Jasminka Nikolić • Branislav Vukanović • Milada Nalesnik

PRIRUČNIK
ZA PRAKTIČNU I SEMINARSKU NASTAVU IZ MEDICINSKE BIOHEMIJE I HEMIJE

KVANTITATIVNA ANALIZA

Uloga kliničko-biohemijske laboratorije je izvođenje kvalitativnih i kvantitativnih analiza

humanih tečnosti kao što su krv, urin i likvor, kao i analiza fecesa, tkiva, konkremenata (kamenaca)
i drugih materijala. Da bi rezultati bili pouzdani i korisni u postavljanju dijagnoze i liječenju,
moraju da se koriste provjerene analitičke metode i odgovarajući instrumenti. U osnovi svih
standarda analitičkog kvaliteta rada nalaze se utvrđeni principi i procedure, koji moraju da se
poštuju. Osnovni faktori su čistoća rastvora reagensa i rastvarača, kvalitet i čisoća laboratorijskog
posuđa, kao i pouzdanost i kvalitet mjerne opreme i odabranih metoda. Neophodno je razumjeti
hemijske reakcije svakog testa i uticaja fizičkih parametara na procedure.

ANALITIČKE TEHNIKE
U KLINIČKO-BIOHEMIJSKOJ LABORATORIJI

Za mjerenje koncentracije konstituenata biološkog humanog materijala, u kliničko-biohemijskoj

laboratoriji, koriste se brojne tehnike. U ovom Priručniku biće opisane i korištene najjednostavnije
tehnike, primjerene uslovima u kojima se rade laboratorijske vježbe.

APSORPCIONE OPTIČKE METODE

Mnoga određivanja u kliničko-biohemijskim laboratorijama su zasnovana na mjerenju energije

zračenja koja može da bude emitovana, propuštena, apsorbovana ili reflektovana pod
kontrolisanim uslovima.

Mjerenje intenziteta elektromagnetnog zračenja i učinka tog zračenja obuhvata izuzetno važne
analitičke metode za kvalitativnu i kvantitativnu analizu supstanci. Fotometrija i
spektrofotometrija se baziraju na interakciji određenog jedinjenja sa elektromagnetskim
radijacijama, usljed čega dolazi do apsorpcije svjetlosti određene talasne dužine. Metode su
jednostavne, ne zahtijevaju izolovanje jedinjenja iz biološkog materijala i kao takve se vrlo često
koriste u kliničko-biohemijskim laboratorijama. Dodatni razlozi zbog kojih se danas,
spektrofotometrijske metode tako često upotrebljavaju su i dostupnost mjernog instrumenta svim
kliničko-biohemijskim laboratorijama, povoljne cijene reagensa koji se koriste, mogućnosti
automatizacije, itd.

Dodatkom nekog reagensa u pripremljeni biološki uzorak nastaje obojeni kompleks, koji apsorbuje
svjetlost određene talasne dužine. Obojeni rastvori apsorbuju svjetlo proporcionalno intenzitetu
boje, a intenzitet boje zavisi od količine jedinjenja u rastvoru. Ovaj princip korišten je u vizuelnim,
a zatim fotoelektričnim kolorimetrima. Kolorimetrija je metoda kojom se određuje koncentracija
nekog rastvora poređenjem sa bojom rastvora poznate koncentracije. Vizuelni kolorimetri se
oslanjaju na ljudsko oko, koje komparira boju rastvora sa obojenim diskovima. Dobijeni rezultati
 Jasminka Nikolić • Branislav Vukanović • Milada Nalesnik
PRIRUČNIK
ZA PRAKTIČNU I SEMINARSKU NASTAVU IZ MEDICINSKE BIOHEMIJE I HEMIJE

su subjektivni i često netačni, što je uslovilo da se vizuelni kolorimetri više ne koriste. U

fotoelektričnom kolorimetru fotoćelija je zamijenila ljudsko oko, što je uslovilo da dobijeni
rezultati budu mnogo objektivniji. Pri fotometrijskim mjerenjima potrebno je monohromatsko
svjetlo.

Propustljivost obojenih rastvora za svjetlo je utoliko manja (a apsorpcija veća) ukoliko je njihova
koncentracija veća, tj. intenzitez boje veći. Sposobnost obojenih rastvora da u manjoj, ili većoj
mjeri, propuštaju svjetlost naziva se transmisija ili transparencija (T). Transparencija predstavlja
odnos između količine svjetla koju rastvor propusti (I) i količine svjetla koje pada na rastvor (I0).

T= I/I0

I je uvijek manje od I0. Transparencija je mjerilo propustljivosti apsorbera za dati snop

monohromatskih talasa, a zavisi od dužine puta kroz rastvor. Ovo formuliše Lambert-ov zakon
koji glasi: Kada zrak monohromatske svjetlosti prolazi kroz medijum (rastvor) koji ga apsorbuje,
intenzitet zraka (svjetlosti) opada eksponencijalno sa porastom dužine puta.
Beer-ov zakon na sličan način povezuje transparenciju sa koncentracijom nekog obojenog
jedinjenja u rastvoru: Kada zrak monohromatske svjetlosti prolazi kroz sredinu koja ga apsorbuje,
njegov intenzitet opada eksponencijalno sa porastom koncentracije jedinjenja koja ga apsorbuje.
Ova dva zakona se kombinuju u Lambert-Beer-ov zakon .

I0
log  a  b  c   log T
I

Povećanjem koncentracije jedinjenja (supstance koju mjerimo) u rastvoru transparencija varira

obrnuto srazmjerno i logaritamski s koncentracijom. Iz ovoga se može izvesti novi termin
apsorpcija (A), ili ekstinkcija (E), koja je direktno proporcionalna koncentraciji.

A =  logT A = a bc

Konstanta proporcionalnosti a definisana kao apsorptivnost (A/bc; c u g/L) ne zavisi od

koncentracije rastvora, već od prirode rastvorene supstance, talasne dužine i temperature. b je put
svjetlosti izražen u cm i c je koncentracija komponente koja apsorbuje svjetlost, a izražava se u
mol/dm3.

Kada je b = 1 cm, a c izraženo u mol/L, konstantu a mijenja ε (epsilon) i označava se kao molarna
apsorpcija.

Grafički prikaz zavisnosti apsorpcije (A) i koncentracije po Lambert-Beer-ovom zakonu daje

pravu liniju, koja prolazi kroz koordinatni početak. Ukoliko izmjerimo apsorpcije (A) za više
različitih koncentracija iste supstance i grafički prikažemo dobili smo standardnu krivu. Uz
pomoć te standardne krive, nepoznata koncentracija istog jedinjenja u rastvoru može da se odredi
iz dobijene apsorpcije (A).
 Jasminka Nikolić • Branislav Vukanović • Milada Nalesnik
PRIRUČNIK
ZA PRAKTIČNU I SEMINARSKU NASTAVU IZ MEDICINSKE BIOHEMIJE I HEMIJE

Direktna proporcionalnost između apsorpcije i koncentracije se mora da utvrdi eksperimentalno

za dati instrument pri određenim uslovima. Često postoji linearan odnos do određene koncentracije
ili apsorpcije. Za ovakve rastvore se kaže da se pokoravaju Lambert-Beer-ovom zakonu. Uz ova
ograničenja iz formule A = a  b  c , može da se izvede kalibraciona konstanta K i koristiti za
izračunavanje koncentracije nepoznatog uzorka upoređujući ga sa standardnim rastvorom.

A = a bc
Prema tome slijedi:

c = A/ab = A ·1/ab

Apsorptivnost (a) i put svjetlosti (b) ostaju konstante u datoj metodi analize; zato se 1/ab može
da zamijeni kalibracionom konstantom K

c=A·K

Vrijednost konstante K (K = c/A) se dobija mjerenjem apsorpcije (A) standarda poznate

koncentracije (c). Konstanta se ne smije koristiti kada standard ili nepoznata očitavanja prelaze
linearni dio kalibracione krive (tj. ako kriva više ne podliježe Lamber-Beer-ovom zakonu).

Dakle, koncentracija neke supstance u rastvoru (na pr. uzorku biološkog materijala) može da se
dobije iz očitane apsorpcije (A) bilo iz kalibracione krive ili računskim putem korištenjem
kalibracione konstante.

Lambert-Beer-ov zakon vrijedi samo za monohromatsku svjetlost pod uslovom da sa promjenom

koncentracije ne dolazi do promjene u jonizaciji, asocijaciji i disocijaciji rastvorenog jedinjenja.

Osnovni dijelovi instrumenta koji mjeri apsorpciju zračenja su: izvor zračenja, monohromator ili
filter, kiveta za uzorak i detektor. Instrument može da ima i druge dijelove kao npr. uređaj za
cijepanje zrake (duble beam), motor za pokretanje monohromatora i dr. U spekrofotometru je
izvor zračenja (svjetla) lampa u kojoj se nalazi gas nekog elementa pod određenim pritiskom.
Dovođenjem energije (električne struje) gasu, ili parama metala, pobuđuju se elektroni koji
emituju određene kvante energije ultraljubičastog i/ili vidljivog zračenja. Najčešće lampe su:
živina, volframova, deuterijeva i kombinacije. Električna struja je izvor energije za lampu.

Sistem za izolovanje zračne energije željene talasne dužine, isključujući druge talasne dužine,
naziva se monohromator. Izolovanje spektra se može postići na više načina uključujući upotrebu
filtra, prizmi ili difrakcionih rešetki. Kombinacija sočiva i otvora može se postaviti ispred, ili iza
monohromatora, da bi svjetlosne zrake usmjerio paralelno, ili da bi izolovao uske dijelove
svjetlosnog zraka. Različiti otvori se mogu koristiti da bi čitavu zračnu energiju usmjerili ka
fotoćeliji.

Najjednostavniji tip filtera je tanko obojeno staklo. Izvjesni metalni kompleksi ili soli rastvoreni
ili suspendovani u staklu apsorbuju pojedinačne talasne dužine i propuštaju samo svjetlost
odabrane talasne dužine kroz filter. Jedinica za mjerenje talasne dužine je nm (10-9 m).
 Jasminka Nikolić • Branislav Vukanović • Milada Nalesnik
PRIRUČNIK
ZA PRAKTIČNU I SEMINARSKU NASTAVU IZ MEDICINSKE BIOHEMIJE I HEMIJE

Stakleni filter nije pravi monohromator, pošto propušta svjetlost relativno širokog opsega talasnih
dužina. Spektralna čistoća filtera, ili nekog drugog monohromatora, obično se opisuje terminima
spektralnih linija. Definiše se kao širina u nm spektralne transmisione krive na tački koja je jednaka
polovini vrha transmisije. Najčešće korišteni stakleni filteri imaju spektralnu liniju oko 50 nm i
potpuno su adekvatni za brojne namjene. Nazivaju se i širokolinijski filteri, a praktičnu primjenu
su našli u kolorimetrima.

Uskolinijski filteri su konstruisani od dielektričnog materijala kontrolisane debljine, stavljenog

između dva tanka posrebrena komada stakla. Debljina sloja određuje talasnu dužinu transmitovane
energije. Imaju usku spektralnu širinu, obično od 5-10 nm i nazivaju se interferentni filtri.

Prizme i refrakcione rešetke se široko primjenjuju kao monohromatori, jer proizvode kompletne
spektre umjesto pojedinačnih talasnih dužina. Izbor tipa monohromatora zavisi od svrhe
analiziranja.

Uzorak koji mjerimo nalazi se u kiveti mjernog instrumenta. Kivete se nazivaju i apsorpcione
ćelije, a mogu da budu okrugle, četvrtaste, ili pravougaone, napravljene od stakla, kvarcnog stakla,
ili plastike. U rutinskom kolorimetrijskom radu obično se koriste okrugle staklene kivete.
Četvrtaste ili pravougaone kivete imaju optičke površine sa konstantnim svjetlosnim putem.
Najčešće korištene imaju dužinu puta svjetlosti 1 cm.

Dva najčešće korištena detektora za mjerenje intenziteta svjetla u ultravioletnom i vidljivom dijelu
spektra su fotoćelije i fotomultiplikatorske cijevi. Fotoćelije se koriste u jeftinijim instrumentima
(npr. kolorimetrima), a fotomultiplikatorske cijevi u skupljim i kvalitetnijim (većina
spektrofotometara).
Apsorpciju (A) na kolorimetra očitavamo na skali, dok spektrofotometri imaju digitalni displej
za očitane vrijednosti apsorpcije (A), a često i pisač kao dodatak.

Mnoga biohemijska jedinjenja posjeduju karakteristične apsorpcione spektre u ultravioletnom ili

u vidljivom dijelu spektra. Poznavanje tih spektara omogućava njihovu identifikaciju i određivanje
količine u nekom biološkom uzorku. Zato je prije analize nekog biohemijskog parametra
neophodno podesiti odgovarajuću talasnu dužinu na spektrofotometru ili izabrati odgovarajući
filter na kolorimetru (Tabela 3.). Primjer: Hemoglobin maksimalno apsorbuje svjetlost na talasnim
dužinama 555 i 430 nm. Oksihemoglobin ima apsorpcioni spektar na 577, 541 i 413 nm. To
uslovljava boju krvi koja se mijenja od tamno crvene (venska krv) do svijetlo crvene (arterijska
krv). Karboksihemoglobin ima apsorpcioni spektar na 577, 535 i 418 nm. Iako malo pomjeranje
apsorpcionog spektra karboksihemoglobina u odnosu na oksihemoglobin, dovoljno je da se otkrije
prisustvo karboksihemoglobina u krvi. Ovo ima veliki sudsko-medicinski značaj u slučaju smrti
usljed trovanja ugljen monoksidom.
 Jasminka Nikolić • Branislav Vukanović • Milada Nalesnik
PRIRUČNIK
ZA PRAKTIČNU I SEMINARSKU NASTAVU IZ MEDICINSKE BIOHEMIJE I HEMIJE

Tabela 3. Obimi apsorbancija za odgovarajuću komplementarnu boju filtera

talasna dužina (nm) oblast boja filtera

< 380 UV nevidljiva

380-440 vidljiva ljubičasta
440-500 vidljiva plava
500-580 vidljiva zelena
580-600 vidljiva žuta
600-620 vidljiva narandžasta
620-750 vidljiva crvena
750-2000 bliska IR nevidljiva

HROMATOGRAFIJA

Hromatografija je separacijska metoda kojom se razdvaja smjesa, manje ili više fizičko-hemijskih
sličnih, supstanci na grupe ili pojedinačne komponente. Nakon separacije može se obaviti
kvantifikacija razdvojenih supstanci pogodnom metodom. Pomoću hromatografije razdvajaju se
brojne supstance: neorganski joni, aminokiseline, šećeri, lipidi, droge, steroidi, nukleinske
kiseline, rastvorivi virusi i specifični materijali, kao što su subćelijski materijali i bakterije.
Razdvajanje se zasniva na dinamičkoj raspodjeli supstanci između dvije faze od kojih je jedna
pokretna (mobilna faza) u odnosu na drugu (stacionarna faza).

Separacija smjese supstanci obavlja se na osnovu nekih fizičko-hemijskih osobina kao što su npr.
lipofilnost (rastvorljivost u lipidima), jonski naboj, veličina molekule itd. Raspodjela se zasniva
na jednom od fizičkih principa: adsorpciji, raspodjeli supstanci između dva rastvarača koja se ne
miješaju, raspodjeli između tečne i gasovite faze, na izmjeni jona ili difuziji u pore određene
veličine. Prema tome, razlikujemo više vrsta hromatografija: adsorpcionu, podionu, gasnu, jonsko-
izmjenjivačku i gel-filtracijsku.

Uprkos činjenici da je hromatografija veoma djelotvorna separacijska tehnika i da joj je

potencijalna primjena u kliničkoj biohemiji izrazito široka ona je u rutini veoma rijetko metoda
izbora. Osnovni razlog je činjenica da je hromatografski postupak veoma spor, a često je potrebna
i posebna priprema biološkog materijala. Rad na savremenim gasnim ili tečnim hromatografima
zahtijeva posebnu edukaciju, tako da se u biohemijskim laboratorijama daje prednost enzimskim i
imunohemijskim metodama. Značajnu primjenu hromatografske metode imaju u toksikološkoj
hemiji i kliničkoj farmakokinetici.

Površinska adsorpciona hromatografija, poznata kao tečno-čvrsta hromatografija (LSC),

najstariji je oblik ove tehnike. Ruski botaničar Tsvet je upotrijebio ovu tehniku 1906. godine da bi
razdvojio biljne pigmente. Koristio je kolonu ispunjenu kalcijum-karbonatom i tehniku je nazvao
hromatografija. Kod adsorbcione hromatografije supstance se razdvajaju na osnovu različite
adsorpcije za adsorbense, koji u tom slučaju predstavljaju stacionarnu fazu. Najčešći adsorbensi
 Jasminka Nikolić • Branislav Vukanović • Milada Nalesnik
PRIRUČNIK
ZA PRAKTIČNU I SEMINARSKU NASTAVU IZ MEDICINSKE BIOHEMIJE I HEMIJE

su silikagel ili aluminijum oksid, koji se nalaze u cijevi (koloni), kroz koju prolazi mobilna faza
sa rastvorenim supstancama.

U kliničko-biohemijskim laboratorijama najviše se koristi diobena hromatografija, koja se

zasniva na razlikama u koeficijentu raspodjele nekih supstanci između dva rastvarača koji se ne
miješaju. U praksi to znači da se hromatografski sistem sastoji od dvije faze, stacionarne i mobilne.
Stacionarna faza je tečnost nanesena na neki inertni nosač (adsorpcijom ili hemijski vezana). U
većini je slučajeva u diobenoj hromatografiji stacionarna faza polarnija, a mobilna manje polarna.
Nosači su celuloza, hidroksiapatiti, neki silikageli itd. Hromatografija na papiru (papirna
hromatografija) tipičan je primjer diobene hromatografije. Kod hromatografije na filter papiru
raspodjela se odvija između vode koja je vezana na celulozu i neke mobilne faze. Filter papir mora
imati dređenu čvrstoću, debljinu, homogenost, kapacitet da primi tečnost i čistoću.

Prema načinu rada razlikuje se silazna, uzlazna i radijalna hromatografija. Kod silazne
hromatografije filter papir se stavi jednim krajem u kadu sa rastvaračima da slobodno visi, tečnost
i nanijeti materijal putuju prema dole. Kod uzlazne hromatografije filter papir se objesi ili savije u
cilindar, da donjim krajem bude u posudi sa rastvaračem. Probe se apliciraju na donjem kraju
papira, a tečnost se kapilarnim silama penje papirom prema gore.

Slika 1. Uzlazna papirna hromatografija

Razlikuju se, takođe, jednosmjerna i dvosmjerna hromatografija. Kod jednosmjerne

hromatografije probe se nanose u obliku tanke crte, nekoliko centimetara od uronjenog kraja papira
u rastvarač. Proba se nanosi mikropipetom, tako da je crta uska i kratka. Nakon toga se papir uroni
u rastvarač koji se nalazi u komori za hromatografiju, koja je prethodno bila zasićena parama
rastvarača (Slika 1.). Ostavi se da front rastvarača dođe do 1-2 cm od kraja papira, pa se papir
izvadi iz komore i osuši. Razvijanje hromatograma se vrši odgovarajućim reagensom (na pr.
ninhidrinom ukoliko se hromatografski razdvajaju aminokiseline). Odnos udaljenosti neke
supstance na hromatogramu, mjerene od starta, prema udaljenosti do koje je stigao front
b
rastvarača, naziva se Rf vrijednost ili retencioni faktor (Rf= ), što je pokazano na Slici 2.
a
Retencioni faktor (faktor zadržavanja) neke supstance je karakterističan za tu supstancu, a zavisi
od uslova hromatografije, tj. rastvarača, vrste papira, odnosno drugih nosača kod drugih vrsta
hromatografije. Pod strogo kontrolisanim hromatografskim uslovima mogu se na osnovu
 Jasminka Nikolić • Branislav Vukanović • Milada Nalesnik
PRIRUČNIK
ZA PRAKTIČNU I SEMINARSKU NASTAVU IZ MEDICINSKE BIOHEMIJE I HEMIJE

izračunatih retencionih faktora, sa hromatograma, identifikovati komponente. Obično se, uporedo

sa probama, na istom papiru, rade i standardi, te se na osnovu njihovog putovanja identifikuju
komponente u probama.

Slika 2. Hromatogram
a - udaljenost fronta rastvarača od starta – pređeni put rastvarača
b - udaljenost izdvojene supstance od starta – pređeni put komponente

Hromatografija na tankom sloju (TLC) je takođe diobena hromatografija. U TLC kao nosač
(stacionarna faza) koristi se čvrsti adsorbens. Najčešće su to celulozni prah ili silikagel naneseni u
tankom sloju (oko 0,2 mm debljine) na staklenu ploču. Nanošenje se vrši specijalnim aplikatorom.
Mogu se nabaviti već pripremljene ploče presvučene raznim sorbentima (silikagelom,
mikrocelulozom i dr). Princip i način rada su kao kod papirne hromatografije, samo se aplicira
manji volumen ispitivanog uzorka (1-5 μL) oko 1 cm od ruba ploče i obično se vrši uzlazna
hromatografija. Razdvajanje komponenti je brže i oštrije u odnosu na papirnu hromatografiju.

Jonsko-izmjenjivačka hromatografija se izvodi na koloni napunjenoj jonskim izmjenjivačem.

To su razne smole s kovalentno vezanim jonskim grupama, za koje se supstance, rastvorene u
mobilnoj fazi, vežu elektrostatskim silama. Dakle, jonska izmjena kao hromatografski princip
zasniva se na činjenici da neki čvrsti materijali imaju naelektrisane grupe, koje elektrostatskim
silama mogu na sebe da vežu jone suprotnog naelektrisanja iz rastvora. Važnu ulogu ima i mobilna
faza, tj. njena jonska jakost. Organske smole, koje se koriste kao jonski izmjenjivači, dijele se na
katjonske i anjonske. Katjonski izmjenjivači imaju na površini negativno naelektrisane
funkcionalne grupe za koje je labilno vezan neki katjon, koji se zamjenjuje rastvorenim katjonom
iz mobilne faze. Anjonski izmjenjivači imaju kovalentno vezane pozitivno naelektrisane grupe na
koje je labilno vezan neki anjon, koji se zamjenjuje sa anjonom iz rastvorene supstance u mobilnoj
fazi. Na ovakvim izmjenjivačima dobro se odvajaju anjonski helati metala, slabe kiseline i neke
aminokiseline. Aminokiseline u jako kiseloj sredini vežu se za katjonski izmjenjivač, zamjenjujući
njegov labilno vezani katjon, a zatim se povećanjem pH eluiraju ponovnom zamjenom katjona.
Na istom principu rade i analizatori aminokiselina, kojima se određuje koncentracija aminokiselina
u biološkom materijalu. Interakcija između izmjenjivača i rastvarača, pri jonsko-izmjenjivačkoj
hromatografiji, sastoji se u potiskivanju supstance koja je vezana za izmjenjivač jonima iz
rastvarača. Ne mora uvijek da bude neophodno da je jonski naboj jona iz mobilne faze veći od
 Jasminka Nikolić • Branislav Vukanović • Milada Nalesnik
PRIRUČNIK
ZA PRAKTIČNU I SEMINARSKU NASTAVU IZ MEDICINSKE BIOHEMIJE I HEMIJE

jonskog naboja supstance koja se eluira, ali su joni iz rastvarača u znatnom suvišku u odnosu na
supstancu koju treba odvojiti.

Gel-filtracijska hromatografija zasniva se na razdvajanju komponenti smjese na osnovu veličine

molekule. Stacionarna faza pri tome je obično sastavljena iz gelirajućih hidrofilnih čestica
dekstrana (Sefadex), poliakrilamida ili agaroze. Čestice su međusobno povezane da u njima ostaju
porozni otvori i kanalići. Kada se na kolonu napunjenu takvim gelom nanese mobilna faza sa
rastvorenim materijalom, koji se želi rastaviti na sastavne komponente, molekule čija je veličina
manja od pora, lakše ulaze u pore i tu se „zaglavljuju“, dok veće molekule ne mogu da uđu u pore,
prolaze kroz relativno velike međuprostore između čestica stacionarne faze (Slika 3.). Na taj se
način u eluatu s kolone pojavljuje komponenta s velikim molekulama, a što komponenta ima manje
molekule, to više zaostaje.

Slika 3. Gel-filtracijska hromatografija

Pripremljeno prema J. M. Berg and all, Biochemistry, 5th ed.

Gel-filtracijska hromatografija se koristi za odvajanje hidrofilnih, ili hidrofobnih materija u

zavisnosti od vrste upotrijebljenog gela. Hidrofilni gelovi su naročito pogodni za odvajanje
sastojaka u vodenim rastvorima (npr. enzimi, antitijela, proteini, hemoglobini, polisaharidi i
nukleinske kiseline). Hidrofobni gelovi su pogodni za odvajanje sastojaka koji su rastvorivi samo
u organskim rastvaračima. Tako hidrofobni gelovi služe za razdvajanje triglicerida i masnih
kiselina.

Afinitetna hromatografija se zasniva na specifičnoj reakciji između dvije molekule od kojih je

jedna vezana za sorbens, a druga se nalazi u mobilnoj fazi. To može da bude na pr. vezanje enzima
na inhibitor, vezanje antigena na antitijelo, ali i neki drugi slučaj u kome se dvije supstance
specifično vežu. Nepokretna faza se u afinitetnoj hromatografiji priprema imobiliziranjem
molekula (nazvanog ligand) na nosaču, direktno ili preko „vezujuće ruke“. Dužina i naboj
„vezujuće ruke“ su odlučujući za sposobnost nepokretne faze da specifično vezuje i otpušta
sastojke. Nosač mora da bude neaktivan, što je moguće više, da bi se spriječila nespecifična
adsorpcija. Regulisanje pH i jonske jačine je neophodno da bi se postigle čvrste veze između
 Jasminka Nikolić • Branislav Vukanović • Milada Nalesnik
PRIRUČNIK
ZA PRAKTIČNU I SEMINARSKU NASTAVU IZ MEDICINSKE BIOHEMIJE I HEMIJE

sastojaka i liganda. Ako je međudejstvo sastojka i liganda specifično, sastojak može biti pomjeren
u jednom koraku uz dodatak supstrata ili inhibitora, naizmjeničnom promjenom pH ili jonske
jačine, ili dodavanjem agensa za prekidanje vodoničnih veza. Značaj afinitetne hromatografije leži
u njenoj selektivnosti. U kliničko-biohemijskoj laboratoriji koristi se u preparativnom odvajanju
proteina i antitijela. Odvajanje glikoziliranog hemoglobina od ostalih hemoglobina afinitetnom
hromatografijom je značajna primjena ove analitičke tehnike.

Gasna hromatografija (GC) predstavlja proces kojim se mješavina komponenata u isparivom

obliku odvaja na svoje sastojke, kretanjem pokretne (gas) faze preko nepokretne faze. Pojedinačne
komponente uzorka će pod kontrolisanim uslovima biti prisutne djelimično u nepokretnoj i
djelimično u pokretnoj fazi u skladu sa pritiskom pare. Komponente sa visokim pritiskom pare (tj.,
one koje brzo isparavaju) biće brže eluirane nego druge sa nižim pritiskom pare. Ako jedna
komponenta ima selektivnu interakciju sa nepokretnom fazom, a druga ima manji stepen
interakcije, razlike u eluciji i efikasnosti odvajanja biće povećane.

Tečna hromatografija (LC) je postupak kojim se mješavina komponenata razdvaja na njene

sastavne komponente pomoću protoka tečnosti (npr. pokretna faza) preko nepokretne faze. Tečna
hromatografija pod visokim pritiskom (HPLC) je vrsta tečne hromatografije koja efikasnije
odvaja komponente iz mješavine. Mobilna faza se pod pritiskom ubrizgava u HPLC aparaturu
(Slika 4.) i u neprekidnom toku prelazi preko stacionarne faze. HPLC ima veliki značaj u analitici
lijekova, a primjenjuje se za razdvajanje, kvalitativnu i kvantitativnu analizu smjese aktivnih i
neaktivnih supstanci koje ulaze u sastav farmaceutskih doziranih oblika.

Slika 4. Hromatograf je instrument kojim se vrši hromatografska analiza

 Jasminka Nikolić • Branislav Vukanović • Milada Nalesnik
PRIRUČNIK
ZA PRAKTIČNU I SEMINARSKU NASTAVU IZ MEDICINSKE BIOHEMIJE I HEMIJE

signala (mV)
Intenzitet
vrijeme (min)

Slika 5. Hromatogram
Vizualni prikaz rezultata hromatografskog postupka.
Svakoj supstanci (A, B i C) odgovara određeni pik na hromatogramu

ANALIZA AMINOKISELINA

Zahvaljujući osobinama aminokiselina, kao što su molekularna veličina, električno naelektrisanje,

moguće je njihovo razdvajanje, identifikacija i kvantitativno određivanje.

Aminokiseline je moguće analizirati:

 hromatografski (tankoslojna, papirna, na koloni, gasna, tečna...)
 elektroforetski
 na osnovu specifičnosti pojedinih aminokiselina

Tri su nivoa testova za analizu aminokiselina i to:

1. „screening“ testovi
2. tačna identifikacija nepoznate aminokiseline ili metabolita
3. kvantitativni testovi

Početni „screening testovi“ obuhvataju primjenu:

 tankoslojne hromatografije
 bojenih reakcija sa urinom
 Guthrie-v mikrobiološki test

Hromatografske tehnike se najčešće koriste za analizu aminokiselina i obuhvataju 3 stepena:

pripremu uzorka, hromatografsko razdvajanje i identifikaciju razdvojenih aminokiselina.
Neophodno je da dijete bude na normalnoj ishrani, prije uzimanja uzoraka. Uzorke krvi i urina je
potrebno uzimati istovremeno. Plazmu treba odmah odvojiti i ne smije biti hemolizovana
(koncentracija aminokiselina u eritrocitima je veća nego u plazmi). Ukoliko se analiza
aminokiselina ne radi odmah, uzorke plazme, urina ili likvora neophodno je zamrznuti do
analiziranja. Neposredno prije analiziranja potrebno je pripremiti uzorke tjelesnih tečnosti ili tkiva,
tako što će se ukloniti proteini, lipidi, neorganske soli i druge supstance, koje bi mogle interferirati
s hromatografskim razdvajanjem. U plazmi ili serumu se prvo uklanjaju proteini,
deproteinizacijom sa sulfoslicilnom kiselinom ili nekim drugim taložnim sredstvom. Nakon
centrifugiranja i odvajanja supernatanta, vrši se ekstrakcija sa nekim rastvaračem, primjenom
jonskoizmjenjivačkih smola ili elektrodijalizom (uklanjanje soli iz supernatanta). Za urin i likvor
 Jasminka Nikolić • Branislav Vukanović • Milada Nalesnik
PRIRUČNIK
ZA PRAKTIČNU I SEMINARSKU NASTAVU IZ MEDICINSKE BIOHEMIJE I HEMIJE

(relativno razblaženi uzorci), prethodni tretman je nešto jednostavniji. Najčešće se izvodi

jednodimenzionalna ili dvodimenzionalna tankoslojna hromatografija (bolje razdvajanje
aminokiselina). U jednodimenzionalnoj tankoslojnoj hromatografiji, kojom se identifikuje većina
aminoacidopatija, primjenjuju se standardne smješe aminokiselina.

Kvalitativni testovi, zasnovani na bojenim reakcijama urina sa pojedinim reagensima (feri-

hlorid, cijanid/nitroprusid, 2,4-dinitrofenilhidrazin, nitrozonaftol) se koriste za „screening“
ispitivanja poremećaja metabolizma aminokiselina. Pri izvođenju ovih testova, dolazi do
karakteristične promjene boje, koja nastaje u reakciji sa odgovarajućim metabolitom, tako npr. u
slučaju fenilketonurije feri-hlorid daje tamnoplavozelenu boju sa fenilpiruvatom iz urina;
prolazna zelena boja u reakciji feri-hlorida sa p-hidroksifenilpiruvatom se javlja u slučaju
tirozinurije, prolazna plava boja u reakciji sa homogentizinskom kiselinom u slučaju
alkaptonurije itd.

Guthrie-v mikrobiološki test je jedan od testova, koji se primjenjuju u sklopu rutinskog

neonatalnog skrininga za detekciju fenilketonurije i kongenitalne hipotireoze. Fenilketonurija
je nasljedno recesivna metabolička bolest, čiji je uzrok nedostatak ili smanjena aktivnost enzima
fenilalanin hidroksilaze, koja oksidiše fenilalanin u tirozin, te se uslijed toga fenilalanin (unijet
hranom, kao sastavni dio proteina) ne metaboliše, već se nakuplja u tjelesnim tečnostima, a
izlučuje urinom. Povećana koncentracija fenilalanina djeluje toksično na ćelije centralnog nervnog
sistema, dovodeći do razvoja mentalne retardacije, poremećaja psihomotornog razvoja i
epileptičnih napada. Pravovremena dijagnoza i terapija fenilketonurije (dijeta sa posebnim
mješavinama aminokiselina, bez fenilalanina – nerijetko je doživotna) obezbjeđuje normalan
psihomotorni razvoj oboljele djece.

Guthrie-v test se izvodi u prvoj nedjelji života novorođenčeta, pod uslovom da je dijete prethodno
jelo barem 48 sati. Novorođenčetu se uzima kap krvi iz pete (zasjecanjem kože) na specijalni filter
papir, da bi se nakon određene pripreme, u uzorku odredile koncentarcije fenilalanina, tiroksina
(T4) i tireostimulirajućeg hormona (TSH). Guthrie-v test inhibicije bakterijskog rasta se izvodi na
agaru, koji sadrži inhibitor rasta specifičan za aminokiselinu, koja se određuje. Kao inhibitori za
otkrivanje fenilketonurije (L-fenilalanin) koristi se β-2-tienilalanin, za otkrivanje homocistinurije
(L-metionin) - metioninsulfoksin itd. Na agar, koji uz inhibitor sadrži i bakterijske spore Bacillus
subtilis, dodaje se krv ili urin i nakon inkubacije, posmatra rast bakterija. Ako je u uzorku povećana
koncentracija ispitivane aminokiseline, umanjuje se djelovanje inhibitora i dolazi do pojačanog
rasta bakterija. Kako bi se izbjegli lažno negativni rezultati, uzorak ne smije sadržavati antibiotike,
a svaki pozitivan nalaz treba potvrditi kvantitativnim fluorometrijskim i enzimatsko-
kolorimetrijskim testom (Quantase) ili hromatografski (HPLC), a moguća je i kombinacija sa
masenom spektrometrijom. Granična normalna vrijednost koncentracije fenilalanina, za Guthrie-
v test je 4 mg/dL (240 µmol/L) fenilalanina, odnosno za fluorometrijsko i enzimatsko-
kolorimetrijsko određivanje 2 mg/dL (120 µmol/L).
 Jasminka Nikolić • Branislav Vukanović • Milada Nalesnik
PRIRUČNIK
ZA PRAKTIČNU I SEMINARSKU NASTAVU IZ MEDICINSKE BIOHEMIJE I HEMIJE

fenilalanin
Slika 6. Uzorak krvi za Guthrie-v test uzima se
zarezivanjem kože na peti novorođenčeta

ELEKTROFOREZA

Elektroforeza je proces u kome rastvorema supstanca, ili čestica efektivnog naboja (q), putuje u
viskoznom puferu, pod djelovanjem električnog polja, prema jednoj od elektroda, zavisno od
prirode njezinog naboja. Mnoge molekule posjeduju naelektrisanje i zahvaljujući tome migriraju
u rastvoru, kroz koji se propušta struja, ka elektrodi suprotnog naelektrisanja. Za elektroforezu
malih naelektrisanih jona koristi se naziv jontoforeza, tako da se pod nazivom elektroforeza obično
smatra putuvanje koloidnih naelektrisanih čestica, odnosno makromolekula, kao što su proteini.

Elektroforetska pokretljivost zavisi od brojnih faktora, kao što su:

 veličina, oblik, koncentracija, električni naboj, stepen hidracije i disocijacije čestice

 viskoznost, pH, temperatura i jonska jačina pufera
 jačina električne struje
 vrijeme putovanja

Da bi se tokom elektroforeze naelektrisanje čestica održalo konstantnim potrebno je da se jonska

jačina, pH, viskoznost i temperatura pufera ne mijenjaju u toku elektroforeze.

Brzina putovanja molekule u električnom polju (v) može se izračunati iz jačine električnog polja
(E), naboja (naelektrisanja) molekule (q) i koeficijenta trenja (f).

E q
v=
f

Sila putovanja koja djeluje na molekulu, koja putuje stalnom brzinom, jednaka je otporu trenja
koji čestica mora da savlada u viskoznom puferu.

Jačina električnog polja (E) zavisi od razlike potencijala između elektroda (U) i udaljenosti između
elektroda (d):
 Jasminka Nikolić • Branislav Vukanović • Milada Nalesnik
PRIRUČNIK
ZA PRAKTIČNU I SEMINARSKU NASTAVU IZ MEDICINSKE BIOHEMIJE I HEMIJE

U
E=
d

Koeficijent trenja (f) zavisi od oblika i veličine migrirajuće molekule i viskoznosti medija (η), za
molekulu sfernog oblika radijusa (r).

f = 6 πηr

U biohemiji se često koristi izraz elektroforetska pokretljivost (mobilnost) (μ). Pod određenim
uslovima elektroforetska pokretljivost čestica je fizička konstanta. Ona je direktno srazmjerna
naboju čestice, a obrnuto veličini molekule i viskoznosti pufera.

v q
μ= =
E f

Elektroforetski se mogu razdvojiti i molekule koje imaju jednako naelektrisanje, u definisanim

uslovima elektroforeze, ukoliko se razlikuju po veličini i/ili obliku, jer u tom slučaju na njih djeluje
različita sila otpora.

Veličina molekula djeluje negativno na njihovu pokretljivost, ukoliko su veće, utoliko se sporije
kreću, usljed povećanja sile trenja i elektrostatske interakcije sa okolnom sredinom. Oblik
molekula takođe utiče na pokretljivost. Primjer su fibrilarni i globularni proteini iste molekulske
mase, a kreću se pri elektroforezi različitim brzinama. Brzina pokretljivosti direktno je
proporcionalna jačini struje, koja mora da bude konstantna u toku cijelog procesa razdvajanja
čestica. Količina električne struje koja se koristi u elektroforezi ograničena je zbog stvaranja
toplote. Porast temperature dovodi do porasta jonske pokretljivosti i slobodne difuzije, kao i
smanjenja viskoznosti pufera. Grijanje elektroforetskog sistema glavni je problem pri izvođenju
svih elektroforetskih tehnika.

Pri elektroforezi u slobodnom rastvoru (slobodna elektroforeza) molekule prisutne u rastvoru,

putuju usljed difuzije, u širokim zonama. Ova pojava se znatno umanjuje primjenom inertnih
nosača, kao što su papir, tanki sloj SiO2, Al2O3 ili celuloza. Elektroforeza na papiru i tankom sloju
(Slika 7.) primjenjuju se za razdvajanje manjih molekula (aminokiselina, peptida, ugljikohidrata
itd.). Za razdvajanje makromolekula (proteina i nukleinskih kiselina) koristi se agarozni ili
poliakrilamidni gel.

Slobodna elektroforeza (Tiselius) prva je elektroforetska tehnika primjenjena za odvijanje

naelektrisanih čestica. Izvodi se u čistom puferskom rastvoru u cijevi slova „U“, koja je jednim
krajem spojena sa anodom, a drugim s katodom. Zonska elektroforeza označava putovanje
naelektrisanih čestica unutar granica čvrstog elektroforetskog nosača, a ime je dobila jer je svaka
naelektrisana čestica, nakon odvajanja, izolovana u pojedinačnu zonu na elektroforetskom nosaču.
 Jasminka Nikolić • Branislav Vukanović • Milada Nalesnik
PRIRUČNIK
ZA PRAKTIČNU I SEMINARSKU NASTAVU IZ MEDICINSKE BIOHEMIJE I HEMIJE

Adsorpcija je svojstvo nekih elektroforetskih nosača, posebno papira i agara, koji slično „učinku
prosijavanja“ smanjuje elektroforetsku pokretljivost čestica koje se odvajaju. U rijetkim
slučajevima adsorpcija može da doprinese boljem odvajanju čestica.

Elektroendosmoza je pojava koja se događa u toku elektroforeze na papiru, acetatnoj celulozi i

agaru. U dodiru sa vodom ovi elektroforetski nosači postaju negativno nabijeni zbog adsorpcije
hidroksilnih jona. Pozitivni joni iz rastvora nakupljaju se oko ovih nepokretnih jona
elektroforetskog nosača stvarajući jonski oblak sastavljen od pretežno pozitivnih jona. Potencijal
koji nastaje između nepokretnih negativnih jona i pozitivnog jonskog oblaka nazvan je
elektrokinetičkim potencijalom, ili zeta-potencijalom. Djelovanjem električne struje negativni joni
elektroforetskog nosača ostaju nepokretni, a pozitivni joni slobodno putuju prema katodi. Budući
da su joni u rastvoru veoma hidrirani, njihovo kretanje dovodi i do kretanja rastvarača. To
putovanje pozitivnih jona pufera i rastvarača, u odnosu na nepokretni elektroforetski nosač
nazvano je elektroendosmozom. Nabijene čestice makromolekula koje putuju u suprotnom
smijeru moraju da savladaju ovaj tok hidriranih pozitivnih jona. Ako je sila elektroforeze slabija
od elektroendosmoze putovanje čestica makromolekula biće prema katodi. Sila eloktroendosmoze
stalna je u svim tačkama duž elektroforetskog nosača.

Slika 7. (a) elektroforetska kada, sadrži dva puferska dijela, spojena s anodom i katodom
(b) papirna traka sa razdvojenim česticama
 Jasminka Nikolić • Branislav Vukanović • Milada Nalesnik
PRIRUČNIK
ZA PRAKTIČNU I SEMINARSKU NASTAVU IZ MEDICINSKE BIOHEMIJE I HEMIJE

Budući da se elektroforetske tehnike primjenjuju za analizu više vrsta bioloških materijala, postoje
i različiti agensi za njihovu detekciju. Proteini nemaju boju (osim u slučaju kada sadrže prostetsku
grupu, kao što je npr. hem), i zato se njihov položaj na elektroforetskom nosaču ne može da vidi
neposredno. Elektroforetski razdvojeni proteini detektuju se nakon bojenja, imunofiksacije, ili
drugih postupaka. Enzimi se detektuju zimogramskim tehnikama (koristi se reakcija koju
katalizuje ispitivani enzim, da bi nastao proizvod koji može da se detektuje). Nukleinske kiseline
mogu da se detektuju bojenjem ili tehnikom molekularne hibridizacije. S RNA ili DNA probama.

Slika 8. Denzitometar
Nakon što su razdvojene frakcije, na traci za elektroforezu (papir, celogel i dr.) učinjene vidljivim,
moguće je da se dobiju i kvantitativni rezultati. Traka sa obojenim frakcijama analizira se u
denzitometru (Slika 8.). Pomjeranjem trake preko izvora monohromatske svjetlosti u denzitometru
obojene zone (razdvojene frakcije) apsorbuju monohromatsku svjetlost, a na pisaču se ispisuje
kriva koja se naziva elektroferogram (elferogram, u slučaju proteina proteinogram). Elferogram
predstavlja dijagramski prikaz frakcija, na kome svaki pik predstavlja jednu elektroforetsku
frakciju proteina. Pikovi mogu da predstavljaju desetine, i stotine, različitih proteina, koji pod
datim uslovima pH imaju istu brzinu migracije.
Primjena elektroforetskih tehnika u medicinsko-biohemijskim laboratorijama je mnogostruka.
Svakodnevnu primjenu ima elektroforeza na acetatnoj celulozi ili agarozi, koja omogućava
procjenu približne koncentracije serumskih bjelančevina ( albumin, α1-antitripsin, haptoglobin, α2-
makroglobulin, C3, transferin, IgA i IgG), tipiziranje lipoproteina, razdvajanje izoenzima laktat
dehidrogenaze, kreatin kinaze i drugih enzima, te detekciju patoloških hemoglobina.
Elektroforeza na akrilamidnom gelu primjenjuje se za analizu tjelesnih tečnosti s niskim
sadržajem bjelančevina kao što su urin, cerebrospinalna tečnost, saliva, eksudati i transudati i
analizi sastava bjelančevina ćelijskih i tkivnih homogenata.
 Jasminka Nikolić • Branislav Vukanović • Milada Nalesnik
PRIRUČNIK
ZA PRAKTIČNU I SEMINARSKU NASTAVU IZ MEDICINSKE BIOHEMIJE I HEMIJE

Slika 9. Aparatura za gelsku elektroforezu

Gel suzbija konvektivne struje nastale usljed malih temperaturnih gradijenata, što je neophodno
za postizanje efektivnog razdvajanja. Takođe, gel služi kao molekulsko sito. Molekule koje su
male u poređenju sa porama gela lako se kreću kroz gel, dok su molekule koje su veće od pora
gela gotovo nepokretne. Akrilamidni gel je termostabilan, transparentan i relativno hemijski
inertan. Nenaelektrisan je, tako da je efekat elektroendosmoze uklonjen. Veličina pora može da se
kontroliše izborom različitih koncentracija akrilamida i metilenbisakrilamida (reagens za poprečno
vezivanje) i vremena polimerizacije. Aparatura za gelsku elektroforezu prikazana je Slikom 9.

Slika 10. Nakon završenog elektroforetskog postupka na gelu proteini su obojeni bojom Coomassie blue,
koja se vezuje za proteine, ali ne i na gel.
Metodom nativne poliakrilamidne gelske elektroforeze proteini se razdvajaju na osnovu
naelektrisanja i veličine molekula. Pri tome se struktura proteinskih molekula ne mijenja, ona
ostaje nativna, što znači da proteini pri ovoj elektroforezi ne gube svoje biološke funkcije. Očuvana
ostaje i kvaternarna struktura proteina, tako da ova metoda nije povoljna za razdvajanje
podjedinica.

Poliakrilamidnom elektroforezom u prisustvu natrijevog dodecilsulfata proteini se razdvajaju na

osnovu razlika u molekulskim masama. Elektroforetsko razdvajanje se vrši u denaturišućim
uslovima. Ovaj tip elektroforeze omogućava brzo određivanje broja različitih proteina u smjesi
 Jasminka Nikolić • Branislav Vukanović • Milada Nalesnik
PRIRUČNIK
ZA PRAKTIČNU I SEMINARSKU NASTAVU IZ MEDICINSKE BIOHEMIJE I HEMIJE

koja se analizira, kao i određivanje molekulske mase proteina, a u medicinskoj biohemiji koristi
se za razlikovanje tipa proteinurije.

Izoelektrično fokusiranje je elektroforetska tehnika u kojoj se razdvajanje proteina vrši na

osnovu razlike u njihovim izoelektričnim tačkama (Slika 11.). Izoelektrična tačka (pI) je pH
vrijednost rastvora kod koje je protein električki neutralan, pa je i elektroforetska pokretljivost
proteina jednaka nuli. pI zavisi od sastava proteina i zato je fizičko-hemijska konstanta za svaki
protein. Budući da su odnosi aminokiselina i njihov broj različiti za svaki protein, raspon
izoelektričnih tačaka je veoma širok. Poliakrilamidni gel je, pri ovoj elektroforezi, sa pH
gradijentom, što se postiže tako da se u gel, prije nego što se polimerizira, dodaju poliamfoliti. Na
gel na kome je uspostavljen pH gradijent nanosi se uzorak. Zavisno od predznaka rezultirajućeg
naboja (koji se mijanja pri različitim pH) proteini putuju prema jednoj ili drugoj elektrodi.
Niski
Niski Visoki
pH
pH pH

Niski Visoki
pH pH

Slika 11. Izoelektrično fokusiranje

Kada dođu u zonu na gelu čiji je pH jednak njihovoj izoelektričnoj tački zaustaviće se. Kod tog
pH molekula proteina nema rezultirajući naboj i prestaje da se kreće u električnom polju. Ovim
postupkom mogu se razdvojiti proteini čiji se pI razlikuje za samo 0,0025. Proteini se pri
izoelektričnom fokusiranju izdvajaju u veoma uskim zonama, koje se nakon bojenja opažaju kao
oštre crte. Izoelektrično fokusiranje ima veliku primjenu u medicinskoj biohemiji. Primjenjuje se
za fenotipiziranje α1-antitripsina, razlikovanje patoloških hemoglobina, fenotipiziranje
apolipoproteina, ispitivanje polimorfizma pojedinih komponenata komplementa i drugo.

Slika 12. Dvosmjerna elektroforeza

 Jasminka Nikolić • Branislav Vukanović • Milada Nalesnik
PRIRUČNIK
ZA PRAKTIČNU I SEMINARSKU NASTAVU IZ MEDICINSKE BIOHEMIJE I HEMIJE

Tehnike dvosmjerne elektroforeze, koje su kombinacija dviju različitih elektroforetskih tehnika,

daju više podataka o sastavu nekog uzorka, u odnosu na jednosmjerne elektroforetske tehnike.
Idealno je da se u svakom smijeru sastojci uzorka odvajaju prema različitim fizičkim i hemijskim
osobinama. Najčešće se izoelektrično fokusiranje koristi za odvajanje u jednom smijeru, zbog
svoje mogućnosti da koncentriše sastojke uzorka u izuzetno uske zone, u akrilamidnom gelu niske
koncentracije. Za odvajanje u drugom smijeru najčešće se koristi elektroforeza na akrilamidnom
gelu u prisustvu natrijevog dodecilsulfata, koja zajedno sa izoelektričnim fokusiranjem, daje
podatak o izoelektričnoj tački i o molekulskoj masi pojedinih sastojaka ispitivanog uzorka. Ovakav
primjer kombinacije dviju elektroforetskih tehnika pokazan je na Slici 12. Dvosmjerna
elektroforeza kao vrhunska tehnika u analitici proteina doprinosi novim saznanjima o sastavu
proteina ćelija i tkiva.