Scribd Logo
Upload

Welcome to Scribd!

  • LP-uriTest2Sem1MicroGen - PDF Versiunea 1 PDF

    Uploaded by

    Gavrilas Florin
    14 views28 pages

    Original Title

    LP-uriTest2Sem1MicroGen.pdf · versiunea 1.pdf

    Copyright

    © © All Rights Reserved

    Available Formats

    PDF or read online from Scribd

    Did you find this document useful?

    Is this content inappropriate?

    Report this Document

    Copyright:

    © All Rights Reserved
    Download as PDF or read online from Scribd
    Flag for inappropriate content
    14 views28 pages

    LP-uriTest2Sem1MicroGen - PDF Versiunea 1 PDF

    Uploaded by

    Gavrilas Florin

    Copyright:

    © All Rights Reserved
    Download as PDF or read online from Scribd
    Flag for inappropriate content
    of 28
    6. TEHNICI DE iNSAMANTARE A MICROORGANISMELOR Insamantarea microorganismelor consti in trecerea pe medi de cultura specifice acestora, dintr-o cultura preexistenti, dintr-un produs patologic sau din alte surse: apd, aer, sol, . in vederea izolarii si identificarii taxonomice a acestora. insdmantarea se realizeaza prin trecerea unei cantitati adecvate dintt-o probit pe suprafata sau in profunzimea unui mediu nutrtiv, cu scopul detectirii si izolarii_ unor microorganisme din proba respectiva Inocularea reprezinti trecerea unei cantititi adecvate dintr-o culturé puri, numita inocul, pe un mediu de cultura steril a cdrui compozitie este favorabild cresterii si multipl unei culturi noi. Cultivarea microorganismelor presupune asigurarea condiiilor optime de crestere (aerare, agitare, temperatura si umiditate, prezenfa unor principii nutritive in doze bine determinate etc.), dupa inoculare/insimantarea lor pe un mediu de cultura specific, in vederea obtinerii de culturi microbiene. Exist doud modalititi de cultivare, si anume: = discontinud: consta in cultivarea microorganismelor pe un mediu nutrtiv pana 1a ‘epuizarea substanjelor nutritive, determindnd limitarea inmultirii microorganismelor in functie de disponibilitatile de hrandi si de acumularea unor produse de catabolism. continud cultivarea la nivel de laborator si industrial in instalajii speciale (bioreactoare modeme de diferite capacitati - a se vedea Anexa 1) care oferd posibilitatea reinnoirii permanente a mediului de cultura cu o anumita rata ce se poate regla, dirijarea controlata a tuturor parametrilor necesari (pH, temperatura, agitare, acrare ete.) si care asiguri mentinerea culturii microbiene in faza de crestere logaritmicd pe timp nelimitat. Scopurile insimAnfirii microorganismelor sunt: ‘*examinarea cantitativ (cuantificarea ine&rcaturii microbiene) si calitativa (identificarea taxonomic’) a unei probe luate in lucru; ‘estudiul unor caractere (de exemplu: morfologice, fiziologice, serologice, genetice) a microorganismelor; © obtinerea unor produse biologice (de exemplu: antibiotice, vitamine, polizaharide, enzime, aminoacizi) sintetizate de microorganisme: « conservarea mieroorganismelor in colectii (bainci) de culturi Reguli generale ce se impun pentru efectuarea corect a unei insimantiri Efectuarea corecti, in conditii aseptice, a tehnicilor de insiimantare presupune respectarea urmatoarelor reguli de manipulare: ‘@5i se realizeze in mod steril: inocularea/insamantarea trebuie si se realizeze in conditii aseptice (in hota cu flux laminar sau in apropierea flacarii unui bec de gaz, care asigura 0 zondi aseptica cu diametrul de 30 em); ‘@si se evite diseminarea microorganismelor in mediul inconjuritor si excluderea posibilitatii contamindri cu alte microorganisme a mediului nutritiv pe care il folosim; ‘¢suprafata de Iucru se dezinfecteaz cu un tampon imbibat intr-o solutie dezinfectanta (de cexemplu: spirt, alcool etilic 70%) la inceputul si sfarsitul luerului ‘¢mainile se spala cu sipun atat inainte cat si dupa terminarea luerarii; 41 ‘¢insiimanfarea/inocularea se va face intr-un interval de timp cat mai scurt posit reduce la minim contactul materialului de insiiménjat cu atmosfera ambianti ¢in timpul lucrului se evita conversatia si orice migcare a altor persoane in jurul executantului tuburile si plicile Petri insiméntate se noteazi cu. markerul, far a omite numele si numarul probei, denumirea abreviata a mediului de cultura si data insamanfari ‘instrumentarul (acul, ansa de platina, ansa Drigalski) se va steriliza inainte si dupa folosire. Ansele si acele uscate se flambeazi/incalzesc 1a rosu direct in zona calda a Macdrii unui bee de gaz, in timp ce ansele ude se introduc mai intai in zona rece a flacarii si abia dupa evaporarea lichidului de pe ele se inetilzesc la rosu in zona calda, pentru a evita astfel improscarea” cu material din ansa in jur (figura 6.1). Sterilizarea corecta a ansei/acului de smantare se realizeazA prin flambarea port-ansei céteva secunde si apoi incilzirea la rosu a firului acesteia . pentru a ATENTIE: pentru a nu distruge microorganismele la prelevare din cauza temperaturii ridicate din bucla ansei, aceasta se raceste pe peretii interiori ai eprubetei sau pe capacul plicii Petri pe interior sau prin atingerea mediului de cultura in zona fiiré microorgansime. ‘Ansa Drigalski se introduce in spirt si apoi se flambeaza (alco! flambare), ricindu-se inainte de utilizare prin atingerea capacului cutiei Petri din interior; se va evita atingerea obiectelor si a instrumentarului de lucru sterile (ans microbiologica, ac de insiméntare, pipet etc.) de orice suprafata nesteriba (halat, mas de lucru): + gura eprubetelor si flacoanelor, marginile plicilor Petri din sticlt sterile se vor flamba la deschiderea si inchiderea acestora: ‘¢ scoaterea dopurilor se va realiza prin risucire, fra bruscare, pentru a nu crea curenti care ‘ar putea imprastia sporii germenilor in mediul inconjurdtor: ‘in intervalul de timp in care recipientete trebuie mentinute deschise este obligatorie tinerea acestora intr-o pozitie oblic& si cu deschiderea in imediata apropiere a flacarii becului de gaz: dupa folosire, instrumentarul din sticlé/plastic (pipete gradate si pipete Pasteur, varfuri pentru pipeta automata, obiecte din plastic de unicd folosimta) se va depune in paharul cu amestec dezinfectant ‘¢mediile nutritive insamanjate se incubeazi in termostaV/anaerostat, la temperatura optima de dezvoltare a microorganismelor, pe o perioad& de timp corespunzitoare. De regul’, plicile Petri se depun cu capacul in jos, pentru a evita scurgerea picaturilor de condens de pe capacul plicii pe suprafaja mediului si aparitia coloniilor aditionale: ‘recipientii si mediile contaminate se sterilizeaza (de obicei prin autoclavare), apoi mediile decontaminate se arunca la gunoi, iar sticlaria se spala cu detergent si se clateste bine. Pregittirea insiméngari si timpii de desfagurare ai acesteia = bee de gaz; = produse de dezinfectie (exemplu: sublimat coroziv, alcool etilic ete.); - ansa de platind sau ac de insamantare, ansa Drigalski, pipeta gradata, pipet Pasteur, vairfuri de pipeta sterile, pipete automate; = produsul de insimantat (produs patologie, cultura, ete); - medii de cultura sterile (repartizate in eprubete, baloane, cutii Petri, dupa caz), 42 Figura 6.1 Sterilizarea ansei/acului de insamantare (sursa: Burcea M., 2010) a flambarea unei anse uscate; b- flambarea unei anse ude T+ zona rece a flacarii; 2- zona calda a flicarii, la nivelul creia se realizeaza flambarea si ‘ncdlzrea la osu; 3- punctul eu temperaturd maxima Pregdtirea pentru lucru: stanga becului de gaz se ageazi = stativul cu eprubetele, recipientele sau materialele din care se face prelevarea ‘materialului de insamantat; - eprubetele sau cutiile Petri cu mediul steril pe care se face insiméntarea; ~ alte materiale sterile ce se utilizeaza la insdimantare. ~indreapta becului de gaz se aseazi: I contindnd agent dezinfectant (exemplu: sublimat coroziv 5%) destinat materialelor folosite pe parcursul insimantarii (varfuri de pipet, pipet, anse de unica folosintd, ete.) Cel ce executé operatia de insaméntare trebuie si efectueze mult dexteritate si rapiditate, ceea ce presupune un anumit exercitiu Principalele tehnici de insamantare, in functie de tipul mediilor de pe care se realizez transferul microorganismelor, sunt redate in tabelul 6.1. jngur toate operatiile, cu ‘Tabel 6.1 Principalele tehnici de insamantare utilizate in microbiologic Tipul mediului Instrumentarul utilizat Tehnica de insimantare de cultura folosita Din mediu solid | Cuansa, ac {in mediu lichid Din mediu lichid | Cu ans, ac, pipet ‘in mediu lichid ‘Cu ans pe mediu inclinat ‘Tehnica epuizarii ansei ‘Cuac pe mediu repartizat in coloand Tehnica infeparit | Din medi solid +O sa pe mediu repartizat in placi Petri | Tehnica in sectoare, inmedinsolld Tehnica striurilor (pentagon) ‘Cu ansa pe mediu inelinat Tehnica epuizarii ansei ‘cu ac pe mediu repartizat in coloand Tehnica infeparii Din medi ‘Cu ansa pe mediu repartizat in placi Petri | Tehnica in sectoare, | in mediu solid (pentagon) | ‘Cu pipeta pe mediu repartizat in plicit Pett Tehnica in "gazon” 43 Pentru dobindirea dexteritatii in efectuarea unei insiimantari este necesard cunoasterea si respectarea regulilor prezentate mai sus, cunoasterea si respectarca etapelor de insdimantare ce se succed (figura 6.2), Mod de luerw: Omogenizarea probei de analizat; . Sterilizarea ansei prin incdlzire la rosu: 1 2. 3. Flambarea gurii eprubet 4, Prelevarea materialului microbian in bucla ansei 5. Flambarea gurii celei de a doua eprubete; 6 7. 8 inchiderea eprubetei; Insaméntarea materialului din ansi pe un mediu de cultura; Sterilizarea ansei prin incalzire la rosu ] ee 4 Figura 6.2 Tehnica insimantarii microorganismelor cu ajutorul ansei de platind (sursa: Benson J.H., 1990) 6.1. insimantarea microorganismelor de pe mediu solid pe mediu solid Mediu! agarizat pe care se face transferul poate fi repartizat in placi Petri, in tub inclinat sau in tub drept. Tehnica epuizarii ansei jn bucla ansei ramane © cantitate mic& de biomas’ prelevati care va fi dispersat& sub forma unei linii in zig-zag pe suprafata mediului solid dispus in tub inelinat sau in placa Petri, lisind progresiv un numar mai mic de celule microbiene, crescnd posibilitatea obfinerii unor colonit izolate. Metoda striurilor (figura 6.3) este o variant a metodei epuizirii ansei. Epuizarea ansei se realizeazi trasind cu ansa, pe suprafafa mediului repartizat in placi Petri, grupuri de linii in zig-zag care se intersecteaza unele pe altele. Metoda sectoarelor (figura 6.4) Este de asemenea, o alta varianta a metodei epuizarii ansei, Suprafata plicii Petri se imparte cu markerul in 4 sectoare si se numeroteaz4. insiméntarea se va incepe in primul ind treptat confinutul ansei prin trecerea buclei prin cele 4 sectoare. Inolate coloniale Figura 6.3 a- insimantarea microorganismelor prin metoda striurilor fractionate; b- Obtinerea de colonit izolate dupa perioada de incubare Figura 6.5 insdmantarea microorganismelor pe mediu dispus in tub drept (sursa: Benson J.H., 1990) 4s Tehnica prin inteparea mediului (figura 6.5) Pe mediu solid dispus in tub drept: se realizeazd prin inteparea mediului cu acul de insamantare Mod de lucru: 1. Sterilizarea acului de insimantare; 2. Deschiderea si flambarea gatului eprubetelor. 3, Prelevarea in conditii aseptice a microorganismului dupa racirea in prealabil a acului de ‘nsimanarea pe peretii din interior si introducerea acestuia in eprubeta cu mediu dispus rept; 4. inteparea mediului o singura dati, pe o lungime de 2-3 em: Flambarea si inchiderea gatului eprubetei: 6. Sterilizarea acului de insaméntare si incubarea tubului in termostat la temperatura optima de dezvoltare. 6.2. insimantarea microorganismelor de pe mediu lichid pe mediu lichid Acest tip de insiméntare se reali insamantare. -2i cu pipeta gradatd, pipeta Pasteur sau ansa de Mod de lueru (figura 6.6): 1, Omogenizarea suspensiei microbiene; 2. Sterilizarea ansei de platina; 3. Deschiderea si flambarea gatului eprubetelor/flacoanelor (suspensia microbiand gi eprubeta cu mediu nutritiv steril); 4, Transferul culturii microbiene in tubul cu mediu ster, la interfata aer-lichids 5. Flambarea gatului eprubetelor; 6. Inchiderea ambelor eprubete: 7. Sterilizarea ansei de insiméntare; 8. Dispersarea microorganismului transferat prin agitarea eprubetei temperatura optima de dezvoltare. incubarea la termostat la Figura 6.6 Etapele de insimanjare a microorganismelor din mediu lichid in mediu lichid (sursa: Benson J.H., 1990) 46 6.3. insimdntarea microorganismelor de pe mediu solid pe mediu lichid Se realizeaz cu ansa de insimantare sau cu tamponul steril de recoltare. ‘Mod de lucru (figura 6.7) Sterilizarea ansei de platin’; Preluarea in conditii aseptice a tulpinii microbiene de pe mediu solid repartizat in placd Petris . Deschiderea si flambarea gatului eprubetei continand mediul lichid Eliberarea confinutului microbian al ansci la interfata lichid-aer; Flambarea si inchiderea eprubetel: Sterilizarea ansei de insimantare; Dispersarea microorganismului transferat prin agitarea eprubetei i incubarea Ia termostat la ‘temperatura optima de dezvoltare. Spin eS 1 2 3 Sry <| p 4 5 6 Fr &

    You might also like