3. METODE DE STERILIZARE SI INHIBARE A MICROORGANISMELOR Microorganismele sunt rispandite pretutideni in natura: apa, aer, sol, pe tegumentele gi mucoasele vietuitoarelor, pe obiectele pe care le utilizim. Numeroase microorganisme au un rol important in dezvoltarea planetei noastre si numai un numar mic din totalul celor cunoscute exercité efecte daundtoare cum ar fi alterarea alimentelor sau a altor produse comerviale, producerea unor boli la om, animale si plante. Prima conditie necesara pentru a putea studia un microorganism in cultura pura, pe medii artificial in afara mediului natural, este cunoasterea metodelor care si permit indepartarea sau distrugerea germenilor contaminanti din mediile de cultura, din recipienti $i de pe suprafaja instrumentelor cu care se luereaz8. Existi numeroase metode, alegerea metodei potrivite depinde de natura si proprietatile materialului care va fi sterilizat (sticlarie, cauciue, metal) Termeni de bazii: STERILIZAREA COMPLETA: ansamblul de procedee care au ca scop distrugerea virusurilor si microorganismelor vii prezente intr-un mediu, pe instrumente sau obiectele de laborator atat sub forma lor vegetativa, cat si sub forma de spori: STERILIZAREA INCOMPLETA: ansamblul de procedee care permit distrugerea formelor vegetative ale microorganismelor: ASEPSIA: ansamblul de masuri si metode prin care se evita contaminarea, introducerea din exterior intr-un mediu steril sau cu microbiota specifica, a microorganismelor viabile: DEZINFECTIA: metode chimice prin care sunt distruse toate formele vegetative ale microorganismelor, dar nu si a formelor sporulate; ANTISEPSIA: metode de inléturare sau distrugere a formelor vegetative microbiene, existente pe tegumente, mucoase, pligi, utilizand substanfe antiseptic. in practica sunt utilizati deseori si alti vermen Substanja microbiocida sau germicida (bactericida, fungicida) are efect dezinfectant, de distrugere a microorganismelor in forma vegetativa. Spunem cd o substanti este germicida daca efectul ei se produce cu o vitezd mare si se produce la coneentratii foarte mici de substanta. in aceasta categorie intra substanfele dezinfectante, care in general distrug microbii de pe diferite obiecte neanimate sau de pe suprafete si care au toxicitate ridicatd, ceea ce face contraindicaté aplicarea lor pe tesuturile vii. Exemple: formol, fenol, cloramina. Aleoolul absolut de 96° este un dezinfectant foarte slab, el actioneazé prin coagularea proteinelor. Substanta microbiostatica (bacteriostaticd, fungistatica) are efect antimicrobian, de inhibare a activitatii si procesului de multiplicare celulard. Spunem ca 0 substanti este microbiostaticd daca efectul ei se produce la concentratii relativ mari de substanti, iar viteza de omorare a celulelor este mic. Antisepticele sunt substanfe care au in general, actiune microbiostatied si actioneaza in concentratii mici si pentru timp scurt, ce face posibild aplicarea lor pe tesuturi vii, Exemple: alcoolul etilic de 70°, KMnOs 01%, tinetura de iod, albastru de metilen, verde malachit, acidul boric, H2O>, detergentii, conservanti alimentari etcrugere si inhibare a microorganismelor Caldura useat — Incinerare, inealzire la rosu, sterilizare in etuva, flambare CAldura umeda — Autoclavare,tindalizare, Metode de distrugere pasteurizare, fierbere Agenti chimici — Gaze steritizante, substante dezinfectante (de ex. oxidul de etilend, f-propiolactona) Radiatii — UV, x,y, Bete Filtrare — Filtre cu porozitate diferita in funetie de categoria de microorganisme de eliminat Ultracentrifugare — Sedimentarea Metode de separare Supunere la —Reffigerare, congelare temperaturi joase Deshidratare |» —Conservarea alimentelor prin deshidratare Liofilizare — — Deshidratare sub vid Ia Metode de inhibare temperatura joast Marireapresiunit__ ss amura sirop osmotice ‘Agentii chimici —Substante microbiostatice (dezinfectanti diluati, colorant, conservanti, antibiotice) 3.1.1, Sterilizare prin caldura uscati Incinerarea Incinerarea (metoda de sterilizare completa) consti in arderea materialelor folosite si nerecuperabile, in cuptoare speciale sau crematori, la temperaturi de 300-500°C Utitizaré Metoda se aplic& pentru: cadavre si carcase de animale de experienti infectate, reriduuri organice solide, produse patologice, materiale de unicd folosint& din plastic, vata gi pansamente infectate, etc. Incdlzirea ta rogu Metoda consta in tinerea obiectului metalic in partea superioara a flacdrii unui bee de gaz, pind la inrosirea complet’ a acestuia, inainte si dupa utilizare. Desi prezinta marele dezavantaj al degeadarii in timp a obiectelor metalice, aceasta rmane una dintre metodele cele ‘mai freevent utilizate in microbiologie, Este o metoda de sterilizare completa. Utilizatré Metoda se aplica la sterilizarea obiectelor metalice de dimensiuni mici: firul de plating al ansei si acului de insamantare (inainte gi dupa folosire), spatula si acul de disoFlambarea Metoda consti in trecerea de cateva ori, timp de cateva secunde, prin flacara unui bec de gaz a obiectelor de mici dimensiuni si cu suprafatd neteda. Se sterilizeaza inainte si dupa fiecare utilizare. Flambarea este o sterilizare incompletd. in unele cazuri se utilizeaza flambarea cu alcool, care consti in imersia obiectului de sterilizat in alcool, urmati de flambarea lui la flacdira becului de gaz. Utiliztri Prin aceasta metoda se sterilizeazi: portansa (ansei si a acului de insimantare), suprafafa externa a pipetelor gradate, pipetelor Pasteur, gatul flacoanelor Erlenmeyer, gura eprubetelor, suprafata lamelor pentru fixarea frotiurilor ete. Flambarea cu alcool este folosita la sterilizarea anselor de etalare (ansa Drigalski) si a obiectelor de metal (pense, foarfeci).. Stet Sterilizarea cu aer cald este cea mai eficienta masur de sterilizare si se realizeaza in aparate metalice (etuva, cuptor Pasteur sau Poupinel).. Etuva (a se vedea Anexa 1) poate fi de diferite capacitati si dimensiuni, cu pereti dubli din tabla, termoizolangi. Aparatul este previzut cu 0 sursi de caldura, de obicei o rezistenti electric’ gi un termostat ce permit mentinerea constanté a temperaturii selectate, uniformizats in incinta de sterlizare printr-un sistem de ventilatie, iar produsii' de combustie sunt elimin: printr-un orificiu, situat in partea inferioara a aparatului. in interior se gasesc rafturi de sita metalicd pentru asezarea obiectelor de sterilizat izarea cu aer cald Mod de lucru: 1. Materialele curate, perfect uscate sunt impachetate in hartie de ambalaj, rezistenta la temperaturi ridicate: Obiectele astfel pregatite se ageaza pe rafturile metalice din interiorul aparatului, listind intre ambalaje pentru a facilita circulatia aerului cald si pentru a asigura 0 incalzire omogena. De asemenea, se va evita contactul cu peretii interni ai etuvei pentru ca hartia de impachetat s8 nu se carbonizeze; 3. Se pomeste sursa de caldurd si se regleazd timpul si temperatura necesare sterilizaii Timpul de sterilizare este de 30-60 minute din momentul atingerii temperaturit de 180°C. Prin aceasta metoda se realizeaza o sterilizare completa 4. Dupa terminarea sterilizarii, deschiderea aparatului se realizeazi doar dupa scdderea temperaturii interioare pana la valoarea de 70°C, pentru a evita accidemtele, dar si pentru a proteja sticlaria, care, la contactul cu aerul rece din exterior s-ar putea sparge ca urmare a racirii bruste. 5. Eficienfa sterilizarii cu aer cald la etuva se verificd in mod indirect, observand culoarea hartiei de impachetat, ingalbenirea hartici si a vatei indica o sterilizare completa. in cazul, in care ambalajul are culoarea maron arata faptul ed s-a depasit temperatura de 180°C si ci sterilizarea a fost periclitata. Sub actiunea caldurii, hértia si vata se descompun degajand tun gudron bogat in substanfe antiseptice care vor impiedica dezvoltarea microorganismelor ce urmeazii a fi cultivate in recipientul respectiv. Recipientele trebuie spalate cu alcool si poi cu apa, uscate si sterilizate din nou. Utilicari Aceasti metodi este aplicati la sterilizarea: stickiriei de laborator (eprubete, baloane, 20pipete gradate, pipete Pasteur, plici Petri, anse de etalare din sticla, fiole de recoltare), obiecte din metal (pense, bisturie), obiecte din portelan (mojare, capsule), tampoane de vat pentru recoltare, etc. Obiectele astfel sterilizate pot fi pastrate timp de maxim doua saptamani in dulapuri bine inchise. NYATENTIE: prin acest procedeu nu se sterilizeaza: obiecte din cauciuc, din plastic, seringi cu armaturd metalica sau din plastic, medii de cultura, 3.1.2. Sterilizare prin caldura umeda Fierberea Este 0 metoda de sterilizare incompletd, care nu asiguri distrugerea sporilor si se realizeazA in fierbatoare electrice sau cu gaze, in care temperatura apei ajunge Ia 90-100°C. Se recomanda si se foloseasca apa distilaté pentru a evita depunerea sirurilor. Printr-o fierbere timp de 10-15 minute in apa distilata, marea majoritate a germenilor patogeni sunt distrusi Pentru siguranti, fierberea se realizeaza timp de 30-60 minute, Se recomanda adiugarea a 4- 5% carbonat de sodiu sau potasiu, borat de sodiu, care ridicd cu cateva grade punctul de fierbere si impiedicd ruginirea. Obiectele sterilizate prin fierbere se recomanda a fi imediat izate. Utiliziri Metoda este aplicata rareori in microbiologie, dar se folosea in medicina pentru sterilizarea obiectelor din metal de dimensiuni mici: foarfeci, seringi cu armatur& metalicd, pense, bisturie, ete Pastewi Pasteurizarea, procedeu descris de Pasteur, este o metodi de sterilizare incompletd, putin folosita in microbiologie, deoarece asiguré numai inactivarea formelor vegetative, dar utilizata cu mare succes in industria alimentard, Exist doud tipuri de pasteurizat Pasteurizarea inaltd (2-3 minute la 90°C) ~ Pasteurizarea joasd (30 minute la 63°C) in prezent, in industria alimentara sunt utilizate variante ale pasteurizarii - Flash-pasteurizarea (high temperature- short time- HTST): incalzirea produsului la 75°C, timp de cateva secunde urmati de ricirea brusea a acestuia: - Ultra- pasteurizarea (ultra high temperature): inealzirea produsului la 141°C, timp de 2 secunde, urmata de ricirea brused a acestuia. Utilizaré {in industria alimentara existé instalatii speciale pentru sterilizarea paryiala a anumitor ide (lapte, suc de fructe, bere, vin, conserve). ‘Tindalizarea Este 0 metoda de sterilizare fractionata, descrisa de Tyndall in 1877, care se utilizeaza pentru medii si solujii ce contin substante termolabile, ai céror constituenfi pot fi denaturati sub actiunea temperaturilor ridicate. Comparativ cu pasteurizarea este 0 metoda de sierilizare completa. ‘Tindalizarea consta in trei pasteurizari de cite 60 minute, efectuate la intervale de 24 core, prin imersia recipientelor cu substanje termolabile in bai cu apa sau intr-un autoclay special la temperatura constanté (60-65°C). incalzirile repetate ale mediilor si solutiilortermolabile omoara atét formele vegetative existente inital, cat si pe cele germinate din spori in intervalele dintre incalzi Mod de Iueru: 1, Prima pasteurizare distruge toate formele vegetative din mediul de sterilizat; Incubare la temperatura de dezvoltare adecvata: dupa 24 ore de incubare in conditii optime, eventualii spori prezenti in mediu si nedistrusi in prima etapa germineaza (ajungand in stare vegetativa): 3. A doua pasteurizare distruge sporii care au germinat; 4, Incubare din nou: este posibil ca uneori, uni spori sii nu germineze inainte de a dova pasteurizare, de aceea medi ‘optime de germinare; 5. A treia pasteurizare: asigurd distrugerea tuturor sporilor germinati si oferd siguranta unei tindalizari reusite. 6. Controlul sterilizarii prin tindalizare se verific& prin incubarea la termostat a med lichidelor cu substante termolabile sterilizate astfel, la temperatura de 28-37°C, timp de 24 de ore. Utiticiri in practica microbiologic’, tindalizarea se foloseste la sterilizarea serului, a sangelui, or de cultura cu lapte sau must, solufiilor de zaharuri, de vitamine, pentru inactivarea tunor vaceinuri sau sterilizarea antibioticelor etc. Autoclavarea Sterilizarea cu vapori de apii sub presiune (autoclavarea) este 0 metoda de sterilizare completa care se realizeazi intr-un aparat special, numit autoclav. Este cea mai folositi in practica microbiologica. Autoclavul (a se vedea Anexa 1) este un cazan cilindric asezat orizontal sau vertical, prevazut cu pereti grosi, dubli (rezistenti la presiuni ridicate) si cu un capac greu, gros care se inchide ermetic. Pe capac sau pe invelisul extern al autoclavului se aflé asezate un termometru siun manometru, care indica temperatura si presiunea in interiorul autoclavei. Cu vapori de apa sub presiune se objin temperaturi de peste 100°C, avand un puternic efect sterilizant deoarece denatureazi proteinele celulare si in special enzimele. Durata sterilizirii depinde de temperatura si presiune: 18°C... 0,5 AM serene 90 min, RVC. 1 atm. 20-30 min, 134°C. 2 atm... 10min, Mod de lucru 1. Autoclavul se umple cu apa distilata pana la nivelul gritarului si se aseaza cosurile de sdrmd care contin materialele de sterilizat; se recomand ca materialele de autoclavat sa fie acoperite cu hartie sau folie de aluminiu, pentru ca apa rezultata din condensarea vaporilor si nu ude dopurile si astfel s& conduca la 0 contaminare ulterioara; 2. Se inchide etans aparatul: Se porneste sursa de caldura, avind grija ca supapa pentru eliberarea aerului si fie deschisd, deoarece pentru a realiza o bund autoclavare aerul din interiorul autoclavei trebuie Sa fie eliminat in prealabil, pentru cd amestecul vapori-aer la o presiune data are 0 temperaturd mai micd decat cea a vaporilor de apa puri 4. Cand vaporii ies din autoclay in jet continuu supapa se inchide si se asteapt pan’ la objinerea presiunii dorite: 225. Cand s-a atins presiunea corespunzatoare temperaturii dorite se regleazd sursa de calduri pentru a pastra aceast presiune constanta (in cazul autoclavelor moderne se deschide in mod automat o supapi de siguranta, care asigura pdstrarea constanta a presiunii in aparat): 6. Se asigurai mentinerea temperaturii dorite un anumit timp, cuprins intre 10 si 60 minute, functie de natura si volumul obiectelor/mediilor de cultura aflate la sterilizat; 7. Dupa terminarea timpului de sterilizare, autoclavul se deschide numai dupa ce temperatura ajunge la 70-80°C si presiunea la zero. Deschiderea aparatului inainte de sciderea ‘completa a presiunii poate fi periculoasi si in plus, conduce la decompresie brusca, fapt care provoaci spargerea sticlariei, aruncarea dopurilor si proiectarea lichidelor din recipiente: 8. Se scot din aparat materialele supuse sterilizari. Controlul eficienei sterilizdrit prin auoclavare se poate realiza prin mai multe metode: = fizice: temperatura din interior se controleaz cu ajutorul unui termometru special; ~ chimice: in folosirea unor substante chimice sub forma de pulbere cu punct de topire cunoscut: benzonafiolul-110°C, sulful-115°C, acidul benzoie-121°C; - biologice: in folosirea unor culturi sporulante rezistente la temperaturi ridicate Bacillus stearothermophilus, rezistente la 121°C timp de 5 minute, iar la 130°C timp de | minut, Reusita autoclavarii se verified prin incubarea la termostat a mediilor si lichidelor sterilizate, la temperatura de 28-37°C, timp de 24 de ore Usilizairi Metoda este aplicatd la sterilizarea: tuturor substantelor si obiectelor care nu se degradeaz’ la temperaturi mai mari de 100°C: apa distilatd, solutie fiziologic’, uk parafina, medii de cultura, medii contaminate, instrumente metalice, obiecte cu garnituri sau tuburi de cauciuc, obiecte din plastic rezistent la temperatura (varfurile de la micro automata, pipetele Pasteur), membrane filtrante, vata, tifon ete, 3.1.3. Steri area cu ajutorul radiatiilor Metoda se bazeazai pe actiunea germicida a radiatiilor ionizante sau neionizante, find utilizati in special in sterilizarea suprafetelor si a inedperilor. Radiafiile UV sunt radiatii neionizante, cu efect maxim la lungimea de und de 260 ‘im, determinand distrugerea microorganismelor prin reactii fotochimice primare gi secundare pe care le genereazi la nivelul substratului concomitent cu alterarea structurii acizilor nucleici = ADN si ARN. Radiatiile ultraviolete sunt nocive pentru formele vegetative, avand o actiune mai redusi asupra sporilor. Lampa germicida (lampa UV) este de fapt un tub din sticld speciala in care descarcérile electrice intr-o atmosfera cu vapori de mercur la presiune joast genereaz radiatii ultraviolete. Se foloseste la sterilizarea suprafetelor si la reducerea incAreaturii microbiene a spatiilor de lueru Uriliztri Radiatiile UV (260 nm) sunt foarte letale, dar au o putere sc&zuti de penetrare, motiv pentru care sunt utilizate la sterilizarea aerului din laborator, hotelor, boxelor de lueru suprafetelor plane, meselor de lucru etc. in prezent, majoritatea laboratoarelor de microbiologic sunt dotate cu hota cu flux laminar (a se vedea Anexa 1), 0 incinta in care ‘manipularea materialului biologic se realizeazd tn conditii de maxima siguranta si steriitate. Jn aceasta incinta, aerul este recirculat continuu si sterilizat cu ajutorul unei kimpi UV si cu{iltre speciale tip HEPA (High Efficiency Particulate Air Filires), in timp ce vaporii nocivi sunt ‘ndepairtati cu ajutorul filtrelor din carbon activ sau de tip HEPA. Alte tipuri de radiagii: ‘ye. sunt unde emise cu viteza si energie foarte mare care produc radiatii ionizante la nivelul substratului. Sursa de radiatii gamma sunt in principal izotopii de cobalt (Cow). Aceste radiatii se utilizeaza la sterilizarea a rece a pansamentelor, firelor de suturd, a sticlariei, instrumentelor si manusilor de unica folosinta, a antibioticelor gi hormonilor etc.; X - au efect mutagen si sunt rar utilizate in sterilizare: a- au eficienta ridicata, totusi au o putere slaba de penetrare; Neutronii - sunt agenti sterilizanti foarte eficienti, totusi datorita costului foarte ridieat si a radioactivititii sunt foarte putin’ utiliza Electronii - au o putere de penetrare foarte slaba, dar se pot folosi pentru ste suprafetelor netede. lizarea 3.14, Sterilizarea cu ultrasunete Ultrasunetele sunt vibratii acustice cu frecventt de peste 20 kHz gi sunt utilizate in asa numita metoda de sonicare care asiguré o sterilizare completd. Sonicarea are la bazd dezintegrarea rapida a celulelor microbiene prin ruperea peretelui celular. Ultrasunetele sunt objinute in aparate speciale, numite bai de sterilizare prin ultrasonare (a se vedea Anexa 1) $i sunt generate prin trecerea unui curent altemativ de frecvent& inalta printr-un cristal de cuart care va genera vibratii. Metoda se foloseste la sterilizarea mediilor de cultura termolabile, vase de laborator din materiale plastice, instrumente diverse. 3.1.5. Metode de sterilizare cu substante chimice Sterilizarea (completa sau incompleta) cu substante chimice se practica in laboratoarele de microbiologic pentru sterilizarea materialelor si a obiectelor intrebuinjate sau infectate accidental. Dintre substanfele chimice cu efect sterilizant cele mai folosite sunt: oxidul de etilen’, B-propiolactona, bromura de etil si formaldehida. Metoda este aplicata la steriizarea prin fumigatie sau cu ajutorul unor aparate speciale a aerului din inc&peri, a suprafetelor si aparatelor de dimensiuni mari, a unor instrumente, pulberi uleiuri, medicamente. Dintre substanfele chimice cu efect dezinfectant cele mai folosite sunt: detergenti, sapunuri, halogeni, alcool, sublimat coroziv etc. 3. 1, Metode de sterilizare complet cu substante chimice - Sterilizarea cu oxid de etilend Oxidul de etilend este un gaz care poate distruge germenii prin fixarea la proteinele celulare din produsele termolabile. Este 0 metoda de sterilizare completa si se realizeaza la 54°C, timp de 3-4 ore sau la 38°C, timp 5-8 ore si o umiditate de 40-50%, intr-o incinta de tip autoclay, adaptata special acestui scop, in care se introduc produsele de sterilizat si oxidul de etilend (in concentratie de 700 mg/L). Dupa terminarea sterilizarii se aplic& o puternicd aerare a obiectelor pentru eliminarea gazului rezidual, extrem de toxic. Intrucdt, in stare purd oxidul de etilend este un gaz exploziv, de obicel se foloseste in combinatie cu dioxidul de carbon (80- 90%) sau cu diclorofluorometan. 4Utiticari Metoda este utila in chirurgie si stomatologie, iar in microbiologie se foloseste la sterilizarea materialelor din plastic si a produselor termolabile: seringi, cutii Petri, pipete sau numai varfuri de pipete, anse de plastic ete Recent, oxidul de etilend este autorizat de catre FDA (Food and Drug Administration), ind utilizat ca agent de afumare pentru condimente, folosit pentru conservarea produselor alimentare, in concentratie de 700 ppm. - Sterilizarea cu f-propiolactona (BPL) f-propiolactona se aplic& prin furigatie Ia concentratii de 1-5 mg/L. la umiditate de 75-80% si temperatura de 25°C. pentru sterilizarea completa a suprafetelor plane. BPL are 0 cficienta ridicata, reusind si omoare in cateva minute bacteriile si sporii acestora, ins puterea de penetrare este sc&zuti comparativ cu oxidul de etilend. Usilicairi Metoda este aplicata la sterilizarca camerelor de pital, incintelor etc. In solutie apoast, BPL poate fi utilizata pentru sterilizarea serurilor si a vaceinurilor. 3.1.5.2 Dezinfectia Dezinfectia este 0 metoda de sierilizare incompletd. Dezinfectantele sunt substante chimice cu efect germicid, care se aplica in mod obisnuit pe obiecte neanimate, in scopul distrugerii microorganismelor contaminante. Aprecierea activitatii antimicrobiene a unei substante se realizeaz comparativ cu cea a fenolului, considerat ca etalon. Coeficientul fenolic (IF) este un indice care exprim& puterea microbiocida a unei substanje fafa de cea a fenolului, care are coeficientul fenolic 1, raportata la dou’ specii de microorganisme-test: Salmonella typhi si Staphylococcus aureus. Substantele cu coeficienti fenolici mai mari de I au putere antimicrobiand mai mare decat cea a fenolului, si invers concentratia minima in care substanta X este activa a ‘concentratia in care este activ fenohal Utilicatri in laboratorul de microbiologie sunt folosite numeroase substante dezinfectante si produsi cu rol dublu, dezinfectant si antiseptic, dintre care cele mai importante sunt enumerate in cele ce urmeazi: = Dezinfectanti care altereazii permeabilitatea peretului celular ‘© Detergensii si amoniu cuaternar: sunt substante tensioactive care emulsioneaza lipidele. Au efect bun de curajire mecanica si o puternied actiune germicidd, fiind utilizati la spalarea si curdtarea sticliriei de laborator ‘© Sdpunurile: sunt siruri de sodiu ale acizilor grasi, care actioneazi prin emulsionarea germenilor si indepartarea mecanied a murdariei si implicit a germenilor. 25.zinfectani care denatureazd prowinele (alcoolii, acizii, alealit © Alcoolul etilie (alcool de 70°): este mai eficient comparativ cu alcoolul dublu rafinat (96° aleoolice), deoarece actioneazi mai lent, dar mai profund. Este utilizat la dezinfectia mainilor, a instrumentarului, ete. « Lzopropanolul (in solutie apoasi 70%) are eficienta aproximativ similara ca si etanolul, Ambele solutii sunt bactericide si fungicide, dar nu si sporicide = Dezinfectanti care actioneazd asupra gruparitor active ale proteinelor ‘© Sublimatul coroziv (biclorura de mercur 1%): este 0 substanta dezinfectanta cu o mare putere bactericida (IP=827), dar toxicd. in solutie apoasi de 5%o are efect bactericid, folosindu-se la dezinfectarea obiectelor. in solutie diluat& 1:200 000 sau 1:100 000 are fect bacteriostatic si se poate utiliza la dezinfectia mainilor. © Clorul (solutie apoasit $i gazoasd) yi cloraminele (1F'=200): clorul sub forma gazoasi sau in solutie apoasi este un agent dezinfectant eficient, dar nu si sub forma de sare (NaCl). Sub forma gazoasi este toxic. Sunt folosite la dezinfectia halatelor, a unor obiecte de imbracdminte, a inciperilor si supratetelor, a apei potabile (-3mg°%c), a apelor reziduale, 1 grupurilor sanitare, a piscinelor etc. Hipocloritul de sodiu are o gama largit de utiliziri si este un excelent agent dezinfectant / antimicrobian, © Jodul: ate efect bactericid, folosindu-se in solutie aleoolica (solutiile farmaceutice contin 2% iod si sub 70% alcool) pentru dezinfectia rdnilor usoare. * Fluorul: este eficient sub forma de fluorurd de sodiu, fiind utilizat in produse destinate dezinfectiei cavitatii bucale (1-4ppm). in concentratii mari, fluorul reprezinta 0 otrava. ‘+ Borul (sub forma de borat de soci © Permanganatul de potasiu (KMnO.): compus puternic oxidant utilizat in dilutie de 1:1 000 - 1: 5 000 are efect bactericid, folosit pentru rani usoare. este dezinfectant lejer, utilizat gi pentru mucoase, © Apa oxigenaté (H20y): in concentratie de 3% are un efect bactericid. ¢ Amestecul sulfocromic: este un dezinfectant foarte puternic utilizat in mod constant in laboratorul de microbiologie la dezinfectia pipetelor sia lamelor contaminate. * Formaldehida: are actiune dubla, dezinfectantd si sterilizanta, fiind utilizata atat sub forma lichidi (Solutia de aldehida formicd 40%, numité formol), pentru dezintes suprafetelor de ciment, sticl& sau faiantd, cat si sub forma de aerosoli, la sterilizarea prin fumigatie a incaperilor. La o concentratie de 3,8%, formaldehida are efeet letal pentru formele vegetative si de rezistenta. La prepararea vaccinurilor se foloseste formaldehida in concentratie de 0,04-0,1%,3.1.6. Metode de separare (climinare mecanic’) 3.1.6.1. Filtrarea sterilizanta Filtrarea sterilizanta const in trecerea aerului sau a substantelor (ce se modifica sub actiunea cAldurii) printr-un filtru/membrana filtranta cu pori de dimensiuni foarte mici, care refin toate microorganismele. Exist dou categorii de filtre sterilizante: Membrane filtrame care lucreazit in profiuncime retin microorganismele in toatd grosimea membranei si sunt confectionate din materiale fibroase (azbest, celuloza, fibre de le tasate artificial (caolin poros, stil’ sinter Principalele filtre utilizate in microbiologie sunt: > Filtrele Chamberland: sunt confectionate din portelan si sunt notate cu L. (din care doar Ls-Ly refin toate bacteriile, cu exceptia riekettsiilor); > Filtre Berkefeld: sunt confectionate din pamént de infuzorii si notate in functie de porozitatea lor cu V, N si W. Dezavantajul acestor filtre este imposibilitatea de sterilizare si refolosire, datorita fragilitati lor; > Filtre din sticl& poroasi: sunt notate cu G (Go-Gis), in functie de porozitate. Exemplu, filtrele Gs sunt confectionate din granule de sticla cu porozitatea de 0,1-1,5m si sunt sterilizante. Avantajele acestui tip de filtre: rezista la agentii fizici si chimici; nu modifica pl-ul mediului filtrat; pot fi refolosite de mai multe ori (dupa curatarea si sterilizarea lor), cu conditia de a se lucra cu grija pentru a evita fisurarea lor; > Eiltrele Seitz: sunt confeetionate din azbest amalgamat cu celulozi si pot avea efect clarifiant, adicd de limpezire a unui lichid (notate EK) sau sterilizant (notate EKS). jeari: in industria alimentara (vinuri, sucuri, bere etc.), chimico-farmaceutica (seruri, vaceinuri, medicamente). Membrane filtrante tip ,ecran”, care retin particulele si germenii la suprafafa lor, sunt cconfeetionate din polimeri de celuloza. Porozitatea lor poate fi cuprins& intre 8 um si 10 nm Un astfel de exemplu il constituie membranele filtrante Millipore, care au porozitti cuprinse intre 0,025 si Iu si sunt alcdtuite din acetat de celuloz. Majoritatea bacteriilor pot fi retinute cu ajutorul membranelor de 0,22y, in timp ce pentru drojdii sunt necesare membrane de 0,454. in microbiologic, membranele Millipore se folosese in mod curent in sterilizarea unor ccantitati mari de lichid (medii de cultura, solutii) sau cand se doreste determinarea numérului ji natura microorganismelor la unitatea de volum filtrata in vederea efectuarii controlului microbiologic al unui produs sau cind se doreste concentrarea unui numir redus de microorganisme dintr-un produs lichi. Un sistem de filtrare (figura 3.1) este aleatuit dintr-o palnie din sticla gradata sau simpla si o membrana filtranta sterila care se ageaz pe un suport de susfinere a membranei. Suportul membranei se cupleaza la un balon de colectare sau balon Kitasato prin intermediul tunui dop de cauciue sau cu ajutorul unei cleme de prindere. Pentru ca filtrarea si se realizeze eficient si rapid, intregul sistem este cuplat la o pompa de vid. in vederea executarii unei filtrari corecte, trebuie respectate urmatoarele reguli + inainte de inceperea filtrarii, stickiria folosita si membranele filtrante se sterilizeaza separat prin autoclavare la 110°C, timp de 20 minute: 274 Sistemul de filtrare se monteaza corect, in conditii aseptice, in apropierea faci becului de gaz: ~ Se conecteaza balonul de recoltare (ex. balon Kitasato) la pompa de vid: La inceput, presiunea exercitata la filtrare este mica (100-200 mmHg) si va fi crescuti treptat, dar nu mai mult de 400 mmHg, pentru a evita deformarea porilor sau ruperea membrane: filtrante; ~ Timpul de filtrare nu trebuie si depaiseasca 30 minute, deoarece pot fi antrenate prin filtru bacteriile mici sau cele foarte mobile; Se va evita alternanta de presiune normal si compresiune, care poate afecta capacitatea filtrului de a refine bacteriile: + Lichidul filtrat se recolteazat in conditii aseptice, Pentru sterilizarea unei cantitati mici de lichid sunt mai utile membranele filtrante montate intr-un suport de polipropilena (filtre Whatman Polydise) (figura 3.2), care sunt livrate in ambalaje sterile si pot fi adaptate la seringi, Controtul eficientei sterilizarit Lichidul filtrat poate fi controlat prin incubare la termostat la 28-37°C, timp de 24-48 ore. Utilizatri Aceasti metoda este aplicati pentru sterilizarea mediilor de cultura solutiilor care contin substante termolabile (de exemplu, solutiile de antibiotice, glucide. Vitamine, a serului, ascitei, a mediilor de cultura ce contin lapte, a mediului cu must), pentru sterilizarea unor reactivi, examenul de rutin al aerului, apei, laptelui, izolarea bacteriilor din produse sirace in microorganisme (Insimanjarea filtratului pe medii de cultura); examinarea directa la microscop a bacteriilor retinute pe filtru Pentru decontaminarea hacteriand si fungicd a aerului se utilizeaza aparate speciale care combina mai multe metode de sterilizare: iradierea cu raze UV, ozonizarea si filtrarea aerului prin filtre HEPA. ‘ ; Seer eriny eek, aa S «~ Pine "Fstop pete nee ‘Membr ia pe et ase peri abt ° Fsestalpee f) 4 ‘Transeain coni asepticea eran lane pe med de ata Figura 3.1, Sistem de filtrare 28'A- partile componente ale unui sistem de filtrare Millipore dezasamblat; B - grabirea filtrarii prin crearea de vid cu ajutorul pompei de vid (prelucrare dupa http://georges.dolisi.free.fr/Microbio/TP/Millipore.htm) = Figura 3.2, Filire Whatman Polydise 3.1.6.2. Centrifugarea Centrifugarea este o tehnica rapida si eficienti de separare a microorganismelor de lichidele in care sunt suspendate sau a unor substante cu densitati diferite, cu ajutorul fortei centrifuge, care este mult mai mare decat cea gravitationala, grabind sedimentarea. Fora zgravitationald este un parametru de constructie caracteristic fiecarei centrifugi, care se exprima in unitati gravitationale (g) sau rotatii per minut (rpm). Mod de lueru: Pentru a accelera procesul de separare a microorganismelor se folosesc centrifuga si ultracentrifuga. Centrifugele moderne, denumite si “unghiulare”, asiguri o pozitie find a tuburilor de centrifuga la un unghi de 45°, care permite o separare mai bund a particulelor, dar sio diminuare a incaizirii tuburilor, datorita frecarii cu aerul in timpul centrifuga (a se vedea Anexa 1). Viteza de sedimentare a particulelor la centrifugare depinde de o serie de factori: 4 Marimea particulelor de sedimemat: cu cit particulele sunt mai mici, cu atit forja centrifugal’ si durata centrifugari trebuie si fie mai mari Exemple: fungii (drojdiile si mucegaiurile) sedimenteaz& la minimum 1000-2000 rpm; bacteriile necesita la 2000-4000 rpm: virusurile la 50.000 ~ 150.000 rpm; + Vascozitatea mediului: cu cat vascozitatea mediului este mai mare, cu atit sedimentarea este mai dificila. Exemplu: microorganismele dintr-un suc sedimenteazi mai usor faja de cele din lapte (find mediu bogat in proteine, grasimi). ‘Centrifugarea unei probe se realizeazi astfel: 1. Tuburile de centrifug’ contindnd proba de analizat, care au greutate egal, sunt asezate diametral opus in rotorul centrifugi: Se regleaza turatia si timpul de centrifugare, in conformitate cu valorile dorite; La sfarsitul centrifugarii capacul se va deschide numai dup oprirea completa a rotorului Utilizatri — Limpezirea unor lichide, medii de cultura ~ Concentrarea unor lichide sirace in microorganisme: ~ Separarea unor microorganisme de dimensiuni diferite. 293.1.7. Metode de inhibare a activititii microbiene Antisepsia reprezint& ansamblul de procedee prin care sunt inhibate activitatea si multiplicarea microorganismelor pentru o anumité perioada de timp si se realizeazd prin metode fizice sau chimice. 0 substanja chimicd sau un procedeu fizie pot fi incadrate in categoria bacteriostaricilor sau fungistaticilor daca bacteriile sau fungii iyi pot relua activitatea vitala Ja mai pufin de o ord de la disparitia sau incetarea actiunii agentulu. Principalele metode de inhibare a activitatii microbiene sunt: -Refrigerarea / Congelarea: temperatura scizuta (in frigider la 4°C si in congelator la -20°C) determina inhibarea dezvoltarii microorganismelor pentru un timp limitat. Utiligari: pastrarea alimentelor, pistrarea microorganismelor pentru o perioada determinatl; ~ Deshidratarea: dezvoliarea microorganismelor este inhibatd in medii cu continut scdzut de apa. Utitizari: pastrarea prin uscare a fructelor, legumelor, mezeluri oF, ele.; = Desicarea: procedeu de uscare sub vid in exicator a tulpinilor microbiene. Utilizdri: conservarea microorganismelor; - Liofilizarea: tehnicd de uscare sub vid, la temperaturi joase, realizatd in liofilizator. Utilizari: conservarea timp indelungat a tulpinilor microbiene; “resterea presiunii_ osmotice it @_prin supraconcentrarea mediulut: prin adaos de glucide (in siropuri, dulceturi) sau de sare Utilizari: conservarea fructelor, legumelor, edimii, pestelui, ete - Folosirea agentilor microbiostatici: principalele categorii de agenti microbiostatici ~ antibiotice si agenti chemoterapeutici sintetici, care au spectru specific de actiune. -coloranti (violet de gentiana, albastru de metilen, verde malachit);, -conservanti (acid benzoic sau acid acetic); ~dezinfectanti diluati. Utilizari: in medicina, industria alimentara, cosmetic& 30