treba revalidirati ako se iz bilo kojeg razloga kao nova temperatura
odabire 41 oC, itd.).
Iako postoji suglasnost o tome koja ispitivanja treba provesti postoje razlike u
gledištima kako ih treba provesti. Zahtjevi validacije se stalno mijenjaju i jako variraju
ovisno npr. o tipu lijeka koji se ispitiuje, stupnju razvoja lijeka i službenom tijelu kojem se
aplikacija podnosi. Proces validacije ne može se odijeliti od stvarnog razvoja uvjeta metode
jer onaj koji metodu razvija ne može znati da li su uvjeti metode prihvatljivi ili ne sve dok
se ne provedu validacijska ispitivanja. Razvoj i validacija nove analitičke metode trebaju
biti jedan iterativni proces. Rezultati validacije mogu ukazati da je potrebna izmjena u
postupku koja onda traži revalidaciju.
Meñunarodna regulatorna tijela/publikacije koje se bave analitičkom terminologijom
i validacijom su npr., IUPAC – International Union of Pure and Applied Chemistry, ILAC
– International Laboratory Accreditation Conference, WELAC – Western European
Laboratory Accreditation Cooperation, ICH – International Conference on Harmonization
(16-18), ISO – International Organization for Standardization, Eurachem (8), EPA (34),
FDA (33-36), AOAC International (Association of Official Analytical Chemists) (1),
EDQM – European Directorate for the Quality of Medicines & Health Care (7), USP
Convention (37-40), Society of Japan Pharmacopoeia (19), British Pharmacopoeia

2
Commission (3), etc. Neki od značajnih autora na polju validacije su Braggio sa
suradnicima (2), Conacher (4), de Ruig (26), Green (10), Hokanson (12, 13), Huber (14,
15), Renger sa suradnicima (25), Shah i sur. (29, 30), Szepesi i sur. (31), Vessman (41),
Wegscheider (42), i drugi.
«EURACHEM guide» (8) važan je dokument u ovom području. Prema njemu
validacija metode je srodna razvoju metode; tamo gdje završava razvoj metode započinje
validacija metode. Mnoge izvedbene značajke metode koje su vezane uz validaciju su već
procijenjivane barem, aproksimativno tijekom razvoja metode.
Valja imati na umu da različita regulatorna tijela propisuju različite zahtjeve
validacije. Npr., US FDA, USP i ICH formirali tri različita seta validacijskih zahtjeva
stvarajući zabunu meñu praktičarima koji rade u industriji (tablica 1) (28).

Tablica 1. ICH, USP i FDA validacijski parametri (prema ref. 28)

(pres 2)
Validacijski parametar ICH/USP FDA FDA GMP
(zakonski)
Specifičnost + +
Ispravnost + +
Preciznost +
Repetabilnost +
Intermedijarna +
preciznost
Reproducibilnost* + + +
Granica dokazivanja +
Granica odreñivanja +
Osjetljivost + +
Analitički povrat +
Linearnost +
Područje +
Reproducibilnost +
(«ruggedness»)*
Izdržljivost, otpornost + +
(«robustness») *,**
Stabilnost otopine +
uzorka
Prikladnost sustava +
GMP – good manufacturing practice
* ICH i USP.
** Dio USP.
*** Dio ICH ali nije obavezan.

3
KADA SE I ZAŠTO METODA VALIDIRA?
Metoda se validira onda kada je potrebno verificirati da su njezine izvedbene
značajke adekvatne u rješavanju nekog analitičkog problema. Npr., kada se:
- razvija nova metoda za odreñeni problem
- već postojeća metoda revidira da bi ju se unaprijedilo ili joj proširilo djelokrug
- već postojeća metoda koristi u drugom laboratoriju, s različitim analitičarima ili
različitom instrumentacijom
- dokazuje ekvivalencija izmeñu dviju metoda, npr. nove metode i standardne
metode.
Obim validacije ili revalidacije ovisi o prirodi promjena učinjenih pri ponovnoj
primjeni metode u drugim laboratorijima, s drugim instrumentima, operaterima, i pri
drugim uvjetima. Laboratorij treba odlučiti koje se izvedbene značajke trebaju
karakterizirati da bi se metoda validirala. Tako npr., validacija metode za analizu hrane
treba biti usklañena sa strategijom validacije AOAC International.
Analitička kontrola mora biti provedena validiranim metodama (26). Laboratorij
mora imati detaljni protokol metode koju koristi. Validacija metoda za sve moguće
situacije tj. sve vrste analita u mnogovrsnim matriksima, interlaboratorijskim ispitvanjima
pomoću detaljno opisanih metoda je neprovediva zbog financijskih ograničenja, nedostka
analitičkog kapaciteta i nemogućnosti standardizacije visoko sofisticirane instrumentacije
izmeñu laboratorija. No, metode, naročito one koje se koriste u službenoj kontroli, moraju
biti validirane.
Niz je službenih tijela koja postavljaju standardizirane, preporučene ili oficijelne
metode analize (5). Pristup je taj da se preuzme publicirana metoda, provjeri njena
primjenjljivost i područje rada i ako je moguće unaprijed otpornost te se takvu metodu
podvrgava kritičkom ispitivanju u što većem broju laboratorija, koristeći široki raspon
uzoraka. Reproducibilnost se ustanovljava kolaborativnim ispitivanjima koja se provode
prema priznatim protokolima. Metoda se tada piše u zadanom obliku i svaki kompetentni
laboratorij trebao bi biti sposoban da ju koristi i dobije slične rezultate.
Prvi korak u razvoju metode i validacijskom ciklusu je postavljanje minimalnih
zahtjeva koji su specifikacije prihvatljivosti metode te moraju biti prihvaćeni od ponuñača i
korisnika. Tri su stupnja u razvoju i validaciji analitičke metode:
- procjena prihvatljivih izvedbenih značajki u laboratoriju
- dokazivanje uspješne izvedbe u ograničenom interlaboratorijskom ispitivanju
- dokazivanje uspješne izvedbe u kolaborativnom ispitivanju.
Stupanj pouzdanosti validacije metode raste od prvog prema trećem stupnju. Treći
stupanj je najviši stupanj validacije metode.

PARAMETRI VALIDACIJE I STRATEGIJA VALIDACIJE ANALITIČKE METODE

Valjanost metode treba dokazati laboratorijskim eksperimentima koristeći uzorke ili
standarde koji su slični nepoznatim uzorcima koji se rutinski analiziraju. Validacija se
provodi prema pisanom protokolu tj. korak po korak. Najprije valja definirati zadatak
metode i validacijske kriterije koji uključuju sastav matriksa uzorka, tip informacije
(kvalitativna ili kvantitativna), DL («detection limit») i QL («quantitation limit»), područje
linearnosti, preciznost, ispravnost, tip opreme i njezin smještaj. Prije upotrebe instrumenta

4
za validaciju metode treba verificirati njegove značajke primjenom generičkih standarda
(14, 15). Npr., ako je za neku metodu kritična DL vrijednost valja verificirati šum
instrumenta za odreñene detektore i odgovor na odreñeni spoj. Svim supstancijama koje se
koriste za validaciju kritičnih parametara, npr. reagensima i referentnim standardima treba
ispitati točni sastav i čistoću.
Ako imamo malo informacija o izvedbenim značajkama metode ili ih upće nemamo
prikladnost metode za svoju namjenu treba dokazati preliminarnim pokusima koji
uključuju približnu preciznost, radno područje i DL. Ako se dobivaju neprihvatljivi
rezultati analize treba promijeniti ili samu metodu, opremu, tehniku ili granice
prihvatljivosti. Na taj način razvoj metode i validacija čine jedan iterativni proces. Npr., u
tekućinskoj kromatografiji selektivnost se postiže odabirom odgovarajuće mobilne faze. Za
kvantitativna mjerenja faktor rezolucije dvaju pikova treba biti ≥2,6; ako se ova vrijednost
ne postiže sastav mobilne faze treba dalje optimirati. Standardnu metodu treba validirati u
vlastitom laboratoriju.
Analitički kemičari trebaju biti svjesni da nema univerzalnog sporazuma o
definiranju nekih pojmova u validaciji metode. Definicije nekih parametara razlikuju se
izmeñu raznih organizacija. Pokušaj harmonizacije za farmaceutske primjene učinjen je
kroz ICH (16-18) te ovisi o tipu analitičkog postupka.
Tablica 2 prikazuje analitičke zahtjeve i odgovarajuće analitičke parametre koje je
potrebno karakterizirati (8).

Tablica 2. Analitički zahtjevi i odgovarajuće izvedbene značajke (prema ref. 8) (pres 3)

Analitički zahtjev Odgovarajuće izvedbene značajke
Da li se očekuje kvalitativni ili kvantitativni Potvrda identiteta, selektivnost/specifičnost
odgovor? Granica dokazivanja
Granica odreñivanja
Da li je analit prisutan u više od jednog oblika, da li Izmjera (analitički povrat∗)
nas zanima analit koji se ekstrahira, koji je slobodan
ili ukupni analit?
Potvrda identiteta
Koji su analiti koji nas zanimaju i koje su njihove Potvrda identiteta
koncentracije? Granica dokazivanja
Granica odreñivanja
Radno i linearno područje
Koliko ispravan i precizan mora biti odgovor? Koliki Izmjera (analitički povrat*)
je dozvoljeni stupanj nesigurnosti i kako se on Ispravnost/istinitost (točnost)
izražava? Repetabilnost
Reproducibilnost
Koji su mogući interferenti? Selektivnost/specifičnost
Da li je rezultate potrebno usporeñivati s rezultatima «Ruggedness»/robustnost
drugih laboratorija? Reproducibilnost
Da li je rezultate potrebno usporediti s vanjskim Ispravnost
specifikacijama? Reproducibilnost

Minimalni kriteriji prihvatljivosti trebaju biti postavljeni za svaki parametar metode

(vidi dio II, tablica 7).

∗
Engl. – recovery

5
ISKAZIVANJE VALIDACIJSKIH PARAMETARA
Potvrda identiteta, selektivnost/specifičnost. – Validirana metoda mora pokazati da
odgovor analita može biti pripisan samo jednoj komponente. Prema Eurachem-u (8)
potrebno je analizirati uzorke (koji sadrže moguće interferente u prisutnosti analita) i
referentne materijale metodom koja se ispituje, i drugim neovisnim metodama. Važno je
ustanoviti sposobnost metode da potvrdi identitet analita i da ga izmjeri u prisutnosti
mogućih interferenata. Treba ispitati da li interferenti pojačavaju ili inhibiraju dokazivanje
i odreñivanje analita; ako je u pitanju ovo drugo treba potražiti drugu metodu.
USP 29 (40) i BP 2007 (3) definiraju specifičnost analitičke metode kao sposobnost
da se analit nedvosmisleno izmjeri u prisustvu nekih drugih sastavnica, kao što su
onečišćenja, razgradni produkti i sastavnice matriksa uzorka. Termin selektivnost je
prikladniji jer postoji vrlo malo metoda koje odgovaraju na samo jedan analit. Oba pojma
treba pažljivo razlikovati; Vessmann (41) naglašava razlike izmeñu specifičnosti i
selektivnosti onako kako ih definiraju WELAC i ICH.
Specifičnost analitičke metode je sposobnost da se ispravno (i specifično) izmjeri
(odgovor) analit(a) u prisustvu (potencijalnih) sastavnica uzorka tj. onih koje se očekuju
kao sastavnice matriksa uzorka, odnosno sposobnost metode da izmjeri samo ono za što je
namijenjena da izmjeri. Npr., imunokemijska ispitivanja trebaju biti visoko specifična jer
se njima odredjuje samo analit, a ne metaboliti. U kvalitativnim ispitivanjima treba
pokazati da je pozitivan rezultat posljedica prisustva analita a ne njemu strukturno sličnih
ili srodnih spojeva (40). Odgovor analita u ispitivanim smjesama koje sadrže analit i sve
potencijalne sastavnice uzorka usporeñuje se s odgovorom otopine koja sadrži samo analit.
Specifičnost se zato često procjenjuje i izražava kao veličina odstupanja rezultata
ispitivanja dobivenih analizom uzoraka koji sadrže dodana onečišćenja, razgradne
produkte, srodne kemijske specije ili placebo sastavnice od onih dobivenih na uzorcima
bez ovih dodataka (kod kvantitativne analize) (40, 3). Ovo odstupanje može se izraziti kao
razlika u rezultatima analize izmeñu dviju grupa uzoraka. Za analizu ljekovitih proizvoda
selektivnost treba dokazati ispitivanjem smjese inaktivnih tvari (placebo oblik,
meñuprodukti sinteze, ekscipijensi, razgradni produkti, onečišćenja tijekom sinteze, itd.). U
toku razvoja metode selektivnost treba dokazati i u odnosu na razgradne produkte lijeka
njegovom namjernom razgradnjom kiselinom, lužinom, oksidansima i intenzivnim
osvjetljivanjem. Obično se analit podvrgne stresnim uvjetima dovoljnim da ga se razgradi
do čistoće 80-90%. Za sirovine lijekova tipični stresni uvjeti su toplina (50-60 oC), svjetlo
(600 FC u UV), kiselina (0,1 mol dm-3 HCl), baza (0,1 mol dm-3 NaOH) i oksidans (3%
H2O2). Za ljekovite oblike valja ispitati utjecaj razgradnih produkata pomoćnih tvari pa se
stresnim uvjetima podvrgava placebo oblik, npr. uz toplinu, svjetlo i vlagu (70-80%, 85%).
Tada se analiziraju dobivene smjese te se u kromatografiji pik analita procjenjuje na
čistoću i rezoluciju od najbližeg eluiranog pika na baznoj liniji od barem 1,5 (11, 28). Kada
je jednom postignuta prihvatljiva rezolucija analita od potencijalnih sastavnica uzorka
kromatografski parametri kao što su tip kolone, sastav mobilne faze, brzina protoka i način
detekcije smatraju se definiranima.
U svakoj metodi važno je izmjeriti reagens i «field» blankove (blankovi supstrata,
realni blankovi) da bi bili sigurni da u njima nije prisutan nikakav interferent kao ni analit.
«Field» blankove treba izmjeriti za svaki proizvod. Da bi se potvrdio identitet i količina
analita idealan pristup je korištenje dva potpuno različita analitička principa no u kriznim
situacijama to često nije moguće zbog nedostatka vremena (4). Npr., kod organskih analita
se spektrometrijom masa potvrñuje identitet i utvrñuje količina analita. Kemijskim

6
reakcijama tj. derivatizacijom funkcionalne skupine nakon koje slijedi analiza ili
primjenom detektora koji rade na različitim principima postiže se selektivnost u
kromatografiji. U LC selektivnost se postiže i odabirom optimalne kolone i postavljanjem
kromatografskih uvjeta kao što su sastav mobilne faze, temperatura kolone i λ detekcije.
Danas se «on-line» primjenom UV/Vis «diode array» detektora i spektrometra masa
dobivaju spektri tijekom eluacije pika koji pokazuju da li je pik čist ili nije. Tek kada je
čistoća pika sigurno potvrñena (preko «peak angle» i «treshold angle» vrijednosti) prelazi
se na kemijsku, strukturnu identifikaciju analita kombinacijom UV, MS i NMR spektara
dobivenih iz suvremenih HPLC instrumenata (20). Kod anorganskih analita problem se
rješava obično tako da se koriste različite λ (npr. kod AAS) ili da se koriste posve različiti
mjerni sustavi (npr., ICP vs. AAS, X-zrake vs. AAS, etc.).
Kada su onečišćenja ili razgradni produkti neidentificirani ili promjenjljivi
specifičnost se može iskazati na temelju analize uzoraka koji sadrže onečišćenja ili
razgradne produkte ispitivanom metodom te usporedbom ovih rezultata s rezultatima
dodatnih ispitivanja čistoće (npr. kromatografija koja je obično selektivna tehnika,
topljivost faza, skenirajuća kalorimetrija). Stupanj slaganja rezultata je tada mjera
specifičnosti.
Kod bioanalitičkih postupaka da ispitivanje ne bi trpjelo zbog interferencija
endogenih spojeva rade se analize kontrolnih slijepih uzoraka. Nadalje, valja dokazati
selektivnost s obzirom na metabolite, a u kasnijim fazama razvoja lijeka treba dokazati
selektivnost i s obzirom na druge, istovremeno uzete lijekove (politerapija): slijepi matriks
valja obogatiti s tim lijekovima i njihovim metabolitima pri maksimalno očekivanoj
koncentraciji u kliničkim uzorcima (2).
Radno i linearno područje, kalibracijska linearnost/funkcija. – Eurachem (8) kaže
da valja analizirati slijepi uzorak i referentne materijale ili obogaćene slijepe uzorke pri
raznim koncentracijama; potrebno je barem 6 koncentracija + slijepi uzorak. U grafičkom
prikazu odgovora u funkciji koncentracije vizualno se procjenjuje linearno područje te
gornja i donja koncentracijska granica. Zatim, se tri puta mjere referentni materijali ili
obogaćeni slijepi uzorci pri 6 različitih koncentracija unutar linearnog područja, te vizualno
iz grafičkog prikaza prepoznaju «bjegunci»*, računa se koeficijent korelacije (R) i
rezidualne y-vrijednosti.
Linearnost analitičke metode jest sposobnost da se izraze rezultati ispitivanja koji su
linearno proporcionalni koncentraciji analita u uzorku u datom koncentracijskom području,
neposredno ili preko dobro definirane matematičke transformacije. Ispitivanje linearnosti
verificira da su otopine uzorka u koncentracijskom području u kojemu je odgovor analita
linearno proporcionalan koncentraciji analita. Slučajna raspodjela oko pravca potvrñuje
linearnost dok sustavni trendovi indiciraju nelinearnost. «Bjegunce» ne treba maknuti dok
se ne napravi provjera pri bliskim, susjednim koncentracijama. Ponekad je bolje «fit»-ati
nelinearnu funkciju, no funkcije koje su višeg reda od kvadratnog se ne preporučuju.
Granica odreñivanja obično čini donju granicu radnog područja.
Gradijent analitičkog odgovora odnosno promjena odgovora instrumenta s
promjenom koncentracije analita je kalibracijska osjetljivost te nije isto što i DL. To je
nagib kalibracijskog pravca (npr., «a»). Ako je funkcija odgovora linearna, kalibracijska
osjetljivost služi za računanje granice odreñivanja analita.
Prema dugim izvorima, ovo se ispitivanje obično provodi na temelju 3-6 mjerenja
(npr., injektiranja u kromatografiji) primjenom serije standardnih otopina pri najmanje 5
*
Engl. – outlier

7
koncentracija koje pokrivaju 50-150% (10) ili 25-125% (12) ciljane koncentracije analita.
Najmanje pet koncentracijskih nivoa potrebni su da se detektira zakrivljenost ucrtanih
podataka. U postupku postavljanja konačne metode obično se koriste 3 standarda i pri 80,
100 i 120% od ciljane koncentracije (10, 15). Prema USP 29 (40) i BP 2007 (3) područje za
postupke odreñivanja aktivne tvari iznosi 80-120% ciljane koncentracije, kod odreñivanja
ujednačenosti sadržaja 70-130%, kod odreñivanja onečišćenja od granice onečišćenja do
120% (3) odnosno 50-120% (40), a za ispitivanja otpuštanja ±20% oko očekivane
koncentracije. Validacija preko šireg koncentracijskog područja osigurava da rutinske
standarde odmaknemo od koncentracija s nelinearnim odgovorom, te da metoda pokriva
dovoljno široko područje odnosno da uključuje granice ispitivanja ujednačenosti sadržaja i
da omogući kvantitaciju sirovih uzoraka. Za metode kvantitacije onečišćenja linearnost se
procjenjuje u prisustvu ljekovite supstancije pripravom standardnih otopina pri 5
koncentracijskih razina preko područja 0,05-2,5% (m/m).
Linearnost se obično izražava kao varijanca nagiba regresijskog pravca koji se dobije
metodom najmanjih kvadrata iz rezultata dobivenih analizom uzoraka s promjenjljivom
koncentracijom analita. Prihvatljivost podataka za linearnost često se procjenjuje
ispitivanjem koeficijenta korelacije, R, i y-odsječka linije regresije za funkciju analitički
odgovor vs. koncentracija analita. Koeficijent korelacije od >0,999 se obično smatra
dokazom prihvatljivog uklapanja podataka u regresijski pravac. Odsječak na ordinati treba
biti manji od nekoliko postotaka odgovora dobivenog za analit pri ciljanoj koncentraciji
odnosno ne smije biti značajno različit od nule. Da bi se to ustanovilo treba provesti
statističko testiranje; ukoliko odsječak nije statistički značajno različit od nule, smije ga se
zanemariti i koristiti idealni kalibracijski pravac. Ako odsječak na ordinati jeste začajno
različit od nule valja pokazati da on ne utječe na ispravnost metode. Ovi parametri ipak
mogu dovesti do pogrešnih zaključaka pa se ne smiju primijeniti bez vizuelnog ispitivanja
funkcije odgovora (npr., visina ili površina pika) vs. koncentracija. S obzirom na to da je
odstupanje od linearnosti katkada teško detektirati mogu se koristiti još dva dodatna
pristupa. Prvi je da se prikažu devijacije od regresijske linije vs. koncentracija ili log
koncentracije analita (slika 1). U linearnom području odstupanja će biti podjednako
distribuirana izmeñu pozitivnih i negativnih vrijednosti (24, 11). U tu svrhu računa se i RSS
(«residual sum of the squares») (27) čija brojčana vrijednost treba biti što je moguće manja
u slučaju valjane linijske regresije (pres. 4):
1
RSS = Σ(yp – ymj)2
N
yp – vrijednost analitičkog signala procijenjena iz kalibracijske funkcije, ymj – izmjerena vrijednost
analitičkog signala, N – broj koncentracijskih razina analita
Drugi je pristup da se vrijednost analitičkog signala podijeli s koncentracijom analita
i dobije tzv. relativni odziv ili faktor odziva («response factor», 10, 15) te on grafički
prikaže u odnosu na koncentraciju analita (slika 1). Dobivena funkcija treba biti linearna i
vodoravna kroz cijelo područje linearnosti. Kod većih koncentracija dolazi do negativne
devijacije od linearnosti. Korištenje logaritamske skale može proširiti koncentracijsko
područje analita. Relativni odziv pokazuje linearnost sve do točke kod koje on presijeca
liniju 95%:
faktor odziva = (anal. signal – y0)/konc. analita
y0 – odsječak na ordinati
ili, ako odsječak na ordinati nije značajno različit od nule:

8
 faktor odziva = anal. signal /konc. analita

U završnici ispitivanja linearnosti treba postaviti valjano koncentracijsko područje za

standarde. Općeniti pristup za ispitivanje ljekovitih proizvoda koristi kalibraciju s jednom
koncentracijom referentnog standarda (12). Kako se pretpostavlja da je faktor odziva
jednak i za uzorak i za standarde, validacijom radnog područja treba identificirati
koncentracijsko područje u kojem je ovaj omjer stalan. Ispravni rezultat može se postići
samo onda ako se faktori odziva za uzorke različitih koncentracija unutar radnog područja
dobro podudaraju s onima standarda.
Primjeri kriterija (10): koeficijent korelacije za svaku od 3 krivulje (5 koncentracija
na svakoj) treba biti R ≥0,99 za koncentracijsko područje 80-120% ciljane koncentracije;
odsječak na osi y treba biti ≤2% signala ciljane koncentracije. Alternativni kriterij je da
funkcija faktora odziva vs. koncentracija pokaže sve vrijednosti unutar ±2,5% faktora
odziva za ciljanu koncentraciju u koncentracijskom području 80-120%. Kod analize
onečišćenja, treba biti R ≥0,98 za svaku od 3 krivulje (5 koncentracija u svakoj) u području
0,1-2,5% glavne sastavnice, dok odsječak na osi y treba biti ≤10% odgovora dobivenog za
2,5% (m/m) onečišćenja. Alternativno, funkcija faktora odziva vs. koncentracija treba dati
sve vrijednosti unutar ±5% od srednjeg faktora odgovora za konc. ≥0,5% (m/m) i unutar
±10% srednjeg faktora odziva za konc. <0,5% (m/m).

Slika 1. Grafički prikazi arbitrarne linijske funkcije: a) analitički signal vs. konc. analita, b) faktor odziva vs.
log koncentracije analita (Rc – linija konstantnog odziva) (prema ref. 15). (pres. 5)

9
 Pri postavljanju kalibracijskog pravca obično se ne uključuju slijepi uzorci i ne
zahtijeva se kalibracija kroz nulu, ali R treba biti >0,99. Bolji je kriterij odreñivanje
preračunate (interpolirane) koncentracije dobivene unošenjem mjerenog odziva za svaki
standard u regresijsku jednadžbu. Postotno odstupanje za svaku kalibracijsku razinu računa
se kao:
odstupanje (%) = [(nominalna konc. – interpol. konc.)]x100/nominalna konc.
Kalibracijska funkcija je prihvatljiva onda kada nijedan standard nema odstupanje
>20%. Ako takvih odstupanja ipak ima, do dva standarda se smiju odbaciti (bjegunci) i
ponoviti linijsku regresiju. Kalibracija je neprihvatljiva ako treba odbaciti više od 2
standarda ili ako ih preostane manje od 5. Nadalje, regresijska linija treba imati nagib blizu
1, s odsječkom blizu 0. Odsječak ne smije prijeći vrijednost 20% signala pri granici
odreñivanja. Dobra linearnost postiže se u kromatografiji dok se jača odstupanja od
linearnosti opažaju, npr., u imunokemijskim analizama.
Kalibracijska osjetljivost. – Kalibracijska osjetljivost je nagib kalibracijskog pravca,
i važan je parametar unutar validacijskog procesa. Npr., u FAAS analizama poznat je
utjecaj sastavnica matriksa uzorka na veličinu analitičkog signala. Promjene kalibracijske
osjetljivosti mogu tada kvantitativno opisati interferencije kao posljedicu pojedinačnih ili
kombiniranih efekata matriksa koje ugrožavaju ispravnost, te osigurati prepoznavanje
mogućih izvora sustavnih pogrešaka. Ovamo spadaju kemijske i fizičke interferencije
sastavnica, npr., bioloških uzoraka (kliničkih uzoraka, hrane, itd.), koje mogu dovesti do
promjene područja linearnog odgovora, kalibracijske osjetljivosti i odsječka pravca (21-
23). Ovakva ispitivanja mogu se temeljiti i na kratkom multifaktorski dizajniranom
eksperimentu («short multifactial design», SMD) (vidi II. dio, str. 22). Pokazalo se da je t-
testiranje paralelnosti kolektivnih kalibracijskih pravaca selektivniji pristup u procjeni
efekata pojedinih parametara na kalibracijsku osjetljivost nego SMD. Prvi pristup izvlači
više faktora nesigurnosti od SMD-a koji tolerira greške čak veće od 10%. SMD svejedno
može biti koristan jer indicira smjer analitičke pogreške. Može se dakle preporučiti
kombinacija oba pristupa.
Zbog mogućih interakcija sastavnica kompleksnih uzoraka, kao što su tkiva (npr.
jetra) ili biološke tekućine, pojedinačni efekti matriksa nisu jednostavno aditivni u bi- i
multi-komponentnim smjesama. Tako je pod različitim eksperimentalnim uvjetima i uz
različiti sastav kalibracijskih standarda moguće konstruirati setove kalibracijskih funkcija.
Mogu se uočiti rotacijski (utjecaj na kalibracijsku osjetljivost) i translacijski efekti (utjecaj
na y-odsječak) na kalibracijski pravac.
Ispravnost i točnost. – Ispravnost predstavlja prema prema ISO 3534-1
(Eurachem98) blizinu rezultata stvarnoj vrijednosti. Ponekad ju se naziva "trueness"
(istinitost) (18). Valja prepoznati sustavne i slučajne efekte na rezultat. Zato se ispravnost
(“accuracy”) ispituje kao dvije komponente: istinitost (točnost, «trueness») i preciznost.
Preciznost predstavlja mjeru meñusobne blizine pojedinačnih rezultata unutar seta tj.
raspršenost rezultata oko aritmetičke sredine te se izražava standardnom devijacijom (SD)
kao mjerom rasipanja vrijednosti.
Prema ICH (18), USP 29 (40) i BP 2007 (3) ispravnost analitičke metode jeste
blizina rezultata dobivenih ispitivanom metodom odnosno izmjerenih vrijednosti i stvarne
vrijednosti uzorka te se izražava kao postotna greška (% odstupanja, «% bias»); ova
definicija odgovara samo pojmu «trueness» (istinitost, točnost) prema Eurachem-u (8), i ne
uključuje preciznost. Ova ispitivanja mjere efekte matriksa uzorka na rezultate za analit i
efikasnost postupka priprave uzorka.

10
 Za procjenu ispravnosti (10, 8) stvarnu vrijednost može se dobiti na 4 načina:
1. Analizom uzorka poznate koncentracije, npr. primjenom SRM-a odnosno CRM-a
(«standard reference material» odnosno «certified reference material»), i usporedbom
izmjerene vrijednosti sa stvarnom vrijednošću koja je iskazana certifikatom. Analiziraju se
slijepi uzorak s reagensom («reagent blank») i referentni materijal primjenom predložene
metode 10 puta, vrijednost za referentni materijal korigira se vrijednošću slijepog uzorka te
usporeñuje sa stvarnom ili prihvaćenom vrijednosti za referentni materijal. Neki od
svjetskih proizvoñača takvih materijala su: Institute for Reference Materials and
Measurements (IRMM, Geel, Belgija, proizvodi npr. «BCR-485, Mixed vegetables» s
deklariranim sadržajem karotenoida i drugih vitamina, humani serum BCR-637, 638 i 639
s deklariranim sadržajem Al, Se, Zn, itd.), NIST (National Institute of Standards and
Technology (Gaithersburg, MD, SAD), SERO AS (Billingstad, Norveška, koji proizvodi
npr. serum «SeronormTM Trace Elements serum L-1&L-2» s deklariranim sadržajima
metala u tragovima i teških metala), itd. Ipak, iako su dobro karakterizirani, ovakvi uzorci
nisu dostupni za mnoge nove analite srodne lijekovima. Ako takav materijal nije dostupan
slijepi matriks uzorka može se obogatiti s poznatom koncentracijom analita pa se računa
analitički povrat (izmjera, «recovery»). Ovdje valja voditi računa o tome da se što bolje
simulira realni uzorak. Izmjera ovisi o matriksu uzorka, postupku priprave uzorka i
koncentraciji analita. To je mjera efikasnosti metode da detektira sav analit prisutan u
izvornom uzorku, tj. mjera egzaktnosti metode te vrijedi za sve praktične svrhe. Odreñuje
se tako da se ispitivana metoda primijeni na uzorke, ili smjese pomoćnih tvari kojima su
dodane poznate količine analita i to iznad i ispod razina očekivanih u uzorcima. Istinitost
(«trueness») računa se iz rezultata ispitivanja kao postotak pronañenog analita. Izmjera
treba biti što bliža 100% ali je još važnije da je konstantna unutar kalibracijskog područja.
Zato se ona procjenjuje blizu ekstrema kalibracijskog područja i pri jednoj srednjoj
koncentraciji.
2. Usporedbom rezultata ispitivanja nove metode s rezultatima već postojeće metode
koja je poznata kao ispravna (referentna metoda). Za farmaceutska ispitivanja takva
alternativna metoda često nije dostupna.
3. i 4. temelje se na izmjeri poznatih količina analita dodanih u matricu uzorka.
3. Najšire primijenjeno ispitivanje izmjere provodi se tako da se analit dodaje u slijepe
matrice. Obogaćeni uzorci se pripravljaju u triplikatu pri tri koncentracijske razine u
području 50-150% (10) odnosno 75-125% od deklarirane koncentracije kod odreñivanja
sadržaja i 25-125% u studijama oslobañanja (12). Ako su potencijalna onečišćenja
izolirana njih valja dodati u matricu da bi simulirali nečiste uzorke. Za metode koje
analiziraju onečišćenja ili razgradne produkte obogaćeni uzorci se pripravljaju u triplikatu
na tri razine koncentracija u području koje pokriva očekivani sadržaj onečišćenja u uzorku
(0,1-2,5%, m/m). Koncentraciju analita u obogaćenim uzorcima valja odrediti istim
kvantitativnim postupkom koji će se koristiti i u konačnoj metodi (npr. isti broj konc.
standarda, isti broj injektiranja uzorka i standarda, etc.). Računa se postotna izmjera. Valja
imati na umu da se analit dodan uzorku može ponašati drugačije (obično dajući veću
izmjeru) od endogenog analita. Npr., kod AAS-a, specijacija endogenog analita može se
razlikovati od onog dodanog.
Procjena izmjere korisna je za nove ljekovite proizvode pri provedbi inicijalne
validacije metode te zajedno s linearnošću definira ukupno područje metode. Izmjera se
ispituje i dodatkom lijeka u smjesu ekscipijensa ljekovitog oblika, u onom odnosu koji je
prisutan u ljekovitom proizvodu. Za već uhodane proizvode, korisnije ju je ispitati kroz
svježe i kroz stare uzorke primjenom starih i novih postupaka te statistički usporediti

11
rezultate. Ako postoje značajne razlike treba ustanoviti da li one potječu iz značajki
proizvoda ili valjanosti nove metode.
Eurachem (8) kaže da se za procjenu izmjere analiziraju blankovi matriksa ili uzorci,
obogaćeni i neobogaćeni analitom, pri nizu koncentracija, i CRM, te se izmjera izražava
relativno u odnosu na obogaćivanje ili CRM.
4. Radi se o postupku standardne adicije koja se može upotrijebiti za odreñivanje
izmjere obogaćenog analita. Ovaj se pristup koristi onda kada nije moguće pripraviti slijepi
matriks uzorka. To se može dogoditi s liofiliziranim materijalom u kojem je specijacija
značajno različita kada je analit odsutan.
Primjeri kriterija: kriterij ispravnosti metode može biti onaj FDA da je srednja
izmjera (analitički povrat) 100±2% (10) kod svake koncentracije unutar područja 80-120%
ciljane koncentracije analita. Analitički povrat od 70% (2) odnosno 70-120% se obično
smatra prihvatljivim na razini tragova (ppb, niski ppm) (4). Za metodu analize onečišćenja
srednja izmjera treba biti unutar 0,1% apsolutno od teoretske koncentracije ili 10%
relativno (koje je veće) za onečišćenja u području 0,1-2,5%.
SMD koncept uspješno se može primijeniti da se ispitaju oni radni parametri koji
ugrožavaju ispravnost odreñivanja. Npr., kod odreñivanja Cu, Zn i Mn FAAS-om u
matriksima koji simuliraju homogenate jetre štakora ispitivan je utjecaj 7 parametara na
kalibracijsku osjetljivost (21-23).
Koncentracijsko područje. - Područje analitičke metode je koncentracijski interval
izmeñu gornje i donje razine analita (uključujući i granične) za koje se ustanovi da su
odreñene precizno, ispravno i linearno ispitivanom metodom. Područje se izražava u istim
jedinicama kao i rezultat analize (npr., %, mol dm-3, ppb). Kalibracijsko područje je
definirano očekivanim koncentracijama analita u uzorcima te će za kromatografsku analizu
biti u području linearnog odgovora detektora analita, gdje je odgovor izravno
proporcionalan koncentraciji. Ovo područje ne smije biti preširoko jer se pri ekstremima
gubi ispravnost i preciznost, a niti preusko. Ako područje treba biti široko kao u
toksikokinetičkim ispitivanjima preporučuje se validacija dva preklapajuća kalibracijska
područja pa se uzorci uključuju u šarže s niskom ili visokom kalibracijskom funkcijom (2).
U praksi, područje se odreñuje korištenjem podataka iz ispitivanja linearnosti i ispravnosti.
Uz pretpostavku da su, kako je ranije opisano, dobiveni prihvatljivi rezultati za linearnost i
ispravnost (izmjera) jedino preostaje procjena preciznosti. Podaci za preciznost mogu se
dobiti iz triplikatnih analiza obogaćenih uzoraka u ispitivanju ispravnosti.
Slika 2 ilustrira kako se preciznost mijenja u funkciji koncentracije analita. Tako
RSD vrijednosti značajno rastu uz pad koncentracije analita. Veća varijabilnost se očekuje
kada se razina analita približava granici dokazivanja. Ponuñač metode mora prosuditi kod
koje koncentracije nepreciznost postaje prevelika za primjenu metode.
Područje linearnosti je ono unutar kojega je dokazano da postupak daje linearni
odgovor detektora. Nekad se definira i dinamičko područje odgovora, gdje je
prepoznatljiva funkcionalna ali ne i linearna ovisnost analitičkog signala o koncentraciji
analita. Reproducibilni nelinearni odgovor može biti prihvatljiv, npr. kod imunokemijskih
postupaka.

12
 Slika 2. RSD u funkciji koncentracije analita (QL – «quantitation limit»). (pres. 6)

Primjer kriterija: Područje metode analize treba biti definirano kao koncentracijski
interval unutar kojega su dobiveni linearnost i prihvatljiva RSD (relativna standardna
devijacija). Za metodu odreñivanja onečišćenja prihvatljivo područje će biti definirano kao
koncentracijski interval preko kojega su prema gornjim kriterijima postignuti linearnost i
ispravnost te se postiže nepreciznost od ≤10%.
Linearnost i koncentracijsko područje procjenjuju se matematičkom obradbom
rezultata analize uzoraka s koncentracijom analita kroz proglašeno koncentracijsko
područje metode. Obično se računa regresijski pravac rezultata ispitivanja vs. koncentracija
analita. U nekim slučajevima da bi se dobila proporcionalnost podaci ispitivanja trebaju biti
podvrgnuti matematičkoj transformaciji prije regresijske analize, npr. logaritmiranju. Nagib
regresijskog pravca i njegova varijanca daju matematičku mjeru linearnosti; odsječak na
ordinati (y-odsječak) npr. je mjera potencijalne pogreške analize. Alternativno računanju
regresijskog pravca može se grafički prikazati funkcionalna ovisnost rezultata analize vs.
konc. analita. Područje metode se validira tako da se verificira da analitička metoda
osigurava prihvatljivu preciznost, istinitost (točnost) i linearnost kada se primijeni na
uzorke koji sadrže analit pri granicama područja kao i unutar područja.
Preciznost. – Preciznost analitičke metode jeste stupanj podudaranja pojedinačnih
neovisnih rezultata ispitivanja kada se postupak ponavlja na višestrukim uzorcima
dobivenim iz jednog cjelovitog homogenog uzorka. Dakle to je raspršenost rezultata
višestrukih analiza homogenog uzorka dobivenih pod identičnim uvjetima. Preciznost
pokazuje koliko dobro metoda funkcionira kod ponovljene primjene. Da bi ovo ispitivanje
imalo smisla mora ga se provesti koristeći egzaktni uzorak i standardni izvedbeni postupak
koji će se koristiti u završnoj metodi. Preciznost se odredjuje mjerenjem dovoljnog broja
alikvota homogenog uzorka da bi se mogla izračunati statistički valjana procjena SD ili
RSD (stariji naziv koeficijent varijacije, CV). Ova su ispitivanja zapravo neovisne analize
uzoraka koje su provedene potpunim analitičkim postupkom od priprave uzorka do
konačnog rezultata ispitivanja.
Prema ICH preciznost se može izraziti kao ponovljivost (repetabilnost,
«repeatability», ponekad «within-run», «intra-batch» ili «intra-assay» preciznost),
intermedijarna preciznost («intermediate precision») i reproducibilnost (3, 18, 40).
Interlaboratorijska preciznost (reproducibilnost) je najvažniji aspekt preciznosti jer mjeri
kolika se interlaboratorijska varijabilnost u interpretaciji rezultata dobivenih iz raznih
laboratorija smije tolerirati. Dakle, reproducibilnost je preciznost dobivena izmeñu

13
različitih laboratorija te treba verificirati da će metoda dati iste rezultate u raznim
laboratorijima. Ona se procjenjuje tako da alikvote jednog homogenog uzorka analiziraju
razni analitičari u raznim laboratorijima koristeći radne uvjete i uvjete okoline koji se od
laboratorija do laboratorija mogu razlikovati ali su još uvijek unutar specificiranih
parametara metode.
Ipak, moguće je mjeriti jednu komponentu ove preciznosti tj. intralaboratorijsku
preciznost koja se odnosi na primjenu postupaka unutar laboratorija kroz kratko vrijeme,
npr. svakih 3-5 dana (»day-to-day» ili «inter-day» preciznost) ili češće, uz istog analitičara
i istu opremu ali uz dnevno svježe uzorke, standarde, mobilnu fazu i reagense. U ranom
kliničkom razvoju lijeka ovo ispitivanje preciznosti je dovoljno, no ako se priključuju novi
analitičari potrebni su novi podaci o preciznosti. Repetabilnost je u većini slučajeva
prihvaćena kao kriterij za USP analitičke postupke. Repetabilnost je obično 1/2 do 1/3
reproducibilnosti. U farmaceutskoj kontroli kvalitete lako se postiže nepreciznost bolja od
1 ili 2% dok je u biološkim uzorcima vjerojatnija RSD od 16% pri graničnim
koncentracijama i 10% pri drugim koncentracijama. Za uzorke okoliša i hrane preciznost
jako ovisi o matriksu uzorka, koncentraciji analita i analitičkoj tehnici pa može varirati od
2 pa do više od 20%. Intermedijerna preciznost («intermediate precision») ili ukupna
intralaboratorijska reproducibilnost označava dugotrajnu varijabilnost mjernog procesa i
indicira varijacije unutar istog laboratorija, npr. u različitim danima ili kroz nekoliko
tjedana, s raznim analitičarima ili opremom npr., primjenom različitih instrumenata,
standarda i reagenasa različitih proizvoñača, kolona različitih proizvodnih šarži, etc.
[ponekad i «between-run», «inter-batch» preciznost (ili repetabilnost)].
Procjena preciznosti, I krug (10):
1. Ispitivanje preciznosti instrumenta ili repetabilnosti injektiranja (najmanje 10
injektiranja iste otopine uzorka u kromatograf);
2. Repetabilnost ili preciznost unutar analiza («intra-assay precision»): dobiva se
ponovljenim analizama alikvota homogenog uzorka koji su neovisno pripravljeni u istom
laboratoriju i u istom danu.
Primjeri kriterija: nepreciznost instrumenta (RSD) treba biti ≤1% (10, 11) te
repetabilnost ≤2% (10). Za metodu odreñivanja onečišćenja pri granici odreñivanja
nepreciznost instrumenta treba biti ≤5%, a repetabilnost ≤10%.
Proširivanje okvira (opsega) zadatka (10): kada je validacija kompletirana ponuñač
metode mora biti siguran u njezinu sposobnost da osigura dobro odreñivanje analita u
vlastitom laboratoriju. Dodatna ispitivanja trebaju osigurati da će metoda funkcionirati i u
drugom laboratoriju uz druge analitičare, instrumente i reagense, gdje će se koristiti kroz
dulje vrijeme. Područje rada odnosi se na broj različitih supstrata na koje se postupak može
uspješno primijeniti. Postupak, naročito u AOAC oficijelnoj metodi, smatra se valjanim
samo za one proizvode koji su uključeni u kolaborativno ispitivanje. Da bi se proširilo
područje primjene neke oficijelne metode može se zahtijevati minikolaborativno ispitivanje
koje onda pokazuje da se izvedbeni parametri dobiveni u glavnom ispitivanju mogu postići
i u drugim proizvodima.
Granica dokazivanja (pres. 7). – Eurachem ju prikazuje kao LoD (8), ICH kao DL
(18), ranije LOD (16, 17). Kada se mjerenja rade na niskoj razini analita, npr. u analizi
tragova, važno je znati koja je njegova najniža koncentracija koju je dotičnom metodom
moguće pouzdano dokazati. Pojavljuju se termini «limit of detection» ili «detection limit»;
ISO govori o «minimum detectable net concentration», dok IUPAC preferira «minimum
detectable (true) value». Srednja vrijednost i standardna devijacija slijepog uzorka ovise o

14
matriksu slijepog uzorka, što znači da je i granica detekcije ovisna o tom matriksu. Moguće
ju je procijeniti iz 10 neovisnih mjerenja slijepog uzorka ili slijepog uzorka obogaćenog
analitom pri najnižoj prihvatljivoj koncentraciji (najniža koncentracija za koju se može
dobiti prihvatljiv stupanj nesigurnosti) iz kojih se izračuna srednja vrijednost i pribroji joj
se 3 ili 4,65 standardnih devijacija (proizlazi iz testiranja hipoteze). To je najniža
koncentracija analita u uzorku koja može biti detektirana nad šumom sustava tj. moguće ju
je razlikovati od razine pozadine (obično trostruka razina šuma) ali ne nužno i
kvantificirana pod navedenim eksperimentalnim uvjetima. DL je dakle točka pri kojoj je
mjerena vrijednost veća od njezine nesigurnosti. DL obično se izražava kao koncentracija
analita (npr., %, ppb) u uzorku.
Kod kvalitativnih ispitivanja postoji granica ispod koje specifičnost postaje upitna.
Da bi se procijenio DL kod kvalitativnih mjerenja slijepi uzorci se obogaćuju analitom pri
nekoliko koncentracija i pri svakoj provodi 10 neovisnih mjerenja. Ponovljena mjerenja na
raznim razinama su randomizirana. Tada se konstruira krivulja % pozitivnih (%
negativnih) rezultata vs. koncentracija pa se procjenjuje granična koncentracija kod koje
ispitivanje postaje nesigurno (10).
Granica dokazivanja je parametar limit testova. Limit testovi uglavnom
ustanovljavaju da je koncentracija analita iznad ili ispod odreñenog praga. DL treba
procijeniti samo za metode mjerenja onečišćenja kod kojih se kromatografski pikovi koji
su blizu DL-a trebaju vidjeti. DL treba procijeniti u ranoj fazi razvoja metode i validacije te
ga treba provjeriti ako su ikakve izmjene učinjene u konačnom postupku.
Procjena DL vrijednosti ovisi da li se radi o instrumentalnoj ili ne-instrumentalnoj
metodi. Za instrumentalne postupke koriste se različite tehnike. Npr., odreñuje se odnos
signal/šum usporedbom rezultata ispitivanja uzoraka poznate koncentracije analita s
rezultatima za slijepe uzorke te se ustanovljava minimalna razina kod koje se analit
pouzdano dade detektirati. Prihvaća se odnos signal/šum bazne linije od 2:1 ili 3:1 (18, 40).
I u kromatografiji je DL injektirana količina analita koja rezultira pikom visine 2-3 puta
većom od šuma bazne linije (15). ICH predviña i druge mogućnosti; može se mjeriti i
veličina odgovora pozadine analizom većeg broja slijepih uzoraka te množenjem dobivene
standardne devijacije s faktorom 2 ili 3 dobiti procjenu DL. [2 odnosno 3 je faktor koji
odgovara statističkoj pouzdanosti od 97,73 odnosno 99,86% (27).] Ova granica se validira
analizom pogodnog broja uzoraka za koje se zna da su blizu DL ili su pripravljeni pri DL.
Za ne-instrumentalne metode (npr. TLC) DL se općenito odreñuje vizualnom analizom
uzoraka poznate koncentracije analita i ustanovljavanjem minimalne razine kod koje se
analit može detektirati.
Primjeri kriterija: Prema starijim izvorima DL može se definirati i kao razina
pozadine mjerene u «field» blanku + 3SD “field” blanka (4). Osim kriterija temeljenog na
odnosu signal/šum, ICH (18) sugerira i:
DL = 3,3SD/a
a - nagib kalibracijskog pravca, SD – standardna devijacija višestrukih mjerenja slijepog uzorka, ili
rezidualna SD kalibracijskog pravca, ili SD odsječka toga pravca, pri koncentracijama analita blizu DL
vrijednosti.
Granica odreñivanja (pres. 7). – Prema Eurachem-u (8) granica odreñivanja označava
se kao LoQ. Radi se 10 neovisnih mjerenja slijepog uzorka te se dobivenoj srednjoj
vrijednosti dodaje 5, 6 ili 10 standardnih devijacija. Takoñer, moguće je obogatiti slijepe
uzorke analitom pri koncentraciji bliskoj granici odreñivanja, napraviti 10 neovisnih
mjerenja pri svakoj koncentraciji, izračunati standardnu devijaciju kod svake koncentracije
i nacrtati ovisnost standardne devijacije o koncentraciji te procijeniti vizualno LoQ. LoQ se

15
izražava kao najniža koncentracija analita koju je moguće odrediti s prihvatljivim stupnjem
nesigurnosti. Ona je često i koncentracija najnižeg kalibracijskog standarda.
Prema ICH (18), QL (ranije LOQ) je parametar postupaka kvantitativne analize za
niske razine spojeva u matriksima uzoraka, npr., onečišćenja u sirovinama ljekovitih
supstancija i razgradnih spojeva u gotovim lijekovima. To je najniža koncentracija analita u
uzorku koja se može odrediti s deklariranim stupnjem pouzdanosti (4), s prihvatljivom
preciznošću i ispravnošću pod navedenim eksperimentalnim uvjetima te se postavlja kao
najniža koncentracija standarda korištenog u validaciji (2, 3, 18, 40). QL treba biti unutar
radnog koncentracijskog područja, te se izražava kao i koncentracija analita (npr. %, ppb).
Procjena QL ovisi o tome da li se radi o instrumentalnom ili ne-instrumentalnom postupku.
Za instrumentalne postupke običava se mjeriti veličinu odgovora pozadine ponovljenim
analizama niza slijepih tj. «field» uzoraka (obogaćenih ili endogenih) i računanjem SD
ovog odgovora. SD množen s faktorom, obično 10, daje procjenu QL. QL se validira
analizom pogodnog broja uzoraka za koje se zna da su blizu te granice ili su pripravljeni
pri QL. Često se QL računa kao najniža koncentracija analita koja daje S/N = 10 (18, 40). U
kromatografiji se za QL obično zahtijeva da visine pikova budu 10-20 puta veće od šuma
bazne linije (15). QL se može definirati i kao koncentracija koja daje S/N ≥ 10:1 i ≤10%
preciznosti ili kao S/N ≥ 20:1 s ≤5% preciznosti. Uzorci s padajućom koncentracijom
analita injektiraju se 6 ili 10 puta (8, 15). Izračunata SD ili RSD grafički se prikazuje u
ovisnosti o koncentraciji analita, te količina koja odgovara prethodno definiranoj traženoj
preciznosti proglašava QL (slika 2).
Kod vizualnih ne-instrumentalnih metoda QL se obično odreñuje analizom uzoraka
poznate koncentracije i ustanovljavanjem minimalne razine pri kojoj analit može biti
odreñen s prihvatljivom istinitošću i preciznošću. U kolaborativnim ispitivanjima QL se
općenito smatra najnižom razinom analita koja se može uspješno analizirati (4).
Primjeri kriterija: QL je najniža koncentracija analita za koju se dobiva RSD ≤20%
kod ispitivanja repetabilnosti (10). Definira se i kao srednja vrijednost slijepog uzorka +
10SD tog uzorka (4), a ICH (18) definira QL analogno DL-u (str. 14, 15):
QL = 10SD/a
Realne slijepe uzorke i za DL i za QL često je teško pronaći.
Stabilnost (2, 10). - Tijekom ranijih validacijskih ispitivanja ponuñač metode dobiva
neke informacije o stabilnosti reagenasa, mobilnih faza, standarda i otopina uzorka. Za
rutinska ispitivanja kada se dnevno pripravlja i analizira puno uzoraka često je bitno da
otopine budu dovoljno stabilne da omoguće odgodu mjerenja, npr. kod kvara instrumenta
ili analiza tijekom noći primjenom sustava za samouzorkovanje. Uzorci i standardi trebaju
se ispitati kroz najmanje 48 sati, a odreñivanje sastavnica treba se obaviti usporedbom sa
svježe pripravljenim standardima. Ako otopine nisu stabilne kroz 48 sati treba stabilnost
poboljšati pronalaženjem adekvatnih uvjeta čuvanja ili aditivima.
Kod bioanalitičkih postupaka važna je stabilnost analita u biološkim tekućinama.
Valja ustanovili uvjete i vrijeme čuvanja uzoraka te osigurati integritet uzoraka prije
analize (npr., hlañeni «autosampler»-i). Važna je i stabilnost realnih uzoraka.
Primjeri kriterija: Kriterij stabilnosti za metode odreñivanja je da uzorak i
standardne otopine i mobilna faza budu stabilni kroz 48 sati pod definiranim uvjetima
čuvanja. Prihvatljiva stabilnost je ona kada je promjena u odgovoru standarda ili uzorka u
odnosu na svježe pripravljene standarde ≤2%. Za metode onečišćenja, uzorak, standardne
otopine i mobilna faza moraju biti stabilni npr., kroz 24 sata pod definiranim uvjetima

16
čuvanja a prihvatljivu stabilnost dokumentira promjena u odgovoru standarda ili uzorka
kod QL u odnosu na svježe pripravljene standarde ≤20% (28).
Procjena preciznosti, krug II (10). - Preostala ispitivanja preciznosti uključuju
mnogo od onoga što se ranije nazivalo «ruggedness». Dok USP 23 (38) zahtijeva procjenu
«ruggedness» u svim kategorijama ispitivanja već USP 24 (39) pa i USP 29 (40) kažu da se
«ruggedness» odnosno reproducibilnost izmeñu laboratorija, ili intermedijarna preciznost
razmatraju samo tijekom standardizacije postupka prije nego što ga se predloži za
farmakopeju. «Intermediate precision» je preciznost kada analizu provodi više analitičara
koristeći više instrumenata u toku više dana u jednom laboratoriju (mogu se koristiti
različiti izvori reagenasa, razne šarže kolona). Rezultati ovih ispitivanja omogućuju da se
identificira koji od faktora značajno doprinosi varijabilnosti konačnog rezultata. Posljednji
tip ispitivanja preciznosti je reproducibilnost (vidi «ruggedness») koja se odreñuje
ispitivanjem homogenih uzoraka u raznim laboratorijima često kao dio interlaboratorijskih
«cross-over» ispitivanja. Rezultati ispitivanja reproducibilnosti često više ukazuju na
mjerna odstupanja u rezultatu nego na odreñivanje same preciznosti. Statistička
ekvivalencija često se koristi kao mjera prihvatljivosti interlaboratorijskih rezultata.
Alternativni i praktičniji pristup upotreba je «analitičke ekvivalencije» u kojoj se odabire
područje prihvatljivih rezultata prije ispitivanja i ono se koristi da se prosudi o
prihvatljivosti rezultata iz različitih laboratorija.
Primjeri kriterija: kriterij reproducibilnosti metode može biti da su rezultati analize
dobiveni u više laboratorija statistički ekvivalentni ili da se srednji rezultati nalaze unutar
2% vrijednosti dobivene u glavnom testiranom laboratoriju. Za metodu na onečišćenje
rezultati dobiveni u više laboratorija trebaju biti statistički ekvivalentni ili srednji rezultati
trebaju biti unutar 10% od vrijednosti dobivene u glavnom laboratoriju za onečišćenje >1%
(m/m), unutar 25% za onečišćenja od 0,1-1,0% (m/m) i unutar 50% za onečišćenja <0,1%
(m/m).
Robustnost (izdržljivost, otpornost, «robustness») (10). – USP 22 (37) ne spominje
robustnost. Već USP 23 i sljedeća izdanja USP (38, 40) te ICH (18) definiraju robustnost
ali ne zahtijevaju njezinu procjenu. Ispitivanja robustnosti ustanovljavaju efekte koje radni
parametri imaju na rezultate analize. Robustnost analitičke metode mjera je njezine
sposobnosti da ostane nenarušena malim ali namjernim varijacijama parametara metode te
indicira njezinu pouzdanu primjenu. Ispitivani parametri su dio opisane metode pa se
ispituju «unutarnji» faktori metode unutar realnih granica i odreñuje njihov kvantitativni
utjecaj na rezultat analize.
Ove se parametre može procijeniti jedan po jedan ili istovremeno kao dio
multifaktorskog eksperimenta. To su «fractional factorial» (FF) ili Plackett-Burman (PB)
dizajn gdje je broj eksperimenata veći za jedan od broja ispitivanih faktora (npr., 11 faktora
ispituje se kroz 12 eksperimenata). Obično se ispituju faktori na svoja dva krajnja nivoa
koja ovise o izboru i iskustvu analitičara. Tri ili više nivoa obično nisu potrebna; ponekad
se eventualno radi ispitivanje na tri nivoa (+1, 0, -1) (6). U dizajniranom eksperimentu
najmanji broj ispitanih faktora je 3. Ako treba popuniti dizajn koriste se i lažni («dummy»)
faktori. Broj eksperimenata u dizajniranom ispitivanju je 8-24.
Rezultati za efekte ovih parametara omogućuju da se postavi područje prihvatljivih
vrijednosti koje će se uključiti u konačni postupak. U kromatografiji se varira niz
parametara kao što su sastav mobilne faze kroz % organskog otapala ili pH, koncentracija
ili ionska jakost pufera u mobilnoj fazi, temperatura kolone, injektirani volumen, brzina
protoka mobilne faze, λ detekcije. Npr., koncentracija metanola u mobilnoj fazi (±2%), pH
mobilne faze (±0.5), temperature kolone (±1-5 oC). Ako je utjecaj nekog parametra unutar

17
prethodno specificiranih tolerancija metode za njega se kaže da je unutar područja
robustnosti metode. Ako se u analitičkom postupku koriste postupci predobradbe uzorka
poput ekstrakcije tekuće-tekuće, tekuće-čvrsto, ultrafiltracije, dijalize prije kromatografije
ili elektroforeze i faktore iz ovih postupaka treba uklopiti u ispitivanje robustnosti.
Podaci o ispitanim efektima nam omogućuju da prosudimo da li metodu treba
revalidirati kada se promijeni jedan ili više parametara. ICH (18) preporučuje da se
izdržljivost procijeni u fazi razvoja metode.
Primjeri kriterija: Parametri za ispitivanje robustnosti u kromatografiji su sastav
mobilne faze, kroz npr., sadržaj MeOH u mobilnoj fazi (±2%), pH mobilne faze (±0,1 pH
jedinica), temperatura kolone (±5 oC) (10). Ako su ove promjene parametara unutar granica
koje daju prihvatljivu kromatografiju one će biti uključene u postupak metode.
Reproducibilnost («ruggedness»). – O pojmu reproducbilnosti već je bilo riječi (vidi
str. 4, 13, 17). Prema Eurachem-u (8) valja identificirati varijable koje mogu značajno
utjecati na metodu. Eksperimenti se temelje na analizi referentnih materijala, uzoraka
poznatog sastava da bi se ustanovio utjecaj sustavne promjene varijabli na ispravnost i
preciznost rezultata. Nakon što se ustanovi utjecaj svake promjene uvjeta na srednju
vrijednost rezultata varijable se rangiraju prema veličini efekta od najvećeg prema manjem
te se analiziraju.
Reproducibilnost je stupanj ponovljivosti rezultata metode dobivenih analizom istih
uzoraka pod različitim ali normalnim uvjetima (npr., različiti laboratoriji, analitičari i
instrumenti, različite šarže reagenasa, različita vremena analize, različite temperature,
različiti dani, etc.) (40) kao dio kolaborativnih ispitivanja. Navedeni parametri su tzv.
vanjski faktori metode. Reproducibilnost rezultata postignuta pod normalnim, očekivanim
radnim uvjetima od laboratorija do laboratorija i od analitičara do analitičara obično se
izražava kao nedostatak utjecaja radnih i okolnih uvjeta metode na rezultate. Procjenjuje se
analizom alikvota iz homogenog uzorka u raznim laboratorijima s raznim analitičarima
koristeći radne i okolne uvjete koji se mogu razlikovati ali su još uvijek unutar
specificiranih parametara analize. Stupanj reproducibilnosti rezultata se tada odreñuje kao
funkcija varijabli metode analize. Ova reproducibilnost može se usporediti s preciznošću
analize pod normalnim uvjetima pa se dobiva mjera otpornosti analitičke metode.
Prema Eurachem-u (8) tijekom ispitivanja preciznosti treba analizirati standarde,
referentne materijale ili obogaćene slijepe uzorke pri različitim koncentracijama unutar
radnog područja. Kod ispitivanja repetabilnosti radi isti analitičar uz istu opremu i u istom
laboratoriju kroz kraće vrijeme. Intra-laboratorijska reproducibilnost [odgovara
intermedijarnoj preciznosti (vidi str. 13] (3, 18, 40) i inter-laboratorijska repoducibilnost
(«ruggedness») trebaju različite analitičare, različitu opremu i dulje vrijeme, a posljednja se
radi u različitim laboratorijama kao dio kolaborativnih ispitivanja. Svi oblici preciznosti
izražavaju se (relativnom) standardnom devijacijom od obično 10 neovisnih ponovljenih
analiza pri svakoj koncentraciji.
«Ruggedness» i «robustness» mogu služiti procjeni reproducibilnosti i intermedijarne
preciznosti metode te definiranju prikladnosti sustava kroz ispitivanje prikladnosti sustava
(«system suitability test»).
Ispitivanje prikladnosti sustava («system suitability test», SST). - To je sastavni dio
mnogih analitičkih postupaka. Ispitivanja se temelje na konceptu da oprema, elektronika,
analitički postupci i uzorci čine jedinstveni sustav (18). Uvjeti koji se ispituju ovise o tipu
postupka te su naročito važni u kromatografiji, npr., sastav i pH mobilne faze, proizvodna
šarža ili proizvoñač kolona, temperatura, brzina protoka mobilne faze, pa se dodatne

18
 informacije nalaze u farmakopejama (9, 40). Dobiveni kromatografski parametri kao što su
broj teorijskih tavana, razvlačenje pika, rezolucija i repetabilnost vremena zadržavanja i
površine pika, i kapacitetni faktor trebaju zadovoljiti tražene zahtjeve (28). U ovom
ispitivanju nužni su uzorak kontrole kvalitete i standard koje treba otopiti u mobilnoj fazi.
ICH tretira SST kao dio validacije dok ga USP tretira posebno unutar odjeljka
kromatografije. SST valja ipak provesti prije validacijskih ispitivanja.
Ispitivanje prikladnosti sustava traži ICH jer ono osigurava prikladnost i efikasnost
operativnog sustava. SST granice dobivaju se iz podataka optimizacije i validacije metode i
iskustava analitičara. Za definiranje SST limita (6) preporučuje se «worst-case» situacija
koja se postiže takvom kombinacijom faktora koji npr. u kromatografiji daju najlošiju
rezoluciju, najniži k', najviši «tailing» faktor.

LITERATURA

1. AOAC, AOAC Peer Verified Methods Program, Manual on Policies and Procedures,
Arlington VA, Nov. 1993.
2. S. Braggio, R. J. Barnaby, P. Grossi, i M. Cugola, A strategy for validation of bioanalytical
methods, J. Pharm. Biomed. Anal. 14 (1996) 375-388.
3. British Pharmacopoeia 2007, Her Majesty's Stationery Office, London, 2007.
4. H. B. S. Conacher, Validation of methods used in crisis situations: Task force report, J. Assoc.
Off. Anal. Chem. 73 (1990) 332-334.
5. N. T. Crosby, Ad hoc analysis: How do you know you have got it right, Anal. Proc. 28 (1991)
138-139.
6. B. Dejaegher, Y. Vander Heyden, Ruggedness and robustness testing, J. Chromatogr. A 1158
(2007) 138-157.
7. EDQM, OMCL Guideline on Validation of Analytical Procedures, Council of Europe,
Strasbourg 2005
8. Eurachem, EURACHEM Guide: The Fitness for Purpose of Analytical Methods – A Laboratory
Guide to Method Validation and Related Topics, LGC, Teddington 1998.
9. European Pharmacopoeia, 6th ed., Council of Europe, Strasbourg, 2008, Vol. 1, pp. 72-77.
10. J. M. Green, A practical guide to analytical method validation, Anal. Chem. News Feat. May 1
(1996) 305A-309A.
11. D. B. Hibbert, Method validation of modern analytical techniques, Accred. Qual. Assur. 4 (1999)
352-356.
12. G. C. Hokanson, A life cycle approach to the validation of analytical methods during
pharmaceutical product development, Part I: The initial method validation process, Pharm.
Technol. 18 (1994) 118-130.
13. G. C. Hokanson, A life cycle approach to the validation of analytical methods during
pharmaceutical product development, Part II: Changes and the need for additional validation,
Pharm. Technol. 18 (1994) 92-100.
14. L. Huber, Validation of Computerized Analytical Systems, Interpharm, Buffalo Grove IL, 1995.
15. L. Huber, Validation of analytical methods: Review and strategy, LC-GC Int., Feb. 1998, reprint
publication No 0261, Hewlett-Packard, Publication No. 12-5967-5622E. [LC-GC Int. 9 (1996)
794-799.]

19
16. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of
Pharmaceuticals for Human Use, ICH Harmonized Tripartite Guideline, Text on Validation of
Analytical Procedures, Step 4, Geneva, Oct. 1994.
17. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of
Pharmaceuticals for Human Use, ICH Harmonized Tripartite Guideline, ICH Topic Q2B,
Validation of Analytical Procedures: Methodology, Step 4, Nov 1996, Geneva, June 1997.
18. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of
Pharmaceuticals for Human Use, ICH Harmonized Tripartite Guideline, Validation of
Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1), Current Step 4 version, Parent
Guideline 27 October 1994 (Complementary Guideline on Methodology dated 6 November
1996, incorporated in November 2005), Geneva, November 2005.
19. Japan Pharmacopoeia XIV, Society of Japanese Pharmacopoeia, Tokyo 2002, pp. 1330-1332.
20. I. Krull i M. Swartz, Determining specificity in a regulated environment, LCGC 19 (2001) 604-
614.
21. S. Luterotti: Matrix effects in the determination of Zn(II) ion in whole rat liver by flame atomic
absorption spectrometry, Analyst 120 (1995) 925-930.
22. S. Luterotti: Short multifactorial concept in analysis of copper(II) in complex matrices by flame
atomic absorption spectrometry, Acta Pharm. 46 (1996) 239-244.
23. S. Luterotti: Short multifactorial plan for the determination of trace metals in complex matrices
by flame atomic absorption spectrometry, J. Anal. Atom. Spectrom. 11 (1996) 973-978.
24. M. Mulholland i D. B. Hibbert, Linearity and the limitations of least squares calibration, J.
Chromatogr. A 762 (1997) 73-82.
25. B. Renger, H. Jehle, M. Fischer i W. Funk, Validation of analytical procedures in pharmaceutical
analytical chemistry, J. Planar Chromatogr. 8 (1995) 269-278.
26. W. G. De Ruig, R. W. Stephany i I. G. Dijkstra, Criteria for the detection of analytes in test
samples, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 72 (1989) 487-490.
27. M. L. Samuels, Statistics for the Life Sciences, Dellen Publishing Company, San Francisco 1991.
28. G. A. Shabir, Validation of high performance liquid chromatography methods for pharmaceutical
analysis – Understanding the differences and similarities between validation requirements of
the US Food and Drug Administration, the US Pharmacopeia and the International Conference
on Harmonization, J. Chromatogr. A 987 (2003) 57-66.
29. V. P. Shah K. K. Midha, S. Dighe, I. J. McGilveray, J. P. Skelly, A. Yacobi, T. Layloff, C. T.
Viswanathan, C. E. Cook, R. D. McDowall, K. A. Pittman i S. Spector, Analytical methods
validation: Bioavailability, bioequivalence and pharmacokinetic studies, Eur. J. Drug Metab.
Pharmacokin. 16 (1991) 249-255.
30. V. P. Shah K. K. Midha, S. Dighe, I. J. McGilveray, J. P. Skelly, A. Yacobi, T. Layloff, C. T.
Viswanathan, C. E. Cook, R. D. McDowall, K. A. Pittman i S. Spector, Naslov???, Pharm. Res.
9 (1992) 588-592.
31. G. Szepesi, M. Gazdag, i K. Mihalyfi, Selection of high-performance liquid chromatographic
methods in pharmaceutical analysis III. Method validation, J. Chromatogr. A 464 (1991) 265-
278.
32. US EPA, Guidance for Methods Development and Methods Validation for the Resource
Conservation and Recovery Act (RCRA) Program, Washington 1995.
33. US FDA, Technical Review Guide, Validation of Chromatographic Methods, Center for Drug
Evaluation and Research (CDER), Rockville MD, 1993.

20
34. US FDA, General principles of Validation, Center for Drug Evaluation and Research (CDER),
Rockville MD, 1987.
35. US FDA, Guidelines for Submitting Samples and Analytical Data for Method Validation, Center
for Drugs and Biologics, Department of Health and Human Services, Rockville MD, 1987.
36. US FDA, Guidance for Industry – Bioanalytical Method Validation, Rockville MD, 2001
37. USP22/NF17, General Information/<1225>, Validation of Compendial Methods, The United
States Pharmacopeial Convention, Rockville MD, 2000, pp. 1710-1712.
38. USP23/NF18, General Information/<1225>, Validation of Compendial Methods, The United
States Pharmacopeial Convention, Rockville MD, 2001, pp. 1982-1984.
39. USP 24/NF 19, General Information/<1225>, Validation of Compendial Methods, The United
States Pharmacopeial Convention, Rockville MD, 2002, pp. 2149-2152.
40. USP 29/NF 24, General Information/<1225>, Validation of Compendial Methods, The United
States Pharmacopeial Convention, Rockville MD, 2007, pp. 2149-2152.
41. J. Vessman, Selectivity or specificity? Validation of analytical methods from the perspective of
an analytical chemist in the pharmaceutical industry, J. Pharm. Biomed. Anal. 14 (1996) 867-
869.
42. W. Wegscheider, Validation of Analytical Methods, in Accreditaion and Quality Assurance in
Analytical Chemistry, H. Guenzler (ur.), Springer Verlag, Berlin 1996.

21
 II. dio

KRATKI MULTIFAKTORSKI DIZAJNIRANI EKSPERIMENT U VALIDACIJI

«Ruggedness» i «robustness» su dva slična pojma koji se zahtijevaju ili sugeriraju

unutar validacijskog procesa (vidi I.dio, str. 2, 17, 18). USP 23 (28) zahtijeva ispitivanje
reproducibilnosti kao mjere interlaboratorijske preciznosti u sve 4 kategorije metoda, a već
USP 24 (29) pa i USP 29 (30) ne, no obje definiraju robustnost. USP 29 (30), JP XIV (14) i
ICH (13) traže ispitivanje reproducibilnosti samo u slučaju metoda koje su kandidati za
farmakopeju, a ICH traži procjenu robustnosti u razvojnoj fazi.
Fisher (7) je ponudio pristup promjene više faktora istovremeno koji je u
farmaceutskoj validaciji bio slabo poznat. Na taj se način prepoznaju, kvantificiraju i
kontroliraju oni parametri koji izazivaju varijabilnost rezultata. Najveća prednost ovog
postupka je u prepoznavanju faktora koji utječu na proces ili na varijabilnost rezultata, te u
mogućnosti ispitivanja interakcija. Ovaj pristup može se koristiti da se omogući
prebacivanje nove metode u drugi laboratorij. Zbog svoje sličnosti reproducibilnost i
robustnost mogu se procijeniti na istovjetan način primjenom «short multifactorial design»-
a (SMD, 25, 31). Iako se oba mogu ispitati tako da se varira jedan po jedan faktor, a ostali
zadrže fiksnim mnogo je ekonomičnije, efikasnije i informativnije koristiti multifaktorski
dizajniranu matricu (eksperiment). Dizajnirani eksperiment u validaciji može pokazati da
metoda i faktori okoline ne utječu na rezultate ali mogu i identificirati uvjete koje treba
podrobnije kontrolirati ili ispitati. Kod dizajna malog obima odnosno s praznim
(«dummy») faktorima radije se koristi algoritam Donga (2)
Variranje više faktora istovremeno jedan je od načina provedbe kontroliranih
eksperimenata (26). Obično se koriste Plackett-Burmanovi (23) planovi od 8 ili 12 pokusa
(7, 25, 31). 8- ili 12-eksperimentalni plan (matrica) omogućuje ispitivanje 7 ili 11
parametara metode istovremeno. Ovi planovi ispituju svaki parametar na 2 razine,
vrijednosti ili verzije. Kombinacije razina variraju se na specifičan i vrlo simetričan način.
Zbog simetrije dizajna moguće je procijeniti efekt svakog faktora korištenjem svih
sakupljenih podataka. Za 7 parametara potrebno je 8 umjesto 128 (27) eksperimenata, a za
8 parametara 12 umjesto 211 (=2048) eksperimenata! Eksperimente treba provesti
slučajnim redoslijedom te izračunati efekte svakog faktora i rangirati ih od najmanjeg do
najvećeg. Efekt svakog faktora računa se iz prosječnih rezultata dobivenih na obje razine.
Dobivene rezultate moguće je obraditi statistički ili prikazati grafički normalnim grafom
vjerojatnosti pri čemu na apscisu idu rangirani efekti, a na ordinatu M vrijednosti, prosjeci
statistike redova (22). Najbolje je kombinirati grafičku i statističku procjenu.
Efekti pojedinih faktora mogu se dakle izračunati kao:
Di = [(ΣY+1)-(ΣY-1)]/(N/2)
gdje su ΣY±1 zbrojevi odgovora kada su faktori na nivou +1 odnosno -1. N je broj eksperimenata.
Faktori A, B, C, …. (tablice 3 i 4 i slika 3) mogu biti temperatura, vrijeme, miješanje,
stupanj razrijeñenja, dodatak reagensa ili drugog materijala, instrument, analitičar,
proizvoñač, proizvodna šarža, itd. Ako je metoda «izdržljiva» («otporna»), efekti promjene
svakog parametra bit će normalno raspodijeljeni slučajni šum te će graf normalne
vjerojatnosti dati pravac (slika 3). Ako 1 ili više točaka na krajevima pravca ne leže na
pravcu može se zaključiti da metoda nije otporna ili izdržljiva na te faktore. Efekte izvan
krajeva pravca treba ispitati radi unaprijeñenja metode ili izmjene specifikacije.

22
 Tablica 3. Dizajn s 8 eksperimenata (pres. 8)
Parametar
A B C D E F G Hipotetski
Eksperiment rezultat (%)
1 + + + - + - - 103,22
2 - + + + - + - 99,33
3 - - + + + - + 86,58
4 + - - + + + - 103,67
5 - + - - + + + 99,97
6 + - + - - + + 101,07
7 + + - + - - + 96,89
8 - - - - - - - 89,33

Tablica 4. Rangirani efekti i prosjeci (pres. 9)

Faktor Rangirani efekt (Di) Vrijednost M
G -2,76 -1,35
D -1,78 -0,76
C +0,09 -0,35
E +1,71 0
B +4,69 +0,35
F +7,01 +0,76
A +7,41 +1,35

Slika 3 ukazuje da u gornjem primjeru niti jedna varijabla od A do G ne utječe

značajno na rezultat analize.
Fisher (7) pokazuje analogni eksperimentalni plan i računanje Di za svaki parametar.
Standardna devijacija 8 individualnih rezultata može se računati kao:
g
σ' = [2/7 Σ (Di2)]1/2
i=a

Svaka vrijednost Di smatra se značajnom (p<0,05) ako je ∣D∣ > (21/2) σ'. U gornjem
primjeru (21/2) σ' iznosi 8,93; kako niti jedan Di nije veći od ove vrijednosti (najveći je Da
= +7,41), dolazi se do istog zaključka da niti jedan od ispitanih parametara ne utječe
značajno na rezultat analize.
Ako se varira manje od 7 parametara da se upotpuni eksperimentalni dizajn uključuju
se «prazne» («dummy») varijable koje ne bi smjele izazvati nikakve razlike u rezultatu.
Dizajn s 12 eksperimenata pokriva 11 faktora koji mogu biti kombinacija internih i
eksternih. 12-eksperimentalni dizajn prikazan je tablicom 5.

23
 1,5

1
y = 0,217x – 0,5074
R2 = 0,947
Vrijednosti M

0,5

-0,5

-1

-1,5
-4 -2 0 2 4 6 8
Rangirani efekti

Slika 3. Graf normalne vjerojatnosti rangiranih efekata (vidi tablice 3 i 4). (pres. 10)

Tek kada je ispitivanje uspješno prošlo test robustnosti prelazi se na kolaborativno

ispitivanje reproducibilnosti («ruggedness»).

Tablica 5. Dizajn s 12 eksperimenata (pres. 11)

Parametar
A B C D E F G H I J K
Eksperiment
1 + + - + + + - - - + -
2 - + + - + + + - - - +
3 + - + + - + + + - - -
4 - + - + + - + + + - -
5 - - + - + + - + + + -
6 - - - + - + + - + + +
7 + - - - + - + + - + +
8 + + - - - + - + + - +
9 + + + - - - + - + + -
10 - + + + - - - + - + +
11 + - + + + - - - + - +
12 - - - - - - - - - - -

Kratki multifaktorski dizajnirani eksperiment može se uspješno primijeniti na

ispitivanje utjecaja sastava standarda s prilagoñenim matriksom, na ispravnost odreñivanja
Cu, Zn i Mn (18-20) u homogenatima jetre štakora FAAS-om, preko procjene kalibracijske

24
osjetljivosti. Multifaktorski dizajnirani eksperiment uspješno je primijenjen i u ispitivanju
selektivnosti analitičkog postupka (3).
VALIDACIJA BIOANALITIČKIH POSTUPAKA
Selektivne i osjetljive analitičke metode nužne su za odreñivanje lijekova i njihovih
metabolita u biološkom matriksu (krv, serum, plazma, urin, slina, majčino mlijeko, itd.) u
pretkliničkim i/ili biofarmaceutskim i kliničkim farmakološkim ispitivanjima. Stoga
validacija bioanalitičkih postupaka dokumentira da je takva metoda pouzdana i precizna pri
svojoj primjeni. Inicijalna validacija analitičke metode preliminarno osigurava pouzdanost
analitičkog postupka. Kako su tijekom razvoja ljekovitog proizvoda nužne izmjene, stare
informacije postaju temelj iz kojeg nastaje novi validacijski protokol za daljnja ispitivanja
(11). ICH-ovi dokumenti Q2A i Q2B [objedinjeni u Q2(R1), ref. 13] primarno su
namijenjeni industriji ukazujući koji validacijski podaci trebaju biti prisutni u
aplikacijskom podnesku. Ti podaci trebaju pokazati da su preporučeno ispitivanje i kriteriji
prihvatljivosti pod kontrolom, da bi osigurali reproducibilnu kvalitetu proizvoda koji se
stavlja u promet i adekvatnu kontrolu tijekom skladištenja (stabilnost). EDQL dokument iz
2005 (4) daje upute za OMCL-ove (OMCL – «Official Medicines Control Laboratory
Network») te propisuje obim validacije i validacijske značajke o kojima treba voditi računa
u nekoliko slučajeva: kod prijenosa metode iz jednog u drugi laboratorij, kod postupaka
pretraživanja, i kod razvijanja novih analitičkih postupaka. Validacija se provodi paralelno
s razvojem metode; to je iterativni ciklus «razvoj/validacija». «Life cycle approach» (10)
primijenjen na validaciju znači proces koji je započet tijekom razvoja novog ljekovitog
proizvoda kada treba definirati zadatak analitičke metode i formalizirati strategiju
validacije. Tijekom razvoja može doći do promjena u ljekovitom proizvodu koje će tražiti
revalidaciju analitičkog postupka. Isto tako, izmjene u analitičkoj tehnologiji mogu
zahtijevati promjene u analitičkim postupcima tražeći revalidaciju. To je dakle dinamički
proces koji se proširuje kako se dobivaju dodatne informacije i kako se širi primjena
postupka ispitivanja na nove analitičare i nove laboratorije.
Kvaliteta analitičkih podataka je ključni faktor uspješnosti programa razvoja lijeka.
Proces razvoja metode i validacija izravno utječu na kvalitetu ovih podataka. Iako i
temeljita validacija ne može isključiti sve potencijalne probleme, proces razvoja metode i
validacija ukazat će na one najčešće. Npr., tipični problemi koje se može svesti na
minimum ili eliminirati su onečišćenja iz procesa sinteze koji se eluiraju zajedno s pikom
analita. Npr., u HPLC analizi, tip kolone koja više ne dovodi do traženog odjeljivanja jer je
proizvoñač kolone izmijenio proizvodni proces, metoda analize koja je prenesena u drugi
laboratorij gdje je nemoguće postići isti DL, i službeno ispitivanje izvješća validacije od
strane osiguranja kvalitete koje nije našlo dokumentaciju o tome kako je metoda izvedena
tokom validacije. Najbolje je provesti adekvatnu validaciju tijekom razvoja metode.
Postupci procjene razine kvalitete farmaceutskog proizvoda podliježu raznim
zahtjevima. U području analize lijekova ove definicije pokrivaju cijelo polje analitičke
kemije od bioanalize do analize supstancija i produkata. Isti se principi trebaju primijeniti
bez obzira na tip analiziranog uzorka. Postoji niz definicija meñunarodnih organizacija, a
većina od njih je meñusobno usklañena.
Posljednjih nekoliko godina intenzivni su pokušaji harmonizacije na farmaceutskom
polju i za procese validacije. No kako pokazuje ICH, pokušaji regulatornih tijela fokusirani
su samo na validacije postupaka analize čistih ljekovitih supstancija i gotovih lijekova (30).
Slični zahtjevi trebaju biti primijenjeni i na analizu lijekova u tjelesnim tekućinama što daje
temelje za ispitivanja farmakokinetike i bioekvivalencije. «Washington Conference
Report» o validaciji bioanalitičkih metoda diskutiraju Hartmann et al. (8), a smjernice

25
industriji u Europi daju 1996. Braggio i sur. (1) kroz vrlo iscrpan članak o validaciji
bioanalitičkih postupaka tijekom razvoja lijeka u laboratoriju Glaxo-Wellcome, Verona. U
ovom području važni su autori i Karnes sa sur. (15) te Lang i Bolton (17). FDA (27) daje
informacije o validaciji bioanalitičkih metoda u humanoj kliničkoj farmakologiji,
ispitivanjima bioraspoloživosti i bioekvivalencije koje trebaju farmakokinetičku procjenu,
te farmakološkim/toksikološkim ispitivanjima u veterinarskoj medicini i pretkliničkim
studijama. Ove smjernice su primjenjljive na bioanalitičke postupke kao što su plinska
kromatografija (GC) i tekućinska kromatografija (LC) zasebno te kombinirane sa
spektrometrijom masa (MS) kroz LC-MS, LC-MS-MS, GC-MS, GC-MS-MS kod
odreñivanja lijekova i/ili metabolita u biološkim matriksima kao što su krv, serum, krvna
plazma, urin, tkiva, npr., koža.
U ranim fazama razvoja lijeka obično nije potrebno provesti sva validacijska
ispitivanja. Mnogi se istraživači usmjeravaju na specifičnost, linearnost, istinitost (točnost)
i preciznost za lijekove u pretkliničkoj fazi pa sve do faze preliminarne efikasnosti (faza
II). Preostala ispitivanja provode se onda kada lijek dodje do faze efikasnosti (faza III) u
toku razvoja, te postiže veću vjerojatnost da postane produkt na tržištu. Braggio et al. (1)
imaju nešto drugačiji pristup.
Sažeti postupci analize variraju od visoko egzaktnih analitičkih odreñivanja do
subjektivnih procjena značajki. Različite metode ispitivanja zato zahtijevaju različite
validacijske sheme:
- analitičke metode za identifikaciju glavne komponente
- analitičke metode za odreñivanje glavne komponente u «bulk» ljekovitim
susptancijama, ili aktivne komponente (uključujući konzervanse) u gotovim lijekovima
- analitičke metode za odreñivanje onečišćenja u «bulk» ljekovitim supstancijama ili
razgradnih produkata u gotovim lijekovima; ovamo spadaju kvantitativne analize i «limit»
testovi
- analitičke metode za odreñivanje izvedbenih značajki (npr., otapanje, oslobañanje
lijeka).
Za svaku od ovih kategorija potrebne su različite informacije (tablica 6). Validacija
analitičkih metoda verificira se laboratorijskim ispitivanjima. Potrebna dokumentacija treba
pratiti svaki prijedlog za novi ili revidirani sažeti analitički postupak. Postupak treba biti
detaljno razrañen i opisan protokolom.
Selektivnost, linearnost i DL/QL (mjere prikladnost opreme) i izmjera ili analitički
povrat (mjeri ispravnost) mjere su efikasnosti procesa priprave uzorka. Preciznost i
otpornost govore i o opremi i o pripravi uzorka. Prema ICH i svjetskim farmakopejama
(13, 14, 30), inter-laboratorijsko ispitivanje reproducibilnosti («ruggedness») potrebno je
provesti kod standardizacije metode, npr., kod uključivanja u farmakopeju, ali nije
potrebno pri marketinškoj autorizaciji; ispitivanje robustnosti potrebno je provesti samo u
fazi razvoja metode (13). Iako se službeno ne traži valja voditi računa o stabilnosti
analita, sorpciji analita na materijale koji se koriste i otpuštanju interferenata iz korištenog
posuña.

26
 Tablica 6. Analitički parametri validacije prema ICH, USP, JP i EDQM (12-14, 30) (pres. 12)

Tip analitičkog Ispitivanje onečišćenja Odreñivanje

postupka Identi- Analiza
fikacija Sadržaj/ Otapanje tragova‡‡
Kvantitativno Limit djelotvor- (samo
Značajka ispitivanje nost mjerenje),
oslobañanje
Istinitost (točnost)  + †,††,‡‡/ + ‡***/ +
‡*** +†,††,‡‡
Preciznost‡  +  +
-repetabilnost  +  + +
-intermedijarna  +† †*,‡‡/†*  +††*,‡‡/†* +‡‡+
preciznost*
-reproducibilnost†*  +† *  +† *
‡,‡‡
Specifičnost** + + + + ‡***/+†,‡‡ +
‡ †† ,‡‡
Granica detekcije   / *** +  ‡*** +
Granica odreñivanja  +   ‡*** +
Linearnost  +  +  ***/+†,‡‡
‡
+
Područje  + /‡*** + ‡***/+†,‡‡ +
Robustnost****
* Procjenjuje se ili intermedijarna preciznost ili reproducibilnost.
** Odsustvo specifičnosti analitičkog postupka moguće je kompenzirati drugim podupirućim analitičkim
postupcima.
*** Nekada može biti potrebna.
**** Procjena se radi u fazi razvoja metode.
†
JP XIV, ‡ USP 29, † †ICH (2005/Oct 94), ‡‡ EDQM 2005

VALIDACIJA BIOANALITIČKIH METODA TIJEKOM RAZVOJA

LIJEKA/METODE
Ključna uloga analitičkog kemičara je osiguravanje pravovremenih, ispravnih i
pouzdanih podataka što je posebno važno u otkrivanju, razvoju i proizvodnji lijekova.
Validacija metode omogućuje kemičarima da dokažu da je metoda pogodna za primjenu.
To znači da ako je analitički rezultat pouzdan onda je i svaka odluka koja se na njemu
temelji pouzdana. Kriteriji prihvatljivosti trebaju biti uključeni u SOP (Standard Operating
Procedure).
Analitički podaci koriste se:
- da se pretraže potencijalni kandidati za lijekove,
- kao pomoć u razvoju sinteze lijekova,
- za potporu ispitivanjima ljekovitih oblika, praćenje stabilnosti ljekovitih sirovina
(«bulk pharmaceuticals») i oblikovanih proizvoda,
- za ispitivanje otpuštanja iz gotovih proizvoda.

27
 Tablica 7. Tipični validacijski kriteriji prihvatljivosti za metodu za analit (prema ref. 9) (pres. 13)
Validacijsko ispitivanje
Selektivnost («specificity»)
Kalibracijska linearnost
Istinitost (točnost)
Preciznost
Intermedijarna preciznost (razni analitičari, instrumenti, više dana, isti
Kalibracijsko područje
Granica detekcije
Granica odreñivanja
Robustnost
Zadaci
Analit+placebo s intermedijerima, ekscipijensima, razgradnim
onečišćenjima vs. čisti analit
6 razina u području 50-150% od ciljane koncentracije; R>0,999
Analitički povrat CRM-a: ±2% pri koncentracijama 80 i 120% od
ciljane koncentracije
Repetabilnost instrumenta (10 ponovljenih injektiranja u
kromatografiji): RSD<1%
Repetabilnost odreñivanja (višestruka analiza alikvota uzorka tijekom
jednog dana): RSD<2%
laboratorij)
Reproducibilnost (inter-laboratorijsko ispitivanje (daje «bias»)
Procjenjuje se iz ispravnosti i ispitivanja linearnosti
Samo za metode za onečišćenja, S/N=3 iz ispitivanja slijepog uzorka
ili kalibracije
Samo za metode za onečišćenja, koncentracija koja daje definirani
RSD, npr. 10%, ili S/N=10
Koristi eksperimentalni dizajn koji identificira kritične parametre

Analitika bioloških sustava i davanje farmakokinetičkih, farmakodinamičkih,

toksikokinetičkih i metaboličkih podataka igraju važnu ulogu u farmaceutskim
istraživanjima i razvoju lijeka. Važna je sposobnost bioanalitičkih metoda da ispravno
odrede koncentraciju temeljnog lijeka i njegovih metabolita; zato sve bioanalitičke metode
trebaju biti valjano validirane. Ovi podaci moraju biti dobiveni u skladu sa znanstvenim
standardima i trebaju zadovoljiti zahtjeve službenih tijela. Validacija pretkliničkih i
kliničkih metoda treba biti u skladu s GLP. Prije validacije se provjerava korektnost
analitičkih instrumenata i pribora (npr., ispravnost pumpe, repetabilnost i linearnost
autoinjektora, korektna funkcija detektora u smislu odnosa signal/šum, kalibracija vaga i
pipeta, etc.). Minimalni kriteriji prihvatljivosti trebaju biti postavljeni za svaki parametar
metode (vidi tablicu 7). Najvažniji parametri koji opisuju bioanalitičku metodu su:
selektivnost, QL, linearnost, istinitost (točnost) i preciznost. Preliminarna procjena
otpornosti npr. mjerenjem stabilnosti uzorka i standarda dovoljna je u fazi razvoja lijeka
(10). Meñutim, ako se uvode nove varijable potrebna je informacija o otpornosti
(izdržljivosti) meñu analitičarima i meñu laboratorijima. Validacijsko ispitivanje
bioanalitičkih postupaka uključuje odreñivanje u obogaćenim uzorcima («spiked» samples)
pripravljenim iz referentnih standarda i biološkog matriksa te odreñivanjem relevantnih
parametara koji opisuju izvedbu metode (1). Valja procijeniti ispravnost, preciznost,
funkciju odgovora i selektivnost metode na endogene supstancije, metabolite i razgradne
produkte u biološkom matriksu (27).
Obogaćeni/standardni/QC uzorci (1, 27). - Unutar validacijskog postupka koristi se
isti biološki matriks za pripravu obogaćenih uzoraka, kalibracijskih standarda i uzoraka
kontrole kvalitete («quality control», QC), koji se svi pripravljaju iz odvojenih odvaga. Svi
se uzorci obrañuju na isti način. Biološki matriks treba takoñer validirati te navesti
korišteni antikoagulans ili anestetik za dobivanje kontrolnog matriksa, materijal posuña,
etc.
Obogaćeni uzorci («spiked samples», to su slijepi matriksi ili stvarni uzorci
obogaćeni analitom) pripravljaju se iz kalibracijskih standarda (uzorci poznate čistoće,
stabilnosti i uvjeta čuvanja: pripravljeni svježi svaki dan u istom matriksu). QC su setovi
uzoraka analita poznate koncentracije u istom biološkom matriksu te se pripravljaju na tri

28
koncentracijske razine (niski, pri 3xQL, srednji i visoki QC). Oni služe kao dodatna
provjera korektne priprave standardnih otopina za validaciju odnosno za provjeru istinitosti
(točnosti) i preciznosti (27) te su temelj prihvaćanja ili odbacivanja metode. [Eurachem (6)
definira QC kao tipične uzorke koji su dovoljno stabilni kroz odreñeno vrijeme i homogeni
da bi dali isti rezultat, i dobavljivi u količinama dovoljnim za ponovljanje analiza.]
Volumen otopine analita koji se dodaje u slijepi matriks pri pripravi QC-a mora biti manji
od 5% volumena matriksa i sadržavati minimalnu količinu otapala da bi se što vjernije
simulirao realni uzorak. Kod QC barem 67% (4 od 6) QC uzoraka treba upasti unutar 15%
svoje teoretske, nominalne, vrijednosti, a 33% može biti izvan.
Kod bioanalitičkih metoda analitički povrat i preciznost odreñuju se kroz pet
odreñivanja pri jednoj koncentraciji. Od kalibracijskih uzoraka (šest do osam) 75% njih ili
najmanje 6 [uključujuću i najvišu granicu odreñivanja («upper limit of quantification»,
ULOQ)] kada se preračunaju trebaju pasti unutar 15%, a najniža granica odreñivanja
(«lower limit of quantification», LLOQ) unutar 20% od nominalne vrijednosti. RSD za ove
uzorke ne smije prijeći 15% osim za LLOQ kada ne smije prijeći 20%.
Parametri validacije bioanalitičkih metoda u istraživačkoj fazi razvoja lijeka, te u
farmakokinetičkim, toksikokinetičkim i metaboličkim ispitivanjima u životinja i u
kliničkim ispitivanjima sažeti su u tablici 8 (1).
Kalibracija i linearnost (1, 27). – Kalibracijska krivulja treba biti pripravljena u
istom biološkom matriksu kao i uzorci. EMEA (5) definira koncentracijsko područje s
LLOQ i ULOQ kako krajnjim točkama, te s minimalno 6 kalibracijskih koncentracija bez
«blank»-a (bez analita i IS) i nultog uzorka (samo IS bez analita). Pri računanju
kalibracijskih parametara «blank» i nulti uzorak se ne uključuju. Preračunate koncentracije
kalibracijskih standarda moraju se kretati ±15% oko nominalne vrijednosti (±20% za
LLOQ) i to za 75% od minimalno 6 kalibracijskih standarda.
Braggio et al. (1) koriste kalibracijsko područje od čak 50-500 puta pokriveno sa 6-
10 standarda, (R>0,990, po mogućnosti >0,995) ili 6-8 standarda uključujući LLOQ, plus
slijepi uzorak (matriks bez internog standarda) i uzorak nula (matriks s internim
standardom) (27). LLOQ treba dati odgovor barem 5x veći od odgovora slijepog uzorka uz
preciznost od 20% i analitički povrat od 80-120%. On odgovara najnižoj koncentraciji na
standardnoj krivulji. ULOQ metode je najviši standard. Ako funkcija nije linearna potrebno
je više koncentracijskih razina. Kalibracijsko područje ne smije biti preširoko jer dolazi do
gubitka istinitosti (točnosti) i preciznosti. Rezidualni podaci izražavaju se kao ukupni
«bias» {odstupanje (%) = [(koncnom-koncinterp)/koncnom)]x100} dobiven pri svim
koncentracijskim razinama. Najbolji model je onaj s najnižim ukupnim odstupanjm i
odstupanjem koje je konstantno kroz cijelo koncentracijsko područje. Ovaj postupak
primjeren je pretkliničkim ispitivanjima dok se u kliničkim ispitivanjima ovaj postupak
primjenjuje na sve kalibracijske podatke zajedno (unutar dana i izmeñu dana). Standard
koji odstupa za više od 20% smatra se bjeguncem te se maksimalno dva takva bjegunca
smiju eliminirati odnosno barem pet točaka mora ostati da bi se smjela ponoviti linijska
regresija.
U kromatografskim metodama obično se postiže dobra linearnost, a odstupanja od
linearnosti se javljaju, npr., u imunokemijskim ispitivanjima. Kod «ligand-binding»
ispitivanja povratno izračunata ispravnost kalibracijskih standarda i QC uzoraka mora se
kretati unutar ±20%, osim za LLOQ i ULOQ kada ne smije prijeći ±25% (5).
Preciznost i istinitost (točnost), ispravnost («accuracy») (1, 27, 5). – I istinitost
(točnost) i preciznost potrebno je procijeniti pri minimalno tri koncentracije. RSD i %

29
odstupanja definiraju preciznost i istinitost (točnost) analize. Kriteriji za oba parametra u
literaturi su obično 10-25% (5-10% u kromatografiji). Prihvatljiva neispravnost i
nepreciznost za kromatografiju ne treba prijeći 20% pri QL (LLOQ) ili 15% za QC. Ovi
kriteriji vrijede i za ispitivanja ispravnosti i preciznosti unutar jedne analize ili više analiza.
«Radioimunoassay» tehnika (RIA) slabije je precizna pa se za nju postavljaju blaži kriteriji
od 20 i 25% pri QL.
Ispravnost analize realnih uzoraka pacijenata dobiva se na temelju ponovljenih
analiza koje se rade kroz neko vrijeme; razlika izmeñu dvije vrijednosti treba ležati unutar
±20% (30% za «ligand binding» ispitivanja) za barem 67% ponavljanja (5).
Analitički povrat, izmjera («recovery») (1, 27). – Da bi se ustanovila efikasnost
metode da detektira sav analit prisutan u uzorku, usporeñuje se odgovor za esktrahirani
uzorak obogaćen prije ekstrakcije, s odgovorom za ekstrahirani slijepi matriks obogaćen
prije injektiranja ili mjerenja odgovora (1), ili za čisti autentični standard (27). Važno je da
izmjera bude što bliža 100% (minimalno prihvatljivo 70%), precizna i konstantna unutar
kalibracijskog područja pa se kontrolira pri njegovim krajevima i u sredini (1, 27).
Selektivnost/specifičnost (1, 27). – Kromatografske metode su selektivne dok
metode koje se temelje na imunokemijskim reakcijama moraju biti specifične, npr., zbog
nedostatka kromatografske separacije, jer je potrebno odrediti samo analit, a ne i
metabolite.
Da nema interferencija endogenih supstanci u biološkom matriksu (npr., u plazmi,
urinu) pokazat će analiza najmanje 6 pojedinačnih kontrolnih blankova (1, 27) u kliničkim
i najmanje 3 u pretkliničkim ispitivanjima (ili 6 ako je prisutna interferencija), najbolje
prije i poslije jela. Moguća interferencija metabolita lijekova može se ispitati i u
pretkliničkoj i u kliničkoj fazi. U ispitivanju selektivnosti u odnosu na istovremeno
primijenjene lijekove i njihove metabolite slijepi matriks treba obogatiti tim supstancijama
pri njihovoj maksimalno očekivanoj koncentraciji. Selektivnost treba biti osigurana i pri
LLOQ (27).
Specifičnost bioanalitičke metode za realne uzorke se ustanovljava spektroskopskim
metodama poput MS ili «diode-array» detektorom da se ustanovi čistoća eluiranog pika, ili
drugom, dodatnom, kromatografskom metodom različite selektivnosti.
Prema USP, US FDA, EMEA specifičnost znači mogućnost nedvojbenog
razlikovanja/dokazivanja analita i unutarnjeg standarda (IS) od endogenih komponenti
matrice (npr., krv, plazma, urin) i ostalih prisutnih komponenata u matrici uzorka, poput
nečistoća i razgradnih produkata. Komedikaciju takoñer treba uzeti u obzir. Na odsustvo
interferencije ukazuje signal «blank»-a (6x) koji je <20% od vrijednosti LLOQ (5). U
HPLC-u specifičnost znači da je pik analita tražene strukture i 100 % čist (16). Čistoća
pika, homogenost i odreñivanje strukture danas gotovo potpuno počivaju na
kompjuteriziranim metodama, komercijalnim «software»-ima i pregledavanju spektralnih
baza. Stvarna čistoća eluiranog spoja (pika) i njegov identitet najbolje se dokazuje
kombinacijom UV i MS spektara, pa i NMR spektara.
Enantioselektivnost. - Kada se razvija lijek koji je jedan enantiomer treba koristiti
kiralnu metodu da bi se za svaku speciju i za svaki put primjene dokazalo da nema
racemizacije in vivo. Ovakva metoda ne mora biti validirana jer je rezultat kvalitativan.
Ako se racemizacija in vivo dogaña ili ako se razvija racemični lijek kiralnu metodu treba
razviti i validirati.
Stabilnost (1, 27). – Važan dio validacije bionalitičkog postupka je i ispitivanje
stabilnosti analita u biološkom uzorku, reagenasa i matične otopine analita. Stabilnost

30
lijeka u biološkoj tekućini funkcija je uvjeta čuvanja, kemijskih svojstava lijeka, naravi
matriksa i posuña pa se mora procijeniti upravo u odgovarajućem sustavu matriksa i
posuña. Pripravlja se «pool» matrice uzorka (krvna plazma, serum, urin, etc.) pazeći pri
tom na primjenu odreñenog tipa antikoagulansa.
Procjenjuje se stabilnost analita tijekom sakupljanja uzorka i rukovanja uzorkom,
poslije dugotrajnog čuvanja (zamrzavanje pri odgovarajućoj temperaturi) i kratkotrajnog
čuvanja (laboratorij, sobna temperatura) te nakon ciklusa zamrzavanje/odmrzavanje i
predobradbe. Npr., važna je stabilnost nakon obradbe uzorka (npr., ekstrakcije), kod
eventualnog kvara instrumenta tijekom noći. Za ispitivanja stabilnosti koristi se set uzoraka
pripravljenih od svježe matične otopine analita u odgovarajućem biološkom matriksu bez
analita i bez interferencija na minimalno dvije koncentracijske razine. Volumen dodane
matične otopine ne smije prijeći 1% volumena matrice. Ispituje se dugoročna stabilnost
analita u biološkom materijalu, do 1 godine pa i duže, kod niskih koncentracija, te
stabilnost nakon najmanje tri naizmjenična ciklusa zaleñivanja/otapanja (zamrzavanje 12-
24 h, npr., -70 oC)/odmrzavanje. Kratkoročna stabilnost (ili procesna stabilnost, stabilnost
na radnom stolu) ispituje se pri sobnoj temperaturi kroz vrijeme koje je obično dovoljno za
pripravu uzorka, rukovanje uzorkom i mjerenje (obično 4-24 sata), a dugotrajna stabilnost
pod uvjetima čuvanja realnih uzoraka.
Stabilnost matične otopine analita je prihvatljiva uz razlike od 5-7% (21). Ostali
reagensi koji se ispituju na stabilnost su kod kromatografskih metoda derivatizacijski
reagensi i enzimi a kod «ligand binding» metoda antitijela, biološke matrice, etc.
Kod kromatografskih metoda stabilnost analita i IS u matrici se vidi ako se
periodične analize niskih i visokih QC uzoraka ne razlikuju za više ±15% od nominalne
koncentracije (5, 21). Za «ligand binding» metode preporučuje se da srednje odstupanje ne
bude veće od ±20% (odnosno ±25% pri LLOQ i ULOQ) (21).
Stabilnost analita u stvarnom matriksu definira pogodne uvjete skladištenja i vrijeme
skladištenja uzoraka. Npr., pogreška analize može se pojaviti u slučaju N-oksida ili
konjugata faze II, poput glukuronida ili glutationa, koji se skladištenjem ili otapanjem
mogu vratiti u ishodne spojeve što dovodi do njihovih lažno povišenih koncentracija. Iako
se ovo može predvidjeti iz strukture metabolita, najbolje je odmah napraviti provjeru
realnih uzoraka i kontrola kvalitete ili kalibracijskih uzoraka nakon što su ostavljeni 1 dan i
1 tjedan pri sobnoj temperaturi. Lijek se smatra stabilnim u biološkoj tekućini ako je
koncentracija procijenjena iz regresijske linije veća od 95% početne koncentracije.
Braggio i sur. (1) detaljno ukazuju na smjernice validacije u preliminarnoj,
pretkliničkoj i kliničkoj fazi razvoja lijeka (tablica 8):
Validacija preliminarnih metoda. – Preliminarna metoda je ona koja se koristi za
farmakokinetička ispitivanja spojeva pronañenih u fazi istraživanja. Glavni parametri koji
se traže su izmjera, specifičnost, granica detekcije, linearnost u kalibraciji, stabilnost u
biološkim matriksima i stabilnost nakon ekstrakcije, ali ako je potrebno odlučiti izmeñu
nekoliko lijekova s kojim krenuti u daljnji razvoj onda su potrebni i podaci ispravnosti i
preciznosti. Stabilnost uzoraka ispituje se u biološkoj tekućini (krv, urin, etc.) pri 37 oC
kroz najmanje 4 sata. Radi se i naknadna kontrola stabilnosti. Takoñer, da bi se dodatno
kontrolirala stabilnost uzoraka i pouzdanost analize realnih uzoraka pripravljaju se QC-ovi
na dan uzorkovanja, čuvaju zajedno s uzorcima (krv i plazma kratkotrajno na ledu, inače
pri –80 oC, urin i feces pri –20 oC) i istovremeno s njima i analiziraju.

31
 Validacija pretkliničkih metoda. – Bitan dio ovih ispitivanja čine farmakokinetička
i toksikokinetička ispitivanja (ispitivanja neškodljivosti). Preliminarna metoda je već
definirana te se koristi kao takva ili se modificira.
Unutar validacija pretkliničke metode ispituju se istinitost (točnost) i preciznost
unutar analize primjenom seta kalibracijskih uzoraka, seta kontrola kvalitete i obogaćenih
uzoraka na najmanje tri koncentracijske razine (QL, srednja i najviša koncentracija
kalibranta). Izmjera se ispituje takoñer na tri koncentracijske razine, a slijepi uzorci iz
najmanje tri različite životinje služe za potvrdu selektivnosti metode prema endogenim
spojevima. Uzorci kontrole kvalitete analiziraju se zajedno s nepoznatim uzorcima
(dnevna izvedba metode).
Stabilnost se kontrolira analizom uzoraka odmah nakon pripreme i pri barem 10
vremenskih točaka sve do 1 godine skladištenja. Ako se ustanovi nestabilnost na početku
pri –20 oC ispitivanje se nastavlja pri –80 oC. U ovoj fazi obično su dostatni podaci za
nekoliko mjeseci.
Validacija kliničkih metoda. – U ovoj fazi metode su često podvrgnute značajnoj
modifikaciji jer je potrebno poboljšati osjetljivost, preciznost i ispravnost. Izvorna klinička
metoda može biti i automatizirana, no u smislu validacije nema razlike izmeñu kliničke i
automatizirane metode.
Prije primjene u kliničkim ispitivanjima ispituju se analitički povrat i preciznost
unutar analize i izmeñu analiza kroz više dana, te rezultati analiza kontrola kvalitete kroz
više dana. Ponovno se koriste kalibracijski uzorci, obogaćeni uzorci pri svakoj
koncentraciji kalibracijskog standarda i kontrole kvalitete pri tri koncentracijske razine.
Slijepi matriks uzima se od barem 6 različitih individua. Uzorci kontrole kvalitete čuvaju
se pod istim uvjetima kao i realni uzorci i analiziraju se zajedno sa svakom šaržom
uzoraka tijekom validacije izmeñu dana.
Prenošenje metode i promatranje metode. – Kada se metoda prenosi u drugi
laboratorij, npr. ugovorni laboratorij, treba provesti validaciju zajedno sa serijom «blind»
kontrola kvalitete koje je pripravilo sponzor ili realnih uzoraka koje je sponzor već
analizirao. Kalibracijske parametre, selektivnost i nadasve kontrole kvalitete treba
promatrati tijekom duljeg perioda primjene metode da bi se ustanovili eventualni trendovi i
«drift»-ovi izvedbenih značajki metode.

32
 Tablica 8. Bioanalitičke metode u razvoju lijeka (prema ref. 1) (pres. 14)
Stupanj Primjena
1. Istraživanje Farmakološka ispitivanja
(preliminarna
farmakokinetika i
metabolizam kandidata za
lijekove u životinja)
2. Rani razvoj Toksikokinetika
Apsorpcija−distribucija−
metabolizam−ekskrecija u
životinja (ADME)
modificirana metoda
Faza I kliničkog ispitivanja
(dobrovoljci)
3. Puni razvoj Kliničke faze II, III, IV
Metoda Validacijski parametri
Preliminarna Selektivnost (specifičnost)
Analitički povrat (izmjera)
DL
Linearnost
Kratkoročna stabilnost
(Preciznost, istinitost/točnost)
Modifikacija/razvoj
nove metode
Pretklinička Preciznost i istinitost (točnost)
unutar analize
Analitički povrat (izmjera)
Proširenje kalibracijskog
područja
QC
Selektivnost (specifičnost)
Temeljna
Klinička Preciznost i istinitost (točnost)
(definirana metoda) unutar analize/izmeñu analiza
Selektivnost (specifičnost)
Dugoročna stabilnost
Stabilnost otapanje/zaleñivanje
Potpuno Veliki uzorci tj. šarže
automatizirano

LITERATURA

1. S. Braggio, R. J. Barnaby, P. Grossi, i M. Cugola, A strategy for validation of bioanalytical

methods, J. Pharm. Biomed. Anal. 14 (1996) 375-388.
2. B. Dejaegher, Y. Vander Heyden, Ruggedness and robustness testing, J. Chromatogr. A 1158
(2007) 138-157.
3. K. Doerffel, Multifaktorpläne – ein einfaches Hilfsmittel zur Prüfung auf Selektivität, Pharmazie
49 (1994) 216-218.
4. EDQM, OMCL Guideline on Validation of Analytical Procedures, Council of Europe,
Strasbourg 2005.
5. EMEA, European Medicines Agency, Committee for Medicinal Products for Human Use
(CHMP), Guideline on Validation of Bionalaytical Methods - Draft agreed Sept 2009, adoption
by CHMP Nov 2009, end of consult. May 2010, EMEA, London Nov 2009.
6. Eurachem, EURACHEM Guide: The Fitness for Purpose of Analytical Methods – A Laboratory
Guide to Method Validation and Related Topics, LGC, Teddington 1998.
7. B. V. Fisher, Collaborative trials, Anal. Proc. 21 (1984) 443-448.
8. C. Hartmann, D. L. Massart i R. D. McDowall, An analysis of the Washington Conference
Report on bioanalytical method validation, J. Pharm. Biomed. Anal. 12 (1994) 1337-1343.
9. D. B. Hibbert, Method validation of modern analytical techniques, Accred. Qual. Assur. 4 (1999)
352-356.
10. G. C. Hokanson, A life cycle approach to the validation of analytical methods during
pharmaceutical product development, Part I: The initial method validation process, Pharm.
Technol. 18 (1994) 118-130.

33
11. G. C. Hokanson, A life cycle approach to the validation of analytical methods during
pharmaceutical product development, Part II: Changes and the need for additional validation,
Pharm. Technol. 18 (1994) 92-100.
12. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of
Pharmaceuticals for Human Use, ICH Harmonized Tripartite Guideline, Text on Validation of
Analytical Procedures, Step 4, Geneva, Oct. 1994.
13. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of
Pharmaceuticals for Human Use, ICH Harmonized Tripartite Guideline, Validation of
Analytical procedures: Text and methodology Q2(R1), Current Step 4 version, Nov 1996,
Geneva, Nov 2005.
14. Japan Pharmacopoeia XIV, Society of Japanese Pharmacopoeia, Tokyo 2002, pp. 1330-1332.
15. H. T. Karnes, G. Shiu i V. P. Shah, Validation of bioanalytical methods, Pharm. Res. 8 (1991)
421-426.
16. I. Krull i M. Swartz, Determining specificity in a regulated environment, LCGC 19 (2001) 604-
614.
17. J. R. Lang i S. Bolton, A comprehensive method validation strategy for bioanalytical applications
in the pharmaceutical industry – 1. Experimental considerations, J. Pharm. Biomed. Anal. 9
(1991) 357-361.
18. S. Luterotti: Matrix effects in the determination of Zn(II) ion in whole rat liver by flame atomic
absorption spectrometry, Analyst 120 (1995) 925-930.
19. S. Luterotti: Short multifactorial concept in analysis of copper(II) in complex matrices by flame
atomic absorption spectrometry, Acta Pharm. 46 (1996) 239-244.
20. S. Luterotti: Short multifactorial plan for the determination of trace metals in complex matrices
by flame atomic absorption spectrometry, J. Anal. Atom. Spectrom. 11 (1996) 973-978.
21. W. Nowatzke i E. Woolf, Best practices during bionalaytical method validation for the
characterization of assay reagents and the evaluation of analyte stability in assay standards,
quality controls, and study samples, AAPS J. 9 (2007) E117-E122.
22. E. S. Pearson i H. O. Hartley, Biometrika Tables for Statisticians, Biometrika Trust, University
College, London 1976, pp. 29-32, 205-210.
23. R. L. Plackett i J. P. Burman, The design of optimum multifactorial experiments, Biometrika
(London) 33 (1946) 305-325.
24. G. A. Shabir, Validation of high performance liquid chromatography methods for pharmaceutical
analysis – Understanding the differences and similarities between validation requirements of
the US Food and Drug Administration, the US Pharmacopeia and the International Conference
on Harmonization, J. Chromatogr. A 987 (2003) 57-66.
25. L. D. Torbeck, Ruggedness and robustness with designed experiments, Pharm. Technol. 20
(1996) 168-172.
26. L. D. Torbeck i R. C. Branning, Designed experiments – A vital role in validation, Pharm.
Technol. 20 (1996) 108-114.
27. US FDA, Guidance for Industry – Bioanalytical Method Validation, Rockville MD, 2001
28. USP23/NF18, General Information/<1225>, Validation of Compendial Methods, The United
States Pharmacopeial Convention, Rockville MD, 2001, pp. 1982-1984.
29. USP 24/NF 19, General Information/<1225>, Validation of Compendial Methods, The United
States Pharmacopeial Convention, Rockville MD, 2002, pp. 2149-2152.
30. USP 29/NF 24, General Information/<1225>, Validation of Compendial Methods, The United
States Pharmacopeial Convention, Rockville MD, 2007, pp. 2149-2152.

34
31. W. J. Youden i E. H. Steiner, Ruggedness test for procedures, in Statistical Manual of the
Association of Official Analytical Chemists, AOAC, Arlington, VA, 1975, pp. 33-36.

35
 Dane Bicanic∗ i Svjetlana Luterotti**

FOTOTERMIČKE METODE U KEMIJSKOJ ANALIZI

Motto

Istraživanja posljednjih godina ukazuju na činjenicu da se kao kandidati novih

pouzdanih analitičkih postupaka u analizi kompleksnih uzoraka uvode postupci iz skupine
fototermičkih tehnika. U konvencionalnoj spektroskopiji mjereni uzorak treba biti proziran ili
propustljiv za upadno elektromagnetsko zračenje; stoga se apsorpcija računa iz izmjerene
transmisije. Za razliku od tradicionalnih analitičkih tehnika, fototermičke metode
(«photothermal methods», PT) funkcioniraju u refleksiji ili transmisiji te se temelje na
neizravnom mjerenju apsorbancije u optički neprozirnim uzorcima ili onima koji raspršuju
svjetlo. Za razliku od, npr., HPLC i spektrofotometrije, fototermičke metode ne koriste
ekstrakciju te je jedina predobradba uzorka homogenizacija. Na taj način izbjegavaju se
dugotrajni i često mukotrpni postupci uobičajene predobradbe uzoraka.

PT tehnike uključuju fotoakustičku spektroskopiju («photoacoustic spectroscopy») u

UV-Vis i IR području, optotermički prozor («optothermal window») koji je varijanta
fotoakustične spektroskopije, i spektroskopiju termičke leće («thermal lens spectroscopy»).
Ove su tehnike već našle svoju primjenu u ispitivanju autentičnosti hrane i njezine nutritivne
vrijednosti, poljoprovredi, ispitivanju onečišćenja i zaštiti okoliša, etc. (npr., u detekciji i
kvantifikaciji karotenoida u proizvodima iz rajčice i manga, margarinima, brašnima, uljima,
sintetskih boja u farmaceutskim oblicima, ukupnih masnih kiselina u uljima, vode u medu,
fenola u crvenim vinima i sorgum brašnu, proteina i laktoze u mlijeku, karbonata i PAHs u
tlima).

∗ 1
Biophysics Division, Agrotechnology and Food Sciences, Wageningen University, Dreijenlaan 3,
6703 HA Wageningen, The Netherlands
** Zavod za analitičku kemiju, Farmaceutsko-biokemijski fakultet, Sveučilište u Zagrebu, HR-10000
Zagreb, Ante Kovačića 1
 UVOD

Zadnjih godina razvijene su nove nekonvencionalne analitičke metode temeljene na

fotoakustičkim i fototermičkim efektima koje su se pokazale naročito korisnima u analizi
hrane (2). Uzorci hrane mogu se tako jednostavno analizirati bez primjene dugotrajnih i
skupih postupaka predobradbe, npr., ekstrakcija; uzorak je potrebno samo homogenizirati.

Fototermičke tehnike (PT) temelje se na neizravnom mjerenju apsorbancije u optički

neprozirnim uzorcima i onima koji raspršuju svjetlo (2). Optički neprozirne polutekućine
apsorbiraju energiju svjetla i prevode ju u toplinsku energiju (1, 3). Naime, energija
ekscitacije elektronskih stanja u atomima ili molekulama gubi se serijom ne-zračećih
relaksacija što rezultira grijanjem uzorka. Za razliku od spektrofotometrijskih detektora koji
mjere učinak uzorka na ulaznu ekscitacijsku zraku, kod PT metoda uzorak ne treba biti
proziran. Bitno je samo poklapanje valne duljine upadnog zračenja i valne duljine apsorpcije
analita. Ako je taj uvjet ispunjen analit će apsorbirati upadno zračenje uzrokujući stvaranje
topline (i toplinskih valova) i porast temperature u uzorku. Količina stvorene topline
proporcionalna je apsorbanciji pa tako i koncentraciji apsorbirajućeg analita te se može
mjeriti kroz promjene parametara uzorka induciranih toplinom. Svaka sastavnica uzorka koja
apsorbira pri λ ekscitacije interferira s analitom jer stvara dodatnu toplinu.

Kod PT tehnika detektiraju se fenomeni koji nastaju u apsorbirajućem uzorku kada je

on podvrgnut periodički moduliranom zračenju pri odreñenoj valnoj duljini. Apsorpcija
svjetla u uzorku ne rezultira raspadom niti fotokemijskim procesima već dovodi do
periodičkog stvaranja topline koja izaziva odgovarajuće promjene nekih fizičkih svojstava u
uzorku ili u kontaktnoj tekućini. Npr., PT efekti uključuju nabreknuće čvrste površine kad ju
se zagrijava, pojavu zvuka, stvaranje gradijenta indeksa loma u kontaktnoj tekućini, promjene
u količini toplinskog zračenja emitiranog od strane uzorka, etc. (1). Ovi efekti mogu se
detektirati raznim PT metodama kao što su «photothermal beam deflection» (PTBD),
«optothermal window spectroscopy» (OW), «photoacoustic spectroscopy» (PAS), «thermal
lens spectrometry» (TLS), «photothermal radiometry» (PTR), etc. Svaka od ovih metoda
koristi specifični pretvarač koji stvara izmjenjljivi napon (tzv. PT signal) kod neke
modulacijske frekvencije. Amplituda PT signala izravno je proporcionalna količini topline
stvorene u uzorku. Detektori su fotodioda (u PTBD i TLS), mikrofon (u PAS), IR detektor (u
PTR) (1).

2
 Toplina koja se stvara u uzorku primarno ovisi o koncentraciji apsorbirajućeg
kromofora, upadnoj snazi koja dolazi na uzorak i termičkim svojstvima uzorka. Izravna
proporcionalnost izmeñu PT signala i koncentracije kromofora čini PT metode pogodnima za
za njihovo odreñivanje. Dapače, PT metode uspješno su primijenjene u detekciji tragova
analita u plinovitom stanju (6) i u tekućinama (5), kao i u ispitivanjima tekućina koje jako
apsorbiraju (1, 2).

PT tehnike moguće je primijeniti za izravnu, brzu i jednostavnu kvantifikaciju analita

(bez predobradbe uzorka) i u optički neprozirnim uzorcima (npr., uzorci hrane, klinički
uzorci) (3-5). Ovo je ustanovljeno koreliranjem rezultata PT metoda s analizama dobivenim
nekom konvencionalnom fizičko-kemijskom metodom (npr., HPLC, spektrofotometrija).
Najčešće korišteni koncepti su koncept «optothermal window spectroscopy» (OW) i
«photoacoustic spectroscopy» (PAS) koji su temeljno različiti od onih u konvencionalnoj
spektroskopiji pa se ovim tehnikama lako analiziraju uzorci koji su potpuno neprozirni,
polutekući i gusti. U oba slučaja frakcija zračenja koja dolazi iz periodički moduliranog
izvora zračenja i koju apsorbira uzorak prevodi se u toplinu. Uzorak se periodički grije/hladi
što utječe na tlak plina (u PA efektu) u hermetički zatvorenoj komori (PA komora) iznad
kondenzirane faze uzorka (1). Što se tiče OW koncepta toplina stvorena u kondenziranoj fazi
uzrokuje radijalnu ekspanziju piezoelektričnog diska koji nosi uzorak. Amplituda tlaka (PA
signal) ili radijalne ekspanzije (OW signal) u korelaciji je s količinom topline stvorene u
uzorku a količina topline prvenstveno ovisi o koncentraciji apsorbirajuće specije i snazi
upadnog ekscitirajućeg zračenja. Stoga je veličina PA i OW signala izravno proporcionalna
koncentraciji analita. Kod OW mjerenja uzorak se postavlja na površinu safirnog diska dok se
u PA mjerenjima stavlja u udubljenje za uzorak. U oba slučaja mjeri se OW and PA signal
kod neke modulacijske frekvencije i procesira računalom.
PA (ili OW) signal normalizira se sa signalom crne tinte ili praha ugljika kao
referentnim uzorkom odnosno kao jakim apsorberom izmjerenim pod identičnim
eskperimentalnim uvjetima. Na taj način kompenzira se utjecaj nestabilnosti izvora
ekscitacije ili valne duljine na dobiveni signal. Iz normaliziranog signala računa se
bezdimenzijski umnožak βµ koji služi za postavljanje kalibracijske funkcije u odnosu na neku
referentnu metodu (HPLC, spektrofotometrija). Ta funkcija kasnije može poslužiti za
kvantifikaciju analita PAS-om ili OW-om pod istim eksperimentalnim uvjetima (geometrija
zrake uzorka, snaga lasera, modulacijska frekvencija, etc.).

3
 Literatura

1. D. P. Almond, P. M. Patel, Photothermal Science and Techniques, u: Physics and its Applications
(ur. E. R. Dobbs), Chapman&Hall, London 1996.

2. S. E. Bialkowski, Photothermal Spectroscopy Methods for Chemical Analysis, u: Chemical

Analysis - A series of monographs on analytical chemistry and its applications, Volume 134 (ur. J.
D. Winefordner), Wiley, New York 1996.

3. D. Bicanic, J. Swarts, S. Luterotti, G. Pietraperzia, O. Dόka, H. de Rooij, Direct quantification of

lycopene in products derived from thermally processed tomatoes: Optothermal window as a
selective, sensitive, and accurate analytical method without the need for preparatory steps, Anal.
Chem.76 (2004) 5203-5207.

4. M. Franko, P. van Bovenkamp, D. Bicanic, Determination of trans-β-carotene and other

carotenoids in blood plasma using high-performance liquid chromatography and thermal lens
detection, J. Chromatogr. B 718 (1998) 47-54.

5. S. Luterotti, M. Franko, M. Šikovec, D. Bicanic, Ultrasensitive assays of trans- and cis-β-carotenes

in vegetable oils by high performance liquid chromatography-thermal lens detection, Anal. Chim.
Acta 460 (2002) 193-200.

6. S. T. Persijn, F. J. M. Harren, I. Wijkamp, L. Mitrayana, Study of gas exchange in insects by

sensitive laser photoacoustic spectroscopy, Instr. Sci. Technol. 34 (2006) 85-97.

4
 FOTOAKUSTIČKA SPEKTROSKOPIJA (PAS)

Princip

Općenito, fotoakustička spektroskopija uključuje selektivno osvjetljavanje

kondenzirane faze uzorka pomoću zrake periodički moduliranog svjetla, npr., iz lasera, LED-
a ("light-emitting diode") ili lampe, čija valna duljina koincidira s valnom duljinom
apsorpcije analita u uzorku. Zbog nezračećih prijelaza, dio energije koju uzorak apsorbira
pretvara se u toplinu. Kao rezultat toga uzorak se periodički grije i hladi, tj., temperatura
uzorka periodički oscilira pri frekvenciji modulacije. Tako nastali toplinski valovi dolaze do
površine uzorka i uzrokuju periodičko grijanje i hlañenje sloja plina iznad uzorka. U PA
komori koja ima stalni volumen takve ekspanzije i kontrakcije plina dovode do nastanka
zvučnih valova čiju amplitudu detektiramo mikrofonom (kao voltažu, tzv., PA signal) pri
modulacijskoj frekvenciji. PA spektar dobiva se kao funkcija PA signala mikrofona o valnoj
duljini upadnog svjetla. Optički i termički parametri uzorka i plina s kojim je on u kontaktu
važni su u procesu nastajanja PA signala.

Temeljna definicija koja opisuje ponašanje u plinovitoj fazi kaže, da se fotoakustička

spektroskopija temelji na fotoakustičnom efektu kada zračenje odreñene valne duljine kojeg
emitira neki izvor zračenja ulazi u interakciju s molekulama plina koje se nalaze u
apsorpcijskoj kiveti (5). Ako je frekvencija emisije izvora zračenja, fe, jednaka jednoj od
karakterističnih apsorpcijskih frekvencija, fa, plina u kiveti (i ovdje se radi o liniji spektralne
širine zbog Dopplerovog efekta ili proširenja zbog sudara) dolazi do pobuñivanja
odgovarajuće molekulske razine i kratko vrijeme nakon toga (ovisno o tlaku unutar kivete) do
relaksacije putem nezračećih sudara. Na taj način povećava se kinetička energija molekula
plina što dovodi do porasta temperature plina. Zbog toga dolazi i do odgovarajućeg porasta
tlaka plina u kiveti. Rotirajućim sektorom koji se postavlja izmeñu izvora zračenja i kivete
periodički se modulira intenzitet zračenja što dovodi do pobuñivanja akustičnog titranja (tj.
stvaranja zvuka) pri istoj modulacijskoj frekvenciji, fm. Za detekciju amplitude zvučnog
signala koristi se osjetljivi mikrofon u kombinaciji sa sinkronom detekcijom pomoću faznog
pojačala (slika 1). U obzir dolaze IR i ostala područja elektromagnetskog zračenja pod
uvjetom da postoji koincidencija izmeñu emisijske i apsorpcijske frekvencije.

5
 Slika 1. Laserski fotoakustički spektrometar. Na prednjem dijelu glavne kivete pričvršćena je
referentna kiveta u kojoj se nalazi smjesa poznate koncentracije (prema ref. 5). (pres. 1)

Amplituda A zvučnog signala (V) izravno je proporcionalna snazi snopa upadnog

zračenja P0 pri odreñenoj valnoj duljini λ, broju apsorbirajućih molekula po jedinici
volumena Na, osjetljivosti kivete Sm i veličini apsorpcijskog presjeka δ pri istoj valnoj duljini.
U slučaju slabe apsorpcije vrijedi:

A = P0 Na δ Sm (1)

Umnožak Na δ predstavlja frakciju apsorpcije (prema upadnoj snazi) po jedinici dužine,

odnosno:

Na δ = P apsorbirano od strane P0 L molekula plina (2)

gdje je L dužina kivete a P dio upadne energije koji molekule plina apsorbiraju. Veza izmeñu
koncentracije C i Na data je jednadžbom:

Na = N0 C (3)

gdje je N0 = 2,7x1025 molekula m-3 (pri standardnim uvjetima), a C je bezdimenzijski

koncentracijski udio. Iz jednadžbi (1), (2) i (3) dobiva se:

A = P0 N0 δ C Sm (4)

Eksplicitni izraz za Sm je:

Sm = (γ-1) Bm L 2/π2 fm V (5)

6
gdje je Bm osjetljivost mikrofona (mV Pa-1), fm je modulacijska frekvencija (s-1 = Hz), V je
volumen kivete (m3), a γ je omjer vrijednosti specifične topline pri konstantnom tlaku cp i
konstantnom volumenu cV (taj je broj veći od 1). Veza izmeñu δ i koeficijenta apsorpcije α
(mjeri se u atm-1 m-1) je:

δ = α p/C N0 (6)

gdje p predstavlja tlak.

Iz jednadžbi (4) i (6) slijedi da se pod pretpostavkom da je vrijednost δ ili α poznata za

ispitivanu supstanciju, fotoakustičkim mjerenjem može uspostaviti jednoznačna veza izmeñu
amplitude A zvučnog signala i koncentracije molekula plina C. Takoñer, mijenjanjem valne
duljine izvora zračenja pri konstantnoj koncentraciji molekula plina dobiva se fotoakustički
spektar plina koji je u izravnoj korelaciji s apsorpcijskim spektrom supstancije.

Instrumentacija

Fotoakustička kiveta izgrañena je obično u obliku cijevi i posjeduje cilindričnu

simetriju (5). Ona može biti rezonantna i nerezonantna. Prva, svojom geometrijskom
konstrukcijom (dimenzijama) sama djeluje kao akustički rezonator te pojačava amplitudu
stvorenog zvučnog signala pri modulacijskoj frekvenciji fm. Takva kiveta posjeduje visoki
akustički faktor. Rezonantna kiveta je vrlo osjetljiva na vrstu plina koji se istražuje jer je
brzina širenja zvučnog vala ovisna o gustoći, odnosno sastavu plinske smjese. Zato se
upotreba takve rezonantne kivete preporučuje pri finim mjerenjima niskih koncentracija ili
kod promatranja koncentracije jedne komponente u funkciji vremena. Takva protočna kiveta
za «on-line» mjerenja radi tako da se uzorak smjese prosisava kroz kivetu pomoću dovodne i
odvodne cijevi. Najbolje je ove cijevi smjestiti na mjestima gdje je amplituda zvučnog vala
jednaka nuli (čvor), dok se mikrofon nalazi tamo gdje akustički val ima maksimalnu
amplitudu (trbuh vala).

Uz zvučni signal koji nastaje zbog prisutnosti molekula plina koje apsorbiraju
zračenje, dolazi, neovisno o tipu kivete, do pojave «šuma» zbog apsorpcije i raspršenja
upadnog zračenja na materijalu od kojeg je izgrañen prozor kojim se kiveta zatvara. S
obzirom da se apsorpcijom zračenja taj prozor zagrijava i to u tempu modulacijske
frekvencije, mikrofon prepoznaje takav šum i registrira ga kao signal. Šum je proporcionalan
snazi upadnog zračenja. Da bi se ovaj efekt smanjio fotoakustičku kivetu valja smjestiti

7
unutar jedne druge, duže, šuplje cijevi pa se postiže da je udaljenost izmeñu površine prozora
i mikrofona veća od udaljenosti izmeñu otvorenog kraja kivete i mikrofona.

Upadno zračenje u PA kivetu ulazi kroz kvarcni prozorčić, a uzorak se postavlja u

mikrolitarsko semisferično udubljenje u držaču uzorka. Ono je akustički spojeno s
minijaturnim mikrofonom pomoću kapilare. PA signal procesira se pojačalom te računa
srednja vrijednost većeg broja ponovljenih ili neovisnih mjerenja. Konstrukcijski dijelovi
prikazani na slici 2 (8). Danas je pravilnom konstrukcijom fotoakustičke kivete i izborom
mikrofona moguće uz relativno nisku cijenu konstruirati fotoakustički spektrometar sa CO2
laserom kao izvorom zračenja. Njegov spektralni raspon može se proširiti od 9-11 µm na 8-12
µm primjenom izotopa ugljika.

Analitička primjena

Fotokaustička mjerenja rade se i u tekućoj i u čvrstoj fazi.

PAS se preporučuje kao novo analitičko sredstvo za jednostavne i brze rutinske

kontrole, npr., ukupnih karotenoida u margarinima (10), brašnima (11) i tjestenini (7) ili
likopena u svježoj rajčici (2). Kontinuirani Ar-laser služi kao izvor emisije npr. pri 496, 488
ili 476,5, ili 502 nm (10, 11, 2), a emitirana snaga koja dolazi na uzorak u PAS kiveti kreće
se od 10 do 20 mW te se detektira detektorom. Rotirajući sektor modulira zraku na
frekvenciju od 24-25 Hz. Kod te modulacijske frekvencije duljina termičke difuzije je, npr., u
margarinu procijenjena na oko 175 µm. Nerezonirajuća PAS jedinica napravljena je sa
Suprasil prozorom, ”O” prstenastom brtvom i mikrofonom. Nosač uzorka je pločica od
nehrñajućeg čelika sa centralnim polukružnim udubljenjem (dijametar 6-8 mm). Ovo se
udubljenje puni uzorkom te mu se površina poravna spatulom. U slučaju mjerenja u
margarinima (10) laserska zraka nije bila fokusirana; na mjestu uzorka njezin promjer je bio
oko 2 mm. Pod tim je uvjetima prijenos toplinske energije u lateralnom smjeru zanemariv te
se ovaj protok smije smatrati jednodimenzionalnim. PAS signal iz mikrofona se detektira
pomoću faznog pojačala uz integracijsko vrijeme od 1 s. PAS signali normalizirani su prema
crnoj tinti i iz njih je izračunat umnožak duljine toplinske difuzije µ i apsorpcijskog
koeficijenta po jedinici duljine β.

Kod mjerenja luteina u kukuruznoj kaši korišten je ureñaj prikazan na slici 3 (1).
Njega čine «continuous wave» (c. w. ) kriptonski laser [A] koji emitira pri 441 nm, set ravnih
zrcala [B, C], rotirajući sektor („chopper“ [D], dijafragma [E] i PA jedinica konstruirana u

8
laboratoriju [F]. Fazno pojačalo i računalo korišteni su za obradu podataka. Oko 13 mW
nefokusiranog laserskog zračenja stiže na uzorak. PA jedinica (vidi umetak na slici 3) sastoji
se iz dva dijela. Donji dio [L], je blok od nehrñajućeg čelika (10x10x2 cm) sa centralnom
cilindričnom šupljinom [H] koji služi kao držač uzorka. Dijametar i dubina šupljine su 6 i 16
mm za uzorak volumena od 0,33 cm3. Gornji dio jedinice [I] nosi kvarcni prozor [K]
(dijametar 25,4 mm, debljina 2 mm) i mikrofon [J] smješten u cilindričnom postranom kanalu
(dijametar 1,5 mm, duljina 15 mm). [G] je dodatni blok od nehrñajućeg čelika (10x10x2 cm).
Gornji i donji dijelovi PA lako se demontiraju i sastavljaju što omogućava brzo mijenjanje
uzoraka i čišćenje, važno za ponavljanje mjerenja. Kaša od kukuruza (71-84% kukuruza)
služila je i kao „blank“ i za pripravu serije standardnih smjesa s dodanim luteinom. S
poravnatom PA jedinicom napunjenom s uvijek približno istom količinom uzorka mjereni su
amplituda i faza PA signala kod 441 nm (λmax za lutein je 445 nm) te je izmjeren visoki
signal slijepog uzorka koji tek treba objasniti. PAS je metoda kandidat za analize luteina i u
drugim namirnicama (npr., kelj, brokoli) kao i u pomoćnim lijekovima.

Nadalje, za odreñivanje ukupnih karotenoida u tjestenini (7), može se koristiti PA

jedinica s Xe lampom. Zeleni LED (λ=505 nm) bio je primijenjen pri PAS analizi likopena u
proizvodima iz rajčice (4). Nedavno je predloženo PAS odreñivanje ukupnih antocijana u
homogenatu ploda višnje primjenom zelenog laserskog pokazivača (λ=532 nm, 16 mW) (8).

Slika 2. a) Nosač uzorka i PA detektor. Periodički modulirana laserska zraka ulazi u PA ćeliju
kroz prozirni prozorčić. Apsorpcija ulaznog zračenja od strane uzorka stvara toplinske valove. Ovi
toplinski valovi stvaraju zvučne valove u sloju plina iznad uzorka u zatvorenoj PA ćeliji, koji se
detektiraju mikrofonom. b) Poprečni presjek PA ćelije: A – prozirni kvarcni prozorčić, B – nosač
uzorka, C – metalna šipka, D – ekscentrični kotač, E – poluga nosača uzorka, F - O-prsten; G –
kapilarna cijev, H - mikrofon; I – uzorak, J – modulirana laserska zraka (iz ref. 8). (pres. 1)

9
 G A
B
H

I
J
K L

Slika 3. Ureñaj za PA mjerenja luteina: A – c. w. kriptonski laser, B, C - set ravnih zrcala, D –

rotirajući sektor, E – dijafragma F - PA ćelija (umetak): G – blok od nehrñajućeg čelika, H - centralna
cilindrična šupljina, I - gornji dio PA ćelije, K - kvarcni prozor (dijametar 25.4 mm, debljina 2 mm), J
- mikrofon u cilindričnom kanalu, L – podnožje (iz ref. 1). (pres. 1)
PAS se može primijeniti za vrlo osjetljive analize zagañivača u zraku; primjenom
lasera velike izlazne snage mogu se doseći DL vrijednosti od nekoliko ppbv ("part-per-
billion" - 1x10-9, ovdje kao volumski udjeli), npr., za NH3 (12, 13). Sa CO i CO2 laserima
postignuta je linearna korelacija izmeñu PAS signala i koncentracije čak u rasponu od 6
redova veličine. DL ovisi o stupnju stabilizacije snage lasera kao i frekvencije rotirajućeg
sektora. Detektirani su i izmjereni razni spojevi, npr., dušikovi oksidi, monokloretan, freon-
12, etanol, toluen, vinilklorid, metanol, izopropanol, cikloheksan, acetonitril, ozon, etilen,
vodena para, H2S, HCHO, HCl, SO2, dimetilamin, H2O2, metan, etilacetat, metil antranilat,
karvon, pulegon, etc. (3, 5, 6, 9).

Slike 4 i 5 ilustriraju aparature za PAS mjerenja na brašnima. i u homogenatima manga.

Još 1985. Stahl i Breuer su pokazali da je PAS superiorna u odnosu na denzitometrijska

mjerenja praha droga i karotenoida (14).

10
11
 Slika 4. Pogled na radni stol s aparaturom za
PAS mjerenja na brašnima. (pres. 1)

Slika 5. Pogled na radni stol s aparaturom za ispitivanje homogenata manga: lijeva slika (središte) -
PAS, lijevo – OW; desna slika: PAS: 1 - c. w. Ar-ion laser, 2 – tri ravna zrcala, 3 – rotirajući sektor, 4
– PA jedinica. (pres 1)

12
 Literatura

1. D. Bicanic, S. Luterotti, M. Becucci, V. Fogliano, P. Versloot, Photoacoustic measurement of lutein

in biological matrix, J. Phys. IV France 125 (2005) 825-828.

2. D. Bicanic, D. Dimitrovski, S. Luterotti, K. Marković, C. van Twisk, J. G. Buijnsters, O. Dóka,

Correlation of trans-lycopene measurements by the HPLC method with the optothermal and
photoacoustic signals and the color readings of fresh tomato homogenates, Food Biophys. 5 (2010)
24-33.

3. D. D. Bićanić. C. M. A. Sikens, F. T. Schiet, CO2 laser photoacoustic spectrum of methyl

anthranilate, Chem. Senses 10 (1985) 259-268.

4. D. Bicanic, H. Skenderović, K. Marković, O. Doka, L. Pichler, G. Pichler, S. Luterotti,

Quantification of lycopene in the processed tomato-based products by means of the light emitting
diode (LED) and compact photoacoustic (PA) detector, J. Physics Conf. Series 214 (2010) 1-5.

5. D. D. Bićanić, I. Šimonović, F. Harren, Identifikacija i motrenje toksičkih komponenata u plinskoj

fazi pomoću laserske fotoakustičke spektroskopije, Arhiv Hig. Rada Toksikol. 37 (1986) 275-284.

6. D. Bićanić, B. Zuidberg, H. Jalink, A. Miklós, K. Hartmans, A. Van Es, The assessment of laser
photoacoustic spectroscopy as the analytical tool for studying the potato sprout suppressants
carvone and pulegone, Appl. Spectr. 44 (1990) 263-265.

7. O. Dóka, D. Bicanic, J. G. Buijnsters, R. Spruijt, S. Luterotti, Gy. Végvári, Exploiting direct and
indirect methods for the estimation of the total carotenoid concentration in dried pastas, Eur.
Food Res. Technol. 230 (2010) 813-819.

8. O. Dóka, G. Ficzek, D. Bicanic, R. Spruijt, S. Luterotti, M. Tóth, J. G. Buijnsters, Gy. Végvári,

Direct photothermal techniques for rapid quantification of total anthocyanin content in sour cherry
cultivars, Talanta 84 (2011) 341-346.

9. S. A. Johnson, Trace gas detection, using infrared lasers, Anal. Proc. 23 (1986) 1-4.

10. S. Luterotti, D. Bicanic, K. Jandragić, Photoacoustic spectroscopy and optothermal window as

analytical tools to quantitate carotenes in margarines, Food Chem. 108 (2008) 316-321.

11. S. Luterotti, D. Bicanic, K. Kljak, D. Grbesa, E. San Martin Martinez, R. Spruyt, Assaying of total
carotenoids inflours of corn and sweetpotato by photoacoustic spectroscopy, Food Biophys. 6
(2011) 12-19.

12. H. Sauren, E. Gerkema, D. Bicanic, H. Jalink, Real-time in situ determination of ammonia

concentrations in the atmosphere by means of intermodulated Stark resonant CO2 laser
photoacoustic spectroscopy, Atmos. Environ. 27A (1993) 109-112.

21
13. H. Sauren, T. Regts, C. van Asselt, D. Bicanic, Simplifying the laser photoacoustic trace detection
of ammonia by effective suppression of water vapour and of carbon dioxide as the major
absorbing atmospheric constituents, Environ. Technol. 12 (1991) 719-724.

14. E. Stahl, H. D. Breuer: Photo-Akustische Spektroskopie in der Pharmazie, Arch. Pharm.

(Weinheim) 318 (1985) 36-40.

22
 «OPTOTHERMAL WINDOW» (OW)

Princip
Detaljno objašnjenje mehanizma razvijanja OW signala opisano je u literaturi (2, 7, 9,
10, 13, 15). Ukratko, ova tehnika prikladna je za izravno mjerenje visoke apsorbancije u
tekućim, polutekućim i gustim („pasty-like“) uzorcima. U načelu, neprozirni uzorak stavlja se
na tanki disk izrañen iz materijala s velikim toplinskim koeficijentom ekspanzije (tanka
safirna pločica) i periodički obasjava laserskim zračenjem (koje emitira onu valnu duljinu
koju uzorak apsorbira) a koje upada okomito na donju stranu safirne pločice. Ovo zračenje
prolazi kroz disk i stiže do uzorka koji se nalazi na gornjoj strani pločice. Selektivna
ekscitacija odnosno apsorpcija moduliranog upadnog zračenja rezultira nezračećom
relaksacijom uzorka, tj., njegovim zagrijavanjem i pojavom periodičkih oscilacija
temperature uzorka. Zahvaljujući dobrom toplinskom kontaktu uzorka i diska mijenja se i
temperatura diska što dovodi do periodičkih ekspanzija/kontrakcija. Naime, energija
toplinskih valova se difuzijom prenosi iz uzorka na safirnu pločicu koja se zagrijava i hladi i
tako širi i steže. Na stražnju stranu pločice fiksira se prsten iz piezoelektričkog materijala koji
detektira ovu periodičku deformaciju i pretvara ju u oscilirajući napon pri odreñenoj
modulacijskoj frekvenciji. To je OW signal (karakteriziran amplitudom i fazom u odnosu na
upadno zračenje) koji mjerimo faznim pojačalom uz odgovarajuću konstantu integracije.
Dobiveni signal, općenito, ovisi o nizu parametara, kao što su snaga upadnog zračenja,
modulacijska frekvencija, osjetljivost piezoelektričkog detektora, termička i optička svojstva
analita i safirnog diska, etc. Ako su eksperimentalni uvjeti dobro odabrani, poglavito
modulacijska frekvencija, OW signal počinje ovisiti samo o apsorpcijskom koeficijentu
analita te tako i o njegovoj koncentraciji.

OW ureñaj sačinjavaju prozirni safirni disk karakteriziran velikim toplinskim

koeficijentom ekspanzije (debljina 300 µm, dijametar 14-20 mm) s anularnim prstenom
izrañenim iz olovo-cirkonat-titanata (PZT, PbZrxTi1-xO3) vezanim za njegovo dno (1, 8).
Mala količina neprozirnog uzorka (mikrolitarski volumen) stavlja se izravno na središnji dio
safirnog diska a zračenje prolazi najprije kroz safirni disk da bi došlo do uzorka. Da bi se
definirao volumen uzorka (obično 1 cm3) može se za gornju površinu safira zalijepiti drugi
stakleni prsten (i. d. 15 mm, visina 6 mm). Uzorak mora pokriti samo osvijetljeni dio diska

23
(kružni pojas, npr., dijametra 4 mm) diska. Iris dijafragma koristi se da zaštiti PZT detektor
od neželjenog grijanja uzrokovanog prolaskom laserskog zračenja.

Uz optimirane i strogo kontrolirane eksperimentalne uvjete amplituda OW signala je

izravno korelirana s toplinom osloboñenom u uzorku. Ona je proporcionalna umnošku
intenziteta laserske zrake, apsorpcijskom koeficijentu uzorka po jedinici duljine (koji korelira
s koncentracijom apsorbirajuće specije) i duljinom toplinske difuzije kod odgovarajuće
modulacijske frekvencije. Tako je mjerenjem OW signala moguće izmjeriti koncentraciju
analita u kompleksnom uzorku.

OW je kombinacija spektroskopije i kalorimetrije. Važna značajka metode je ta da

debljina uzorka nije važna sve dotle dok je uzorak optički neproziran što implicira da je
fizička debljina uzorka Luz (cm) veća od dubine optičkog prodora Lopt = 1/βopt (cm) laserske
zrake u uzorku kod odreñene valne duljine i duljine toplinske difuzije (µuz) uzorka. βopt je
optički apsorpcijski koeficijent, apsorbancija po jedinici duljine optičkog puta (cm-1):

βuz = ε c

gdje je ε molarni apsorpcijski koeficijent analita (dm3 mol-1 cm-1) a c molarna koncentracija
analita (mol dm-3). Takoñer, važan parametar u nastajanu OW signala je duljina toplinske
difuzije (µuz) koja ovisi o toplinskoj difuzivnosti α (cm2 s-1) i modulacijskoj frekvenciji fm
(Hz) (vidi dolje). Samo ona toplina koja se stvara u uzorku unutar sloja debelog poput jedne
duljine toplinske difuzije efikasno komunicira s diskom od safira i dovodi do stvaranja OW
signala. Ona ovisi o modulacijskoj frekvenciji. Niske modulacijske frekvencije prodiru dublje
i omogućuju ispitivanje dubljih slojeva uzorka, dok se površinski slojevi ispituju s visokim
frekvencijama. Uzorak koji ima fizičku debljinu Luz apsorbira periodički modulirano zračenje
te izaziva stvaranje topline u uzorku. Dubina optičkog prodora upadnog laserskog zračenja
inverzna je optičkom apsorpcijskom koeficijentu βuz. Opadanje stvorenog toplinskog vala koji
difundira kroz uzorak karakterizirano je, tzv., duljinom toplinske difuzije µuz. To je ustvari
udaljenost kroz koju amplituda toplinskog vala padne od svoje maksimalne vrijednosti do
vrijednosti 1/e. Za uzorak s toplinskom difuznosti αuz, duljina toplinske difuzije µuz ovisi
samo o modulacijskoj frekvenciji (fm) prema relaciji (8):

µuz = (αuz /πfm)1/2

Samo toplina koja je stvorena u sloju debljine µuz toplinski komunicira s detektorom.
Ako je ispunjen uvjet:

24
 µuz < Lopt (= 1/βuz) < Luz

OW signal korelira s količinom topline što je izravno proporcionalno energiji deponiranoj u

uzorku, a ovisno o koncentraciji analita. Dakle, sve dok vrijedi da je duljina toplinske difuzije
µuz manja od dubine optičke penetracije 1/β i fizičke debljine uzorka, signal je linearno
proprcionalan bezdimenzionalnom umnošku βµ.

Izmeñu uzorka i diska od safira potreban je dobar toplinski kontakt. Ako takav
kontakt nije ostvaren može doći do većih odstupanja signala i gubitka ispravnosti analize (3).

Optotermički signal normalizira se prema signalu crne tinte, kao jakog apsorbera
dobivenog pri istim eksperimentalnim uvjetima. S poznatim signalom uzorka Ss i signalom
crne tinte SI, računa se normalizirani signal S=Ss/SI. Pod gornjim uvjetom (µ <1/β < L) S ovisi
samo o umnošku βµ (8, 16) (pres. 2):

β ⋅µ
S=
(1 + β ⋅ µ )2 + 1
Kod viših vrijednosti umnoška βµ, S se zasićuje dok u detekciji tragova (βµ << 1) S teži
S = βµ/√2. Maksimalna osjetljivost postiže se za βµ = 1.

Invertiranjem gornje jednadžbe računa se vrijednost βµ:

2
β ⋅µ =
(2 S ) − 1 − 1
2

Nužno je baratati s βµ, a ne sa samim β kada se radi korelacija s koncentracijom

analita u uzorku (8). Jedino kada je eksplicitno poznata toplinska difuznost uzorka (što je
rijetko slučaj) moguće je računati µ kod date frekvencije prema relaciji sa str. 15.

S poznatim µ i s vrijednosti βµ dobivenom izravno iz normaliziranih optotermičkih

signala, moguće je korelirati β i koncentraciju likopena. Za uzorke proizvoda iz rajčice
nañena je duljina toplinske difuzije od ca 200 µm pri 25 Hz (6).

25
 Instrumentacija

H
G

F
E
D

A
B pumpa

Slika 1. OW ureñaj koji se sastoji od izvora zračenja, nekoliko ravnih zrcala, modulatora i
masivne platforme, sve na granitnoj podlozi: A - izvor zračenja: c.w. argon-ion laser, B - ravna zrcala,
C - rotirajući sektor, D - ravno zrcalo, E – nosač, F – štitnik u obliku rukava, G - polimerno kučište, H
- detektor snage (iz ref. 8). (pres. 2).

Slika 1 prikazuje Ar-laserski OW ureñaj (8). Izvor zračenja je c. w. Ar-ion laser (na
uzorak stiže 14 mW snage) [A] čiju zraku reflektiraju dva ravna zrcala [B], te ju mehanički
modulira (25 Hz) rotirajući sektor [C]. Kolimirana zraka prolazi kroz kružni otvor te dolazi na
ravno zrcalo [D] postavljeno pod kutem od 45o u polimernom kučištu [G]. OW jedinicu čini
prozirni safirni disk (debljina 300 µm, dijametar 14 mm), s piezoelektričnim anularnim
prstenom zalijepljenim za poleñinu. Cijelu jedinicu drži nosač [E] u kučištu [G]. Rukav [F]
štiti OW prozor od vanjskih utjecaja. Periodički modulirano zračenje ulazi u disk odozdo i
stiže u uzorak na njegovoj površini. Uzorak apsorbira zračenje koje prolazi kroz uzorak.
Stvorena toplina difundira natrag u safirni disk zbog čega on ekspandira u radijalnom smjeru.
Seriju takvih periodičkih ekspanzija/kontrakcija detektira piezoelektrični prsten koji stvara
napon (optotermički signal). Iznad prazne OW jedinice smješten je detektor snage [H].

26
 Relativno visoka cijena laserskog ureñaja i njegova veličina za sada ograničavaju
njegovu široku primjenu. Stoga je osmišljen ureñaj s OW koji kao emiter koristi LED («light
emitting diode») kao snažni, cjeloviti i jeftini izvor zračenja u odnosu na plinski laser (3).

Slika 2 prikazuje LED-OW ureñaj: LED kao izvor zračenja [A], leće [B], konveksnu
leću [C], optičko vlakno [E] (vidi umetak u slici 2), pomične vijke [F, G i H], mikrometar [I]
koji rotira ploču [D] (3).

Slika 2. LED-OW ureñaj. A – LED, izvor zračenja, B – leće, C - konveksna leća, E - optičko
vlakno (vidi umetak), F, G i H - pomični vijci, I - mikrometar koji rotira ploču D, K - prsten iz
piezoelektričnog materijala zalijepljen za poleñinu OW senzora, J – konus iz pleksiglasa, L, M -
prozor od safira s uzorkom, N – zaštitni cilindar postavljen koaksijalno sa safirnim diskom (iz ref. 3).
(pres. 2)

I ovdje je OW senzor disk od safira (debljina 300 µm, dijametar 16 mm) s prstenom [K]
iz piezoelektričnog materijala zalijepljenog za poleñinu diska. Optičko vlakno [E] prenosi
LED zračenje na OW senzor. Zato je kraj vlakna utisnut u dno čepa od pleksiglasa [J] koji
ispunjava prostor izmeñu safirnog diska i prstena [K]. Zračenje iz LED-a prolazi odozdo kroz

27
prozirni safirni disk prije nego što uñe u uzorak. Od početnih 70 mW koje LED emitira, u
uzorak ulazi 1,8 mW. Nañena je dobra stabilnost LED-a s «driftom» manjim od 0,3%.

Homogenizirani uzorak, npr., proizvoda iz rajčice stavlja se na površinu prozora od

safira [L, M] da se pokrije ozračena regija (dijametar 5 mm). Dovoljna količina je oko 2 cm3.
Zbog utjecaja vanjskih vibracija uzorak je potrebno zaštititi cilindrom (dug 150 mm,
dijametar 3 cm) [N] postavljenim koaksijalno sa safirnim diskom. Signal ide u pojačalo.

Shematski prikaz OW ureñaja dat je na slici 3.

Referentni signal
Pojačalo
(„lock-in“)
OW signal

Uzorak
Prozorčić
od safira

PZT
Dijafragma

„Chopper“
Obrada
podataka na
računalu
Laser

Slika 3. Shematski prikaz OW ureñaja. Periodički modulirana laserska zraka prolazi kroz iris
dijafragmu i prozirni disk od safira prije nego ju apsorbira uzorak. Stvaranje topline u uzorku izaziva
ekspanziju prozorčića pa se takva mehanička deformacija može mjeriti piezoelektričnim senzorom
načinjenim iz Pb Zr titanata (PZT) (prema ref. 12). (pres 2)

Analitička primjena

OW je uspješno primijenjen u analizama karotenoida, poglavito likopena u

komercijalnim proizvodima iz rajčice (3, 6, 8) i u homogenatima iz svježe rajčice (4).
Odreñivanje likopena u uzorcima iz rajčice radi se pri 502 nm jer je to selektivna i osjetljiva
analitička linija za likopen. Za mjerenje likopena pri 502 nm koristi se c. w. Ar-ion laser;
snaga koja dolazi na uzorak iznosi 6-17 mW (6, 8, 4). Takoñer, koristi se LED koji emitira
izmeñu 470 i 530 nm uz maksimum pri 505 nm, dakle blizu analitičke linije likopena od 502
nm (3).

28
 Mjerenja velikog broja sukcesivnih amplituda signala na jednom alikvotu uzorka daju
preciznost instrumenta (intrinsička preciznost) (npr., 18 amplituda unutar 20 s, ili 150 u 30 s,
ili čak 500 u 300 s). Nakon, npr., 30 sekundi ovaj se postupak ponavlja (npr., 3 puta) i dobiva
srednja vrijednost signala za prvi alikvot uzorka. Nakon što se prvi alikvot uzorka makne,
safirni disk se očisti i stavi novi alikvot istog uzorka te gornji postupak ponavlja nekoliko
puta da bi se dobili rezultati ponovljenih analiza na temelju kojih se računa preciznost OW
analiza jednog uzorka. Za uzorke rajčice intrinsička RSD bila je bolja od 0,1 (8) do 0,2% (6).
Preciznost LED-OW instrumenta iznosila je 0,5-7%, a za uzorke s ≥400 mg likopena kg-1 čak
≤2% (3).

Ponovljivost OW odreñivanja likopena u proizvodima iz rajčice iznosila je 0,4-10%

uz Ar-ion laser (8) odnosno 0,5-7% uz LED (3).

OW se pokazao jednostavnom, selektivnom i preciznom (preciznost usporedljiva sa

spektrofotometrijom) analitičkom metodom u analizi karotenoida u kompleksnim uzorcima.
Najveća mu je prednost da se uzorci analiziraju izravno bez ikakve predobradbe. Npr., u
komercijalnim proizvodima iz rajčice odreñen je likopen u koncentraciji od 100 do 700
mg kg-1 i dobivene su odlične linearne korelacije s rezultatima klasičnih analitičkih metoda
(spektrofotometrija, HPLC) (npr., ref. 1, 3, 6, 8). Slika 4 ilustrira radni stol s OW aparaturom
za ispitivanja pirea iz rajčice.

OW je potencijalno primjenljiv i za mjerenje likopena i β-karotena u svježem voću i

povrću, npr., mangu, lubenici, guavi, crvenom grapefruit-u, papaji, svježoj rajčici. Tako je u
homogenatu manga (5) moguće detektirati samo 3 mg kg-1 β-karotena, a u homogenatima
lubenice (11) i svježe rajčice (4) 9 odnosno 25 mg kg-1 likopena.

Mjerenja ukupnih karotena u margarinima (14) rañena su primjenom c. w. Ar-ion

lasera pri 488 nm (30 mW). Pokazalo se da normalizacija signala značajno doprinosi
proširivanju linearnog koncentracijskog područja. Ipak, OW (za razliku od PAS) nije
dovoljno osjetljiv za detekciju ukupnih karotena u tipičnim margarinima već tek u
obogaćenim uzorcima.

Nedavno je OW sustav predložen i u analizi homogenata ploda višnje; primjenom

zelenog laserskog pokazivača pri 532 nm bilo je moguće dokazati 8 mg kg-1 ukupnih
antocijana uz ponovljivost mjerenja od 1-3%. (12). Nepreciznost instrumenta kretala se
izmeñu 1 i 8% (2% u prosjeku).

29
 Preliminarna mjerenja ukazuju i na mogućnost primjene OW u analizi ukupnih
karotenoida i klorofila u algama.

Slika 4. Pogled na radni stol s OW aparaturom u koju se smješta senzor (lijevo); OW aparatura za
ispitivanja pirea iz rajčice (desno). (pres 2)

12
 Literatura

1. D. Bicanic, M. Anese, S. Luterotti, D. Dadarlat, J. Gibkes, M. Lubbers, Rapid, accurate and direct
determination of total lycopene content in tomasto paste, Rev. Sci. Instrum. 74 (2003) 687-689.

2. D. Bicanic, M. Chirtoc, I. Chirtoc, J. P. Favier, P. Helander, Photothermal determination of

absorption coefficients in optically dense fluids - application to oleic acid and water at CO laser
wavelengths, Appl. Spectrosc. 49 (1995) 1485-1489.

3. D. Bicanic, R. Cuypers, S. Luterotti, M. Šporec, A. Zoppi, J. Vugec, Practical, reliable and

inexpensive assay of lycopene in tomato products based on the combined use of light emitting
diode (LED) and the optothermal window, Acta Chim. Slov. 55 (2008) 468-473.

4. D. Bicanic, D. Dimitrovski, S. Luterotti, K. Marković, C. van Twisk, J. G. Buijnsters, O. Dóka,

Correlation of trans-lycopene measurements by the HPLC method with the optothermal and
photoacoustic signals and the color readings of fresh tomato homogenates, Food Biophys. 5
(2010) 24-33.

5. D. Bicanic, D. Dimitrovski, S. Luterotti, C. van Twisk, J. G. Buijnsters, O. Dóka, Estimating

rapidly and precisely the concentration of beta carotene in mango homogenates by measuring the
amplitude of optothermal signals, chromaticity indices and the intensities of Raman peaks, Food
Chem. 121 (2010) 832-838.

6. D. Bicanic, V. Fogliano, S. Luterotti, J. Swarts, G. Piani, G. Graziani, Quantification of lycopene

in tomato products: comparing the performances of a newly proposed direct photothermal method
and high-performance chromatography, J. Sci. Food Agric. 85 (2005) 1149-1153.

7. D. Bicanic, C. Neamtu, M. Manojlovic, D. van der Linden, D. Dadarlat, K. Posavec, A.

Gijsbertsen, Z. Kurtanjek, Tomato pastes and their moisture content as determined via the
measurements of thermal effusivity by means of infrared photothermal radiometry and inverse
photopyroelectric technique. Acta Chim. Slov. 51 (2004) 39-46.

8. D. Bicanic, J. Swarts, S. Luterotti, G. Pietraperzia, O. Dόka, H. de Rooij, Direct quantification of

lycopene in products derived from thermally processed tomatoes: Optothermal window as a
selective, sensitive, amd accurate analytical method without the need for preparatory steps, Anal.
Chem.76 (2004) 5203-5207.

9. D. Dadarlat, C. Neamtu, E. Surducan, A. Hadj-Sahraoui, S. Longuemart, D. Bicanic, Accurate

photopyroelectric measurements of thermal diffusivity of (semi)liquids, Instrum. Sci. Technol. 30
(2002) 387-396.

21
10. M. Defernez, H. S. Tapp, E. K. Kemsley, R. H. Wilson, Optothermal (OT) spectroscopy: A
photoacoustic technique, Am. Lab. 34 (2002) 34-38.

11. D. Dimitrovski, D. Bicanic, S. Luterotti, C. van Twisk, J. G. Buijnsters, O. Dóka, The

concentration of trans-lycopene in postharvest watermelon: An evaluation of analytical data
obtained by direct methods, Postharv. Biol. Technol. 58 (2010) 21-28.

12. O. Dóka, G. Ficzek, D. Bicanic, R. Spruijt, S. Luterotti, M. Tóth, J. G. Buijnsters, Gy. Végvári,
Direct photothermal techniques for rapid quantification of total anthocyanin content in sour
cherry cultivars, Talanta 84 (2011) 341-346.

13. P. Helander, Practical aspects on measuring refractive index profiles of non-circular fibreoptic
preforms, Meas. Sci. Technol. 16 (2005) 828-832.

14. S. Luterotti, D. Bicanic, K. Jandragić, Photoacoustic spectroscopy and optothermal window as

analytical tools to quantitate carotenes in margarines, Food Chem. 108 (2008) 316-321.

15. D. H. McQueen, R. Wilson, A. Kinnunen, Near and mid-infrared photoacoustic analysis of

principal components of foodstuffs, TRAC-Trends Anal. Chem. 141 (1995) 482-492.

16. P. Poulet, J. Chambron, R. Unterreiner, Quantitative photoacoustic spectroscopy applied to

thermally thick samples. J. Appl. Phys. 51 (1980) 1738-1742.

20
 SPEKTROMETRIJA TERMIČKE LEĆE (TLS)

Princip

Fototermički fenomeni, uključujući i termičku leću (TL), temelje se na porastu

temperature u ozračenom uzorku. Spektrometrija termičke leće ("thermal lens spectrometry",
TLS) temelji se na neizravnom mjerenju apsorbancije kroz efekt termičke leće. Ovaj efekt je
posljedica oslobañanja topline u ozračenom uzorku, kao oblika relaksacije apsorbirane
energije bez zračenja (2, 4, 8, 9, 16). Kod efekta termičke leće, radijalno simetrična Gaussova
razdioba intenziteta laserske zrake stvara toplinu koja je najjača u centru zrake jer je tu
intenzitet zrake najveći. Zbog temperaturnog gradijenta koji nastaje izmeñu središta zrake i
ostatka materijala, unutar ozračenog uzorka stvara se element poput leće kao posljedica
promjene gradijenta indeksa loma i promjene karakterističnog profila mjerne laserske zrake.
Ovaj efekt vidljiv je i za laserske zrake snage u mW i u uzorcima koji su prozirni pa je TL
pogodna za mjerenja niskih apsorpcija u uzorcima koji ne fluoresciraju. Osjetljivost ove
tehnike veća je od konvencionalne transmisijske ili refleksijske spektroskopije jer se ovdje
apsorbirana energija mjeri izravno. Novi TL instrumenti posebno su pogodni za mikrolitarske
volumene i uzorke niskih koncentracija i apsorbancija, čak do 10-7, npr. uzorke koji su
eluirani s kolone HPLC-a ili kapilare u elektroforezi.

Nastajanje temperaturnog gradijenta, odnosno temperaturna distribucija koja ovisi o

vremenu unutar ozračenog uzorka, zajednička je za sve fototermičke tehnike. Zbog toga što
se stvara radijalna temperaturna distribucija koja nije uniformna, unutar uzorka se stvara
gradijent indeksa loma koji ovisi o vremenu (pres. 3):

n(x,y,t) = n0 + (δn/δT)TA T(x,y,t)

gdje je n0 - neperturbirani indeks loma pri temperaturi okoline, TA; δn/δT - temperaturni
koeficijent indeksa loma uzorka; T(x,y,t) – temperaturna distribucija, t - vrijeme.

Kao posljedica toga ozračeni se uzorak ponaša poput leće, te utječe na profil intenziteta
laserske zrake tako što mijenja njezin radijus, w. Promjene u intenzitetu zrake koje su
proporcionalne promjenama snage zrake kojom ona stiže na detektor izravna, su mjera snage
termičke leće.

21
 Signal termičke leće, s(t), za lasersku zraku s Gaussovim profilom obično se mjeri kao
relativna promjena intenziteta u centru mjerne zrake i iskazuje kao:

s(t) = [w22(t) - w22(0)]/ w22(0) = -2zl/f(t)

gdje je w2(0) radijus neperturbirane zrake na detektoru, w2(t) je radijus zrake perturbirane od
strane termičke leće koji ovisi o vremenu, zl je udaljenost izmeñu “struka” mjerne zrake i
uzorka, dok je f(t) žarišna daljina termičke leće.

Kada se računa žarišna daljina termičke leće, koja je potrebna za procjenu snage
termičke leće, potrebno je uzeti u obzir različite moguće geometrijske konfiguracije
ekscitacijske zrake i mjerne zrake. Najčešće se koriste kolinearna i transverzalna
(ortogonalna) konfiguracija. Kolinearna konfiguracija, u načelu osigurava veću osjetljivost.
Signal termičke leće linearno je ovisan o energiji pulzirajućeg lasera ili snazi c. w. lasera koji
se koristi za ekscitaciju. On je takoñer jako ovisan o veličini ekscitirajuće zrake. Zbog toga se
za ekscitaciju preferiraju strogo fokusirane laserske zrake velike snage ili energije. Efekt
termičke leće takoñer ovisi o termo-optičkim svojstvima uzorka. Otapala koja imaju relativno
nisku termičku vodljivost i relativno visoki temperaturni koeficijent indeksa loma su pogodna
za mjerenja termičkom lećom.

Visoka osjetljivost TLS tehnike proizlazi iz ovisnosti TLS signala (∆I/I) o snazi
ekscitacijskog lasera (P) (4):

∆I/I = 2,303AP (-δn/δT)/λ k

ili

∆I/I = 2,303AE

gdje je:

E = P(-δn/dT)/λ k

E – faktor povećanja osjetljivosti u odnosu na konvencionalna transmisijska mjerenja, λ -

valna duljina ispitnog lasera, A - apsorbancija, k - toplinska vodljivost uzorka. E se dade
izračunati iz termo-optičkih parametara, δn/δT i k.

Relativna promjena u intenzitetu lasera na osi zrake je izravna mjera jačine termičke
leće koja je proporcionalna asporbanciji uzorka. Mjerenja apsorbancije termičkom lećom daju
puno veću osjetljivost i niže DL vrijednosti od konvencionalne spektrometrije.

22
Instrumentacija

Temelji TLS instrumentacije opisani su u ref. 8. Kod instrumenata s dvostrukom

zrakom nastajanje i detekcija termičke leće se postižu odvojeno moduliranom ekscitacijskom
zrakom i nemoduliranom mjernom zrakom. Kao izvor ekscitacijske zrake obično služi c. w.
laser ili pulzirajući laser dok se mjerna zraka obično dobiva iz relativno slabijeg c. w. lasera.
Korišenjem odvojenih leća kojima se ekscitacijska zraka fokusira izravno na uzorak te
mimoilaze „strukovi“ ekscitacijske i mjerne zrake, može se postići najveća snaga termičke
leće. Dobro prostorno preklapanje obiju zraka unutar uzorka potrebno je za optimalnu
osjetljivost. Podešavanje i kombiniranje zraka olakšava se npr. sustavom cijepanja zrake ili
dikroičnim zrcalom. Nastala termička leća dovodi do promjena u intenzitetu mjerne zrake, što
se može osjetljivo pratiti ureñajima poput faznog pojačala koje daje srednju vrijednost
signala, uz uvjet da je ekscitacijska zraka profiltrirana prije nego što je stigla na detektor.
Intenziteti signala u eksperimentima s termičkom lećom s dvostrukom zrakom, obično se
dobivaju iz razlike izmeñu intenziteta centra mjerne zrake na početku i na kraju laserske
ekscitacije [∆I = I(0) - I(t)].

Shema eksperimentalnog sustava za mjerenje karotenoida HPLC-TLS sustavom

prikazana je na slici 1.

Analitička primjena

Spektrometrija termičke leće je jedan od laserskih fototermičkih detekcijskih sustava

koji je uspješno primijenjen u analizi okoliša (4, 7, 16, 17), analizi teških metala (18-21) i
biomedicinskim istraživanjima (22), npr., analizi humane plazme (6) ili životinjske jetre (15),
te hrane (4, 12-14) i dodataka prehrani (11). TLS uspješno se koristi kao detekcijski sustav u
sprezi s protočnom analizom ("flow injection analysis" - FIA), HPLC, ionskom
kromatografijom, kapilarnom elektroforezom ("capillary electrophoresis" - CE) (3).

Vezani sustav HPLC-TLS opisan je u ref. 1, 3, 6, 8, 21. TLS detektor omogućio je

vrlo osjetljivo dokazivanje karotenoida u različitim kompleksnim uzorcima (1, 10). HPLC-
TLS instrument korišten za analize karotenoida konstruiran je u laboratoriju. TLS
spektrometar za detekciju karotenoida nakon HPLC uključuje Ar-ion laser (476,5 nm, 60
mW), kao izvor za ekscitaciju i He-Ne laser (632,8 nm, 7-20 mW) kao mjerni laser.
Mehanički rotirajući sektor modulirao je ekscitacijsku zraku pri frekvenciji od 40 Hz koja je
fokusirana na ćeliju s uzorkom. Promjene intenziteta mjerne zrake mjere se fotodiodom i
faznim pojačalom uz odgovarajuće vrijeme integracije (npr., 1-3 s). Opisani sustav

23
primijenjen je za detekciju nakon HPLC separacije karotenoida u uljima, ribljim i
vegetabilnim (11-13), ekstraktima životinjske jetre (15) te ekstraktima iz pirea od rajčice (14).

TLS je korisna i za odreñivanje trans izomera u uljima i mastima. IR-TLS s dvije

zrake uspješno je primijenjena za mjerenje trans nezasićenih masnih kiselina u margarinima
otopljenim u CS2 pri apsorpcijskoj liniji kod 965 cm-1 (5). Korišten je CO2 laser te je LOD
spušten za dva reda veličine (tj. na 0,002%), u odnosu na konvencionalnu IR spektroskopiju.

protočna kiveta
ekscitacijski laser
(Ar-ion)
filter

fotodioda
mjerni laser (He-Ne)

uzorak pumpa C18 kolona

TLS signal

Slika 1. Spregnuti sustav HPLC-TLS za mjerenje karotenoida. (pres. 3)

24
 Literatura

1. A. Chartier, J. Georges, Liquid chromatographic determination of carotenoids using dual-beam

continuous-wave laser thermal lens detection, Anal. Chim. Acta 284 (1993) 311-316.

2. H. L. Fang, R. L. Swofford, The thermal lens in absorption spectroscopy, u: Ultrasensitive Laser

Spectroscopy (ur. D. S. Kliger), Academic Press, New York 1983, str. 176-232.

3. M. Franko, Thermal lens spectrometric detection in flow injection analysis and separation
techniques, Appl. Spectr. Rev. 43 (2008) 358-388.

4. M. Franko, Recent applications of thermal lens spectrometry in food analysis and environmental
research, Talanta 54 (2001) 1-13.

5. M. Franko, D. Bicanic, P. van de Bovenkamp, Dual beam infrared thermal lens spectrometry at 965
cm-1 absorption band as a mesure of conjugated trans fatty acids content in margarine samples, J.
Phys. IV 4 (1994) C7-479-C7-482.

6. M. Franko, P. van Bovenkamp, D. Bicanic, Determination of trans-β-carotene and other

carotenoids in blood plasma using high-performance liquid chromatography and thermal lens
detection, J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 718 (1998) 47-54.

7. M. Franko, M. Šikovec, J. Kožar-Logar, D. Bicanic, Thermal lens spectrometry in food analysis

and environmental research, Anal. Sci. 17 (2001) s515-s518.

8. M. Franko, C. D. Tran, Analytical thermal lens instrumentation, Rev. Sci. Instrum. 67 (1996) 1-18.

9. J. Georges, Advantages and limitations of thermal lens spectrometry over conventional

spectrophotometry for absorbance measurements, Talanta 48 (1999) 501-509.

10. J. Kožar Logar, M. Šikovec, A. Malej, M. Franko, The effects of eluent mixing on TLS detection in
gradient elution HPLC, Anal. Bioanal. Chem. 374 (2002) 323-328.

11. S. Luterotti, M. Franko, D. Bicanic, Ultrasensitive determination of β-carotene in fish oil-based

supplementary drugs by HPLC-TLS, J. Pharm. Biomed. Anal. 21 (1999) 901-909.

12. S. Luterotti, M. Franko, D. Bicanic, Fast quality screening of vegetable oils by HPLC-thermal lens
spectrometric detection, JAOCS 79 (2002) 1027-1031.

13. S. Luterotti, M. Franko, M. Šikovec, D. Bicanic, Ultrasensitive assays of trans- and cis-β-carotenes
in vegetable oils by high-performance liquid chromatography-thermal lens detection, Anal. Chim.
Acta 460 (2002) 193-200.

14. S. Luterotti, K. Marković, M. Franko, D. Bicanic, N. Vahčić, O. Doka, Ultratraces of carotenes in

tomato purées: HPLC-TLS study, Rev. Sci. Instrum. 74 (2003) 684-686.

25
15. S. Luterotti, M. Sikovec, D. Bicanic, Ultrasensitive determination of trans-β-carotene in rat and
beef livers by means of high-performance liquid chromatography coupled with thermal lens
detection, Talanta 53 (2000) 103-113.

16. R. D. Snook, R. D. Lowe, Thermal lens spectrometry: a review, Analyst 120 (1995) 2051-2068.

17. E. Strauss, J.-P. Favier, D. Bicanic, K. van Asselt, M. Lubbers, Sensitive colorimetric analysis of
ammonium ion in water by laser photothermal detection, Analyst 116 (1991) 77-79.

18. M. Šikovec, M. Franko, F. G. Cruz, S. A. Katz, Thermal lens spectrometric determination of

hexavalent chromium, Anal. Chim. Acta 330 (1996) 245-250.

19. M. Šikovec, Mi. Novič, M. Franko, Application of thermal lens spectrometric detection to the
determination of heavy metals by ion chromatography, J. Chromatogr. A 739 (1996) 111-117.

20. M. Šikovec, Mi. Novič, M. Franko, Determination of hexavalent chromium in drinking water by
thermal lens spectrometry, Ann. Chim. 90 (2000) 163-168.

21. M. Šikovec, Mi. Novič, V. Hudnik, M. Franko, On-line thermal lens spectrometric detection of
Cr(III) and Cr(VI) after separation by ion chromatography J. Chromatogr. A 706 (1995) 121-126.

22. R. M. Villanueva Camañas, J. M. Sanchis Mallols, E. F. Simó Alfonso, G. Ramis Ramos, Thermal
lens spectrometric detection of catecholamines after oxidation to aminochromes, Anal. Lett. 25
(1992) 1425-1445.

26
 OPTOTERMISTOR

Princip
“Optotermistor” je novi detektor koji se sastoji iz tankog diska od safira (proziran,
velike toplinske vodljivosti, dobrih optičkih, mehaničkih i kemijskih svojstava; dijametar 5
mm, debljina 130 µm, zaštićen od refleksija osim centralnog dijela dijametra 1,5 mm) i
termistora u obliku prstena (dijametar 2,57 mm, debljina 13 µm s tankim 13-µm metalnim
slojevima na svakoj strani) [Termistor je tip otpornika čiji se otpor mijenja s temperaturom:
∆R = k∆T , ∆R – promjena otpora, ∆T – promjena temperature, k - temperaturni koeficijent
otpora prvog reda.] On ima negativni temperaturni koeficijent (NTC) (3). Za razliku od
mikrofona i piezoelektričnog kristala koji se često koriste kao pretvarači u fotoakustičkim i
optotermičkim detektorima, optotermistor je neosjetljiv na vanjske vibracije pa ga se može
koristiti u bučnoj okolini.

Instrumentacija

Uzorak koji sadrži likopen stavlja se na safirni disk te apsorbira periodički modulirano
zračenje što stvara toplinu i toplinske valove (polje temperaturne raspodjele). Takve
periodičke oscilacije temperature (porast/pad) u uzorku detektiraju se optotermistorom i
prevode u napon (PT signal). Slika 1 (1) prikazuje ureñaj konstruiran u laboratoriju. Zračenje
koje emitira halogena lampa od 20 W [A] elektronički se modulira pri 8,3 Hz. Filter od
obojenog stakla (središnja valna duljina pri 500 nm blizu je one od 502 nm koja je jedan od
λmax likopena, širina linije 40 nm) [B] filtrira zračenje prije nego je ono fokusirano lećama
[C] na polimerno optičko vlakno dijametra 1 mm [E]. Sustav za cijepanje zrake [G]
usmjerava frakciju emitiranog svjetla na fotodiodu [D]. Drugi kraj optičkog vlakna i safirni
disk čine cjelinu [F]; vlakno je izravno utisnuto u stražnju površinu diska. Termistor je
pričvršćen na stražnju stranu safirnog diska. Slika 2 (1) prikazuje transverzalni presjek
optotermistora: safirni disk, NTC i optičko vlakno, sve integrirano u jednoj cjelini.

27
 F

G
C
B

Slika 1. Ureñaj za kvantitaciju likopena u proizvodima iz rajčice: [A] - halogena lampa, [B] -
filtar, [C] - konvergentne leće, [D] - fotodioda, [E] - optičko vlakno, [F] - dio koji nosi
optotermistor, [G] – sustav za cijepanje zrake (iz ref. 1). (pres. 4)

Za reproducibilna mjerenja važan je termički kontakt izmeñu uzorka i safirnog diska.

Nadalje, eskperimentalna geometrija, modulacijska frekvencija i stvarna snaga koja ulazi u
uzorak moraju biti isti za sve uzorke. Takoñer, važna je homogenizacija uzorka jer prisutnost
mjehurića zraka i nehomogenosti u uzorku mogu kroz unutarnje refleksije utjecati na prijenos
topline.

28
 uzorak

uzorak
debljina
safir 130 um
metal 1 13 um
NTC 14 um
metal 2 13 um

optičko vlakno
optičko vlakno

Slika 2. Uvećani prikaz (lijevo) i transverzalni presjek (desno) optotermistora. Strelica

označava smjer ulaznog (filtriranog) zračenja (prema ref. 1). (pres. 4)

Analitička primjena
Malo uzorka, manje od 0,2 cm3, stavlja se na očišćenu gornju površinu safirnog
diska. Zračenje iz halogene lampe prolazi kroz optičko vlakno, prolazi (odozdo) kroz safirni
disk gotovo bez gubitaka (safir je pri ovim valnim duljinama praktički proziran) i konačno
ulazi u uzorak (npr, proizvod iz rajčice). Količina uzorka je nevažna sve dok uzorak pokriva
centralni dio safirnog diska osvijetljenog zrakom svjetla (2). Toplina razvijena u uzorku
difundira iz grijane točke kroz safirni disk u termistor. Udaljenost kroz koju difundira toplina
mora biti usporedljiva s dijametrom upadne zrake. To zahtijeva da osvijetlena površina bude
mala, da je modulacijska frekvencija niska i da je duljina toplinske difuzije [µ=(α/πfm)1/2] u
safirnom disku velika (α - termička difuzivnost, fm - modulacijska frekvencija). Kod
modulacijske frekvencije od 8,3 Hz duljina toplinske difuzije u safiru je 706 µm što je
usporedljivo s udaljenošću izmeñu grijane točke i termistora. Periodičke varijacije
temperature detektiraju se termistorom izvan ozračene regije i pretvaraju u PT signal. Uz datu
modulacijsku frekvenciju PT signal izravno je proporcionalan bezdimenzionalnom umnošku
βµ (β - apsorpcija kromofora po jedinici duljine kod date λ, on je umnožak molarne
apsorptivnosti ε i koncentracije kromofora). Dobiveni PT signali se normaliziraju dijeljenjem
sa signalom dobivenim za crnu tintu (uzorak koji jako apsorbira) pod istim uvjetima (4).

29
 Uzorak se ozrači 20 sekundi frekvencijom od 8,3 Hz. S obzirom na to da je neko
vrijeme potrebno za postizanje ravnoteže podaci dobiveni u prvih 5 s se odbacuju i
registriraju oni u daljnjih 15 s te računa računa prosjek, i βµ. Nakon 30 s postupak se ponavlja
(npr. 5 puta). Zatim se uzorak uklanja, disk očisti pamučnim štapićem navlaženim vodom i
alkoholom. Tada se aplicira svježa količina istog uzorka i postupak ponavlja nekoliko puta.
Time se dobiva nekoliko rezultata neovisnih analiza.

Optotermistor omogućava selektivno, osjetljivo i jednostavno (bez predobradbe)

odreñivanje likopena u proizvodima iz paradajza. Mjerenja je moguće provesti pri
koncentracijama ispod 10 mg likopena/100 g uzorka (<100 ppm). Preciznost mjerenja bila je
bolja od 1%.

30
 Literatura

1. D. Bicanic, J. Swarts, S. Luterotti, P. Helander, V. Fogliano, M. Anese, Optothermistor as a

breakthrough in the quantitation of lycopene content of thermally processed tomato-based foods:
Verification versus absorption spectrophotometry and high-performance liquid chromatography, J.
Agric. Food Chem. 53 (2005) 3295-3299.

2. D. Bicanic, J. Swarts, S. Luterotti, G. Pietraperza, O. Dóka, H. De Rooij, Direct quantification of

lycopene in products derived from thermally processed tomatoes: Optothermal window as a
selective, sensitive and accurate analytical method without the need for preparatory steps, Anal.
Chem. 76 (2004) 5203-5207.

3. P. Helander, Simple and reliable optothermal sensor, u Photoacoustic and Photothermal

Phenomena III (Springer Series in Optical Sciences 69, ur. D. Bicanic), Springer-Verlag, Berlin
1992, pp. 562-564.

4 P. Helander, A method for the analysis of the optothermal and photoacoustic signals, Meas. Sci.
Technol. 4 (1993) 178-185.

31
AUTORI VAM SE ZAHVALJUJU

NA PAŽNJI!

32
A
D
E
F
G
H
B

23