INVESTIGACION ORIGINAL

publicado: 25 de Enero 2017 doi:

10.3389 / fmicb.2017.00040

Análisis Metatranscriptomic revela inesperadamente

Diverse microbiana Metabolismo en un punto
caliente biogeoquímicos en un acuífero aluvial

Talia NM Jewell, Ulas Karaoz, Markus Bill, Romy Chakraborty, Eoin L. Brodie, Kenneth H. Williams y Harry R.
Beller *

Tierra y Ciencias del Ambiente, Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley, Berkeley, CA, EE.UU.

depósitos de materia orgánica en los acuíferos aluviales han demostrado resultar en la formación de zonas reducidas de

forma natural (NRZs), que pueden modular el estado de acuífero redox y influir en la especiación y la movilidad de los

metales, que afecta a la geoquímica de las aguas subterráneas. En este estudio, hemos tratado de comprender mejor cómo

los combustibles de materia orgánica comunidades microbianas naturales dentro de los puntos calientes (anóxicas

biogeoquímicos NRZs) en un acuífero shallowalluvial en el lugar de rifle (CO). Hemos llevado a cabo un experimento de

microcosmos 20 días en el que los sedimentos NRZ, que fueron enriquecidos en material de planta leñosa enterrado,

sirvieron como la única fuente de donantes de electrones y microorganismos. Los microcosmos se construyeron y se
Editado por:
incubaron en condiciones anaerobias en botellas de suero con una inicial N 2 espacio de cabeza y se tomaron muestras cada
David Emerson,
Laboratorio Bigelow para Ocean
5 días para metagenoma y metatranscriptome pro fi les en combinación con mediciones biogeoquímicos. datos
Sciences, EE.UU. biogeoquímicos indicaron que la descomposición de la materia orgánica nativa produjo en diferentes fases, comenzando con
Revisado por: mineralización de la materia orgánica disuelta (DOM) a CO 2 durante la primera semana de incubación, seguido por un pulso
Mustafa Yucel,
de acetogénesis que dominó de carbono de reflujo después de 2 semanas. Un pulso de la metanogénesis co-produjo con
Universidad Tecnica del Medio Este,
pavo acetogénesis, pero sólo representaba una pequeña fracción de carbono fl ux. El agotamiento de DOM en el tiempo se
Anirban Chakraborty,
correlaciona fuertemente con aumentos en la expresión de muchos genes asociados con heterotrofía (por ejemplo, ácido
Universidad de Calgary, Canadá
amino, ácido graso, y el metabolismo de hidratos de carbono) que pertenecen a una Hydrogenophaga cepa que representó
* Correspondencia:

Harry R. Beller un porcentaje relativamente grande ( ~ 8%) del metatranscriptome. Esta Hydrogenophaga cepa también expresado genes
hrbeller@lbl.gov indicativos de chemolithoautotrophy, incluyendo CO 2 fi jación, H 2

sección de la especialidad:

Este artículo fue sometido a

microbiológica y química
Geomicrobiología, una
oxidación, la oxidación del compuesto S, y fi cación denitri. El pulso de la acetogénesis parece haber sido catalizada
sección de la revista Frontiers in
Microbiology colectivamente por una serie de diferentes organismos y metabolismos, lo más prominente piruvato: ferredoxina

Recibido: 09 de octubre de el año 2016

oxidorreductasa. genes inesperados Se identificaron entre los transcritos más altamente expresado (> percentil 98),
Aceptado: 06 de enero de 2017 incluyendo carboxilasa acetona y la pared celular asociada hidrolasas con sustratos desconocidos (peptidoglicano
Publicado: 25 de de enero de 2017
numerosos hidrolasas asociados-pared celular menor expresadas dirigido). Muchas de las hidrolasas más altamente
Citación:
expresados ​pertenecían a una California. cepa Bathyarchaeota y puede haber sido asociado con el reciclado de la
Jewell TNM, Karaoz T, Bill M,
Chakraborty R, Brodie EL, Williams biomasa bacteriana. En general, estos resultados ponen de manifiesto la complejidad de la transformación de la materia
KH y Beller HR (2017) Análisis
orgánica en NRZs y las vías metabólicas microbianas que interactúan para mediar en el estado redox y el ciclismo
Metatranscriptomic revela
Inesperadamente Diverse microbiana
elemental.
Metabolismo en un Biogeoquímico caliente

Lugar en un acuífero aluvial.

Frente. Microbiol. 08:40. doi: Palabras clave: cepa resuelta metatranscriptome, metagenoma, acuífero, reducido naturalmente zona (NRZ),

10.3389 / fmicb.2017.00040 Hydrogenophaga, Bathyarchaeota, biogeoquímica

Frontiers in Microbiology | www.frontiersin.org 1 De enero de 2017 | Volumen 8 | artículo 40

Jewell et al.
INTRODUCCIÓN
acuíferos poco profundos se caracterizan a menudo como ambientes oligotróficos en el
que un estilo de vida microbiana heterotrófica es apoyado por la materia orgánica
allochthonous derivado de superficie ( Ghiorse y Wilson, 1988 ), Al menos en acuíferos
que no están sujetos a la contaminación del subsuelo antropogénico. Una excepción a
la generalización de los acuíferos como oligotrófica es la aparición de orgánico-ricos,
zonas reducidas de forma natural (NRZs) en acuíferos aluviales, que han sido bien
documentados en aguas poco profundas, acuíferos aluviales de la cuenca del río
Colorado, en particular en el Departamento de Energía de EE.UU. sitio de estudio en Ri
fl e, CO (por ejemplo,
Blazejewski et al., 2009; Campbell et al, 2012.; Janot et al, 2015.; Wainwright et al., 2016 ).
Tales NRZs son de particular interés debido a que representan puntos calientes
biogeoquímicos que mantienen subóxicas condiciones persistentes / anóxicas que
pueden mediar sustancialmente la especiación y la movilidad de los metales y por lo tanto
en fl geoquímica influencia del agua subterránea ( Campbell et al, 2012.; Janot et al., 2015 ).
NRZs en el sitio fl e Ri se caracterizan por condiciones perennemente reducidos,
de grano fino sedimento del acuífero, y enriquecimiento relativo de la materia orgánica
(con prominente material de planta leñosa) y hierro sulfuro de minerales (tales como la
pirita framboidal y mackinawita) (por ejemplo, Qafoku et al., 2009; Campbell et al,
2012.; Janot et al., 2015 ). NRZs se distribuyen heterogéneamente en todo el Ri fl e
acuífero y se estima que constituyen el 10% del volumen de acuífero ( Qafoku et al.,
2009 ). Se ha propuesto que NRZs en el sitio fl e Ri, que se encuentra en una llanura de
fl adyacente al río Colorado, se formaron los horizontes del suelo de ribera tan
profundamente enterrados ( Janot et al., 2015 ). La materia orgánica enterrada (por
ejemplo, resistido biomasa vegetal) en estos depósitos probable ha servido como un
donador de electrones de larga vida alimentando la reducción de sulfato y, directa o
indirectamente, Fe (III) reducción andu (VI), contribuyendo así a la formación de hierro
sulfuro de minerales y depósitos de U poco soluble (IV) (por ejemplo, Campbell et al,
2012.; Janot et al., 2015 ).
En cierta medida, las actividades microbianas en los NRZs se han deducido a
partir de una amplia caracterización geoquímica ( Campbell et al, 2012.; Janot et al.,
2015 ). Aunque las comunidades microbianas acuíferos en el sitio fl e Ri han sido
extremadamente bien caracterizado, en particular mediante metagenomic (por
ejemplo, Castelle et al, 2013.; Hug et al, 2013.; Brown et al., 2015 ), Así como
metatranscriptomic ( Jewell et al., 2016 ) Y proteómica (por ejemplo,
Callister et al., 2010 estudios), las actividades microbianas en NRZs no han sido
un foco explícito. Además, el dinámica de la actividad microbiana en el NRZs no
se han documentado con datos de expresión génica o con el muestreo frecuente.
Una motivación principal de este estudio fue investigar, en detalle gen escala, el
metabolismo microbiano dinámico en rifle NRZs. En particular, estábamos interesados ​en
la identificación de las fuentes de energía primaria en estos puntos calientes
biogeoquímicos (por ejemplo, material vegetal alimentando metabolismo heterótrofo; hierro
sulfuro de minerales de abastecimiento de combustible metabolismo quimiolitoautotróficas)
y que destacan lo que realmente se expresaban componentes del metabolismo
genómicamente codificada. Por lo tanto, en este estudio, hemos integrado
metatranscriptomic fi co cepa específica y metagenomic datos con los datos geoquímicos
en microcosmos anaeróbicas en el cual rifle NRZ
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Metatranscriptomes de Acuífero Biogeoquímico Hotspot
sedimentos sirvió como la única fuente de microorganismos y donadores de
electrones. Hemos vinculado los procesos biogeoquímicos dominantes observadas
durante la incubación, tales como la mineralización de carbono orgánico disuelto
(DOC) a CO 2, seguido por un pulso de acetogénesis, con información sobre el genoma
a gran escala en la que las vías metabólicas y taxones se catalizando esas
actividades. Metatranscriptomic datos también revelaron algunas actividades
metabólicas altamente expresados ​que no necesariamente se espera que para este
sistema y que no se indican los datos geoquímicos.
MATERIALES Y MÉTODOS Acuífero
sedimentos Collection
Las muestras de sedimentos se recogían en marzo 2013 desde un acuífero de poca
profundidad, aluvial situado cerca de Ri fl e, CO (EE.UU.) por la perforación sin agua sónica ( ASTM-D6914-04
2004 ) Durante la instalación de monitoreo del agua subterránea, así CMT-03 ( Danczak et al.,
2016 ). Una amplia descripción del sitio, incluyendo una descripción detallada del proceso de
muestreo de perforación y los sedimentos sónica, se puede encontrar en Williams et al. (2011) .
sedimentos NRZ recuperados de una profundidad per fi l de 3-4m debajo de la superficie del
suelo se colocaron dentro de N 2- gaseados bolsas núcleo de polietileno después de la
recuperación del acuífero y procesada dentro de una cámara anaeróbica ELD-portátil fi. Las
muestras de 4-m de profundidad se colocaron dentro de no-espacio de cabeza tarros Mason
y saturados con agua subterránea bombeada desde un pozo de control proximal (JB05) a la
ubicación de la perforación ( ~ 1,5 m de distancia) para asegurar la incursión de oxígeno
mínima durante el almacenamiento y envío. Las muestras se almacenaron a 4 ◦ C hasta ser
repartido en microcosmos individuales.
Anaeróbica rifle Arti fi cial de las aguas subterráneas
Anaeróbico Ri fl e Arti fi cial de aguas subterráneas (RAGW) se preparó en base a la
composición geoquímica acuosa de sitio de las aguas subterráneas [que se ha
descrito en otra parte ( Williams et al., 2011; Fox et al., 2012 )]: 7,7 mM NaHCO 3, KCl
0,4 mM, 4 mM MgSO 4. 7H 2 O, 4,8 mm CaSO 4, y 2,6 mm de NaCl. A medida que el
RAGW no incluye una fuente de N o P, éstos tienen que ser proporcionada por el
sedimento del acuífero, como es de suponer el caso que se en el lugar condiciones.
La solución basal (excluyendo NaHCO 3)
se hizo estéril y anaeróbico en autoclave, seguido inmediatamente por la purga bajo
filtró, anaeróbico 90% N 2 -10% de CO 2, usando métodos descritos previamente ( Beller
et al., 2012 ). bicarbonato de sodio anaeróbico y estéril (1M solución madre) se
preparó por separado en una botella de suero, como se describe en otro lugar ( Beller
et al., 2012 ). El stock de bicarbonato se añadió a la solución arti fi aguas
subterráneas cial basal en una cámara anaeróbica (Tipo B, Coy Laboratory Products,
Inc., Grass Lake, Mich.) Cuando ambas soluciones se habían enfriado. El pH final
fue 7,03. agua altamente purificada (18 ? resistencia) obtenido a partir de un sistema
Milli-Q Biocel (Millipore, Bedford, MA) se utilizó para preparar todas las soluciones
acuosas descritas en este artículo.
microcosmos de construcción
A menos que se indique lo contrario, toda la preparación y muestreo de los
microcosmos se realizaron dentro de una cámara anaeróbica que contiene un
100% de pureza ultra alta N 2 ambiente y todo el equipo (serumbottles, tapones,
fórceps, Bowl) se esterilizaron
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Jewell et al.
y se dejó desgasificar en la caja de guantes durante al menos 1 día antes de
su uso. Para preparar el inóculo, el agua superposición se retiró del frasco
que contiene el sedimento del acuífero, y el sedimento se transfirió a un
recipiente de acero inoxidable estéril, donde se homogeneizó por agitación y
romper los grumos con una espátula de acero inoxidable estéril. Ramitas y
rocas fueron retirados manualmente utilizando pinzas. En total, se prepararon
36 microcosmos; detalles del diseño experimental se presentan en la Tabla
suplementaria 1. Veinticuatro microcosmos “en vivo” se prepararon con 7 g
del sedimento se homogeneizó y 15 ml RAGW en botellas de suero de 60 ml.
Las botellas se sellaron con tapones de caucho de butilo y por recalcado de
aluminio-tops y, a continuación protegidos de la luz con papel de aluminio. ◦ C
durante 40 min) antes de la adición de la RAGW. El espacio de cabeza de
cada uno de los 36 microcosmos se intercambió por vacío de gases tres
veces con pureza ultra alta N 2. Diez de los microcosmos vivo y cuatro de los
microcosmos muertos se incubaron a temperatura ambiente, mientras que 10
microcosmos vivo, cuatro microcosmos muertos, y dos microcosmos de
control libre de sedimentos (RAGWonly) fueron unidos a un respirómetro,
alsomaintained a temperatura ambiente. Microcosmos se incubaron sin
agitación.
muestreo microcosmos
El estudio microcosmos procedió durante 20 días con muestreo cial sacri fi en los días
0, 5, 11, 15, y 20. Un esquema de muestreo que detalla los métodos biológicos
analíticos y moleculares que se realizaron en cada microcosmos y en qué punto de
tiempo se presenta en la Tabla Suplementaria 1 . en el punto 0 el tiempo, cuatro
microcosmos vivo eran inmediatamente sacrificado, y en los puntos de tiempo 5, 11,
15, y 20 días, uno microcosmwas vivo fi sacrificial eliminan del respirómetro y,
junto con uno sacri fi cial microcosmos no respirómetro, se ensayó para la
concentración de DOC y δ 13 do DOC microcosmos inalteradas se eliminó a través del tapón con una jeringuilla y se
(Espectrometría de masas, o MS); CO 2, CH 4, H 2, O 2, y N 2 O (cromatografía de gases,coloca en un tubo de 1,5 ml Eppendorf. Los tubos se centrifugaron a 14.000 rpm
o GC); cloruro, acetato, propionato, sulfato, nitrito y nitrato (cromatografía iónica, o
IC); NH + 4 y Fe (II) (ensayos de microplaca colorimétricos), y el pH. Además de la
toma de muestras cial fi sacri, dos microcosmos no respirómetro adicionales en
cada punto de tiempo se ensayaron para determinar N 2 O, CH 4,
CO 2, cloruro, acetato, propionato, sulfato, nitrito, nitrato, NH + 4,
DOC, y el pH para proporcionar análisis geoquímico más replicar. Además, para el
análisis metagenomic y metatranscriptomic, uno sacri fi cial microcosmos vivo fue
retirado de la respirómetro y, junto con uno sacri fi cial microcosmos no respirómetro,
se conservó para la extracción de ácido nucleico. microcosmos muertos eran fi sacri
cialmente recogidos en los días 0 y 20 y se tomaron muestras como se ha descrito
anteriormente para los microcosmos vivo.
respirometría
El medidor de respiración Micro Oxymax (Columbus Instruments, Ohio, EE.UU.) se
utilizó para medir la evolución de los gases (CO 2 y H 2,
aunque H 2 no se detectó por el respirómetro). El principio de medición
involucrado muestreo de gas del espacio superior de la cámara de muestra (es
decir, botella de suero). CO 2 fue detectado por un solo haz, sensor de infrarrojos
y H 2 fue detectado por un sensor electroquímico. El accesorio de respirómetro
tenía un bucle cerrado que cicla el espacio de cabeza con medición periódica
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Metatranscriptomes de Acuífero Biogeoquímico Hotspot
de desprendimiento de gas cada 8 h. Se midió el consumo y la producción de las
tasas de gases del espacio de cabeza y las emisiones netas se registraron como
inmicroliters emisiones acumuladas.
Métodos analíticos para los Gases
Además de las mediciones de gas hechas continuamente por respirometría,
mediciones periódicas de CO 2, CH 4, norte 2 OH 2,
O 2, y N 2 fueron realizados por GC. muestras de espacio de cabeza de cuatro
microcosmos en un momento dado de muestreo (Tabla 1) se retiraron con jeringas
(4 ml para CO 2, CH 4, y N 2 O; 8 ml de H 2, O 2, y N 2 medido en sólo muestras ciales sacri
fi) y se analizaron en un modelo de cromatógrafo de gases GC-2014 de diseño
personalizado (Shimadzu, Pleasanton, CA, EE.UU.) equipada con dos detectores de
conductividad térmica (TCD) para CO 2 (> 500 ppm), H 2, O 2, y N 2, un detector de
conductividad eléctrica (ECD) para N 2 O, un detector de ionización de llama (FID)
para CH 4 y compañía 2
(<500 ppm; después de la conversión en metano en un metanizador), y software
GCSolution. Para llevar, columnas de acero inoxidable para separaciones de gases
incluyen: 80/100 Hayesep T (1m × 1/8 '' × ID 2,1 mm y 0,5 m × 1/8 '' × 2,1 mm ID),
80/100 Hayesep D (2m ×
1/8 '' × 2,1 mm ID), y 60/80 Tamiz Molecular 5A (2m × 1/8 ''
× 2,1 mm ID). calibraciones de tres puntos se realizaron utilizando mezclas de gases de
encargo (Scott Specialty Gases, Fremont, CA, USA).
Métodos analíticos para los constituyentes
disueltos
Para la medición de componentes disueltos en sacri fi microcosmos ciales, los
microcosmos se transfirieron a tubos de 50 ml, sellados con Para fi lm, y se
centrifugaron durante 2 min a 14.000 rpm (4 ◦ C) fuera de la cámara anaeróbica.
Dentro de la cámara anaeróbica, el sobrenadante se transfirió a un segundo tubo
de 50 ml y se utilizó para ensayos descritos a continuación. Para constituyentes
disueltos en microcosmos fi ciales no sacrificios, 1,25 ml de la fase líquida de
durante 2 minutos (4 ◦ C) y el sobrenadante se utiliza en los siguientes ensayos: el
pH se midió utilizando un medidor de pH sympHony (VWR, Radnor, PA, EE.UU.)
con un electrodo Orion 911 600 (Thermo Fisher Scientific c, Waltham, MA,
EE.UU.); amonio fue cuantificada fi usando un fenol-hipoclorito colorimétrico
ensayo en microplaca modi fi ed de Weatherburn (1967) ; diluciones (1: 2 y 1:10) se
prepararon en agua reactivo a partir del sobrenadante restante y cloruro, acetato,
propionato, sulfato, nitrito, y las concentraciones de nitrato fueron cuanti fi con un
modelo ICS-2000 IC (Dionex, Sunnyvale, CA) como descrito anteriormente ( Beller
et al., 2013b ). Para DOC y la composición de isótopos estables de carbono, 450- μ alícuotas
L de muestra acidifica con 5% (v / v) HCl se cargaron y se evaporaron a 9 × 10
cápsulas mm Sn (Costech Analytical Technologies, Inc., Valencia, EE.UU.). Las
cápsulas se pliegan y se cargan en un automuestreador en blanco cero conectada
a una ECS 4010 Analizador Elemental (Costech Analytical Technologies Inc.,
Valencia, EE.UU.) acoplado a un Delta V más espectrómetro de masas de relación
isotópica (Thermo Fisher Scientific c, Bremen, Alemania). La composición isotópica
se informa en el convencional δ 13 Cnotation en relación con la escala de V-PDB.
Sobre la base de las normas de propionato correr con lotes de muestra, la
precisión analítica de
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Jewell et al.
concentración de carbono y de δ 13 C se estima en ± 2% y
± 0,29 ‰, respectivamente.
Análisis de total Fe (II)
Para medir total (disuelto y sedimentos-asociado) Fe (II) en el microcosmos, los
microcosmos se agitaron y 0,2 ml de la suspensión homogeneizada resultante se
retira a través del tapón utilizando una jeringa con una aguja de calibre 20, se
disolvió inmediatamente en 1,8 ml de HCl 1 N, y brie vórtex fl y. Un ensayo
colorimétrico (ferrozina) de microtitulación para el Fe (II) se llevó a cabo de acuerdo
con Beller et al. (2013b) con la siguiente modificación fi: la mezcla / HCl suspensión
se incubó durante 1 h en la caja de guantes anaerobia y 100 μ L del sobrenadante
después de establecerse se utilizó en el ensayo.
El análisis de carbono orgánico total en el
sedimento
Las muestras de sedimentos se analizaron para el carbono orgánico total (COT) por
oxidación de combustión catalíticamente ayudado a 900 ◦ C y un detector NDIR usando un
analizador de TOC-V Shimadzu equipado con un módulo de sólidos (SSM) en sedimentos
molino de bolas después de la fumigación ácido para eliminar el carbono inorgánico. el
sedimento se secó al aire era un molino de bolas usando bolas de carburo de tungsteno a
un polvo fi ne. fumigación Acid con vapores de HCl se realizó según
Ramnarine et al. (2011) .
Nucleic Acid Conservación y Extracción
Sacri fi microcosmos ciales se abrieron en la cámara anaeróbica y los ácidos nucleicos
fueron preservados mediante la mezcla de 30 ml de reactivo de preservación de ARN
(citrato de sodio 25 mM, 10mMEDTA, sulfato de amonio 10 M, pH 5,2, Beller et al., 2013A )
Con la suspensión de sedimentos. Las suspensiones de sedimentos conservados se
incubaron a temperatura ambiente durante 1 h en la cámara anaeróbica, se transfirió a 50
ml tubos de centrífuga de polipropileno, retirado de la cámara, y se centrifugaron durante
10 min a 8000 × g (4 ◦ DO). La capa acuosa se desechó y el sedimento se almacenó a - 80 ◦ C se generaron con el paquete R ggplot2 ( Wickham, 2009; R Core Team, 2015 ). A fi
hasta el procesamiento adicional.
El ADN genómico y el ARN total se co-extraídos y cuantificados como se
describe por Jewell et al. (2016) con las siguientes modificaciones: (1) 0,25 g
de Chelex-100 (malla 100-200) (Sigma-Aldrich, Número CAS 11139-85-8) se
incluyó con el sedimento y ff extracción bu er para facilitar la eliminación de
Fe, y (2) la ADN genómico extraído fue aún más purificado con perlas
magnéticas Sera-Mag SpeedBead carboxilo (GE Healthcare,
65152105050250) usando una modificación de Rohland y Reich (2012) , Como sigue:
perlas de 1,2X Sera-Mag (0,1%, preparados de PEG bu ff er [PEG8000, 18% 1M
NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8, EDTA 1 mM pH 8, 0,05% de Tween 20 en agua tratada
con DEPC] se añadió a cada muestra, se mezcló mediante pipeteo, y se incubaron
durante 10 min a temperatura ambiente con suave tocando cada 2 min. se colocaron
los tubos que contienen las muestras en un soporte magnético y se incubaron 2 min
hasta que las perlas Sera-Mag separadas fuera de la solución. la sobrenadante se
desechó y las perlas de ADN unido se lava con 120 μ L de etanol al 80% durante 1
minuto. Después se eliminó el etanol, el ADN se eluyó de las perlas con er TE bu ff,
colocados en el estante magnético para separar las perlas, y
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eluyente transfirió a un tubo fresco y se almacena a - 80 ◦ C hasta que se necesite.
Metagenómica y Metatranscriptomic Biblioteca de
construcción y secuenciación
bibliotecas de ADN y ADNc genómico se construyeron y se secuenciaron como se
describe por Jewell et al. (2016) y secuenciado utilizando un Illumina HiSeq 2500 (San
Diego, CA, EE.UU.) con 150 pb lee. -Extremo emparejado lee se obtuvieron para el
ADN (ca. 400-bp inserciones) y de un solo extremo lee por cDNA (ca. insertos de 260
pb).
Análisis de Metagenomic y Metatranscriptomic
corto Reads
Un total de 62,9 Gb de 11 muestras metagenomic (5,72 ± 0,46 Gb / muestra)
fueron co-montado, binned, curada, taxonómicamente y filogenéticamente pro fi
llevó y anotado como descrito por
Jewell et al. (2016) . estadísticas co-montaje final se dan en la Tabla Suplementaria
2. Un total de 42,99 Gb de 10 muestras metatranscriptomic (4,3 ± 2,12 Gb /
muestra) fueron asignadas por separado para cada muestra para la co-montaje
para la cuanti fi cación de los transcritos, tal como se describe por Jewell et al.
(2016) .
El análisis bioinformático
Los genes de interés para las vías selectedmetabolic se confirmaron con MetaCyc ( Caspi
et al., 2012 ) Y identificados en la metatranscriptome con BLAST 2.2.30+ ( Camacho et
al., 2009 ), BLASTP ( Altschul et al., 1990 ), Y JGI IMG ( Markowitz et al., 2013 ) Como se
describe por Jewell et al. (2016) . genes adicionales de interés fueron ed fi identi en los
contenedores seleccionados con el Departamento de Sistemas de Energía de
conocimientos de Biología (KBase, http://kbase.us) “RAST Anotación microbianos
Contigs v1.0.0” trabajo flujo. Los alineamientos de secuencias se realizaron con el
músculo ( Edgar, 2004 ), Árboles vecinos a participar generan usando FastTree ( Price
et al., 2009 ), Y los datos se integran con los datos de expresión y se visualizan con el
árbol interactiva de la vida ( Letunic y Bork, 2011 ). Replicar datos RPKM se sumaron
para el análisis, así como los datos de cobertura de pliegue de ADN. mapas de calor
datos le incluyendo IDs ORF y para cada ORF: sca ff viejo ID, ID bin, doble cobertura
de bibliotecas de ADN para cada muestra, RPKM a partir de bibliotecas de ADNc para
cada muestra, la parte superior 10 UniRef realiza, por ciento de proteína identidades
de secuencia para cada UniRef golpeado, secuencia traducida del predictedORF,
anotaciones funcionales, así como información adicional está disponible en la siguiente
doi: http://dx.doi.org/10.21952/WTR/1338826.
RESULTADOS
Temporal Per fi les de geoquímicas Condiciones
Los datos geoquímicos de los sedimentos microcosmos (1,35 ± TOC 0,03%) y agua
superponiendo se generaron durante el transcurso de tiempo de 20 días ( La Figura
1A; Tabla 1). Los datos indican dos fases del metabolismo del carbono: oxidación de la
materia orgánica disuelta (DOM) durante los primeros 15 días y un pulso de
acetogénesis y la metanogénesis entre los días 15 y 20. Durante el primer 15 días, el
agotamiento de DOC se correlacionó fuertemente a la generación
4 De enero de 2017 | Volumen 8 | artículo 40
Jewell et al. Metatranscriptomes de Acuífero Biogeoquímico Hotspot

FIGURA 1 | mediciones geoquímicas tomadas durante el estudio microcosmos de 20 días. (UNA) CO2, acetato, DOC, y el metano. mediciones de CO2 se presentan como valores de microcosmos muertos menos en vivo para dar cuenta

de pérdidas abióticos de CO2 (valores de CO2 vivas y muertas separadas se muestran en la Figura 1 complementario). ( SEGUNDO) De regresión lineal fi cio de CO2 producido vs DOC consumido. Tenga en cuenta que los datos de

acetato en día 20 representa la media de 3 de cada 4 replica-detalles se dan en Tabla 1.

TABLA 1 | Los datos geoquímicos para microcosmos durante el estudio de 20 días.

Variable Vivir Delicado

día 0 Dia 5 día 11 día 15 día 20 día 0 día 20

Promedio Dakota del Sur a Promedio Dakota del Sur Promedio Dakota del Sur Promedio Dakota del Sur Promedio Dakota del Sur Promedio Dakota del Sur Promedio Dakota del Sur

pH 7.9 0.0 8.1 0.2 8.1 0.2 8.1 0.4 Coger N/A 7.9 0.0 N/A

Fe (II) (mM) 8.0 2.4 9.0 0.03 9.8 0.03 9.1 0.01 15.0 2.2 4.5 0.4 N/A

amonio ( μ METRO) 178 1.6 153 12 143 23 154 17 137 3.3 202 6.1 212 18

Cloruro de (mM) 3.34 0.13 3.27 0.09 3.29 0.12 3.50 0.21 3.29 0.23 3.36 0.12 3.38 0.23

acetato de ( μ METRO) 60 4.3 44 13 6.7 2.8 42 22 620c 35c 120 26 110 35

propionato ( μ METRO) < sistema antibloqueo de frenos < DL < DL < DL < DL < DL < DL

Sulfato de (mM) 8.67 0.11 8.36 0.46 8.26 0.59 8.66 0.90 8.10 0.86 9.00 0.31 8.75 0.39

nitrato ( μ METRO) 114 5.6 118 12 111 14 98 41 120 25 115 2.5 109 17

nitrito ( μ METRO) < DL < DL < DL < DL < DL < DL < DL

DOC ( μ mol) 17.7 14.4 9.1 7.0 5.9 2.2 5.9 3.1 2.5 0.6 69.3 10.5 57.5 7.9

DOC δ 13C ( ‰) - 28.54 < DL < DL < DL < DL - 23.82 0.44 - 23.56 0,19

El óxido nitroso (ppm) < DL < DL < DL < DL < DL < DL < DL

Metano (ppm) 1.3 0.0 4.3 0.29 6.4 0,19 7.7 0,76 15.4 0.56 1.3 0.0 1.3 0.0

Hidrógeno (ppm) < DL < DL < DL < DL < DL < DL < DL

una desviación estándar.

segundo No analizada.

do Tenga en cuenta que los datos de acetato en día 20 (en vivo) representa la media de 3 repeticiones que estaban conectados a la respirómetro; un cuarto de la muestra, no unido a la respirómetro, no mostró un aumento de etilo. Si se incluyeran

todas las réplicas, acetato habría 470 ± 310 μ METRO.

re Por debajo del límite de detección: propionato, 10 μ METRO; nitrito, 10 μ METRO; DOC δ 13 C, 0,9 μ mol C; óxido nitroso, 0,2 ppm; hidrógeno, 40 ppm.

de CO 2 ( r 2 = 0,97, P < 0,01; La Figura 1B), lo que sugiere la mineralización biológica
de la DOC. Durante el pulso de la acetogénesis y la metanogénesis que comenzó en
el día 15, acetogénesis representaba una proporción mucho mayor de carbono
transformado de la metanogénesis (nota las unidades en las Figura 1A). Hay varios
indicadores geoquímicas que los microcosmos permanecieron anóxica durante todo
el experimento, incluyendo Fe total (II) concentraciones (disueltas más
Temporal
sedimentos-asociados), que varió de 8 a 15 mmol / L desde el día 0 al 20 ( Tabla 1). Evidencia
de leve (0,56 mm; 6-7% de sulfato de inicial), pero no significantes ( t- prueba, P> 0.05)
la reducción del sulfato se observó durante el estudio de 20 días ( Tabla 1).
reacción abióticos del hidrógeno resultante sulfuro de Fe con sedimentassociated (III)
podría, a lo sumo, han representado ~ 65% de la reducción observada Fe (III) durante
el estudio. Un listado completo de los datos geoquímicos se presenta en Tabla 1.
Per fi les de microcosmos metagenomes y
Metatranscriptomes
metagenomic datos y metatranscriptomic para cada uno de los cinco puntos de
tiempo “en vivo” (días 0, 5, 11, 15, y 20) y uno “mataron”

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punto de tiempo (día 20) se analizaron para la composición de la comunidad
(abundancia ciento ADN comunidad) y la actividad (transcripción abundancia
ciento comunidad). están disponibles en la información complementaria de los
datos. contenedores que representan ~ 50- 55% del ADN y ARNm pertenecía a los
siguientes cinco grupos taxonómicos ( Figura 2): Clostridios (Clostridiaceae,
Ruminococcaceae,
y Peptococcaceae), Archaea
Bathyarchaeota y taxones Archaeal sin resolver), cloro fl EXI (Dehalococcoidia,
Anaerolineae, y sin resolver cloro fl EXI taxones), y el grupo Bacteroidetes /
Chlorobi. Las familias exi fl Cloro representaban aproximadamente el 15% del
metagenoma en el día 0, comparable a la fracción de cloro fl EXI identificados
en otro estudio metagenomic en el sitio fl e Ri en condiciones similares ( Hug et
al., 2013 ). El grupo quinto, Proteobacteria, se compone de la alfa subphyla
(taxones sin resolver), beta (Rhodocyclales, Comamonadaceae,
y sin resolver taxones),
taxones gamma, delta (desulfobacterales, desulfovibrionales, syntrophobacterales,
y taxones delta sin resolver), y taxones epsilon sin resolver ( Figura 2, Tabla
Suplementaria 3). contenedores individuales asociados con sulfato-reductores y Fe
(III) bacterias -la reducción, tales como desulfobacterales, desulfovibrionales, y Geobacter
entre la delta Proteobacteria, constituía una parte relativamente pequeña de los
metagenomes y metatranscriptomes en todas las muestras. Por ejemplo, el más
abundante bin sulfato reductoras (b152, representando desulfovibrionales),
compuesta a lo sumo 6,2% de metagenomes y 1,3% de metatranscriptomes en
todas las muestras; la papelera de sulfato-reductor más activa (b98, representando
Desulfobulbaceae) compuesto como máximo 2,2% de metagenomes y 1,7% de
metatranscriptomes. Sin embargo, colectivamente, los contenedores que
representan sulfato de bacterias reductoras (b1, b7,
FIGURA 2 | composición taxones Primaria. (UNA) Porcentaje de total de la Comunidad mapeado de ADN (como la profundidad de la cobertura) y ( SEGUNDO) por ciento de comunidad total de mapeado mRNA (como RPKM). Hydrogenophaga B174, que
pertenece a la familia Comamonadaceae, está en un recuadro en rojo.
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b16, b37, b71, b84, B93, B98, B103, B140, B152) constituida hasta un 13% de
metagenomes y 6,6% de metatranscriptomes. Las subunidades sul dissimilatory
más altamente expresado fi te reductasa ( DsrA y dsrB) pertenecido a b98
(k101_1599993_66261_1 y k101_233918_9973_2,
respectivamente). Geobacter spp.,
Fe (III) bacterias -la reducción de cuya presencia y actividad está bien documentada en
( California. el sitio fl e Ri bajo ciertas condiciones (por ejemplo,
Anderson et al., 2003 ), Compuesto de menos de 0,7% de metagenomes y 0,5% de
metatranscriptomes en este estudio.
bins taxonómica (b20, b60.1, b60.2, B117, B137, B174) que pertenecen a la
familia Comamonadaceae beta-proteobacterial representaron el 15,2% de la
metatranscriptome en el día 11, con Hydrogenophaga bin 174 solo representa el
7,8%. Abundancia (ADN) y la actividad metabólica (ARNm) de esta bandeja se
correlacionó bien con el consumo de DOC ( r 2 = 0,97 y 0,75, respectivamente), lo
que sugiere que la actividad heterotrófica catalizada por Hydrogenophaga fue un
irresoluto contribuyente importante a la mineralización DOC ( Figura 3A). La expresión de
genes de interés para heterotrófica metabolismo, incluyendo los implicados en el
catabolismo de aminoácidos, azúcares y graso acids- también se correlacionó
bien con el consumo de DOC (en La Figura 3B,
correlaciones de cada transcripción vs consumo DOC tenían
r 2- valores mayores que o igual a 0,85; Suplementaria Cuadro 4).
Actividad metabólica del destacado Strain,
Hydrogenophaga B174, según la evaluación de la
transcripción de datos
Nosotros vías metabólicas expresadas reconstruidos en
Hydrogenophaga B174 y se encontró evidencia de una sorprendentemente
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catabolizar compuestos derivados de plantas para heterótrofos

crecimiento. donantes de electrones para chemolithoautotrophy incluyen H 2, CO, y compuestos
de S reducido, como se discute en más detalle a continuación.

Denitri fi cación y transporte de electrones

fosforilación
Hay una fuerte evidencia de la transcripción de denitri fi cación en Hydrogenophaga B174,
con muchos de los genes estructurales y transportadores de nitrato / nitrito que muestran
máximos de expresión en el día 5 ( La Figura 5A; Suplementaria Cuadro 6). Los genes se
agrupan en múltiples edad sca ff: nitrato respiratoria subunidades reductasa unidas a
membrana y transportadores de nitrato forman un clúster ( soplón 1 K 2 GH) en una ff sca de
edad, mientras que el citocromo discos compactos 1

nitrito reductasa ( NIRS) formado un grupo con otro NIR (genes nirSMCFDLGHJN) y
genes de reductasa óxido nítrico norCBQ
y Nord en un segundo sca ff edad. El viejo sca ff que contiene el
NIR y ni genes tenían alta con synteny Hydrogenophaga sp. LP0072, que
compartió 82, 87, y 86% de identidad de secuencia con traducida Hydrogenophaga B174
NIRS, norB, y NORC,
respectivamente (Figura 2; Tabla suplementario 7). Este ff sca edad, también
incluye un gen de proteína 30S ribosomal con 95% de identidad de secuencia
traducida al de Hydrogenophaga
sp. T4. El gen que codifica la enzima que cataliza la etapa final en denitri catión fi,
reductasa óxido nitroso ( nosZ), estaba presente en otras partes del genoma.
Además de expresado catión fi denitri, encontramos genes que representan la
nitrato reductasa (assimilatory nasab) y una nitrito reductasa ( norv) que se pueden
utilizar para proteger contra el estrés oxidativo ( Silaghi-Dumitrescu et al., 2003 ). Las
transcripciones de asimilación de nitrato reductasa tenían máxima expresión en el
día 5, mientras norv expresión sólo se detectó en el día 15. Mientras que era
inesperado de encontrar activo fi cación denitri en un sistema cerrado con el agua
subterránea simulada que no contiene nitrato añadida, este hallazgo también fue

FIGURA 3 | Las tendencias temporales de Hydrogenophaga la expresión del gen B174 y el consumo DOC. apoyada por la evidencia de la transcripción de denitri fi cación en una
(UNA) Las tendencias de concentración de COD y
Hydrogenophaga población B174 relativa y actividad (como% de la comunidad de ADN y ARNm,
respectivamente). La trama DOC es idéntica a la de Figura 1.
Dechloromonas cepa, b45, que expresa genes estructurales que representan a cada
A partir del análisis de regresión lineal, la r 2-valor de DOC vs. ciento ADN de días 0 a 15 es de 0,98 ( P < 0,05)
paso de denitri fi cación: napAB, NIRS, norBC, y
y de DOC vs. ciento ARNm es 0,90 ( P>
0,05). ( SEGUNDO) Seleccionado Hydrogenophaga ORFs B174 implicados en el metabolismo heterótrofo que nosZ ( Figura 5B). Se detectaron niveles relativamente bajos de nitrato en los
tienen una fuerte correlación inversa con la concentración de DOC ( r 2> 0.8 a partir de los días 0 a 15). Las microcosmos ( ~ 110 μ METRO; Tabla 1), presumiblemente liberado del sedimento; No se
anotaciones ORF son los siguientes: ácido graso de beta-oxidación: enoil-CoA hidratasa (# 1); la degradación de
encontró evidencia basada en ómicas de Nitri fi cación, y sería muy poco probable en
aminoácidos:
este sistema anóxico. Interpretación de las tendencias en los datos de concentración de
putativo amino ácido ABC permeasa transportador (# 2), de cadena ramificada amino ácido transportador
ABC permeasa (# 3), deshidrogenasa de ácido amino (# 4), peptidasas (# 5 y # 6); hidrolasas diversos: alfa /
nitrato se confunde por relativamente altas desviaciones estándar, en particular en los
beta hidrolasa pliegue de proteínas (# 7), urea carboxilasa (# 8), alofanato hidrolasas (# 9 y # 10), hidrolasas días 15 y 20.
(# 11 y # 12), hidrolasa hydroxyacylglutathione (# 13), transglicosilasa lítica (# 14) ; catabolismo de
carbohidratos: fosfofructoquinasa (# 15), fosfoglicerato quinasa (# 16) isomerasa, guanililtransferasa
Además de denitri catión fi, encontramos genes que codifican complejos
manosa-1-fosfato / manosa-6-fosfato (# 17), mutarotasa D-hexosa-6-fosfato (# 18), proteína de unión a
completas de la cadena de transporte de electrones I, II, III, IV, y V. No todos
carbohidratos (# 19), y la sintasa de G malato (# 20). ORF identificación, anotación, RPKM, y
estos genes se expresaron; la mayor expresión se encontró para el complejo
IV (citocromo CBB 3)
genes, con cinco de los seis subunidades expresadas. Relativamente alta
r 2-valores se enumeran en la Tabla 4 complementario.
expresión de el bajo nivel de oxígeno-tensión citocromo
oxidasa característica de entornos subóxicas, citocromo
CBB 3 ( Jarra y Watmough de 2004 ), También fue encontrado en conjunción con
diverso estilo de vida ( Figura 4, Suplementaria Cuadro 5). activo denitri fi cación en un estudio metatranscriptomic anterior en el sitio Ri fl e ( Jewell
Hydrogenophaga aparece B174 ser un facultativamente et al., 2016 ). En particular, los genes del complejo I nuoABCDEFGHIJKLMN compartido
desnitrificantes, cepa mixotrófico que puede asimilar CO 2 una ff sca antiguo con lo NIR y ni genes fi cación denitri descritos anteriormente.
autotróficamente través de la vía Calvin-Benson-Bassham (que incluye
Rubisco) y tiene numerosos medios de

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FIGURA 4 | Hydrogenophaga diagrama de células B174 que representa vías de conservación catabólicos y de energía seleccionadas activos durante el estudio. Esta reconstrucción es un compuesto de vías que estaban activos en
cualquier punto medido durante el estudio de 20 días. Los genes que no se expresan, o para los que el gen no se identificó en el metagenoma y por lo tanto podría ser asignado ningún nivel de expresión, están representados en el
diagrama como blanco y negro, respectivamente. complejos de proteína (por ejemplo, ETC y hidrogenasas) se representan en el diagrama con un gradiente de color si no se expresaron todos los genes de subunidades. Denitri fi
cación: 1, los transportadores de nitrato / nitrito ( narK1K2); 2, la nitrato reductasa ( narGH); 3, nitrito reductasa ( NIRS); 4, el óxido nítrico reductasa ( norB); 5, el óxido nitroso reductasa ( nosZ); 6, nitrato assimilatory reductasa ( nasab); 7,
nitrito assimilatory reductasa ( nirB); 8, el óxido nítrico anaeróbica reductasa fl avoredoxin ( norv); la degradación de aminoácidos: 9, amino transportadores de ácidos; 10, la arginina deiminasa; 11, ornitina carbamoiltransferasa; 12,
quinasa carbamato; 13, arginina descarboxilasa; 14, agmatinase; 15, arginasa;

16, ureasa ( ureABC); 17, ornitina ciclodeaminasa; 18, bifuncional prolina deshidrogenasa / deshidrogenasa gamma-semialdehído-L glutamato; 19, histidina amoníaco-liasa; 20, urocanase; 21 imidazolonepropionase; 22,
formimidoylglutamase; 23, glutamato deshidrogenasa; 24, aspartato aminotransferasa; β- oxidación:
25, transportadores de ácidos grasos; 26, acil-CoA deshidrogenasa; 27, enoil-CoA hidratasa; 28, 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa; 29; acetil-CoA acetiltransferasa (tiolasa); Planta de la degradación de la biomasa: 30,
transportadores de azúcares; 31, xilosa isomerasa; 32, xiluloquinasa; 33, tanasa y feruloil esterasa; 34, feruloyl-CoA sintasa;
35, vainillina sintasa / trans-feruloyl-CoA hidratasa; 36, vainillina deshidrogenasa; 37, pirogalol hydroxytransferase subunidad grande; 38, dioxigenasa galato; 39, hidrolasa 2-pirona-4,6-dicarboxilato; hidratasa 40,
4-oxalomesaconate; 41, 4-carboxi-4-hidroxi-2-oxoadipato aldolasa / oxaloacetato descarboxilasa; glucólisis:
42, glucoquinasa; 43, la isomerasa de glucosa-6-fosfato; 44, 6-fosfofructoquinasa; 45, fructosa-1,6-bisfosfato aldolasa; isomerasa 46, triosa-fosfato; 47, de tipo I deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato; 48, fosfoglicerato quinasa; 49,
fosfoglicerato mutasa; 50, enolasa; 51, la piruvato quinasa; Entner-Doudoroff Camino: 52, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa; 53, 6 fosfogluconolactonasa; 54, deshidratasa de fosfogluconato; 55, 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato
aldolasa; Ciclo TCA: 56, piruvato deshidrogenasa (acetil-transferir) ( aceE); 57, citrato (Si) sintasa ( gltA); 58, aconitato hidratasa ( acnAB); 59, isocitrato deshidrogenasa (NADP +) ( ICDA); 60, 2-oxoglutarato deshidrogenasa subunidad E1
( sucA); 61, succinato-CoA ligasa subunidad, beta ( sucCD); 62, succinato deshidrogenasa fl avoprotein subunidad ( sdhABCD); 63, fumarato hidratasa ( fumCA); 64, malato deshidrogenasa ( MDH); Ciclo CBB: 65, transportistas de
bicarbonato; 66, ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa / oxigenasa (RUBISCO) ( rbcLSQO); 67, fosfoglicerato quinasa; 68, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa; isomerasa 69, triosa-fosfato; aldolasa 70, fructosa-bisfosfato; 71, clase
de fructosa-1,6-bisfosfatasa 1; 72, transcetolasa; 73, ribulosa-fosfato 3-epimerasa;

74, phosphoribulokinase; 75, “aeróbico” monóxido de carbono deshidrogenasa ( coxLSM); S oxidación: 76, transportistas S-compuestos; 77, rodanasa; 78, sul fi deshidrogenasa Te; 79, S genes de oxidación ( soxCD, citocromo do
552, citocromo do 551, soxYZAXBR); la oxidación de H2: 80, [NiFe] hidrogenasa ( hupLU) y proteínas accesorias / de maduración; cadena de transporte de electrones (ETC) / fosforilación oxidativa: 81, ETC complejo I-NADH:
ubiquinona oxidorreductasa ( nuoABCDEFGHIJKLMN); 82, ETC complejo II-succinato deshidrogenasa ( sdhCD, sdhAB); 83, ETC complejo III-citocromo antes de Cristo 1 de tipo oxidorreductasa ubiquinol ( Petab); 84, ETC IV-
complejo CBB De tipo 3 citocromo do oxidasa ( ccoPQON); 85, ETC complejo V-ATP sintasa ( atpCDIBEFHAG).

Metabolismo heterótrofo incluyendo la biomasa de origen vegetal (glucosa a partir de celulosa, xilosa a partir
evidencia transcripcional fuerte de un estilo de vida heterótrofa fue apoyada por la de hemicelulosa, y varios compuestos fenólicos), ácidos grasos y aminoácidos.
expresión de genes asociados con el uso de numerosos donadores de electrones genes de degradación de xilosa ( Xylab) y genes xilosa transportadoras ( xylFGH) se
y fuentes de carbono heterótrofa, organizaron en un solo

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FIGURA 5 | expresión temporal de los genes seleccionados para (A) fi cación denitri en Hydrogenophaga B174 y ( SEGUNDO) denitri fi cación y carboxilasa acetona en
Dechloromonas b45. La expresión (RPKM) se ha normalizado al máximo para cada gen.

racimo y expresado parcialmente; expresión de catabolismo de la glucosa quimiolitoautotróficas Metabolismo

vía También se observó la ff Entner-Doudoro (ED) y las vías de glucólisis. La A medida que el género Hydrogenophaga fue nombrado por su capacidad para obtener
presencia de las dos vías de ED y la glucólisis fue sorprendente, ya que, hasta la energía a través de la oxidación de hidrógeno ( Davis et al., 1969; Willems y Gillis, 2009 ), No
fecha, no ha habido ninguna documentación de la glucólisis en el Hydrogenophaga género.
es sorprendente que los transcritos asociados a una hidrogenasa captación unida a la
De hecho, la entrada más reciente de Hydrogenophaga en el Manual de Bergey ( Willemsmembrana [NiFe] fueron identificados en la metatranscriptome. Hydrogenophaga B174 tuvo
y Gillis, 2009 ) Sólo se refiere a un estudio de 1981 ( Lee y Schlegel, 1981 ) Para el dos [NiFe] racimos hidrogenasa con las subunidades grandes y pequeñas, hupL y
metabolismo heterótrofo en H. ava seudo fl
hupU, respectivamente (tenga en cuenta que la nomenclatura hidrogenasa no ha sido
(antes seudo Pseudomonas fl ava). Sin embargo, hay por lo menos tres Hydrogenophaga
estandarizada en la literatura). Las secuencias traducidas para los pares de
especies (sp. Root209, sp. T4, y sp. LPB0072) con genes anotados como subunidades pequeñas y grandes fueron> 95% idénticas entre sí. Estos hidrogenasas
6-fosfofructoquinasa, la enzima única para la glucólisis ( Bloxham y Lardy, 1973 ), pertenecen al grupo 1 de la respiratorio H unido a la membrana 2 hidrogenasas
En la base de datos GenBank no redundante. Las secuencias traducidas de los absorción y la subunidad grande tiene el patrón de L2 firma subunidad ( Vignais et al.,
dos genes únicos a la vía de ED, deshidratasa de fosfogluconato aldolasa y 2001 ), Excepto para el residuo líder. accesorios y maduración proteínas adicionales se
2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato, eran 86 y 93% idénticos a los de Hydrogenophagaencontraron en grupos con estas subunidades, así como en otras partes del genoma.
sp. LPB0072, mientras que la secuencia traducida del gen único para la Mientras que sólo una de las subunidades grandes se expresó, y ninguna de las
glucólisis, la fosfofructoquinasa, era 91% idéntica a la de LPB0072 cepa. subunidades pequeñas, el accesorio y proteínas de maduración HUPH ( k101_5515505_209934_6)
Además de las dos vías de catabolismo de la glucosa, los genes para una vía y
de las pentosas fosfato anabólico incompleta estaban presentes. No es sin
precedentes para tener ambas vías catabólicas en el mismo organismo, por hypF ( k101_2898432_117423_2) estaban entre los ORFs más altamente
ejemplo, un pariente cercano, Polaromonas sp. JS666, tiene genes que expresado en el metatranscriptome (Cuadro 8)
codifican tanto la glucólisis y de la vía ED, así como una vía del fosfato de
pentosa (incompleto Mattes et al., 2008 ). Además de la conservación de energía de H 2 la oxidación, la reducción de azufre
oxidación compuesto y la oxidación de CO también eran evidentes en el
metatranscriptome. Las transcripciones de la agrupación de genes de oxidación S, soxCDc
552 YZAXB, junto con soxR,
Catabolismo de fenoles derivados de plantas se evidenció mediante la expresión rodanesa, y fcbbAB genes, se detectaron. Las transcripciones también se detectaron a
de genes para la degradación ferulato a vainillato ( FAEA, ferAB, ligV), degradación de partir de un grupo de genes que contiene la forma putativa I aeróbico monóxido de carbono
floroglucinol pirogalol (presumiblemente galato derivado), y además en oxaloacetato. deshidrogenasa (CODH) subunidades
Los genes implicados en el metabolismo del ácido graso por β- oxidación se Coxs, coxM, y coxL. Este CODH se caracteriza por oxidación de CO aeróbico, pero
expresaron junto con numerosos genes implicados en el metabolismo de también se ha informado para generar equivalentes reductores para la reducción de
aminoácidos (arginina, prolina, glutamato, aspartato, histidina, entre otros). Genes nitrato ( King, 2006; Hoeft et al., 2007 ). La secuencia traducida de la subunidad grande, coxL,
asociados con el metabolismo de otros compuestos que contienen N-, a saber, urea, tiene la forma II CODH motivo del sitio activo (AYRGAGR), distinguiéndola de la forma
fueron altamente expresado para la hidrólisis de urea ( ureABC) y el transporte. I ( Rey, 2003 ). Sin embargo, este motivo se encuentra en una variedad de enzimas con
sustratos di ff Erent especificidades y requiere

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líneas adicionales de pruebas para confirmar CO-especificidad, incluyendo la
disposición gen estructural y la presencia de accesorio timonel
genes agrupados con los genes estructurales ( Rey y Weber, 2007 ). Hydrogenophaga genesEl pulso de la acetogénesis comenzando en el día 15, aparentemente, no estaba
estructurales B174 se agruparon pero no contiguous- coxL y coxM estaban separados
por un ORF que codifica un péptido de 37 aminoácidos. Esta disposición no se observó
en ninguno de los otros Hydrogenophaga genomas examinados. Sin embargo, las
proteínas accesorias coxFGEDM estaban presentes en la agrupación.
Chemolithoautotrophy alimentada por H 2, Tiosulfato, y la oxidación de CO está muy
extendida en el Hydrogenophaga género ( Gra ff y Stubner, 2003; Kämpfer y col., 2005;
Yoon et al., 2008; Willems y Gillis, 2009 ). La oxidación de estos compuestos también
puede ayudar al crecimiento mixotrófico combustible en compuestos orgánicos, dando a
la especie A medible ventaja de crecimiento frente al crecimiento puramente
heterotrófica ( Kiessling andMeyer, 1982; VandenHoven y Santini, 2004 ). Más allá de su
papel como un donador de electrones, el CO puede servir como una fuente de carbono
autotrófico través de fi jación de CO 2, el producto de su oxidación por CODH ( Meyer y
Schlegel, 1983 ).
Metatranscriptome Pro archivos durante
Acetogénesis pulso
relacionado con el metabolismo de sólo uno o dos taxones dominante, sino más bien,
un número relativamente grande de taxones con metabolismos de generación de
etilo, en particular el autótrofa, vía Wood-Ljungdahl carbono-asimilar y múltiples vías
de fermentación ( La Figura 6). genes altamente expresado en de etilo (y acetylCoA-)
itinerarios productoras
monóxido de carbono incluido
deshidrogenasa sintasa / acetil-CoA (di ff Erent que el “aeróbico” CODH se
mencionó anteriormente), la acetil-CoA decarbonylase / sintasa, piruvato:
ferredoxina oxidorreductasa (PFOR), formatelyase piruvato, piruvato
deshidrogenasa, NADP + piruvato deshidrogenasa dependiente, acetato quinasa,
fosfato acetiltransferasa (aka fosfotransacetilasa), acetil-CoA hidrolasa, y de etilo:
succinato CoA-transferasa ( Las figuras 6A, B). De éstos, PFOR fue el más
destacado en el metatranscriptome, con la expresión PFOR distribuye de forma
relativamente uniforme sobre un gran número de taxones, pero con fi cativas
contribuciones más significantes de un pequeño número de taxones, en particular, Dechloromonas
b45 y la

La figura 6 | Expresión temporal pro fi les para transcripciones potencialmente contribuyen a un pulso de acetogénesis después de día 15: (A) expresión de genes relacionados de etilo-y concentración de acetato de (línea roja), ( SEGUNDO)
mapa de calor de los valores RPKM sumadas de todas las transcripciones relacionadas acetato-contribuyen, ( DO) valores PFOR RPKM por bin, con contenedores más prominentes de relieve en la clave. abreviaturas de genes:
monóxido de carbono deshidrogenasa / acetil-CoA sintasa (CODH / ACS), acetil-CoA decarbonylase / sintasa (ACD / ACSS), piruvato: ferredoxina oxidorreductasa (PFOR), piruvato formato liasa (PFL), piruvato deshidrogenasa
(PDH) , NADP + deshidrogenasa dependiente de piruvato (PDH / NADP +), acetato quinasa (aCKA), fosfato acetiltransferasa (fosfotransacetilasa, PTA), acetil-CoA hidrolasa (ACH), y acetato de: succinato CoA-transferasa (SCT).

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Cestos de múltiples taxones b18, b30, y B94 ( Figura 6C, Suplementaria Cuadro 9).
Caracterización de genes más altamente expresados
Ochenta y un bins contribuyeron a la 100 más altamente expresado ( ≥ percentil
99) los genes más de el 20-día
estudiar; tres grupos taxonómicos, Dechloromonas ( b45), California.
Bathyarchaeota (B89), y Hydrogenophaga ( B117, B174) representó colectivamente,
aproximadamente la mitad (45-56%) de los 100 mejores transcripciones ( La Figura
7). Una lista completa de las 100 transcripciones por día se puede encontrar en la
Tabla Suplementaria
8. Tres tipos de genes se incluyeron constantemente entre los 100 mejores
transcripciones: hidrolasas (hidrolasas más notablemente celulares
wallassociated), subunidades acetona carboxilasa, y transposases.
Bin 89, clasificados como California. Bathyarchaeota, fue el bin mejor
representado entre los 100 mejores-transcripciones en todos los tiempos de
muestreo, de 35 a 49% de los 100 mejores transcripciones ( La Figura 7). California. Bathyarchaeota
es un reciente catión reclasi fi de la archaeal Miscellaneous Crenarchaeota Group
(MCG) ( Meng et al., 2014 ) Y algunos miembros se cree que un estilo de vida de
barrido, el consumo de hidratos de carbono derivados de plantas y proteínas
detríticos ( Lazar et al., 2016 ). Esto fue reflejado por
California. B89 Bathyarchaeota, que expresa numerosas hidrolasas, incluyendo
10 en las 100 mejores ORFs más altamente expresados ​(Cuadro 8). Cuatro de
estas hidrolasas fueron anotados como hidrolasas de pared-asociados a
células; la secuencia traducida con la mejor identidad (99%), pero la baja
cobertura (35%), pertenecía a multivorans Sulfurospirillum DSM 12446, mientras
que el que tiene el mejor la identidad y la cobertura (72 y 73%, respectivamente)
pertenecían a Peptoclostridium di fi cile
CD7. hidrolasas de pared asociada a célula diana peptidoglicano y pueden tener
múltiples funciones, a menudo por la misma enzima ( Wycko ff et al., 2012 ), Tales
como el crecimiento celular (por ejemplo, Höltje, 1995 ), La depredación física en
células bacterianas para los nutrientes (por ejemplo, Lerner et al., 2012 ), Y la
reestructuración comunidad por la orientación selectiva de las especies individuales ( Campana
et al., 2010; Schwarz et al., 2010 ). los California. hidrolasas Bathyarchaeota no, sin
embargo, poseen la NLPC / P60 dominio catalítico conservado asociados con
hidrolasas que se dirigen a peptidoglicano ( Margot et al., 1999; Xu et al., 2009 ).
hidrolasas de pared asociada a las células pertenecientes a otros taxones en el
metatranscriptome hicieron contener este dominio / P60 NLPC. Un árbol filogenético
de todas las transcripciones traducidas hidrolasa mostró que la mayoría de los 100
mejores hidrolasas agrupan y aparte de las hidrolasas que contienen el dominio de
metas de peptidoglicano ( Figura 8, Suplementaria Cuadro 9). Mientras que el sustrato
(s) que estas California. hidrolasas Bathyarchaeota están apuntando es desconocida, la
muy alta expresión relativa de las transcripciones sugiere que desempeñan un papel
significativo en la transformación del carbono en este sistema.
subunidades acetona carboxilasa ( acxA, acxB, acxC) con 97- 99% de identidad
de secuencia traducida a los de Dechloromonas
spp. estaban entre los ORF más altamente expresado en el
metatranscriptome (Tabla 8). Acetona
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Metatranscriptomes de Acuífero Biogeoquímico Hotspot
FIGURA 7 | El número de ORFs de los cubos que contribuyen representados en las 100 mejores
transcripciones en cada punto de tiempo. Bin 89 representa
California. Bathyarchaeota.
carboxilasa se puede utilizar por las bacterias para asimilar CO 2
bajo condiciones anaeróbicas y acetona canal en el metabolismo del carbono
central ( vía acetoacetato). Parece que Dechloromonas puede haber acoplado
catión fi denitri a carboxilación acetona, en particular en el día 5, cuando la
expresión de múltiples genes de cationes fi y carboxilasa acetona denitri eran
todos a la
sus máximos ( Figura 5B). tal nitrato
metabolismo dependiente de acetona ha estado en observado en otros ERS
denitri Fi ( Platina et al., 1990; Dullius et al., 2011; Oosterkamp et al., 2015 ),
Pero no en Dechloromonas.
carboxilasa Acetona pertenecientes a Cloro EXI FL fue observan en este sitio
de campo en un estudio metagenómica anterior y se anotó como fuente
potencial de etilo ( vía acetil-CoA) en el medio ambiente ( Hug et al., 2013 ).
Para explicar la presencia de acetona en este sistema, buscamos evidencia
transcripcional de acetoacetato descarboxilasa, y encontramos estos
transcritos en dos Cloro fl EXI bins (k101_4019724_159251_3 en b46.3 y
k101_1257655_52416_1 en b46.13) y en una Bacteroidetes / Chlorobi
(K101_5859895_221904_4,
compartimiento
B124), aunque con secuencia traducida bajas identidades a una secuencia de
acetoacetato descarboxilasa bien caracterizado de
Clostridium acetobutylicum ( 23-27%) ( Gerischer y Dürre, 1990 ).
Transposases pertenecientes a una variedad de contenedores taxonómicos fueron
prominentes en las 100 mejores transcripciones expresadas. Esto no es sorprendente,
puesto que un estudio de los genes codificantes de proteínas en repositorios de datos (por
ejemplo, semilla, RAST) transposases fi cados como los genes más abundantes en la
naturaleza ( Aziz et al., 2010 ), Una demanda que ha sido apoyada por estudios metagenomic
y metaproteomic en diversos entornos ( Ram et al., 2005; Brazelton y Baross, 2009; Kleiner et
al., 2013 ).
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La Figura 8 | árbol filogenético de hidrolasas expresadas. Las líneas rojas representan ORFs de los 100 mejores transcripciones anotado como hidrolasas de pared asociada de células. Las líneas azules representan hidrolasas de

pared-asociados a células con un dominio catalítico de peptidoglicano-orientación. ORF de California. Bathyarchaeota B89 se muestran en negrita. apoyo valores locales (50-100%) para los nodos se representan como círculos de escala de

pequeño a grande. La expresión (RPKM) para cada ORF en cada punto de tiempo está representado por histogramas apiladas que rodean el árbol. Los valores RPKM, anotaciones, y las identidades de secuencia para cada ORF en este

árbol se pueden encontrar en la Tabla complementaria 9. Las secuencias de hidrolasa fueron alineados con Clustal Omega ( Sievers et al., 2011 ) Y se recorta y se visualizaron con Jalview ( Waterhouse et al., 2009 ).

DISCUSIÓN enriquecimiento relativo de la materia orgánica y el metabolismo microbiano

anaerobio, incluyendo tanto fermentativa y respiratorio [por ejemplo, sulfato y Fe
NRZs se han caracterizado como puntos calientes biogeoquímicos en el sitio fl e (III) reducción] vías, basado en datos geoquímicas y metagenomic ( Campbell et
Ri (y en otras partes) y se han asociado con una al, 2012.; Hug et al.,

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Jewell et al.
2013; Janot et al., 2015 ). Aquí, se investigó adicionalmente la actividad metabólica dinámica
en puntos calientes NRZ en el sitio e fl Ri mediante la integración de metatranscriptomic fi c
cepa específica y metagenomic datos con los datos geoquímicas en microcosmos
anaerobias en el que NRZ acuífero sedimento sirve como la única fuente de
microorganismos y donadores de electrones.
Si bien los datos metatranscriptome fundamentadas principales tendencias indicadas
por los datos geoquímicos (a saber, la mineralización DOM y Acetogénesis),
también nos dieron algunos resultados que
fueron inesperados a la luz de las caracterizaciones previas de NRZs, incluyendo
los siguientes: (1) además del metabolismo fermentativo esperado, que se
observó, dos taxones ( Hydrogenophaga B174 y Dechloromonas b45) mostró una
fuerte evidencia de denitri catión fi, (2) además de metabolismo heterótrofo, que
se esperaba y se observó, tanto el metabolismo quimiolitoautotróficas (con H 2, CO,
y S especies como donadores de electrones) y el metabolismo heterótrofo eran
activos en Hydrogenophaga B174, una cepa que representó la mayor parte de la
metatranscriptome observado en el estudio, (3), además de la utilización esperada
de biomasa de origen vegetal como fuente de carbono y donador de electrones,
que se observó, la evidencia de la pared celular asociada hidrolasas (por ejemplo,
la orientación de peptidoglicano) y acetona carboxilasa entre los genes más
altamente expresado en el estudio sugieren otras importantes fuentes de energía
y de carbono, incluyendo acetona y biomasa potencialmente bacteriana, y (4)
California. Bathyarchaeota, particularmente bin 89, tenía una parte
desproporcionadamente grande presencia en los metatranscriptomes de todas las
muestras, aunque este filo es mejor conocido por sus sedimentos ocurrencia inmarine,
estuarios, y de agua dulce ( Meng et al, 2014.; Evans et al, 2015.; He et al, 2016.; Lazar et
al., 2016 ). A continuación, detallaremos estos hallazgos en el contexto de cómo construir
y ampliar el conocimiento de los estudios existentes de rifle NRZs.
Reducción de nitratos se ha postulado a desempeñar un papel en el metabolismo
NRZ ( Janot et al., 2015 ), Pero esta actividad no había sido documentada en rifle
NRZs antes. El potencial metabólico para la reducción de las especies de NOx ha
sido sugerido por el análisis metagenomic de sedimentos NRZ (por ejemplo, de Ri fl e
bien D04, situada 4,4 m ca. desde bien CMT-03). Por ejemplo, reductasas nitrito ( nirK
y nrfA) se registraron en algunos Cloro reconstruida fl exi genomas en los sedimentos
así D04 ( Hug et al., 2013 ) Y un complejo de NXR aparente (primera describe como
un nitrito: se informó oxidorreductasa nitrato en anammox bacterias) en el
reconstruido RBG-1 del genoma en estos sedimentos ( Castelle et al., 2013 ). Hemos
encontrado pruebas de la transcripción del activo fi cación en denitri Hydrogenophaga B174microbios NRZ (por ejemplo, Hug et al., 2013 ). Sin embargo, los muy altos niveles
y Dechloromonas b45 basado en la expresión de denitri canónica genes fi cationes
(por ejemplo, Figura 5).
En el contexto experimental del presente estudio (por ejemplo, con una comunidad
compleja y fi unde balance de masa definida para los elementos principales), es di FFI
culto de fi identificar nitivamente los donadores de electrones que se acoplaron con denitri
fi cación en Hydrogenophaga B174. Sin embargo, para algunos observaron reacciones
quimiolitoautotróficas, tales como la oxidación del compuesto S y monóxido de
deshidrogenasa “aeróbico” de carbono, de acoplamiento a la reducción de nitrato parece
probable. Esto se debe a la oxidación del compuesto S y “aeróbica” monóxido de carbono
deshidrogenasa estaría limitada energéticamente si junto con aceptores de electrones
menos favorable que O 2
o nitrato [por ejemplo, Fe (III) o sulfato]; de hecho, sólo tienen
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Metatranscriptomes de Acuífero Biogeoquímico Hotspot
sido documentado para ser acoplado con O 2 o nitrato en procariotas
quimiolitoautotróficas, mesófilos (esto excluye photolithotrophs anaeróbicas, las
cuales no son relevantes en nuestro sistema experimental) (lightprotected Dobbek
et al., 1999; Friedrich et al., 2005; King, 2006; Hoeft et al., 2007; Ghosh y la
presa, 2009 ). Puesto que la evidencia geoquímica indica fuertemente que
microcosmos CMT03 eran estrictamente anaeróbico, es razonable deducir que
algunos, tal vez todos, del metabolismo activo de quimiolitoautotróficas Hydrogenophaga
B174 se acopló a la reducción del nitrato / catión fi denitri.
Rifle estudios de acuíferos de las regiones no NRZ también han informado
de la aparición de Hydrogenophaga spp., aunque esto era típicamente en el
contexto de quimiolitotrofía bajo aeróbica / microaerophilic (no nitrato reductoras)
condiciones. Por ejemplo, en estudios de columna a través de OW-FL con
reducida Ri fl e acuífero sedimento
incuba bajo microaerophilic
condiciones, Hydrogenophaga spp. constituía hasta el 98% de la comunidad de las
aguas subterráneas y Fe, S, y se observaron oxidación U ( N'Guessan et al., 2010 );
otro β- quimiolitoautótrofos proteobacterial, tales como Thiobacillus spp., también
fueron prominentes en el sistema y puede haber influido en algunos de esta
actividad. En otro estudio, Hydrogenophaga sp. representaron el 8% de la en el lugar comunidad
microbiana en bio películas asociados con sedimentos acuíferos tras su
modificación de etilo ( Williams et al., 2013 ). Por último, una Fe (II) -oxidizing Hydrogenophaga
cepa (P101) se aisló de Ri fl e las aguas subterráneas en condiciones microaerófilas
( Chan, 2015 ); esta cepa tenía un fenotipo facultativa mixotrófico, en que podría
crecer en un medio orgánico complejo, de baja concentración, así como minerales
ferrosos como FeS y FeCO 3.
Hasta cierto punto, Hydrogenophaga B174 y otros microbios descritos en
este estudio expresado componentes de la
potencial metabólico heterótrofa que se han descrito en estudios anteriores de
metagenome Ri fl e sedimentos NRZ, tales como el metabolismo fermentativo de la
materia y acetogénesis orgánico derivado de plantas (por ejemplo, Hug et al., 2013 ). Por
ejemplo, hemos documentado la expresión de fermentación de la glucosa derivada de
plantas vía glucólisis y PFOR (por ejemplo, Las figuras 4, 7), metabolismo de los
compuestos fenólicos derivados de plantas (por ejemplo,
ferulato y
galato), homoacetogenesis vía la vía de Wood-Ljungdahl (monóxido de carbono
deshidrogenasa / sintasa acetil-CoA), y beta-oxidación de los ácidos grasos, todos
los cuales han sido codificados en genomas reconstruidas de seleccionado Ri fl e
de expresión ( ≥ percentil 99) de carboxilasa acetona y hidrolasas celulares
wallassociated fueron inesperados y tienen implicaciones para el metabolismo
heterótrofo en este sistema NRZ. En Dechloromonas
b45, la expresión de la carboxilasa de acetona y genes fi cación denitri estaban
altamente correlacionados ( Figura 5), y es posible que carboxilasa acetona se
utiliza para asimilar CO 2 y acetona canal en metabolismo central de carbono ( vía
acetoacetato y, finalmente, acetil-CoA) en condiciones desnitrificantes ( Platina y
Schink, 1990 ). Una fuente potencial de acetona en esta comunidad microbiana ( vía
acetoacetato descarboxilasa) se discutió anteriormente. Alternativamente,
también es posible que la reacción de acetona carboxilasa se podría ejecutar en
sentido inverso (como se demuestra in vitro; Platina y Schink, 1990 ), Lo que dió
la energía en forma de ATP a partir de acetoacetato y ADP
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Jewell et al.
(Ecuación 1 para la reacción hacia adelante; Platina y Schink, 1990 ):
CH 3 - CO - CH 3 ( acetona) + CO 2 ( aq) + ATP
+ H 2 O → CH 3 - CO - CH 2 - ARRULLO - ( acetoacetato)
+ H + + ADP + P yo
La reacción inversa es endergónica a pH 7 y las condiciones standardstate ( Platina y
Schink, 1990 ), Pero podría convertirse en exergónica en plausibles (concentraciones
en estado no estándar) de sustrato y de producto. Teóricamente, las fuentes de
acetoacetato para la reacción inversa podrían incluir acetoacetil-CoA (por ejemplo, a
partir de beta-oxidación) y la conversión de acetoacetil-CoA a acetoacetato vía una
reacción CoA-transferasa. Hasta donde sabemos, esta vía de la participación acetona
carboxilasa (a la inversa) no se ha documentado en vivo, pero proporciona una posible
explicación de la expresión muy alta de la carboxilasa de acetona en un sistema que
puede no tener una fuente abundante de acetona. Estos potenciales reacciones
heterótrofas, junto con el potencial de eliminación de la biomasa bacteriana y otras
implicaciones de las hidrolasas de pared asociada de células altamente expresadas
(discutido anteriormente) proporcionar más conocimientos en lo que se conoce sobre el
metabolismo microbiano en NRZs.
La investigación adicional se basará en nuestra comprensión de la dinámica
emergente biogeoquímicos en NRZs. Específicamente, un estudio de campo en curso
implica la liberación de nitratos en un NRZ subsuelo en el sitio fl e Ri, que proporcionará
más información sobre el ciclo del N en estas zonas, donde la reducción de nitrato y
cationes denitri fi parecen ser importantes, y también proporcionará una interesante
comparación de un comunicado de nitrato anterior en un área que no incluía NRZs ( Jewell
et al., 2016 ).
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Metatranscriptomes de Acuífero Biogeoquímico Hotspot
CONTRIBUCIONES DE AUTOR
HB y TJ concebido y diseñado los experimentos. TJ (principalmente), HB, KW
(componente campo), MB (TOC y datos isotópica) y RC (datos respirómetro) llevaron a
cabo los experimentos. TJ y HB analizaron los datos. Reino Unido lleva a cabo
co-ensamblaje, hurgar en la basura, anotación, andmapping de los datos de la
(1)
transcripción. Themanuscript fue escrita por TJ y HB (principalmente) y todos los autores
contribuyeron a re fi nir el texto.
FONDOS
Este trabajo fue apoyado en el marco de el subsuelo
Biogeoquímicos investigación científica área de enfoque financiado por el Departamento
de Energía, o fi cina de la Ciencia, o fi cina de Investigación Biológica y Ambiental de
Estados Unidos bajo el premio número DE-AC02-05CH11231.
EXPRESIONES DE GRATITUD
Agradecemos a Patricia Fox y Peter Nico (LBNL) útil para los debates sobre
los análisis geoquímicos. Este trabajo utiliza el Laboratorio de Genómica
Secuenciación Vincent J. Coates en UC Berkeley, apoyado por el NIH S10
Instrumentación Grants S10RR029668 y S10RR027303.
MATERIAL SUPLEMENTARIO
El Material complementario para este artículo se puede encontrar en línea en:
http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.
2017.00040 / completa # complementaria-material de
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El conflicto de intereses declaración: Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia
de cualquier relación comerciales o financieras que puedan interpretarse como un potencial conflicto de
intereses.
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dieciséis De enero de 2017 | Volumen 8 | artículo 40